KR102616629B1 - 신경퇴행성 장애 또는 뇌졸중의 치료에서 사용하기 위한 유전자 작제물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 유전자 작제물 및 이러한 작제물을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 작제물 및 벡터는 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 헌팅턴 질환, 운동 뉴런 질환을 포함하는 신경퇴행성 장애의 치료, 예방 또는 완화를 위한, 또는 뇌졸중의 치료를 위한, 또는 신경 재생 및/또는 생존의 촉진을 위한 유전자 치료법 방법에서 사용될 수 있다.

Description

신경퇴행성 장애 또는 뇌졸중의 치료에서 사용하기 위한 유전자 작제물

본 발명은 유전자 작제물, 그리고 특히 이러한 작제물을 포함하는 재조합 벡터, 및 신경퇴행성 장애의 치료, 예방 또는 완화를 위한, 또는 뇌졸중의 치료를 위한, 또는 신경 재생 및/또는 생존의 촉진을 위한 유전자 치료법 방법에서 작제물 및 벡터의 용도에 관한 것이다.

신경퇴행성 질환은 주로 뉴런에 영향을 미치는 것이다. 퇴행성 공정에는 뉴런 구조의 진행성 손실, 뉴런 기능의 진행성 손실, 또는 진행성 뉴런 세포사가 관여될 수 있다. 여러 구체적 장애가 신경퇴행성 질환으로 분류된다. 파킨슨 질환은 장기 신경퇴행성 장애이며, 대략 7백만 명에 영향을 미치는 것으로 추정된다. 헌팅턴 질환도 장기 신경퇴행성 장애이므로, 파킨슨 질환 및 헌팅턴 질환의 개선된 치료에 대한 필요성이 존재하고, 신경 재생 또는 생존의 촉진은 이러한 환자에게 유익할 수 있다.

운동 뉴런 질환에는 운동 뉴런에 대한 신경퇴행성 효과를 갖는 모든 장애가 포함된다. 여기에는 근위축 측삭 경화증(ALS), 원발 측삭 경화증(PLS), 진행성 근육 아트로피(PMA), 진행성 연수 마비(PBP), 거짓연수 마비, 또는 척추 근육 아트로피가 포함된다. 뇌로의 혈류가 방해받거나 감소되는 경우 뇌졸중이 일어나며, 불량한 혈류는 세포사를 일으킬 수 있다.

알츠하이머 질환은 모든 치매의 약 60%를 차지하며, 추정치는 세계적으로 2600만 명을 초과하는 개인이 알츠하이머 질환을 갖는 것으로 보고된다[1]. 치매에는 보통 기억, 언어 및 인지 공정에서의 결핍을 포함하는 정신 기능의 진행성 쇠퇴가 관여된다. 알츠하이머 질환은 환자 자신에 영향을 미칠 수 있을 뿐만 아니라 종종 비용을 지급받지 못한 채 환자를 돌봐야 하는 수 백만 명의 보호자에게 큰 영향을 갖는다. 알츠하이머 질환의 가장 큰 위험 인자는 연령이므로, 사람들이 더 고령으로 더 오래 생존함에 따라 유병률은 극적으로 증가한다[1]. 알츠하이머 환자수 증가는 이미 세계적인 헬스케어 시스템에 큰 영향을 갖고 있다. 알츠하이머 질환과 연관된 전형적인 병리에는 뇌의 거시적 아트로피, 대뇌 피질의 회색질 박화, 뉴런 손실을 시사하는 확대된 뇌실, 단백질 덩어리로 응집하는, 베타-아밀로이드 펩타이드[Aβ]를 포함하는 미시적인 세포외 아밀로이드 플라크, 응집된 타우 단백질을 포함하는 세포외 신경원섬유 매듭, 및 뇌혈관 아밀로이드, 즉 혈관 주위 아밀로이드 단백질이 관여된다. 알츠하이머 질환에서, 뇌내 여러 영역, 특히 전두, 측두 및 두정부 피질, 해마, 및 기저 전뇌의 콜린성 핵은 잘못 폴딩된 아밀로이드 β-펩타이드의 세포외 침적에 의해 유도되는 아밀로이드 플라크, 및 고인산화된 타우 단백질로 이루어진 신경원섬유 매듭을 갖는다. 이들 뇌 영역은 단기 기억에 필수적인 뉴런 회로에 관여되는 핵심 영역이다. 아밀로이드 플라크 침적은 뇌에 걸쳐 무작위로 나타나지만, 세포내 신경원섬유 매듭의 출현은 경-엔토리날(trans-entorhinal) 피질에서 먼저 검출되는 잘 정의된 패턴[2]을 따르는 것으로 보인다. 이어서 신경원섬유 매듭은 엔토리날 피질, 해마 영역, 이어서 대뇌 피질로 바깥쪽으로 순차적으로 확산되는 것으로 관찰된다. 여러 연구는 알츠하이머 질환의 가장 초기 변화 중 하나에 시냅스 손실이 관여되며, 이는 정신 쇠퇴[3]와 연관되어 궁극적으로 여러 뇌 영역에 걸쳐 현저한 세포 손실을 야기함을 시사하였다. 따라서 질환 증상은 해마에 의존하는 공정인, 새로운 기억을 만들지 못하는 것으로 시작해서, 뇌에 걸쳐 느린 파괴의 진행을 따른다.

신경 성장 인자(NGF), 뉴로트로핀-3(NT-3), 및 뉴로트로핀-4/5(NT-4/5)와 함께 뇌-유래 신경영양 인자(BDNF)는 영양 인자의 뉴로트로핀 패밀리의 구성원이다[4~5]. 뉴로트로핀은 말초 신경계 및 중추 신경계 모두에서 광범위한 뉴런의 발달, 생존 및 기능에서 필수적 역할을 담당한다. 뉴로트로핀은 저친화도 p75^NTR 수용체 및 고친화도 티로신 수용체 키나제(Trk) 패밀리의 2가지 세포 표면 수용체와 상호작용한다[4~5]. 신경 성장 인자(NGF)는 TrkA에 우선적으로 결합하며, 뇌 유래 신경영양 인자(BDNF) 및 뉴로트로핀-4/5(NT4/5)는 트로프미오신 수용체 키나제-B(TrkB)에 결합하고, 뉴로트로핀-3(NT-3)은 TrkC(및 더 적은 정도로 TrkA)에 결합한다[12~13].

뇌-유래 신경영양 인자(BDNF)는 고도 발현되고 중추 신경계, 특히 해마 및 대뇌 피질에 걸쳐 널리 분포되어 있는 단백질이다[6~7]. 이는 해마, 피질, 콜린성 및 도파민성 뉴런의 생존 및 기능에서 중요한 것으로 나타났다[8]. BDNF는 알츠하이머 질환, 헌팅턴 질환, 우울증, 정신분열병, 및 레트(Rett) 증후군을 포함하는 여러 뇌 장애와 연관된다. 알츠하이머 질환에서 나타난 초기 기억 기능부전은 알츠하이머 질환 해마[9] 및 두정부 피질에서 상당한 BDNF mRNA 수준 감소[10] 및 엔토리날 피질, 해마, 측두, 전두 및 두정부 피질에서 BDNF 단백질 수준 감소[11~16]가 보고되었으므로, 해마에서의 BDNF 수준과 관련될 수 있는 것으로 가정되었다. 그러나 BDNF 수준 변화는 소정 BDNF 전사체의 특정한 하향조절에 기인하는 것으로 보인다. 메타-분석은 또한 건강한 대상체 대비 알츠하이머 환자의 혈중 뉴로트로핀 수준의 상당한 감소를 나타낸다[17]. 또한 BDNF의 더 낮은 뇌척수액 중 농도는 경도 인지 장애(MCI)로부터 알츠하이머 질환으로의 진행을 예측하는 것으로 나타났다[18].

여러 연구는 BDNF의 프로-도메인의 Val66Met 다형성(여기서 발린은 메티오닌으로 치환됨)을 나타내는 대상체가 알츠하이머 질환으로의 진행 증가와 연관됨을 시사하며[19] 다른 BDNF 다형성이 또한 시사될 수 있다. BDNF의 더 큰 전구체 버전인 프로BDNF 및 성숙 BDNF(mBDNF)의 손실은 질환 초기에 일어나며(플라크 침적 전) 기억 결핍과 연관된다[20~21]. 이들 데이터는 알츠하이머의 인지 장애에 내재하는 BDNF 농도 감소, 시냅스 손실 및 세포 기능부전 간 연관성을 제시한다. BDNF는 또한 TrkB 수용체와의 상호작용 및 포스포이노시톨-3-키나제(PI3K) 및 단백질 키나제(Akt) 신호전달의 후속 증가를 통해 뉴런 세포에서 신속한 타우 탈인산화를 유도하는 것으로 나타났다[22~23]. 따라서, BDNF 농도 감소가 또한 AD의 병리적 특징인 타우 고인산화에 기여할 수 있다. 마우스에서의 BDNF 발현 감소를 유도하는 증가된 타우로의 반대 효과도 존재하는 것으로 나타난다[24]. 최근 데이터는 또한 BDNF를 포함하는 뉴로트로핀의 프로-도메인의 존재 하 Aβ 신경 독성의 잠재적 악화를 실증하였다[25].

mBDNF 수용체 TrkB를 발현하는 뉴런에서의 변화가 또한 사후 알츠하이머 뇌에서 발견되었다. 예를 들어, 알츠하이머 이환자의 사후 뇌에서 TrkB 양성 뉴런의 47% 감소가 보고되었다[26]. 이는 수용체를 정상 발현하는 뉴런의 손실 또는 TrkB 발현의 생화학적 하향조절에 기인할 수 있다. TrkB의 감소는 뉴런 생존을 위해 필수적인 키나제 활성을 나타내지 않는, 알츠하이머 질환에서의 전두 및 측두 피질 모두에서 절단된 수용체 이소형 TrkB-T1 및 TrkB-Shc의 상향-조절에 의해서도 악화될 수 있다[27]. 뉴런 배양에서 Aβ에 의한, 프로테아제 칼파인의 활성화는 수용체 Shc 도킹 부위 근처의 절단에 의해 TrkB 감소를 유도하여[28] 완전 기능적 수용체의 결함 키나제 활성을 갖는 절단된 이소형으로의 전환을 야기한다. 이어서 기능적 TrkB 수용체의 절단된 이소형으로의 전환 효과는 뉴로트로핀 싱크 또는 우성 음성 수용체로서 작용할 수 있다. 알츠하이머 질환의 마우스 모델에서, TrkB 수용체의 녹아웃은 Aβ의 침적에 영향을 미치지 않고 알츠하이머 질환-유사 신호전달 이상 및 기억 결핍을 악화시키는 것으로 관찰되었다[29]. 이들 데이터는 TrkB 수용체의 손실 및/또는 감소된 BDNF 생성 및 분비를 통한 활성 손실이 알츠하이머-유사 증상 및 병태생리의 생성에서 중요한 요소를 나타냄을 제시한다.

알츠하이머의 뇌에서 BDNF/TrkB 신호전달 결함에 기여하는 다른 중요한 기전에는 TrkB-FL 및 포스포리파제-γ(PLCγ) 활성화의 방해 없이 Aβ의 치사-미만 농도에 의한 미토겐 활성화된 단백질 키나제(MAPK/ERK) 및 PI3K/Akt 경로의 억제[30], 및 BDNF-유도된 TrkB 세포내이입의 손상이 포함된다. Aβ 올리고머에 대한 노출은 글리코겐 합성효소 키나제-3β(GSK3β)-매개된 다이나민-1 인산화를 통한 수용체 세포내이입 및 하류 Akt 활성화를 손상시킬 수 있다[31]. 또한, Aβ 올리고머는 유비퀴틴 시스템의 손상[33] 및 칼슘 항상성의 변경[34]을 통해 BDNF-매개된 TrkB 후방향 수송을 방해하는 것으로 나타났다[32].

전체적인 그림은 알츠하이머 질환에서, 특히 BDNF 시스템에 대한 신경영양 신호전달의 상당한 손상에 대한 것이다. BDNF 신호전달의 보충 또는 부스팅이 알츠하이머 질환의 몇몇 동물 모델에서 조사되었다. 예를 들어, BDNF 주사는 Aβ[1-42]에 의해 유도되는 알츠하이머 질환의 래트 모델에서 학습 결함을 완화한다[35]. 뇌에 침투할 수 있는 HIV-인코딩된 전사 트랜스활성화인자(TAT)와 함께 BDNF의 활성 도메인을 함유하는 신규 융합 펩타이드의 주입은 동물 모델에서 TrkB/ERK1/2/Akt 경로 활성화 및 몇몇 기억-연관된 단백질의 복원과 함께 공간 기억을 유의미하게 개선하였다[36]. 또한, 렌타바이러스-기반 유전자 치료법을 사용한 BDNF의 발현은 알츠하이머 질환의 마우스 트랜스제닉 모델 및 인지 감소를 나타내고 있는 고령 영장류에서 신경보호 효과를 갖는 것으로 나타났다[37].

BDNF는 뇌에서 생성될 수 있고 말초로 수송될 수 있으며, 여기서 뉴런을 지지하고 이의 생존을 유지할 수 있다[38~44]. 소정 조건, 예컨대 N-메틸-D-아스파르테이트와 같은 글루타메이트 수용체 작용제로의 흥분독성 부상 동안, BDNF는 상대적으로 낮은 수준이기는 하지만 말초 뉴런에서도 생성될 수 있다[45~46]. BDNF는 보통 세포외 공간 내로의 방출을 위해 전체 폴리펩타이드의 소포로의 수송을 촉진하는 짧은 신호 펩타이드 서열을 함유하는 프리프로-폴리펩타이드(즉 프리프로BDNF)로서 생성된다. 신호 펩타이드의 절단 및 제거는 프리프로BDNF를 프로BDNF로 전환한다. 이어서 N-말단 프로BDNF 서열이 세포내 또는 세포외 절단되어 성숙 BDNF(mBDNF)를 생성한다[47]. 프로-BDNF 및 mBDNF는 둘 다 생물학적 활성을 보유하며, 프로-BDNF는 p75^NTR 수용체를 우선적으로 활성화하고 더 짧은 mBDNF는 TrkB 수용체를 활성화한다[48~50]. 예를 들어, 망막 내 p75^NTR 및 TrkB 수용체의 활성화는 망막 신경절 세포(RGC) 생존에 대해 반대 효과를 나타내며, 전자는 직접적인 RGC-세포체-p75^NTR-활성화를 통해[48~51] 또는 뮐러 세포 상에서 p75^NTR 활성화를 통해 간접적으로 아폽토시스에 관여됨으로써, RGC 손실을 추가 촉진하는 종양 괴사 인자-알파(TNF-α)의 방출을 자극한다[52].

녹내장의 동물 모델은 신경 압궤 후 또는 IOP 상승 후, 신경영양 mBDNF/TrkB 신호전달에서 프로-BDNF/p75^NTR 경로로의 이동이 존재함을 실증하였다. 프로-BDNF[28] 및 p75^NTR 수용체[55]의 상대 수준에서 반대되는 상승과 함께 망막 내 mBDNF 및 TrkB 수용체의 수준 감소가 실증되었다[50, 53~54]. 실험적으로 상승된 IOP를 갖는 래트에 대한 재조합 단백질의 눈 주사를 통한 mBDNF의 보충은 처리되지 않은 눈에 비해 RGC의 생존을 증가시킴으로써, 상기 뉴로트로핀에 대한 핵심 신경보호 역할을 확인시켜준다[42~44].

따라서 상기 관점에서, 신경 재생 또는 생존의 촉진, 신경퇴행성 장애 또는 뇌졸중의 치료, 예방, 또는 완화를 위한 개선된 유전자 치료법에 대한 필요성이 존재한다.

본 발명자들은 단일 프로모터의 제어 하에 티로신 키나제 수용체 B(TrkB), 및 TrkB 수용체의 작용제를 인코딩하는 신규한 유전자 작제물을 구축하였다. 작제물의 프로모터는 작용제 및 수용체가 적절한 신경 세포에서만 발현되며, 이들 세포의 생존을 촉진함을 확실히 하기 위해 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명의 제1 양태에 따르면, 신경퇴행성 장애 또는 뇌졸중의 치료, 예방 또는 완화에서 사용하기 위한, 티로신 키나제 수용체 B(TrkB)를 인코딩하는 제1 코딩 서열, 및 TrkB 수용체의 작용제를 인코딩하는 제2 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 유전자 작제물이 제공된다.

본 발명자들은 실시예에서 TrkB 수용체 및 그 작용제를 둘 다 코딩하는 유전자를 단일 유전자 작제물에 조합할 수 있음을 실증하였다. 이는 특히 이들의 큰 크기에 기반하여 어려운 일이었으며, 이들을 생리적으로 유용한 농도로 공동-발현할 수 있을 것이라고는 예측될 수 없었다. 유리하게는, 본 발명의 작제물로, 선행 기술에 기재된 바와 같이[56], 재조합 단백질을 주사할 필요가 없다 또한, 선행 기술에서는 단백질의 정기 주사를 수행하는 것이 여전히 필요한 반면, 본 발명의 작제물은 단회 유전자 치료법 투여만을 필요로 한다.

바람직하게는, 사용 시, TrkB 수용체는 작용제에 의해 활성화됨으로써 신경 세포의 생존을 촉진한다. 본 발명의 유전자 작제물은 바람직하게는 다음으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 신경퇴행성 장애의 치료, 예방 또는 완화를 위해 사용된다: 알렉산더 질환, 알페르 질환, 알츠하이머 질환, 근위축 측삭 경화증(ALS), 모세관 확장실조, 뉴런 지방 갈색소증, 바튼 질환, 소 해면양 뇌증(BSE), 카나반 질환, 뇌성 마비, 코케인 증후군, 피질기저 퇴행, 크로츠펠트-야콥 질환, 전두측두엽 퇴행, 고셔 질환, 헌팅턴 질환, HIV-연관 치매, 케네디 질환, 크라베 질환, 레위체 치매, 리소좀 저장 장애, 신경보렐리아증, 마차도-조세프 질환, 운동 뉴런 질환, 다시스템 아트로피, 다발 경화증, 다중 설파타제 결핍, 점액지질증, 기면증, 니만-픽 C형, 니만 픽 질환, 파킨슨 질환, 펠리체우스-메르츠바허 질환, 픽 질환, 폼페 질환, 원발성 측삭 경화증, 프리온 질환, 진행성 핵상 마비, 레프숨 질환, 산도프 질환, 실더 질환, 악성 빈혈에 이차적인 척추의 아급성 조합 퇴행, 스피엘마이어-포그트-쇼그렌-바텐 질환, 척추소뇌 실조, 척추 근육 아트로피, 스틸레-리차드슨-올제우스키 질환, 척수 매독, 및 태이-삭스 질환.

바람직한 구현예에서, 유전자 작제물은 알츠하이머 질환의 치료, 예방 또는 완화를 위해 사용된다.

바람직한 구현예에서, 유전자 작제물은 헌팅턴 질환의 치료, 예방 또는 완화를 위한 것이다.

바람직한 구현예에서, 유전자 작제물은 파킨슨 질환의 치료, 예방 또는 완화를 위한 것이다.

바람직한 구현예에서, 유전자 작제물은 운동 뉴런 질환의 치료, 예방 또는 완화를 위한 것이다.

바람직한 구현예에서, 유전자 작제물은 뇌졸중의 치료, 예방 또는 완화를 위한 것이다.

유전자 치료법 작제물은 신경퇴행성 장애, 예컨대 알츠하이머 질환, 또는 뇌졸중의 치료를 위한 몇몇 유익한 치료 효과를 가질 수 있다. 유익에는 고갈된 뇌 mBDNF 농도의 치료적 보충, 또는 뉴로트로핀 패밀리로부터의 다른 영양 인자를 이용한 보충이 포함된다. 다른 유익에는 정상 뇌 조직에서의 TrkB 수용체 밀도 수준의 복원이 포함된다. 프로-서열에 대한 코딩부가 부재된, 예를 들어 프로BDNF에 대한 코딩부가 부재한 유전자 작제물 내 작용제를 포함시키는 능력이 또한 mBDNF/TrkB 유형 신호전달을 선호하고 프로-BDNF/p75NTR 유형 효과에서 멀어지며 균형 복원력을 갖는다. 또한 유전자 치료법이 프로-도메인 뉴로트로핀의 생성 없이 작용제, 예컨대 mBDNF의 성숙 형태를 생성하기 위해 사용될 수 있으므로, 작제물이 생성되고 작용제, 예컨대 프로BDNF의 프로-형태를 방출하는 경우 일어날 수 있는, Aβ 신경독성을 악화시킬 위험이 크게 낮을 것이다. 바람직하게는, 본 발명의 작제물은 뉴런에서 타우 인산화(알츠하이머 뇌와 연관된 병태생리적 특성 중 하나임)를 감소시키도록 구성된다.

따라서 유리하게는, 본 발명의 작제물은 이들 세포에서 TrkB-신호전달을 유지하거나 증강시키기 위해 신경 세포를 표적화하는 데 사용될 수 있다. 따라서, 작제물은 병태생리적 스트레스인자에 대한 보호를 최대화하고, 신경 재생 및/또는 생존을 촉진하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 작제물은 하나 이상의 프로모터의 제어 하에 TrkB 수용체 및 수용체 작용제의 발현으로 인한 신경퇴행성 장애 또는 뇌졸중의 장기 치료를 제공하기 위해 사용될 수 있다. 결과적으로, 작제물은 심지어 조합으로도 일시적인 치료 효과를 제공하는 여러 대안적 치료를 사용할 필요성을 극복하였다. 또한, 본 발명의 작제물은 이것이 TrkB 수용체 및 수용체의 작용제 모두에서 국소화된 증가로 인해 TrkB 수용체 작용제에 대한 신경 세포 민감도를 유의미하게 증강시키기 위해 사용될 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 유전자 작제물은 도 1에 나타내는 하나의 구현예인 발현 카세트를 포함한다. 도 1에서 알 수 있듯이, 작제물은 프로모터, TrkB 수용체를 인코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열, 및 TrkB 수용체의 바람직한 작용제로서 작용하는 성숙 뇌 유래 신경영양 인자(mBDNF)를 인코딩하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 그러나, 본원에서 논의된 바와 같이, 다른 작용제가 사용될 수 있음이 이해될 것이다. 또한 도 1에 나타낸 바와 같이, 발현 카세트에는 또한 2A 스페이서 서열, 간염 바이러스 전사-후 조절 요소(WPRE)를 인코딩하는 서열, 폴리A 테일을 인코딩하는 서열, 그리고 왼쪽 및 오른쪽 역방위 말단 반복 서열(ITR)이 포함된다.

따라서 바람직하게는 유전자 작제물은 제1 및 제2 코딩 서열 간에 배치된 스페이서 서열을 포함하며, 이 스페이서 서열은 소화되거나 절단됨으로써 별도 분자로서 TrkB 수용체 및 작용제를 생성하도록 배치된 펩타이드 스페이서를 인코딩한다. 도 1에 예시된 구현예에서, TrkB 수용체에 대한 코딩 서열은 수용체 작용제(BDNF)에 대한 코딩 서열의 5'에, 이들 간에 스페이서 서열을 가지고 배치된다. 그러나 또 다른 구현예에서, 수용체 작용제에 대한 코딩 서열은 수용체에 대한 코딩 서열의 5'에, 이들 간에 스페이서 서열을 가지고 배치될 수 있다.

바람직하게는, 유전자 작제물은 우드척 간염 바이러스 전사-후 조절 요소(WPRE)를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 이는 2개의 트랜스유전자, 즉 TrkB 수용체 및 그 작용제, 바람직하게는 BDNF의 발현을 증강시킨다. 바람직하게는, WPRE 코딩 서열은 트랜스유전자 코딩 서열의 3'에 배치된다.

우드척 간염 바이러스 전사-후 조절 요소(WPRE)의 하나의 구현예는 감마-알파-베타 요소를 포함하는 592 bp 길이이며, 본원에서 하기와 같이 서열번호 57로 언급된다:

AATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAGCTGACGTCCTTTCCATGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCTG [서열번호 57]

바람직하게는, WPRE는 실질적으로 서열번호 57에 나타낸 바와 같은 핵산 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함한다.

그러나 바람직한 구현예에서, 절단된 WPRE가 사용되며, 이는 베타 요소의 결실로 인해 247 bp 길이이고, 본원에서 하기와 같이 서열번호 58로 언급된다:

AATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTAGTTCTTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGT [서열번호 58]

유리하게는, 작제물에서 사용된 절단된 WPRE 서열은 트랜스유전자 발현에 부정적 영향을 미치지 않고 총 300 bp 가량을 절감하였다. 바람직하게는, WPRE는 실질적으로 서열번호 58에 나타낸 바와 같은 핵산 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함한다.

바람직하게는, 유전자 작제물은 폴리A 테일을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 바람직하게는, 폴리A 테일 코딩 서열은 트랜스유전자 코딩 서열의 3', 바람직하게는 WPRE 코딩 서열의 3'에 배치된다.

바람직하게는, 폴리A 테일은 유인원 바이러스 40 폴리-A 224 bp 서열을 포함한다. 폴리A 테일의 하나의 구현예는, 본원에서 하기와 같이 서열번호 59로 언급된다:

AGCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTGGGAGGTTTTTTAAAGCAAGTAAAACCTCTACAAATGTGGTA [서열번호 59]

바람직하게는, 폴리A 테일은 실질적으로 서열번호 59에 나타낸 바와 같은 핵산 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함한다.

바람직하게는, 유전자 작제물은 왼쪽 및/또는 오른쪽 역방위 말단 반복 서열(ITR)을 포함한다. 바람직하게는, 각각의 ITR은 작제물의 5' 및/또는 3' 말단에 배치된다.

제1 양태의 유전자 작제물에서의 프로모터는 RNA 폴리머라제가 제1 및 제2 코딩 서열에 결합하고 이를 전사하도록 유도할 수 있는 임의의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다. 하나의 구현예에서, 제1 양태의 유전자 작제물에서의 프로모터는 사이토메갈로바이러스(CMV) 구성적 프로모터일 수 있다. 이는 뉴런 및 아교 세포 둘 다에 대해 비선택적인 것으로 여겨진다.

하나의 바람직한 구현예에서, 프로모터는 인간 시냅신 I(SYN I) 프로모터이며, 인간 뇌에서 작용하는 것으로 나타났다. 인간 시냅신 I(SYN I)을 인코딩하는 469개 뉴클레오타이드 서열의 하나의 구현예는 하기와 같이 본원에서 서열번호 1로 언급된다:

CTGCAGAGGGCCCTGCGTATGAGTGCAAGTGGGTTTTAGGACCAGGATGAGGCGGGGTGGGGGTGCCTACCTGACGACCGACCCCGACCCACTGGACAAGCACCCAACCCCCATTCCCCAAATTGCGCATCCCCTATCAGAGAGGGGGAGGGGAAACAGGATGCGGCGAGGCGCGTGCGCACTGCCAGCTTCAGCACCGCGGACAGTGCCTTCGCCCCCGCCTGGCGGCGCGCGCCACCGCCGCCTCAGCACTGAAGGCGCGCTGACGTCACTCGCCGGTCCCCCGCAAACTCCCCTTCCCGGCCACCTTGGTCGCGTCCGCGCCGCCGCCGGCCCAGCCGGACCGCACCACGCGAGGCGCGAGATAGGGGGGCACGGGCGCGACCATCTGCGCTGCGGCGCCGGCGACTCAGCGCTGCCTCAGTCTGCGGTGGGCAGCGGAGGAGTCGTGTCGTGCCTGAGAGCGCAG [서열번호 1]

따라서 바람직하게는, 프로모터는 실질적으로 서열번호 1에 나타낸 바와 같은 핵산 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함할 수 있다.

또 다른 바람직한 구현예에서, 프로모터는 CAG 프로모터이며, 이는 또한 인간 뇌에서 작용하는 것으로 나타났다. CAG 프로모터는 바람직하게는 사이토메갈로바이러스 초기 인핸서 요소, 제1 엑손 및 닭 베타-액틴 유전자의 제1 인트론 및 토끼 베타-글로빈 유전자의 스플라이스 수신체를 포함한다. CAG 프로모터를 인코딩하는 1733개 뉴클레오타이드 서열의 하나의 구현예는 하기와 같이 본원에서 서열번호 2로 언급된다:

CTCGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGCGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCTCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCAGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGTCGGTCGGGCTGCAACCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTACGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAGAATTG [서열번호 2]

또 다른 바람직한 구현예에서, 프로모터는 CAG 프로모터의 절단된 형태, 예컨대 하기와 같이 본원에서 서열번호 3으로 언급되는 프로모터의 664개 뉴클레오타이드 형태이다:

CTAGATCTGAATTCGGTACCCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCG [서열번호 3]

바람직한 추가 구현예에서, 프로모터는 CAG 프로모터의 절단된 형태, 예컨대 하기와 같이 본원에서 서열번호 48로 언급되는 프로모터의 584개 뉴클레오타이드 형태이다:

GCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCG [서열번호 48]

따라서, 바람직하게는 프로모터는 실질적으로 서열번호 2, 3 또는 48에 나타낸 바와 같은 핵산 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함한다.

과학 문헌에 제시된 여러 바이시스트론 유전자 작제물은 (i) 2개 유전자의 발현을 별도로 유도하기 위해 도입된 이중 프로모터를 갖거나, (ii) 재조합 바이러스 벡터 내의 단일 프로모터로부터 전사된 2개의 유전자를 연결하기 위한 뇌심근염 바이러스(EMCV)의 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 사용한다[45-46]. 그러나, IRES-의존적 번역의 효율은 상이한 세포 및 조직에서는 다를 수 있고 IRES-의존적 제2 유전자 발현은 바이시스트론 벡터에서의 캡-의존적 제1 유전자 발현보다 크게 낮을 수 있다[47]. 또한, rAAV 벡터의 크기 한계(일반적으로 <5kb)는 이중 프로모터 또는 IRES 링커를 사용하는 큰 유전자 작제물, 예컨대 BDNF와 함께 TrkB 수용체의 도입을 막을 것이다.

따라서 바람직한 구현예에서, 유전자 작제물은 제1 및 제2 코딩 서열 간에 배치된 스페이서 서열을 포함하며, 이 스페이서 서열은 소화됨으로써 TrkB 수용체 및 작용제를 별도 분자로서 생성하도록 구성되는 펩타이드 스페이서를 인코딩한다. 바람직하게는, 스페이서 서열은 바이러스 펩타이드 스페이서 서열, 보다 바람직하게는 바이러스 2A 펩타이드 스페이서 서열을 포함하고 인코딩한다[47]. 바람직하게는, 2A 펩타이드 서열은 제1 코딩 서열을 제2 코딩 서열로 연결한다. 이는 작제물이 다양한 벡터에서의 발현과 함께 일어나는 크기 제약을 극복할 수 있게 하며 제1 양태의 작제물에 의해 인코딩되는 모든 펩타이드의 발현이 단일 프로모터의 제어 하에, 단일 단백질로서 일어날 수 있도록 한다.

따라서, TrkB, 2A 펩타이드, 및 작용제(바람직하게는 BDNF)의 서열을 함유하는 단일 단백질의 번역 후, 말단 글리신-프롤린 연결에서 바이러스 2A 펩타이드 서열 내 절단이 일어남으로써 2개 단백질, 즉 TrkB 및 작용제(예로, mBDNF)를 방출한다. 유전자 작제물은 바이러스 2A 펩타이드의 짧은 잔여 N-말단 아미노산 서열이 TrkB 수용체의 세포내 부분에 부착된 채 유지됨으로써 면역원성 위험을 제거하고 성숙 수용체의 세포내 신호전달능을 방해하지 않도록 설계된다. C-말단 바이러스 2A 서열로부터의 잔류 프롤린 아미노산은 N-말단 작용제 신호 펩타이드에 부착된 채 유지되며 궁극적으로는 성숙 단백질로부터 신호 서열의 절단 후 작용제 단백질로부터 제거된다.

본 발명자들은 스페이서 서열의 2개 구현예를 생성하였다. 본원에 기재된 두 구현예에 공통적인 펩타이드 스페이서 서열의 하나의 중요한 구획은 C-말단이다. 따라서, 바람직하게는 펩타이드 스페이서 서열은 하기와 같이, 본원에서 서열번호 4로 언급되는 아미노산 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함한다:

QAGDVEENPGP [서열번호 4]

바람직하게는, 펩타이드 스페이서 서열의 소화 또는 절단 부위는 서열번호 4의 말단 글리신 및 끝단 프롤린 사이에 배치된다.

바람직한 제1 구현예에서, 스페이서 서열은 하기와 같이, 본원에서 서열번호 5로 언급되는 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함한다:

GGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCT [서열번호 5]

상기 제1 구현예에서, 펩타이드 스페이서 서열은 하기와 같이 본원에서 서열번호 6으로 언급되는 아미노산 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함한다:

GSGATNFSLLQAGDVEENPGP [서열번호 6]

바람직한 제2 구현예에서, 스페이서 서열은 하기와 같이 본원에서 서열번호 7로 언급되는 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함한다:

AGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCT [서열번호 7]

상기 제2 구현예에서, 펩타이드 스페이서 서열은 하기와 같이 본원에서 서열번호 8로 언급되는 아미노산 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함한다:

SGATNFSLLKQAGDVEENPGP [서열번호 8]

본 발명자들은 TrkB 수용체의 서열을 조심스럽게 고려하였고, 제1 양태의 유전자 작제물에서 제1 코딩 서열에 의해 인코딩되는 수용체의 몇몇 바람직한 구현예를 생성하였다.

하나의 바람직한 구현예에서, 제1 코딩 서열은 TrkB의 인간 정규 이소형을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 바람직하게는, TrkB의 정규 이소형은 아래에 나타낸 바와 같이, 본원에서 서열번호 9로 언급되는 아미노산 서열(822개 잔기), 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함한다:

MSSWIRWHGPAMARLWGFCWLVVGFWRAAFACPTSCKCSASRIWCSDPSPGIVAFPRLEPNSVDPENITEIFIANQKRLEIINEDDVEAYVGLRNLTIVDSGLKFVAHKAFLKNSNLQHINFTRNKLTSLSRKHFRHLDLSELILVGNPFTCSCDIMWIKTLQEAKSSPDTQDLYCLNESSKNIPLANLQIPNCGLPSANLAAPNLTVEEGKSITLSCSVAGDPVPNMYWDVGNLVSKHMNETSHTQGSLRITNISSDDSGKQISCVAENLVGEDQDSVNLTVHFAPTITFLESPTSDHHWCIPFTVKGNPKPALQWFYNGAILNESKYICTKIHVTNHTEYHGCLQLDNPTHMNNGDYTLIAKNEYGKDEKQISAHFMGWPGIDDGANPNYPDVIYEDYGTAANDIGDTTNRSNEIPSTDVTDKTGREHLSVYAVVVIASVVGFCLLVMLFLLKLARHSKFGMKGPASVISNDDDSASPLHHISNGSNTPSSSEGGPDAVIIGMTKIPVIENPQYFGITNSQLKPDTFVQHIKRHNIVLKRELGEGAFGKVFLAECYNLCPEQDKILVAVKTLKDASDNARKDFHREAELLTNLQHEHIVKFYGVCVEGDPLIMVFEYMKHGDLNKFLRAHGPDAVLMAEGNPPTELTQSQMLHIAQQIAAGMVYLASQHFVHRDLATRNCLVGENLLVKIGDFGMSRDVYSTDYYRVGGHTMLPIRWMPPESIMYRKFTTESDVWSLGVVLWEIFTYGKQPWYQLSNNEVIECITQGRVLQRPRTCPQEVYELMLGCWQREPHMRKNIKGIHTLLQNLAKASPVYLDILG [서열번호 9]

바람직하게는, 상기 구현예에서, 제1 코딩 서열은 아래에 나타낸 바와 같이 본원에서 서열번호 10으로 언급되는 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함한다:

ATGTCGTCCTGGATAAGGTGGCATGGACCCGCCATGGCGCGGCTCTGGGGCTTCTGCTGGCTGGTTGTGGGCTTCTGGAGGGCCGCTTTCGCCTGTCCCACGTCCTGCAAATGCAGTGCCTCTCGGATCTGGTGCAGCGACCCTTCTCCTGGCATCGTGGCATTTCCGAGATTGGAGCCTAACAGTGTAGATCCTGAGAACATCACCGAAATTTTCATCGCAAACCAGAAAAGGTTAGAAATCATCAACGAAGATGATGTTGAAGCTTATGTGGGACTGAGAAATCTGACAATTGTGGATTCTGGATTAAAATTTGTGGCTCATAAAGCATTTCTGAAAAACAGCAACCTGCAGCACATCAATTTTACCCGAAACAAACTGACGAGTTTGTCTAGGAAACATTTCCGTCACCTTGACTTGTCTGAACTGATCCTGGTGGGCAATCCATTTACATGCTCCTGTGACATTATGTGGATCAAGACTCTCCAAGAGGCTAAATCCAGTCCAGACACTCAGGATTTGTACTGCCTGAATGAAAGCAGCAAGAATATTCCCCTGGCAAACCTGCAGATACCCAATTGTGGTTTGCCATCTGCAAATCTGGCCGCACCTAACCTCACTGTGGAGGAAGGAAAGTCTATCACATTATCCTGTAGTGTGGCAGGTGATCCGGTTCCTAATATGTATTGGGATGTTGGTAACCTGGTTTCCAAACATATGAATGAAACAAGCCACACACAGGGCTCCTTAAGGATAACTAACATTTCATCCGATGACAGTGGGAAGCAGATCTCTTGTGTGGCGGAAAATCTTGTAGGAGAAGATCAAGATTCTGTCAACCTCACTGTGCATTTTGCACCAACTATCACATTTCTCGAATCTCCAACCTCAGACCACCACTGGTGCATTCCATTCACTGTGAAAGGCAACCCCAAACCAGCGCTTCAGTGGTTCTATAACGGGGCAATATTGAATGAGTCCAAATACATCTGTACTAAAATACATGTTACCAATCACACGGAGTACCACGGCTGCCTCCAGCTGGATAATCCCACTCACATGAACAATGGGGACTACACTCTAATAGCCAAGAATGAGTATGGGAAGGATGAGAAACAGATTTCTGCTCACTTCATGGGCTGGCCTGGAATTGACGATGGTGCAAACCCAAATTATCCTGATGTAATTTATGAAGATTATGGAACTGCAGCGAATGACATCGGGGACACCACGAACAGAAGTAATGAAATCCCTTCCACAGACGTCACTGATAAAACCGGTCGGGAACATCTCTCGGTCTATGCTGTGGTGGTGATTGCGTCTGTGGTGGGATTTTGCCTTTTGGTAATGCTGTTTCTGCTTAAGTTGGCAAGACACTCCAAGTTTGGCATGAAAGGCCCAGCCTCCGTTATCAGCAATGATGATGACTCTGCCAGCCCACTCCATCACATCTCCAATGGGAGTAACACTCCATCTTCTTCGGAAGGTGGCCCAGATGCTGTCATTATTGGAATGACCAAGATCCCTGTCATTGAAAATCCCCAGTACTTTGGCATCACCAACAGTCAGCTCAAGCCAGACACATTTGTTCAGCACATCAAGCGACATAACATTGTTCTGAAAAGGGAGCTAGGCGAAGGAGCCTTTGGAAAAGTGTTCCTAGCTGAATGCTATAACCTCTGTCCTGAGCAGGACAAGATCTTGGTGGCAGTGAAGACCCTGAAGGATGCCAGTGACAATGCACGCAAGGACTTCCACCGTGAGGCCGAGCTCCTGACCAACCTCCAGCATGAGCACATCGTCAAGTTCTATGGCGTCTGCGTGGAGGGCGACCCCCTCATCATGGTCTTTGAGTACATGAAGCATGGGGACCTCAACAAGTTCCTCAGGGCACACGGCCCTGATGCCGTGCTGATGGCTGAGGGCAACCCGCCCACGGAACTGACGCAGTCGCAGATGCTGCATATAGCCCAGCAGATCGCCGCGGGCATGGTCTACCTGGCGTCCCAGCACTTCGTGCACCGCGATTTGGCCACCAGGAACTGCCTGGTCGGGGAGAACTTGCTGGTGAAAATCGGGGACTTTGGGATGTCCCGGGACGTGTACAGCACTGACTACTACAGGGTCGGTGGCCACACAATGCTGCCCATTCGCTGGATGCCTCCAGAGAGCATCATGTACAGGAAATTCACGACGGAAAGCGACGTCTGGAGCCTGGGGGTCGTGTTGTGGGAGATTTTCACCTATGGCAAACAGCCCTGGTACCAGCTGTCAAACAATGAGGTGATAGAGTGTATCACTCAGGGCCGAGTCCTGCAGCGACCCCGCACGTGCCCCCAGGAGGTGTATGAGCTGATGCTGGGGTGCTGGCAGCGAGAGCCCCACATGAGGAAGAACATCAAGGGCATCCATACCCTCCTTCAGAACTTGGCCAAGGCATCTCCGGTCTACCTGGACATTCTAGGC [서열번호 10]

또 다른 바람직한 구현예에서, 제1 코딩 서열은 TrkB의 이소형 4를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 바람직하게는, TrkB의 이소형 4는 아래에 나타낸 바와 같이 본원에서 서열번호 11로 언급되는 아미노산 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함한다:

MSSWIRWHGPAMARLWGFCWLVVGFWRAAFACPTSCKCSASRIWCSDPSPGIVAFPRLEPNSVDPENITEIFIANQKRLEIINEDDVEAYVGLRNLTIVDSGLKFVAHKAFLKNSNLQHINFTRNKLTSLSRKHFRHLDLSELILVGNPFTCSCDIMWIKTLQEAKSSPDTQDLYCLNESSKNIPLANLQIPNCGLPSANLAAPNLTVEEGKSITLSCSVAGDPVPNMYWDVGNLVSKHMNETSHTQGSLRITNISSDDSGKQISCVAENLVGEDQDSVNLTVHFAPTITFLESPTSDHHWCIPFTVKGNPKPALQWFYNGAILNESKYICTKIHVTNHTEYHGCLQLDNPTHMNNGDYTLIAKNEYGKDEKQISAHFMGWPGIDDGANPNYPDVIYEDYGTAANDIGDTTNRSNEIPSTDVTDKTGREHLSVYAVVVIASVVGFCLLVMLFLLKLARHSKFGMKDFSWFGFGKVKSRQGVGPASVISNDDDSASPLHHISNGSNTPSSSEGGPDAVIIGMTKIPVIENPQYFGITNSQLKPDTFVQHIKRHNIVLKRELGEGAFGKVFLAECYNLCPEQDKILVAVKTLKDASDNARKDFHREAELLTNLQHEHIVKFYGVCVEGDPLIMVFEYMKHGDLNKFLRAHGPDAVLMAEGNPPTELTQSQMLHIAQQIAAGMVYLASQHFVHRDLATRNCLVGENLLVKIGDFGMSRDVYSTDYYRVGGHTMLPIRWMPPESIMYRKFTTESDVWSLGVVLWEIFTYGKQPWYQLSNNEVIECITQGRVLQRPRTCPQEVYELMLGCWQREPHMRKNIKGIHTLLQNLAKASPVYLDILG [서열번호 11]

바람직하게는, 제1 코딩 서열의 상기 구현예는 아래에 나타낸 바와 같이 본원에서 서열번호 12로 언급되는 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함한다.

ATGTCGTCCTGGATAAGGTGGCATGGACCCGCCATGGCGCGGCTCTGGGGCTTCTGCTGGCTGGTTGTGGGCTTCTGGAGGGCCGCTTTCGCCTGTCCCACGTCCTGCAAATGCAGTGCCTCTCGGATCTGGTGCAGCGACCCTTCTCCTGGCATCGTGGCATTTCCGAGATTGGAGCCTAACAGTGTAGATCCTGAGAACATCACCGAAATTTTCATCGCAAACCAGAAAAGGTTAGAAATCATCAACGAAGATGATGTTGAAGCTTATGTGGGACTGAGAAATCTGACAATTGTGGATTCTGGATTAAAATTTGTGGCTCATAAAGCATTTCTGAAAAACAGCAACCTGCAGCACATCAATTTTACCCGAAACAAACTGACGAGTTTGTCTAGGAAACATTTCCGTCACCTTGACTTGTCTGAACTGATCCTGGTGGGCAATCCATTTACATGCTCCTGTGACATTATGTGGATCAAGACTCTCCAAGAGGCTAAATCCAGTCCAGACACTCAGGATTTGTACTGCCTGAATGAAAGCAGCAAGAATATTCCCCTGGCAAACCTGCAGATACCCAATTGTGGTTTGCCATCTGCAAATCTGGCCGCACCTAACCTCACTGTGGAGGAAGGAAAGTCTATCACATTATCCTGTAGTGTGGCAGGTGATCCGGTTCCTAATATGTATTGGGATGTTGGTAACCTGGTTTCCAAACATATGAATGAAACAAGCCACACACAGGGCTCCTTAAGGATAACTAACATTTCATCCGATGACAGTGGGAAGCAGATCTCTTGTGTGGCGGAAAATCTTGTAGGAGAAGATCAAGATTCTGTCAACCTCACTGTGCATTTTGCACCAACTATCACATTTCTCGAATCTCCAACCTCAGACCACCACTGGTGCATTCCATTCACTGTGAAAGGCAACCCCAAACCAGCGCTTCAGTGGTTCTATAACGGGGCAATATTGAATGAGTCCAAATACATCTGTACTAAAATACATGTTACCAATCACACGGAGTACCACGGCTGCCTCCAGCTGGATAATCCCACTCACATGAACAATGGGGACTACACTCTAATAGCCAAGAATGAGTATGGGAAGGATGAGAAACAGATTTCTGCTCACTTCATGGGCTGGCCTGGAATTGACGATGGTGCAAACCCAAATTATCCTGATGTAATTTATGAAGATTATGGAACTGCAGCGAATGACATCGGGGACACCACGAACAGAAGTAATGAAATCCCTTCCACAGACGTCACTGATAAAACCGGTCGGGAACATCTCTCGGTCTATGCTGTGGTGGTGATTGCGTCTGTGGTGGGATTTTGCCTTTTGGTAATGCTGTTTCTGCTTAAGTTGGCAAGACACTCCAAGTTTGGCATGAAAGATTTCTCATGGTTTGGATTTGGGAAAGTAAAATCAAGACAAGGTGTTGGCCCAGCCTCCGTTATCAGCAATGATGATGACTCTGCCAGCCCACTCCATCACATCTCCAATGGGAGTAACACTCCATCTTCTTCGGAAGGTGGCCCAGATGCTGTCATTATTGGAATGACCAAGATCCCTGTCATTGAAAATCCCCAGTACTTTGGCATCACCAACAGTCAGCTCAAGCCAGACACATTTGTTCAGCACATCAAGCGACATAACATTGTTCTGAAAAGGGAGCTAGGCGAAGGAGCCTTTGGAAAAGTGTTCCTAGCTGAATGCTATAACCTCTGTCCTGAGCAGGACAAGATCTTGGTGGCAGTGAAGACCCTGAAGGATGCCAGTGACAATGCACGCAAGGACTTCCACCGTGAGGCCGAGCTCCTGACCAACCTCCAGCATGAGCACATCGTCAAGTTCTATGGCGTCTGCGTGGAGGGCGACCCCCTCATCATGGTCTTTGAGTACATGAAGCATGGGGACCTCAACAAGTTCCTCAGGGCACACGGCCCTGATGCCGTGCTGATGGCTGAGGGCAACCCGCCCACGGAACTGACGCAGTCGCAGATGCTGCATATAGCCCAGCAGATCGCCGCGGGCATGGTCTACCTGGCGTCCCAGCACTTCGTGCACCGCGATTTGGCCACCAGGAACTGCCTGGTCGGGGAGAACTTGCTGGTGAAAATCGGGGACTTTGGGATGTCCCGGGACGTGTACAGCACTGACTACTACAGGGTCGGTGGCCACACAATGCTGCCCATTCGCTGGATGCCTCCAGAGAGCATCATGTACAGGAAATTCACGACGGAAAGCGACGTCTGGAGCCTGGGGGTCGTGTTGTGGGAGATTTTCACCTATGGCAAACAGCCCTGGTACCAGCTGTCAAACAATGAGGTGATAGAGTGTATCACTCAGGGCCGAGTCCTGCAGCGACCCCGCACGTGCCCCCAGGAGGTGTATGAGCTGATGCTGGGGTGCTGGCAGCGAGAGCCCCACATGAGGAAGAACATCAAGGGCATCCATACCCTCCTTCAGAACTTGGCCAAGGCATCTCCGGTCTACCTGGACATTCTAGGC [서열번호 12]

본 발명자들은 TrkB 수용체의 서열 연구에 상당한 발명 노력을 기울였으며 TrkB가 보통 BDNF 이량체의 존재 하에 이량체화 및 자가인산화 후 인산화되는 5개 티로신 잔기(서열번호 9의 위치 516, 701, 705, 706 및 816)를 포함함을 깨달았다. 이들 5개 티로신 잔기의 인산화의 문제는 수용체가 포스파타제, 예컨대 Shp-2 포스파타제에 의해 쉽게 탈활성화될 수 있다는 것이다. 따라서, 생체내 수용체의 인산화 및 생성되는 탈활성화를 방지하기 위해, 생성되는 포스포티로신을 모사하고 BDNF의 존재 하에 활성으로 유지되며 포스파타제, 예컨대 Shp-2 포스파타제에 의해 탈활성화될 수 없는 수용체를 생성하기 위해, 바람직하게는 하나 이상의 이들 핵심 티로신이 돌연변이된다(보다 바람직하게는, 글루탐산으로). 이러한 TrkB의 돌연변이체 형태는 더 긴 기간 동안 활성으로 유지되거나, 수용체가 내재화될 때까지 TrkB 수용체 활성을 생성하는 것으로 목표로 한다.

아래에 제공되는 DNA 및 아미노산 서열은 5개 글루탐산(E) 잔기로 돌연변이된 이들 5개 티로신(Y) 잔기의 위치를 예시한다. 이들 잔기 중 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개가 본 발명의 구현예에서 글루탐산으로 돌연변이될 수 있음이 이해될 것이다. 이들 돌연변이의 다양한 조합, 예로, 위치 516 및 701만, 또는 위치 705, 706 및 816만 등이 또한 고려된다.

따라서, 또 다른 바람직한 구현예에서, 제1 코딩 서열은 TrkB 수용체의 돌연변이체 형태를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 여기서 서열번호 9의 위치 516, 701, 705, 706 및/또는 816에서 하나 이상의 티로신 잔기가 개질되거나 돌연변이된다. 바람직하게는, 서열번호 9의 위치 516, 701, 705, 706 및/또는 816에서 적어도 2개, 3개 또는 4개의 티로신 잔기가 개질된다. 가장 바람직하게는, 서열번호 9의 위치 516, 701, 705, 706 및/또는 816에서 모든 5개 티로신 잔기가 개질된다.

바람직하게는, 또는 각각의 티로신 잔기가 상이한 아미노산 잔기, 보다 바람직하게는 글루탐산으로 개질된다. 따라서, 바람직하게는 TrkB 수용체의 돌연변이체 형태는 Y516E, Y701E, Y705E, Y706E 및/또는 Y816E를 포함한다.

바람직하게는, TrkB 수용체의 개질된 형태는 아래에 나타낸 바와 같이 본원에서 서열번호 13으로 언급되는 아미노산 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함한다:

MSSWIRWHGPAMARLWGFCWLVVGFWRAAFACPTSCKCSASRIWCSDPSPGIVAFPRLEPNSVDPENITEIFIANQKRLEIINEDDVEAYVGLRNLTIVDSGLKFVAHKAFLKNSNLQHINFTRNKLTSLSRKHFRHLDLSELILVGNPFTCSCDIMWIKTLQEAKSSPDTQDLYCLNESSKNIPLANLQIPNCGLPSANLAAPNLTVEEGKSITLSCSVAGDPVPNMYWDVGNLVSKHMNETSHTQGSLRITNISSDDSGKQISCVAENLVGEDQDSVNLTVHFAPTITFLESPTSDHHWCIPFTVKGNPKPALQWFYNGAILNESKYICTKIHVTNHTEYHGCLQLDNPTHMNNGDYTLIAKNEYGKDEKQISAHFMGWPGIDDGANPNYPDVIYEDYGTAANDIGDTTNRSNEIPSTDVTDKTGREHLSVYAVVVIASVVGFCLLVMLFLLKLARHSKFGMKGPASVISNDDDSASPLHHISNGSNTPSSSEGGPDAVIIGMTKIPVIENPQEFGITNSQLKPDTFVQHIKRHNIVLKRELGEGAFGKVFLAECYNLCPEQDKILVAVKTLKDASDNARKDFHREAELLTNLQHEHIVKFYGVCVEGDPLIMVFEYMKHGDLNKFLRAHGPDAVLMAEGNPPTELTQSQMLHIAQQIAAGMVYLASQHFVHRDLATRNCLVGENLLVKIGDFGMSRDVESTDEERVGGHTMLPIRWMPPESIMYRKFTTESDVWSLGVVLWEIFTYGKQPWYQLSNNEVIECITQGRVLQRPRTCPQEVYELMLGCWQREPHMRKNIKGIHTLLQNLAKASPVELDILG [서열번호 13]

바람직하게는, 상기 구현예에서, 제1 코딩 서열은 아래에 나타낸 바와 같이 본원에서 서열번호 14로 언급되는 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함한다:

ATGTCGTCCTGGATAAGGTGGCATGGACCCGCCATGGCGCGGCTCTGGGGCTTCTGCTGGCTGGTTGTGGGCTTCTGGAGGGCCGCTTTCGCCTGTCCCACGTCCTGCAAATGCAGTGCCTCTCGGATCTGGTGCAGCGACCCTTCTCCTGGCATCGTGGCATTTCCGAGATTGGAGCCTAACAGTGTAGATCCTGAGAACATCACCGAAATTTTCATCGCAAACCAGAAAAGGTTAGAAATCATCAACGAAGATGATGTTGAAGCTTATGTGGGACTGAGAAATCTGACAATTGTGGATTCTGGATTAAAATTTGTGGCTCATAAAGCATTTCTGAAAAACAGCAACCTGCAGCACATCAATTTTACCCGAAACAAACTGACGAGTTTGTCTAGGAAACATTTCCGTCACCTTGACTTGTCTGAACTGATCCTGGTGGGCAATCCATTTACATGCTCCTGTGACATTATGTGGATCAAGACTCTCCAAGAGGCTAAATCCAGTCCAGACACTCAGGATTTGTACTGCCTGAATGAAAGCAGCAAGAATATTCCCCTGGCAAACCTGCAGATACCCAATTGTGGTTTGCCATCTGCAAATCTGGCCGCACCTAACCTCACTGTGGAGGAAGGAAAGTCTATCACATTATCCTGTAGTGTGGCAGGTGATCCGGTTCCTAATATGTATTGGGATGTTGGTAACCTGGTTTCCAAACATATGAATGAAACAAGCCACACACAGGGCTCCTTAAGGATAACTAACATTTCATCCGATGACAGTGGGAAGCAGATCTCTTGTGTGGCGGAAAATCTTGTAGGAGAAGATCAAGATTCTGTCAACCTCACTGTGCATTTTGCACCAACTATCACATTTCTCGAATCTCCAACCTCAGACCACCACTGGTGCATTCCATTCACTGTGAAAGGCAACCCCAAACCAGCGCTTCAGTGGTTCTATAACGGGGCAATATTGAATGAGTCCAAATACATCTGTACTAAAATACATGTTACCAATCACACGGAGTACCACGGCTGCCTCCAGCTGGATAATCCCACTCACATGAACAATGGGGACTACACTCTAATAGCCAAGAATGAGTATGGGAAGGATGAGAAACAGATTTCTGCTCACTTCATGGGCTGGCCTGGAATTGACGATGGTGCAAACCCAAATTATCCTGATGTAATTTATGAAGATTATGGAACTGCAGCGAATGACATCGGGGACACCACGAACAGAAGTAATGAAATCCCTTCCACAGACGTCACTGATAAAACCGGTCGGGAACATCTCTCGGTCTATGCTGTGGTGGTGATTGCGTCTGTGGTGGGATTTTGCCTTTTGGTAATGCTGTTTCTGCTTAAGTTGGCAAGACACTCCAAGTTTGGCATGAAAGGCCCAGCCTCCGTTATCAGCAATGATGATGACTCTGCCAGCCCACTCCATCACATCTCCAATGGGAGTAACACTCCATCTTCTTCGGAAGGTGGCCCAGATGCTGTCATTATTGGAATGACCAAGATCCCTGTCATTGAAAATCCCCAGGAATTTGGCATCACCAACAGTCAGCTCAAGCCAGACACATTTGTTCAGCACATCAAGCGACATAACATTGTTCTGAAAAGGGAGCTAGGCGAAGGAGCCTTTGGAAAAGTGTTCCTAGCTGAATGCTATAACCTCTGTCCTGAGCAGGACAAGATCTTGGTGGCAGTGAAGACCCTGAAGGATGCCAGTGACAATGCACGCAAGGACTTCCACCGTGAGGCCGAGCTCCTGACCAACCTCCAGCATGAGCACATCGTCAAGTTCTATGGCGTCTGCGTGGAGGGCGACCCCCTCATCATGGTCTTTGAGTACATGAAGCATGGGGACCTCAACAAGTTCCTCAGGGCACACGGCCCTGATGCCGTGCTGATGGCTGAGGGCAACCCGCCCACGGAACTGACGCAGTCGCAGATGCTGCATATAGCCCAGCAGATCGCCGCGGGCATGGTCTACCTGGCGTCCCAGCACTTCGTGCACCGCGATTTGGCCACCAGGAACTGCCTGGTCGGGGAGAACTTGCTGGTGAAAATCGGGGACTTTGGGATGTCCCGGGACGTGGAAAGCACTGACGAAGAAAGGGTCGGTGGCCACACAATGCTGCCCATTCGCTGGATGCCTCCAGAGAGCATCATGTACAGGAAATTCACGACGGAAAGCGACGTCTGGAGCCTGGGGGTCGTGTTGTGGGAGATTTTCACCTATGGCAAACAGCCCTGGTACCAGCTGTCAAACAATGAGGTGATAGAGTGTATCACTCAGGGCCGAGTCCTGCAGCGACCCCGCACGTGCCCCCAGGAGGTGTATGAGCTGATGCTGGGGTGCTGGCAGCGAGAGCCCCACATGAGGAAGAACATCAAGGGCATCCATACCCTCCTTCAGAACTTGGCCAAGGCATCTCCGGTCGAACTGGACATTCTAGGC [서열번호 14]

제2 코딩 서열이 TrkB 수용체의 작용제를 인코딩하며, 이는 바람직하게는 영양 인자의 뉴로트로핀 패밀리의 구성원인 것이 이해될 것이다. TrkB 수용체의 작용제는 프로-서열이 없는 영양 인자의 뉴로트로핀 패밀리의 구성원일 수 있다. TrkB 수용체의 작용제는 성숙 형태인 영양 인자의 뉴로트로핀 패밀리의 구성원일 수 있다. 따라서 TrkB 수용체의 바람직한 작용제는 뇌-유래 신경영양 인자(BDNF); 신경 성장 인자(NGF); 뉴로트로핀-3(NT-3); 뉴로트로핀-4(NT-4); 및 뉴로트로핀-5(NT-5); 또는 이의 단편으로 이루어지는 작용제 군으로부터 선택될 수 있다. TrkB 수용체의 바람직한 작용제는 프로-서열이 없는 뇌-유래 신경영양 인자(BDNF); 프로-서열이 없는 신경 성장 인자(NGF); 프로-서열이 없는 뉴로트로핀-3(NT-3); 프로-서열이 없는 뉴로트로핀-4(NT-4); 및 프로-서열이 없는 뉴로트로핀-5(NT-5); 또는 이의 단편으로 이루어지는 작용제 군으로부터 선택될 수 있다. TrkB 수용체의 바람직한 작용제는 성숙 뇌-유래 신경영양 인자(BDNF); 성숙 신경 성장 인자(NGF); 성숙 뉴로트로핀-3(NT-3); 성숙 뉴로트로핀-4(NT-4); 및 성숙 뉴로트로핀-5(NT-5); 또는 이의 단편으로 이루어지는 작용제 군으로부터 선택될 수 있다.

각각의 이들 작용제의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열은 당업자에게 공지되어 있을 것이다. 그러나, 예로서, 뉴로트로핀-4(NT-4)의 하나의 구현예의 아미노산 서열은 하기와 같이 실질적으로 서열번호 49에 나타낸 바와 같다:

MLPLPSCSLPILLLFLLPSVPIESQPPPSTLPPFLAPEWDLLSPRVVLSRGAPAGPPLLFLLEAGAFRESAGAPANRSRRGVSETAPASRRGELAVCDAVSGWVTDRRTAVDLRGREVEVLGEVPAAGGSPLRQYFFETRCKADNAEEGGPGAGGGGCRGVDRRHWVSECKAKQSYVRALTADAQGRVGWRWIRIDTACVCTLLSRTGRA [서열번호 49]

뉴로트로핀-4(NT-4)의 상기 구현예의 핵산 코딩 서열은 하기와 같이 실질적으로 서열번호 50에 나타낸 바와 같다:

ATGCTCCCTCTCCCCTCATGCTCCCTCCCCATCCTCCTCCTTTTCCTCCTCCCCAGTGTGCCAATTGAGTCCCAACCCCCACCCTCAACATTGCCCCCTTTTCTGGCCCCTGAGTGGGACCTTCTCTCCCCCCGAGTAGTCCTGTCTAGGGGTGCCCCTGCTGGGCCCCCTCTGCTCTTCCTGCTGGAGGCTGGGGCCTTTCGGGAGTCAGCAGGTGCCCCGGCCAACCGCAGCCGGCGTGGGGTGAGCGAAACTGCACCAGCGAGTCGTCGGGGTGAGCTGGCTGTGTGCGATGCAGTCAGTGGCTGGGTGACAGACCGCCGGACCGCTGTGGACTTGCGTGGGCGCGAGGTGGAGGTGTTGGGCGAGGTGCCTGCAGCTGGCGGCAGTCCCCTCCGCCAGTACTTCTTTGAAACCCGCTGCAAGGCTGATAACGCTGAGGAAGGTGGCCCGGGGGCAGGTGGAGGGGGCTGCCGGGGAGTGGACAGGAGGCACTGGGTATCTGAGTGCAAGGCCAAGCAGTCCTATGTGCGGGCATTGACCGCTGATGCCCAGGGCCGTGTGGGCTGGCGATGGATTCGAATTGACACTGCCTGCGTCTGCACACTCCTCAGCCGGACTGGCCGGGCC [서열번호 50]

NT-4 서열에 대한 신호 펩타이드의 아미노산 서열은 하기와 같이 실질적으로 서열번호 51에 나타낸 바와 같다:

MLPLPSCSLPILLLFLLPSVPIES [서열번호 51]

상기 신호 펩타이드의 핵산 서열은 하기와 같이 실질적으로 서열번호 52에 나타낸 바와 같다:

ATGCTCCCTCTCCCCTCATGCTCCCTCCCCATCCTCCTCCTTTTCCTCCTCCCCAGTGTGCCAATTGAGTCC [서열번호 52]

상기 NT-4 서열에 대한 프로펩타이드의 아미노산 서열은 하기와 같이 실질적으로 서열번호 53에 나타낸 바와 같다:

QPPPSTLPPFLAPEWDLLSPRVVLSRGAPAGPPLLFLLEAGAFRESAGAPANRSRR [서열번호 53]

상기 프로펩타이드의 핵산 서열은 하기와 같이 실질적으로 서열번호 54에 나타낸 바와 같다:

CAACCCCCACCCTCAACATTGCCCCCTTTTCTGGCCCCTGAGTGGGACCTTCTCTCCCCCCGAGTAGTCCTGTCTAGGGGTGCCCCTGCTGGGCCCCCTCTGCTCTTCCTGCTGGAGGCTGGGGCCTTTCGGGAGTCAGCAGGTGCCCCGGCCAACCGCAGCCGGCGT [서열번호 54]

상기 NT-4 서열에 대한 성숙 단백질 서열의 아미노산 서열은 하기와 같이 실질적으로 서열번호 55에 나타낸 바와 같다:

GVSETAPASRRGELAVCDAVSGWVTDRRTAVDLRGREVEVLGEVPAAGGSPLRQYFFETRCKADNAEEGGPGAGGGGCRGVDRRHWVSECKAKQSYVRALTADAQGRVGWRWIRIDTACVCTLLSRTGRA [서열번호 55]

상기 성숙 NT-4 단백질의 핵산 코딩 서열은 하기와 같이 실질적으로 서열번호 56에 나타낸 바와 같다:

GGGGTGAGCGAAACTGCACCAGCGAGTCGTCGGGGTGAGCTGGCTGTGTGCGATGCAGTCAGTGGCTGGGTGACAGACCGCCGGACCGCTGTGGACTTGCGTGGGCGCGAGGTGGAGGTGTTGGGCGAGGTGCCTGCAGCTGGCGGCAGTCCCCTCCGCCAGTACTTCTTTGAAACCCGCTGCAAGGCTGATAACGCTGAGGAAGGTGGCCCGGGGGCAGGTGGAGGGGGCTGCCGGGGAGTGGACAGGAGGCACTGGGTATCTGAGTGCAAGGCCAAGCAGTCCTATGTGCGGGCATTGACCGCTGATGCCCAGGGCCGTGTGGGCTGGCGATGGATTCGAATTGACACTGCCTGCGTCTGCACACTCCTCAGCCGGACTGGCCGGGCC [서열번호 56]

따라서, 하나의 바람직한 구현예에서, 제2 코딩 서열은 뉴로트로핀-4(NT-4)를 인코딩하며, 이는 실질적으로 서열번호 49 또는 55에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함할 수 있다. 따라서, 제2 코딩 서열은 실질적으로 서열번호 50 또는 56에 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함할 수 있다.

그러나 TrkB 수용체의 가장 바람직한 작용제에는 프리프로-뇌 유래 신경영양 인자(프리-프로-BDNF), 프로-BDNF 또는 성숙 BDNF(mBDNF)가 포함된다. BDNF는 처음에 소포체에서 확인되는 리보솜에 의해 전구체 단백질, 프리프로BDNF로 합성된다. 인간 프리프로BDNF 유전자(ENSG00000176697)에 인코딩되는 적어도 17개의 스플라이스 변이체가 공지되어 있다. 일단 프리프로BDNF가 조면 소포체 내로 들어가면, 프리프로BDNF는 신호 펩타이드의 절단에 의해 프로BDNF(즉 "프리" 서열)로 전환된다. 프로BDNF는 프로BDNF 상에 존재하는 추가 N-말단 펩타이드 서열의 절단에 의해 mBDNF로 전환된다. 이어서 프로BDNF 및 mBDNF가 둘 다 세포외 공간 내로 분비되고, 여기서 다양한 세포 상 수용체에 결합하고 이를 활성화한다.

프로BDNF는 우선적으로 수용체, p75^NTR에 결합하고 이를 활성화하며, 이는 활성화되는 경우 일부 세포 유형에서 아폽토시스를 유도할 수 있다. 따라서, 하나의 바람직한 구현예에서, 프로BDNF는 p75^NTR 수용체의 작용제이다. 하나의 구현예에서, 프로BDNF는 정규 프로BDNF이다. 바람직하게는, 정규 프로BDNF는 아래에 나타낸 바와 같이 본원에서 서열번호 15로 언급되는 아미노산 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함한다.

APMKEANIRGQGGLAYPGVRTHGTLESVNGPKAGSRGLTSLADTFEHVIEELLDEDQKVRPNEENNKDADLYTSRVMLSSQVPLEPPLLFLLEEYKNYLDAANMSMRVRRHSDPARRGELSVCDSISEWVTAADKKTAVDMSGGTVTVLEKVPVSKGQLKQYFYETKCNPMGYTKEGCRGIDKRHWNSQCRTTQSYVRALTMDSKKRIGWRFIRIDTSCVCTLTIKRGR [서열번호 15]

바람직하게는, 상기 구현예에서, 제2 코딩 서열은 아래에 나타낸 바와 같이 본원에서 서열번호 16으로 언급되는 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함한다:

GCCCCCATGAAAGAAGCAAACATCCGAGGACAAGGTGGCTTGGCCTACCCAGGTGTGCGGACCCATGGGACTCTGGAGAGCGTGAATGGGCCCAAGGCAGGTTCAAGAGGCTTGACATCATTGGCTGACACTTTCGAACACGTGATAGAAGAGCTGTTGGATGAGGACCAGAAAGTTCGGCCCAATGAAGAAAACAATAAGGACGCAGACTTGTACACGTCCAGGGTGATGCTCAGTAGTCAAGTGCCTTTGGAGCCTCCTCTTCTCTTTCTGCTGGAGGAATACAAAAATTACCTAGATGCTGCAAACATGTCCATGAGGGTCCGGCGCCACTCTGACCCTGCCCGCCGAGGGGAGCTGAGCGTGTGTGACAGTATTAGTGAGTGGGTAACGGCGGCAGACAAAAAGACTGCAGTGGACATGTCGGGCGGGACGGTCACAGTCCTTGAAAAGGTCCCTGTATCAAAAGGCCAACTGAAGCAATACTTCTACGAGACCAAGTGCAATCCCATGGGTTACACAAAAGAAGGCTGCAGGGGCATAGACAAAAGGCATTGGAACTCCCAGTGCCGAACTACCCAGTCGTACGTGCGGGCCCTTACCATGGATAGCAAAAAGAGAATTGGCTGGCGATTCATAAGGATAGACACTTCTTGTGTATGTACATTGACCATTAAAAGGGGAAGATAG [서열번호 16]

또 다른 구현예에서, 프로BDNF는 프로BDNF의 이소형 2이며, 이는 바람직하게는 발린에서 메티오닌으로의 돌연변이를 포함한다(밑줄 친 아미노산). 바람직하게는, 프로BDNF의 이소형 2는 아래에 나타낸 바와 같이 본원에서 서열번호 17로 언급되는 아미노산 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함한다:

APMKEANIRGQGGLAYPGVRTHGTLESVNGPKAGSRGLTSLADTFEHMIEELLDEDQKVRPNEENNKDADLYTSRVMLSSQVPLEPPLLFLLEEYKNYLDAANMSMRVRRHSDPARRGELSVCDSISEWVTAADKKTAVDMSGGTVTVLEKVPVSKGQLKQYFYETKCNPMGYTKEGCRGIDKRHWNSQCRTTQSYVRALTMDSKKRIGWRFIRIDTSCVCTLTIKRGR [서열번호 17]

그러나 하나의 구현예에서, 작용제는 프로BDNF, 또는 이의 단편 또는 변이체가 아니며, 대신에 제2 코딩 서열은 바람직하게는 성숙 BDNF를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 성숙 BDNF(mBDNF)는 우선적으로 TrkB에 결합하고 이를 활성화하며, 이는 활성화되는 경우 신경 세포의 생존을 촉진한다. 따라서 성숙 BDNF가 TrkB의 가장 바람직한 작용제이다. 제1 양태에 따른 작제물은 다른 공지된 유전자 작제물과 달리, 이 작제물이 미스폴딩되지 않은 성숙 BDNF 단백질을 생성할 수 있으므로 유리하다.

따라서, 하나의 바람직한 구현예에서, 제2 코딩 서열은 성숙 BDNF를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. mBDNF는 유전자에 의해 인코딩되는 모든 17개 이소형에 공통된다. 7개의 상이한 단백질 서열이 존재하며, 그 중 5개는 정규 형태에 대해 연장된 신호 서열을 갖고, 하나는 정규 신호 서열을 갖지만 발린에서 메티오닌으로의 돌연변이를 갖는다(이는 이소형 2, 4, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 및 16에 공통됨). 발린에서 메티오닌으로의 돌연변이는 세포로부터 BDNF의 방출을 감소시키는 것으로 여겨진다.

바람직하게는, 성숙 BDNF는 아래에 나타낸 바와 같이 본원에서 서열번호 18로 언급되는 아미노산 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함한다:

HSDPARRGELSVCDSISEWVTAADKKTAVDMSGGTVTVLEKVPVSKGQLKQYFYETKCNPMGYTKEGCRGIDKRHWNSQCRTTQSYVRALTMDSKKRIGWRFIRIDTSCVCTLTIKRGR [서열번호 18]

바람직하게는, 제2 코딩 서열의 상기 구현예는 아래에 나타낸 바와 같이 본원에서 서열번호 19로 언급되는 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함한다:

ATGACCATCCTTTTCCTTACTATGGTTATTTCATACTTTGGTTGCATGAAGGCTGCCCCCATGAAAGAAGCAAACATCCGAGGACAAGGTGGCTTGGCCTACCCAGGTGTGCGGACCCATGGGACTCTGGAGAGCGTGAATGGGCCCAAGGCAGGTTCAAGAGGCTTGACATCATTGGCTGACACTTTCGAACACGTGATAGAAGAGCTGTTGGATGAGGACCAGAAAGTTCGGCCCAATGAAGAAAACAATAAGGACGCAGACTTGTACACGTCCAGGGTGATGCTCAGTAGTCAAGTGCCTTTGGAGCCTCCTCTTCTCTTTCTGCTGGAGGAATACAAAAATTACCTAGATGCTGCAAACATGTCCATGAGGGTCCGGCGCCACTCTGACCCTGCCCGCCGAGGGGAGCTGAGCGTGTGTGACAGTATTAGTGAGTGGGTAACGGCGGCAGACAAAAAGACTGCAGTGGACATGTCGGGCGGGACGGTCACAGTCCTTGAAAAGGTCCCTGTATCAAAAGGCCAACTGAAGCAATACTTCTACGAGACCAAGTGCAATCCCATGGGTTACACAAAAGAAGGCTGCAGGGGCATAGACAAAAGGCATTGGAACTCCCAGTGCCGAACTACCCAGTCGTACGTGCGGGCCCTTACCATGGATAGCAAAAAGAGAATTGGCTGGCGATTCATAAGGATAGACACTTCTTGTGTATGTACATTGACCATTAAAAGGGGAAGATAG [서열번호 19]

또 다른 구현예에서, 작용제는 프로-서열이 없지만 신호 펩타이드가 N-말단에 콘주게이션된, 영양 인자의 뉴로트로핀 패밀리의 구성원이다. 작용제는 성숙 형태이고 신호 펩타이드가 N-말단에 콘주게이션된 영양 인자의 뉴로트로핀 패밀리의 임의의 구성원일 수 있다. 신호 펩타이드는 작용제의 적절한 폴딩 또는 생성을 촉진하는 임의의 신호 펩타이드일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 신호 펩타이드는 본원에 개시된 임의의 신호 펩타이드일 수 있다.

또 다른 바람직한 구현예에서, 작용제는 신호 펩타이드가 그 N-말단에 콘주게이션된 mBDNF이다. 아래에서 논의된 바와 같이, 신호 펩타이드는 프리프로BDNF의 정규 신호 펩타이드, 또는 IL-2의 신호 펩타이드, 또는 본 발명자들에 의해 생성된 새로운 신규 신호 서열일 수 있다.

바람직하게는, 제2 코딩 서열은 TrkB 수용체 작용제에 대한 신호 펩타이드, 가장 바람직하게는 BDNF에 대한 신호 펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 하나의 바람직한 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열은 BDNF에 대한 정규 신호 펩타이드를 인코딩한다. 바람직하게는, 제2 코딩 서열의 상기 구현예는 아래에 나타낸 바와 같이 본원에서 서열번호 20으로 언급되는 아미노산 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는 신호 펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다:

MTILFLTMVISYFGCMKA [서열번호 20]

바람직하게는, 제2 코딩 서열의 상기 구현예는 아래에 나타낸 바와 같이 본원에서 서열번호 21로 언급되는 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함한다:

ATGACCATCCTTTTCCTTACTATGGTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAGGCG [서열번호 21]

본 발명자들은 일련의 연장된 신호 펩타이드를 생성하였다. 바람직한 구현예에서, BDNF에 대한 이소형 신호 펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 이소형 2, 3, 6, 5 및 4로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 각각의 이러한 연장된 신호 펩타이드에 대한 핵산 및 아미노산 서열을 아래에 나타낸다.

이소형 2

MFHQVRRVMTILFLTMVISYFGCMKA [서열번호 22]

ATGTTCCACCAGGTGAGAAGAGTGATGACCATCCTTTTCCTTACTATGGTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAGGCG [서열번호 23]

이소형 3 및 6

MQSREEEWFHQVRRVMTILFLTMVISYFGCMKA [서열번호 24]

ATGCAGAGCCGGGAAGAGGAATGGTTCCACCAGGTGAGAAGAGTGATGACCATCCTTTTCCTT ACTATGGTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAGGCG [서열번호 25]

이소형 5

MLCAISLCARVRKLRSAGRCGKFHQVRRVMTILFLTMVISYFGCMKA [서열번호 26]

ATGCTCTGTGCGATTTCATTGTGTGCTCGCGTTCGCAAGCTCCGTAGTGCAGGAAGGTGCGGGAAGTTCCACCAGGTGAGAAGAGTGATGACCATCCTTTTCCTTACTATGGTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAGGCG [서열번호 27]

이소형 4

MCGATSFLHECTRLILVTTQNAEFLQKGLQVHTCFGVYPHASVWHDCASQKKGCAVYLHVSVEFNKLIPENGFIKFHQVRRVMTILFLTMVISYFGCMKA [서열번호 28]

ATGTGTGGAGCCACCAGTTTTCTCCATGAGTGCACAAGGTTAATCCTTGTTACTACTCAGAATGCTGAGTTTCTACAGAAAGGGTTGCAGGTCCACACATGTTTTGGCGTCTACCCACACGCTTCTGTATGGCATGACTGTGCATCCCAGAAGAAGGGCTGTGCTGTGTACCTCCACGTTTCAGTGGAATTTAACAAACTGATCCCTGAAAATGGTTTCATAAAGTTCCACCAGGTGAGAAGAGTGATGACCATCCTTTTCCTTACTATGGTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAGGCG [서열번호 29]

따라서, 바람직한 구현예에서, 제2 코딩 서열은 본원에서 서열번호 23, 25, 27 또는 29 중 어느 하나로 언급되는 신호 서열 펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 바람직하게는, 신호 펩타이드는 본원에서 서열번호 22, 24, 26 또는 28 중 어느 하나로 언급되는 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명자들은 또한 작용제, 바람직하게는 BDNF에 대한 신규 신호 펩타이드의 다양한 구현예를 생성하였다. 이들 신호 펩타이드는 N-말단 구획(라이신(K) 및 아르기닌(R) 잔기가 부가됨) 및 선행 소수성 영역(류신(L) 잔기가 부가됨)의 염기성 수준을 증가시키며, 이는 야생형 정규 신호 서열로 관찰되는 수준에 비해 BDNF의 분비를 증가시킨다.

a) QTA003P (IL-2 신호)

MYRMQLLSCIALSLALVTNS [서열번호 30]

ATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTTGCATTGCACTAAGTCTTGCACTTGTCACAAACAGT [서열번호 31]

b) QTA004P

MKRRVMIILFLTMVISYFGCMK [서열번호 32]

ATGAAAAGAAGAGTGATGATCATCCTTTTCCTTACTATGGTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAGAGCG [서열번호 33]

c) QTA009P ( 개질된 IL-2)

MRRMQLLLLIALSLALVTNS [서열번호 34]

ATGAGGAGGATGCAACTCCTGCTCCTGATTGCACTAAGTCTTGCACTTGTCACAAACAGT [서열번호 35]

d) QTA010P

MRRMQLLLLTMVISYFGCMKA [서열번호 36]

ATGAGGAGGATGCAACTCCTGCTCCTGACTATGGTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAGGCG [서열번호 37]

e) QTA0012P

MRILLLTMVISYFGCMKA [서열번호 38]

ATGAGAATCCTTCTTCTTACTATGGTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAGGCG [서열번호 39]

f) QTA0013P

MRRILFLTMVISYFGCMKA [서열번호 40]

ATGAGAAGAATCCTTTTCCTTACTATGGTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAGGCG [서열번호 41]

g) QTA0014P

MRRFLFLLVISYFGCMKA [서열번호 42]

ATGAGGAGGTTCCTTTTCCTTCTTGTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAGGCG [서열번호 43]

i) QTA0015P

MRRFLFLLYFGCMKA [서열번호 44]

ATGAGGAGGTTCCTTTTCCTTCTTTACTTCGGTTGCATGAAGGCG [서열번호 45]

도 6은 작용제, 바람직하게는 BDNF의 분비를 부스팅하기 위해 본 발명의 작제물에서 사용된 신호 펩타이드의 바람직한 추가 구현예에 대한 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열을 나타낸다. 신호 펩타이드에서 제2 잔기는 트레오닌(T)으로 이는 바람직하게는 하나 이상의 염기성 잔기, 예컨대 라이신(K) 또는 아르기닌(R)에 의해 대체된다. 이소류신(I), 류신(L), 페닐알라닌(F) 및 류신(L)을 포함하는 신호 펩타이드에서 잔기의 다음 연장부는 바람직하게는 하나 이상의 소수성 잔기에 의해 대체된다.

따라서, 바람직한 구현예에서, 제2 코딩 서열은 본원에서 서열번호 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101 또는 103 중 어느 하나로 언급되는 신호 서열 펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 바람직하게는, 신호 펩타이드는 본원에서 서열번호 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100 또는 102 중 어느 하나로 언급되는 아미노산 서열을 포함한다.

따라서, 본 발명자들이 프로-서열의 제거에 의해 BDNF 유전자 서열을 개질하였고, 이는 또한 이전에 결코 달성된 바 없었으며, 결과적으로 완전 신규 신호 펩타이드의 도입과 조합되어 적절히 폴딩된 성숙 BDNF를 생성하였고, 이는 이전까지 내인성 서열로 달성된 바를 초과하여 BDNF 생성 및 방출을 유의미하게 부스팅함이 이해될 것이다.

바람직하게는, 유전자 작제물은 왼쪽 및/또는 오른쪽 역방위 말단 반복 서열(ITR)을 포함한다. 바람직하게는, 각각의 ITR은 작제물의 5' 및/또는 3' 끝단에 배치된다. ITR은 바이러스(예로, AAV 또는 렌티바이러스) 혈청형에 특이적일 수 있고, 이것이 그 이차 구조에 헤어핀 루프를 형성하는 한, 임의의 서열일 수 있다.

ITR의 하나의 구현예(상업적으로 이용 가능한 AAV 플라스미드로부터의 왼쪽 ITR)의 DNA 서열은 본원에서 하기와 같이 서열번호 46으로 나타낸다:

CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT [서열번호46]

ITR의 또 다른 구현예(상업적으로 이용 가능한 AAV 플라스미드로부터의 오른쪽 ITR)의 DNA 서열은 본원에서 하기와 같이 서열번호 47로 나타낸다:

AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG [서열번호47]

상기로부터, 당업자는 제1 양태의 작제물의 하나의 구현예의 뉴클레오타이드 서열뿐만 아니라 인코딩된 트랜스유전자의 아미노산 서열을 이해할 것이다. 그러나, 의혹을 배제하기 위해, 플라스미드 QTA020P(및 벡터 QTA020V) 내에 함유된 쥣과 TrkB 수용체-바이러스-2A 펩타이드-mBDNF에 대해 코돈 최적화된 2940 bp 서열의 코딩 서열은 본원에서 하기와 같이 서열번호 107로 언급된다:

ATGAGCCCATGGCTGAAGTGGCACGGACCAGCAATGGCAAGACTGTGGGGCCTGTGCCTGCTGGTGCTGGGCTTCTGGAGAGCCAGCCTGGCCTGTCCAACCTCCTGCAAGTGTAGCTCCGCCAGGATCTGGTGCACAGAGCCTTCTCCAGGCATCGTGGCCTTTCCCCGCCTGGAGCCTAACAGCGTGGATCCCGAGAATATCACCGAGATCCTGATCGCCAACCAGAAGCGGCTGGAGATCATCAATGAGGACGATGTGGAGGCCTACGTGGGCCTGAGAAACCTGACAATCGTGGACTCCGGCCTGAAGTTCGTGGCCTATAAGGCCTTTCTGAAGAACTCTAATCTGAGGCACATCAACTTCACCCGCAATAAGCTGACATCTCTGAGCCGGAGACACTTTCGGCACCTGGATCTGTCCGACCTGATCCTGACCGGCAATCCATTCACATGCTCTTGTGACATCATGTGGCTGAAGACCCTGCAGGAGACAAAGTCTAGCCCCGATACCCAGGACCTGTACTGTCTGAACGAGTCCTCTAAGAATATGCCTCTGGCCAACCTGCAGATCCCTAATTGTGGACTGCCAAGCGCCCGGCTGGCCGCACCTAACCTGACAGTGGAGGAGGGCAAGTCCGTGACACTGTCCTGTTCTGTGGGCGGCGATCCCCTGCCTACCCTGTATTGGGACGTGGGCAACCTGGTGTCTAAGCACATGAATGAGACCTCCCACACACAGGGCTCTCTGAGAATCACAAATATCAGCTCCGACGATAGCGGCAAGCAGATCTCTTGCGTGGCAGAGAACCTGGTGGGAGAGGATCAGGACAGCGTGAATCTGACCGTGCACTTCGCCCCCACCATCACATTTCTGGAGTCTCCTACCAGCGATCACCACTGGTGCATCCCCTTCACAGTGCGGGGAAACCCAAAGCCCGCCCTGCAGTGGTTTTACAACGGCGCCATCCTGAATGAGTCCAAGTATATCTGTACCAAGATCCACGTGACCAACCACACAGAGTACCACGGCTGCCTGCAGCTGGATAATCCCACCCACATGAACAATGGCGACTACACACTGATGGCCAAGAACGAGTATGGCAAGGACGAGAGGCAGATCAGCGCCCACTTCATGGGCCGCCCTGGAGTGGATTATGAGACCAACCCTAATTACCCAGAGGTGCTGTATGAGGACTGGACCACACCTACCGATATCGGCGACACCACAAACAAGTCTAATGAGATCCCAAGCACAGATGTGGCCGACCAGTCTAACAGGGAGCACCTGAGCGTGTACGCAGTGGTGGTCATCGCCTCCGTGGTGGGCTTCTGCCTGCTGGTCATGCTGCTGCTGCTGAAGCTGGCCCGCCACTCTAAGTTTGGCATGAAGGGCCCAGCCTCCGTGATCTCTAATGACGATGACAGCGCCAGCCCCCTGCACCACATCAGCAACGGCTCCAATACCCCTTCTAGCTCCGAGGGCGGCCCAGATGCCGTGATCATCGGCATGACAAAGATCCCCGTGATCGAGAACCCTCAGTACTTCGGCATCACCAATTCCCAGCTGAAGCCTGACACATTTGTGCAGCACATCAAGCGGCACAACATCGTGCTGAAGAGGGAACTGGGAGAGGGAGCCTTCGGCAAGGTGTTTCTGGCCGAGTGCTATAACCTGTGCCCAGAGCAGGATAAGATCCTGGTGGCCGTGAAGACCCTGAAGGATGCCAGCGACAACGCCCGGAAGGACTTCCACAGAGAGGCCGAGCTGCTGACAAATCTGCAGCACGAGCACATCGTGAAGTTTTACGGCGTGTGCGTGGAGGGCGACCCTCTGATCATGGTGTTCGAGTATATGAAGCACGGCGATCTGAACAAGTTTCTGAGAGCACACGGACCAGATGCCGTGCTGATGGCAGAGGGAAATCCCCCTACCGAGCTGACACAGTCTCAGATGCTGCACATTGCACAGCAGATTGCAGCAGGAATGGTGTACCTGGCCAGCCAGCACTTCGTGCACAGGGATCTGGCAACCAGAAACTGCCTGGTGGGAGAGAATCTGCTGGTGAAGATCGGCGACTTTGGCATGTCCCGGGACGTGTACTCTACCGACTACTATAGAGTGGGCGGCCACACAATGCTGCCCATCAGGTGGATGCCACCCGAGAGCATCATGTATCGCAAGTTCACCACAGAGTCTGACGTGTGGAGCCTGGGCGTGGTGCTGTGGGAGATCTTTACCTACGGCAAGCAGCCTTGGTATCAGCTGTCCAACAATGAAGTGATCGAGTGTATTACACAGGGACGCGTGCTGCAGAGGCCACGCACATGCCCCCAGGAGGTGTACGAGCTGATGCTGGGCTGTTGGCAGCGGGAGCCACACACCAGAAAGAACATCAAGAGCATCCACACACTGCTGCAGAATCTGGCCAAGGCCTCCCCCGTGTATCTGGACATCCTGGGCAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTATGAGAATCCTTCTTCTTACTATGGTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAGGCGCACTCCGACCCTGCCCGCCGTGGGGAGCTGAGCGTGTGTGACAGTATTAGCGAGTGGGTCACAGCGGCAGATAAAAAGACTGCAGTGGACATGTCTGGCGGGACGGTCACAGTCCTAGAGAAAGTCCCGGTATCCAAAGGCCAACTGAAGCAGTATTTCTACGAGACCAAGTGTAATCCCATGGGTTACACCAAGGAAGGCTGCAGGGGCATAGACAAAAGGCACTGGAACTCGCAATGCCGAACTACCCAATCGTATGTTCGGGCCCTTACTATGGATAGCAAAAAGAGAATTGGCTGGCGATTCATAAGGATAGACACTTCCTGTGTATGTACACTGACCATTAAAAGGGGAAGATAG [서열번호 107]

플라스미드 QTA029P(및 벡터 QTA029V) 내에 함유된 인간 TrkB 수용체-바이러스-2A 펩타이드-mBDNF에 대해 코돈 최적화된 2943 bp 서열의 코딩 서열은 본원에서 하기와 같이 서열번호 108로 언급된다:

ATGTCATCTTGGATCCGCTGGCACGGGCCAGCGATGGCCCGATTGTGGGGCTTCTGCTGGCTTGTTGTAGGCTTCTGGCGCGCGGCGTTCGCGTGTCCGACCTCTTGCAAATGCTCAGCAAGCCGAATTTGGTGCTCAGACCCTAGTCCAGGAATTGTTGCATTCCCCCGACTGGAACCAAACTCCGTCGACCCGGAGAATATAACTGAGATATTTATTGCAAATCAAAAACGCCTTGAAATCATTAACGAGGATGACGTGGAGGCCTACGTTGGTTTGAGAAATCTTACTATTGTCGACTCCGGACTTAAATTTGTAGCTCATAAAGCCTTCCTGAAGAACTCTAATCTGCAGCACATTAATTTCACGAGAAATAAGCTGACCAGCTTGTCCCGGAAGCATTTCCGCCATCTCGACCTGAGCGAGCTCATACTGGTCGGAAACCCATTTACGTGCTCCTGTGACATCATGTGGATCAAAACTCTGCAAGAGGCGAAAAGTAGTCCGGATACCCAAGACCTTTACTGTCTTAATGAAAGCTCAAAAAATATCCCGCTGGCCAACCTGCAGATACCGAACTGCGGACTTCCTAGTGCGAATTTGGCTGCCCCAAATCTTACCGTCGAAGAAGGCAAATCAATCACGCTTTCTTGTTCTGTAGCTGGAGATCCAGTGCCTAATATGTATTGGGACGTGGGTAACCTCGTCTCAAAACATATGAACGAAACGAGCCACACCCAGGGCTCTTTGCGGATAACAAACATCTCCTCTGATGATTCTGGAAAGCAAATCAGTTGCGTAGCTGAAAATCTGGTTGGCGAAGATCAAGATTCAGTCAATCTGACAGTCCATTTCGCCCCAACGATCACCTTTCTGGAGAGCCCAACTAGCGATCACCACTGGTGTATTCCGTTTACGGTAAAAGGAAATCCAAAACCTGCACTCCAATGGTTTTATAATGGAGCCATCTTGAATGAAAGCAAATATATCTGTACTAAAATCCATGTGACGAATCACACCGAGTATCACGGGTGTCTTCAATTGGATAATCCAACCCATATGAATAATGGTGATTATACTTTGATAGCGAAGAACGAATACGGCAAAGACGAAAAGCAAATATCCGCACATTTCATGGGTTGGCCTGGCATCGACGACGGTGCGAACCCGAACTACCCAGATGTTATTTACGAGGATTATGGGACTGCGGCAAACGACATTGGCGACACCACAAACCGAAGCAACGAGATACCAAGTACTGACGTCACTGACAAAACGGGTCGAGAGCATTTGTCTGTTTACGCCGTTGTTGTTATCGCCTCAGTTGTCGGATTTTGCCTGTTGGTCATGCTTTTCCTCCTGAAGCTCGCGCGACATTCCAAGTTTGGCATGAAGGGG CCAGCAAGTGTTATATCCAATGATGATGATAGCGCTTCTCCATTGCACCACATAAGTAACGGCTCAAACACGCCGTCATCTAGTGAAGGTGGACCAGACGCGGTCATTATAGGGATGACTAAAATTCCCGTAATCGAAAACCCTCAGTACTTCGGCATAACCAACAGTCAGCTTAAACCCGATACTTTCGTGCAGCACATCAAAAGGCACAACATAGTCCTCAAGCGCGAACTCGGGGAGGGAGCCTTCGGAAAGGTCTTTCTTGCTGAGTGCTATAATTTGTGTCCTGAGCAGGATAAAATTCTTGTGGCTGTAAAAACTCTCAAAGATGCTTCCGACAACGCACGGAAGGATTTTCATCGGGAGGCCGAACTGTTGACGAATTTGCAGCACGAGCATATAGTAAAGTTCTACGGGGTATGTGTTGAGGGGGACCCGTTGATTATGGTCTTCGAGTATATGAAGCACGGGGACCTGAACAAATTTTTGCGCGCCCATGGGCCTGATGCCGTCCTTATGGCAGAAGGGAACCCTCCAACAGAACTCACCCAGAGTCAGATGTTGCACATAGCGCAACAGATCGCGGCCGGCATGGTTTACCTGGCCAGTCAACACTTCGTGCATAGAGATCTTGCCACTCGCAACTGTTTGGTCGGGGAGAACCTTCTGGTTAAGATTGGTGACTTTGGTATGTCACGAGATGTGTATTCCACTGACTATTACAGAGTTGGGGGTCATACAATGCTTCCTATTCGGTGGATGCCCCCCGAATCCATCATGTACAGAAAGTTCACGACAGAGAGTGATGTT TGG AGT CTCGGCGTGGTGCTCTGGGAAATTTTCACATACGGAAAGCAGCCGTGGTATCAACTTAGCAACAATGAGGTGATAGAGTGTATTACACAGGGTCGGGTGTTGCAGCGCCCTCGAACGTGCCCACAAGAAGTATATGAACTTATGCTCGGGTGCTGGCAAAGAGAACCACATATGAGAAAAAATATCAAGGGGATACATACATTGCTTCAGAACTTGGCCAAGGCATCACCCGTCTACCTCGATATACTGGGCAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTATGAGAATCCTTCTTCTTACTATGGTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAGGCGCACTCCGACCCTGCCCGCCGTGGGGAGCTGAGCGTGTGTGACAGTATTAGCGAGTGGGTCACAGCGGCAGATAAAAAGACTGCAGTGGACATGTCTGGCGGGACGGTCACAGTCCTAGAGAAAGTCCCGGTATCCAAAGGCCAACTGAAGCAGTATTTCTACGAGACCAAGTGTAATCCCATGGGTTACACCAAGGAAGGCTGCAGGGGCATAGACAAAAGGCACTGGAACTCGCAATGCCGAACTACCCAATCGTATGTTCGGGCCCTTACTATGGATAGCAAAAAGAGAATTGGCTGGCGATTCATAAGGATAGACACTTCCTGTGTATGTACACTGACCATTAAAAGGGGAAGATAG [서열번호 108]

따라서, 가장 바람직한 구현에에서, 작제물은 실질적으로 서열번호 107 또는 108에 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함한다.

본 발명자들은 본 발명의 작제물을 포함하는 일련의 재조합 발현 벡터를 생성하였다.

따라서, 제2 양태에 따르면, 신경퇴행성 장애 또는 뇌졸중의 치료, 예방 또는 완화에서 사용하기 위한 제1 양태에 따른 유전자 작제물을 포함하는 재조합 벡터가 제공된다.

본원에 기재되는 작제물 및 발현 벡터는 신경 재생 및 생존을 촉진하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 벡터는 알츠하이머 질환, 헌팅턴 질환, 파킨슨 질환, 운동 뉴런 질환, 또는 뇌졸중의 치료, 예방 또는 완화를 위한 것이다. 본원에 기재되는 재조합 벡터는 본원에 기재된 바와 같은 임의의 치료 또는 용도를 위한 것일 수 있다.

재조합 벡터는 재조합 AAV(rAAV) 벡터일 수 있다. rAAV는 자연 발생 벡터 또는 하이브리드 AAV 혈청형을 갖는 벡터일 수 있다. rAAV는 AAV-1, AAV-2, AAV-3A, AAV-3B, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10,　및　AAV-11일 수 있다. 바람직하게는, rAAV는 rAAV 혈청형-2이다.

유리하게는, 재조합 AAV2는 숙주 유기체에서 최소 면역 반응을 유발하며 벡터 투여 후 적어도 1년 동안 지속될 수 있는 장기 트랜스유전자 발현을 매개한다.

본원에서 사용되는 용어 "재조합 AAV(rAAV) 벡터"는 적어도 하나의 말단 반복 서열을 함유하는 재조합 AAV-유래 핵산을 의미한다.

벡터의 바람직한 구현예를 도 2~5에 나타낸다.

제3 양태에 따르면, 대상체에서 신경퇴행성 장애 또는 뇌졸중을 치료하거나, 예방하거나, 완화하는, 또는 대상체에서 신경 재생 및/또는 생존을 촉진하기 위한 방법이 제공되며, 이 방법은 이러한 치료를 필요로 하는 대상체에 제1 양태에 따른 유전자 작제물, 또는 제2 양태에 따른 재조합 벡터의 치료 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.

일부 구현예에서, 방법은 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 운동 뉴런 질환, 헌팅턴 질환, 또는 본원에 개시되는 임의의 다른 신경퇴행성의 치료, 예방, 또는 완화를 위한 것일 수 있다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 유전자 작제물 또는 재조합 벡터는 유전자 치료법 기법에서 사용된다. 작제물 또는 벡터에 의해 인코딩되는 작용제는 작제물/벡터에 의해 또한 인코딩되는 TrkB를 활성화함으로써 뉴런 세포의 생존을 촉진한다.

또 다른 구현예에서, 작제물 및 벡터는 신경 재생 및/또는 생존을 촉진하기 위해 사용될 수 있다.

제1 양태에 따른 유전자 작제물, 또는 제2 양태에 따른 재조합 벡터가 약제에서 사용될 수 있고, 이는 신경퇴행성 장애 또는 뇌졸중을 치료하거나, 완화하거나, 예방하기 위한, 또는 신경 재생 및/또는 생존을 촉진하기 위한 단독치료법(본 발명의 제1 양태에 따른 유전자 작제물 또는 제2 양태에 따른 벡터의 사용)으로서 사용될 수 있음이 이해될 것이다. 대안적으로, 본 발명에 따른 유전자 작제물 또는 재조합 벡터는 신경퇴행성 장애 또는 뇌졸중을 치료하거나, 완화하거나, 예방하기 위한, 또는 신경 재생 및/또는 생존을 촉진하기 위한 공지된 치료법에 부가하여 또는 이와 조합되어 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 유전자 작제물 또는 재조합 벡터는 특히 조성물이 사용될 방식에 따라 여러 상이한 형태를 갖는 조성물에서 조합될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 조성물은 분말, 정제, 캡슐, 액체, 연고, 크림, 겔, 하이드로겔, 에어로졸, 스프레이, 마이셀 용액, 경피 패치, 리포좀 현탁액의 형태 또는 치료를 필요로 하는 사람 또는 동물에 투여될 수 있는 임의의 다른 적합한 형태일 수 있다. 본 발명에 따른 약제의 비히클은 이것이 주어지는 대상체에 의해 잘 관용되는 것이어야 함이 이해될 것이다.

본 발명에 따른 유전자 작제물 또는 재조합 벡터는 또한 서방성 또는 지연-방출 장치 내에 도입될 수 있다. 이러한 장치는, 예를 들어 피부 상에 또는 아래에 삽입될 수 있고, 약제는 수 주 또는 심지어 수 개월에 걸쳐 방출될 수 있다. 장치는 적어도 치료 부위에 인접하여 배치될 수 있다. 이러한 장치는 유전자 작제물 또는 재조합 벡터로의 장기 치료가 요구되는 경우 그리고 보통 빈번한 투여(예로, 적어도 매일 주사)를 필요로 할 경우 특히 유리할 수 있다.

바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 약제는 혈류, 신경 내로 또는 직접 치료를 필요로 하는 부위 내로 주사에 의해 대상체에 투여될 수 있다. 예를 들어, 약제는 혈액-뇌-장벽을 통과하도록 구성된다. 주사는 정맥내(볼루스 또는 주입) 또는 피하(볼루스 또는 주입) 또는 피내(볼루스 또는 주입)일 수 있다.

요구되는 유전자 작제물 또는 재조합 벡터의 양이 그 생물학적 활성 및 생체이용률에 의해 결정되고, 이는 다시 투여 방식, 유전자 작제물 또는 재조합 벡터의 물리화학적 특성 및 이것이 단독치료법으로서 또는 조합 치료법에서 사용되는지 여부에 의존함이 이해될 것이다. 투여 빈도는 또한 치료받는 대상체 내에서 순환 폴리펩타이드의 반감기에 의해 영향받을 것이다. 투여될 최적 투여량은 당업자에 의해 결정될 수 있고, 사용 중인 특정 유전자 작제물 또는 재조합 벡터, 약학적 조성물의 강도, 투여 방식, 및 장애의 진행 또는 단계와 함께 변할 것이다. 치료받는 특정 대상체에 따라, 대상체 연령, 체중, 성별, 식이, 및 투여 시점을 포함하는 추가 요인이 투여량을 조정하는 것을 필요로 할 것이다.

일반적으로, 사용되는 유전자 작제물 또는 재조합 벡터에 따라, 본 발명에 따른 작제물 또는 벡터의, 0.001 ㎍/체중㎏ 내지 10 ㎎/체중㎏, 또는 0.01 ㎍/체중㎏ 내지 1 ㎎/체중㎏의 1일 용량이 신경퇴행성 장애, 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 헌팅턴 질환, 운동 뉴런 질환, 또는 뇌졸중을 치료하거나, 완화하거나, 예방하기 위해 사용될 수 있다.

유전자 작제물 또는 재조합 벡터는 장애의 개시 전에, 동안, 또는 후에 투여될 수 있다. 1일 용량은 단회 투여(예로, 단회 1일 주사 또는 비강 분무 흡입)로서 제공될 수 있다. 대안적으로, 유전자 작제물 또는 재조합 벡터는 1일 동안 2회 이상의 투여를 필요로 할 수 있다. 일례로서, 유전자 작제물 또는 재조합 벡터는 0.07 ㎍ 내지 700 ㎎(즉 체중 70 ㎏을 가정하여)의 2개(치료받는 장애의 중증도에 따라 2개 이상)의 1일 용량으로서 투여될 수 있다. 치료를 수여받는 환자는 깨었을 때 제1 용량을, 이어서 저녁에(2회 용량 요법인 경우) 또는 이후 3~ 또는 4-시간 간격으로 제2 용량을 복용할 수 있다. 대안적으로, 서방성 장치는 반복 용량을 투여할 필요 없이 환자에게 본 발명에 다른 유전자 작제물 또는 재조합 벡터의 최적 용량을 제공하기 위해 사용될 수 있다.

공지된 절차, 예컨대 약학 산업(예로, 생체내 실험, 임상 시험 등)에서 통상적으로 채택되는 것들이 본 발명에 따른 유전자 작제물 또는 재조합 벡터의 특정 제형물 및 정확한 치료 요법(예컨대 제제의 1일 용량 및 투여 빈도)을 형성하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명자들은 이들이 먼저 TrkB 수용체 및 TrkB 수용체 작용제의 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 인코딩하는 유전자 작제물을 제시하는 것으로 여긴다.

제4 양태에 따르면, 제1 양태에 따른 유전자 작제물, 또는 제2 양태에 따른 재조합 벡터, 및 약학적으로 허용가능한 비히클을 포함하는 약학적 조성물이 제공된다.

제5 양태에 따르면, 제5 양태에 따른 약학적 조성물을 제조하는 방법이 제공되며, 이 방법은 제1 양태에 따른 유전자 작제물, 또는 제2 양태에 따른 재조합 벡터를 약학적으로 허용가능한 비히클과 접촉시키는 단계를 포함한다.

"대상체"는 척추동물, 포유류, 또는 가내 동물일 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 조성물 및 약제는 임의의 포유류, 예를 들어 가축(예로, 말), 애완 동물을 치료하기 위해 사용될 수 있거나, 다른 수의학적 적용에서 사용될 수 있다. 그러나 가장 바람직하게는, 대상체는 인간이다.

유전자 작제물, 재조합 벡터 또는 약학적 조성물의 "치료 유효량"은 대상체에 투여되는 경우, 신경퇴행성 장애, 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 헌팅턴 질환, 운동 뉴런 질환, 뇌졸중을 치료하기 위해, 또는 요망되는 효과, 예컨대 신경 재생 및/또는 생존 촉진을 생성하기 위해 필요한 상기 언급된 양인 임의의 양이다.

예를 들어, 사용되는 유전자 작제물, 재조합 벡터 또는 약학적 조성물의 치료 유효량은 약 0.01 ㎎ 내지 약 800 ㎎, 및 바람직하게는 약 0.01 ㎎ 내지 약 500 ㎎일 수 있다. 유전자 작제물, 재조합 벡터 또는 약학적 조성물의 양이 약 0.1 ㎎ 내지 약 250 ㎎, 가장 바람직하게는 약 0.1 ㎎ 내지 약 20 ㎎의 양인 것이 바람직하다.

본원에서 언급되는 "약학적으로 허용가능한 비히클"은 약학적 조성물의 제형화에서 유용한 당업자에게 공지된 임의의 공지된 화합물 또는 공지된 화합물들의 조합이다.

하나의 구현예에서, 약학적으로 허용가능한 비히클은 고체일 수 있고, 조성물은 분말 또는 정제의 형태일 수 있다. 약학적으로 허용가능한 고체 비히클에는 풍미제, 윤활제, 가용화제, 현탁제, 염료, 충전제, 활택제, 압축 보조제, 불활성 결합제, 감미제, 보존제, 염료, 코팅, 또는 정제-붕해제로도 작용할 수 있는 하나 이상의 성분이 포함될 수 있다. 비히클은 또한 캡슐화 물질일 수 있다. 분말에서, 비히클은 본 발명에 따른 미분된 활성 제제와의 혼합물인 미분된 고체이다. 정제에서, 활성 제제(예로, 본 발명에 따른 유전자 작제물 또는 재조합 벡터)는 적합한 비율로 필요한 압축 특성을 갖는 비히클과 혼합되고 요망되는 형태 및 크기로 압축될 수 있다. 분말 및 정제는 바람직하게는 최대 99%의 활성 제제를 함유한다. 적합한 고체 비히클에는, 예를 들어 인산칼슘, 스테아르산마그네슘, 활석, 당, 락토스, 덱스트린, 전분, 젤라틴, 셀룰로스, 폴리비닐피롤리딘, 저융점 왁스 및 이온 교환 수지가 포함된다. 또 다른 구현예에서, 약학적 비히클은 겔일 수 있고 조성물은 크림 등의 형태일 수 있다.

그러나, 약학적 비히클은 액체일 수 있고, 약학적 조성물은 용액 형태이다. 액체 비히클은 용액, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 엘릭서 및 가압 조성물을 제조하는 데 사용된다. 본 발명에 따른 유전자 작제물 또는 재조합 벡터는 약학적으로 허용가능한 액체 비히클, 예컨대 물, 유기 용매, 둘 다의 혼합물 또는 약학적으로 허용가능한 오일 또는 지방 중에 용해되거나 현탁될 수 있다. 액체 비히클은 다른 적합한 약학적 첨가제, 예컨대 가용화제, 유화제, 완충제, 보존제, 감미제, 풍미제, 현탁화제, 증점제, 컬러, 점도 조절제, 안정화제 또는 삼투압-조절제를 함유할 수 있다. 경구 및 비경구 투여를 위한 액체 비히클의 적합한 예에는 물(부분적으로는 상기와 같은 첨가제, 예로, 셀룰로스 유도체, 바람직하게는 나트륨 카복시메틸 셀룰로스 용액을 함유함), 알코올(1가 알코올 및 다가 알코올, 예컨대 글리콜을 포함함) 및 이의 유도체, 및 오일(예로, 분획화된 코코넛 오일 및 아라키스 오일)이 포함된다.　비경구 투여를 위해, 비히클은 또한 유성 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트 및 이소프로필 미리스테이트일 수 있다. 멸균 액체 비히클은 비경구 투여를 위한 멸균 액체 형태 조성물에서 유용하다. 가압 조성물을 위한 액체 비히클은 할로겐화 탄화수소 또는 다른 약학적으로 허용가능한 추진제일 수 있다.

멸균 용액 또는 현탁액인 액체 약학적 조성물은, 예를 들어, 근육내, 경막내, 경막외, 복강내, 정맥내 및 특히 피하 주사에 의해 이용될 수 있다. 유전자 작제물 또는 재조합 벡터는 투여 시 멸균수, 식염수, 또는 다른 적절한 멸균 주사용 매질을 사용해서 용해되거나 현탁될 수 있는 멸균 고체 조성물로서 제조될 수 있다.

본 발명의 유전자 작제물, 재조합 벡터 및 약학적 조성물은 다른 용질 또는 현탁화제(예를 들어, 용액을 등장성으로 만들기 충분한 식염수 또는 글루코스), 담즙 염, 아카시아, 젤라틴, 소르비탄 모노올레에이트, 폴리소르베이트 80(소르비톨의 올레에이트 에스테르 및 에틸렌 옥사이드와 공중합된 그 무수물) 등을 함유하는 멸균 용액 또는 현탁액 형태로 경구 투여될 수 있다. 본 발명에 따른 유전자 작제물, 재조합 벡터 또는 약학적 조성물은 또한 액체 또는 고체 조성물 형태로 경구 투여될 수 있다. 경구 투여에 적합한 조성물에는 고체 형태, 예컨대 알약, 캡슐, 과립, 정제, 및 분말, 그리고 액체 형태, 예컨대 용액, 시럽, 엘릭서, 및 현탁액이 포함된다.　비경구 투여에 유용한 형태에는 멸균 용액, 에멀젼, 및 현탁액이 포함된다.

추가 양태에 따르면, 시신경 장애 또는 달팽이관 장애를 치료하거나, 예방하거나 완화하는 데, 또는 신경 재생 및/또는 생존을 촉진하는 데 사용하기 위한, 제1 양태에 따른 유전자 작제물, 또는 제2 양태에 따른 재조합 벡터가 제공되며; 여기서 제2 코딩 서열은 뉴로트로핀 패밀리로부터의 영양 인자의 성숙 형태를 포함한다. 제2 코딩 서열은 신호 펩타이드를 포함할 수 있다. 작제물 또는 벡터는 작용제에 프로-서열이 없지만 신호 펩타이드를 갖도록 하는 것일 수 있다. 신호 펩타이드는 N-말단에 부착될 수 있고 작용제의 분비, 발현, 또는 폴딩을 부스팅할 수 있다. 제2 코딩 서열은 성숙 신경 성장 인자(NGF), 성숙 뉴로트로핀-3(NT-3), 성숙 뉴로트로핀-5(NT-5), 또는 이의 단편 또는 변이체 중 임의의 것을 포함할 수 있다.

본 발명이 임의의 핵산 또는 펩타이드 또는 이의 변이체, 유도체 또는 유사체로 연장되며, 이것이 이의 변이체 또는 단편을 포함하여, 본원에 언급되는 임의의 서열의 아미노산 또는 핵산 서열을 실질적으로 포함함이 이해될 것이다. 용어 "실질적으로 아미노산/뉴클레오타이드/펩타이드 서열", "변이체" 및 "단편"은 본원에서 언급되는 임의의 하나의 서열의 아미노산/뉴클레오타이드/펩타이드 서열과 적어도 40% 서열 동일성을, 예를 들어 서열번호 1~108 등으로서 확인되는 서열과 40% 동일성을 갖는 서열일 수 있다.

언급되는 임의의 서열과 65% 초과, 보다 바람직하게는 70% 초과, 더욱 바람직하게는 75% 초과, 더욱 더 바람직하게는 80% 초과의 서열 동일성인 서열 동일성을 갖는 아미노산/폴리뉴클레오타이드/폴리펩타이드 서열이 또한 고려된다. 바람직하게는, 아미노산/폴리뉴클레오타이드/폴리펩타이드 서열은 본원에서 언급되는 임의의 서열과 적어도 85% 동일성, 보다 바람직하게는 본원에서 언급되는 임의의 서열과 적어도 90% 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 92% 동일성, 더욱 더 바람직하게는 적어도 95% 동일성, 더욱 더 바람직하게는 적어도 97% 동일성, 더욱 더 바람직하게는 적어도 98% 동일성, 가장 바람직하게는 적어도 99% 동일성을 갖는다.

당업자는 2개의 아미노산/폴리뉴클레오타이드/폴리펩타이드 서열 간 동일성 백분율을 어떻게 계산하는지 이해할 것이다. 2개의 아미노산/폴리뉴클레오타이드/폴리펩타이드 서열 간 동일성 백분율을 계산하기 위해, 2개 서열의 정렬이 먼저 제조된 후, 서열 동일성 값이 계산되어야 한다. 2개 서열에 대한 동일성 백분율은 (i) 서열을 정렬하기 위해 사용되는 방법, 예를 들어, ClustalW, BLAST, FASTA, Smith-Waterman(상이한 프로그램에서 구현됨), 또는 3D 비교로부터의 구조 정렬; 및 (ii) 정렬 방법에 의해 사용되는 파라미터, 예를 들어, 국소 대 전체 정렬, 사용되는 페어-스코어 매트릭스(예로, BLOSUM62, PAM250, Gonnet 등), 및 갭-페널티, 예로, 함수 형태 및 상수에 따라 상이한 값을 취할 수 있다.

정렬을 수행한 후, 2개 서열 간 동일성 백분율을 계산하는 여러 상이한 방식이 존재한다. 예를 들어, (i) 가장 짧은 서열의 길이; (ii) 정렬의 길이; (iii) 서열의 평균 길이; (iv) 비-갭 위치의 수; 또는 (v) 오버행을 제외하고 동등화된 위치의 수로 동일성 수를 나눌 수 있다. 또한, 동일성 백분율이 또한 매우 길이 의존적임이 이해될 것이다. 따라서, 서열 페어가 짧을수록, 확률 상 일어날 것으로 예상할 수 있는 서열 동일성이 높다.

따라서, 단백질 또는 DNA 서열의 정확한 정렬은 복잡한 공정임이 이해될 것이다. 유명한 다중 정렬 프로그램(Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Research, 22, 4673-4680; Thompson et al., 1997, Nucleic Acids Research, 24, 4876-4882)은 본 발명에 따른 단백질 또는 DNA의 다중 정렬을 생성하기 위해 바람직한 방식이다. ClustalW에 대한 적합한 파라미터는 하기와 같을 수 있다: DNA 정렬에 있어서: 갭 개방 페널티 = 15.0, 갭 연장 페널티 = 6.66, 및 매트릭스 = 동일성. 단백질 정렬에 있어서: 갭 개방 페널티 = 10.0, 갭 연장 페널티 = 0.2, 및 매트릭스 = Gonnet. DNA 및 단백질 정렬에 있어서: ENDGAP = -1, 및 GAPDIST = 4. 당업자는 최적 서열 정렬을 위해 이들 및 다른 파라미터를 변화시키는 것이 필요할 수 있음을 인지할 것이다.

그 후, 바람직하게는, 2개의 아미노산/폴리뉴클레오타이드/폴리펩타이드 서열 간 동일성 백분율의 계산이 이러한 정렬로부터 (N/T)*100으로 계산될 수 있고, 식 중 N은 서열이 동일한 잔기를 공유하는 위치의 수이고, T는 갭을 포함하지만 오버행을 제외하여 비교되는 위치의 총 수이다. 따라서, 2개의 서열 간 동일성 백분율을 계산하기 위해 가장 바람직한 방법은 (i) 예를 들어 상기 나타낸 바와 같은, 적합한 파라미터 세트를 사용하여 ClustalW 프로그램을 사용하는 서열 정렬을 수행하는 단계; (ii) N 및 T값을 하기 공식 내로 삽입하는 단계를 포함한다:

- 서열 동일성 = (N/T)*100

유사한 서열을 확인하기 위한 대안적 방법은 당업자에게 공지되어 있을 것이다. 예를 들어, 실질적으로 유사한 뉴클레오타이드 서열은 엄격한 조건 하에 DNA 서열 또는 이의 상보체에 혼성화하는 서열에 의해 인코딩될 것이다. 엄격한 조건이란, 본 발명자들은 뉴클레오타이드가 대략 45℃에서 3x 염화나트륨/시트르산나트륨(SSC)에 이어 대략 20~65℃에서 0.2x SSC/0.1% SDS 중 1회 세척으로 필터-결합된 DNA 또는 RNA에 혼성화함을 의미한다. 대안적으로, 실질적으로 유사한 폴리펩타이드는, 예를 들어, 서열번호 3 및 5에 나타낸 서열과 적어도 1개, 그러나 5개, 10개, 20개, 50개 또는 100개 미만의 아미노산만큼 상이할 수 있다.

유전자 코드의 축퇴로 인해, 본원에 기재되는 임의의 핵산 서열이 이에 의해 인코딩되는 단백질 서열에 실질적으로 영향을 미치지 않고 변이되거나 변화되어 이의 기능적 변이체를 제공할 수 있음이 명확하다. 적합한 뉴클레오타이드 변이체는 서열 내 동일한 아미노산을 인코딩하는 상이한 코돈의 치환에 의해 변경됨으로써, 침묵 변화를 생성하는 서열을 갖는 것들이다. 다른 적합한 변이체는 상동성 뉴클레오타이드 서열을 갖지만, 이것이 치환하는 아미노산과 유사한 생물리적 특성의 측쇄를 갖는 아미노산을 인코딩하는 상이한 코돈의 치환에 의해 변경되어 보존적 변화를 생성하는 일부 또는 전부 서열을 포함하는 것들이다. 예를 들어 소형 비-극성, 소수성 아미노산에는 글리신, 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 및 메티오닌이 포함된다. 대형 비-극성, 소수성 아미노산에는 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신이 포함된다. 극성 중성 아미노산에는 세린, 트레오닌, 시스테인, 아스파라긴 및 글루타민이 포함된다. 양으로 하전된(염기성) 아미노산에는 라이신, 아르기닌 및 히스티딘이 포함된다. 음으로 하전된(산성) 아미노산에는 아스파르트산 및 글루탐산이 포함된다. 따라서 어느 아미노산이 유사한 생물리적 특성을 갖는 아미노산으로 대체될 수 있는지가 이해될 것이며, 당업자는 이들 아미노산을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 알 것이다.

본원(모든 첨부 청구범위, 요약 및 도면 포함)에 기재된 모든 특성 및/또는 이렇게 개시된 모든 방법 또는 공정의 모든 단계는 이러한 특성 및/또는 단계의 적어도 일부가 상호 배타적인 조합을 제외하고, 임의의 조합으로 임의의 상기 양태와 조합될 수 있다.

본 발명의 더 우수한 이해를 위해, 그리고 이의 구현예가 어떻게 실제로 수행될 수 있는지를 나타내기 위해, 이제 예로서 첨부되는 도면에 대한 언급이 수행될 것이다:
도 1은 본 발명에 따른 유전자 작제물의 하나의 구현예의 모식도이다;
도 2는 정규 신호 서열(파란색) + 프로BDNF(빨간색) 및 mBDNF(검은색)를 함유하는 "플라스미드 QTA001PA"로 알려진 본 발명에 따른 재조합 벡터의 제1 구현예의 모식도이다. 여기에는 -IRES-GFP-서열(청록색 및 보라색)도 포함된다;
도 3은 프로BDNF를 갖지 않고(그러나 mBDNF만 생성함) QTA001PA와 동일한 신호 서열(파란색)을 갖는 "플라스미드 QTA002P"로 알려진 본 발명에 따른 재조합 벡터의 제2 구현예의 모식도이다. 여기에는 -IRES-GFP-서열(청록색 및 보라색)도 포함된다;
도 4는 프로BDNF를 갖지 않고(그러나 mBDNF만 생성함) IL-2 신호 서열(파란색)을 갖는 "플라스미드 QTA003P"로 알려진 본 발명에 따른 재조합 벡터의 제3 구현예의 모식도이다. 여기에는 -IRES-GFP-서열(청록색 및 보라색)도 포함된다;
도 5는 프로BDNF를 갖지 않고(그러나 mBDNF만 생성함) 신규 신호 서열(파란색)을 갖는 "플라스미드 QTA004P"로 알려진 본 발명에 따른 재조합 벡터의 제4 구현예의 모식도이다. 여기에는 -IRES-GFP-서열(청록색 및 보라색)도 포함된다;
도 6은 본 발명의 작제물에서 사용된 신호 펩타이드의 상이한 구현예에 대한 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열을 나타낸다. 제2 잔기는 하나 이상의 염기성 잔기, 예컨대 라이신(K) 또는 아르기닌(R)에 의해 대체될 수 있는 트레오닌(t)이다. 이소류신(I), 류신(L), 페닐알라닌(F) 및 류신(L)을 포함하는 잔기의 다음 연장부는 하나 이상의 소수성 잔기에 의해 대체될 수 있다;
도 7은 상이한 신호 펩타이드 서열을 가지며 연장된 프로BDNF 성분에 대한 코딩 서열이 없이 mBNDF에 대해 코딩하는 유전자를 함유하는 플라스미드의 형질도입(4 ㎍ DNA/웰) 24시간 후 특이적 ELISA를 사용한 HEK293 세포로부터의 BDNF의 방출을 나타낸다(데이터는 n = 4에 대해 평균 ± SEM으로 나타냄);
도 8은 플라스미드의 형질도입 24시간 후 HEK293 세포 용해액 중 BDNF-면역반응성 물질의 세포 농도(임의 단위)의 웨스턴 블로팅 결과를 나타낸다(데이터는 n = 4에 대해 평균 ± SEM으로 나타냄);
도 9는 세포가 QTA002P, QTA003P 및 QTA004P 형질도입으로의 단일 14 kDa 밴브에 비해 QTA001PA로 형질도입된 경우 2개 분자량 밴드(32 kDa 및 14 kDa)를 나타내는 세포 용해액의 웨스턴 블롯에서의 BDNF-면역반응성을 나타낸다;
도 10은 선택적 프로BDNF ELISA를 사용하여 플라스미드의 형질도입 24시간 후 특이적 ELISA를 사용하여 측정되는 HEK293 인큐베이션 배지 중 프로BDNF 농도를 나타낸다(데이터는 n = 4에 대해 평균 ± SEM으로 나타냄);
도 11은 플라스미드 QTA002P(내인성 정규 신호 펩타이드 서열), 및 QTA009P 내지 QTA013P에 의한 HEK293 세포 용해액 중 BDNF 발현을 나타낸다. 데이터는 평균 + S.E.M으로 나타낸다. ** QTA002P 대비 P<0.01;
도 12는 플라스미드 QTA002P(내인성 정규 신호 펩타이드 서열), 및 QTA009P 내지 QTA013P에 의한 HEK293 세포 인큐베이션 배지 중 BDNF 발현을 나타낸다. 데이터는 평균 + S.E.M으로 나타낸다. ** QTA002P 대비 P<0.01;
도 13은 세포가 플라스미드 QTA015P(IRES 스페이서에 의해 분리된 BDNF 및 eGFP를 발현함), QTA021P(기능적 바이러스-2A 펩타이드 서열에 의해 분리된 BDNF에 이어 eGFP를 발현함), QTA022P(비-기능적 바이러스-2A 펩타이드 서열에 의해 분리된 BDNF에 이어 eGFP를 발현함) 및 QTA023P(기능적 바이러스-2A 펩타이드 서열에 의해 분리된 eGFP에 이어 BDNF 코딩부를 발현함)로의 형질도입 24시간 후 HEK293 세포로부터의 웨스턴 블롯을 나타낸다. 데이터는 BDNF-면역반응성(A), eGFP-면역반응성(B) 및 HEK293 세포로부터 인큐베이션 배지 내로 방출된 BDNF의 양(C)으로 나타냄. 데이터는 밴드 밀도의 평균 + S.E.M으로 나타낸다;
도 14a는 QTA020V 벡터로의 전달감염 48시간 후 HEK293 세포 균질액의 웨스턴 블롯을 나타내며 바이러스-2A 펩타이드 서열에 의해 분리된 TrkB 수용체 및 BDNF를 포함하는 대형 전구체 코딩 영역의 효율적 가공을 나타낸다. 도 14b 및 14c는 바이알-2A 펩타이드 절단 후 생성된 트랜스유전자 단백질이 가공 후 HEK293 세포에서 정확한 세포내 구획(TrkB 수용체는 세포 표면으로 그리고 BDNF는 방출 전 저장 소포로)으로 수송되었음을 나타낸다;
도 15a 는 TrkB 수용체 발현을 나타내며 도 15b는 rAAV2 벡터, QTA020V에 대한 마우스 망막 균질액 중 BDNF 발현을 나타낸다. 데이터는 마우스 망막 균질액의 웨스턴 블롯에서 밀도의 평균 + S.E.M으로 나타낸다. ** 나이브(미-주사 동물) 대비 P<0.01;
도 16은 바이러스-2A 펩타이드 서열에 의해 분리된, TrkB 수용체 및 BDNF에 대한 코딩을 함유하는 rAAV2 벡터인 QTA020V의 주사 후 면역세포화학에 의해 나타낸 바와 같은 마우스 망막 신경절 세포층에서의 TrkB(A) 및 BDNF(B) 트랜스유전자의 발현을 나타낸다.
도 17은 rAAV2-CAG-eGFP 벡터로 처리된 대조군 동물 대비 마우스에서의 시신경 압궤(ONC) 후 망막 신경절 세포(RGC) 생존을 나타낸다. 데이터는 망막 평탄-실장에서 Brn3A-양성 세포에 의해 계수되는 동물 당 망막에 걸친 망막 신경절 세포의 평균수에 대한 평균 + S.E.M.으로 나타낸다. 대조군 대비 *** P<0.001, * P<0.05;
도 18은 트랜스유전자를 발현하지 않는(공(Null) 바이러스), BDNF 단독(QTA027V), TrkB 단독(QTA025V) 및 BDNF 및 TrkB 둘 다(QTA020V)를 발현하는 rAAV2 바이러스 벡터로의 전달감염 후 웨스턴 블로팅에 의한 미분화 인간 SH-SY5Y 신경모세포종 세포 균질액 중 BDNF(도 18a) 및 TrkB(도 18b) 트랜스유전자의 발현을 나타낸다. 도 18c는 공 바이러스 벡터, QTA020V, QTA025V 또는 QTA027V로의 전달감염 후 웨스턴 블롯에서 SH-SY5Y 세포에서의 활성화된 인산화 TrkB 수용체 수준을 나타낸다. BDNF 및 TrkB를 둘 다 발현하는 QTA020V 벡터 단독은 전달감염되지 않은 세포에 비해, TrkB 수용체 활성화를 유의미하게 증가시키는 것으로 확인되었다(**P<0.01; ANOVA에 이어 다중 비교를 위한 본페로니 개질 t-테스트). 데이터는 n = 4 실험에 있어서 평균 + S.E.M.으로 나타낸다;
도 19는 TUNEL 염색에 의해 과산화수소(H₂O₂ 0.1 mM 또는 1.0 mM)의 첨가에 의해 생성된 산화적 스트레스에 대한 노출 후 배양 중인 미분화 SH-SY5Y 세포의 아폽토시스 세포사 수준을 나타낸다. 과산화수소의 첨가 전, BDNF 및 TrkB 수용체를 둘 다 발현하는 rAAV2 벡터 QTA020V로 전달감염된 세포는 미처리 세포에 비해 아폽토시스에 대해 유의미하게 보호되는 것으로 확인되었다(**P<0.01; ANOVA에 이어 다중 비교를 위한 본페로니 개질 t-테스트). 데이터는 n = 6~10에 대해 평균 + S.E.M.으로 나타낸다;
도 20은 P301S 돌연변이체 인간 타우 트랜스제닉 마우스로부터 수득되고 위치 세린 396/세린 404(PHF-1) 또는 세린 202/세린 205(AT8)에서 인산화된 타우를 인식하는 항체로 염색된 시신경의 대표 면역세포화학 이미지를 나타낸다. 마우스는 3월령에 rAAV2 벡터 QTA020V(mBDNF 및 TrkB 수용체를 모두 발현함)가 유리질내 주사되었고, 3주 후 면역세포화학을 위한 시신경 제거 전에 희생시켰다.

하기 실시예는 신경 재생 및/또는 생존을 촉진하기 위한 본 발명의 구현예의 용도를 실증한다. 실시예에 개시된 용도, 방법, 및 치료로부터 유도될 수 있는 교시도 본원에 개시된 바와 같은 신경퇴행성 장애 및 뇌졸중의 치료에 적용 가능하다.

방법 및 물질

분자 클로닝 및 플라스미드 작제물

DNA 서열에 대한 코돈 최적화를 온-라인 툴(http://www.idtdna.com/CodonOpt)을 사용하여 수행하고 DNA 블록은 Integrated DNA technologies, Inc.(IDT; 9180 N. McCormick Boulevard, Skokie, IL 60076-2920, USA) 또는 GenScript(860 Centennial Ave, Piscataway, NJ 08854, USA)에서 합성하였다. 마스터 플라스미드 QTA001PA 및 후속 플라스미드를 제조하기 위한 클로닝은 표준 분자 생물학 및 클로닝 기법을 사용하여 수행하였다.

플라스미드 스케일 업 및 정제

DNA 플라스미드를 하룻밤 동안 SURE 적격 세포(Agilent Technologies; cat. #200238)에서 스케일 업하여 maxi-prep 정제 후 2.29 ㎍/㎕ 플라스미드를 제공하였다. 잔여 플라스미드를 최대 500 ㎍ 스케일 및 최소 내독소가 존재하는 형질도입 품질로 스케일 업하였다.

HEK293 배양 및 플라스미드 DNA를 이용한 세포 형질도입

HEK293 세포(400,000개 세포)를 80% 융합성까지 10% 우태 혈청(FBS), 1% 페니실린 및 1% 스트렙토마이신(1% Pen/Strep)을 함유하는 1.5 ㎖ Dulbecco 최소 필수 배지(DMEM) 중 폴리-L-라이신(10 ㎍/㎖, Sigma-Aldrich; cat. #P1274) 코팅된 6웰 플레이트에서 배양하였다. 이어서 배지를 2 ㎖ DMEM(첨가제 없음)으로 교환하였다. 2 내지 3시간 후, 4 ㎍ 플라스미드 DNA + 10 ㎕ 리포펙타민(4 ㎕/㎖; Thermo Fisher Scientific; cat. #12566014)을 함유하는 추가 0.5 ㎖ 전달감염 배지를 각각의 웰에 첨가하여 전달감염 기간 동안 상청액 수집을 위해 2.5 ㎖의 총 부피를 생성하였다.

SH-SY5Y 배양 및 rAAV2 바이러스 벡터로의 세포 전달감염

SH-SY5Y 세포를 폴리-L-라이신(10 ㎍/㎖, Sigma 제품 #P1274)으로 코팅된 6웰 플레이트(300,000개 세포), 96웰 플레이트(10,000개 세포) 또는 13 ㎜ 유리 커버슬립(100,000개 세포) 상에서 배양하였다. 10% 우태 혈청(FBS), 1% 페니실린 및 1% 스트렙토마이신(1% Pen/Strep)을 함유하는 Dulbecco 최소 필수 배지(DMEM)를 사용하여 세포를 37℃에서 80% 융합성까지 배양한 후 전달감염 전에 첨가제가 없는 DMEM으로 교환하였다. 사용된 DMEM 부피는 6웰 플레이트(2 ㎖), 96웰 플레이트(100 ㎕), 커버슬립(500 ㎕)이었다. PBS 중 희석된 벡터를 직접 배양 배지로 1.0×10¹⁰(VP)/㎖의 최종 농도로 첨가하고 37℃에서 48시간 동안 인큐베이션하였다.

과산화수소-유도된 SH-SY5Y 세포사 및 TUNEL 염색

SH-SY5Y 세포 전달감염 48시간 후, 배지를 신선 DMEM(첨가제 비함유)으로 교환하였다. 과산화수소(H₂O₂)(Thermo Fisher Scientific; 제품 #BP2633500, 로트 #1378087)를 여과수(0.1 또는 1.0 mM 농도로) 중에 희석하고 추가 24시간 동안 동일 부피의 웰 또는 플레이트에 첨가하였다. 여과수는 비히클 대조군으로 작용하였다. 커버슬립을 PBS 중 2회 세척하고 실온에서 1 M 인산염 완충 식염수(PBS) 중 4% 파라포름알데하이드에서 30분 동안 고정하였다. PBS 중 3회 더 세척 후, 세포를 차단하고 실온에서 60분 동안 PBS 중 5% 일반 염소 혈청(NGS), 3% 소 혈청 알부민(BSA) 및 0.3% Triton X-100에서 인큐베이션에 의해 투과화하였다. 이어서 세포를 차단 용액 중 희석된 TrkB에 대한 상업적 토끼 폴리클로날 항체(Abcam; 제품 # ab33655, 로트 # GR232306-1, 1:500 희석도), 토끼 폴리클로날 항-BDNF 항체(Santa Cruz Biotechnology Inc; 제품# sc-546; 로트# CO915, 1:300 희석도) 또는 p-Tyr⁵¹⁵-TrkB(Abcam 제품# ab109684 로트# GR92849-4, 1:750)와 4℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 실온에서 2시간 동안 alexa fluor 488에 콘주게이션된 이차 항-토끼 항체(Life Technologies; 제품 # A11034, 1:1000)를 사용하여 염색을 드러내었다. TUNEL 염색(Promega; 제품 #G3250; 로트 #0000215719)을 위해, 세포를 PBS 중 3회 세척하고, 10분 동안 TUNEL 평형화 완충액 중에 침지시켰다. 제조업체의 프로토콜에 따라 TUNEL 반응 혼합물을 제조하고 100 ㎕/커버슬립을 37℃에서 1시간 동안 세포에 첨가하였다. 15분 동안 1X 표준 시트레이트 용액(SCS) 중에 인큐베이션하여 반응을 정지시켰다. 세포 핵을 1 ㎍/㎖ DAPI(Thermo Scientific; 제품 #D1306, 1:8000)로 카운터염색하였다. 세포를 3회 더 세척한 후 이미지화 전에 fluorSave™ 시약(Calbiochem/EMD Chemicals Inc., Gibbstown, NJ, USA)과 함께 실장하였다. 20X 대물렌즈 및 Leica DM6000 에피형광 현미경(Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)을 사용하여 이미지화를 수행하였다.

ELISA에 의한 BDNF 측정

HEK293 세포로부터 분비된 BDNF의 양을 전달감염 24시간 후 세포 배양 배지 중에 측정하였다. 배지를 원심분리하여 파편을 제거하고 상업적 인간 BDNF ELISA 키트(Sigma-Aldrich, 제품# RAB0026)를 사용하여 측정하였다. 샘플을 신선 제조된 BDNF 표준물질과 비교하여 BDNF 농도를 결정하였다.

BDNF 및 TrkB 수용체에 대한 웨스턴 블로팅

DMEM 인큐베이션 배지를 제거하고, 저온 인산염 완충 식염수 중에 세포를 세척하고, 350 ㎕ 신선 제조 용해 완충액(10 ㎖ 용해-M 시약 + 1개 정제의 complete Mini 프로테아제 억제제 칵테일, Roche; cat. #04719964001, + 100 ㎕ Halt 포스파타제 억제제 칵테일(100X), Thermo Scientific; cat. #78428)을 웰에 첨가하여 HEK293 세포 내 BDNF 및 TrkB-면역반응성의 양을 측정하였다. 세포 균질화 후, BCA 검정(Pierce BCA 단백질 검정 키트, Thermo Scientific; cat. #23227)을 사용하여 단백질 현탁액을 정량하였다. 6 ㎍ 내지 15 ㎍ HEK293 세포 용해액 단백질/레인을 비스-트리스 겔(12% NuPAGE Novex; cat. #NP0342BOX, Thermo Scientific)에 흘리고 하룻밤 동안 인큐베이션한 일차 토끼 폴리클로날 항-BDNF 항체(Santa Cruz Biotechnology Inc; 제품# sc-546; 1:500 희석), 토끼 폴리클로날 항-TrkB 항체(Abcam; cat. #ab33655, 1:2000 희석으로 사용) 또는 eGFP 항체(Abcam 제품 #ab-290, 1:500으로 사용)를 사용하여 웨스턴 블로팅에 의해 조사하였다. 일차 항체를 HRP 콘주게이션된 항-토끼 항체(벡터 Laboratories; cat. #PI-1000, 1:8000)로 가시화하고, ECL Prime(Amersham, GE Healthcare, UK) 및 Alliance 웨스턴 블로팅 이미지화 시스템(UVItec Ltd, Cambridge, UK)으로 신호를 검출하였다. 마우스 망막의 웨스턴 블로팅을 위해, 벡터-처리된 동물의 눈을 500 ㎕ 신선 제조 용해 완충액(10 ㎖ 용해-M 시약 + 1개 정제의 cOmplete Mini 프로테아제 억제제 칵테일, Roche 제품# 04719964001 + 100 ㎕ Halt 포스파타제 억제제 칵테일(100X), Thermo Scientific 제품# 78428) 중에 균질화하였다. 조직을 1분 동안 손상시킨 후(Qiagen, TissueRuptor 제품# 9001273) 추가 15분 동안 얼음 상에 유지했다. 이어서 단백질을 상술된 바와 같이 웨스턴 블로팅에 의해 분석하였다.

면역세포화학

HEK293 세포(70,000개)를 4웰 플레이트 내에서 13 ㎜, 폴리-L-라이신으로 코팅된 커버슬립 상에 접종하고 0.5 ㎖ 배지 중 10% FBS 및 1% Pen/Strep을 함유하는 DMEM 중에 인큐베이션하였다. 세포를 80% 융합성까지 성장시킨 후, 배지를 2~3시간 동안 0.4 ㎖ DMEM(첨가제 비함유)으로 교환한 후, 최종 부피가 0.5 ㎖에 도달하도록 추가 0.1 ㎖ 전달감염 배지(0.8 ㎍ 플라스미드 DNA + 2 ㎕ 리포펙타민)를 첨가하였다. 커버슬립을 PBS 중 2회 세척하고 실온에서 1 M 인산염 완충 식염수(PBS) 중 4% 파라포름알데하이드에서 30분 동안 고정하였다. PBS 중 3회 더 세척 후, 세포를 차단하고 실온에서 60분 동안 PBS 중 5% 일반 염소 혈청(NGS), 3% 소 혈청 알부민(BSA) 및 0.3% Triton X-100에서 인큐베이션에 의해 투과화하였다. 이어서 세포를 차단 용액 중에 희석된 BDNF(Santa Cruz Biotechnology Inc; 제품# sc-546; 1:300 희석) 또는 TrkB(Abcam 제품# ab33655, 1:500 희석)에 대한 상업적 토끼 폴리클로날 항체와 4℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 실온에서 2시간 동안 alexa fluor 647에 콘주게이션된 이차 항-토끼 항체(Invitrogen, 제품# A21248, 1:1000)를 사용하여 염색을 드러내었다. 또한 세포 핵을 1 ㎍/㎖ DAPI(Thermo Scientific, 제품# D1306, 1:8000)로 카운터염색하였다. 세포를 3회 더 세척한 후 이미지화 전에 fluorSave™ 시약(Calbiochem/EMD Chemicals Inc., Gibbstown, NJ, USA)과 함께 실장하였다. 3X 디지털 줌 및 0.5~0.8 순차 스캐닝 z-스텝 간격을 사용해서 20X 대물렌즈 및 Leica DM6000 에피형광 현미경(Leica Microsystems, Wetzlar, Germany) 또는 63X 오일 대물렌즈가 장착된 Leica SP5 공초점 현미경(Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)을 사용해서 이미지화를 수행하였다.

대조군 또는 벡터 처리된 동물로부터의 망막 구조 및 시신경에 대한 면역세포화학을 위해(주사 후 3 내지 4주차에), 조심스럽게 절제된 눈을 하룻밤 동안 4% 파라포름알데하이드/0.1% PBS(pH 7.4) 중에 고정하고 4℃에서 30% 수크로스/0.1% PBS 중에 탈수하였다(24시간). 이어서 눈을 최적 절단 온도 화합물(OCT)(Sakura Finetek, Zoeterwoude, Netherlands)을 함유하는 실리콘 몰드 중에 포매하고 드라이 아이스 상에서 냉동시켰다. 망막의 등-배/상-하 축을 통한 13 ㎛ 섹션 또는 P301S 마우스의 시신경을 통한 종단 섹션을 Bright OTF 5000 크리오스타트(cryostat)(Bright Instruments, Huntingdon, UK)를 사용해서 superfrost plus 슬라이드(VWR 제품# 631-0108) 상에 수집하였다. 슬라이드를 PBS 중에 3회 세척하고, 실온에서 60분 동안 PBS 중 5% 일반 염소 혈청(NGS), 3% 소 혈청 알부민(BSA) 및 0.3% Triton X-100에서 투과화하였다. 이어서 차단 용액 중에 희석된 BDNF(Santa Cruz Biotechnology Inc; 제품# sc-546 1:300), TrkB(Abcam; 제품# ab33655 1:500), 타우 Ser^396/404(PHF-1; Cambridge에서 생성, 1:500) 또는 타우 Ser^202/205(AT8; Invitrogen 제품# MN1020 1:500)에 대한 상업적 토끼 폴리클로날 항체와 4℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 실온에서 2시간 동안 alexa fluor 647에 콘주게이션된 이차 항-토끼 항체(Invitrogen, 제품# A21248, 1:1000)를 사용하여 염색을 드러내었다. 망막 세포 핵을 또한 1 ㎍/㎖ DAPI(Thermo Scientific, 제품# D1306, 1:8000)로 카운터염색하였다. 슬라이드를 3회 더 세척한 후 이미지화 전에 fluorSave™ 시약(Calbiochem/EMD Chemicals Inc., Gibbstown, NJ, USA)과 함께 실장하였다. 3X 디지털 줌 및 0.5~0.8 순차 스캐닝 z-스텝 간격을 사용해서 20X 대물렌즈 및 Leica DM6000 에피형광 현미경(Leica Microsystems, Wetzlar, Germany) 또는 63X 오일 대물렌즈가 장착된 Leica SP5 공초점 현미경(Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)을 사용해서 이미지화를 수행하였다.

유리체내 주사

7~10일 순응 기간 후, 12주령 C57/BL.6 또는 16주령 P301S(Harlan labs, Bicester, U.K.) 마우스를 다양한 연구군으로 무작위화하였다. 이어서 이들을 케타민(50 ㎎/㎏) 및 실라진(5 g/㎏)의 복강내 주사로 마취하였다. 국소 1% 테트라카인 점안제를 연구 1일차에 투여하였다. 1% 트로피카미드 점안제를 사용해서 동공을 확장시켰다. 수술 현미경을 사용하여, 30-게이지 바늘로 부분-두께 공막 파일로트 구멍을 만들어서 30 ㎛의 팁 지름 및 2.5 ㎜의 팁 길이를 갖는 미세 금속 마이크로피펫에 의한 기저 공막, 맥락막 및 망막의 침투를 촉진하였다. 이어서 마이크로피펫을 10 ㎕ 유리 시린지(Hamilton Co., Reno, NV)에 연결한 후, 군에 따라 피펫 내로 2 ㎕의 벡터 현탁액을 흡인하였다. 유리체내 주사 동안 수정체 침투 또는 와정맥 손상을 회피하기 위해 주의를 기울였다. 주사 부위는 상-측두 둘레의 대략 3 ㎜ 뒤를 목표로 하였다. 1분에 걸쳐 느리게 주사를 제공하여 벡터 현탁액의 확산을 허용하였다. 오른쪽 눈을 건드리지 않고 놔두어 내부 반대쪽 대조군으로 사용하였다.

시신경 압궤(ONC)

벡터 투여 3주(21일) 후, 마우스로 ONC 시술을 거치거나, 미처리 상태로 놔두거나, 모의(sham)-압궤하였다. 양안 수술경 하에, 안구 아래에서 시작해서 눈 측두 주위로 결막에 용수철 가위를 사용하여 소형 절개를 수행하였다. 이렇게 해서 안구의 후방 측면을 노출시켜 시신경을 가시화하였다. 노출된 시신경을 10초 동안 크로스-액션 겸자(Dumont #N7 cat. #RS-5027; Roboz)로 안구로부터 대략 1~3 ㎜를 신경에 압력을 가하는 자가-클램핑 작용의 압력만으로 쥐었다. 10초 후, 시신경을 놓고, 겸자를 제거하고, 눈을 제 자리로 돌려놓았다. ONC 7일 후, 동물을 도태시켰다. 하룻밤 동안 4% 파라포름알데하이드/0.1% PBS(pH 7.4) 중에 기관을 배치하여 각 군으로부터 양안을 고정하였다. 이어서 각막으로부터 후방 눈 구조의 절제 및 수정체 제거 후 망막 평탄-실장을 제조하였다. 망막 평탄-실장을 4% 파라포름알데하이드/0.1% PBS 중에 30분 동안 후 고정하고 PBS 중 0.5% Triton X-100 중에 세척하였다. 망막을 10분 동안 -80℃에서 냉동하여 핵 막을 투과화하고 항체 투과를 개선한 후 실온에서 60분 동안 PBS 중 10% 일반 당나귀 혈청(NDS), 2% 소 혈청 알부민(BSA) 및 2% Triton X-100에서 차단하였다. RGC를 Brn3A에 대한 항체(1:200 Santa Cruz, #sc-31984)로 카운터염색하고 20X 대물렌즈 및 Leica DM6000 에피형광 현미경(Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)을 사용하여 형광 현미경 하에 가시화하였다. 1.5X 디지털 줌 및 0.5~0.8 순차 스캐닝 z-스텝 간격을 사용해서 40X 오일 대물렌즈가 장착된 Leica SP5 공초점 현미경(Leica Microsystems)을 사용해서 더 고해상 이미지를 수득하였다. 핵 계수용 이미지-기반 툴 플러그인(ITCN)을 사용하여 ImageJ에 의해 RGC 세포수를 측정하고 RGC/㎟ 밀도로 표현하였다.

작제물 및 벡터

본 발명자들은 도 1에 나타낸 바와 같은 유전자 작제물을 생성하였고, 이는 시신경 병리, 예컨대 녹내장, 또는 달팽이관 병리를 겪는 대상체를 치료하기 위해, 또는 신경 재생 및/또는 생존을 촉진하기 위해 사용될 수 있다. 작제물은 동시 생성 및 mBDNF의 국소 방출에 의해 RGC의 세포 표면 상 TrkB 수용체 밀도를 유지하거나 증가시키고 TrkB 수용체 경로를 통한 신호전달을 유지하거나 증가시키도록 설계되었다.

작제물은 TrkB 수용체 및 그 작용제, 성숙 뇌-유래 신경영양 인자를 인코딩하는 트랜스유전자를 포함한다. 이들 트랜스유전자는 인간 시냅신 I(SYN I) 프로모터 또는 CAG 프로모터인, 단일 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 유리하게는, 도 1의 작제물은 이것이 인코딩하는 트랜스유전자의 크기에 의해 방해받지 않고 rAAV2 벡터에 배치될 수 있다. 이는 제1 트랜스유전자, TrkB가 바이러스 2A 펩타이드 서열에 이어 BDNF 신호 펩타이드, 그리고 이어서 성숙 단백질에 연결되도록 작제물이 배향되기 때문이다. 바이러스 2A 펩타이드의 짧은 N-말단 아미노산 서열이 TrkB 수용체의 세포내 부분에 부착된 채 유지되며 C-말단 바이러스 2A 서열로부터의 잔류 프롤린 아미노산이 N-말단 BDNF 신호 펩타이드에 부착된 채 유지되고 궁극적으로 절단 후 mBDNF 단백질로부터 제거되기 때문에 상기 배향은 또한 면역원성 위험을 최소화한다. 벡터는 약리적으로 허용가능한 완충 용액 중에 배치될 수 있고, 이는 대상체에 투여될 수 있다.

도 2~5는 발현 벡터의 다양한 구현예를 나타낸다. 도 2는 정규 신호 서열(파란색)(즉 MTILFLTMVISYFGCMKA[서열번호 20]) + 프로BDNF(빨간색) 및 mBDNF(검은색)를 함유하는 "플라스미드 QTA001PA"로 공지된 벡터를 나타낸다. 도 3은 "플라스미드 QTA002P"로 공지된 벡터를 나타낸다. 이는 프로BDNF를 인코딩하지 않으며 mBDNF만을 생성하고, QTA001PA와 동일한 신호 서열(파란색)을 인코딩한다. 도 4는 또한 프로BDNF를 인코딩하지 않았지만 mBDNF만 생성하는 "플라스미드 QTA003P"로 공지된 벡터를 나타낸다. 이는 mBDNF에 대한 정규 신호 서열 대신, IL-2 신호 서열(파란색)을 포함한다. 마지막으로, 도 5는 "플라스미드 QTA004P"로 공지된 벡터를 나타낸다. 이는 프로BDNF를 인코딩하지 않는 대신 mBDNF만을 생성한다. 이는 또한 신규 신호 서열(파란색), [서열번호 32]을 인코딩한다.

본 발명자들은 성숙 BDNF(mBDNF) 요소로 시작하는 녹내장 유전자 치료법 개념에 관한 작제물 및 벡터를 생성하고 연구하였다. 이들은 프로BDNF 코딩 영역 없이 BDNF 서열을 함유하는 플라스미드(QTA002P, 도 3 참고)로의 리포펙타민 형질도입 후 HEK293 세포로부터 mBDNF의 생성 및 방출을 명확히 실증하였다(도 7 참고). 세포로부터 방출된 mBDNF는 14 kDa 단량체로 예측되며(웨스턴 블로팅 및 BDNF에 대해 상업적으로 이용 가능한 항체를 사용하여 측정됨) 효모 및 다른 세포-기반 제조 접근을 사용해서 상업적 양의 mBNDF를 생성하기 위해 시도 중인 몇몇 그룹에서 보고된 바와 같이¹, 단백질 응집물에 대한 증거는 존재하지 않는다. 따라서 mBDNF는 TrkB 수용체를 활성화하기 위해 단백질 분자가 비-공유 이량체를 형성할 수 있도록 하는 형태로 방출된다.

BDNF에 대한 ELISA(mBDNF 및 더 큰 연장된 프로BDNF 단백질을 구별하지 않음)를 사용하여, 본 발명자들은 내인성 정규 18-아미노산 신호 펩타이드 서열(MTILFLTMVISYFGCMKA)을 코딩하는 DNA 서열을 신규 펩타이드 서열(QTA004P - 도 5 참고)로 치환하고 BDNF 유전자를 함유하는 플라스미드로 세포의 리포펙타민 형질도입 후 동등 수준의 BDNF를 HEK293 인큐베이션 배지 내로 방출할 수 있음을 또한 실증하였다(도 7 참고).

내인성 신호 펩타이드의 인터류킨-2 신호 펩타이드를 코딩하는 서열로의 치환(QTA003P - 도 4 참고)은 배지로부터 BDNF의 방출에서 덜 효과적이었다. 배지 내로 방출된 BDNF 수준은 현재 약 1 ~ 2 nM이며 상기 작용제의 농도는 특이적 TrkB 수용체를 최대로 활성화하기 충분하다(IC50 약 0.9 nM). BDNF 방출 수준은 조합된 프로BDNF 및 mBDNF 서열을 함유하며 또한 플라스미드 QTA002P(도 3 참고) 및 QTA004P(도 5 참고)에 비해 18-아미노산 정규 신호 펩타이드를 또한 포함하는 플라스미드 QTA001PA(도 2 참고)로 대략 35배 더 높다(876 ± 87 ng/㎖ BDNF).

리포펙타민 플라스미드 형질도입 24시간 후 정량적 웨스턴 블로팅에 의해 세포에 남아있는 BDNF의 측정은 QTA002P 및 QTA004P 이용 시에 비해 QTA001PA로 더 낮은 BDNF 잔여 농도를 드러내었다(도 8 참고).

또한, QTA001PA에 의해 형질도입된 세포 용해액 중 BDNF 면역반응성의 대략 절반은 프로BDNF 형태(32 kDa의 분자량 밴드)인 반면 QTA002P, QTA003P 및 QTA004P로 형질도입된 세포의 용해액 중에는 프로BDNF 밴드가 부재하였고(도 9 참고), 이들 플라스미드가 프로BDNF 연장 코딩 서열을 함유하지 않기 때문일 것이다.

프로BDNF에 특이적인 ELISA를 사용하여, 본 발명자들은 QTA001PA로 형질도입된 세포로부터 방출된 BDNF-면역반응성의 약 70 ng/㎖(2.2 nM 또는 3.5%)이 프로BDNF 형태인 반면 대부분(96.5% 또는 876 ng/㎖/63 nM)은 mBDNF로 방출됨을 실증할 수 있었다(도 10 참고). 연장된 프로BDNF에 대한 코딩 서열을 함유하지 않는 QTA002P, QTA003P 또는 QTA004P에 의해 형질도입된 세포로부터는 프로BDNF-면역반응성이 검출되지 않았다.

따라서, 모든 플라스미드가 14 kDa mBDNF 단백질을 생성할 수 있지만, HEK293 세포로부터 방출된 mBDNF의 양은 대개 단백질 보관 효율 및 분비 소포로의 패키징에 의존함이 명확하다. 따라서 플라스미드 QTA001PA로 생성된 바와 같이, 조합된 프로BDNF 및 mBDNF 서열을 함유하는 연장된 형태의 단백질(도 2)은 세포 내에 축적되는 것으로 드러나는 더 작은 mBDNF 서열을 갖는 것에 비해 훨씬 더 효율적으로 분비 소포 내로 패키징되고 인큐베이션 배지 내로 방출된다.

도 11을 참조하면, 플라스미드 QTA002P에 나타낸 바와 같이, 플라스미드 QTA009P 내지 QTA013P에 포함된 신규 서열로의 내인성 정규 신호 펩타이드 서열에 대한 코딩부의 치환은 플라스미드로의 형질도입 24시간 후 HEK293 세포에서 BDNF 농도를 증가시키는 것으로 나타난다. 도 12는 플라스미드 QTA002P에 포함된 내인성 정규 신호 펩타이드 코딩 서열의 신규 서열로의 치환(플라스미드 QTA009P 내지 QTA013P)이 플라스미드로의 형질도입 24시간 후 측정되는, HEK293 세포로부터의 BDNF 방출(ELISA에 의해 측정됨)을 증가시킴을 실증한다.

도 13에 나타낸 바와 같이, 바이러스-2A 펩타이드 서열의 부가는 큰 전구체 단백질에 대한 코딩 서열의 2개의 트랜스유전자, eGFP 및 BDNF로의 효율적 가공을 일으킨다. 웨스턴 블롯은 이들이 플라스미드: (i) QTA015P(IRES 스페이서에 의해 분리된 BDNF 및 eGFP 발현), (ii) QTA021P(기능적 바이러스-2A 펩타이드 서열에 의해 분리된 BDNF에 이은 eGFP의 발현), (iii) QTA022P(비-기능적 바이러스-2A 펩타이드 서열에 의해 분리된 BDNF에 이은 eGFP의 발현) 및 (iv) QTA023P(기능적 바이러스-2A 펩타이드 서열에 의해 분리된 eGFP에 이은 BDNF 코딩부의 발현)로 형질도입된 24시간 후의 HEK293 세포를 나타낸다.

QTA021P(mBDNF-바이러스-2A 펩타이드-eGFP에 대해 코돈 최적화된 서열을 함유하는 플라스미드)의 코딩 서열을 하기와 같이 본원에서 서열번호 104로 나타낸다:

ATGACTATCCTGTTTCTGACAATGGTTATTAGCTATTTCGGTTGCATGAAGGCTCACAGTGATCCCGCACGCCGCGGAGAACTTAGCGTGTGCGACAGCATCAGCGAGTGGGTCACCGCCGCCGATAAGAAGACCGCTGTGGATATGTCCGGCGGGACCGTCACTGTACTCGAAAAAGTTCCAGTGAGCAAAGGCCAACTGAAACAATATTTCTATGAAACTAAGTGCAACCCCATGGGGTACACCAAGGAGGGCTGCCGGGGAATCGACAAGAGACACTGGAATTCCCAGTGCCGGACCACTCAGAGCTACGTCCGCGCCTTGACGATGGATTCAAAGAAGCGCATCGGATGGCGGTTCATAAGAATCGACACCAGTTGTGTGTGCACGCTGACGATAAAACGGGGGCGGGCCCCCGTGAAGCAGACCCTGAACTTTGATTTGCTCAAGTTGGCGGGGGATGTGGAAAGCAATCCCGGGCCAATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGCGTTGTGCCAATACTGGTTGAGTTGGATGGCGATGTCAACGGACACAAATTTAGCGTAAGCGGGGAGGGAGAGGGCGACGCCACATATGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATTTGCACGACCGGCAAATTGCCCGTCCCTTGGCCCACACTTGTGACGACCCTGACTTATGGCGTACAGTGCTTCAGCAGGTACCCTGATCATATGAAGCAACACGACTTCTTTAAGAGTGCCATGCCAGAGGGATACGTCCAGGAAAGAACCATATTCTTCAAAGATGATGGAAATTACAAAACCCGGGCAGAGGTCAAGTTTGAAGGCGACACCCTGGTGAACAGGATCGAACTCAAAGGCATCGATTTCAAAGAGGACGGAAACATCCTCGGACACAAACTGGAATACAATTACAACAGCCACAACGTCTACATCATGGCAGATAAACAAAAGAACGGTATTAAAGTGAACTTCAAGATCCGGCACAACATCGAAGACGGCTCCGTCCAGCTTGCCGACCACTACCAGCAAAATACCCCGATCGGCGACGGCCCCGTTCTCCTCCCCGATAATCACTACCTGAGTACACAGTCAGCCTTGAGCAAAGACCCTAATGAAAAGCGGGACCACATGGTTTTGCTGGAGTTCGTTACCGCAGCGGGTATTACGCTGGGTATGGACGAGCTTTACAAGTAA [서열번호 104]

QTA022P(mBDNF-비-기능적 바이러스-2A 펩타이드-eGFP에 대해 코돈 최적화된 서열을 함유하는 플라스미드)의 코딩 서열을 하기와 같이 본원에서 서열번호 105로 나타낸다:

ATGACTATCCTGTTTCTGACAATGGTTATTAGCTATTTCGGTTGCATGAAGGCTCACAGTGATCCCGCACGCCGCGGAGAACTTAGCGTGTGCGACAGCATCAGCGAGTGGGTCACCGCCGCCGATAAGAAGACCGCTGTGGATATGTCCGGCGGGACCGTCACTGTACTCGAAAAAGTTCCAGTGAGCAAAGGCCAACTGAAACAATATTTCTATGAAACTAAGTGCAACCCCATGGGGTACACCAAGGAGGGCTGCCGGGGAATCGACAAGAGACACTGGAATTCCCAGTGCCGGACCACTCAGAGCTACGTCCGCGCCTTGACGATGGATTCAAAGAAGCGCATCGGATGGCGGTTCATAAGAATCGACACCAGTTGTGTGTGCACGCTGACGATAAAACGGGGGCGGGCCCCTGTCAAACAAACCCTCAATTTTGACTTGCTGAAGCTTGCTGGGGATGTCGAGTCCGCTGCCGCGGCTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGCGTTGTGCCAATACTGGTTGAGTTGGATGGCGATGTCAACGGACACAAATTTAGCGTAAGCGGGGAGGGAGAGGGCGACGCCACATATGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATTTGCACGACCGGCAAATTGCCCGTCCCTTGGCCCACACTTGTGACGACCCTGACTTATGGCGTACAGTGCTTCAGCAGGTACCCTGATCATATGAAGCAACACGACTTCTTTAAGAGTGCCATGCCAGAGGGATACGTCCAGGAAAGAACCATATTCTTCAAAGATGATGGAAATTACAAAACCCGGGCAGAGGTCAAGTTTGAAGGCGACACCCTGGTGAACAGGATCGAACTCAAAGGCATCGATTTCAAAGAGGACGGAAACATCCTCGGACACAAACTGGAATACAATTACAACAGCCACAACGTCTACATCATGGCAGATAAACAAAAGAACGGTATTAAAGTGAACTTCAAGATCCGGCACAACATCGAAGACGGCTCCGTCCAGCTTGCCGACCACTACCAGCAAAATACCCCGATCGGCGACGGCCCCGTTCTCCTCCCCGATAATCACTACCTGAGTACACAGTCAGCCTTGAGCAAAGACCCTAATGAAAAGCGGGACCACATGGTTTTGCTGGAGTTCGTTACCGCAGCGGGTATTACGCTGGGTATGGACGAGCTTTACAAGTAA [서열번호 105]

QTA023P(eGFP-바이러스-2A 펩타이드-mBDNF에 대해 코돈 최적화된 서열을 함유하는 플라스미드)의 코딩 서열을 하기와 같이 본원에서 서열번호 106으로 나타낸다:

ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAGGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGGCTCCCGTTAAACAAACTCTGAACTTCGACCTGCTGAAGCTGGCTGGAGACGTGGAGTCCAACCCTGGACCTATGACCATCCTTTTCCTTACTATGGTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAGGCGCACTCCGACCCTGCCCGCCGTGGGGAGCTGAGCGTGTGTGACAGTATTAGCGAGTGGGTCACAGCGGCAGATAAAAAGACTGCAGTGGACATGTCTGGCGGGACGGTCACAGTCCTAGAGAAAGTCCCGGTATCCAAAGGCCAACTGAAGCAGTATTTCTACGAGACCAAGTGTAATCCCATGGGTTACACCAAGGAAGGCTGCAGGGGCATAGACAAAAGGCACTGGAACTCGCAATGCCGAACTACCCAATCGTATGTTCGGGCCCTTACTATGGATAGCAAAAAGAGAATTGGCTGGCGATTCATAAGGATAGACACTTCCTGTGTATGTACACTGACCATTAAAAGGGGAAGATAG [서열번호 106]

도 14a를 참조하면, QTA020V 벡터로의 전달감염 48시간 후 HEK293 세포 균질액의 웨스턴 블롯을 나타낸다. 이는 바이러스-2A 펩타이드 서열에 의해 분리된 TrkB 수용체 및 BDNF를 포함하는 큰 전구체 코딩 영역의 효율적 가공을 나타낸다. 2개의 TrkB 및 mBDNF-면역반응성 트랜스유전자는 예측된 정확한 분자량 크기 내에 있다. TrkB 수용체 밴드 위 큰 전구체 단백질의 염색 부재가 주지되어야 하며, 5개 반복체에서 전구체 단백질의 거의 완전하거나 완전한 가공을 시사한다. 도 14b 및 14c는 바이알-2A 펩타이드 절단 후 생성된 트랜스유전자 단백질이 가공 후 HEK293 세포에서 정확한 세포내 구획(TrkB 수용체는 세포 표면으로 그리고 BDNF는 방출 전 보관 소포로)으로 수송되었음을 나타낸다.

도 15는 TrkB 수용체 및 BDNF에 대한 2개의 코딩 영역을 분리하는 바이러스-2A 펩타이드 서열의 부가가 rAAV2 벡터, QTA020V의 유리체내 주사 후 마우스 망막 에서 2개의 트랜스유전자로의 효율적 가공을 일으킴을 나타낸다.

도 16은 바이러스-2A 펩타이드 서열에 의해 분리된, TrkB 수용체 및 BDNF에 대한 코딩부를 함유하는 rAAV2 벡터, QTA020V의 주사 후 면역세포화학에 의해 나타내는 마우스 망막 신경절 세포층에서의 트랜스유전자 발현을 나타낸다. 망막층을 구별하기 위해 표적 망막 신경절 세포체는 항-Brn3A 항체로 빨간색으로 염색되며 세포 핵은 DAPI를 이용해서 파란색으로 카운터염색된다.

도 17을 참조하면, 유리체내 주사(2 ㎕의 9×10¹² 벡터 입자/㎖)를 통한 QTA020V(바이러스-2A 펩타이드 서열에 의해 분리된, TrkB 수용체 및 BDNF에 대한 코딩부 함유)의 사전-처리는 rAAV2-CAG-eGFP 벡터로 처리된 대조군 동물 대비 마우스에서 시신경 압궤 후 망막 신경절 세포 생존에 대해 유의미한 신경보호 효능을 부여함이 나타난다. QTA020V 벡터에 의한 신경보호 수준도 BDNF만을 발현하는 벡터에 의해 제공되는 것보다 컸다. 모든 3개 군의 동물이 시신경 압궤 절차를 거쳤고, 부상 7일 후 망막 신경절 세포수를 측정하였다. 망막 신경절 세포는 모의 압궤를 거친 동물 대상체 대비 대조군(검은색 막대)에서 71%만큼 감소되었다(데이터는 나타내지 않음).

작제물의 신경보호 효과

도 18을 참조하면, 트랜스유전자를 발현하지 않거나(공 바이러스), BDNF 단독(QTA027V), TrkB 단독(QTA025V) 그리고 BDNF 및 TrkB 둘 다(QTA020V)를 발현하는 rAAV2 바이러스 벡터로의 전달감염 후 웨스턴 블로팅에 의해 미분화 인간 SH-SY5Y 신경모세포종 세포 균질액에서 BDNF 트랜스유전자(도 18a 참고) 및 TrkB 트랜스유전자(도 18b 참고)의 발현을 나타낸다. 우수한 발현 수준이 달성됨이 명확하다.

도 18c를 참조하면, 공 바이러스 벡터, QTA020V, QTA025V 또는 QTA027V로의 전달감염 후 웨스턴 블롯에서 SH-SY5Y 세포에서의 활성화된 인산화 TrkB 수용체 수준을 나타낸다. BDNF 및 TrkB를 둘 다 발현하는 QTA020V 벡터만 전달감염되지 않은 세포에 비해, TrkB 수용체 활성화를 유의미하게 증가시키는 것으로 확인되었다. 이와 같이, 본 발명의 작제물은 두 트랜스유전자를 모두 효과적으로 발현하며 신경모세포종 SH-SY5Y 세포에서 활성화된 인산화 TrkB 수용체를 생성하는 것으로 나타나, 신경퇴행성 장애, 예컨대 알츠하이머 질환, 또는 뇌졸중이 치료될 수 있음을 시사하였다.

도 19를 참조하면, TUNEL 염색에 의해 과산화수소(H₂O₂ 0.1 mM 또는 1.0 mM)의 첨가에 의해 생성된 산화적 스트레스에 대한 노출 후 배양 중인 미분화 신경모세포종 SH-SY5Y 세포의 아폽토시스 세포사 수준을 나타낸다. 과산화수소의 첨가 전, BDNF 및 TrkB 수용체를 둘 다 발현하는 rAAV2 벡터 QTA020V로 전달감염된 세포는 놀랍게도 미처리 세포에 비해 아폽토시스에 대해 유의미하게 보호되는 것으로 확인되었다. 다시, 이들 데이터는 본 발명의 작제물이 신경퇴행성 장애 또는 뇌졸중의 치료, 예방 또는 완화에서 사용될 수 있다는 생각을 뒷받침한다.

이제 도 20을 참조하면, P301S 돌연변이체 인간 타우 트랜스제닉 마우스로부터 수득되고 위치 세린 396/세린 404(PHF-1) 또는 세린 202/세린 205(AT8)에서 인산화된 타우를 인식하는 항체로 염색된 시신경의 대표 면역세포화학 이미지를 나타낸다.

P301S 트랜스제닉 마우스에서는 8월령 경에 주로 해마에서 그러나 신피질 및 엔토리날 피질을 포함하는 다른 뇌 영역으로 확산되며 뉴런 손실 및 뇌 아트로피가 발생한다. 이들에서는 신피질, 편도, 해마, 뇌간, 및 척추에서 광범위한 신경원섬유 매듭-유사 봉입체가 발생한다. 매듭 병리에는 미세아교세포증 및 별아교세포증이 수반되지만 아밀로이드 플라크는 수반되지 않는다[56, 57, 58].

마우스를 유리체내 주사를 통해 표적 망막 신경절 세포 및 이의 축삭에서 TrkB 수용체 및 BDNF를 모두 발현하는 QTA020V로 처리하였다. 도 20에서의 이미지는 PHF-1 및 AT-8을 사용하여, 타우 과인산화 정도가 시신경을 이루는 축삭에서 유의미하게 감소됨을 예시한다. 이러한 생체내 데이터는 본 발명의 작제물을 사용하여, TrkB 및 BDNF의 발현 증가가 알츠하이머 뇌와 연관된 병태생리적 특징 중 하나인 뉴런에서의 타우 인산화를 유의미하게 감소시킬 수 있음을 나타낸다.

결론

알츠하이머 질환에 있어서, 일반적으로 질환에 대한 대리물로 간주되며 유전자 치료법이 임상 결과에 대한 예측 가능성 정도와 함께 평가될 수 있는 전임상 모델이 하나도 존재하지 않음이 이해될 것이다. 그러나 이의 게놈에 대한 개질이 질환을 갖는 인간에서 확인된 유전적/신경화학적 또는 생화학적 변화 중 하나를 설치류 내로 도입한 동물 모델은 이용 가능하다. 이들 변화에는 과도한 Aβ 생성 및 플라크의 형성[59] 축삭 수송을 매개한다고 여겨지는 뉴런 세포체 및 축삭 내 과인산화된 타우 단백질의 생성[60] 및 BDNF 및 그 인지체 수용체, TrkB 둘 다의 감소[11~14, 27]가 포함된다.

인간 사후 조직 및 그 생성에 관여되는 BACE-1 효소의 차단을 통해(베루베세스타트; Merck) 또는 항체 중화를 통해(예로, 솔레네주맙; Eli Lilly 및 바피뉴주맙; Pfizer/J&J) 두 실험 동물로부터 모두 베타-아밀로이드를 성공적으로 제거할 수 있는 다양한 제제의 능력에 기반하여, 이들 접근은 둘 다 III상 임상 연구에서 유의미한 임상적 유익을 생성하는 데 실패했다. 따라서, 알츠하이머 질환으로 진단받은 인간 뇌에서 널리 기재된 사후 변화 중, BDNF 신호전달의 손실 및 과인산화된 타우와 연관된 신경원섬유 매듭의 존재만이 신경학적 병태와 연관된 병태생리적 변화를 복원하거나 늦추기 위해 평가되지 않은 접근이다.

상당한 발명 노력 끝에, 본 발명자들은 둘 다 상기 질환에서 감소되는 것으로 보고된(상기 인용된 참고문헌 참고) TrkB 수용체 및 BDNF를 둘 다 동시에 발현하고 상향조절할 수 있는 신규 작제물을 사용하여 BDNF 신호전달의 손실을 극복하는 문제를 해결하였다.

BDNF는 짧은 반감기를 가지므로, 뇌 내로 하루 수 회 주사 또는 연속 주입을 필요로 할 수 있는 재조합 BDNF의 정기 투여는 임상적으로 타당하지 않으며 아마도 TrkB 수용체 하향조절과 연관될 것이다. 또한, 본 발명자들은 SHSY-5Y 세포에서, TrkB 수용체만 발현하는 rAAV2가 활성 p-Y⁵¹⁵-TrkB 수준에 의해 측정되는 상기 수용체의 활성을 유의미하게 증가시키기에 충분하지 않음을 도 18c에서 또한 실증하였다. 본 발명의 작제물은 (i) 프로-BDBF 코딩부의 손실, (ii) 중요한 프로-BDNF 서열의 누락으로 인한 BDNF의 세포내 수송 및 정상 단백질 폴딩과 연관된 문제를 극복하기 위한 신규 신호 펩타이드의 도입, (iii) TrkB 및 BDNF 서열의 리보솜 생성 간에 번역 '건너뜀'을 촉진하는 바이러스-2A 펩타이드 서열을 함유하는 단일 트랜스유전자의 작제, 및 (iv) 마지막으로 약칭된 WPRE 및 폴리A 서열을 포함하는 여러 발명 단계를 통해, TrkB 수용체 및 BDNF 둘 다의 큰 코딩 서열을 수용하도록 구체적으로 설계되었다. 따라서, 본 발명자들은 2개의 트랜스유전자, BDNF, 및 그 인지체 수용체, BDNF를 발현하는 신규 작제물이 TrkB 수용체만의 단순 상향조절에 비해 훨씬 더 우수하다는 증거를 제공하였다. 본 발명자들은 또한 신규 유전자 치료법 작제물이 이전에 실증된 바와 같이[56], 그러나 BDNF의 추가(정기) 주사를 필요로 하지 않고, 최적 활성을 제공할 수 있음을 실증하였다.

본 발명자의 주된 목적은 제공된 실시예가 명확히 실증하는 저수준 BDNF/TrkB 신호전달을 해결할 수 있는 유전자 치료법을 개발하는 것이었다. 신규 유전자 치료법 작제물이 도 20에 나타낸 바와 같이, 과인산화된 타우 단백질 밀도(타우 단백질 길이에 따른 몇몇 인산화된 세린 잔기를 인식하는 2개 항체를 사용하여 측정됨)의 큰 감소를 일으킬 수 있다는 것은 예상치 못한 것이었다. 타우는 뇌 및 다른 신경 조직, 예컨대 시신경에서 확인되는 도처에 존재하는 단백질이다. 모델 시스템으로서 시신경을 사용하여, 눈에서 증가된 BDNF 신호전달이 상기 단백질 이소형의 제안된 병리적 수준을 감소시키는 것으로 확인되었다. 따라서, P301S 트랜스제닉 마우스 계통에서 BDNF/TrkB 신호전달을 상향조절하는 능력 및 이러한 인산화된 타우 밀도의 현저한 감소 관찰은 예상되지 않았다.

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tttggtaatg ctgtttctgc ttaagttggc aagacactcc 1380 aagtttggca tgaaagattt ctcatggttt ggatttggga aagtaaaatc aagacaaggt 1440 gttggcccag cctccgttat cagcaatgat gatgactctg ccagcccact ccatcacatc 1500 tccaatggga gtaacactcc atcttcttcg gaaggtggcc cagatgctgt cattattgga 1560 atgaccaaga tccctgtcat tgaaaatccc cagtactttg gcatcaccaa cagtcagctc 1620 aagccagaca catttgttca gcacatcaag cgacataaca ttgttctgaa aagggagcta 1680 ggcgaaggag cctttggaaa agtgttccta gctgaatgct ataacctctg tcctgagcag 1740 gacaagatct tggtggcagt gaagaccctg aaggatgcca gtgacaatgc acgcaaggac 1800 ttccaccgtg aggccgagct cctgaccaac ctccagcatg agcacatcgt caagttctat 1860 ggcgtctgcg tggagggcga ccccctcatc atggtctttg agtacatgaa gcatggggac 1920 ctcaacaagt tcctcagggc acacggccct gatgccgtgc tgatggctga gggcaacccg 1980 cccacggaac tgacgcagtc gcagatgctg catatagccc agcagatcgc cgcgggcatg 2040 gtctacctgg cgtcccagca cttcgtgcac cgcgatttgg ccaccaggaa ctgcctggtc 2100 ggggagaact tgctggtgaa aatcggggac tttgggatgt cccgggacgt gtacagcact 2160 gactactaca gggtcggtgg 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<211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 Met Arg Arg Met Gln Leu Leu Leu Leu Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu 1 5 10 15 Val Thr Asn Ser 20 <210> 35 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 35 atgaggagga tgcaactcct gctcctgatt gcactaagtc ttgcacttgt cacaaacagt 60 60 <210> 36 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Met Arg Arg Met Gln Leu Leu Leu Leu Thr Met Val Ile Ser Tyr Phe 1 5 10 15 Gly Cys Met Lys Ala 20 <210> 37 <211> 63 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 37 atgaggagga tgcaactcct gctcctgact atggttattt catacttcgg ttgcatgaag 60 gcg 63 <210> 38 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 Met Arg Ile Leu Leu Leu Thr Met Val Ile Ser Tyr Phe Gly Cys Met 1 5 10 15 Lys Ala <210> 39 <211> 54 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39 Ala Thr Gly Ala Gly Ala Ala Thr Cys Cys Thr Thr Cys Thr Thr Cys 1 5 10 15 Thr Thr Ala Cys Thr Ala Thr Gly Gly Thr Thr Ala Thr Thr Thr Cys 20 25 30 Ala Thr Ala Cys Thr Thr Cys Gly Gly Thr Thr Gly Cys Ala Thr Gly 35 40 45 Ala Ala Gly Gly Cys Gly 50 <210> 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sapiens <400> 47 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 120 gagcgcgcag ctgcctgcag g 141 <210> 48 <211> 584 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 48 gcgttacata acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat 60 tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc 120 aatgggtgga ctatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc 180 caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt 240 acatgacctt atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta 300 ccatggtcga ggtgagcccc acgttctgct tcactctccc catctccccc ccctccccac 360 ccccaatttt gtatttattt attttttaat tattttgtgc agcgatgggg gcgggggggg 420 ggggggggcg cgcgccaggc ggggcggggc ggggcgaggg gcggggcggg gcgaggcgga 480 gaggtgcggc ggcagccaat cagagcggcg cgctccgaaa gtttcctttt atggcgaggc 540 ggcggcggcg gcggccctat aaaaagcgaa gcgcgcggcg ggcg 584 <210> 49 <211> 210 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 49 Met Leu Pro Leu Pro Ser Cys Ser Leu Pro Ile Leu Leu Leu Phe Leu 1 5 10 15 Leu Pro Ser Val Pro Ile Glu Ser Gln Pro Pro Pro Ser Thr Leu Pro 20 25 30 Pro Phe Leu Ala Pro Glu Trp Asp Leu Leu Ser Pro Arg Val Val Leu 35 40 45 Ser Arg Gly Ala Pro Ala Gly Pro Pro Leu Leu Phe Leu Leu Glu Ala 50 55 60 Gly Ala Phe Arg Glu Ser Ala Gly Ala Pro Ala Asn Arg Ser Arg Arg 65 70 75 80 Gly Val Ser Glu Thr Ala Pro Ala Ser Arg Arg Gly Glu Leu Ala Val 85 90 95 Cys Asp Ala Val Ser Gly Trp Val Thr Asp Arg Arg Thr Ala Val Asp 100 105 110 Leu Arg Gly Arg Glu Val Glu Val Leu Gly Glu Val Pro Ala Ala Gly 115 120 125 Gly Ser Pro Leu Arg Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Arg Cys Lys Ala Asp 130 135 140 Asn Ala Glu Glu Gly Gly Pro Gly Ala Gly Gly Gly Gly Cys Arg Gly 145 150 155 160 Val Asp Arg Arg His Trp Val Ser Glu Cys Lys Ala Lys Gln Ser Tyr 165 170 175 Val Arg Ala Leu Thr Ala Asp Ala Gln Gly Arg Val Gly Trp Arg Trp 180 185 190 Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Thr Leu Leu Ser Arg Thr Gly 195 200 205 Arg Ala 210 <210> 50 <211> 630 <212> DNA 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Glu Glu Gly Gly Pro Gly Ala Gly Gly Gly Gly Cys Arg Gly 65 70 75 80 Val Asp Arg Arg His Trp Val Ser Glu Cys Lys Ala Lys Gln Ser Tyr 85 90 95 Val Arg Ala Leu Thr Ala Asp Ala Gln Gly Arg Val Gly Trp Arg Trp 100 105 110 Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Thr Leu Leu Ser Arg Thr Gly 115 120 125 Arg Ala 130 <210> 56 <211> 390 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 56 ggggtgagcg aaactgcacc agcgagtcgt cggggtgagc tggctgtgtg cgatgcagtc 60 agtggctggg tgacagaccg ccggaccgct gtggacttgc gtgggcgcga ggtggaggtg 120 ttgggcgagg tgcctgcagc tggcggcagt cccctccgcc agtacttctt tgaaacccgc 180 tgcaaggctg ataacgctga ggaaggtggc ccgggggcag gtggaggggg ctgccgggga 240 gtggacagga ggcactgggt atctgagtgc aaggccaagc agtcctatgt gcgggcattg 300 accgctgatg cccagggccg tgtgggctgg cgatggattc gaattgacac tgcctgcgtc 360 tgcacactcc tcagccggac tggccgggcc 390 <210> 57 <211> 592 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 57 aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60 ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat 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atggcggttc 360 ataagaatcg acaccagttg tgtgtgcacg ctgacgataa aacgggggcg ggcccccgtg 420 aagcagaccc tgaactttga tttgctcaag ttggcggggg atgtggaaag caatcccggg 480 ccaatggtga gcaagggcga ggagctgttc accggcgttg tgccaatact ggttgagttg 540 gatggcgatg tcaacggaca caaatttagc gtaagcgggg agggagaggg cgacgccaca 600 tatggcaagc tgaccctgaa gttcatttgc acgaccggca aattgcccgt cccttggccc 660 acacttgtga cgaccctgac ttatggcgta cagtgcttca gcaggtaccc tgatcatatg 720 aagcaacacg acttctttaa gagtgccatg ccagagggat acgtccagga aagaaccata 780 ttcttcaaag atgatggaaa ttacaaaacc cgggcagagg tcaagtttga aggcgacacc 840 ctggtgaaca ggatcgaact caaaggcatc gatttcaaag aggacggaaa catcctcgga 900 cacaaactgg aatacaatta caacagccac aacgtctaca tcatggcaga taaacaaaag 960 aacggtatta aagtgaactt caagatccgg cacaacatcg aagacggctc cgtccagctt 1020 gccgaccact accagcaaaa taccccgatc ggcgacggcc ccgttctcct ccccgataat 1080 cactacctga gtacacagtc agccttgagc aaagacccta atgaaaagcg ggaccacatg 1140 gttttgctgg agttcgttac cgcagcgggt attacgctgg gtatggacga gctttacaag 1200 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ttacaaaacc cgggcagagg tcaagtttga aggcgacacc 840 ctggtgaaca ggatcgaact caaaggcatc gatttcaaag aggacggaaa catcctcgga 900 cacaaactgg aatacaatta caacagccac aacgtctaca tcatggcaga taaacaaaag 960 aacggtatta aagtgaactt caagatccgg cacaacatcg aagacggctc cgtccagctt 1020 gccgaccact accagcaaaa taccccgatc ggcgacggcc ccgttctcct ccccgataat 1080 cactacctga gtacacagtc agccttgagc aaagacccta atgaaaagcg ggaccacatg 1140 gttttgctgg agttcgttac cgcagcgggt attacgctgg gtatggacga gctttacaag 1200 taa 1203 <210> 106 <211> 1203 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 106 atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60 ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120 ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180 ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240 cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300 ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360 gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420 aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480 ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540 gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600 tacctgagca cccagtccgc cctgagcaag gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660 ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaaggct 720 cccgttaaac aaactctgaa cttcgacctg ctgaagctgg ctggagacgt ggagtccaac 780 cctggaccta tgaccatcct tttccttact atggttattt catacttcgg ttgcatgaag 840 gcgcactccg accctgcccg ccgtggggag ctgagcgtgt gtgacagtat tagcgagtgg 900 gtcacagcgg cagataaaaa gactgcagtg gacatgtctg gcgggacggt cacagtccta 960 gagaaagtcc cggtatccaa aggccaactg aagcagtatt tctacgagac caagtgtaat 1020 cccatgggtt acaccaagga aggctgcagg ggcatagaca aaaggcactg gaactcgcaa 1080 tgccgaacta cccaatcgta tgttcgggcc cttactatgg atagcaaaaa gagaattggc 1140 tggcgattca taaggataga cacttcctgt gtatgtacac tgaccattaa aaggggaaga 1200 tag 1203 <210> 107 <211> 2940 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 107 atgagcccat ggctgaagtg gcacggacca gcaatggcaa gactgtgggg cctgtgcctg 60 ctggtgctgg gcttctggag agccagcctg gcctgtccaa cctcctgcaa gtgtagctcc 120 gccaggatct ggtgcacaga gccttctcca ggcatcgtgg cctttccccg cctggagcct 180 aacagcgtgg atcccgagaa tatcaccgag atcctgatcg ccaaccagaa gcggctggag 240 atcatcaatg aggacgatgt ggaggcctac gtgggcctga gaaacctgac aatcgtggac 300 tccggcctga agttcgtggc ctataaggcc tttctgaaga actctaatct gaggcacatc 360 aacttcaccc gcaataagct gacatctctg agccggagac actttcggca cctggatctg 420 tccgacctga tcctgaccgg caatccattc acatgctctt gtgacatcat gtggctgaag 480 accctgcagg agacaaagtc tagccccgat acccaggacc tgtactgtct gaacgagtcc 540 tctaagaata tgcctctggc caacctgcag atccctaatt gtggactgcc aagcgcccgg 600 ctggccgcac ctaacctgac agtggaggag ggcaagtccg tgacactgtc ctgttctgtg 660 ggcggcgatc ccctgcctac cctgtattgg gacgtgggca acctggtgtc taagcacatg 720 aatgagacct cccacacaca gggctctctg agaatcacaa atatcagctc cgacgatagc 780 ggcaagcaga tctcttgcgt ggcagagaac ctggtgggag aggatcagga cagcgtgaat 840 ctgaccgtgc acttcgcccc caccatcaca tttctggagt ctcctaccag cgatcaccac 900 tggtgcatcc ccttcacagt gcggggaaac ccaaagcccg ccctgcagtg gttttacaac 960 ggcgccatcc tgaatgagtc caagtatatc tgtaccaaga tccacgtgac caaccacaca 1020 gagtaccacg gctgcctgca gctggataat cccacccaca tgaacaatgg cgactacaca 1080 ctgatggcca agaacgagta tggcaaggac gagaggcaga tcagcgccca cttcatgggc 1140 cgccctggag tggattatga gaccaaccct aattacccag aggtgctgta tgaggactgg 1200 accacaccta ccgatatcgg cgacaccaca aacaagtcta atgagatccc aagcacagat 1260 gtggccgacc agtctaacag ggagcacctg agcgtgtacg cagtggtggt catcgcctcc 1320 gtggtgggct tctgcctgct ggtcatgctg ctgctgctga agctggcccg ccactctaag 1380 tttggcatga agggcccagc ctccgtgatc tctaatgacg atgacagcgc cagccccctg 1440 caccacatca gcaacggctc caatacccct tctagctccg agggcggccc agatgccgtg 1500 atcatcggca tgacaaagat ccccgtgatc gagaaccctc agtacttcgg catcaccaat 1560 tcccagctga agcctgacac atttgtgcag cacatcaagc ggcacaacat cgtgctgaag 1620 agggaactgg gagagggagc cttcggcaag gtgtttctgg ccgagtgcta taacctgtgc 1680 ccagagcagg ataagatcct ggtggccgtg aagaccctga aggatgccag cgacaacgcc 1740 cggaaggact tccacagaga ggccgagctg ctgacaaatc tgcagcacga gcacatcgtg 1800 aagttttacg gcgtgtgcgt ggagggcgac cctctgatca tggtgttcga gtatatgaag 1860 cacggcgatc tgaacaagtt tctgagagca cacggaccag atgccgtgct gatggcagag 1920 ggaaatcccc ctaccgagct gacacagtct cagatgctgc acattgcaca gcagattgca 1980 gcaggaatgg tgtacctggc cagccagcac ttcgtgcaca gggatctggc aaccagaaac 2040 tgcctggtgg gagagaatct gctggtgaag atcggcgact ttggcatgtc ccgggacgtg 2100 tactctaccg actactatag agtgggcggc cacacaatgc tgcccatcag gtggatgcca 2160 cccgagagca tcatgtatcg caagttcacc acagagtctg acgtgtggag cctgggcgtg 2220 gtgctgtggg agatctttac ctacggcaag cagccttggt atcagctgtc caacaatgaa 2280 gtgatcgagt gtattacaca gggacgcgtg ctgcagaggc cacgcacatg cccccaggag 2340 gtgtacgagc tgatgctggg ctgttggcag cgggagccac acaccagaaa gaacatcaag 2400 agcatccaca cactgctgca gaatctggcc aaggcctccc ccgtgtatct ggacatcctg 2460 ggcagcggag ctactaactt cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct 2520 ggacctatga gaatccttct tcttactatg gttatttcat acttcggttg catgaaggcg 2580 cactccgacc ctgcccgccg tggggagctg agcgtgtgtg acagtattag cgagtgggtc 2640 acagcggcag ataaaaagac tgcagtggac atgtctggcg ggacggtcac agtcctagag 2700 aaagtcccgg tatccaaagg ccaactgaag cagtatttct acgagaccaa gtgtaatccc 2760 atgggttaca ccaaggaagg ctgcaggggc atagacaaaa ggcactggaa ctcgcaatgc 2820 cgaactaccc aatcgtatgt tcgggccctt actatggata gcaaaaagag aattggctgg 2880 cgattcataa ggatagacac ttcctgtgta tgtacactga ccattaaaag gggaagatag 2940 2940 <210> 108 <211> 2943 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 108 atgtcatctt ggatccgctg gcacgggcca gcgatggccc gattgtgggg cttctgctgg 60 cttgttgtag gcttctggcg cgcggcgttc gcgtgtccga cctcttgcaa atgctcagca 120 agccgaattt ggtgctcaga ccctagtcca ggaattgttg cattcccccg actggaacca 180 aactccgtcg acccggagaa tataactgag atatttattg caaatcaaaa acgccttgaa 240 atcattaacg aggatgacgt ggaggcctac gttggtttga gaaatcttac tattgtcgac 300 tccggactta aatttgtagc tcataaagcc ttcctgaaga actctaatct gcagcacatt 360 aatttcacga gaaataagct gaccagcttg tcccggaagc atttccgcca tctcgacctg 420 agcgagctca tactggtcgg aaacccattt acgtgctcct gtgacatcat gtggatcaaa 480 actctgcaag aggcgaaaag tagtccggat acccaagacc tttactgtct taatgaaagc 540 tcaaaaaata tcccgctggc caacctgcag ataccgaact gcggacttcc tagtgcgaat 600 ttggctgccc caaatcttac cgtcgaagaa ggcaaatcaa tcacgctttc ttgttctgta 660 gctggagatc cagtgcctaa tatgtattgg gacgtgggta acctcgtctc aaaacatatg 720 aacgaaacga gccacaccca gggctctttg cggataacaa acatctcctc tgatgattct 780 ggaaagcaaa tcagttgcgt agctgaaaat ctggttggcg aagatcaaga ttcagtcaat 840 ctgacagtcc atttcgcccc aacgatcacc tttctggaga gcccaactag cgatcaccac 900 tggtgtattc cgtttacggt aaaaggaaat ccaaaacctg cactccaatg gttttataat 960 ggagccatct tgaatgaaag caaatatatc tgtactaaaa tccatgtgac gaatcacacc 1020 gagtatcacg ggtgtcttca attggataat ccaacccata tgaataatgg tgattatact 1080 ttgatagcga agaacgaata cggcaaagac gaaaagcaaa tatccgcaca tttcatgggt 1140 tggcctggca tcgacgacgg tgcgaacccg aactacccag atgttattta cgaggattat 1200 gggactgcgg caaacgacat tggcgacacc acaaaccgaa gcaacgagat accaagtact 1260 gacgtcactg acaaaacggg tcgagagcat ttgtctgttt acgccgttgt tgttatcgcc 1320 tcagttgtcg gattttgcct gttggtcatg cttttcctcc tgaagctcgc gcgacattcc 1380 aagtttggca tgaaggggcc agcaagtgtt atatccaatg atgatgatag cgcttctcca 1440 ttgcaccaca taagtaacgg ctcaaacacg ccgtcatcta gtgaaggtgg accagacgcg 1500 gtcattatag ggatgactaa aattcccgta atcgaaaacc ctcagtactt cggcataacc 1560 aacagtcagc ttaaacccga tactttcgtg cagcacatca aaaggcacaa catagtcctc 1620 aagcgcgaac tcggggaggg agccttcgga aaggtctttc ttgctgagtg ctataatttg 1680 tgtcctgagc aggataaaat tcttgtggct gtaaaaactc tcaaagatgc ttccgacaac 1740 gcacggaagg attttcatcg ggaggccgaa ctgttgacga atttgcagca cgagcatata 1800 gtaaagttct acggggtatg tgttgagggg gacccgttga ttatggtctt cgagtatatg 1860 aagcacgggg acctgaacaa atttttgcgc gcccatgggc ctgatgccgt ccttatggca 1920 gaagggaacc ctccaacaga actcacccag agtcagatgt tgcacatagc gcaacagatc 1980 gcggccggca tggtttacct ggccagtcaa cacttcgtgc atagagatct tgccactcgc 2040 aactgtttgg tcggggagaa ccttctggtt aagattggtg actttggtat gtcacgagat 2100 gtgtattcca ctgactatta cagagttggg ggtcatacaa tgcttcctat tcggtggatg 2160 ccccccgaat ccatcatgta cagaaagttc acgacagaga gtgatgtttg gagtctcggc 2220 gtggtgctct gggaaatttt cacatacgga aagcagccgt ggtatcaact tagcaacaat 2280 gaggtgatag agtgtattac acagggtcgg gtgttgcagc gccctcgaac gtgcccacaa 2340 gaagtatatg aacttatgct cgggtgctgg caaagagaac cacatatgag aaaaaatatc 2400 aaggggatac atacattgct tcagaacttg gccaaggcat cacccgtcta cctcgatata 2460 ctgggcagcg gagctactaa cttcagcctg ctgaagcagg ctggagacgt ggaggagaac 2520 cctggaccta tgagaatcct tcttcttact atggttattt catacttcgg ttgcatgaag 2580 gcgcactccg accctgcccg ccgtggggag ctgagcgtgt gtgacagtat tagcgagtgg 2640 gtcacagcgg cagataaaaa gactgcagtg gacatgtctg gcgggacggt cacagtccta 2700 gagaaagtcc cggtatccaa aggccaactg aagcagtatt tctacgagac caagtgtaat 2760 cccatgggtt acaccaagga aggctgcagg ggcatagaca aaaggcactg gaactcgcaa 2820 tgccgaacta cccaatcgta tgttcgggcc cttactatgg atagcaaaaa gagaattggc 2880 tggcgattca taaggataga cacttcctgt gtatgtacac tgaccattaa aaggggaaga 2940 tag 2943

Claims (48)

1. 티로신 키나제 수용체 B(TrkB)를 인코딩하는 제1 코딩 서열, 및 상기 TrkB 수용체의 작용제를 인코딩하는 제2 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 유전자 작제물을 포함하는 재조합 벡터로서,
   상기 작용제는 성숙 BDNF이고, 상기 제2 코딩 서열은 상기 TrkB 수용체의 작용제 분비를 부스팅하는 신호 펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 유전자 작제물은 상기 제1 및 제2 코딩 서열 사이에 배치된 스페이서 서열을 포함하고, 상기 스페이서 서열은 분해됨으로써 상기 TrkB 수용체 및 작용제를 별도 분자로서 생성하도록 배치되는 펩타이드 스페이서를 인코딩하며, 신경퇴행성 장애의 치료, 예방 또는 완화에서 사용하기 위한 재조합 벡터.
2. 청구항 1에 있어서,
   상기 유전자 작제물은 우드척 간염 바이러스 전사-후 조절 요소(WPRE)를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터.
3. 청구항 2에 있어서,
   상기 WPRE는 서열번호 57 또는 58에 나타낸 바와 같은 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터.
4. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
   상기 작제물은 폴리A 테일을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터.
5. 청구항 4에 있어서,
   상기 폴리A 테일은 서열번호 59에 나타낸 바와 같은 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터.
6. 청구항 1에 있어서,
   상기 프로모터는 인간 시냅신 I(SYN I) 프로모터인 재조합 벡터.
7. 청구항 6에 있어서,
   상기 프로모터는 서열번호 1에 나타낸 바와 같은 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터.
8. 청구항 1에 있어서,
   상기 프로모터는 CAG 프로모터인 재조합 벡터.
9. 청구항 8에 있어서,
   상기 프로모터는 서열번호 2, 3 또는 48에 나타낸 바와 같은 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터.
10. 청구항 1에 있어서,
    상기 스페이서 서열은 바이러스 펩타이드 스페이서 서열을 인코딩하는 재조합 벡터.
11. 청구항 10에 있어서,
    상기 스페이서 서열은 바이러스 2A 펩타이드 스페이서 서열을 인코딩하는 재조합 벡터.
12. 청구항 1에 있어서,
    상기 펩타이드 스페이서 서열은 서열번호 4에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 재조합 벡터.
13. 청구항 1에 있어서,
    상기 스페이서 서열은 서열번호 5에 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터.
14. 청구항 1에 있어서,
    상기 펩타이드 스페이서 서열은 서열번호 6에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 재조합 벡터.
15. 청구항 1에 있어서,
    상기 스페이서 서열은 서열번호 7에 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터.
16. 청구항 1에 있어서,
    상기 펩타이드 스페이서 서열은 서열번호 8에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 재조합 벡터.
17. 청구항 1에 있어서,
    상기 제1 코딩 서열은 TrkB의 인간 정규 이소형을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 상기 TrkB의 정규 이소형은 서열번호 9에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 재조합 벡터.
18. 청구항 1에 있어서,
    상기 제1 코딩 서열은 서열번호 10에 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터.
19. 청구항 1에 있어서,
    상기 제1 코딩 서열은 TrkB의 이소형 4를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터.
20. 청구항 19에 있어서,
    TrkB의 이소형 4는 서열번호 11에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 재조합 벡터.
21. 청구항 19 또는 청구항 20에 있어서,
    상기 제1 코딩 서열은 서열번호 12에 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터.
22. 청구항 1에 있어서,
    상기 제1 코딩 서열은 서열번호 9에 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 서열번호 9의 위치 516, 701, 705, 706 및/또는 816에서 하나 이상의 티로신 잔기가 상이한 아미노산 잔기로 개질되는 재조합 벡터.
23. 청구항 22에 있어서,
    서열번호 9의 위치 516, 701, 705, 706 및/또는 816에서 적어도 2개, 3개 또는 4개 티로신 잔기가 상이한 아미노산 잔기로 개질되는 재조합 벡터.
24. 청구항 23에 있어서,
    서열번호 9의 위치 516, 701, 705, 706 및/또는 816에서 모든 5개 티로신 잔기가 상이한 아미노산 잔기로 개질되는 재조합 벡터.
25. 청구항 22에 있어서,
    상기 티로신 잔기 또는 각각의 티로신 잔기가 글루탐산으로 개질되는 재조합 벡터.
26. 청구항 22에 있어서,
    상기 TrkB 수용체의 개질된 형태는 서열번호 13에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 재조합 벡터.
27. 청구항 26에 있어서,
    상기 제1 코딩 서열은 서열번호 14에 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터.
28. 청구항 1에 있어서,
    성숙 BDNF는 서열번호 18에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 재조합 벡터.
29. 청구항 28에 있어서,
    상기 제2 코딩 서열은 서열번호 19에 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터.
30. 청구항 1에 있어서,
    상기 제2 코딩 서열은 상기 TrkB 수용체의 작용제에 대한 신호 펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터.
31. 청구항 30에 있어서,
    상기 제2 코딩 서열은 BDNF에 대한 신호 펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터.
32. 청구항 30에 있어서,
    상기 뉴클레오타이드 서열은 BDNF에 대한 정규 신호 펩타이드를 인코딩하며, 상기 제2 코딩 서열은 서열번호 20에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 신호 펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터.
33. 청구항 30에 있어서,
    상기 제2 코딩 서열은 서열번호 21에 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터.
34. 청구항 1에 있어서,
    상기 제2 코딩 서열은 서열번호 23, 25, 27 또는 29 중 어느 하나에 나타낸 바와 같은 신호 서열 펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 상기 신호 펩타이드는 서열번호 22, 24, 26 또는 28 중 어느 하나에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 재조합 벡터.
35. 청구항 1에 있어서,
    상기 제2 코딩 서열은 서열번호 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101 또는 103 중 어느 하나에 나타낸 바와 같은 신호 서열 펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나; 상기 신호 펩타이드는 서열번호 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100 또는 102 중 어느 하나에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 재조합 벡터.
36. 청구항 1에 있어서,
    상기 작제물은 서열번호 107 또는 108에 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터.
37. 청구항 1에 있어서,
    상기 벡터는 재조합 AAV(rAAV) 벡터인 재조합 벡터.
38. 청구항 37에 있어서,
    상기 rAAV는 AAV-1, AAV-2, AAV-3A, AAV-3B, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10 또는 AAV-11인 재조합 벡터.
39. 청구항 38에 있어서,
    상기 rAAV는 rAAV 혈청형-2인 재조합 벡터.
40. 청구항 1에 있어서,
    상기 신경퇴행성 장애는 알렉산더 질환, 알페르 질환, 알츠하이머 질환, 근위축 측삭 경화증(ALS), 모세관 확장실조, 뉴런 지방 갈색소증, 바튼 질환, 소 해면양 뇌증(BSE), 카나반 질환, 뇌성 마비, 코케인 증후군, 피질기저 퇴행, 크로츠펠트-야콥 질환, 전두측두엽 퇴행, 고셔 질환, 헌팅턴 질환, HIV-연관 치매, 케네디 질환, 크라베 질환, 레위체 치매, 리소좀 저장 장애, 신경보렐리아증, 마차도-조세프 질환, 운동 뉴런 질환, 다시스템 아트로피, 다발 경화증, 다중 설파타제 결핍, 점액지질증, 기면증, 니만-픽 C형, 니만 픽 질환, 파킨슨 질환, 펠리체우스-메르츠바허 질환, 픽 질환, 폼페 질환, 원발성 측삭 경화증, 프리온 질환, 진행성 핵상 마비, 레프숨 질환, 산도프 질환, 실더 질환, 악성 빈혈에 이차적인 척추의 아급성 조합 퇴행, 스피엘마이어-포그트-쇼그렌-바텐 질환, 척추소뇌 실조, 척추 근육 아트로피, 스틸레-리차드슨-올제우스키 질환, 척수 매독, 및 태이-삭스 질환으로 구성되는 군으로부터 선택되는 재조합 벡터.
41. 청구항 1에 있어서,
    상기 신경퇴행성 장애는 알츠하이머 질환인 재조합 벡터.
42. 청구항 41에 있어서,
    뉴런에서의 타우 인산화가 감소되는 재조합 벡터.
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