ES2345091B1 - Peptidos y anticuerpos utiles para la elaboracion de medicamentos para el tratamiento o prevencion de enfermedades humanas neurodegenerativas. medicamentos asi obtenidos y sus aplicaciones. - Google Patents
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Abstract
Péptidos y anticuerpos útiles para la
elaboración de medicamentos para el tratamiento o prevención de
enfermedades humanas neurodegenerativas, medicamentos así obtenidos
y sus aplicaciones.
La presente invención describe inhibidores de la
expresión génica del gen que codifica para la proteína NP1, que
actúa como un inductor de apostosis neural y neurodegeneración,
útiles para la elaboración de medicamentos o composiciones
farmacéuticas para el tratamiento o prevención de enfermedades
humanas neurológicas, preferentemente enfermedades
neurodegenerativas. Más preferentemente, la enfermedad
neurodegenerativa es el Alzheimer. Estos inhibidores incluyen
anticuerpos específicos de la proteína NP1 humana así como de
péptidos derivados de la misma que pueden ser utilizados en
procedimientos de inmunización pasivay activa, respectivamente,
frente a estas enfermedades.
Description
Péptidos y anticuerpos útiles para la
elaboración de medicamentos para el tratamiento o prevención de
enfermedades humanas neurodegenerativas, medicamentos así obtenidos
y sus aplicaciones.
Métodos para la prevención y tratamiento de
trastornos neurológicos incluyendo enfermedades neurodegenerativas,
como por ejemplo la enfermedad de Alzheimer y trastornos
convulsivos.
Evidencia previa sugiere que los mecanismos
bioquímicos que causan la degeneración y muerte patológica de
neuronas diferenciadas y maduras en diversos trastornos
neurodegenerativos son los mismos que los que componen el programa
intrínseco de suicidio celular o apoptosis una de cuyas funciones es
inducir la síntesis "de novo" de proteínas letales para
eliminar las células sobrantes durante el desarrollo del cerebro
^{1-3}.
En neuronas maduras está bien establecido que la
reducción de la actividad neuronal pone en funcionamiento el
programa intrínseco de muerte celular que provoca la síntesis
"de novo" de proteínas letales que causan
neurodegeneración apoptótica ^{4}. Identificar cuáles son estas
proteínas letales pro-apoptóticas que se sintetizan
de nuevo antes de que las neuronas alcancen un punto irreversible
del proceso de muerte ha sido la estrategia que ha guiado la
investigación de nuestro laboratorio para obtener nuevas dianas para
el desarrollo de tratamientos neuroprotectores.
Con este objetivo, se ha investigado la
expresión génica durante la fase inicial del programa de muerte
neuronal producido por reducción de la actividad sináptica. Mediante
el uso de una técnica de análisis de expresión génica diferencial
^{5}, se ha demostrado que la Pentraxina Neuronal 1 (NP1) es una
proteína letal pro-apoptótica que se sintetiza en
mayor cantidad cuando se reduce la actividad neuronal. Estudios
previos indican que la NP1 forma parte del programa intrínseco de
muerte y que contribuye a la neurodegeneración apoptótica que
provoca la reducción de la actividad neuronal ^{6}. Originalmente,
la NP1 fue identificada y aislada como una proteína que se une de
forma dependiente de calcio con taipoxina, una toxina de veneno de
serpiente ^{7}. El gen NP1 codifica una glicoproteína de una masa
molecular aparente de aproximadamente 50 kDa, cuya secuencia de
aminoácidos predice que es secretada. La expresión de NP1 se
restringe al sistema nervioso ^{7}.
La NP1 forma parte de la familia de proteínas
Pentraxina, que recibe su nombre por su capacidad de formar
pentámeros. Esta familia se compone de 8 proteínas que pueden
subdividirse en dos clases estructurales de acuerdo a su tamaño; las
pentraxinas cortas (aprox. 200 aminoácidos) y las largas (aprox. 400
aminoácidos) ^{8}. Las pentraxinas cortas, identificadas hace ya
tiempo en primer lugar, forman parte de la respuesta de fase aguda
del sistema inmunitario innato e incluyen la proteína
C-reactiva (CRP) y el componente amiloide P del
suero (SAP). Las Pentraxinas largas, que han sido identificadas más
recientemente, comparten con las cortas el dominio Pentraxina en el
lado C-terminal, pero en su lado
Amino-terminal son muy diferentes entre si. Existen
al menos tres Pentraxinas largas que se expresan en sistema
nervioso: la Pentraxina Neuronal 1 (NP1), la pentraxina relacionada
con actividad neuronal o Pentraxina Neuronal 2 (Narp o NP2) y el
receptor de pentraxina neuronal (NPR) ^{7:9-11}.
Del estudio de las secuencias se predice que la NP1 y la NP2 son
proteínas de secreción, mientras que NPR se identifica como una
proteína transmembrana tipo II sin dominio intracelular ^{9:12}.
La función fisiológica de las pentraxinas neuronales no ha sido aun
establecida. Sin embargo, en base a la homología que NP1 tiene con
las pentraxinas más cortas como la proteína
C-reactiva y la proteína P amiloide de suero, se
propuso inicialmente que la función de la NP1 es la de captar
material de desecho durante la remodelación de la sinapsis
(Schlimgen et al., 1995; Omeis et al., 1996;
Kirkpatrick et al., 2000). Por otro lado, estudios mas
recientes del grupo de Paul Worley (J. Hopkins) han demostrado que
Narp/NP2 tiene efectos sinaptogénicos y participa en fenómenos de
remodelación sináptica ^{13:14}.
Los estudios del grupo de Paul Worley and
Richard Huganir han demostrado que la NP1 y la NP2 regulan el
agrupamiento del subtipo AMPA de receptores de glutamato en sinapsis
excitadoras, uniéndose a ellos en un dominio extracelular. La mitad
amino terminal de la NP1 codifica varios dominios de
espiral-enrollada (coiled-coil) que
son esenciales para la multimerización de NP1 con ella misma o con
otras proteínas ^{13}. Además, la mitad carboxilo terminal de la
NP1 codifica un dominio de lectina dependiente de calcio que
reconoce oligosacáridos en glicoproteínas o glicolípidos. Hasta el
momento se ha demostrado que la NP1 se une a los subtipos de
receptores AMPA de glutamato ^{14},
pero aún no se han identificado otras proteínas que interactúen con NP1, a excepción de NP2 y los receptores de AMPA. Hasta muy recientemente, tampoco se conocía ni la función, ni ninguna interacción, del receptor de pentraxinas NPR. Pero un estudio muy reciente ha demostrado que NPR tiene un dominio CROMO (dominio modificador de la organización de cromatina) que es un dominio de interacción con otras proteínas y ADN. En este estudio se demuestra que NPR a través de su dominio CROMO se une al dominio intracelular del receptor de tirosina fosfatasa PTPRO que está implicado en guía y crecimiento axonal ^{15}. Este resultado permite considerar que los posibles efectos sobre neuritogénesis de la NP1 pueden estar mediados por una interacción con NPR y el receptor de tirosina fosfatasa PTPRO asociado a él.
pero aún no se han identificado otras proteínas que interactúen con NP1, a excepción de NP2 y los receptores de AMPA. Hasta muy recientemente, tampoco se conocía ni la función, ni ninguna interacción, del receptor de pentraxinas NPR. Pero un estudio muy reciente ha demostrado que NPR tiene un dominio CROMO (dominio modificador de la organización de cromatina) que es un dominio de interacción con otras proteínas y ADN. En este estudio se demuestra que NPR a través de su dominio CROMO se une al dominio intracelular del receptor de tirosina fosfatasa PTPRO que está implicado en guía y crecimiento axonal ^{15}. Este resultado permite considerar que los posibles efectos sobre neuritogénesis de la NP1 pueden estar mediados por una interacción con NPR y el receptor de tirosina fosfatasa PTPRO asociado a él.
Por otro lado, investigando la influencia de los
diversos trayectos de señalización intracelulares que controlan la
supervivencia y la muerte celular sobre la expresión de NP1 se ha
demostrado que la sobreexpresión de NP1 durante el proceso de muerte
apoptótica se induce por una fosforilación activadora de la
actividad de la quinasa GSK3. Ni los trayectos de señalización
implicados en muerte celular, como las proteínas quinasas activadas
por estrés (SAP quinasas) c-jun
N-terminal (JNK) o p38, ni el trayecto de
señalización trófica PI3K/AKT activado por IGF, regulan la expresión
de NP1^{16}. El hallazgo de que la expresión de NP1 se regula por
la quinasa GSK3 proporciona evidencia que indica que la degeneración
neurítica inducida por NP1 comparte un mecanismo común con la
neurodegeneración inducida por beta-amiloide. Varios
estudios han demostrado que beta-amiloide provoca un
incremento de la actividad de la quinasa GSK3^{17} y que GSK3 está
incrementada en el cerebro con la enfermedad de Alzheimer (ver
revisión en ^{18}.
Por otro lado, existe evidencia muy bien fundamentada de que el incremento de la actividad de la quinasa GSK3 produce retracción neurítica, mientras que la reducción de la actividad GSK3 produce sinaptogénesis ^{19-22}.
Por otro lado, existe evidencia muy bien fundamentada de que el incremento de la actividad de la quinasa GSK3 produce retracción neurítica, mientras que la reducción de la actividad GSK3 produce sinaptogénesis ^{19-22}.
La mayoría de los procedimientos y técnicas de
intervención terapéutica que hasta la fecha se dirigen a impedir el
daño neuronal en los trastornos neurológicos tienen como objetivo el
disminuir los estímulos tóxicos que causan el trastorno ^{23}. Por
ejemplo, en la enfermedad de Alzheimer, existe gran cantidad de
resultados que indican que los oligómeros solubles de la proteína
beta-amiloide (Ab) son la causa de la pérdida de
memoria, la demencia y la neurodegeneración que son las
características típicas de la enfermedad ^{24-26}.
En base a esta evidencia, la mayoría de las estrategias de
tratamiento y prevención de la enfermedad de Alzheimer pretenden
reducir la cantidad de proteína Ab, ya sea por modulación
farmacológica de las secretasas de Ab o por inmunoterapia activa o
pasiva para reducir la cantidad de oligómeros solubles de Ab
^{23}.
Hace ya tiempo que se ha postulado que la
neurotoxicidad inducida por el péptido Ab es la responsable de las
alteraciones sinápticas y la degeneración neuronal que se observa en
la enfermedad de Alzheimer ^{27}. A pesar de que la hipótesis
apoptótica de la degeneración neuronal en el cerebro de Alzheimer es
un tema aún en debate ^{26}, varios análisis histológicos de
cerebros de pacientes con la enfermedad han identificado neuronas
con morfología apoptótica ^{28}.
Además, diversos estudios han demostrado que el péptido Ab induce el programa de muerte apoptótica en cultivos primarios de neuronas ^{29:30}.
Además, diversos estudios han demostrado que el péptido Ab induce el programa de muerte apoptótica en cultivos primarios de neuronas ^{29:30}.
Experimentos previos han demostrado que la
Pentraxina Neuronal 1 (NP1) forma parte del programa de muerte
neuronal apoptótica ^{6:16}. Así, los resultados demuestran que la
reducción de actividad neuronal por privación de potasio produce un
gran incremento en la expresión de NP1 antes de causar muerte
neuronal. Estos resultados permitieron proponer una nueva función
para la NP1: que la NP1 es parte del programa génico de muerte
apoptótica que se induce por reducción de actividad ^{6}.
A diferencia de la proteína NP1, se ha
demostrado que la expresión de la otra pentraxina de la familia de
las pentraxinas largas, la Narp/NP2 no se altera por la reducción de
actividad u otros estímulos neurotóxicos. Por el contrario, la
expresión de Narp/NP2 se incrementa sólo cuando se aumenta la
actividad neuronal en situaciones como la potenciación a largo plazo
o las convulsiones ^{11}. En base a estas observaciones, se ha
planteado la hipótesis que las pentraxinas neuronales NP1/NP2 forman
parte de un interruptor génico operado por actividad neuronal. Por
otro lado, existe evidencia que indica que Ab induce degeneración
neurítica en cultivos primarios de neuronas de hipocampo por un
mecanismo común al proceso apoptótico ^{31}.
Por otro lado, recientemente se ha demostrado
que la producción de Ab depende de la actividad neuronal y que a su
vez, la proteína Ab reduce la neurotransmisión sináptica excitadora
^{33:34}.
\vskip1.000000\baselineskip
Un aspecto de la presente invención lo
constituye un compuesto útil para la elaboración de medicamentos o
composiciones farmacéuticas para el tratamiento de enfermedades
humanas neurológicas, preferentemente enfermedades
neurodegenerativas, en adelante compuesto de la presente invención,
constituido por un compuesto o agente inhibidor de la actividad de
la proteína NP1 humana.
Por tanto, un aspecto particular de la invención
lo constituye un compuesto de la invención en que el compuesto
inhibidor es un ácido nucleico o polinucleótido que impide o
disminuye la expresión del gen codificante de la proteína NP1 humana
y que incluye, al menos, una secuencia de nucleótidos seleccionada
entre:
a) una secuencia de nucleótidos antisentido
especifica de la secuencia del gen o del mRNA de la proteína
NP1,
b) una ribozima específica del mRNA de la
proteína NP1,
c) un aptámero específico del mRNA de la
proteína NP1,
d) un RNA de interferencia (shRNAi) específico
del mRNA de la proteína NP1, y
e) un microRNA específico del mRNA de la
proteína NP1.
Otro aspecto particular de la invención lo
constituye un compuesto de la invención en que el compuesto
inhibidor es vector, en adelante vector de la expresión, que
comprende un ácido nucleico o polinucleótido de la invención que
impide o disminuye la expresión del gen codificante de la proteína
NP1 humana, ya sea un vector de expresión o un vector de
transferencia.
Otro aspecto particular de la invención lo
constituye un compuesto de la invención en que el compuesto
inhibidor es un anticuerpo específico de la proteína NP1 humana y
funcionalmente activo que impide o disminuye la actividad
neurodegenerativa de la proteína NP1 humana, ya sea monoclonal o
policlonal.
Otra realización particular de la presente
invención lo constituye el anticuerpo de la invención en el que es
un anticuerpo, preferentemente policlonal, específico de un epítopo
constituido por la secuencia de aminoácidos correspondiente a la
secuencia X-Y de la proteína NP1 Humana (SEO ID
NO18).
Otro aspecto particular de la invención lo
constituye un péptido o epítopo de la proteína NP1 humana, en
adelante péptido de la invención, basada porque constituida por un
fragmento de la zona comprendida entre los aminoácidos 24 a 229 de
la proteína NP1, preferentemente de un tamaño de 15 aminoácidos.
Otro aspecto de la presente invención lo
constituye el uso de un compuesto o agente inhibidor de la actividad
de la proteína NP1 humana, en adelante uso de un compuesto de la
presente invención, en la elaboración de un medicamento o
composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades humanas
neurológicas, preferentemente enfermedades neurodegenerativas, más
preferentemente la enfermedad de Alzheimer.
Otro aspecto de la presente invención lo
constituye una composición farmacéutica o un medicamento para el
tratamiento de enfermedades neurológicas, preferentemente
neurodegenerativas, en adelante composición farmacéutica de la
presente invención, que comprende una cantidad terapéuticamente
efectiva de un compuesto o agente inhibidor de la proteína NP1
humana, junto con, opcionalmente, uno o más adyuvantes y/o vehículos
farmacéuticamente aceptables.
Otro aspecto particular de la presente invención
lo constituye la composición farmacéutica de la invención en la que
el compuesto inhibidor es un ácido nucleico o polinucleótido que
impide o disminuye la expresión del gen codificante de la proteína
NP1 humana y que comprende, al menos, una secuencia de nucleótidos
seleccionada entre:
a) una secuencia de nucleótidos antisentido
especifica de la secuencia del gen o del mRNA de la proteína
NP1,
b) una ribozima específica del mRNA de la
proteína NP1,
c) un aptámero específico del mRNA de la
proteína NP1,
d) un RNA de interferencia (iRNA) específico del
mRNA de la proteína NP1, y
e) un microRNA de interferencia (iRNA)
específico del mRNA de la proteína NP1.
Otro aspecto particular de la presente invención
lo constituye la composición farmacéutica de la invención en la que
el compuesto inhibidor es un anticuerpo específico de la proteína
NP1. Esta composición terapéutica puede ser utilizada en un
procedimiento terapéutico de inmunización pasiva de pacientes con
una enfermedad neurodegenerativa, preferentemente con enfermedad de
Alzheimer.
Otro aspecto particular de la presente invención
lo constituye la composición farmacéutica de la invención en la que
el compuesto inhibidor es un péptido de la invención y que puede ser
utilizada en un procedimiento terapéutico de inmunización activa de
pacientes con una enfermedad neurodegenerativa, preferentemente con
enfermedad de Alzheimer.
Otro objeto de la presente invención lo
constituye el uso de la composición farmacéutica de la invención en
un método de tratamiento de un mamífero, preferentemente un ser
humano, afectado por una enfermedad neurológica, preferentemente una
enfermedad neurodegenerativa, más preferentemente la enfermedad de
Alzheimer, en adelante uso de la composición farmacéutica de la
presente invención, consistente en la administración de dicha
composición terapéutica que inhibe el proceso neuropatológico.
La presente invención se basa en que los
inventores han observado que la reducción de la expresión de una de
las proteínas del programa intrínseco de muerte celular apoptótica,
concretamente la pentraxina neuronal 1, proteína NP1, induce el
incremento de proteínas sinápticas y un incremento de la
excitabilidad neuronal lo que permite la reducción o detención de
los procesos de neurodegeneración que tienen lugar en mamíferos,
preferentemente humanos, y más preferentemente en la enfermedad de
Alzheimer. Así, cuando la actividad neuronal disminuye, como pasa
cuando se acumula mucho Ab, aumenta la cantidad de NP1 y se inicia
el proceso de reducción de sinapsis y neurodegeneración
apoptótica.
Más concretamente, los resultados que se han
obtenido demuestran que la exposición de cultivos primarios de
neuronas corticales al péptido Ab incrementa la expresión de NP1
antes de inducir la muerte apoptótica (Figura 1). Además, se ha
demostrado también que la NP1 es un factor esencial para que se
produzca la neurotoxicidad por Ab, y que provoca a su vez pérdida de
sinapsis y daño neuronal. La pérdida de contactos sinápticos entre
neuronas está directamente relacionada con pérdida de memoria.
Cuando se bloquea el incremento de NP1 mediante silenciamiento
génico por RNA de interferencia se impide el daño a la sinapsis y se
previene la aparición de los efectos neurotóxicos de Ab (Figura 2).
En cambio, en ausencia de Ab, si se tratan las neuronas con NP1 se
reproduce el proceso neuropatológico inducido por Ab. Además, se ha
observado también que la cantidad de NP1 es mucho más elevada en
cerebros de pacientes con Alzheimer que en cerebros control (Figura
3). En los cerebros diagnosticados con Alzheimer la NP1 se localiza
en las dendritas neuronales dañadas, donde se asocia con proteínas
sinápticas como SNAP-25 y sinaptofisina. Estos
resultados establecen que la NP1 desempeña un papel clave en la
neurotoxicidad provocada por los oligómeros solubles de la proteína
beta amiloide en la enfermedad de Alzheimer.
Igualmente, la reducción de la expresión de la
proteína NP1 mediante silenciamiento génico por RNAi produce un
incremento significativo de las proteínas sinápticas PSD95 y
sinaptofisina y por tanto un incremento del número de sinapsis
excitadoras, lo que constituye una evidencia de recuperación o
mantenimiento de parámetros relacionados con la memoria (Figura 4);
y al mismo tiempo produce un incremento de la excitabilidad neuronal
en cultivos primarios de neuronas corticales (Figura 5).
Se ha comprobado que anticuerpos dirigidos
contra epítopos de la proteína de la NP1 humana (NPTX1_HUMAN,
SwissProt primary accesión number Q15818) reconocen las formas
nativas y desnaturalizadas de NP1 y son capaces de inmunoprecipitar
NP1 (Figura 6), lo que permite postular su uso en procesos
terapéuticos de inmunización pasiva de pacientes con una enfermedad
neurodegenerativa, preferentemente con enfermedad de Alzheimer.
Además, péptidos derivados de la secuencia de la proteína NP1
humana, más preferentemente, péptidos cuya secuencia se encuentre
dentro de la zona entre los aminoácidos 24 a 229 de NP1, pueden
utilizarse como medicamentos inductores de una inmunización activa
(generación de anticuerpos endógenos) en pacientes con una
enfermedad neurodegenerativa, preferentemente con enfermedad de
Alzheimer.
A diferencia de la enfermedad de Alzheimer, la
epilepsia es un trastorno neurológico crónico que se caracteriza por
la aparición de forma recurrente de convulsiones espontáneas. Las
convulsiones se asocian a un hipereexcitabilidad neuronal en
determinadas zonas cerebrales que se produce por una actividad
neuronal excesiva o asincrónica. Indicar comentario adicional que
razone las posibles aplicaciones de estos mismos elementos para el
tratamiento de la epilepsia.
En resumen, los resultados de la presente
invención permiten el desarrollo de nuevas aproximaciones
terapéuticas de enfermedades neurodegenerativas, mediante el uso de
composiciones farmacéuticas que comprendan principios activos
inhibidores de la expresión de la proteína humana NP1. Por otro
lado, la regulación de la expresión de NP1 puede representar un
tratamiento terapéutico eficaz para otros trastornos neurológicos
crónicos como los trastornos convulsivos.
Por lo tanto, un aspecto de la presente
invención lo constituye un compuesto útil para la elaboración de
medicamentos o composiciones farmacéuticas para el tratamiento de
enfermedades humanas neurológicas, preferentemente enfermedades
neurodegenerativas, en adelante compuesto de la presente invención,
constituido por un compuesto o agente inhibidor de la actividad de
la proteína NP1 humana.
Tal como se utiliza en la presente invención el
término "compuesto/agente inhibidor o antagonista" se refiere a
una molécula que cuando se une o interactúa con la proteína NP1
humana, o con fragmentos funcionales de la misma, disminuye o
elimina la intensidad o la duración de la actividad biológica
neurodegenerativa de dicha proteína. En esta definición se incluye
además aquellos compuestos que impiden o disminuyen la expresión del
gen codificante de la proteína NP1 humana, es decir, que impiden o
diminuyen la transcripción del gen, la maduración del RNAm, la
traducción del RNAm y la modificación
post-traduccional. Un agente inhibidor puede estar
constituido por un péptido, una proteína, un ácido nucleico o
polinucleótido, un carbohidrato, un anticuerpo, un compuesto químico
o cualquier otro tipo de molécula que disminuya o elimina el efecto
y/o la función de la proteína NP1 humana.
A modo ilustrativo, dicho polinucleótido puede
ser un polinucleótido que codifica una secuencia de nucleótidos
antisentido especifica de la secuencia del gen o del mRNA de la
proteína NP1, o bien un polinucleótido que codifica una ribozima
específica del mRNA de la proteína NP1, o bien un polinucleótido que
codifica un aptámero específico del mRNA de la proteína NP1, o bien
polinucleótido que codifica un RNA de interferencia ("small
interference RNA" o siRNA) específico del mRNA de la proteína
NP1, o bien polinucleótido que codifica un microRNA específico del
mRNA de la proteína NP1 humana.
Tal como se utiliza en la presente invención
"proteína NP1 humana" se refiere a una proteína con la
secuencia de referencia siguiente: NPTX1_HUMAN, SwissProt primary
accesión number Q15818, o a una vahante funcionalmente equivalente
de la misma.
Por "vahante funcionalmente equivalente" o
"variante" se entiende, en el contexto de la presente
invención, toda proteína que se puede obtener a partir de la NP1
humana anteriormente indicada mediante la sustitución, deleción o
inserción de uno o más aminoácidos y que mantiene sustancialmente la
función de la proteína original. La determinación de la función de
la NP1 humana se puede llevar a cabo usando métodos convencionales
ampliamente conocidos para el experto en la materia, entre los
cuales están los utilizados en la presente invención. Esta variante
comprende fragmentos de la proteína NP1 humana con actividad
neurodegenerativa.
En el caso de las variantes por substitución, la
substituciones son preferentemente substituciones conservativas,
esto es, los aminoácidos se sustituyen por otros con características
similares en cuanto a la propiedades de su cadena la-
teral. Así, substituciones conservativas incluyen substituciones dentro de los grupos de amino ácidos según la tabla 1.
teral. Así, substituciones conservativas incluyen substituciones dentro de los grupos de amino ácidos según la tabla 1.
Adicionalmente, uno ó más de los aminoácidos de
las variantes de la invención pueden estar sustituidos por
aminoácidos no convencionales naturales o sintéticos como por
ejemplo, beta-amino ácidos, ácido
2-aminoadípico, alpha-asparagina,
ácido 2-aminobutanoico, ácido
2-aminiocáprico, alpha-glutamina,
alpha-metilalanina, ácido
2-aminopimélico, ácido
gamma-amino-beta-hidroxibenzenopentanoico,
ácido 2-aminosubérico,
2-carboxiazetidina, beta-alanina,
ácido beta-aspártico, ácido 3,6 diaminohexanoico,
ácido butanoico, ácido 4-amino
4-amino-3-hidroxibutanoico,
ácido
gamma-amino-beta-hidroxiciclohexanepentanoico,
N5-aminocarbonilornitina,
3-sulfoalanina, ácido 2,4 diaminobutanoico, ácido
diaminopimélico, ácido 2,3 diaminopropanoico, ácido 2,7
diaminosubérico, S-etiltiocisteina, ácido
gamma-glutámico, ácido
gamma-carboxiglutámico, ácido pirogultámico,
homarginina, homocisteina, homohistinba, homoserina, ácido
2-hidroxiisovalérico, ácido
2-hidroxipentanoico,
5-hidroxilisina, 4-hidroxiprlolina,
2-carboxioctahidroindol,
3-carboxiisoquinolina, isovalina, ácido
2-hidroxipropanoico, ácido mercaptoacético, ácido
mercaptobutanoico,
4-metil-3-hidroxiprolina,
ácido mercaptopropanoico, norlceucina, nortirosina, norvalina,
ornitina, penicilamina, 2-fenilglicina,
2-carboxipiperidina, sarcosina,
1-amino-1-carboxiciclopentano,
statin, 3-tienilalanina,
epsilon-N-trimetilisina,
3-tiazolialanina, ácido
alpha-amino-2,4-dioxopirimidinapropanoico.
Adicionalmente, la invención contempla variantes
de los péptidos de la invención en los que uno o más aminoácidos han
sufrido modificaciones en su cadena lateral. Ejemplos de
modificaciones de cadena lateral contempladas en la presente
invención incluyen modificaciones de grupos amino tales como
alquilación, amidinación, acilación, carbomoilación,
trinitrobencilación, piridoxilación, modificaciones del grupo
guanidino de los restos de arginina consistentes en la formación de
condensados heterocíclicos; modificaciones de los grupos carboxilo
mediante amidación, modificaciones de tirosinas mediante
metoxilación, modificación del anillo imidazólico de la histidina
mediante alquilación o N-carboxietilación,
modificaciones de la prolina mediante hidrixliación en posición 4.
Alternativamente, la invención contempla variantes de los péptidos
de la invención mediante glicosilación, es decir, la adición de
grupos de glicano bien en la cadena lateral serine y/o treonina
(O-glicosliación) o en la cadena lateral asparagina
y/o glutamina (N-glicosilación). Los glicanos que
pueden incorporarse a los polipéptidos de la invención incluyen un
número variable de unidades glucídicas (mono-, di-, tri,
tetrasacáridos y sucesivos). Los monosacáridos que forman en glicano
incluyen D-alosa, D-altrosa,
D-glucosa, D-manosa,
D-gulosa, D-idosa,
D-galactosa, D-talosa,
D-galactosamina, D-glucosamina,
D-N-acetylgucosamina,
D-N-acetylgalatosamina,
D-fucosa o D-arabinosa.
Alternativamente, la invención contempla
variantes de los polipéptidos de la invención en los que se incluyen
los estereoisómeros D de al menos uno de los aminoácidos que
constituyen la cadena peptídico para dar así lugar a los isómeros
retro-inverersos.
En otra forma de realización, la invención
contempla peptidomiméticos de los polipéptidos de la invención, es
decir, variantes en las que uno o más de los enlaces peptídicos ha
sido reemplazado por un tipo alternativo de enlace covalente. Dichos
peptidomiméticos se caracterizan por mostrar una mayor estabilidad
al ser más resistentes a proteasas. Modificaciones del esqueleto
peptídico incluyen la sustitución o la inserción en los elementos
del enlace peptídico (-NH-, -CH-, -CO-) de grupos tales como -O-,
-S-, -CH2 en lugar de -NH-, -N-, -C-alquil p -BH-
en lugar de -CHR y -CS-, -CH2-, -SOn-, -P=O(OH)- o
-B(OH)- en lugar de -CO-. Adicionalmente, es posible aumentar
la estabilidad de los péptidos de la invención usando grupos que
bloqueen el extremo N-terminal tales como
t-butiloxicarbonil, acetil, succinil,
metoxisuccinil, suberil, adipil, dansil, benciloxicarbonil,
fluorenilmetoxicarbonil, metoxiadipil, metoxiadipil, metoxisuberil y
2,3-dinitrofenil. Alternativa p simultaneamente, es
posible modificar el extremo C-terminal de los
péptidos mediante amidación.
La determinación del grado de identidad entre
las variantes y los polipéptidos definidos en las secuencias 1 a 19
se lleva a cabo usando métodos y algoritmos informáticos ampliamente
conocidos para el experto en la materia Preferentemente, la
identidad entre dos secuencias de aminoácidos se determina usando el
algoritmo BLASTP (BLAST Manual, Altschul, S., et al, NCBI NLM
NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S., et al., J. Mol. Biol.
21 5: 403-410 (1990). Preferiblemente, los
polipéptidos objeto de la invención muestran una identidad de
secuencia con los polipéptidos definidos en las secuencias de SEQ ID
NO:1 a 19 de al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%,
al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos
94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al
menos 99%.
Por tanto, un aspecto particular de la invención
lo constituye un compuesto de la invención en que el compuesto
inhibidor es un ácido nucleico o polinucleótido que impide o
disminuye la expresión del gen codificante de la proteína NP1 humana
y que incluye, al menos, una secuencia de nucleótidos seleccionada
entre:
a) una secuencia de nucleótidos antisentido
especifica de la secuencia del gen o del mRNA de la proteína
NP1,
b) una ribozima específica del mRNA de la
proteína NP1,
c) un aptámero específico del mRNA de la
proteína NP1,
d) un RNA de interferencia (shRNAi) específico
del mRNA de la proteína NP1, y
e) un microRNA específico del mRNA de la
proteína NP1.
Por otro lado, estas técnicas de inhibición
génica, y más concretamente la vehiculización de los
compuestos
-oligonucleótidos antisentido, iRNA, ribozimas o aptameros- puede llevarse a cabo mediante el uso de nanopartículas que incrementan el éxito de dicha transferencia (Lu PV and Woodle MC, Adv Genet 54: 117-42, 2005; Hawker CJ and Wooley KL, Science 19 (309): 1200-5, 2005).
-oligonucleótidos antisentido, iRNA, ribozimas o aptameros- puede llevarse a cabo mediante el uso de nanopartículas que incrementan el éxito de dicha transferencia (Lu PV and Woodle MC, Adv Genet 54: 117-42, 2005; Hawker CJ and Wooley KL, Science 19 (309): 1200-5, 2005).
Un aspecto más particular de la invención lo
constituye un RNAi que se une preferentemente a la secuencia
fragmento de RNAm de NP1 GTACAGCCGCCTCAATTCT (SEQ ID NO1; esta
secuencia se corresponde a las bases 1004 a 1022 del mRNA de NP1 de
rata (Genbank Accession number U18772)) o a otro fragmento que
comprenda a esta secuencia.
Así, una realización particular lo constituye un
shRNAi contra NP1 (SEQ ID NO1) expresado por la pareja de
nucleótidos siguiente: 5'-gatcccc
GTACAGCCGCCTCAATTCT ttcaagaga AGAATTGAGGCGGCTGTAC ttttt-'3 (SEQ ID
NO4, sentido) y la 5'-agctaaaaa GTACAGCCGCCTCAATTCT
tctcttgaa AGAATTGAGGCGGCTGTAC ggg-3' (SEQ ID NO5,
antisentido).
Otra realización particular lo constituye un
shRNAi contra la forma homologa de la SEQ ID NO1 correspondiente a
las bases 602 a 620 del mRNA de NP1 humano (Genbank Acession number
NM_002522) y expresado por la pareja de nucleótidos siguiente:
5'-gatcccc GCAGTACAGCCGCCTCAAT ttcaagaga
ATTGAGGCGGCTGTACTGC ttttt-'3 (SEQ ID NO6, sentido), y la
5'-agctaaaaa GCAGTACAGCCGCCTCAAT tctcttgaa
ATTGAGGCGGCTGTACTGC ggg-3' (SEQ ID NO7,
antisentido).
Otro aspecto más particular de la invención lo
constituye un RNAi que se une preferentemente a la secuencia
fragmento de RNAm de NP1 GCGGACCAACTACATGTAT (SEQ ID NO2; esta
secuencia se corresponde a las bases 1259 a 1277 del mRNA de NP1 de
rata (Genbank Accession number U18772)) o a otro fragmento que
comprenda a esta secuencia.
Otra realización particular lo constituye un
shRNAi contra NP1 (SEQ ID NO2) expresado por la pareja de
nucleótidos siguiente: 5'-gatcccc
GCGGACCAACTACATGTAT ttcaagaga ATACATGTAGTTGGTCCGC ttttt-'3 (SEQ ID
NO8, sentido) y la 5'-agctaaaaa GCGGACCAACTACATGTAT
tctcttgaa ATACATGTAGTTGGTCCGC ggg-3' (SEQ ID NO9,
antisentido).
Otra realización particular lo constituye un
shRNAi contra la forma homologa de la SEO ID NO1 correspondiente a
las bases 860 a 878 del mRNA de NP1 humano (Genbank Acession number
NM_002522) y expresado por la pareja de nucleótidos siguiente:
5'-gatcccc GCGGACCAACTATATGTAT ttcaagaga
ATACATATAGTTGGTCCGC ttttt-'3 (SEO ID NO10, sentido), y la
5'-agctaaaaa GCGGACCAACTATATGTAT tctcttgaa
ATACATATAGTTGGTCCGC ggg-3' (SEO ID NO11,
antisentido).
Otro aspecto más particular de la invención lo
constituye un RNAi que se une preferentemente a la secuencia
fragmento de RNAm de NP1 GAGATACTCATTAACGACA (SEQ ID NO3; esta
secuencia se corresponde a las bases 1434 a 1452 del mRNA de NP1 de
rata (Genbank Accession number U18772)) o a otro fragmento que
comprenda a esta.
Otra realización particular de la invención lo
constituye un shRNAi contra NP1 (SEQ ID NO3) expresado por la pareja
de nucleótidos siguiente: 5'-gatcccc
GAGATACTCATTAACGACA ttcaagaga TGTCGTTAATGAGTATCTC
ttttt-3' (SEQ ID NO12, sentido) y la
5'-agctaaaaa GAGATACTCATTAACGACA tctcttgaa
TGTCGTTAATGAGTATCTC ggg-3' (SEQ ID NO13,
antisentido).
Otra realización particular de la invención lo
constituye un shRNAi contra la forma homologa de la SEQ ID NO1
correspondiente a las bases 1035 a 1053 del mRNA de NP1 humano
(Genbank Acession number NM_002522) y expresado por la pareja de
nucleótidos siguiente: 5'-gatcccc
GAGATCCTCATCAATGACA ttcaagaga TGTCATT
GATGAGGATCTC ttttt-3' (SEQ ID NO14, sentido), y la 5'-agctaaaaa GAGATCCTCATCAATGACA tctcttgaa TGT
CATTGATGAGGATCTC ggg-3' (SEQ ID NO15, antisentido).
GATGAGGATCTC ttttt-3' (SEQ ID NO14, sentido), y la 5'-agctaaaaa GAGATCCTCATCAATGACA tctcttgaa TGT
CATTGATGAGGATCTC ggg-3' (SEQ ID NO15, antisentido).
Las secuencias de nucleótidos
a)-e) mencionadas previamente impiden la expresión
del gen en mRNA o del mRNA en la proteína NP1, y, por tanto, anulan
su función biológica, y pueden ser desarrolladas por un experto en
el sector de ingeniería genética en función del conocimiento
existente en el estado del arte sobre transgénesis y anulación de la
expresión génica (Clarke, A.R. (2002) Transgenesis Techniques.
Principies and Protocols, 2ª Ed. Humana Press, Cardiff University;
Patente US20020128220. Gleave, Martin. TRPM-2
antisense therapy; Puerta-Ferández E et al.
(2003) Ribozymes: recent advances in the development of RNA tools.
FEMS Microbiology Reviews 27: 75-97; Kikuchi, et
al., 2003. RNA aptamers targeted to domain II of Hepatitis C
virus IRES that bind to its apical loop región. J. Biochem. 133,
263-270; Reynolds A. et al., 2004. Rational
siRNA design for RNA interference. Nature Biotechnology 22 (3):
326-330).
Estos polinucleótidos mencionados pueden ser
utilizados en un proceso de terapia génica en el que mediante
cualquier técnica o procedimiento se permita la integración de los
mismos en las células, preferentemente, células de un paciente
humano enfermo. Este objetivo puede conseguirse mediante la
administración a las células neuronales de una construcción génica
que comprende uno de los polinucleótidos mencionados con el fin de
transformar dichas células permitiendo su expresión en el interior
de las mismas de manera que se inhiba la expresión de la proteína
NP1. Ventajosamente, dicha construcción génica puede estar incluida
dentro de un vector.
Tal como se utiliza en la presente invención el
término "vector" se refiere a sistemas utilizados en el proceso
de transferencia de un gen exógeno o de una construcción génica
exógena al interior de una célula, permitiendo de este modo la
vehiculación de genes y construcciones génicas exógenas, tal como,
por ejemplo, un vector de expresión o un vector de transferencia.
Dichos vectores pueden ser vectores no virales o vectores virales
(Pfeifer A, Verma IM (2001) Gene therapy: promises and problems.
Annu Rev Genomics Hum Genet 2: 177-211) y su
administración puede ser preparada por un experto en la materia en
función de las necesidades y especificidades de cada caso.
En general, el vector de expresión de la
presente invención comprende, al menos, la secuencia de nucleótidos
de la invención, al menos, un promotor que dirige su transcripción
(pT7, plac, ptrc, ptac, pBAD, ptet, etc), al que está
operativamente enlazado, y otras secuencias necesarias o apropiadas
que controlan y regulan la transcripción del gen. Ejemplos de
vectores de expresión apropiados pueden seleccionarse acuerdo con
las condiciones y necesidades de cada caso concreto entre plásmidos
de expresión de microorganismos que pueden contener, además,
marcadores utilizables para seleccionar las células transfectadas o
transformadas con el gen o genes de interés. La elección del vector
dependerá de la célula hospedadora y del tipo de uso que se quiera
realizar. Por tanto, según un modo de realización particular de la
presente invención dicho vector es un plásmido o un vector viral,
por ejemplo un lentivirus. La obtención de dicho vector puede
realizarse por métodos convencionales conocidos por los técnicos en
la materia al igual que para la transformación de microorganismos o
células eucariotas se pueden utilizar diferentes métodos
- transformación química, electroporación, microinyección, etc. - descritos en diversos manuales [Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. (1989). Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.]. Por otro lado, un vector de transferencia puede estar constituido, a título ilustrativo y sin que limite la invención, al siguiente grupo: microesferas, liposomas, nanopartículas y dendrímeros; los cuales tiene la capacidad de acoplarse a la secuencia de nucleótidos de la invención, vehiculizarla al interior de las células y liberarla posteriormente.
- transformación química, electroporación, microinyección, etc. - descritos en diversos manuales [Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. (1989). Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.]. Por otro lado, un vector de transferencia puede estar constituido, a título ilustrativo y sin que limite la invención, al siguiente grupo: microesferas, liposomas, nanopartículas y dendrímeros; los cuales tiene la capacidad de acoplarse a la secuencia de nucleótidos de la invención, vehiculizarla al interior de las células y liberarla posteriormente.
Así, otro aspecto particular de la invención lo
constituye un compuesto de la invención en que el compuesto
inhibidor es vector, en adelante vector de la expresión, que
comprende un ácido nucleico o polinucleótido de la invención que
impide o disminuye la expresión del gen codificante de la proteína
NP1 humana, ya sea un vector de expresión o un vector de
transferencia.
Otra realización particular de la invención lo
constituye un vector de expresión viral, preferentemente un
lentivirus capaz de expresar en el interior de la célula un
nucleótido que inhibe la expresión la proteína NP1 humana,
preferentemente el vector lentivirus
pLVTHM-shRNAi-NP1 desarrollado en la
presente invención (ver Material y Métodos) que comprende, al menos,
una de las parejas de secuencias siguientes:
- 5 secuencias SEQ ID NO 4 y 5,
- 6 secuencias SEQ ID NO 6 y 7,
- 7 secuencias SEQ ID NO 8 y 9,
- 8 secuencias SEQ ID NO 10 y 11,
- 9 secuencias SEQ ID NO 12 y 13, y
- 10 secuencias SEQ ID NO 14 y 15.
\vskip1.000000\baselineskip
Otro aspecto particular de la invención lo
constituye un compuesto de la invención en que el compuesto
inhibidor es un anticuerpo específico de la proteína NP1 humana y
funcionalmente activo que impide o disminuye la actividad
neurodegenerativa de la proteína NP1 humana, ya sea monoclonal o
policlonal.
Tal como se utiliza en la presente invención el
término "anticuerpo funcionalmente activo" se refiere a un
anticuerpo recombinante que mantiene su capacidad de unión a
antígeno, incluyendo minianticuerpos, que se definen como fragmentos
derivados de anticuerpos construidos por tecnología de ADN
recombinante, que, pese a su menor tamaño, conservan la capacidad de
unión al antígeno ya que mantienen al menos un dominio variable de
inmunoglobulina donde residen las zonas de unión a antígenos, y que
pertenece, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de la
invención, al siguiente grupo: antisueros policlonales, moléculas de
IgG purificadas, sobrenadantes o líquido ascítico que contiene
anticuerpos monoclonales, fragmentos Fv, Fab, Fab' y F(ab')2,
ScFvdiabodies, anticuerpos recombinantes monodominio (dAbs),
triabodies y tetrabodies anticuerpos humanizados. En el marco de la
presente invención, se entiende por anticuerpos recombinantes
monodominio y/o dominios tipo inmunoglobulina con capacidad de unión
y reconocimiento independiente, tanto a los dominios variables de
cadena pesada (VH), a los dominios variables de cadena ligera (VL),
a los anticuerpos recombinantes de camélidos (VHH), los anticuerpos
recombinantes de camélidos humanizados, los anticuerpos
recombinantes de otras especies camelizados, los anticuerpos
monodominio IgNAR de peces cartilaginosos; es decir, que se incluyen
tanto dominios que de forma natural son monodominio (caso de VHH e
IgNAR), como anticuerpos que por ingeniería se han alterado para que
por sí solos sean capaces de interaccionar con el antígeno y mejorar
sus propiedades de estabilidad y solubilidad. Se incluye en esta
definición cualquier modificación de los anticuerpos recombinantes
como su multimerización o la fusión a cualquier molécula (p.ej.
toxinas, enzimas, antígenos, otros fragmentos de anticuerpos,
etc.).
El anticuerpo funcionalmente activo puede ser
obtenido de un ser humano o un animal (p.ej. camellos, llamas,
vicuñas, ratones, ratas, conejos, caballos, tiburones nodriza, etc.)
o mediante técnicas de DNA recombinante o síntesis química de genes,
y por otro lado, incluye tanto a anticuerpos monoclonales como a
anticuerpos policlonales.
Otro aspecto más particular de la invención lo
constituye el anticuerpo de la invención, ya sea monoclonal o
policlonal, específico de un epítopo que se encuentra entre los
aminoácidos 24 a 229 de la secuencia de la proteína de la NP1 humana
(NPTX1_HUMAN, SwissProt primary accesión number Q15818),
preferentemente de epítopos ó péptidos de 15 aminoácidos de
tamaño.
Otra realización particular de la presente
invención lo constituye el anticuerpo de la invención en el que es
un anticuerpo, preferentemente policlonal, específico de un epítopo
constituido por la secuencia de aminoácidos correspondiente a la
secuencia perteneciente, a título ilustrativo y sin que limite el
alcance de la invención, al siguiente grupo: SEO ID NO18 y SEO ID
NO19 Tal como se comenta en los ejemplos la zona seleccionada por
los inventores (aminoácidos 24 y 229) es la más característica de la
NP1 y la que se diferencia más de otras proteínas como la NP2 y la
NP3 y se predice dominios de interacción con otras proteínas, que
hace de esta región una buena diana terapéutica, al igual que la
región homologa a ésta en la proteína NP1 humana.
Otro aspecto particular de la invención lo
constituye un péptido o epítopo de la proteína NP1 humana, en
adelante péptido de la invención, basada porque constituida por un
fragmento de la zona comprendida entre los aminoácidos 24 a 229 de
la proteína NP1, preferentemente de un tamaño de 15 aminoácidos, y
perteneciente, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de
la invención, al siguiente grupo: SEQ ID NO18 y SEQ ID NO19.
El péptido de la invención puede ser utilizado
para la producción de un anticuerpo de la invención útil para la
elaboración, por un lado, de un medicamento para un tratamiento de
inmunización pasiva, y por otro lado, de un medicamento para un
tratamiento de inmunización activa (generación de anticuerpos
endógenos) en pacientes con una enfermedad neurodegenerativa,
preferentemente con enfermedad de Alzheimer.
Otro aspecto de la presente invención lo
constituye el uso de un compuesto o agente inhibidor de la actividad
de la proteína NP1 humana, en adelante uso de un compuesto de la
presente invención, en la elaboración de un medicamento o
composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades humanas
neurológicas, preferentemente enfermedades neurodegenerativas, más
preferentemente la enfermedad de Alzheimer.
Otro aspecto particular de la invención lo
constituye el uso de un compuesto de la invención en que el
compuesto inhibidor es un ácido nucleico o polinucleótido que impide
o disminuye la expresión del gen codificante de la proteína NP1
humana.
Otro aspecto particular de la invención lo
constituye el uso de un compuesto en que el compuesto inhibidor es
un anticuerpo específico de la proteína NP1 humana y funcionalmente
activo que impide o disminuye la actividad neurodegenerativa de la
proteína NP1 humana.
\newpage
Otro aspecto particular de la invención lo
constituye el uso de un compuesto en que el compuesto inhibidor es
el péptido de la invención, de tal forma que el medicamento así
obtenido puede ser utilizado en un tratamiento de inmunización
activa (generación de anticuerpos endógenos) en pacientes con una
enfermedad neurodegenerativa, preferentemente con enfermedad de
Alzheimer.
Otro aspecto de la presente invención lo
constituye una composición farmacéutica o un medicamento para el
tratamiento de enfermedades neurológicas, preferentemente
neurodegenerativas, en adelante composición farmacéutica de la
presente invención, que comprende una cantidad terapéuticamente
efectiva de un compuesto o agente inhibidor de la proteína NP1
humana, junto con, opcionalmente, uno o más adyuvantes y/o vehículos
farmacéuticamente aceptables.
Los adyuvantes y vehículos farmacéuticamente
aceptables que pueden ser utilizados en dichas composiciones son los
adyuvantes y vehículos conocidos por los técnicos en la materia y
utilizados habitualmente en la elaboración de composiciones
terapéuticas.
En el sentido utilizado en esta descripción, la
expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la
cantidad del agente o compuesto inhibidor de la actividad de la
proteína NP1, calculada para producir el efecto deseado y, en
general, vendrá determinada, entre otras causas, por las
características propias de los compuestos, incluyendo la edad,
estado del paciente, la severidad de la alteración o trastorno, y de
la ruta y frecuencia de administración.
En una realización particular, dicha composición
terapéutica se prepara en forma de una forma sólida o suspensión
acuosa, en un diluyente farmacéuticamente aceptable. La composición
terapéutica proporcionada por esta invención puede ser administrada
por cualquier vía de administración apropiada, para lo cual dicha
composición se formulará en la forma farmacéutica adecuada a la vía
de administración elegida. En una realización particular, la
administración de la composición terapéutica proporcionada por esta
invención se efectúa por vía parenteral, por vía oral, por vía
intraperitoneal, subcutánea, etc. Una revisión de las distintas
formas farmacéuticas de administración de medicamentos y de los
excipientes necesarios para la obtención de las mismas puede
encontrarse, por ejemplo, en el "Tratado de Farmacia Galénica",
C. Faulí i Trillo, 1993, Luzán 5, S.A. Ediciones, Madrid.
Otro aspecto particular de la presente invención
lo constituye la composición farmacéutica de la invención en la que
el compuesto inhibidor es un ácido nucleico o polinucleótido que
impide o disminuye la expresión del gen codificante de la proteína
NP1 humana y que comprende, al menos, una secuencia de nucleótidos
seleccionada entre:
a) una secuencia de nucleótidos antisentido
especifica de la secuencia del gen o del mRNA de la proteína
NP1,
b) una ribozima específica del mRNA de la
proteína NP1,
c) un aptámero específico del mRNA de la
proteína NP1,
d) un RNA de interferencia (iRNA) específico del
mRNA de la proteína NP1, y
e) un microRNA de interferencia (iRNA)
específico del mRNA de la proteína NP1.
Otro aspecto particular de la presente invención
lo constituye la composición farmacéutica de la invención en la que
el compuesto inhibidor es un anticuerpo específico de la proteína
NP1. Esta composición terapéutica puede ser utilizada en un
procedimiento terapéutico de inmunización pasiva de pacientes con
una enfermedad neurodegenerativa, preferentemente con enfermedad de
Alzheimer.
Otro aspecto particular de la presente invención
lo constituye la composición farmacéutica de la invención en la que
el compuesto inhibidor es un péptido de la invención y que puede ser
utilizada en un procedimiento terapéutico de inmunización activa de
pacientes con una enfermedad neurodegenerativa, preferentemente con
enfermedad de Alzheimer.
Las composiciones terapéuticas de la presente
invención pueden administrarse en combinación con otros medicamentos
que se utilicen para el tratamiento de enfermedades
neurodegenerativas, con el objeto de actuar de forma complementaria
o como refuerzo (por ejemplo, con inhibidores de GSK3 que reducen la
sobre-expresión de NP1 ^{6}).
Otro objeto de la presente invención lo
constituye el uso de la composición farmacéutica de la invención en
un método de tratamiento de un mamífero, preferentemente un ser
humano, afectado por una enfermedad neurológica, preferentemente una
enfermedad neurodegenerativa, más preferentemente la enfermedad de
Alzheimer, en adelante uso de la composición farmacéutica de la
presente invención, consistente en la administración de dicha
composición terapéutica que inhibe el proceso neuropatológico.
Figura 1.- Los oligómeros solubles de Ab
1-42 incrementan la expresión de NP1 en cultivos
primarios de neuronas corticales. A) Ensayo de Western Blot
representativo que muestra el curso temporal del efecto de una
concentración máxima (20 \muM) de oligómeros de Ab sobre los
niveles de las proteínas NP1 y Actina. B) Análisis cuantitativo que
muestra el efecto concentración-dependiente de los
oligómeros solubles de Ab 1-42 (10 y 20 \muM)
sobre los niveles de proteína NP1. Los valores densitométricos de
las bandas correspondientes a la inmunoreactividad de NP1 fueron
normalizados con los valores respectivos de la banda de actina. La
proporción entre NP1 y actina se expresa como porcentaje de los
valores control. Los valores representan la media \pm el error
estándar de la media de, al menos, tres experimentos independientes.
* p<0.05, significativamente diferente de los valores control
(Análisis de varianza de una vía y comparación Bonferroni entre
grupos).
Figura 2- El silenciamiento de la expresión
de NP1 impide la reducción de sinapsis producida por Ab. La
expresión de NP1 fue silenciada por interferencia de RNA (RNAi)
mediante transducción lentiviral. Cultivos primarios de neuronas
corticales fueron transducidos con el vector lentiviral control
pLVTHM-shRandom o con el vector lentiviral de RNAi
dirigido contra NP1,
pLVTHM-shRNAi-NP1 (ver Material y
Métodos, secuencias SEQ ID NO 4 y 5). Cinco microlitros de
partículas lentivirales se añadieron a las neuronas corticales en el
momento de su siembra. A los 5 días de cultivo, las células fueron
tratadas durante 48 horas con vehículo (V) o con oligómeros de Ab
1-42 (20 \muM). A) Ensayo de Western
representativo que muestra que los oligómeros solubles Ab
1-42 producen una reducción significativa en los
niveles de sinaptofisina y que el silenciamiento de NP1 es capaz de
revertir este efecto. Se utilizó la inmunoreactividad contra Actina
como control de carga de proteínas. B) Análisis cuantitativo de los
efectos de los oligómeros solubles Ab 1-42 y del
silenciamiento de NP1 por RNAi sobre los niveles de sinaptofisina.
Los valores densitométricos de las bandas correspondientes a la
inmunoreactividad de sinaptofisina fueron normalizados con los
valores respectivos de la banda de actina. La proporción entre NP1 y
actina se expresa como porcentaje de los valores control. Los
valores representan la media \pm el error estándar de la media de
al menos tres experimentos independientes. * p<0.05,
significativamente diferente de los valores control (prueba t de
grupos independientes). C, control. V, Vehículo.
Figura 3.- Los niveles de NP1 están
incrementados en cerebros de pacientes con la enfermedad de
Alzheimer. Análisis de proteínas en tejido de hipocampo donde se
comprueba que la cantidad de la banda de 54 KDa correspondiente a
NP1 está incrementada en cerebros de dos (2) pacientes
diagnosticados con la enfermedad de Alzheimer (AD) comparados con
tejido de pacientes control (C). La especificidad de la
inmunoreactividad de NP1 en el tejido humano se demuestra porque la
banda desaparece después de la pre-absorción del
anticuerpo con proteína NP1 recombinante (Pr).
Figura 4.- El silenciamiento de la expresión
de NP1 por RNAi incrementa los niveles de proteínas
pre-sinápticas (Sinaptofisina) y
post-sinápticas (PSD95) en las sinapsis
excitadoras. El silenciamiento de NP1 por RNAi, pero no la
sobre-expresión de NP1, produce un incremento
significativo de los niveles de sinaptofisina, representado en A) y
de PSD95, representado en B). Los valores densitométricos de las
bandas correspondientes a la inmunoreactividad de sinaptofisina y
PSD95 fueron normalizados con los valores respectivos de la banda de
actina. Las proporciones sinaptofisina/actina y PSD95/actina se
expresan como porcentaje de los valores control. Los valores
representan la media \pm el error estándar de la media de al menos
tres experimentos independientes. * p<0.05, significativamente
diferente de los valores control (análisis de varianza de una vía
con la comparación de grupos Bonferroni).
Figura 5.- El silenciamiento de la expresión
de NP1 por RNAi incrementa la excitabilidad neuronal medida por las
oscilaciones del nivel de calcio intracelular. En A) se
representa la oscilación espontánea en la concentración de calcio
intracelular que muestran las neuronas corticales en cultivo
tratadas con el vector lentiviral control
pVLTHM-shRandom. B) Las neuronas corticales tratadas
con el vector lentiviral pVTLHM-shNP1 para silenciar
NP1 manifiestan un incremento significativo en oscilación espontánea
de la concentración intracelular de calcio que indica que el
silenciamiento de NP1 provoca un aumento de la excitabilidad
neuronal que depende de receptores de amino-ácidos excitadores. El
tratamiento con tetradotoxina 5 \muM bloquea completamente las
oscilaciones indicando que son resultado de actividad de
neurotransmisión. Los resultados se expresan en % del valor basal de
la fluorescencia de Fura-2 a 340/380 y son el
promedio de al menos diez células corticales.
Figura 6.- Un anticuerpo policlonal dirigido
contra epítopos que se encuentran entre los aminoácidos 24 a 229 de
la secuencia de la proteína de la NP1 humana inmunoprecipita
NP1. El ensayo de inmunoprecipitación se realizó en células
SH-SY5Y que sobre-expresan de forma
permanente NP1. El lisado Total fue incubado con el anticuerpo
contra NP1 y la inmunoprecipitación fue realizada con proteína G
unida a partículas de sefarosa. La figura es un ensayo de western
blot representativo que muestra la inmunoreactividad de NP1 en el
lisado total (carril 1), en el sobrenadante después de
inmunoprecipitar (carril 2), y en el inmunoprecipitado con un
anticuerpo contra los aminoácidos 210-224 de la
proteína NP1 humana (carril 3).
Figura 7.- La sobre-expresión
de NP1 reduce la longitud de neuritas e incrementa la apoptosis,
mientras que el silenciamiento de la expresión de NP1 bloquea estos
efectos. En A) se representa el efecto de
sobre-expresión de NP1 en células de neuroblastoma
humano SH-SY5Y. Estas células fueron transducidas
con el vector lentiviral control pWPI que expresa la proteína verde
fluorescente (GFP), o con el vector lentiviral
pWPI-NP1 que además de GFP,
sobre-expresa NP1. Las células transducidas con este
último vector, si expresan GFP, también
sobre-expresan NP1, que produce a su vez una
reducción significativa de la longitud de sus prolongaciones
neuríticas. En B) se representa el efecto de
sobre-expresión de NP1 y silenciamiento de ésta
sobre-expresión en neuronas corticales en cultivo.
Las neuronas corticales fueron tratadas con doble infección: primero
con el lentivirus control (pWPI-C) o con el
lentivirus que sobre-expresa NP1
(pWPI-NP1) o inmediatamente después con el
lentivirus de silenciamiento control (shRandom) o con el de RNAi de
NP1 (shNP1). La sobre-expresión de NP1 incrementa la
cantidad de núcleos apoptóticos medidos con la tinción Hoechst y
reduce marcadamente la longitud de las neuritas. El silenciamiento
génico impide de forma significativa estos efectos de NP1.
\vskip1.000000\baselineskip
A favor de esta hipótesis, los resultados que se
han obtenido demuestran que la exposición de cultivos primarios de
neuronas corticales a oligómeros solubles del péptido Ab incrementa
la expresión de NP1 antes de inducir la muerte apoptótica (Figura
1). Además, se ha demostrado también que la NP1 es un factor
esencial para que se produzca la neurotoxicidad por Ab. Los
experimentos establecen que Ab causa un incremento de la cantidad de
NP1 que provoca a su vez pérdida de sinapsis y daño neuronal. La
pérdida de contactos sinápticos entre neuronas está directamente
relacionada con pérdida de memoria. Por el contrario, cuando se
bloquea el incremento de NP1 mediante silenciamiento génico por RNA
de interferencia (ver material y Métodos, los datos mostrados en las
figuras y posteriores ejemplos de la invención fueron llevados a
cabo mediante los RNAi de SEQ ID NO4 y 5, mientras que similares
resultados aunque con niveles menores de silenciamiento (entre
30-70%) se realizaron también con dos parejas
distintas de RNAi, las secuencias SEQ ID NO8 y 9 y SEQ ID NO12 y 13,
respectivamente) se impide el daño a la sinapsis y se previene la
aparición de los efectos neurotóxicos de Ab (Figura 2). En cambio,
en ausencia de Ab 1-42, si se tratan las neuronas
con NP1 se reproduce el proceso neuropatológico inducido por Ab.
Además, se ha observado también que la cantidad de NP1 es mucho más
elevada en cerebros de pacientes con Alzheimer (AD) que en cerebros
control (Figura 3). En los cerebros diagnosticados con Alzheimer la
proteína NP1 se localiza en las dendritas neuronales dañadas, donde
se asocia con proteínas sinápticas como SNAP-25 y
sinaptofisina. Estos resultados establecen que la NP1 desempeña un
papel clave en la neurotoxicidad provocada por los oligómeros
solubles de la proteína beta amiloide en la enfermedad de
Alzheimer.
\vskip1.000000\baselineskip
Utilizando vectores lentivirales de
sobre-expresión y silenciamiento de NP1 se ha
demostrado que la sobre-expresión de NP1 en cultivos
primarios de neuronas corticales activa e incrementa el número de
núcleos apoptóticos y reduce el crecimiento neurítico. Por el
contrario, la co-transducción de NP1 con el
silenciador de la expresión shRNAi-NP1 (SEQ ID NO 4
y 5), bloquea significativamente estos efectos (Figura 7).
Además, se ha demostrado que cuando se reduce la
expresión de la proteína NP1 mediante silenciamiento génico por RNAi
se produce un incremento significativo de las proteínas sinápticas
PSD95 y sinaptofisina que estudios previos han demostrado que están
reducidas en modelos de la enfermedad de Alzheimer, lo mismo que
cuando se expresa NP1 mediante vectores (Figura 4A y 4B) El
incremento de PSD95 y sinaptofisina indica que la reducción de NP1
produce un incremento del número de sinapsis excitadoras, lo que
constituye una evidencia de recuperación o mantenimiento de
parámetros relacionados con la memoria.
Por otro lado, se ha demostrado que el
silenciamiento génico de la expresión de NP1, mediante la expresión
shRNAi-NP1 (SEQ ID NO 4 y 5), produce un incremento
de la excitabilidad neuronal medido por las oscilaciones del nivel
de calcio intracelular en cultivos primarios de neuronas corticales
(Figura 5). Las oscilaciones de la concentración de calcio
intracelular en neuronas en las que se ha silenciado la expresión de
NP1 por shRNAi son mucho mayores (B) que las neuronas control (A)
(Figura 5). Además, se demuestra que las oscilaciones de la
concentración de calcio intracelular son debidas a actividad
sináptica porque Tetradotoxina, un bloqueante de canales de sodio
que elimina la actividad sináptica, las reduce marcadamente (Figura
5B).
\vskip1.000000\baselineskip
La proteína de NP1 tiene 432 aminoácidos que
incluye una secuencia de secreción o señal de aproximadamente
16-23 aminoácidos en el lado aminoterminal. La NP1
se expresa fundamentalmente en sistema nervioso, mientras otras
proteínas de la familia de las pentraxinas se expresan también en
otros órganos. Los aminoácidos que se encuentran entre el 229 y el
432 tienen una elevada homología con otras proteínas de la familia
de las pentraxinas. Por el contrario, la zona que se encuentra entre
los aminoácidos 24 y 229 es la más característica de la NP1 y la que
se diferencia más de otras proteínas como la NP2 y la NP3. Además,
se predice que en esta zona existen dos dominios
super-enrollados que se circunscriben entre los
amino-ácidos 33-79 y 105-207 y que
son los que probablemente permiten a la NP1 interactuar o unirse con
otras proteínas. De la zona de entre los amino-ácidos 24 a 229 se
han seleccionado varias secuencias de 15 aminoácidos de longitud con
capacidad antigénica para generar anticuerpos contra esta zona de la
proteína NP1 (ver material y métodos).
Así, se ha comprobado que los anticuerpos
dirigidos contra epítopos que se encuentren entre los aminoácidos 24
a 229 de la secuencia de la proteína de la NP1 humana (NPTX1_HUMAN,
SwissProt primary accesión number Q15818) reconocen las formas
nativas y desnaturalizadas de NP1 y son capaces de inmunoprecipitar
NP1, en concreto con el anticuerpo generado contra el péptido
correspondiente a los aminoácidos 210-224 (SEQ ID
NO18) (Figura 6) (Figura 6). La capacidad de estos anticuerpos de
inmunoprecipitar NP1, predice que tanto la inmunización pasiva con
anticuerpos anti-péptidos cuya secuencia se
encuentre dentro de la zona entre los aminoácidos 24 a 229, como la
generación de anticuerpos endógenos mediante péptidos antigénicos
contenidos en la misma zona, reducirán la cantidad de NP1. El
procedimiento de obtención de anticuerpos contra péptidos de la zona
24 a 229 de la proteína NP1 consiste en conjugar péptidos de 15
aminoácidos con un transportador adecuado e inyectarlos de forma
subcutánea en presencia de un adyuvante (Ver material y
métodos).
Los resultados de la invención indican que la
sobre-expresión de NP1 reduce el crecimiento
neurítico en células de neuroblastoma SH-SY5Y
(Figura 7 A). Asimismo, la sobre-expresión de NP1
incrementa la apoptosis y reduce la longitud de neuritas en neuronas
corticales en cultivos primarios (Figura 7 B). El silenciamiento de
NP1 por RNAi bloquea estos efectos tóxicos de la
sobre-expresión de NP1 (Figura 7B).
Tanto la sobre-expresión de NP1
como el silenciamiento génico se realizan mediante transducción con
vectores lentivirales en cultivos primarios de neuronas corticales.
Se ha utilizado los vectores lentivirales
di-cistrónicos auto-inactivantes,
pWPI i pLVTHM, conjuntamente con plásmidos de empaquetado y cápside
de segunda generación ^{35}. Para ello se ha clonado la secuencia
codificante de NP1 a partir de cDNA de cerebro de rata (Quick Clone
cDNA, Invitrogen) mediante PCR y se ha insertado dentro del vector
pWP1 entre el lugar de restricción Pmel por ligación de extremos
romos. Por otro lado, se ha construido el vector de silenciamiento
génico de NP1, pLVTHM-
shRNAi-NP1-GFP para expresar RNAs
cortos de interferencia (shRNAi). Después de diversas pruebas con
diversas secuencias de DNA para comprobar la eficiencia de
silenciamiento génico, se ha demostrado que los shRNAis dirigidos
contra la secuencia 1 de 19 bases del cDNA de NP1
"GTACAGCCGCCTCAATTCT" (SEQ ID NO1) permiten reducir
aproximadamente un 70% de la expresión de proteína NP1. Otras
secuencias utilizadas y que se ha comprobado que también producen
silenciamiento de la expresión génica de NP1 en un rango entre 70 y
30% son las siguientes: secuencia 2: "GCGGACCAACTACATGTAT" (SEQ
ID NO2); secuencia 3: "GAGATACTCATTAACGACA" (SEQ ID NO3).
En general, dos oligonucleótidos complementarios
de DNA se hibridan para producir un fragmento de DNA de doble cadena
que codifica una cadena de RNA de 19 nucleótidos en la orientación
sentido con un bucle de 9 nucleótidos y una cadena de 19 nucleótidos
anti-sentido dirigida contra la secuencia de NP1.
Así, la secuencia 1 sentido del shRNAi contra NP1 (SEQ ID NO1) es la
siguiente: 5'-gatcccc GTACAGCCGCCTCAATTCT
ttcaag
aga AGAATTGAGGCGGCTGTAC ttttt-'3 (sentido) (SEQ ID NO4), y la secuencia 2 antisentido es la 5'-agctaaaaa GTACAGCCGCCTCAATTCT tctcttgaa AGAATTGAGGCGGCTGTAC ggg-3' (SEQ ID NO5). La secuencia en mayúsculas es la secuencia objetivo de NP1 que corresponde a las bases 1004 a 1022 del mRNA de NP1 de rata (SEQ ID NO1) (Genbank Accession number U18772).
aga AGAATTGAGGCGGCTGTAC ttttt-'3 (sentido) (SEQ ID NO4), y la secuencia 2 antisentido es la 5'-agctaaaaa GTACAGCCGCCTCAATTCT tctcttgaa AGAATTGAGGCGGCTGTAC ggg-3' (SEQ ID NO5). La secuencia en mayúsculas es la secuencia objetivo de NP1 que corresponde a las bases 1004 a 1022 del mRNA de NP1 de rata (SEQ ID NO1) (Genbank Accession number U18772).
Por otro lado, la secuencia correspondiente de
shRNAi dirigida contra la forma humana homologa de la secuencia SEQ
ID NO1 de NP1 es: 5'-gatcccc GCAGTACAGCCGCCTCAAT
ttcaagaga ATTGAGGCGGCTGTACTGC ttttt-'3 (sentido) (SEQ ID NO6), y
5'-agctaaaaa GCAGTACAGCCGCCTCAAT tctcttgaa
ATTGAGGCGGCTGTACTGC ggg-3' (antisentido) (SEQ ID
NO7), que se corresponde con las bases 602 a 620 del mRNA de NP1
humano (Genbank Acession number NM_002522).
Las otras secuencias que se ha comprobado que
también producen silenciamiento de la expresión génica de NP1 en un
rango entre 70 y 30% son las siguientes:
- secuencias frente a la secuencia
"GCGGACCAACTACATGTAT" (SEQ ID NO2), donde la secuencia 1
sentido del shRNAi es 5'-gatcccc GCGGACCAACTACATGTAT
ttcaagaga ATACATGTAGTTGGTCCGC ttttt-'3 (SEQ ID NO8), y la secuencia
2 antisentido es la siguiente 5'-agctaaaaa
GCGGACCAACTACATGTAT tctcttgaa ATA
CATGTAGTTGGTCCGC ggg-3' (SEQ ID NO9). La secuencia en mayúsculas es la secuencia objetivo de NP1 que corresponde a las bases 1259 a 1277 del mRNA de NP1 de rata (Genbank Accession number U18772). La secuencia correspondiente de shRNAi contra la forma humana de NP1 es 5'-gatcccc GCGGACCAACTATATGTAT ttcaagaga ATACATATAGTTGGTCCGC ttttt-'3 (sentido) (SEQ ID NO10), y 5'-agctaaaaa GCGGACCAACTATATGTAT tctctt
gaa ATACATATAGTTGGTCCGC ggg-3' (antisentido) (SEQ ID NO11) que corresponde a las bases 860 a 878 del mRNA de NP1 humano (Genbank Acession number NM_002522).
CATGTAGTTGGTCCGC ggg-3' (SEQ ID NO9). La secuencia en mayúsculas es la secuencia objetivo de NP1 que corresponde a las bases 1259 a 1277 del mRNA de NP1 de rata (Genbank Accession number U18772). La secuencia correspondiente de shRNAi contra la forma humana de NP1 es 5'-gatcccc GCGGACCAACTATATGTAT ttcaagaga ATACATATAGTTGGTCCGC ttttt-'3 (sentido) (SEQ ID NO10), y 5'-agctaaaaa GCGGACCAACTATATGTAT tctctt
gaa ATACATATAGTTGGTCCGC ggg-3' (antisentido) (SEQ ID NO11) que corresponde a las bases 860 a 878 del mRNA de NP1 humano (Genbank Acession number NM_002522).
- secuencias frente a la secuencia
"GAGATACTCATTAACGACA" (SEQ ID NO3), donde la secuencia 1
sentido del shRNAi es 5'-gatcccc GAGATACTCATTAACGACA
ttcaagaga TGTCGTTAATGAGTATCTC ttttt-'3 (SEQ ID NO12), y la secuencia
2 antisentido es la siguiente 5'-agctaaaaa
GAGATACTCATTAACGACA tctcttgaa TGTCGT
TAATGAGTATCTC ggg-3' (SEQ ID NO13). La secuencia en mayúsculas es la secuencia objetivo de NP1 que corresponde a las bases 1434 a 1452 del mRNA de NP1 de rata (Genbank Accession number U18772). La secuencia correspondiente de shRNAi contra la forma humana de NP1 es 5'-gatcccc GAGATCCTCATCAATGACA ttcaagaga TGT
CATTGATGAGGATCTC ttttt-'3 (sentido) (SEQ ID NO14), y 5'-agctaaaaa GAGATCCTCATCAATGACA tctcttgaa TGTCATTGATGAGGATCTC ggg-3' (antisentido) (SEQ ID NO15) que corresponde a las bases 1035 a 1053 del mRNA de NP1 humano (Genbank Acession number NM_002522).
TAATGAGTATCTC ggg-3' (SEQ ID NO13). La secuencia en mayúsculas es la secuencia objetivo de NP1 que corresponde a las bases 1434 a 1452 del mRNA de NP1 de rata (Genbank Accession number U18772). La secuencia correspondiente de shRNAi contra la forma humana de NP1 es 5'-gatcccc GAGATCCTCATCAATGACA ttcaagaga TGT
CATTGATGAGGATCTC ttttt-'3 (sentido) (SEQ ID NO14), y 5'-agctaaaaa GAGATCCTCATCAATGACA tctcttgaa TGTCATTGATGAGGATCTC ggg-3' (antisentido) (SEQ ID NO15) que corresponde a las bases 1035 a 1053 del mRNA de NP1 humano (Genbank Acession number NM_002522).
El shRNAi que se diseñó para utilizar como
control es una secuencia al azar (Random) que se introdujo en el
vector lentiviral control. La secuencia del
shRNAi-Random es: 5'- gatcccc GCAGTGCAATATCGGAAAC
ttcaag
aga GTTTCCGATATTGCACTGC ttttt-3' (sentido) (SEQ ID NO16) y 5'-agctaaaaa GCAGTGCAATATCGGAAAC tctcttgaa GTTTCCGATATTGCACTGC ggg -3' (antisentido) (SEQ ID NO17).
aga GTTTCCGATATTGCACTGC ttttt-3' (sentido) (SEQ ID NO16) y 5'-agctaaaaa GCAGTGCAATATCGGAAAC tctcttgaa GTTTCCGATATTGCACTGC ggg -3' (antisentido) (SEQ ID NO17).
Los dúplex de DNA de shRNAi-NP1
y shRNAi-Random fueron clonados entre los lugares de
restricción HindIII and BgIII del vector pSUPER.retro. Después de
confirmar que shRNAi es capaz de silenciar la expresión de NP1, las
secuencias anteriores fueron sub-clonadas en el
vector lentiviral pLVTHM entre los lugares de restricción
EcoR1-Cla1.
Las partículas víricas son pseudotipadas con la
glicoproteína G del virus de la estomatitis vesicular y se obtienen
mediante transfección transitoria en células 293T siguiendo el
procedimiento estándar descrito por el laboratorio del Dr.
Trono^{36}. Las partículas víricas se concentran por
centrifugación. La titulación para determinar la concentración de
partículas víricas se realiza mediante transducción de células 293T
de diluciones seriadas del concentrado vírico y contaje posterior
por citometría de flujo del número de células que expresan el
marcador codificado por el virus que es la proteína verde
fluorescente (GFP). Los valores de concentración viral que se
obtienen con este procedimiento están en el rango de
1-2x10^{9} unidades de transducción por mililitro
(TU/ml).
Las partículas lentivirales se añaden a los
cultivos de neuronas corticales inmediatamente después de sembrarlas
en las placas en algunos experimentos, o después de su maduración en
otros experimentos. La cantidad de partículas por titulación
utilizada en nuestros experimentos es en el rango de
2-10x10^{6} TUs en un volumen de entre 2 y 5
\mul del concentrado vírico. El porcentaje de neuronas corticales
que expresan GFP 48 horas después de la transducción es de
80-90%.
Los cultivos se realizan a partir de fetos E18
de ratas de la cepa Sprague-Dawley. El procedimiento
de cultivo sigue básicamente el protocolo descrito por Enguita y
cols ^{16}. El procedimiento consiste en: disección del córtex,
disociación química de las células en presencia de tripsina y DNAsa
I, su posterior dilución en el medio de cultivo Eagle Basal
suplementado con 2 mM glutamina, 25 mM potasio y 10% suero fetal
bovino y la siembra de las células en pocillos recubiertos con
poli-L-lisina (10 \mug/ml) a una
densidad de 9x10^{5} células/cm^{2} en medio suplementado con
glucosa (25 mM). Para impedir la proliferación glial, se añade 10
\muM citosina arabinósido a las 72 horas de la siembra y los
experimentos se realizan en cultivos durante 8 días in
vitro.
Los oligómeros solubles de Ab
1-42, conocidos también por Ligandos solubles
derivados de amiloide (ADDLs), se preparan siguiendo procedimientos
estándar descritos por varios grupos ^{37-39}.
La obtención de proteínas a partir de los
cultivos primarios y de los cultivos de líneas celulares se realiza
tras los diversos tratamientos experimentales por procedimientos
estándar. Las células se solubilizan en tampón SDS (62.5 mM
Tris-HCI pH 6.8, 2% SDS, 10% glicerol, 2.5 mM EDTA,
75 mM DTT y 0.001% bromofenol azul). A continuación, las proteínas
se separan mediante electroforesis en geles desnaturalizantes de
SDS-poliacrilamida por procedimientos estándar. Los
polipéptidos separados se pasan a membranas activadas de PVDF
(Millipore) por electrotransferencia. La unión no específica se
bloquea incubando las membranas en una solución de TBS tween con 5%
de leche desnatada en polvo. Para detectar específicamente la NP1,
las membranas se incuban en presencia de anticuerpos monoclonales o
policlonales contra NP1 de rata (1:1500, Transduction Laboratories)
en una solución de 3% BSA en TBST. Para detectar sinaptofisina, las
membranas se incuban con el anticuerpo monoclonal SY38 (1:1000,
Chemicon). Seguidamente, las membranas se incuban con anticuerpos
secundarios conjugados con peroxidasa. Como control de carga de
proteínas se utiliza la inmunodetección de actina mediante un
anticuerpo policlonal de conejo contra actina 20-33
(1:3000, Sigma). La visualización de las proteínas inmunoreactivas
se realiza utilizando un sistema mejorado de quimioluminiscencia
(Supersignal WestDura, Pierce), y la detección de las bandas de
inmunoreactividad se realiza con un sistema de análisis de imagen
VersaDoc Modelo 5000 (Bio-Rad). La intensidad de las
bandas obtenidas se cuantifica mediante densitometría con el
programa de análisis por ordenador Quantity One
(Bio-Rad). Los valores densitométricos de las bandas
de inmunoreactividad de NP1 y sinaptofisina se normalizan con el
valor de la banda de actina correspondiente.
Las neuronas corticales se cargan con una
concentración 5 \muM del indicador de calcio
Fura-2-AM (Molecular Probes) durante
una hora a temperatura ambiente en una solución salina tamponada con
10 mM HEPES (pH 7.4). La medida de la fluorescencia inducida por la
entrada de calcio se realiza en un microscopio invertido de
epifluorescencia con un objetivo de fluorita 20X. Se determina la
fluorescencia de emisión a 510 nm en cada neurona después de excitar
a con un haz de luz de 340 nm y 380 nm de forma alternativa
utilizando un filtro de emisión de 390 nm. La fluorescencia generada
por la unión de Fura-2 con calcio intracelular se
expresa como F340/F380 (proporción de la fluorescencia de emisión a
340/fluorescencia de emisión a 380).
Mediante el análisis del patrón de
hidrofobicidad del fragmento que incorpora los aminoácidos 24 a 229
de la secuencia de la proteína NP1 humana se seleccionaron péptidos
de 15 aminoácidos con capacidad antigénica:
- -
- Péptido NP1_210-224: QRISELEKGQKDNRP (amino-ácidos 210-224 secuencia rata, SEQ ID NO18),
- -
- Péptido NP1_100-115: GEARSGGGRKQPGSG (amino-ácidos 100-115 secuencia rata, SEQ ID NO19).
\vskip1.000000\baselineskip
Después de sintetizar y purificar, dichos
péptidos sintéticos se acoplaron a proteínas transportadoras como
KLH o BSA por procedimientos estándar. A continuación, se inyectaron
junto con adyuvante para inmunizar y producir anticuerpos
policlonales en conejos El nivel de anticuerpos
anti-péptido NP1 se determinó en muestras de suero
por ELISA indirecto en placas en las que previamente se había fijado
cada uno de los péptidos sintéticos. Finalmente, la purificación de
los anticuerpos se realizó en una columna de inmunoafinidad por
procedimientos estándar.
Para más detalle de los materiales y métodos
puede tomarse en cuenta el estudio de los inventores (Maria A. Abad,
Marta Enguita, Nuria DeGregorio-Rocasolano, Isidre
Ferrer, and Ramón Trullas. Neuronal Pentraxin 1 Contributes to the
Neuronal Damage Evoked by Amyloid-\beta and Is
Overexpressed in Dystrophic Neurites in Alzheimer's Brain. The
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<110> CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES
CIENTÍFICAS (CSIC)
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<120> PÉPTIDOS Y ANTICUERPOS ÚTILES PARA
LA ELABORACIÓN DE MEDICAMENTOS PARA EL TRATAMIENTO O PREVENCIÓN DE
ENFERMEDADES HUMANAS NEURODEGENERATIVAS, MEDICAMENTOS ASÍ OBTENIDOS
Y SUS APLICACIONES
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<130> NP1
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<160> 19
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<170> PatentIn version 3.3
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<210> 1
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<223> Dominio 1004-1022 nt
de NP1 de rata
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<223> Dominio 1259-1277 nt
de NP1 de rata
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de NP1 de rata
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<223> shRNAi 1r antisentido NP1
1004-1022
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<223> shRNAi 2r sentido NP1
1259-1277 nt
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<223> shRNAi 2r antisentido NP1
1259-1277 nt
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<400> 9
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<223> shRNAi 2h sentido NP1
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<223> shRNAi 2h antisentido NP1
860-878 nt
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<223> shRNAi 3r sentido NP1
1434-1452 nt
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\hskip-.1em\dddseqskipgatccccgag atactcatta acgacattca agagatgtcg ttaatgagta tctcttttt
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<210> 13
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<211> 59
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<212> DNA
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<213> Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> shRNAi 3r antisentido NP1
1434-1452 nt
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<400> 13
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\hskip-.1em\dddseqskipagctaaaaag agatactcat taacgacatc tcttgaatgt cgttaatgag tatctcggg
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<213> Artificial
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<220>
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<223> shRNAi 3h sentido NP1
1035-1053 nt
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<400> 14
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\hskip-.1em\dddseqskipgatccccgag atcctcatca atgacattca agagatgtca ttgatgagga tctcttttt
\hfill59
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<211> 59
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<212> DNA
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<213> Artificial
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<223> shRNAi 3h antisentido NP1
1035-1053 nt
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<400> 15
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\hskip-.1em\dddseqskipagctaaaaag agatcctcat caatgacatc tcttgaatgt cattgatgag gatctcggg
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<210> 16
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<211> 59
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<212> DNA
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<223> shRNAi-Random
sentido
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\hfill59
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<210> 17
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<211> 59
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<212> DNA
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<213> Artificial
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<223> shRNAi-Ramdom
antisentido
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<400> 17
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<210> 18
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<211> 15
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Péptido
NP1_210-224
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<211> 15
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido
NP1_100-115
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\hskip1cm
Claims (9)
1. Péptido constituido por la secuencia de
aminoácidos SEQ ID NO18 de la proteína NP1 humana.
2. Péptido según la reivindicación 1, donde la
proteína NP1 humana es NPTX1_HUMAN, SwissProt primary accesion
number Q15818.
3. Anticuerpo específico del péptido según
cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2.
4. Uso de un péptido según cualquiera de las
reivindicaciones 1 ó 2, o de un anticuerpo según la reivindicación
3, en la elaboración de un medicamento o composición farmacéutica
para el tratamiento de enfermedades humanas neurológicas.
5. Uso según la reivindicación 4, donde la
enfermedad neurológica es neurodegenerativa.
6. Uso según la reivindicación 5, donde la
enfermedad neurodegenerativa es la enfermedad de Alzheimer.
7. Medicamento o composición farmacéutica para
el tratamiento de enfermedades neurológicas, caracterizado
porque comprende una cantidad terapéuticamente efectiva del
compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
8. Medicamento o composición farmacéutica según
la reivindicación 7, donde la enfermedad neurológica es
neurodegenerativa.
9. Medicamento o composición farmacéutica según
cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8, que además comprende uno o
más adyuvantes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables.
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