JP2007523626A - 細胞死を予防および治療するための手段およびそれらの生物学的適用 - Google Patents
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Abstract
Description
配列番号12:KTGAFLLQGFIQDRAGRMAGETP
配列番号13:GAFLLQGFIQDRAGRMAGETP
配列番号14:FLLQGFIQDRAGRMAGETP
配列番号15:LQGFIQDRAGRMAGETP
配列番号16:GFIQDRAGRMAGETP
配列番号17:FIQDRAGRMAGETP
配列番号18:IQDRAGRMAGETP
配列番号19:IQDRAGRMAGE
配列番号20:IQDRAGRMA
配列番号21:IQDRAGR
配列番号22:IQDRA
配列番号23:IQDR
本発明はまた、Baxおよびカスパーゼ−2間の相互作用を妨害するか、または、カスパーゼ−2依存性Bax切断を妨げることが可能であり、N末端またはC末端において、(特異的な認識に続くまたは続かないで)細胞に入りカスパーゼ−2およびBax間の相互作用を妨害することが可能なキメラ分子を生ずるペプチド性または非ペプチド性の分子と結合されたあらゆる分子を含む。
・慢性変性疾患、例えば、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、多発性硬化症(Multiple sclerosis)、筋萎縮性側索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis)、脊髄延髄萎縮症(spinobulbar atrophy)、プリオン病を含む神経変性疾患の際のアポトーシスを予防および/または治療する、または、
・脊髄損傷の際のアポトーシスを予防および/または治療する、または、外傷性脳損傷(traumatic brain injury)の結果として生じるアポトーシスを予防および/または治療する、または、
・ニューロン保護(neuroprotection)効果を提供する、または、
・脳保護効果を提供する、または、
・自己免疫疾患および移植拒絶反応に伴う、細胞毒性T細胞およびナチュラルキラー細胞が介在するアポトーシスを予防および/または治療する、または、
・心不全(heart failure)、心筋症(cardiomyopathy)、心臓のウイルス感染または細菌感染、心筋虚血、心筋梗塞(myocardial infarct)、および心筋虚血、冠動脈バイパス移植(coronary artery bypass graft)を含む心臓細胞の細胞死を予防する、または、
・例えば化学療法またはHIV治療の結果としてのミトコンドリアの薬物毒性を予防および/または治療する、または、
・ウイルス感染または細菌感染の際の細胞死を予防する、または、
・炎症または炎症性疾患、炎症性腸疾患(inflammatory bowel disease)、敗血症(sepsis)および敗血症性ショックを予防および/または治療する、または、
・卵胞(follicule)から卵母細胞(ovocyte)への段階、卵母細胞から成熟卵への段階および精子の細胞死を予防する(例えば、卵巣組織、人工授精卵を凍結させおよび移植する方法)、または、
・化学療法後の女性および男性の受精能力を保護する、または、
・雌および雄の動物の受精能力を保護する、または、
・黄斑変性(macular degenerescence)および緑内障(glaucoma)を予防および/または治療する、または、急性肝炎(acute hepatitis)、慢性活動性肝炎(chronic active hepatitis)、B型肝炎およびC型肝炎を予防および/または治療する、または、
・男性型禿頭症(male-pattern baldness)、放射線、化学療法または環境上のストレスに起因する髪の喪失を予防する、または
・(高レベルの放射線への露出、熱、火傷、化学薬品、太陽および自己免疫疾患に起因する)皮膚の損傷を治療または改善する、または、
・脊髄形成異常性症候群(myelodysplastic symdrome:MDS)における骨髄細胞の細胞死を予防する、または、
・膵臓炎(pancreatitis)を治療する、または、
・呼吸器系症候群(respiratory symdrome)を治療する、または、
・骨関節炎(osteoarthitis)、変形関節炎(rheumatoid arthritis)、乾癬(psoriasis)、糸球体腎炎(glomerulonephritis)、アテローム性動脈硬化症(atherosclerosis)移植片対被移植体の疾患(graft versus host disease)を治療する、または、
・網膜周皮細胞(retinal pericyte)のアポトーシス、網膜ニューロンアポトーシス緑内障、虚血の結果として生じる網膜損傷、糖尿病性網膜症を治療する、または、
・アポトーシスの増加と関係する疾病状態を治療する、または、
・植物(例えば、草木、草花、葉状植物(キノコ、海草)...)の細胞死を予防する
ためのそれらの使用を含む。
チェックポイントを識別する方法;固定時間および実時間のサイトフローメトリーによるニューロンのアポトーシスのマルチパラメトリックでかつダイナミックな分析
最近になるまで、ニューロン細胞のアポトーシスおよびネクローシスは、主として、2タイプのアプローチによって調査されていた:第1の群の(生化学的)技術は、一般的には、ミトコンドリアのコハク酸デヒドロゲナーゼ活性の比色評価(MTTアッセイ)または乳酸デヒドロゲナーゼ活性の細胞外放出(LDHアッセイ)(Johnson,1995)によりニューロン死の末期の事象を評価する。これらの型どおりのモノパラメトリックな定量技術は、細胞死の機構に関する情報を与えず、他の生化学過程の検出に結び付けられ得ない。より最近になって、いくつかのニューロンに適合する細胞分画プロトコルが、免疫ブロット法によるシトクロムc転座および蛍光発生基質を用いるカスパーゼ活性化の生化学評価について発表された(EthellおよびGreen,2002)。このような最近の方法は、ニューロン個体群に関する半定量的な情報を与えるが、マルチパラメトリックでかつ実時間の分析を除外する。第2の群の技術は、蛍光顕微鏡法(FM)の読み出しを用いて、オルガネラの改変またはアポトーシスが関連するタンパク質を検出する。これらのFM研究のうちの大部分は、クロマチン形態の視覚化(ヘキスト(登録商標)染色)および/またはDNA断片化の生化学的検出(TUNELアッセイ)を含む末期の核変化に焦点が当てられる。ニューロンに関する最新のFM研究では、(固定された細胞における)シトクロムcの免疫局在性(immunolocalization)が報告されたが、細胞生物学の他の領域とは対照的に、ミトコンドリア変化およびカスパーゼ活性化の現場内検出を用いたニューロンに関する研究数は制限される。培養された一次ニューロンに適用される場合、FMベースの分析は、時間を消費しかつ面倒であり、定量化は、細胞体の凝集物および重畳している神経突起のネットワークによって妨げられる。さらに、高感度の蛍光プローブのフォトブリーチングは、劇的なミスリーディング解釈につながり得、かつ、早期の死が関連する事象の実時間の追跡調査を除外することがあり得る。このため、現在知られるところでは、キーとなるアポトーシス事象の細胞生物学の特徴は、一次ニューロンにおいて十分に証明されたわけでも秩序立てられたわけでもなかった。
グルコース、ウマ血清およびウシ胎仔血清の混合物を含有するアドホック(ad hoc)培地においてポリエチレンイミンでコーティングされたウェル上で培養された場合、生後14日胎児マウスから単離された一次皮質ニューロンは、10日を超えて生存した状態で維持され得る(KawamotoおよびBarrett,1986)。
FMベースのPMP(7−AAD染色)およびアポトーシスが関連するホスファチジル−セリン(PS)露出(FITC結合型アネキシンV;緑色蛍光)の同時検出は、血清欠乏ニューロンでは3の細胞群:7−AADおよびFITC−アネキシンV染色の両方を有するサブセット(サブセット2;図2A)、7−AAD染色(サブセット3)またはFITC−アネキシンV染色(サブセット1)のいずれかを有する2つのサブセットが出現することを示す。同一のサブセットはまた、トリプシン処理後にFCにより検出され、速度論追跡調査は、サブセット1は、サブセット2より先に起こり、このサブセット2は、サブセット3より先に起こることを示し(図2B、C)、この結果、PS露出はPMPの前に起こるという結論に至る。最初の検出可能な核事象は、ニューロンサイズの改変より先に起こるらしい相当連続的な核縮小(境界部(perimeter))である(図2D、E)。このニューロンのFC固定時間分析は、カスパーゼ活性化に広げられ得る(図3)。実際に、緑色蛍光ラベルされたカスパーゼ阻害剤(FLICA、FAM−DEVD−FMK)を用いるカスパーゼ−3様活性およびPMP(7−AAD染色)の現場内の同時検出はFM(トリプシン処理前)およびFC(トリプシン処理後)と同様の結果を与え、カスパーゼ−3様活性がPMP前に検出可能であることを示す(図3A、B)。同様の結果は、FLICAベースのカスパーゼ−3活性の検出が、現場内の抗体ベースの活性化されたカスパーゼ−3の検出によって置き換えられた場合に観察される(不図示)。血清欠乏の開始時にニューロンに加えられた場合、新しい広スペクトルのカスパーゼ阻害剤であるキノリン−Val−Asp(OMe)−CH2−O−Ph(Q−VD−OPH)(Melnikovら,2002)およびミトコンドリア・アデニンヌクレオチド・トランスロケータ(ANT)阻害剤であるボンクレキン酸(BA)の両方は、カスパーゼ活性化、PMPおよび核アポトーシスを強く妨げる(図3C、D)。FC定量化は、汎(pan)セリン・プロテアーゼ阻害剤である4−(2−アミノエチル)−ベンゼンスルホニル フルオリド(AEBSF,ペファブロック)とは対照的に、Q−VD−OPHが、血清欠乏によって誘導されるカスパーゼ様活性の95.3±5.6%およびPMP(7−AAD)の93.9±3.8%を阻害することを示す(図3D)。些細でない問題は、所与の細胞死モデルにおいて、カスパーゼ活性化およびPS露出間の階層性を測定することである。スルホロダミン(sulforhodamine)結合型FLICA(赤色蛍光)を用いるカスパーゼ−3様活性およびFITC−アネキシンVを用いるPS露出(緑色蛍光)の現場内FM(トリプシン処理前)およびFC(トリプシン処理後)同時検出は一致し、血清欠乏後、カスパーゼ−3活性は一次ニューロンにおいてPS露出より先に起こることを立証する(図3E、F)。FMによるクロマチン状態(ヘキスト(登録商標);青色蛍光)の同時の分析は、早期のカスパーゼ−3活性が一時的に核凝縮の第1の段階(Susinらの分類による段階I;Susinら,1999)に関係することを示したが、最終の別々のアポトーシス体への核断片化(段階II形態,Susinら,1999)はPS露出の開始後に起こることに留意されるべきである(図3E、4E)。興味深いことに、基準となる汎カスパーゼ阻害剤であるz−VAD−fmkおよびより特定されたカスパーゼ−3様阻害剤であるz−DEVD−fmkの両方は、カスパーゼ−3活性化を強く阻害するが、ニューロンのアポトーシスの分解期(すなわち、PS露出、核凝縮およびPMP)を阻害せず(図3D)、このため、これは、カスパーゼ−3が関連する活性は、これらの実験条件におけるニューロン死にとって必須でないことを示す。これに対して、カスパーゼ−9阻害剤であるz−LEHD−fmkの存在下または不存在下でのクロマチン状態(ヘキスト(登録商標))および緑色蛍光ラベルされたカスパーゼ阻害剤(FLICA,FAM−LEHD−FMK)を用いるカスパーゼ−9様活性の現場内同時検出は、カスパーゼ−9様活性の破壊が核アポトーシスの中間表現型につながり、ここでは、大抵の核が核凝縮の第1工程(段階I;図3G)に抑えられることを示す。さらに、FMおよびFC分析の両方は一致してカスパーゼ−9阻害は、PS露出およびPMPを廃止することを示す(図3G、H)。このため、BAがカスパーゼ−9様活性化を妨げる(図3H)ので、二重の読み出しアプローチは、この実験モデルにおけるカスパーゼ−9の実行ポイントがミトコンドリアの下流かつPS露出および段階IIの核アポトーシスの上流にあることを強く示唆する。
FM分析によって続けられる培養された一次ニューロンのΔΨm高感度染料JC−1による染色は、徐々にΔΨmが損失することを示す。このため、血清欠乏前には、ニューロンからのミトコンドリアは、高ΔΨm(オレンジ色のJC−1蛍光;図4A)を持つが、これに対して、8〜24時間の血清欠乏がなされたニューロンからのミトコンドリアは、低ΔΨm(緑色のJC−1蛍光;図4A)を有する。ΔΨm損失は、明確な地理的階層性を全く示すことなく不均一に進行し、同一のニューロンにおいて不均一性が検出可能である一過性の中間表現型を生じさせた(図4A;Dec)。これは、少なくともこの実験系では同時の調和されたΔΨmはなく、むしろ、崩壊シグナルがミトコンドリアからミトコンドリアへ徐々に伝わったことを示唆する。ヘキスト(登録商標)染色によって観察されるような核アポトーシスのあらゆる徴候の前に完全なΔΨm崩壊が観察される(図4A;青色蛍光)。予想されるように、FMおよびFCベースのΔΨm損失(JC−1)およびPMP(7−AAD染色)の同時定量化は一致して血清欠乏ニューロンではΔΨm損失がBAによって阻害され、PMPより先に起こることを立証する(図4B−E)。(ΔΨm高感度染料CMX−Rosを用いる)ΔΨmおよびカスパーゼ−3様活性(FLICA,FAM−DEVD−FMK)の同時検出をベースとする速度論実験は、ΔΨm損失はカスパーゼ−3活性化より先に起こることを示唆する(不図示)。したがって、カスパーゼ活性のz−DEVD−fmkによる阻害は、SD誘導ΔΨm損失に関して効果を持たない(図4E)。
ニューロンのアポトーシスにおけるミトコンドリアの早期の関与は、薬物曝露に対する迅速なΔΨm応答のモニタリングを必要とする。ΔΨmのFMによる実時間検出は分析を歪曲し得る。繰り返しの取得が(JC−1オレンジ色蛍光の降下として検出される)プローブの劇的なフォトブリーチングを引き起こし、これは、アポトーシス関連のΔΨm損失に誤って帰し得るからである(図5A、B)。この機械的な欠点を解決するために、実時間FCアプローチが開発された。この実時間FCアプローチでは、固定時間FCプロトコルとは対照的に、ニューロンは、最初にトリプシン処理され、第2に、経時的にΔΨm(JC−1)およびPMP(7−AAD)を検出するようにラベリングされる(図5C)。これらの条件では、FM観察は、トリプシン処理されたニューロンがPMPを提示せず、3時間に至るまで高ΔΨmを維持することを明らかにする(図5C)。トリプシン処理後の最初の5時間の間アノイキスの徴候が検出可能でないことに留意されるべきである。20分間にわたるFC記録は、トリプシン処理されたニューロンが依然として安定な高いΔΨmを有し、7−AADに対して不透過である、すなわち、完全な形質膜を維持することを確認する(図5D2−3)。呼吸鎖脱共役剤(respiratory chain uncoupler)であるカルボニルシアニドm−クロロフェニルヒドラゾン(mClCCP)の非トリプシン処理ニューロンへの添加は、ΔΨm崩壊を誘導する(図5D−1)。実時間FCモニタリングは、mClCCPによる処理の2分後でニューロン個体群のΔΨm損失が最大であることを明らかにする(図5D−2,3)。ミトコンドリア毒素である1−メチル−4−フェニル−1,2,3,6−テトラヒドロピリジン(MPTP)により処理された非トリプシン処理ニューロン培養のPMP(7−AAD)およびΔΨm(JC−1)のFM同時検出は、45分後に大抵のニューロンが低ΔΨmであるがPMPの徴候が全くないことを示す(図6A−1)。対照的に、一酸化窒素誘発物質SNPにより処理されたまたは処理されない皮質ニューロンは、高いΔΨmを維持する(図6)。予想されるように、エタノールは、培養されたニューロンにおける大規模な7−AADの組み込みに匹敵するような迅速なPMPを誘導する(図6A−1)。実時間FCが皮質ニューロンのPMP、ΔΨm、細胞サイズおよび粒状度の同時評価に適用される場合、この技術は、15分後に、MPTP処理ニューロンの49.6%(±8.2;n=4)が低ΔΨmであり、これに対して、未処理ニューロンの16.2%(±1.2)および15.0%(±6.2)のSNP処理ニューロンが低ΔΨmであることを示す。実時間FCは、MPTPおよびSNPとは対照的に、エタノール処理が一次的なネクローシスを誘導することを明らかにする。実際に、エタノールは、非常に迅速なPMP(5分後に98%)の引き金となり、これは、ΔΨm損失(5分後に75%)より先に起こる(図6)。興味深いことに、MPTP誘導ΔΨ損失は、不均一である。これは、迅速なΔΨm降下を経るニューロンが大きな粒状度増大を示し、これに対して、わずかなΔΨm減少を経るニューロンは、形態学上の改変を示さないからである(図6)。
(皮質ニューロンの単離および培養)
一次皮質ニューロンは、生後14日胎児スイスマウス(Janvier,Le Genest-Sr-Isle,フランス)の新皮質(neocortices)から単離された。ニューロンは、5%のウマ血清(HS,Eurobio)および2.5%のウシ胎仔血清(FCS,Eurobio)により補充された500μlのイーグルの基本培地(EBM,Eurobio,Les Ulis,フランス)中にcm2当たり7×105の生細胞の密度で、24ウェルプレート(sarstede,Orsay,フランス)またはポリエチレンイミン(PEI,1mg/mL,Sigma,St Quentin Fallavier,フランス)によりコーティングされたLab-Tek(登録商標)カバーグラスチェンバー(chambered coverglass)(Nalge Nunc International,Naperville,IL,米国)上に塗布された。2日後、培地が、180mg/Lのグルコース、5%のHSおよび1%のFCSおよび3μMのシトシン β−D−アラビノフラノシド(Ara C,Sigma)および1μMの5−メチル−10,11−ジヒドロ−5H−ジベンゾシクロヘプテン−5,10−イミン マレイン酸塩(MK-801,Research Biochemicals International)(Knuselら,1990)を含有するN5培地(KawamotoおよびBarrett,1986)により交換され、毎日変えられた。アポトーシスは、5日齢培養において血清抜き出しによって誘導された(Macleodら,2001)。培養の純度(>95%)は、抗微小管結合タンパク質(anti-Microtubule Associated Protein)2モノクローナル抗体(MAP-2,Sigma)および抗グリア細胞繊維性酸性タンパク質(anti-Glial Fibrillary Acidic Protein)ポリクローナル抗体(GEAP,Dako)により評価された。
血清不含有N5培地での1回の注意深い洗浄および250μlの37℃トリプシン−EDTA(Gibco BRL,英国)による15分にわたる37℃でのインキュベーション後にニューロンの酵素分離が行われた。細胞分離は、1000μlのチップ(tip)(Gilson)を用いる5回の丁寧な洗い流しによって行われた。残りのニューロン凝集体は、200μlチップを通じて10回の500μlのN5培地での注意深い洗い流しによって分離された。トリプシン処理手順の確認のために、付着性のニューロンが10μMのCelltracker Green(登録商標)(Molecular Probes,Eugene,OR)によって15分にわたり37℃で染色され、N5培地で洗浄され、そして、トリプシン処理に付された。ニューロン分析は、フローサイトメトリー(FL−1チャネル)および顕微鏡法(励起のためにBP 480/40および発光のためにBP 527/30)によって行われた。トリトンX−100(Sigma)処理(0.02%)が形質膜崩壊についての陽性対照として用いられた。
蛍光標示式細胞分取(Fluorescence-Activated Cell Sorting)が、15mWの空冷488nmアルゴンレーザを備えた3色FACSCaliburサイトメータ(Becton Dickinson,San Jose,CA)を用いて行われた。各サンプルについて、40,000のニューロンからのデータが登録され、CellQuest Pro(登録商標)ソフトウェア(Becton Dickinson)を用いて分析された。サンプルの流量は、実時間分析のために12μl±3μl/分に、固定時間実験のために60μl±3μl/分に設定された。蛍光顕微鏡法(FM)は、100Wの水銀ショートアークランプおよびa×40 N PLAN L対物レンズまたは水浸 × 100N PLAN対物レンズ(Leica,Wetzlar,ドイツ)を備えたDM IRB挿入型蛍光顕微鏡(Leica,Rueil-Malmaison,フランス)を用いて行われた。写真は、CCDカラーカメラ(Leica DC 300F,Leica,フランス)により1300×1030画素の分解能で取得され、Leica QFluoroソフトウェア(Leica,Microsystem AG,スイス)によって制御された。データは、Leica QFluoroソフトウェアを用いて行われるIM1000ソフトウェア(Leica Microsystem AG)によるオフライン分析のために保存された。
形質膜の完全性の損失は、7−アミノアクチノマイシンD(7-AAD,Sigma)に対する上昇した透過性を通じて検出された(Schmidら,1992;Carpenterら,1997;Lecoeurら,2002)。20μg/mlの7−AADが培養されたニューロンに15分にわたり37℃で加えられた。FM分析がBP 515−560フィルタを用いる100msの励起を通じて行われ、7−AAD蛍光がLP 590ロングパスフィルタを通じて検出された。細胞は、トリプシン処理され、その直後に、フローサイトメータ(F1−3チャネル,λ>650nm,PMT=333)上で分析された。アポトーシス体/残さは、懸濁液での細胞生育について記載されたように分析から廃棄された(Lecoeurら,1997)。
形質膜の外層へのホスファチジルセリン露出(PS)は、FITC結合型アネキシンV(アポトーシス検出キット,R&D System)の固定を通じて検出された。20μg/mlの7−AADおよび1X アネキシンVが、200μlのCa2+豊富緩衝液(アポトーシス検出キット)に20分にわたり室温で加えられた。FM実験のために、アネキシンV−FITCが、BP 480/40フィルターを通じて励起され、放射光は、BP527/30フィルターを用いて集められた。FITC−アネキシンV蛍光のFC検出は、F1−1チャネル(530±15nm)で行われ、リニアアンプモード(linear amplifier mode)で分析された(PMTボルト=867,増幅ゲイン=9.00)。スペクトルのオーバーラップは、以下のように補償回路網(compensation network)を調整することによって回避された:FL2−22.9% FL1およびFL2−41.7% FL3。
活性化されたカスパーゼ−3およびカスパーゼ9は、FAM−DEVD−FMKおよびFAM−LEHD−FMK(両者とも蛍光ラベリングされたカスパーゼ阻害剤(Fluorochrome Labeled Inhibitors of Caspase:FLICA)である)(CaspaTag(登録商標)フルオレセインカスパーゼ活性キット,Intergen,NY)を用いて検出された(Lecoeurら,2002;Smolewskiら,2002)。ニューロンは、FLICAのDMSO貯蔵液の1/150により1時間にわたり37℃でインキュベートされた。最後の15分の間に7−AADおよびヘキスト(登録商標)が加えられた。その後、ニューロンは、洗浄バッファ(CaspaTag(登録商標)キット)で3回洗浄された。FM画像化のために、FLICAがBP 480/40フィルタを通じて励起され、放射光は、BP 527/30フィルタを通じて集められた。FC分析のために、FLICA蛍光は、F1−1チャネルを通じて集められた(PMTボルト=501、補償回路網:FL1−7.8% FL2,FL2−40.8% FL1およびFL2−45.4% FL3)。切断されたカスパーゼ−3は、フィコエリトリン(phycoerythrin:PE)結合型ポリクローナル抗体(Beckton Dickinson)を用いる免疫検出(immunodetection)によって細胞内(in cellula)明示された。ニューロンは、7−AADによって染色され、トリプシン処理され、そして、1%のPFAおよび20μg/mlのアクチノマイシンD(AD)を含むPBSに20分にわたり固定された。その後、ニューロンは、100μMのPBS、1%のBSA、20μg/mlのAD、0.05%のサポニンキラヤバーク(Quillqja bark)(Sigma)および20μlの抗カスパーゼ−3抗体に30分にわたり室温で再懸濁させられた(Lecoerら,2001)。PBSで洗浄した後、PEが関連する蛍光がサイトメータ(F1−2チャネル)を用いて分析された。Z−val−Ala−Asp(OMe)−FMK(Z−VAD−FMK)、キノリン−Val−Asp(OMe)−CH2−O−Ph(Q−VD−OPH)、Z−DEVD−FMK(Z−Leu−Glu(OMe)−His−Asp(OMe)−fmk,ICN)およびZ−LEHD−FMK(Z−Asp(OMe)−Glu(OMe)−Val−Asp(OMe)−FMK)(全てICN(Orsay,フランス)から購入された)および4−(2−アミノエチル)−ベンゼンスルホニル フルオリド(AEBSF,Pefabloc SC,Roche,Meylan,フランス)が100μMで血清欠乏の当初に加えられた。スルホロダミン−DEVD−FMK(CaspaTag(登録商標)Red Activity Kit)により、活性化されたカスパーゼ−3およびFITC−アネキシンVを検出することができた。ニューロンは、FLICAのDMSO貯蔵液の1/900および200μlのアネキシンバッファ中の1X FITC−アネキシンVにより30分にわたり37℃でインキュベートされた。その後、ニューロンは、50%の洗浄バッファおよび50%のアネキシンバッファからなるバッファで3回洗浄された。カスパーゼ−3活性は、F1−2チャネルにおいて検出された(585±21nm)。FMのために、FLICAがBP515−560フィルタを通じて励起され、その蛍光が、LP590ロングパス発光フィルタを通じて集められた。
ミトコンドリアの膜電位(ΔΨm)は、5,5’−6,6’−テトラクロロ−1,1,3,3’−テトラエチルベンズイミダゾール カルボシアニド ヨージド(JC-1,Molecular Probes,Eugene,OR)の取り込みによって評価された。ニューロンは、1μMのJC−1および7−AADにより15分にわたり37℃で同時染色された。JC−1モノマーが、FCによってF1−1チャネル(PMTボルト=644)において検出された。J−凝集体は、F1−2チャネルを通じて検出された(PMTボルト=451)(Reersら,1991)。7−AAD検出についてのPMTボルトは326であった。補償回路網:FL1−0.0% FL2、FL2−22.9% FL1、FL2−41.7% FL3およびFL3−0.7% FL2。FM分析のために、緑色およびオレンジ色の蛍光が、1.2sの励起(BP 450−490励起/LP 515ロングパス発光フィルタ)後に同時に記録された。フォトブリーチングは、N20濃度フィルタ(neutral density filter)による当初の入射光の5%までの照射の減衰によって回避された。ボンクレキン酸(BIOMOL,)が25μMで試験された。
実時間実験が5日齢の培養ニューロンについてトリプシン処理直後に行われた。ニューロンは、N5培地に再懸濁させられ、0.7×106細胞/mlに調整され、そして、800nMのJC−1により15分にわたり37℃で負荷がかけられた。次いで、サンプルは、N5培地で1/8に希釈され、20μg/mlの7−AADが加えられた。基礎形態およびΔΨmおよび膜透過性が5分にわたり記録され、薬物;100μMのカルボニル シアニド m−クロロフェニルヒドラゾン(mClCCP,Sigma)、1μMの1−メチル−4−フェニル−1,2,3,6−テトラヒドロピリジン(MPTP,Sigma)および0.6μMのニトロプルシドナトリウム(SNP,Sigma)が加えられた。MPTPは、ミトコンドリア複合体I毒物であり、インビボでマウスおよび霊長類にパーキソニズムを再現するために用いられるアポトーシス誘発物質である(Speciale,2002)。全パラメータの変動が続く15分にわたり記録された。マイクロソフトのエクセルソフトウェアを用いて曲線が描かれた。
ニューロンは、15分にわたり1μMのヘキスト(登録商標)33342(ヘキスト(登録商標)342,Sigma)と共にインキュベートされ、FMによって分析された(5ミリ秒の露出(BP340−380励起フィルタ/LP425ロングパスフィルタ))。核の境界が、Leica Q Fluoroソフトウェアを用いて任意のユニットで発現されるように興味のあるプロセシングマスクの個々の領域を形成することによって測定された。
マイクロソフトのエクセルソフトウェアを用いて統計が行われた。線形回帰解析(linear regression analysis)によって相関関係が計算された。各解析について、R2が示された。異なるアポトーシスの段階にある細胞の百分率を比較するために、対応のないt検定(Unpaired Student’s t test)が実行された。p値<0.05は有意であるとみなされた。
ニューロンのインビトロおよびインビボの細胞死におけるカスパーゼ−2阻害/サイレンシング
汎カスパーゼ阻害は、血清欠乏によって死に誘導された一次皮質ニューロン培養の生き残りを促進する。
早期の事象、例えばΔΨm損失がQ−VD−OPHによって妨げられるという事実は、本発明のモデルにおける(前ミトコンドリア)カスパーゼ(単数または複数)の重要性およびQ−VD−OPHの特異性の両方の問題を提議する。SDモデルにおける細胞死の原因となるより基部に近いカスパーゼ活性を識別するために、より選択的なカスパーゼ阻害剤のパネルが用いられ、それらの影響がいくつかの細胞死パラメータに基づいて分析された(図9A):Z−DEVD−FMK、Z−LEHD−FMK、Z−VDVAD−FMKおよびZ−LETD−FMK(これらは、それぞれ、カスパーゼ−3、−9、−2および−8様活性を阻害する)。効果的なカスパーゼ−2様活性阻害剤(図9D)であるZ−VDVAD−FMKのみがΔΨm損失並びにアポトーシスの他のホールマーク(NA、PMP、PS露出)を廃止することおよび死に対してニューロンを保護することの両方が可能であるようである(図9Aおよび9B)。Q−VD−OPHおよびZ−VDVAD−FMKの阻害プロファイルをより良好に特徴付けるために、ニューロン保護のための最良のパターンが決定された。アポトーシスは、濃度依存性の方法ではQ−VD−OPHおよびZ−VDVAD−FMKによって阻害され、これは、SDの間にカスパーゼ・カスケードが皮質ニューロンにおいて活性化されることを強化する(図10)。高密度の培養(7×105/cm2)を考慮すると、100μMの各阻害剤(これは、この研究で用いられる濃度である)によってより高い保護効果が提供される。血清抜き出し後2〜6時間に遅らせられる阻害剤による処理があまり効率的でないので、SDの当初におけるこれらの阻害剤(100μM)の添加は、Q−VD−OPHまたはZ−VDVAD−FMK誘導型ニューロン保護のための最良のパターンである(補充物質;図10)。さらに、カスパーゼ−2様活性化は、SDの2時間から検出され、ΔΨm降下の最初の徴候(8時間)およびさらなる核変化の両方より先に起こる(図9C)。要するに、これらの所見は、前ミトコンドリア・カスパーゼ−2様活性が、皮質ニューロンにおけるSD誘導型アポトーシスに必要とされる最も基部に近いカスパーゼ活性であることを示している。カスパーゼ−2様活性は、Z−VDVAD−FMKによって破壊されるが、Z−DEVD−FMK、Z−LEHD−FMKまたはZ−LETD−FMKによって破壊されない(図9D)。対照的に、カスパーゼ−3様およびカスパーゼ−9様活性は、Z−VDVAD−FMKによって阻害され、その結果、これは、カスパーゼ−2様活性がカスパーゼ−3様およびカスパーゼ−9様活性の両方の上流にあることを立証する(図9D)。それぞれカスパーゼ−3様およびカスパーゼ−8様活性を廃止する一方で(図9D)、Z−DEVD−FMKおよびZ−LETD−FMKは、ニューロンをSDから保護することができなかった(図9Aおよび9B)、この結果、これは、カスパーゼ−3が活性に関連し、かつ、カスパーゼ8の増加がニューロン分解に必須でないことを示す。さらに、カスパーゼ−8阻害剤も、カスパーゼ−2、−3または−9の活性化を阻止することができなかった(図9D)。カスパーゼ−9阻害剤であるZ−LEHD−FMKは、ΔΨm降下を減じないが、これに対して、これは、アポトーシス体形成を遅らせかつ妨げたが、段階Iの凝縮(NA)、PS露出およびPMPを遅らせかつ妨げることはなかった(図9Aおよび9B)。
配列番号1 5’−caccuccuagagaaggacadTdT−3’
配列番号2 5’−uguccuucucuaggaggugdTdT−3’
である。
配列番号3 5’−caucuacucgagacggacadTdT−3’
配列番号4 5’−uguccgucucgaguagaugdTdT−3’
である。
MMP依存性の事象、例えばシトクロムc放出がカスパーゼ−2阻害またはノックダウンによって妨げられるかどうかを決定するための調査が行われた。SDはミトコンドリアからの細胞質シトクロムc放出の引き金となり、これは、Q−VD−OPH、Z−VDVAD−FMKおよびsiRNA C2 wtによって効果的に阻止される(図12A)。同様に、Q−VD−OPH、Z−VDVAD−FMKおよびsiRNA C2 wtは、カスパーゼ−2活性化を完全に破壊し、下流のカスパーゼ9およびカスパーゼ−3のシトクロムc放出依存性活性化を妨げる(図12Bおよび12C)。イオノマイシンによって誘導される細胞死は、皮質ニューロンにおけるカスパーゼ−2活性化に依存せず(図12B)、これは、Z−VDVAD−FMKおよびsiRNA C2 wtによる他のアポトーシスのホールマークについての保護効果がないことに一致する(図12Dおよび12E)。(Z−LEHD−FMKによる)カスパーゼ−9およびカスパーゼ−3(Z−DEVD−FMKによる)のようなより末端のカスパーゼの阻害はシトクロムc放出を妨げることができなかった(図12A)のに対して、Z−LEHD−FMKは、核凝縮の予備段階(段階I)でのより高頻度の阻止によって観察されるように末期のアポトーシスの特徴を遅らせ得る(図12A)ことに留意されるべきである。Z−LEHD−FMKがΔΨm降下に損なわないのに対してこれがカスパーゼ−9活性化およびアポトーシスの末端の特徴、すなわち、PS露出、NAおよびPMPを妨げるという事実(図9A、9Bおよび9D)をまとめると、これらの結果は、シトクロムc、カスパーゼ−9およびこれに続くカスパーゼ−3活性化に影響を及ぼす古典的なアポトソーム(apoptosome)の形成を支持する。
Baxおよびカスパーゼ−2間の結び付きを精密に確立するために、SDニューロンにおけるカスパーゼ−2およびBaxの発現がmRNAおよびタンパク質レベルにおいてチェックされ、SDを通しての活性なカスパーゼ−2の精密な細胞局在性に調査は焦点が当てられた。
上記結果は、上流および早期のカスパーゼ−2活性が前記インビトロモデルにおいて重大なチェックポイントであることを立証する。このような経路が急性のニューロンのストレスの間にインビボで効果的にターゲットにされ得るのかどうかを決定するための実験が行われた。処理のために、細胞透過性および阻害ポテンシャルの両方を増大させ得る、アミノ末端のキノリン基およびカルボキシ末端のO−フェニロキシ基と結合されたペンタペプチドVDVADを基礎として、Q−VDVAD−OPHと名付けられた新しい細胞透過性のカスパーゼ−2阻害剤プロトタイプのカスタム合成が行われた。
Q−VDVAD−OPHの特異性が組み換えカスパーゼ−2に対して試験され(図15A)、カスパーゼ−2によるインビトロのVDVAD−AMC切断は、Q−VDVAD−OPHによって阻止される。この効果は、Q−VD−OPHおよび特異的カスパーゼ−2可逆阻害剤(Ac−VDVAD−Cho)または不可逆阻害剤(Z−VDVAD−FMK)と同等である。Z−VAD−FMKによる切断阻害がそれほど重要でない一方で、BOC−D−FMKは、カスパーゼ−2に対して完全に不活性であり、この結果、これは、通常の汎カスパーゼ阻害剤のカスパーゼ−2に対するより低い作用強度を立証する。カスパーゼ−2は、Z−DEVD−FMK(カスパーゼ−3様阻害剤)またはZ−LEHD−FMK、Z−LETD−FMK(カスパーゼ−3/9/8様阻害剤)それぞれによって強くは不活性化されない(図15A)。E64d、ALLN、ALLM、他のシステインプロテアーゼ阻害剤であるカルパインは、切断活性を損なうことができない(図16)。SD系統(しかしイオノマイシン誘導型の死ではない)において試験される場合、Q−VDVAD−OPHは、Q−VD−OPH、Z−VDVAD−FMKまたはsiRNA C2 wtが行った(図8B、9Aおよび11Dおよび11B)ように皮質ニューロンの生き残りを促進し(図15B)、この結果、これは、インビボ実験のための特異的カスパーゼ−2阻害剤を提供する。対照的に、BOC−D−FMKおよびZ−VAD−FMKは、SD誘導型ニューロン細胞死に対して非効率であった(図8A)。次いで、Q−VDVAD−OPHが、細胞死がどちらかと言えばアポトーシスにより発生する発育中の脳内の低酸素症−虚血損傷(hypoxic-ishemic injury)の急性モデルにおいて試験された。この一過性の片側病巣虚血モデル(unilateral focal ischemia model)では、子ラット(rat pups)は、再灌流を伴う左頸動脈の一過性の閉塞と関連して恒常的な左中大脳動脈閉塞を経た。次いで、この周産期(perinatal)虚血モデルに投与される時の汎カスパーゼ(Q−VD−OPH)およびカスパーゼ−2特異的(Q−VDVAD−OPH)阻害剤のニューロン保護効果が検討された。Q−VD−OPHまたはQ−VD−VAD−OPHの1回の用量(100μ
g/動物)または賦形剤が、虚血開始前に腹腔内(i.p.)投与された。次いで、大きな浮腫(oedema)(1.5%以下)なく梗塞が安定化される時間ポイントである48時間後に脳が分析された。虚血は、55.0±3.4mm3の梗塞容積を誘導した。これは傷害同側半球(lesioned ipsilateral hemisphere)において22.1±1.4%の損傷を示す。梗塞容積は、通常に分布されるようであった(15〜26%)(図15Cおよび15D)。虚血前に与えられるQ−VD−OPHの単回の用量は、44%まで梗塞容積を大きく低減させ(Newman-Keul’s検定における対照群と比較して12.4±2.6%,p<0.05)、容積は、0〜31に分布された(図15Dおよび15E)。Q−VDVAD−OPHは、同一用量で、梗塞容積において非常に大きい74%の減少を誘導した(Newmann-Keul’検定において対照およびQ−VD−OPH群と比較して5.7±2.3%,p<0.01)(図15Cおよび15D)。12の研究された動物に関して、8が、虚血対照動物と比較してMCA閉塞のレベル(プレート12および13に対応するレベル)で可視の非常に著しくより小さい梗塞(0.5%の中央値)を示したが、脊椎(dorsal)および海馬(dorsal hippocampus)のレベル(プレート21)で示さなかった(図15Cおよび15E)。他の4つは、16.5±1.32%の平均で梗塞を示し、虚血対照動物において得られたものより低い値であった。結論として、我々のデータは、初発因子であるカスパーゼ−2の特異的な阻止が強いニューロン保護を提供し、これは虚血脳障害に対して汎カスパーゼ阻害より効果的であることを立証する。
(前ミトコンドリア・カスパーゼ−2活性は、ニューロンアポトーシスに必要とされる)
本発明は、上記のように、一次皮質ニューロンのSD誘導型アポトーシスが、上流の初発因子であるカスパーゼ−2の活性化に依存し、Bax誘導型ミトコンドリアの機能不全およびこれに続くカスパーゼ依存性のニューロンの破壊の制御を通して進行する新規な固有経路サブタイプを記載する(図17)。
試験された3つの広域スペクトルのカスパーゼ阻害剤の中で、Q−VD−OPHのみが、皮質SD−ニューロンにおいて有意なカスパーゼ阻害および生き残りを提供する。この第3世代の汎カスパーゼ阻害剤は、増大した抗アポトーシス特性を示し、ニューロンに限定されない。これは、最良の細胞透過性(アミノ末端のキノリン基)、カルボキシ末端のO−フェニロキシ基の特異性および効率性(古典的なフルオロメチル/クロロメチル ケトンを超える)に起因するようである。このため、Q−VD−OPHが古い世代の阻害剤であるZ−VAD−FMKおよびBOC−D−FMKより多大に神経生物学のために使用されるようである。ニューロン培養モデルにおけるマルチ−カスパーゼ阻害は、一般的に、全てのアポトーシスを保存するわけではなく一過性または部分的な保護を提供した。この理由は、ミトコンドリアチェックポイントの下流に含まれるカスパーゼ(単数または複数)の阻害がシトクロムc放出を妨げず、むしろ死への傾倒を拡張する、部分的なミトコンドリアのカスパーゼ非依存性経路または(上流のカスパーゼ非依存性の)ミトコンドリア経路の活性化に起因するようである。例えば、神経成長因子(nerve growth factor:NGF)由来のBOC−D−FMKが保護する交感神経ニューロンは、タンパク質合成および電気生理学的形質膜特性を回復することなく形態学的保存を示した。逆に、特異的カスパーゼ−2の不活性またはノックダウンが前ミトコンドリアレベルで起こり、この結果、シトクロムc放出および下流の依存性の事象を妨げれば、SDニューロンは、ほぼ保存された形態(細胞体および神経突起ネットワーク)を示すようである。
本発明は、不活性化される(Z−VDVAD−FMK)またはサイレンシングされる(siRNA C2 wt)場合に高いニューロンの生き残りを促進する前ミトコンドリア・カスパーゼ−2の初期の要求のためのモデルを支持する(図8)。
siRNAを脳内に送達する困難性を考慮して、第1のO−フェニロキシベースおよびキノリンベースの、特異的にカスパーゼ−2を阻害し得るペプチドが、カスパーゼ−2レベルのインビボの治療的な介入についての概念を証明するために設計された。
(一次皮質ニューロンの単離および培養)
一次皮質ニューロンは、E14スイスマウス胎児(embryos)(Janvier)から培養された。マウスは、頚部脱臼によって殺され、胎児は帝王切開によって取り除かれた。大脳皮質が抽出され、組織がL15培地(Gibco BRL)において1000μlチップ(Eppendorf)を用いることによって15回機械的にすり潰され、次いで、残さが取り除かれ、そして、細胞懸濁液は、850rpmで10分にわたり遠心分離された。ニューロンは、2日にわたり、1%グルタミン、5%ウマ血清(HS,Eurobio)および2.5%ウシ胎仔血清(FCS,Eurobio)により補充されたイーグルの基本培地(Eurobio)中に高密度(7×105生細胞/cm2)で、1mg/mlのポリエチレンイミン(Polyethyl-enimine)(Sigma)により事前にコーティングされた、6または24ウェル−プレート(Sarstedt)または4−ウェル−Lab-Tek(登録商標)カバーグラスチェンバー(4-well-Lab-Tek chambered coverglass)(Nalge Nunc International)上に塗布された。DIV3で、培地は毎日交換され、ニューロンは、180mg/lのグルコース、5%のHSおよび1%のFCSおよび3μMのシトシン β−D−アラビノフラノシド(Sigma)および1μMの5−メチル−10,11−ジヒドロ−5H−ジベンゾシクロヘプテン−5,10−イミン マレアート(MK-801,Sigma)を含むN5完全培地に維持された。培養の純度(>95%)は、抗微小管結合タンパク質2モノクローナル抗体(MAP−2,Sigma)および抗グリア細胞繊維性酸性タンパク質ポリクローナル抗体(GEAP,Dako)により制御された。ニューロンは、DIV6−DIV9の間で用いられた。
細胞死は、DIV6において血清欠乏(SD)によって誘導された。簡単には、以下のように血清抜き出しが行われた:N5完全培地において培養されたニューロンが、HSおよびFCSの両方を欠くN5において迅速に3回洗浄され、薬理学的試剤の不存在下または存在下に血清のないN5培地において24時間にわたりインキュベートされた。あるいは、細胞死はまた、24〜48時間にわたるイオノマイシン、スタウロスポリン、カンプトテシン、1−メチル−4−フェニル−1,2,3,6−テトラヒドロピリジン(MPTP)、3−ニトロプロピオン酸(3NPA)、ニトロプルシドナトリウム(SNP)(全てSigmaから購入された)またはβ−アミロイドペプチド(25−35)(Bachem)による処理によって導入された。ニューロン保護アッセイのための試剤がSDまたは薬品処理の当初に(N5完全培地において)加えられた。それらは、それら自体によって細胞毒作用を誘導しない濃度で用いられた。シクロスポリンA、4,4’−ジイソチオシアナスチルベン−2,2’−ジスルホン酸二ナトリウム塩(DIDS)、ルテニウムレッド、デシルユビキノン、1,2−ビス(2−アミノフェノキシ)エタン−N,N,N’,N’−テトラ酢酸のアセトキシメチルエステル(BAPTA−AM)、3−メチルアデニン、バフィロマイシン(bafilomycin)A1、ラパマイシン、レプトマイシン(leptomycin)B、N−ベンジロキシカルボニル−Phe−Phe−フルオロメチルケトン(Z−FF−FMK)、ペプスタチン、オカダ酸、ミクロシスチン(microcystin)LR、H−7、アスピリン、ウォルトマンニン、ゲニステイン(genistein)、ラクタシスチン(lactacystin)、エポキソマイシン、トロロックス(登録商標)(Trolox)、N−アセチル−システイン、グルタチオン、アクチノマイシンD、シクロヘキサミドがSigmaから購入され;N−ベンジロキシカルボニル−Val−Ala−Asp(OMe)−フルオロメチルケトン(Z−VAD−FMK)、BOC−Asp(OMe)−フルオロメチルケトン(BOC−D−FMK)、キノリン−Val−Asp(OMe)−CH2−O−Ph(Q−VD−OPH)、N−ベンジロキシカルボニル−Phe−Ala−フルオロメチルケトン(Z−FA−FMK)、
N−ベンジロキシカルボニル−Asp−Glu(OMe)−His−Asp(OMe)−フルオロメチルケトン(Z−DEVD−FMK)、N−ベンジロキシカルボニル−Leu−Glu(OMe)−His−Asp(OMe)−フルオロメチルケトン(Z−LEHD−FMK)、N−ベンジロキシカルボニル−Leu−Glu(OMe)−Thr−Asp(OMe)−フルオロメチルケトン(Z−LETD−FMK)、N−ベンジロキシカルボニル−Val−Asp(OMe)−Val−Ala−Asp(OMe)−フルオロメチルケトン(Z−VDVAD−FMK)はICNから購入され;キノリン−Val−Asp(OMe)−Val−Ala−Asp(OMe)−CH2−O−Ph(Q−VDVAD−OPH)のカスタム合成がICNによって行われ;4−(2−アミノエチル)−ベンゼンスルホニルフルオリド(AEBSFまたはペファブロックSC)は、Rocheから購入され;N−アセチル−Leu−Leu−Norleu−al(カルパイン阻害剤IまたはALLN)、N−アセチル−Leu−Leu−Met−al(カルパイン阻害剤IIまたはALLM)、trans−エポキシスクシニル−L−ロイシルアミド−(4−グアニジン)ブタン(E64d)、MDL−28170、SB 202190、PD 98059、SP 600125がMerck/VWRから購入された。
マルチプローブ蛍光顕微鏡法(FM)が、事前に染色されたニューロンについて、100Wの水銀ショートアークランプおよびa×40N PLAN L対物レンズまたは水浸(immersion) ×100 N PLAN対物レンズを備えたDM IRB反転(inverted)蛍光顕微鏡(Leica)を用いて行われた。通常、定量研究は、実験当たり5〜10の無作為に選択された領域を計測することによる約200〜600細胞/領域についてのFMおよびより高いサンプルスループットのためのフローサイトメトリー(FC)の両方によって行われた。この後者のために、既に記載されたように(Lecoeurら,2004)染色されたニューロンのトリプシン処理後にアポトーシスおよび関連する事象のマルチパラメトリックな分析が行われた。FCは、15mW空冷488nmアルゴンレーザ(Becton Dickinson)を備えた3色FACSCaliburサイトメータを用いて行われた。
既に記載されているように(Lecoeurら,2004)、FCおよびFMの両方によって測定が行われた。ミトコンドリアの膜電位(ΔΨm)は、ΔΨm高感度染料である5,5’,6,6’−テトラクロロ−1,1’,3,3’−テトラエチルベンズイミダゾリルカルボシアニン ヨージド(JC-1,Molecular Probes)の取り込みによって評価された(Sileyら,1991)。ニューロンは、1μMのJC−1により30分にわたり37℃で負荷がかけられた。FMについては、緑色(モノマー,低ΔΨm)およびオレンジ色(J−凝集体,高ΔΨm)蛍光が同時に取得された(BP 450−490励起/LP 515ロングパス発光フィルタ)。JC−1モノマーは、F1−1チャネルにおいてFCによって検出された。J−凝集体は、F1−2チャネルを通して検出された(Lecoeurら,2004)。あるいは、ΔΨmはまた、60nMのMitoTracker(登録商標)Red(CMXRos;分子プローブ)によって評価され、FM(BP 515−560励起フィルタ/LP 590発光フィルタ)によって検出された。ΔΨm崩壊のための陽性対照は、カルボニルシアニド m−クロロフェニルヒドラゾン(mClCCP,100μM,45分)により行われた。活性化されたカスパーゼ−2、−3、−8および−9は、特異的なFAM結合ペプチド(蛍光色素がラベリングされたカスパーゼ阻害剤(FLICA)と呼ばれる):CaspaTag(登録商標)フルオレセインカスパーゼ活性キット,Q-Biogen,Illkirch,フランス;ApoFluor(登録商標)カスパーゼ検出キット,ICN,Orsay,フランス;FAM−VDVAD−FMK、FMK−DEVD−FMK、FAM−LETD−FMKおよびFAM−LEHD−FMKをそれぞれ用いて検出された。ニューロンは、FLICAと共に(1:150,CaspaTag(登録商標)または1:500,ApoFluor(登録商標))1時間にわたり37℃でインキュベートされ、次いで、3回洗浄バッファで洗浄された。FMのために、FAM結合ペプチドが、BP 480/40フィルタを通して励起され、発光された光は、BP 527/30フィルタを通して集められた。FC分析は、F1−1チャネルにおいて行われた(Lecoeurら,2004)。形質膜の外側のリーフレットへのホスファチジルセリン(PS)露出は、FITC結合型アネキシンV(Immunotech)の固定を通して検出された。形質膜透過性(PMP)は、核DNAへの7−アミノアクチノマイシンD(7−AAD,Sigma)の増加した結合を通して検出された。染色およびFMおよびFCによる分析は、既出(Lecourら,2004)のように行われた。核は、1μMのヘキスト(登録商標)33342により染色され(30分)、FMによって分析された(BP 340−380励起フィルタ/LP 425 ロングパスフィルタ)。核アポトーシス(NA)は、ニューロンにおいて既に規定されたように(Lecourら,2004)評価された。
Lab-tek(登録商標)チャンバスライドでのニューロンの生育は、20分にわたり4%のパラホルムアルデヒド/0.19%のピクリン酸に固定され、PBS中の0.01%のトリトン−X100により5分にわたり透過性化され、次いで、PBS中の10%のFCSにより30〜45分にわたり遮断された。全ての免疫染色は室温で行われた。抗体は、PBS中の1%のウシ血清アルブミン(Sigma)で希釈された。次いで、ニューロンは、マウスのモノクローナルIgG1抗シトクロムc(1時間;1:200;クローン 6H2.B4,BD,Pharmingen)および第2の抗体としてのヤギ抗マウスIgGのAlexa Fluor(登録商標)594 F(ab’)2フラグメント(1時間,1:200;Molecular Probes)を用いて染色された。同様に、Bax転座は、カルボニル末端の21アミノ酸を欠失したマウスのBaxαに対して生じさせられたウサギのポリクローナル抗体(1時間,1:100;Δ21,Santa Cruz Biotechnology)を用いて調査され、FITC−ヤギの抗ウサギIgG抗体(1時間,1:100;Molecular Probes)により検出された。拡散した細胞質シトクロムcまたはBax点状ラベリングのいずれかを示す細胞が、FMの下で、条件当たりおよび実験当たり150〜300の無作為に選ばれた細胞に対応する約10の領域についてカウントされた。カスパーゼ−2は、ラットのモノクローナル抗マウスカスパーゼ−2抗体(10C6,Alexis Biochemicals,San Diego,CA,米国;1:100,1時間)および第2の抗体としてのヤギ抗ラットIgGのAlexa Fluor(登録商標)594 F(ab’)2フラグメント(1時間,1:100,Molecular Probes)を用いることによって細胞内検出された。活性化されたカスパーゼ−3は、FCによって細胞内評価された(Lecoeurら,2004)。進行のため、ニューロンはトリプシン処理され、1%のPFAおよび20μg/mlのアクチノマイシンD(Sigma)を含むPBSに20分にわたり固定された。次いで、ニューロンは、20μg/mlの7−AADおよび20μlのフィコエリトリン結合型ポリクローナル・ウサギ抗カスパーゼ−3抗体(BD Pharmingen)の両方を含む100μLのPBS/1%のBSA/0.05%のサポニンキラヤバーク(Sigma)に30分にわたり再懸濁させられた。
二本鎖siRNAは、マウスカスパーゼ−2遺伝子の配列(AACACCTCCTAG AGAAGGACA;ヌクレオチド185−203;siRNA C2 wt)に対応する。同じ配列の4箇所の突然変異により不活性なsiRNAが設計された(AACATCTACTCG AGACGGACA;siRNA C2 m)。siRNA C2 wtの配列は、その特異性を保証するためにBLASTに提出された。アニーリングされたsiRNA二本鎖化合物(RP−HPLC精製される)は、Proligoから購入された。DIV6での24ウェル−プレート(7×106/ウェル)またはLab-Tek(登録商標)4−カバーグラスチャンバー(1.33×106/ウェル)におけるニューロンの培養は、6時間にわたりsiRNA(3.8μg)によりリポフェクタミン2000(Invitrogen)を用いてトランスフェクトされた。次いで、ニューロンは、洗浄され、完全N5培地にさらに16時間にわたり戻され、その後に、24時間SDまたはイオノマイシン処理に付されたかまたは付されなかった。
RNA抽出は、24ウェル(1.33×106ニューロン)または6ウェル(7×106ニューロン)プレートにおいて、製造者の推薦によるRNeasy(登録商標)mini Kit(Qiagen)を用いて直接的に行われた。逆転写は、Supercript(登録商標)II RNアーゼ H−逆転写酵素(Invitrogen)を用いて行われた。PCRプライマー:Baxフォワードプライマー 5’−AGAGGCAGCGGCAGTGAT−3’、Baxリバースプライマー 5’−AGACACAGTCCAAGGCAGTGG−3’;カスパーゼ−2フォワードプライマー 5’−GAGCAATGTGCACTTCACTGG−3’、カスパーゼ−2リバースプライマー 5−CCACACCATGTGAGAGGAGTG−3’、カスパーゼ−9フォワードプライマー 5’−AGCTGGAGCCGTCACAGCC−3’、カスパーゼ−9リバースプライマー 5’−CTCCGCCAGAACCAATGTCC−3’;GAPDHフォワードプライマー 5’−GGTCGGAGTCAACGGATTTGGTCG−3’、GADPHリバースプライマー 5’−CCTCCGACGCCTGCTTCACCAC−3’ は、Proligoから購入された。 増幅条件は、94℃1分に続いて:Baxについて、94℃30秒、58℃30秒、72℃1分、次いで、72℃15分を30サイクル;94℃30秒、54℃30秒、72℃1分、次いで72℃15分の1サイクルをカスパーゼ−2およびカスパーゼ−9について35サイクルまたはGADPHについて25サイクルである。PCRの後、20μlが1.5%のアガロースゲルを用いる電気泳動に付され、バンドはエチジウムブロミド(ethidium bromide)染色をUV照射することにより視覚化され、これを写真撮影した。GAPDHは、増幅の内部対照として用いられる。
ニューロン(6ウェルプレート中7×106)が、4℃で、完全プロテアーゼ阻害剤反応混液(Roche)により補充された50μlのCSFバッファ(220mMのマンニトール、68mMのスクロース、5mMのピルビン酸塩、0.5mMのEGTA、2mMのMgCl2、2mMのNaCl、2.5mMのKH2PO4、1mMのジチオトレイトール、20μMのサイトカラシンBおよび10mMのHepes,pH7.5)において採取され、次いで、5回の液体窒素中の凍結溶解法サイクルで破壊された。サンプルは、核および未破壊の細胞を除くために900Gで5分にわたり4℃で遠心分離され、続いて、ミトコンドリアに富む重い膜画分を得るために10,000Gで30分にわたり4℃で遠心分離された。その後、サンプルは、ミクロソームをペレット状にするために100,000Gで10分にわたり4℃で遠心分離された。物質は、25mMのトリス−HCl(pH7.4)、25mMのNaCl、5mMのEDTA、1%のトリトンX−100に再懸濁させられ、その後に、ブラッドフォードアッセイ法によってタンパク質濃度が測定された。各画分の10μgがウェスタンブロット分析に用いられた。
ニューロンは、完全プロテアーゼ阻害剤反応混液(Roche)によって補充された25mMのトリス−HCl(pH7.4)、25mMのNaCl、5mMのEDTA、1%のトリトンX−100に室温で溶解させられた。タンパク質濃度は、Bio-Radタンパク質アッセイキットを用いて測定された。タンパク質(カスパーゼ−2については30μg;Baxについては10μg)は、12.5%のポリアクリルアミドゲルを用いて分離され、PVDF膜(Amersham)に移された。免疫染色は、FCL(Amersham Pharmacia Biotech)を用いて示された。モノクローナル抗マウスカスパーゼ−2抗体(11B4,Alexis Biochemicals)は1:1000の希釈度で用いられ;カルボキシ末端の21アミノ酸を欠失したマウスBaxαに対して生じさせられたポリクローナル抗体(Δ21,Santa Cruz Biotechnology)は1:200の希釈度で用いられ、(残渣11〜30を認識する)Baxαのアミノ末端に対して生じさせられたポリクローナル抗体(N20,Santa Cruz Biotechnology)は1:1000の希釈度で用いられた。アクチン(42kDa;Sigma;1:5000)は、等価な負荷対照として用いられた。ヒート−ショックタンパク質60(HSP60)のマウスモノクローナル抗HSP(Sigma;1:400)による免疫ブロット法は、ミトコンドリアに富む重い膜画分の純度をチェックするために用いられた。
ヒト組み換えカスパーゼ−2(BIOMOL Quantizyme(登録商標)Assay System)の活性は、100μlのアッセイバッファ(50mMのHEPES(pH7.4)、100mMのNaCl、0.1%のCHAPS、10mMのDTT、1mMのEDTA、10%のグリセロール)において評価された。50μMのVDVAD−AMCの組み換えカスパーゼ−2(125U)による切断は、30分後に37℃で、蛍光マイクロプレートレーダを用い405nmで励起する510nmの蛍光放射をモニタリングすることによって測定された。VDVADアーゼ活性の阻害のために、阻害剤(2μM)は、カスパーゼ−2の存在下に30分にわたり37℃で事前にインキュベートされ、その後に続いて、50μMのVDVAD−AMC(30分,37℃)によりインキュベートされた。VDVAD−AMC単独により顕著な蛍光バックグランドは観察されなかった。
新生児ウィスターラット(Wistar rat)(雌親プラスその9匹の仔ラット)が、仔ラットが3〜4日齢である時に、Janvier(Le Genest-St-Isle,フランス)から得られた。仔ラットは、食物および水が自由に利用可能な12:12時間の明暗サイクルの元でそれら雌親と共に収容された。動物実験は、実験動物の注意および使用のためのフランスおよび欧州共同体のガイドラインに従って行われた。虚血は、既に記載される(Renolleauら,1998)ように7日齢のラット(17〜21g)に実施された。仔ラットは、抱水クロラール(350mg/kg)の腹腔内注射により麻酔をかけられた。麻酔をかけられたラットは仰向けに置かれ、首に正中切開がなされて左総頸動脈を露出させた。次いで、ラットは、右側を下にする横向きに置かれ、耳と目との間に斜位(oblique)皮膚切開がなされた。側頭筋(temporal muscle)の切除の後、頭蓋骨(cranial bone)が額縫合線(frontal suture)から頬骨弓(zygomatic arch)より下の高さ位置にかけて除かれた。次いで、鼻の裂け目の上のその出現のすぐ後に露出される左中大脳動脈は、大脳静脈より下方の高さ位置で凝固させられた。この手順の後、左総頸動脈を塞ぐためにクリップが置かれた。次いで、ラットは、低体温を回避するためにインキュベータ内に置かれた。50分後、クリップが取り除かれた。頸動脈血流回復が顕微鏡を用いて検査された。次いで、首および頭蓋の皮膚が閉じられた。外科手順の間、体温は37〜38℃に維持された。仔ラットは、回復するまでインキュベータ(32℃)に移され、次いで、その後にそれらの雌親の元(dam)に移された。
ヒトカスパーゼ−2サイレンシングに対して特異的なsiRNAの設計
ヒトカスパーゼ−2遺伝子ノックダウンに特異的なsiRNA(hsiRNA C2 wt)が、ヒト(虚血およびその他)傷害および疾患へのさらなる適用ために設計された。このsiRNA二本鎖化合物は、下記の相補的配列から構成される:
配列番号6 5’−caucuucuggagaaggacadTdT−3’
配列番号7 5’−uguccuucuccagaagaugdTdT−3’
実験アプローチが、Robertsonモデルに基づく前記siRNAを試験するために開発され(Robertsonら,2002)、これは、Z−VDVAD−FMKによるカスパーゼ−2阻害が、ジャーカットT細胞(Jurkat T cell)においてシトクロムc放出およびホスファチジルセリン残渣露出を部分的に減少させたことを示した。
汎カスパーゼ阻害剤であるQ−VD−OPH(25〜100μM)または選択的カスパーゼ−2阻害剤であるZ−VDVAD−FMK(25〜100μM)による事前処理は、DNA−損傷およびトポイソメラーゼII阻害剤であるVP−16によって誘導される細胞死を妨げる(図18)。7〜8時間での生き残りがVP16の広範囲の濃度に対して得られた(図18)。Z−VDVAD−FMKがΔΨm損失を阻止したという事実は、この系統においてカスパーゼ−2活性がミトコンドリアの上流で起こることを示唆する。したがって、図19では、データは、
(i)徐々のΔΨm損失は、Z−DEVD−FMK、Z−LEHD−FMK、Z−LETD−FMKによって廃止されず、Z−VDVAD−FMKまたはQ−VD−OPHのみによって廃止される;
(ii)Z−DEVD−FMK、Z−LEHD−FMK、Z−LETD−FMKは、カスパーゼ−2活性を損なわず、これは、カスパーゼ−2は、研究されたより上流のカスパーゼを示唆する;
(iii)カスパーゼ−9阻害はカスパーゼ−3活性化を妨げるが、カスパーゼ−3阻害はカスパーゼ−9活性化を妨げず、これは、カスパーゼ−3がカスパーゼ−9を通じて活性化されることを示す;
(iv)終端の核変化およびPMPは、Z−VDVAD−FMK、Q−VD−OPHによって大部分妨げられ、Z−LEHD−FMKによってより小さい範囲で妨げられる;
(v)ANTブロッカーであるBAは、ΔΨm損失およびPMPを減少させ、これは、活性化されたカスパーゼ−2の後アポトーシス作用を仲介する際のミトコンドリアの役割を確認する;
(vi)CHXおよびActDがΔΨm損失およびPMPのいずれも妨げないので、VP16−カスパーゼ−2依存性細胞死は翻訳および転写に依存しない;
(vii)Z−LETD−FMKがΔΨm損失、カスパーゼ−2および−3の活性化、核変化およびPMPを妨げることができないため、カスパーゼ−8依存性の経路はこのモデルにおいて重要でない
ことを示す。最後に、データ全体は、前ミトコンドリア・カスパーゼ−2活性化がΔΨm降下を誘導し、カスパーゼ−9/カスパーゼ−3の活性化、核凝縮/断片化および終端のPMPのような下流の事象を促進するモデルの証拠となる。
(細胞培養)
ジャーカット細胞は、ATCCから購入され(クローンE6−1)、10%のウシ胎仔血清により補充されたRMPI 1640(Glutamax rich)培地中100000〜120000細胞/ウェル(24ウェルプレート)の密度で培養された。ジャーカット E6−1細胞(ATCC番号:TIB−152)は、ジャーカット−FHCRCのクローン((Schneiderら(1977)により14年齢の年老いた雄の末梢血から以前に確立され、オリジナルに設計されたJMである)ジャーカット細胞系の誘導体)である。細胞は、実験のために7〜14の継代で用いられた。
細胞は、種々の薬理学的試剤により30分〜1時間にわたり予備処理され、その後に続いて、VP16(VP16またはエトポシド;Sigma)処理(10〜20μM)が7〜8時間にわたり行われた。siRNA実験のために、VP16処理の前に、細胞は24時間にわたり3.8μgのsiRNA(Proligo)/2μLのリポフェクタミン 2000(500μL中)により処理された。マウス・カスパーゼ−2(配列番号1−2または配列番号3−4)が陰性対照のために用いられた。トランスフェクトの収率は、siRNA−FITC(配列番号1−2、配列番号3−4または配列番号6−7)の蛍光検出(フローサイトメトリー,FL−1)によって細胞内チェックされた。
(フローサイトメトリー)
二重のJC−1/7−AAD染色:ミトコンドリア膜電位(ΔΨm)は、DYm高感度染料である5,5’,6,6’−テトラクロロ−1,1’,3,3’−テトラエチルベンズイミダゾリル カルボシアニン ヨージド(JC−1,Molecular Probes,1μM)の取り込みによって評価された。緑色(低ΔΨm)およびオレンジ色(高ΔΨm)の蛍光がそれぞれFL−1およびFL−2チャネルにおいてそれぞれ取得された。PMPは、7−アクチノマイシンD(7AAD;0.02mg;Sigma)の取り込みによって検出された(FL−3チャネル)。あるいは、二重のDioC6(0.1μM)/PI(5×10−3mg)染色が行われ、FL−1およびFL−2チャネルにおいてそれぞれ検出された。7000の事象が各条件のために少なくとも取得される。
活性化されたカスパーゼ−2、−3および−9が、特異的なFAM結合ペプチド(蛍光ラベリングされたカスパーゼ阻害剤(FLICA):CaspTag(登録商標)フルオレセインCaspase Activity Kits,Q-Biogen,Illkirch,フランス;ApoFluor(登録商標)Caspase Detection Kits,ICN,Orsay,フランスと呼ばれる):FAM−VDVAD−FMK、FAM−DEVD−FMK、FAM−LETD−FMKおよびFAM−LEHD−FMKを用いてそれぞれ検出された。細胞は、FLICA(1:150(CaspaTag(登録商標))または1:500(ApoFluor(登録商標)))と共に1時間にわたり37℃でインキュベートされ、次いで、洗浄バッファで3回洗浄された。FMのために、FAM結合ペプチドがBP 480/40フィルタを通じて励起され、放射光がBP 527/30フィルタを通じて集められた。形質膜透過性(PMP)は、7−アミノアクチノマイシンD(0.02mg,7−AAD,Sigma)の核DNAへの増加した結合を通じて検出された(BP515−560フィルタを通じて励起され、蛍光はLP590ロングパス発光フィルタを通じて集められる)。核は、1μMのヘキスト(登録商標)33342により染色され(30分)、分析された(BP 340−380励起フィルタ/LP425ロングパスフィルタ)。ミトコンドリア膜電位は、JC−1(1μM;30分)によって評価された:緑色およびオレンジ色の蛍光が、1.2秒の励起後に同時に記録された(BP450−490励起/LP 515ロングパス発光フィルタ)。
(shRNA)
(shRNAの構築および検証)
siRNAが血液脳関門を越えることが可能であったとしても、それらは、生物学的流体中で不安定であり、このため、克服することが困難な傷害は、インビボの細胞内送達であるだろう。最近になって、いくつかの進展は、siRNA送達のための優れた伝達手段としてウイルスを強調する。例えば、レトロウイルスまたはアデノウイルス(多くの実験的な遺伝子治療研究のための特段上等の導入遺伝子送達ベクター)が、治療のsiRNAを細胞内に送達しかつ安定的にこれを発現させるためにインビトロおよびインビボの両方において設計された。実際に、siRNAの組み換えバージョン:スモール・ヘアピン(small hairpin:sh)RNA(スモールRNAプロモータの制御の下でのヘアピンループバージョンしての構成性のsiRNA発現)がこの問題を回避するために製造された。shRNAの発現は、例えば、レンチウイルスの主鎖(これは、局所的な脳投与(例えば脳内−脳室(intracerebro-venticular)注射)によってインビボでニューロンを安定にトランスフェクトするために用いられ得る)において誘導され得、これは、恒常的なターゲット遺伝子のサイレンシングに導くはずである。
配列番号9 5’−CTAGAAAAAAcacctcctagagaaggacaCAAGCTTCtgtccttctctaggaggtgCGG−3’
2つのオリゴヌクレオチドのアニーリングに続いて、我々は、pGE−1ベクターのBamH IおよびXba I部位にクローニングされたsh−挿入断片を得た(図22B)。PCRによる陽性コロニーのスクリーニングの後、我々は、2つのクローンを選択した(shRNA6およびshRNA9)。これらのクローンは、配列決定され、U6プロモータの制御下のsh配列の正しい挿入を示した。
配列番号10 5’−GATCCCGcatcttctggagaaggacaGAAGCTTGtgtccttctccagaagatgTTTTTT−3’
配列番号11 5’−CTAGAAAAAAcatcttctggagaaggacaCAAGCTTCtgtccttctccagaagatgCGG−3’
(実験の部)
5’ BamH Iおよび3’ Xba Iオーバーハング(overhang)を有する2つの相補的オリゴヌクレオチドが合成された(Proligo)。アニーリング工程の後、これらのオリゴヌクレオチドは、予備処理された(BamH I/Xba I)pGE−1ベクター(Stratagene)にクローニングされた。挿入断片を含む陽性クローンのPCR選択に続いて、2つのクローンが増幅され、それらの配列が検証された(shRNA6およびshRNA9)。
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Claims (47)
- 細胞死におけるカスパーゼ−2活性を妨げ、阻止し/沈黙させるための阻害剤。
- 前記細胞はニューロンである、請求項1に記載のカスパーゼ−2阻害剤。
- 前記細胞はニューロン細胞系である、請求項1に記載のカスパーゼ−2阻害剤。
- 前記細胞は非ニューロン細胞系である、請求項1に記載のカスパーゼ−2阻害剤。
- カスパーゼ−2阻害剤は、カスパーゼ−2 mRNAを特異的にターゲットにしてカスパーゼ−2の発現を減少させるかまたは抑制することが可能な単離された二本鎖RNA分子である、請求項1〜4のいずれか1つに記載のカスパーゼ−2阻害剤。
- ニューロンにおいてカスパーゼ−2の発現を沈黙させる、請求項5に記載のカスパーゼ−2阻害剤。
- ニューロン細胞系においてカスパーゼ−2の発現を沈黙させる、請求項5に記載のカスパーゼ−2阻害剤。
- 非ニューロン細胞系においてカスパーゼ−2の発現を沈黙させる、請求項5に記載のカスパーゼ−2阻害剤。
- 15〜25ヌクレオチド、好ましくは19〜25ヌクレオチドの相補鎖からなる二本鎖体を含む、請求項5〜8のいずれか1つによるRNA分子。
- 相補的な配列番号1および配列番号2の二本鎖体または相補的な配列番号6および配列番号7の二本鎖体を含む、請求項5〜9のいずれか1つによるRNA分子。
- 請求項5〜10のいずれか1つによるsiRNAの配列をベースとするshRNA構築物を含み、該構築物は、細胞内カスパーゼ−2サイレンシングにつながる、請求項5によるRNA分子。
- 配列番号1および配列番号2の両方または配列番号6および配列番号7の両方または配列番号8および配列番号9の両方または配列番号10および配列番号11の両方の挿入断片を含む、請求項11に記載のRNA分子。
- ニューロンまたはニューロン細胞系において細胞内カスパーゼ−2サイレンシングにつながる、請求項11または12に記載のRNA分子。
- 非ニューロン細胞系において細胞内カスパーゼ−2サイレンシングにつながる、請求項11または12に記載のRNA分子。
- 配列番号5を有する分子によるカスパーゼ−2活性のインビトロ阻害。
- 配列番号5を有する分子によるカスパーゼ−2活性のインビボ阻害。
- Baxとカスパーゼ−2との間の相互作用を妨害するかまたはカスパーゼ−2依存性Bax切断を妨げることが可能な分子。
- 配列番号(例えば、配列番号12〜23)を含む3〜40のアミノ酸の長さを有するBax配列由来であり、Baxにおけるカスパーゼ−2切断の推定部位と競争し得るペプチド。
配列番号12:KTGAFLLQGFIQDRAGRMAGETP
配列番号13:GAFLLQGFIQDRAGRMAGETP
配列番号14:FLLQGFIQDRAGRMAGETP
配列番号15:LQGFIQDRAGRMAGETP
配列番号16:GFIQDRAGRMAGETP
配列番号17:FIQDRAGRMAGETP
配列番号18:IQDRAGRMAGETP
配列番号19:IQDRAGRMAGE
配列番号20:IQDRAGRMA
配列番号21:IQDRAGR
配列番号22:IQDRA
配列番号23:IQDR - N末端またはC末端において、(特異的な認識に続いてまたは続かないで)細胞に入りカスパーゼ−2とBaxとの間の相互作用を妨害することが可能なキメラ分子を生ずるペプチド性または非ペプチド性分子と結合された、請求項16による分子。
- N末端またはC末端において、(特異的な認識に続いてまたは続かないで)細胞に入りアポトーシスを予防または治療するかまたはミトコンドリア保護性の細胞保護効果を提供することが可能なキメラ分子を生ずるペプチド性または非ペプチド性分子に結合された、請求項16による分子。
- 前記配列番号を含む3〜10のアミノ酸の長さを有し、該配列番号はN末端またはC末端において、マーカー(例えば、蛍光発光性(AMC、AFC、PE...)、比色性(pNA...)または生物発光性基質、放射性同位体...)と結合されている、請求項16による分子。
- 治療上の有効量の、請求項1〜21のいずれか1つによる少なくとも1種のカスパーゼ−2阻害剤を医薬的に受け入れ可能な担体と共に含む医薬組成物。
- 有効量の、請求項5〜10のいずれか1つによる少なくとも1種の化合物を含む、請求項22に記載の医薬組成物。
- 有効量の、請求項11〜14のいずれか1つによる少なくとも1種の化合物を含む、請求項22に記載の医薬組成物。
- 有効量の配列番号5を含む、請求項22に記載の医薬組成物。
- 有効量の、請求項17〜20のいずれか1つによる少なくとも1種の分子を含む、請求項22に記載の医薬組成物。
- 細胞死を低減させるための、経口投与、局所(例えば、大脳室内、化合物または医薬組成物により含浸されたゲルホーム(登録商標)の大脳内移植、機械的送達用器械の大脳内移植)または全身(例えば、腹膜組織内、静脈内...)投与用の請求項22〜26のいずれか1つに記載の医薬組成物。
- 低酸素症−虚血(H−I)(低酸素症/低血糖症を伴うまたは伴わない虚血)損傷および卒中様の状態(例えば、大脳、腎臓、心臓の不全)を含む病的状態の治療用の請求項22〜26のいずれか1つに記載の医薬組成物。
- 大脳の低酸素症−虚血(H−I)(低酸素症/低血糖症を伴うまたは伴わない虚血)損傷および卒中様の状態(例えば、大脳、腎臓、心臓の不全)を含む病的状態の治療用の請求項22〜26のいずれか1つに記載の医薬組成物。
- 特に、全身性または病巣性H−I(低酸素症/低血糖症を伴うまたは伴わない虚血)損傷および卒中用の状態(例えば、大脳、腎臓、心臓の不全)におけるニューロン死の治療用の請求項22〜26のいずれか1つに記載の医薬組成物。
- 特に、成人または新生児H−I(低酸素症/低血糖症を伴うまたは伴わない虚血)損傷および卒中様の状態(例えば、大脳、腎臓、心臓の不全)におけるニューロン死の治療用の請求項22〜26のいずれか1つに記載の医薬組成物。
- 特に、成人または新生児H−I(低酸素症/低血糖症を伴うまたは伴わない虚血)損傷および卒中様の状態(例えば、大脳、腎臓、心臓の不全)におけるニューロン死の治療用の請求項22〜26のいずれか1つに記載の医薬組成物。
- 特に、一時的または恒常的H−I(低酸素症/低血糖症を伴うまたは伴わない虚血)損傷および卒中様の状態(例えば、大脳、腎臓、心臓の不全)におけるニューロン死の治療用の請求項22〜26のいずれか1つに記載の医薬組成物。
- 特に、再灌流状態を伴うまたは伴わない、H−I(低酸素症/低血糖症を伴うまたは伴わない虚血)損傷および卒中様状態の脳損傷(例えば、大脳、腎臓、心臓の不全)におけるニューロン死の治療用の請求項22〜26のいずれか1つに記載の医薬組成物。
- 特に、中大脳動脈閉塞症(MCAO)におけるニューロン死の治療用の請求項22〜26のいずれか1つに記載の医薬組成物。
- 特に、以下の少なくとも1つの病理的事象が併発された場合のニューロン死の治療用の請求項22〜26のいずれか1つに記載の医薬組成物:再灌流を伴うまたは伴わない、大脳レベルまたは体全体のレベルでの、全身性または病巣性、一時的または恒常的、成人または新生児のH−I(低酸素症/低血糖症を伴うまたは伴わない虚血)。
- ・慢性変性疾患、例えば、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄延髄萎縮症、プリオン病を含む神経変性疾患の際のアポトーシスを予防および/または治療する、または、
・脊髄損傷の際のアポトーシスを予防および/または治療する、または、外傷性脳損傷の結果として生じるアポトーシスを予防および/または治療する、または、
・ニューロン保護効果を提供する、または、
・脳保護効果を提供する、または、
・自己免疫疾患および移植拒絶反応に伴う、細胞毒性T細胞およびナチュラルキラー細胞が介在するアポトーシスを予防および/または治療する、または、
・心不全、心筋症、心臓のウイルス感染または細菌感染、心筋虚血、心筋梗塞および心筋虚血、冠動脈バイパス移植を含む心臓細胞の細胞死を予防する、または、
・例えば化学療法またはHIV治療の結果としてのミトコンドリアの薬物毒性を予防および/または治療する、または、
・ウイルス感染または細菌感染の際の細胞死を予防する、または、
・炎症または炎症性疾患、炎症性腸疾患、敗血症および敗血症性ショックを予防および/または治療する、または、
・卵胞から卵母細胞への段階、卵母細胞から成熟卵への段階および精子の細胞死を予防する(例えば、卵巣組織、人口受精卵を凍結させおよび移植する方法)、または、
・化学療法後の女性および男性の受精能力を保護する、または、
・雌および雄の動物の受精能力を保護する、または、
・黄班変性および緑内障を予防および/または治療する、または、急性肝炎、慢性活動性肝炎、B型肝炎およびC型肝炎を予防および/または治療する、または、
・男性型禿頭、放射線、化学療法または環境上のストレスに起因する髪の喪失を予防する、または、
・(高レベルの放射線への露出、熱、火傷、化学薬品、太陽および自己免疫疾患に起因する)皮膚損傷を治療または改善する、または、
・脊髄形成異常症候群(MDS)における骨髄細胞の細胞死を予防する、または、
・膵臓炎を治療する、または、
・呼吸器系症候群を治療する、または、
・骨関節炎、変形関節炎、乾癬、糸球体腎炎、アテローム性動脈硬化症、移植片対被移植体の疾患を治療する、または、
・網膜周皮細胞のアポトーシス、網膜ニューロンアポトーシス緑内障、虚血の結果として生じる網膜損傷、糖尿病性網膜症を治療する、または、
・アポトーシスの増加と関係する疾病状態を治療する、または、
・植物(例えば、草木、草花、葉状植物(キノコ、海草)...)の細胞死を予防する
ための請求項22〜26のいずれか1つに記載の医薬組成物。 - 細胞死を阻止または予防する、または、細胞死、特にアポトーシスに対して治療のためにインビトロで分子をスクリーニングする工程を包含する方法。
- 細胞死を予防する方法であって、
所与の誘導様式に応じて、所与の細胞タイプにおいて、アポトーシスが関連する事象の階層性を決定する工程と、
より基部に近い可逆的なチェックポイントを阻止してアポトーシス過程に干渉する工程と
を包含する方法。 - ニューロンにおいて迅速な定量的フローサイトメトリーおよび定量的/定性的蛍光顕微鏡法分析を組み合わせる工程を包含する、請求項39に記載の方法。
- 非ニューロン細胞において迅速な定量的フローサイトメトリーおよび定量的/定性的蛍光顕微鏡法分析を組み合わせる工程を包含する、請求項39に記載の方法。
- ニューロン細胞系において迅速な定量的フローサイトメトリーおよび定量的/定性的蛍光顕微鏡法分析を組み合わせる工程を包含する、請求項39に記載の方法。
- 前記チェックポイントはカスパーゼ−2である、請求項39または42に記載の方法。
- 前記チェックポイントはカスパーゼである、請求項39または42に記載の方法。
- 前記チェックポイントは関連のないカスパーゼ活性化である、請求項39または42に記載の方法。
- MPTP処理を含む毒性傷害または保護処理に応答した、ΔΨmおよび形質膜の完全性の信頼性のある実時間フローサイトメトリーによるモニタリングを生じさせるための請求項39〜42のいずれか1つの方法の使用。
- MPTP処理を含むニューロン毒性傷害またはニューロン保護処理に応答した、ΔΨmおよび形質膜の完全性の信頼性のある実時間フローサイトメトリーによるモニタリングを生じさせるための、請求項39〜42のいずれか1つに記載の方法の使用。
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