CN112569339B

CN112569339B - Caspase-2抑制剂在制备抗辐射药中的应用

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Publication number: CN112569339B
Application number: CN202011461448.5A
Authority: CN
Inventors: 陈秋; 崔凤梅; 闫红彬
Original assignee: Suzhou University
Current assignee: Suzhou University
Priority date: 2020-12-08
Filing date: 2020-12-08
Publication date: 2023-07-21
Anticipated expiration: 2040-12-08
Also published as: CN112569339A

Abstract

本发明涉及Caspase‑2抑制剂在制备抗辐射药中的应用，属于医药技术领域。本发明提供了Caspase‑2抑制剂在制备抗辐射药中的应用，研究发现，经11Gy辐照5天后，小鼠的死亡率高达100％，而辐照前腹腔注射Caspase‑2抑制剂Z‑VDVAD‑FMK的小鼠经11Gy辐照5天后，存活率仍达66.67％，经11Gy辐照6天后，存活率仍达33.33％，可见，Caspase‑2抑制剂可显著降低经辐照后的小鼠的死亡率，具有良好的抗辐射作用。

Description

Caspase-2抑制剂在制备抗辐射药中的应用

技术领域

本发明涉及Caspase-2抑制剂在制备抗辐射药中的应用，属于化学技术领域。

背景技术

电离辐射的广泛应用，使人类获益的同时，也带来许多风险。尤其在核能运用上体现得极其明显，远有切尔诺贝利核事故，近有福岛核电站事故，这些核泄漏事故给人类社会带来了深重的灾难。

接受一定剂量的电离辐射会导致放射病，短时间内接受10-50Gy的电离辐射会引起急性胃肠道综合征，由肠黏膜干细胞死亡引起，会迅速出现恶心、呕吐和腹泻，约一周的潜伏期后再反复出现胃肠道症状、败血症、电解质失衡，最终导致死亡。肠道损伤的辐射防护一直是放射生物学领域的研究热点和难点之一。

Caspase-2蛋白是Caspase家族蛋白中较早发现的，也是最保守的成员之一，它同时具有启动和效应两种功能。它定位在细胞核、细胞质和高尔基体，凋亡信号会诱导Caspase-2从细胞核转移到核外，在细胞质被激活，发挥相应的功能。

Caspase-2抑制剂(Z-VDVAD-FMK)是可抑制Caspase-2蛋白活性的一种药物，研究表明，它具有治疗脂肪肝的作用。

目前，关于Caspase-2抑制剂在制备抗辐射药中的应用尚无报道。

发明内容

因此，本发明的目的在于提供了Caspase-2抑制剂的新用途，即提供了Caspase-2抑制剂在制备抗辐射药中的应用。

为解决上述问题，本发明还提供了Caspase-2抑制剂在制备抗辐射药中的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述Caspase-2抑制剂为Z-VDVAD-FMK。

在本发明的一种实施方式中，所述辐射为电离辐射。

在本发明的一种实施方式中，所述电离辐射包括射线和来自放射性物质的辐射。

在本发明的一种实施方式中，所述射线包括X射线、α射线、β射线、γ射线、中子射线、负π介子射线或重离子射线。

在本发明的一种实施方式中，所述重离子射线包括氦离子射线、碳离子射线、氮离子射线、氧离子射线或氖离子射线。

在本发明的一种实施方式中，所述药物含有Caspase-2抑制剂、药物载体和/或药用辅料。

在本发明的一种实施方式中，所述药物载体包含微囊、微球、纳米粒和/或脂质体。

在本发明的一种实施方式中，所述药用辅料包含溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂和/或释放阻滞剂。

在本发明的一种实施方式中，所述药物的剂型为散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、乳剂、混悬剂或注射剂。

本发明技术方案，具有如下优点：

本发明提供了Caspase-2抑制剂在制备抗辐射药中的应用，研究发现，经11Gy辐照5天后，小鼠的死亡率高达100％，而辐照前腹腔注射Caspase-2抑制剂Z-VDVAD-FMK的小鼠经11Gy辐照5天后，存活率仍达66.67％，经11Gy辐照6天后，存活率仍达33.33％，可见，Caspase-2抑制剂可显著降低经辐照后的小鼠的死亡率，具有良好的抗辐射作用。

附图说明

图1-6：肠型放射病剂量辐照不同死亡相关基因敲除小鼠的生存曲线。

图7-8：分别表达GSDM家族蛋白GASMA、GSDMB、GSDMC、GSDMD、GSDME、DFNB59的HCT116细胞在辐照条件下的Western Blot结果。

图9-12：分别表达GSDM家族蛋白GASMA、GSDMB、GSDMC、GSDMD、GSDME、DFNB59的293T细胞在辐照条件下的Western Blot结果。

图13-18：分别表达Caspase家族蛋白Caspase-1、Caspase-2、Caspase-3、Caspase-4、Caspase-5、Caspase-6的HeLa细胞在辐照条件下的Western Blot结果。

图19：不同组致死剂量辐照小鼠肠道Caspase-2蛋白的Western Blot结果。

图20：C57和Caspase-2^-/-小鼠全身辐照7Gy的生存曲线。

图21：C57和Caspase-2^-/-小鼠全身辐照11Gy的生存曲线。

图22：C57和Caspase-2^-/-小鼠腹部照射20Gy的生存曲线。

图23：C57BL/6小鼠全身辐照11Gy，辐照6h的小肠病理。

图24：Caspase-2^-/-小鼠全身辐照11Gy，辐照6h的小肠病理。

图25：C57BL/6和Caspase-2^-/-小鼠全身辐照11Gy，辐照6h的小肠绒毛长度。

图26：C57BL/6小鼠全身辐照11Gy，辐照6h的小肠TUNEL。

图27：Caspase-2^-/-小鼠全身辐照11Gy，辐照6h的小肠TUNEL。

图28：C57BL/6和Caspase-2^-/-小鼠全身辐照11Gy，辐照6h的小肠隐窝TUNEL阳性率。

图29：不同组肠型放射病剂量辐照小鼠的生存曲线。

具体实施方式

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。

下述实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。

实验例1：放射性肠道损伤靶点的初步确认

1.1实验材料

1.1.1实验动物

4-6周龄C57BL/6雄性小鼠，SPF级，购买于南京大学模式动物研究所。Caspase-1(11)^-/-、Caspase-3^-/-、Caspase-8^-/-RIPK1/3^-/-雄性小鼠源于北京大学，Caspase-1(11)^-/-雄性小鼠为由C57BL/6雄性小鼠敲除编码Caspase-1和Caspase-11蛋白的基因所得，Caspase-3^-/-雄性小鼠为由C57BL/6雄性小鼠敲除编码Caspase-3蛋白的基因所得，Caspase-8^-/-RIPK1/3^-/-雄性小鼠为由C57BL/6雄性小鼠敲除编码Caspase-8、RIPK1和RIPK3蛋白的基因所得。Lgr5-EGFP-ires-CreERT2(Lgr5-GFP)小鼠购于美国Jackson Laboratory。所有的小鼠均饲养于苏州大学动物管理中心SPF级动物房内。所有进入动物房的饮用水、小鼠常规饲料、垫料以及各种实验用品均经过高温高压或者辐照灭菌处理，经过严格的微生物控制，严格遵守SPF级动物房的规章管理制度。

1.1.2主要试剂及耗材

1)细胞株HCT116、293T、Hela：中科院细胞所

2)GASMA、GSDMB、GSDMC、GSDMD、GSDME、DFNB59、Caspase-1～Caspase-6的重组质粒：北京大学(GASMA、GSDMB、GSDMC、GSDMD、GSDME、DFNB59、Caspase-1～Caspase-6的重组质粒分别以质粒pcDNA3.1为载体表达编码GASMA、GSDMB、GSDMC、GSDMD、GSDME、DFNB59、Caspase-1～Caspase-6蛋白的基因)

3)E.coli DH5αCompetent Cells：宝日医生物技术有限公司

4)转染试剂ViaFect^TMTransfection Reagent：普洛麦格生物技术有限公司

5)大型/大量质粒抽提试剂盒、ECL底物化学发光检测试剂盒、总蛋白提取试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒：北京艾德莱生物科技有限公司

6)异丙醇、无水乙醇、甲醇：国药集团化学试剂有限公司

7)PVDF膜：Millipore公司

8)30％Acr-Bis：biosharp公司

9)TEMED：生工生物工程有限公司

10)BSA：南京生兴生物技术有限公司

11)脱脂奶粉：Bio-Rad公司

12)Tween-20、1.5M Tris-HCl、10％SDS、1MTris-HCl：上海杰美基因医药有限公司

13)3-MA、NEC-1：Sigma公司

14)Z-VAD-FMK、VX765：Selleck公司

15)抗体：mcherry(GTX128508)：美国GeneTeX公司；GFP(ab13970)、HA(ab137838)、His(ab9108)、Caspase2L(ab179519)：美国abcam公司；Flag(F3165)：美国Sigma-Aldrich公司；Beta-tublin(#15115)：cell signaling technology公司

1.1.3主要仪器

1)生物学X线辐照仪(X-RAD320ix)：PXi公司

2)电动组织研磨器：IKA集团

3)NanoDrop 2000c：Thermo Fisher Scientific公司

4)Synergy 2多功能酶标仪：Bio Tek仪器有限公司

5)低温离心机(5417R)、高速离心机(5804R)：Eppendorf公司

6)细胞培养用倒置显微镜：Olympus公司

7)垂直板电泳槽、电转槽、电泳仪：BioRad公司

8)TS-1型摇床：海门其林贝尔仪器制造公司

9)FluorChem M多色荧光化学发光成像分析系统：Alpha Technologies公司

1.1.4主要配置溶液

1)2×SDS loading buffer：分别称取4g SDS，1.51425g Tris-base，DTT1.5425g，20mL甘油，20mg溴酚蓝(调PH后加)，加入ddH₂O溶解并定容至100mL，调PH至6.8；

2)10％过硫酸铵：称取过硫酸铵0.05g，加入ddH₂O 0.5mL；

3)电泳缓冲液：分别称取甘氨酸94g、Tris-base 15.1g、SDS 5g，加入ddH₂O定容至1L。使用前用ddH₂O稀释5倍；

4)转膜液：电泳缓冲液160mL、甲醇160mL，加入ddH₂O至800mL，室温保存；

5)封闭液：称取脱脂奶粉1g，加入TBST液20mL，充分混匀；

6)抗体稀释液：称取BSA 1g，加入20mL TBST液，混匀后备用；

7)10×TBS溶液：分别称取NaCl 88g、Tris-base 24.22g，加入900mL ddH₂O，待完全溶解，PH值调至8.0，加ddH₂O定容至1L；使用前用ddH₂O稀释10倍，加入0.1％(v/v)的Tween-20，即TBST溶液。

1.2实验方法

1.2.1致死剂量下验证小鼠生存率实验

将小鼠拿到医学部生物学X线辐照仪进行辐照，全身辐照10Gy(辐照致死剂量分为骨髓型放射病剂量1-9Gy和肠型放射病剂量10-50Gy)，剂量率1.5Gy/min，辐照前腹腔注射不同药物，辐照后继续饲养于动物中心暂存室。记录生存曲线。

1.2.2 GSDM家族蛋白辐照后在细胞中的表达及剪切情况

1.2.2.1 GSDM家族蛋白重组质粒转化DH5α感受态大肠杆菌

1)E.coli DH5αCompetent Cells使用前在冰上融化。

2)轻轻混匀，将100μL感受态细胞沿管壁轻轻加入装入1.5mL EP管。

3)将构建好的重组质粒(一般为10ng)加入感受态细胞中，轻轻摇匀。

4)将EP管放在冰上静置约30min。

5)从冰上取出放入42℃水浴锅中水浴约45s。

6)立即取出放在冰上约1-2min。

7)将预先在37℃保温的SOC培养基加入EP管。

8)37℃恒温箱中，200rpm/min振荡培养约60min。

9)吸取200μL菌液加到含有氨苄的LB固体培养基上，用涂布棒使菌液均匀分布在培养基上。

10)放在37℃恒温箱中过夜培养，一般不超过14h。

1.2.2.2筛选目标菌落

1)将LB培养基从培养箱中取出，挑选培养基上的单克隆菌落，加入5mL LB液体培养基中(含有100μg/mL氨苄霉素)，置于37℃恒温摇床中振荡培养，不超过12h。

2)取1mL振荡培养后的菌液加入50mL含有氨苄霉素的LB液体培养基中，置于37℃摇床中继续振荡培养12h。

1.2.2.3抽提质粒

1)将过夜培养的菌液全部加入离心管中，4℃，10000g离心2min，保留沉淀，将上清完全弃除。

2)加入5mL溶液P1，充分混悬震荡，使沉淀完全分散开。然后将细菌悬液移入新的50mL离心管，室温条件下静置约5min。

3)然后加入5mL溶液P2，轻轻颠倒离心管8次，室温放置不能超过5min，待细菌完全裂解，溶液变透明即可进行下一步。

4)再加入5mL溶液PIII，立即将混合溶液充分混匀，直到产生白色絮状物，于4℃，16000g离心5min，将上清移到一个新的50mL离心管中。

5)向离心管中加10mL异丙醇，充分混匀溶液。

6)于4℃，16000g离心10min，弃去上清，沥干管壁上的残余液体，加入5mL70％乙醇进行漂洗，于4℃，16000g离心5min，将上清弃去，直至沉淀晾干。

7)向离心管中加入1.4mL溶液P1溶解沉淀，注意将侧壁及管底的质粒沉淀涮洗下来。然后将溶解后质粒溶液一分为二，移到2个新的1.5mL离心管中，每个约为700μL。

8)每个EP管中加入55μL杂质清除液A，充分混匀后分别加入80μL预冷的内毒素清除剂，再次充分混匀，冰上放置大于5min。

9)将EP管放在42℃水浴中，溶液变浑浊后颠倒混匀，再继续水浴5min。

10)于20℃以上，14000g离心5min，将上层水相转移到新的1.5mLEP管中。

11)向EP管中加入等体积的杂质清除液B，轻柔混匀，于4℃，14000g离心10min，弃去上清，加入70％乙醇洗涤沉淀，于4℃，16000g离心5min，弃上清，共洗涤两次，倒置晾干。

12)每个EP管加100μL无菌的纯水溶解沉淀，可在37℃水浴中助溶，待完全溶解后测量质粒浓度并记录，保存在-20℃备用。

1.2.2.4HCT116和293T细胞的培养和处理

1)培养：HCT116和293T细胞分别用含10％(v/v)BI胎牛血清的5A和DMEM培养基培养，培养在37℃、5％CO2的培养箱中。

2)传代：观察细胞的生长状态，当汇合度达到80-90％时，进行传代。将培养皿内原培养基弃掉，加入1mL DPBS清洗1-2次并弃掉，加入1mL 0.25％(m/m)胰蛋白酶，根据细胞的贴壁性的不同，将培养皿放回培养箱内孵育一段时间，显微镜下观察细胞形态变圆时，中止消化，可根据情况按照1:3或者1:4传代培养。

3)计数：细胞充分混匀后用细胞培养基稀释十倍，加10μL混悬液到计数板的凹槽中，显微镜下计数。

1.2.2.5细胞转染

1)转染前一天，计数16×10⁵个HeLa细胞加入至一个60mm细胞培养皿中。

2)当细胞密度达到80％左右时，准备转染，ViaFect^TMTransfection Reagent上下颠倒混匀，放置至室温。

3)每个转染体系准备一个无菌离心管，加入800μL不含血清的DMEM高糖培养基。

4)加入质粒DNA 10μg，充分混匀。

5)按照1:2比例加入ViaFect^TMTransfection Reagent 20μL，然后用不含血清的DMEM高糖培养基补足1mL，立即混匀，室温下静置15min。

6)将ViaFect^TMTransfection Reagent-DNA混合物均匀加入待转染的细胞中，培养箱中继续培养。最迟在转染24h后进行换液，然后进行后续试验。

1.2.2.6细胞辐照及蛋白提取

1)视情况给予转染后的细胞换液，每组留一皿细胞作为对照，将转染48h的细胞给予X射线辐照10Gy，辐照结束后再放入细胞培养箱继续培养。

2)按照辐照后2h、6h、12h、24h提取蛋白，具体步骤如下：

①2×SDS-PAGE loading buffer加入终浓度1mM的苯甲基磺酰氟(PMSF)，冰上保存备用。

②弃去培养基，预冷的DPBS清洗两次。

③加入300μL的2×SDS-PAGE loading buffer，将培养皿放置在冰上裂解30min。

④刮下细胞，用移液器转移到1.5mL EP管中。

⑤将EP管煮沸10min至蛋白质变性，取出备用。

1.2.2.7 Western Blot检测GSDM家族蛋白表达及剪切情况

1.2.2.7.1 SDS-PAGE蛋白电泳

1)将玻璃板用ddH2O冲洗干净，烘箱中烘干后取出备用。

2)配置10％分离胶

3)将适量配置好的分离胶加入组装好的玻璃板空隙中，加适量去离子水封顶，静置约30min。

4)当可以看到明显的分层线后，将上层去离子水倒掉，并用滤纸小心地将水吸干。

5)配置5％浓缩胶

6)将浓缩胶缓慢加入分离胶上部，加满之后，缓慢将梳子插入。

7)静置待浓缩胶聚合，将梳子小心拔出，将玻璃板组装好，置于电泳内槽，加入适量电泳缓冲液，液体没过加样孔。

8)取适量Marker和样品依次加入孔中，未加样的孔中加入loading buffer防止弥散。

9)打开电源，采用稳压80V，待marker进入分离胶分层后调节至120V直至电泳结束，约1.5h。

1.2.2.7.2转膜

1)剪取适当大小的PVDF膜放在甲醇中浸泡1-2min，将滤纸及海绵垫放入转膜液中充分浸泡，将SDS-PAGE胶的分层胶取下。

2)将转膜的塑料夹展开，在黑色板面上依次放置海绵、滤纸、SDS-PAGE胶、PVDF膜、滤纸和海绵，放置过程中避免气泡，将塑料夹装好，按规定方式放入电转槽中。

3)向电转槽中放入冰袋，并加满转膜液，正确连接电极。

4)打开电源，采取恒流300mA，在冰浴条件下转膜80min。

1.2.2.7.3封闭及抗原抗体反应

1)取出PVDF膜，加入适量的封闭液，放在摇床上室温封闭90min。

2)封闭结束后，将PVDF膜放到TBST溶液中，摇床上洗膜10min，重复洗膜三次。

3)用抗体稀释液按比例稀释一抗，GFP(1:1000)、cherry(1:1000)、HA(1:1000)，按照Marker对应的分子量剪切PVDF膜，并分开放入封膜袋中，加入适量的一抗溶液，4℃孵育过夜。

4)第二天将孵过一抗的PVDF膜放入TBST溶液中，洗膜10min×3次。

5)将PVDF膜放入新的封膜袋中，加入适量的稀释过的二抗溶液，摇床上孵育60min。

6)将膜放入TBST溶液中，摇床上洗膜三次，每次10min。

1.2.2.7.4显影

1)将ECL发光试剂盒中的A、B两种液体等体积均匀混合，配成工作液。

2)取适量均匀滴加在PVDF膜上。

3)放入多色荧光化学发光成像分析系统中显影。

1.2.3 Caspase家族蛋白辐照后在细胞中的表达及剪切情况

1.2.3.1 Caspase家族蛋白重组质粒转化DH5α感受态大肠杆菌(同前)

1.2.3.2筛选单克隆(同前)

1.2.3.3抽取质粒(同前)

1.2.3.4 HeLa细胞的培养和处理(同前)

1.2.3.5细胞转染(同前)

1.2.3.6辐照细胞及蛋白提取(同前)

1.2.3.7 Western Blot检测Caspase家族蛋白表达及剪切情况(同前)

1.2.4小鼠辐照后肠道Caspase-2表达变化

1.2.4.1小鼠辐照

将C57BL/6小鼠拿到医学部生物学X线辐照仪进行辐照，全身辐照11Gy，剂量率1.5Gy/min，辐照后继续饲养于动物中心暂存室。

1.2.4.2小鼠肠道蛋白提取

1)小鼠脱颈处死后，打开腹腔，取出小肠，置于预冷的PBS缓冲液中，尽可能去掉肠系膜和脂肪组织，纵向剖开将肠内容物冲洗干净。

2)将小肠组织剪成小块后放入预冷干净的1.5mL EP管中，每100mg样本加入500μL裂解液(含有1mM的PMSF)，使用匀浆机将小肠组织打碎至无明显肉眼可见固体。

3)于4℃，16000g离心5min。

4)将上清分装到新的1.5mLEP管中，-80℃保存备用。

1.2.4.3 BCA蛋白定量

1)用同一蛋白裂解液将提取的肠道蛋白样品稀释10倍。

2)用该裂解液将蛋白标准品按一定浓度梯度稀释。

3)将稀释好的标准品和肠道蛋白样品各取10μL依次加入到到96孔板中，每个样品设置3个平行孔。

4)按照溶液A:B＝50:1(v/v)，配制BCA工作液，混合均匀。

5)每孔加入200μL BCA工作液，96孔板在振荡器混匀后于37℃孵育30min。

6)在多功能酶标仪上测定其在562nm波长下的吸光值，根据标准曲线公式计算出各个样品的蛋白浓度，最后乘以10即为该样品的真实浓度。

1.2.4.4 Western Blot检测肠道Caspase-2的表达及剪切情况(同前)

1.2.5统计学处理

使用GraphPad Prism软件进行存活分析，并根据对数秩检验进行统计分析。当P<0.05时，认为具有有统计学差异。

1.3实验结果

1.3.1致死剂量辐照小鼠的生存率结果

将4-6周C57BL/6雄性小鼠作为对照组，给予致死剂量辐射后观察生存时间。图1是Caspase-1/-11双敲小鼠给予全身辐照10Gy的生存曲线，与对照组相比，没有统计学意义。图2是Caspase3^-/-小鼠给予全身辐照10Gy小鼠的生存曲线，与对照相比，也没有统计学意义。图3是Caspase-8^-/-RIPK1/3^-/-小鼠给予全身辐照10Gy小鼠的生存曲线，与对照相比，Caspase-8^-/-RIPK1/3^-/-公鼠死亡更早，母鼠也没有统计学意义。图4-5是分别给予11Gy和13Gy的全身辐照的生存曲线，实验组辐照前半小时腹部注射Mix，Mix包括凋亡抑制剂Z-VAD-FMK(80μg/只)，自噬抑制剂3-MA(200μg/只)，坏死抑制剂NEC-1(33μg/只)，焦亡抑制剂VX765(50mg/kg)，可以看出，给予四种死亡类型的抑制剂后，并没有改善其生存率。图6是全身辐照11Gy的生存曲线，实验组辐照前半小时腹腔注射铁死亡抑制剂Liproxstatin-1(10mg/kg)，与对照相比，生存时间没有统计学意义。

1.3.2辐照条件下GSDM家族蛋白在HCT116细胞高表达后的表达及变化结果

将GSDM家族六种蛋白的重组质粒分别在HCT116细胞中高表达，转染48h后给予细胞辐照10Gy，按照辐照后2h、6h、12h、24h和对照(不予辐照)分别收集细胞蛋白，做WesternBlot结果如图7-8所示：图7是GSDMA蛋白高表达后的结果，它带有mCherry标签蛋白，与对照(control)相比，IR2h、6h、12h、24h均没有剪切激活的出现；图8是DFNB59蛋白高表达后的结果，与control相比，IR2h、6h、12h、24h同样也没有剪切激活的出现；GSDMB、GSDMC、GSDMD、GSDME由于转染效果欠佳，导致实验失败，故没有将结果展示。

1.3.3辐照条件下GSDM家族蛋白在293T细胞高表达后的表达及变化结果

由于HCT116细胞转染效率低下，故换用293T细胞进行实验。同样，将GSDM家族六种蛋白的重组质粒分别在293T细胞中高表达，转染48h后辐照10Gy，按照辐照后2h、6h、12h、24h和对照分别收集细胞蛋白，Western Blot结果如图9-12所示：图9是GSDMA蛋白高表达后的结果，带有mCherry标签蛋白，与HCT116结果一致，IR2h、6h、12h、24h与control相比均没有剪切激活的出现；图10是GSDMD蛋白的高表达结果，它带有GFP标签蛋白，辐照后与对照相比同样没有出现剪切激活；图11是GSDME蛋白高表达的结果，它也带有GFP标签蛋白，没有出现激活态。图12是DFNB59蛋白高表达后的结果，与HCT116结果一致。GSDMB和GSDMC结果失败，不再展示。

1.3.4辐照条件下Caspase家族蛋白在HeLa细胞高表达后的表达及变化结果

将Caspase家族蛋白中的Caspase-1、Caspase-2、Caspase-3、Caspase-4、Caspase-5、Caspase-6的重组蛋白分别在HeLa细胞中高表达，转染48h后辐照10Gy，按照辐照后3h、6h、12h和对照分别收集细胞蛋白，Western Blot结果如图13-18所示：图13是Caspase-1在HeLa细胞中高表达后结果，它带有Flag标签蛋白，与对照(control)相比，IR6h下方出现剪切的条带，表示Caspase-1在辐照6h后出现激活的情况；图14是Caspase-2在HeLa细胞高表达的结果，它的标签蛋白是Flag，Caspase-2在无辐照状态下就出现剪切的条带，随着辐照时间的延长，剪切的条带无明显增加趋势，而Caspase-2酶原呈现递减的趋势；图15是Caspase-3在HeLa细胞高表达的结果，它的标签蛋白也是Flag，对照组与辐照组均没有剪切激活；图16和图17分别是Caspase-4和Caspase-5在HeLa细胞中高表达后结果，它们的标签蛋白是HA，不论对照还是辐照，也没有发现剪切激活；图18是Caspase-6在HeLa细胞中高表达后结果，它的标签蛋白是His，对照和辐照组均没有剪切激活。

1.3.5 C57小鼠肠道Caspase-2表达结果

将C57雄性小鼠分为对照组和辐照组，辐照组给予全身辐照11Gy，在辐照后3h、6h提取肠道蛋白，每组取3只做平行样本，做Western blot结果如图19所示，IR3h Caspase-2已被激活，出现cleaved Caspase-2条带，IR6h cleaved Caspase-2条带消失。

综合1.3.1-1.3.5的结果，辐照后，Caspase-2激活最早，3小时时已经发现剪切条带，而Caspase 1要到6小时活化，Caspase-3、Caspase-4、Caspase-5、Caspase-6在照射后12小时内未见激活。

综上，GSDM家族蛋白GASMA、GSDMB、GSDMC、GSDMD、GSDME、DFNB59，以及，Caspase家族蛋白Caspase-1、Caspase-3、Caspase-4、Caspase-5、Caspase-6、Caspase-8、RIPK1/3并非放射性肠道损伤靶点，Caspase家族蛋白Caspase-2可能是放射性肠道损伤靶点。

实施例2：放射性肠道损伤靶点的进一步确认

2.1实验材料

2.1.1实验动物

6-8周龄C57BL/6雄性小鼠，SPF级，购买于南京大学模式动物研究，Caspase-2^-/-雄性小鼠源于北京大学，Caspase-2^-/-雄性小鼠为由C57BL/6雄性小鼠敲除编码Caspase-2蛋白的基因(NCBI Reference Sequence:NM_007610.2)所得。

2.1.2主要试剂及耗材

1)苏木素、伊红：苏州大学实验材料采购系统

2)二甲苯、多聚甲醛、无水乙醇：国药集团化学试剂有限公司

3)TUNEL细胞凋亡检测试剂盒-POD：博士德生物公司

2.1.3主要仪器设备

1)SL18型医用直线加速器：Berkshire公司

2)多功能酶标仪：BioTek公司

3)切片机：Leica公司

2.1.4主要配置溶液

1)4％多聚甲醛：称取40g多聚甲醛，加入800mL去离子水，搅拌加热至65℃，加入10XPBS 100mL，调节PH＝7.3后定容至1000mL，4℃保存。

2)0.01M TBS：称取8.5gNacl,1.2gTris加入1LddH2O，用纯乙酸调pH＝7.5。

2.2实验方法

2.2.1小鼠生存率实验

1)将6-8周龄C57BL/6和Caspase-2^-/-雄性小鼠分别拿到苏州市九龙医院，采用SL18型直线加速器进行全身辐照7Gy，剂量率2Gy/min，辐照后继续饲养于动物中心暂存室，记录生存时间，绘制生存曲线。

2)将6-8周龄C57BL/6和Caspase-2^-/-雄性小鼠分别拿到苏州市九龙医院，采用SL18型直线加速器进行全身辐照11Gy，剂量率2Gy/min，辐照后继续饲养于动物中心暂存室，记录生存时间，绘制生存曲线。

3)将6-8周龄C57BL/6和Caspase-2^-/-雄性小鼠分别拿到苏州市九龙医院，采用SL18型直线加速器进行腹部辐照20Gy，剂量率2Gy/min，辐照后继续饲养于动物中心暂存室，记录生存时间，绘制生存曲线。

2.2.2小鼠十二指肠HE染色

1)取材与固定：小鼠脱颈处死后，取出十二指肠放入预冷的PBS缓冲液中，用1mL注射器将肠管冲洗干净，固定于4％多聚甲醛中16-24小时。

2)脱水与透明：将固定好的组织取出，剪切成合适大小的肠管，转移至包埋盒，按照以下程序进行脱水：55℃恒温水浴锅中90％乙醇Ⅰ(20min)→90％乙醇Ⅱ(20min)→无水乙醇Ⅰ(20min)→无水乙醇Ⅱ(20min)→二甲苯(20min)。

3)浸蜡与包埋：继续放入蜡缸中浸泡1h后，将十二指肠肠管竖立放置于盛有液蜡的包埋槽，置于冷冻机台面上，待自然凝固后将蜡块取出。

4)切片：使用切片机进行切片，石蜡切片厚度为4μm，每个蜡块可多切几片。

5)捞片与烘干：载玻片吸附蜡片后放入60℃水浴箱展片后贴于载玻片中，置于80℃烘箱中40min后取出，可直接进行HE染色，多余的置于玻片盒备用。

6)HE染色：80℃烘箱中40min→二甲苯Ⅰ(5min)→二甲苯Ⅱ(5min)→二甲苯Ⅲ(5min)→无水乙醇(1min)→95％乙醇(1min)→80％乙醇(1min)→75％乙醇(1min)→蒸馏水2min→苏木素染色5min→流水中冲至水无色→伊红染色30s→95％乙醇(1min)→95％乙醇(1min)→无水乙醇(1min)→无水乙醇(1min)→无水乙醇(1min)，待切片晾干后，使用中性树胶封片，注意避免气泡。

2.2.3小鼠十二指肠TUNEL检测

1)将切片置于80℃烘箱中40min融蜡。

2)将片子依次浸入二甲苯Ⅰ→二甲苯Ⅱ→二甲苯Ⅲ，各5min。

3)将片子依次浸入100％乙醇→95％乙醇→90％乙醇→85％乙醇，各5min。

4)将片子依次浸入蒸馏水Ⅰ→蒸馏水Ⅱ，各5min。

5)用吸水纸将组织块周围的水分吸掉，用阻水笔在组织周围画合适大小的圈达到阻水的目的。

6)将3％双氧水滴加入阻水圈内，将组织完全覆盖，室温、避光反应10分钟，用蒸馏水洗涤2min×3次。

7)将Proteinase K按照1:200(v/v)用0.01M TBS稀释，每片加入100μL，放置在37℃恒温箱消化8分钟，用预先配置好的0.01M TBS洗涤3次，每次2min。

8)配置标记液，将TdT和DIG-d-UTP各1μL加入到18μL标记缓冲液中，充分混匀；每片滴加20μL标记液，将片子放入湿盒中，将湿盒放在37℃温箱中标记2h。

9)标记结束后，用0.01M TBS洗片子，2min×3次。

10)每片加50μL封闭液，室温条件下封闭30min，将封闭液甩掉，不用清洗。

11)用抗体稀释液按照1:100将生物素化抗地高辛抗体稀释，充分混匀后，每片滴加50μL稀释的地高辛抗体，将样品放在湿盒中，37℃恒温箱反应30min。

12)0.01M TBS清洗，2min×3次。

13)用抗体稀释液按照1:100(v/v)的比例稀释SABC，充分混匀后50μL/片，置于37℃恒温箱中反应30min。

14)0.01M TBS洗片子4次，每次5min。

15)DAB显色，镜下观察，变为褐色时及时终止显色。

16)复染：将片子放入苏木素染色30s，用流动的自来水冲洗5min，55℃水浴复蓝1min。

17)脱水：85％乙醇→90％乙醇→95％乙醇→100％乙醇各5min。

18)自然晾干后，中性树胶封片。

2.2.4统计学处理(同第一部分)

2.3实验结果

2.3.1 C57BL/6和Caspase-2^-/-雄性小鼠全身辐照7Gy、11Gy以及腹部照射20Gy的生存率结果

如图20所示，C57BL/6和Caspase-2^-/-小鼠接受全身辐照7Gy后，16天内全部死亡，生存时间没有统计学差异。图21所示，C57BL/6和Caspase-2^-/-小鼠接受全身辐照11Gy后，10天内全部死亡，Caspase-2^-/-小鼠最后死亡，其生存时间相对于C57BL/6小鼠来说，具有显著统计学差异(***代表P值＜0.001)。也就是说将Caspase-2敲除后，可以延长全身辐照11Gy小鼠的生存时间。如图22所示，C57BL/6小鼠腹部辐照后9天内全部死亡，而Caspase-2^-/-小鼠30天内仍存活，并且具有显著的统计学差异(***代表P＜0.001)。

2.3.2 C57BL/6和Caspase-2^-/-雄性小鼠全身辐照11Gy，辐照6h的小肠病理结果

如图23-25所示，C57BL/6和Caspase-2^-/-小鼠相比，辐照6h后隐窝细胞无明显变化，而小肠绒毛的长度变短，且具有统计学意义(**代表P＜0.01)。

2.3.3 C57BL/6和Caspase-2^-/-雄性小鼠全身辐照11Gy，辐照6h的小肠TUNEL结果

如图26-28所示，Caspase-2^-/-小鼠的隐窝TUNEL阳性明显少于C57BL/6小鼠，且具有显著的统计学意义(***代表P＜0.001)。

综合2.3.1-2.3.3的结果，为了探究Caspase-2在电离辐射中发挥的作用，使用基因敲除小鼠做了生存率的实验，对于全身辐照7Gy这一实验条件，C57BL/6和Caspase-2^-/-在辐照后16d全部死亡，且没有统计学意义；对于全身辐照11Gy来说，与C57BL/6小鼠相比，Caspase-2^-/-小鼠能够延长生存时间，并具有明显的统计学意义，说明Caspase-2的作用机制在骨髓与肠道之间存在差异；而对于腹部辐照20Gy，C57小鼠9d全部死亡，Caspase-2^-/-小鼠可以存活30d以上，具有显著的统计学差异，这说明Caspase-2的辐射损伤作用部位主要在肠道，C

如图23-28所示，Caspase-2在辐照后被激活，引发肠道上皮细胞死亡。Caspase-2^-/-小鼠能够减少小肠绒毛的的破坏，并且减少隐窝细胞的凋亡，从而起到辐射防护作用。

综上，Caspase家族蛋白Caspase-2确为放射性肠道损伤靶点。

实施例3：Caspase-2抑制剂对致死剂量辐照小鼠生存率的影响

1.1实验材料

1.1.1实验动物

SPF级4-6周龄C57BL/6雄性小鼠购于南京大学模式动物研究所。所有的小鼠均饲养于苏州大学动物管理中心SPF级动物房内。所有进入动物房的饮用水、小鼠常规饲料、垫料以及各种实验用品均经过高温高压或者辐照灭菌处理，经过严格的微生物控制，严格遵守SPF级动物房的规章管理制度。

1.1.2主要仪器

1)生物学X线辐照仪(X-RAD320ix):PXi公司

2)Synergy 2多功能酶标仪：Bio Tek仪器有限公司

1.1.3主要试剂

Z-VDVAD-FMK：APExBio公司

1.2实验方法

1.2.1致死剂量下验证小鼠生存率实验

将小鼠拿到医学部生物学X线辐照仪进行辐照，全身辐照11Gy，剂量率1.5Gy/min，辐照前后腹腔注射Caspase-2抑制剂Z-VDVAD-FMK，辐照后继续饲养于动物中心暂存室。记录生存曲线，记录结果见图29。

1.3实验结果

1.3.1给予小鼠药物后在致死剂量下的生存率结果

选择4-6周C57BL/6小鼠作为实验对象，分为对照组和实验组1-4，给予全身辐照11Gy，剂量率1.5Gy/min，实验组1-2分别在辐照前半小时给予腹腔注射Z-VDVAD-FMK，实验组3-4分别在辐照后半小时给予腹腔注射Z-VDVAD-FMK，辐照后记录生存时间。Z-VDVAD-FMK是用5g/100mL DMSO+食用油溶解。按照20g小鼠腹腔注射100μL的体积配成相应浓度的原液，进行腹腔注射。

如图29所示，所有对照组的小鼠均在11Gy辐照5天后死亡；辐照后腹腔注射Z-VDVAD-FMK不能延长小鼠的生存时间；辐射前腹腔注射20μg/g Z-VDVAD-FMK也不能延长小鼠的生存时间；辐射前腹腔注射10μg/g Z-VDVAD-FMK可显著延长小鼠的生存时间，使得小鼠经11Gy辐照5天后，存活率仍达66.67％，经11Gy辐照6天后，存活率仍达33.33％。

综上，在辐射前注射Caspase-2抑制剂可显著降低经辐照后的小鼠的死亡率，具有良好的抗辐射作用。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims

1.Caspase-2抑制剂作为减少由辐射引起的放射性肠道损伤的活性成分在制备抗辐射药物中的应用，其特征在于，所述辐射为X射线，所述Caspase-2抑制剂为Z-VDVAD-FMK。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物含有Caspase-2抑制剂、药物载体和/或药用辅料。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物载体包含微囊、微球、纳米粒和/或脂质体。

4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药用辅料包含溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂和/或释放阻滞剂。

5.如权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、乳剂、混悬剂或注射剂。