CN113087783B - Hd治疗药物中的小分子多肽及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种HD治疗药物中的小分子多肽及其应用，小分子多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明还提供了小分子多肽的应用。本发明通过对HSF1的转位机制及功能的研究，设计了一个小分子多肽DH1。该多肽通过抑制HSF1的线粒体转位，减弱线粒体的碎片化，提高线粒体DNA的表达量，进而达到保护神经元，改善HD疾病疾病进程的目的，为HD治疗提供新靶点。
Description
技术领域
本发明涉及一种HD治疗药物中的小分子多肽及其应用，属于生物医药技术领域。
背景技术
亨廷顿病（Huntington’s Disease, HD）是一种常染色体显性遗传病，由亨廷顿蛋白基因外显子1中CAG重复区的扩增引起。虽然亨廷顿蛋白(HTT)在全身表达，但聚谷氨酰胺扩展的蛋白特别对纹状体中的中间多棘神经元及其皮质连接有毒。患者患有包括抑郁和焦虑在内的情绪症状，以及特征性的运动障碍和舞蹈病。目前该病尚未存在有效的治疗方法，治疗选择仅限于改善疾失调状。在HD转基因小鼠衍生的纹状体细胞系、HD模型小鼠YAC128、HD病人fibroblast及HD病人衍生的iPSCs中，热休克转录因子1即HSF1出现明显的线粒体转位。现需要通过HSF1的转位机制发掘更好的治疗HD的物质及方法。
发明内容
发明目的：针对上述现有存在的问题和不足，本发明的目的是提供一种HD治疗药物中的小分子多肽及其应用，通过对HSF1的转位机制及功能的研究，设计了一个小分子多肽DH1。该多肽通过抑制HSF1的线粒体转位，减弱线粒体的碎片化，提高线粒体DNA的表达量，进而达到保护神经元，改善HD疾病疾病进程的目的，可能为HD治疗提供新靶点。
技术方案：为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：一种HD治疗药物中的小分子多肽，所述小分子多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
HD治疗药物中的小分子多肽在制备用于治疗HD的药物的应用。
进一步的，所述HD治疗药物中的小分子多肽与HSF1（热休克转录因子1）特异性结合，干扰HSF1与Drp1（线粒体动力相关蛋白1）的位点645~652区结合，抑制神经退行性变。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优点：这是一种新式的HD治疗药物中的小分子多肽及其应用，本专利基于蛋白质-蛋白质的相互作用，通过生物信息学模拟，根据序列同源性设计出一种，旨在通过干扰蛋白质之间相互作用的多肽。该多肽通过调节HD病理条件下HSF1蛋白的错误转位，进而对线粒体形态，线粒体DNA及线粒体的生物发生等进行调节，是一种多途径发挥作用的小分子多肽。
在我们的实验过程中，没有发现蛋白正常功能的改变，证明其特异性较强。在长期给药的过程中，也没有发现细胞毒性等副作用，安全有效。
附图说明
图1是本发明的筛选及验证结果示意图，
图中：A为小分子多肽DH1和DH2的序列及位置，B为免疫沉淀验证HSF1与Drp1的相互作用区域，C为免疫共沉淀验证筛选小分子多肽干扰效果，D为GST pull down验证多肽DH1的干扰效果；
图2是本发明的小分子多肽DH1的特异性检测结果示意图，
图中：A为生物素多肽检测多肽结合蛋白的特异性，B为GST pull down验证多肽DH1对HSF1-HSP90相互作用的干扰；
图3是本发明的HD模型中小分子多肽DH1对HSF1线粒体转位的调节结果示意图，
图中：A为HD纹状体细胞系的，B为HD病人iPSCs分化的类器官的，C为HD模型小鼠的，D为HD病人fibroblast的；
图4是本发明的HD模型中小分子多肽DH1对SSBP1多聚化的调节结果示意图，
图中：A为HD纹状体细胞系的，B为HD病人fibroblast的；
图5是本发明的小分子多肽DH1改善线粒体形态结果示意图；
图6是本发明的小分子多肽DH1调节线粒体DNA的复制结果示意图，
图中：A为实时荧光定量PCR检测线粒体DNA拷贝数，B为免疫荧光检测线粒体DNA表达量，比例尺为20μm；
图7是本发明的小分子多肽DH1调节DARPP32及PGC1α 的表达结果示意图；
图8是本发明的小分子多肽DH1减缓HD iPSCs中的神经退行性变结果示意图，A为HD病人iPSCs分化的纹状体类器官经DH1处理后检测DARPP32阳性神经元比例，B为HD病人iPSCs分化的神经元经DH1处理后检测DARPP32神经元轴突长度，比例尺为50μm。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
小分子多肽的设计筛选
如图1所示，使用L-ALIGN序列比对软件确定Drp1（dynamin-relatedprotein 1，线粒体动力相关蛋白1）（human, NP_036192）和HSF1（heat shock factor 1，热休克转录因子1）（human, NP_005517）之间的同源结构域,序列及位置如图1中A所示。构建相应结构域缺失截断体，与Drp1共转，检测HSF1的线粒体转位。免疫共沉淀验证相互作用区域，WB（western blot，蛋白质印迹法）结果如图1中B显示HSF1的HR-A/B（HSF1结构域固定名称）结构域能够与Drp1发生相互作用。HSF1的HR-A/B结构域缺失后，HSF1的线粒体转位减少。小分子多肽处理HdhQ111（亨廷顿转基因小鼠纹状体细胞），提取总蛋白进行Co-IP免疫共沉淀实验，
提取总蛋白步骤如下：(1) 吸弃细胞培养基，加入适量PBS清洗细胞。
(2)按照具体实验需求加入适量总蛋白提取裂解液，冰上静置10min，期间不间断振荡混匀。
(3)刮掉细胞转移到1.5 mL的EP管中，12000 rpm，4℃离心10 min，收集上清进行蛋白浓度测定。
通过Co-IP免疫共沉淀实验，验证多肽干扰相互作用的能力。小分子多肽处理HdhQ111细胞，结果如图1中C，图中结果表明，设计的两个多肽DH1，DH2均能够干扰HSF1与Drp1的相互作用，且DH1的干扰效果更好。选择用DH1进行实验。如图1中D所示，GST pulldown实验进一步证明了DH1可以干扰HSF1与Drp1的结合，减少HD中HSF1的线粒体转位。
小分子多肽DH1的特异性检测
为了验证DH1特异性结合HSF1,设计合成含有生物素标记的DH1，并通过生物素磁珠进行体外结合实验。线粒体蛋白提取步骤如下：
(1)吸弃细胞培养基，加入适量PBS清洗细胞。
(2)加入1 mL的线粒体提取裂解液，冰上静置20 min，刮掉细胞转移到1.5 mL的EP管中。
(3)用1 mL的注射器匀速抽提细胞裂解液，注意不要抽提出气泡。
(4)800×g，4℃离心10min，收集上清，转移至新的EP管中。
(5)12000×g，4℃离心20min，弃掉上清，留沉淀。（上清为胞浆蛋白，可根据实验需求保存）
(6)在沉淀中加入1 mL的线粒体提取裂解液，上下颠倒混匀洗涤线粒体，12000×g，4℃离心10min，弃掉上清。
(7)按照实验具体要求加入适量线粒体提取裂解液，并加入终浓度为1%的Triton-X 100，涡旋震荡至无肉眼可见沉淀，室温静置5 min后进行蛋白浓度测定。
蛋白浓度测定步骤如下：
(1)按照碧云天BCA蛋白浓度测定试剂盒（S0026B）要求配置蛋白标准品并稀释至相应的浓度。
(2)每个样品孔需要200 μL BCA工作液。根据样品数量，按BCA试剂A：试剂B=50:1的体积比，配制适量的工作液，充分混匀备用。
(3)加适当体积的样品到96孔板中，如果样品体积不足20 μL,加标准品稀释液补齐。每孔加入200 μL的工作液，37℃培养箱孵育30 min。
(4)用酶标仪测量560 nm波长下各孔的OD值，使用Excel软件做出标准曲线。
(5)对于实验样品，每孔加入4 μL样品，然后加入16 μL PBS补齐体积，再加入200μL配好的BCA工作液，37℃培养箱孵育至少30min。
(6)测量560 nm波长下各孔的OD值，根据蛋白标准曲线计算出各样品的浓度。
(7)按照实验需要取适量的蛋白，加入上样缓冲液混匀，金属浴100℃煮8 min，6000 rpm，离心3 min，进行凝胶电泳。
其中电泳为免疫印迹反应-SDS-PAGE电泳，步骤如下：
(1)按实验具体需求，配制不同浓度的分离胶。将分离胶缓缓打入制胶槽中，注意避免气泡产生；然后用1 mL的移液枪缓缓加入超纯水，直至充满整个制胶槽，注意不要将分离胶吹起；加完水后，用移液枪轻轻敲击玻璃板，去除胶槽中的气泡；室温静置等待分离胶凝固，中间不要挪动。以单板10%的分离胶为例，配方如下表1：
表 1
(2)分离胶凝固后倒掉上面的超纯水，并用清洁纸将残留水分吸干净；然后将配制好的5%的浓缩胶加到分离胶上，缓慢插入梳子，避免产生气泡；室温静置等待浓缩胶凝固，中间不要挪动。以单板浓缩胶为例，配方如下表2：
表 2
(3)浓缩胶凝固后，取下制胶的玻璃板放入电泳槽中，加入1×的电泳缓冲液，缓慢拔掉梳子后，用1 mL的枪小心吹打加样孔，清除加样孔中残留的胶丝。
(4)将离心过的蛋白样品与蛋白marker按照顺序依次加入上样孔内。
(5)插入电源，调节电压为100V，开始电泳，当marker完全跑开后，调整电压为180V，待溴酚蓝迁移至分离胶下缘，或按具体实验需求，停止电泳。
接着进行免疫印迹反应的转膜，步骤如下：
(1)剪下大小适中的NC膜备用，并将滤纸和海绵置于转膜缓冲液中直至浸湿完全。
(2)按照从负极到正极的顺序，依次将海绵-滤纸-电泳凝胶-NC膜-滤纸-海绵的“三明治”结构放在转膜夹中，轻压转膜夹，赶走气泡，然后合上夹子，放到转膜槽中。
(3)在转膜槽中放入两个冰盒，加入适量转膜缓冲液，恒流300mA，按照实验需求，设定转膜时间，进行转膜。如果转膜时间过长可以中间更换冰盒，防止温度过高影响转膜。
再进行免疫印迹反应的封闭，步骤如下：
将NC膜放入5%的脱脂牛奶封闭液中，随后放在脱色摇床上，室温缓慢摇动封闭30min。
进行免疫印迹反应的抗体孵育，步骤如下：
(1)一抗孵育：按照抗体说明书，选择合适的稀释比例，使用5%的脱脂牛奶封闭液稀释一抗，4℃孵育过夜。
(2)洗膜：回收一抗后，将NC膜置于1×TBST中，室温，在脱色摇床上洗3次，每次5-10 min。
(3)二抗孵育：使用5%的脱脂牛奶封闭液按照1∶1000的比例稀释与一抗种属相对应的HRP二抗，室温孵育90 min。
(4)洗膜：将NC膜置于1×TBST中，室温在脱色摇床上洗3次，每次5-10 min。
进行免疫印迹反应的化学发光，步骤如下：
采用ECL化学发光法进行显影曝光：按照实验需要，将适量的ECL发光A液和B液等体积混合，室温避光反应1 min；将NC膜放入反应液中，缓慢晃动，使发光液完全没过NC膜，室温避光反应1 min，放入成像仪中采集图像。
进行细胞免疫荧光，步骤如下：
(1)提前一天在12孔板中放入玻片，并加入适量coating溶液，过夜包被。
(2)在12孔板中铺入密度大约为50%的HdhQ7的细胞，保持细胞状态良好。
(3) 24h后按照每孔0.5 μg的量，将Flag-mtHSF1转染入细胞。
(4)转染48 h后，吸弃培养基，PBS清洗三次。
(5)加入4%的多聚甲醛室温固定20 min。
(6)吸弃多聚甲醛后用PBS清洗三次，加入细胞免疫荧光打孔液，室温预打孔5min。
(7)吸弃打孔液，加入封闭液，室温封闭1 h。
(8)弃掉封闭液，一抗孵育。按照抗体稀释比例用封闭液稀释一抗，4℃过夜孵育。
(9)弃掉一抗，PBS清洗细胞三次，按照1:500的稀释比例用封闭液稀释免疫荧光二抗，室温避光孵育2 h。
(10)弃掉二抗，PBS清洗细胞三次，DAPI染片10 min。
(11)弃掉DAPI，PBS清洗细胞三次，用清洁纸吸去多余液体残留，用封片剂封片。室温放置一段时候后，用指甲油封片。
进行线粒体DNA拷贝数检测，步骤如下：
按照天根血液基因组试剂盒（DP304-03）说明书，提取过表达细胞或组织的全基因组。合成不同的核基因引物及线粒体基因引物，配制成终浓度为10 µM的引物Mix。引物序列如下表3：
表 3
荧光定量PCR反应体系（20 μL）如下表4：
表 4
荧光定量PCR反应条件如下表5:
表 5
相对目的基因表达=2–ΔΔCt，其中ΔΔCt=（CtmtDNA-CtGAPDH）mtHSF1 -（CtmtDNA-CtGAPDH）control。
继续进行免疫共沉淀步骤如下：
(1)PBS清洗细胞，用500 μL HEPES裂解液，冰上裂解细胞10 min，收集细胞悬液到1.5mL EP管中。
(2)超声破碎细胞，4℃，12000 rpm，离心15 min，取上清。
(3)BCA测量蛋白浓度后，取等量蛋白，分别加入一抗及IgG阴性对照，4℃混旋孵育过夜。
(4)各加入30 μL protein A/G珠子，4℃混旋孵育1-2 h。
(5)3000 rpm，4℃离心3 min，弃上清。
(6)加入1 mL HEPES清洗珠子，随后3000 rpm，4℃离心3 min，弃上清。反复清洗数次。
(7)吸弃上清，每管加入30 μL裂解液及10 μL上样缓冲液，煮蛋白进行WB分析。
接着进行DSS交联处理步骤如下：
取适量蛋白用裂解液补齐体积，按照DSS:样品=1:20的比例加入25 mM DSS，用枪混匀后，室温静置30 min。随后加入适量的上样缓冲液，涡旋混匀，放入金属浴中100℃煮8min，进行WB。
接着进行GST pull down步骤如下：
(1)将Sepharose珠子混匀后按照每管样品30 μL珠子的量，分装到不同的EP管中，500×g， 4℃离心5 min，弃上清。
(2)按照1：5的比例加入GST Binding 缓冲液，上下颠倒混匀清洗珠子，然后500×g， 4℃离心5 min，反复进行5-6次。
(3)将GST标签的蛋白（500 ng）与小分子多肽TAT/DH1(20 μM)加到TBST缓冲液中，室温混旋孵育1 h。
(4)向含多肽的GST标签蛋白混合液中加入清洗好Sepharose珠子及500 ng的His标签的蛋白，4℃混旋孵育过夜。
(5)第二天500×g，离心5 min，弃上清。然后用 500 μL 预冷的GST Binding缓冲液，混旋洗涤三次，每次15-30 min。
(6)加入30 μL预冷的GST Elution缓冲液，10 μL上样缓冲液，煮蛋白进行WB实验。
再进行生物素体外结合实验步骤如下：
(1) PBS清洗细胞，用500 μL RIPA裂解液，冰上裂解细胞10 min后收集细胞。
(2)将收集的细胞悬液经超声细胞破碎仪破碎后，4℃，12000 rpm，离心15 min，取上清。
(3)BCA测蛋白浓度，取等量蛋白（800 μg左右），分别加入终浓度为10 μM 的biotin-TAT/DH1，4℃混旋孵育过夜。
(4)第二天加入50 μL Streptavidin MagBeads，4℃混旋孵育1 h，3000 rpm，4℃离心3 min，弃上清。
(5)加入1 mL HEPES清洗珠子，随后3000 rpm，4℃离心3 min，弃上清。反复清洗数次。
(6)吸弃上清，每管加入30 μL裂解液及10 μL上样缓冲液，煮蛋白进行WB分析。
进行图像结果处理步骤如下：
所有WB结果均使用分析软件Image J进行数据分析。读取目标条带的灰度值，并以对照组灰度值为1，其他组条带灰度均与对照组做比较，得出各组蛋白的相对表达量，随后进行统计学分析。WB条带及免疫电镜图像使用 Photoshop软件进行处理裁剪，并粘贴入canvas软件进行整理。
由WB结果如图2中A所示，可以看出DH1特异性结合HSF1而不是Drp1，并且未发现与线粒体基质蛋白Clpp，外膜蛋白VDAC结合。通过GST pull down实验检测了DH1对HSF1其它相互作用的影响。WB结果如图2中B所示，表明DH1对HSF1与HSP90（热休克蛋白90）的结合没有影响，即DH1可以特异性干扰HSF1与Drp1的相互作用，而不影响HSF1与其它蛋白的相互作用。
小分子多肽DH1干扰HSF1的线粒体转位
实验组1和对照组1：HD纹状体细胞系和TAT同时在33℃含有5%的CO2的培养箱中培养。多肽以1μM终浓度连续处理3天，HD纹状体细胞系为实验组1，TAT（humanimmunodeficiency virus transactivator，人免疫缺陷病毒反式激活因子）为对照组1。
DH1分别处理HD纹状体细胞系即实验组1得到如图3中A所示，HD病人iPSCs分化的类器官得到如图3中B所示，HD模型小鼠及HD病人fibroblast如图3中C 和D所示，提取线粒体蛋白，检测线粒体HSF1的转位，WB结果表明，HD疾病组在DH1处理后，相较于TAT组即对照组1，HSF1的线粒体转位均下降。结果表明DH1可以减少HSF1的线粒体转位。
小分子多肽DH1对SSBP1多聚化的调节
实验组2：HD纹状体细胞系：33℃含有5%的CO2的培养箱中培养。多肽以1μM终浓度连续处理3天。
对照组2：HD病人fibroblast：37℃含有5%的CO2的培养箱中培养。多肽以1μM终浓度连续处理5天。
DH1分别处理HD纹状体细胞系及HD病人fibroblast实验组2得到如图4中A和B所示，提取线粒体蛋白，DSS（双琥珀酰亚胺辛二酸酯）交联后，检测SSBP1（single strandedDNA binding protein 1，线粒体单链DNA结合蛋白1）的多聚化。WB结果显示,DH1处理后，HD疾病组即HdhQ111细胞及HD病人fibroblast HD1、HD3的SSBP1多聚化上调，表明DH1可以促进线粒体DNA复制，增加线粒体DNA拷贝数。
小分子多肽DH1对线粒体形态的调节
实验组3：HD纹状体细胞系：33℃含有5%的CO2的培养箱中培养。多肽以1μM终浓度连续处理3天。
DH1处理HD纹状体细胞系，免疫荧光检测线粒体形态。如图5所示左侧荧光图可以看出，DH1处理后，HdhQ111细胞中线粒体明显变长，碎片化得到改善。统计图结果也与此一致，在DH1处理后，HdhQ111细胞中线粒体断裂的细胞比例明显降低，表明异常的线粒体形态得到恢复。
小分子多肽DH1对线粒体DNA的调节
实验组4：HD纹状体细胞系：33℃含有5%的CO2的培养箱中培养。多肽以1μM终浓度连续处理3天。
DH1处理HD纹状体细胞系，通过qPCR及免疫荧光检测线粒体形态，以此得出DH1对线粒体DNA的调节。检测按照试剂盒要求提取基因组，通过实时荧光定量检测线粒体DNA的拷贝数。以核编码基因Tert为内参，检测线粒体编码基因Dloop的表达。如图6中A所示qPCR结果图可以看出，DH1处理后，HdhQ111细胞中线粒体明显变长，碎片化得到改善，线粒体DNA拷贝数增加。如图6中B免疫荧光图也可以看出，统计图结果也与此一致，在DH1处理后，HdhQ111细胞中线粒体断裂的细胞比例明显降低，DH1处理组细胞中线粒体DNA明显增多，表明线粒体DNA损伤得到修复。
小分子多肽DH1改善HD中其它功能缺陷
实验组5：HD小鼠:在小鼠6月龄植入缓释泵，每隔6周更换缓释泵，在10月龄收蛋白，3 mg/kg终浓度连续给药4个月。
多肽处理小鼠实验步骤为：
(1)准备6月龄的YAC128小鼠及同窝对照小鼠，随机分组后予以多肽处理。
(2)将小鼠称重，并将其置于诱导盒中进行诱导麻醉。同时依据小鼠体重及给药浓度3 mg/kg计算一个缓释泵中充满药物的用量，将配制好的多肽转移至缓释泵中待用。
(3)待小鼠麻醉完成后将四肢固定在定位仪中进行维持麻醉。剃除小鼠颈部毛发并割开皮肤，将事先预处理好的缓释泵植入小鼠皮下。
(4)手术完成缝合伤口，碘伏处理后置于加热垫上等待小鼠苏醒。
(5)确认小鼠术后状态良好后返还动物中心饲养，每6周更换一次缓释泵，四个月后处死小鼠进行生化实验。
DH1处理HD小鼠即实验组5，提取总蛋白，检测线粒体生物发生关键调控因子PGC1α以及MSN标记物DARPP32的表达。如图7所示，结果表明，在DH1处理后，HD小鼠脑子中PGC1α与DARPP32的表达均上调，PGC1α上调表明线粒体生物发生得到改善，DARPP32表达上调表明神经元损伤初步得到改善。
小分子多肽DH1减缓HD病人iPSCs的神经退行性变
实验组6：HD病人iPSCs分化的类器官：WB用类器官，在第25天给药，第30天收蛋白，1μM终浓度连续处理5天。荧光染色用器官，在第53天给药，第60天收取类器官切片染色，1μM终浓度连续处理7天。
对照组6：按照与实验组相同的条件，用TAT进行处理。在第25天给药，第30天收蛋白，1μM终浓度连续处理5天。荧光染色用器官，在第53天给药，第60天收取类器官切片染色，1μM终浓度连续处理7天。
DH1处理HD病人iPSCs分化的纹状体类器官，再进行免疫荧光实验，步骤为：
(1)固定：PBS清洗iPSCs分化的纹状体类器官或神经元，然后加入适量的4%的PFA固定30min。
(2)清洗：使用PBS清洗类器官或神经元，洗三次，每次5min。
(3)封闭：类器官使用1%的Triton和5%的驴血清封闭1h；神经元先使用0.2%的Triton进行透化，然后使用10%的驴血清封闭1h。
(4)孵育一抗：使用0.1%的Triton和5%的驴血清配制对应的一抗，添加完成后置于4℃冰箱孵育过夜。
(5)清洗：使用PBS清洗类器官或神经元，洗三次，每次10min。
(6)孵育二抗：使用5%的驴血清配制对应通道的荧光二抗，添加完成后置于室温孵育30min（神经元）或1h（类器官）。
(7)清洗：使用PBS清洗类器官或神经元，洗三次，每次10min。
(8)封片：使用封片剂进行封片。
如图8中A所示荧光图及B的统计结果来看，对比TAT组，DH1处理的HD纹状体类器官中DARPP32 阳性神经元的比例增加；随后我们用DH1处理HD病人iPSCs分化的神经元，在第25天给药，第45天固定神经元染色，1μM终浓度隔天处理20天。发现如图8中B所示，DH1处理的HD病人iPSCs分化的神经元的轴突长度增加，结果表明，DH1减缓HD病人iPSCs的神经退行，对神经元损伤达到了初步保护作用。
对实验结果使用graphpad prism 8统计软件进行统计学分析得到如下表6所示结果。所有数据用均数±标准差( ±s)表示。所有结果采用独立样本的t检验或单因素方差分析（One-way ANOVA）下的多样本均数之间的两两比较（Tukey’s multiple comparisontest）进行统计学分析。每个实验至少设置三次独立重复实验。N.S.为无统计学意义，P＜0.05（*）为差异有统计学意义，P＜0.01（**）为有显著性差异，P＜0.001（***）及P＜0.0001（****）为有极其显著性差异。
表 6
| ANTIBODIES | ANTIGEN | SOURCE | IDENTIFIER | Dilution |
| Anti-HSF1 | rabbit | proteintech | 51034-1-AP | 1:500 |
| Anti-VDAC1 | rabbit | abcam | Ab15895 | 1:2000 |
| Anti-Tom20 | rabbit | abcam | ab78547 | 1:1000 |
| Anti-actin | mouse | ZSGB-BIO | TA-09 | 1:2000 |
| Anti-DARPP32 | rabbit | abcam | Ab40801 | 1:1000 |
| Anti-DNA | mouse | Progen | 61014 | 1:100 |
| Anti-SSBP1 | rabbit | proteintech | 12212-1-AP | 1:1000 |
| Anti-DRP1 | mouse | BD bioscience | 611113 | 1:1000 |
| Anti-Clpp | rabbit | abcam | ab124822 | 1:2000 |
| Anti-HSP90 | rabbit | santa cruz | sc-7947 | 1:500 |
| Anti-cMyc | mouse | santa cruz | sc-40 | 1:1000 |
| Anti-PGC1α | rabbit | Novus | NBP104676 | 1:1000 |
| HRP-linked a-rabbit IgG | rabbit | zen Bioscience | 511203 | 1:5000 |
| HRP-linked a-mouse IgG | mouse | zen Bioscience | 511103 | 1:5000 |
| Hoechst33258 | Thermo Fisher Scientific | H1399 | 1:2000 | |
| DAPI | solarbio | C0065 | ||
| Alexa 488, goat anti-rabbit Ig G | rabbit | invitrogen | A11034 | 1:500-1:1000 |
| Alexa Fluor 488, donkey anti-Rabbit IgG (H+L) | rabbit | Thermo Fisher Scientific | A21206 | 1:1000 |
| Alexa 555，goat anti-mouse Ig G (H+L) | mouse | invitrogen | A21422 | 1:500-1:1000 |
通过统计结果可知，DH1通过抑制HSF1的线粒体转位，减弱线粒体的碎片化，提高线粒体DNA的表达量，增加纹状体神经元的表达，进而达到保护神经元，改善HD疾病疾病进程的目的，为HD治疗提供新靶点。
序列表
<110> 南京医科大学
<120> HD治疗药物中的小分子多肽
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 1
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Glu Val Ile Glu Arg
1 5 10 15
Leu Ile Lys
Claims (3)
1.一种HD治疗药物中的小分子多肽，其特征在于：所述小分子多肽的氨基酸序列如SEQID No.1所示。
2.权利要求1所述的HD治疗药物中的小分子多肽在制备用于治疗HD的药物的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述HD治疗药物中的小分子多肽与HSF1（热休克转录因子1）特异性结合，干扰HSF1与Drp1（线粒体动力相关蛋白1）的位点645~652区结合，抑制神经退行性变。
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