CN116637198B - Tfam k76位点的乙酰化修饰在肝癌诊疗中的应用 - Google Patents

Tfam k76位点的乙酰化修饰在肝癌诊疗中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医药和分子生物学技术领域，具体涉及TFAM K76位点的乙酰化修饰在肝癌诊疗中的应用。本发明通过研究发现，首次报道了TFAM K76位点在肝细胞癌的差异表达，表明其对肝细胞癌具有良好的诊断和预后作用；且经研究发现，通过调控TFAM K76位点特别是促进TFAM K76位点乙酰化修饰可用于肝细胞癌的治疗，同时筛选出具有潜在肝细胞癌治疗价值的小分子化合物。总之，本发明为肝细胞癌发生发展提供了新的机制研究，并为肝细胞癌患者提供了有前景的治疗策略，因此具有良好的潜在实际应用之价值。

Description

TFAM K76位点的乙酰化修饰在肝癌诊疗中的应用
技术领域
本发明属于生物医药和分子生物学技术领域，具体涉及TFAM K76位点的乙酰化修饰在肝癌诊疗中的应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
原发性肝癌（primary liver cancer，PLC）简称肝癌，是消化系统最常见的恶性肿瘤之一。因其高度恶性及难治性，受到全世界的广泛关注。同时，PLC根据其病理类型主要分为肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）、肝内胆管癌（Intrahepaticcholangiocarcinoma，ICC）和混合型肝细胞癌-胆管癌（Combined hepatocellularcholangiocarcinoma，cHCC-CCA）三种类型，三者的发病机制、生物学行为、病理组织学、治疗方法以及预后等方面各不相同，其中HCC是最主要的病理类型，占PLC总发病率的75%～85%。HCC的预后受肿瘤分期的影响，早期HCC在标准治疗方案下5年生存率可达70%以上，有症状的晚期患者在系统治疗下的中位生存期仅为1~1.5年。然而肝癌起病隐匿，早期的主要症状主要为肝区疼痛、腹胀、纳差、乏力、消瘦等非特异性症状，绝大多数患者确诊时已处于中晚期。HCC的治疗目前主要以多学科、多系统的综合治疗模式为主，常见治疗方法包括肝切除术、肝移植术、消融治疗、TACE、放射治疗、系统抗肿瘤治疗等多种手段，然而目前的治疗手段未能明显改善HCC患者预后，同时还面临着费用高、起效慢、抗肿瘤效果差、药物毒副作用大、耐药等多种问题。在HCC的治疗过程中，肿瘤的发生发展、侵袭转移及化疗耐药一直是临床工作的重点与难点。探索新的HCC治疗靶点和策略成为目前迫切需要解决的问题。
线粒体是真核细胞中重要的细胞器，是哺乳动物细胞最主要的能量供给单位，线粒体的异常通常伴随着细胞功能的紊乱，在调节细胞代谢、分化、增殖、死亡乃至细胞信号传导等方面也起着不可或缺的作用。作为线粒体稳态的重要调节方式，线粒体生物合成（mitochondrial biogenesis）的下降必然导致线粒体数量的减少和线粒体呼吸的抑制，进而影响HCC的发生发展。有研究表明，乳腺癌细胞在转移和侵袭的过程中表现出线粒体生物合成能力的增强。另一项研究证实，在缺氧条件下，高迁移率族蛋白B1（HMGB1）上调了HCC细胞的线粒体生物发生，促进了肿瘤的存活和增殖。综上所述，线粒体的生物合成是肝癌细胞存活和增殖所必需的，靶向线粒体生物合成的治疗可能对治疗复发及耐药肿瘤是有效的。
线粒体转录因子A（mitochondrial transcription factor A，TFAM）是一种高迁移率族蛋白（HMG box 蛋白家族）因子，其基因位于19号染色体长臂21区（10q21），编码蛋白相对分子质量为25,000Da。目前认为，TFAM是最丰富的mtDNA包装蛋白，参与mtDNA转录、复制与线粒体生物合成、以及线粒体基因组的稳定性调控等过程。因为其在线粒体生理钟的重要作用，TFAM也成为多种线粒体相关疾病的潜在干预靶点，如糖尿病、神经变性疾病、心力衰竭等。TFAM也与肿瘤关系密切。多项研究报道，TFAM在肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、宫颈癌、卵巢上皮癌、膀胱癌等多种人肿瘤细胞中显著表达。TFAM的完全缺失是具有胚胎致死性的，但TFAM的组织特异性缺乏可以破坏呼吸链功能并产生线粒体功能的改变。蛋白质翻译后修饰（Protein translational modification，PTM）在调节蛋白质功能中起关键作用。蛋白质磷酸化修饰是最广泛研究的PTM，然而乙酰化修饰现已被认为是功能丰富的PTM。该现象在线粒体中最为明显，因为线粒体中的磷酸化相对稀缺，而乙酰化修饰则更为普遍。目前已经报道了关于TFAM PTM的几种形式，包括甲基化、磷酸化、泛素化和乙酰化。研究表明，TFAM的甲基化、泛素化和磷酸化均可以降低转录活性，然而乙酰化修饰的作用却鲜有报道。发明人前期研究表明，TFAM K76位点具有乙酰化修饰形式，并且可以调控线粒体的生物合成，然而，TFAM K76位点的乙酰化修饰在HCC中的作用尚不明确。
发明内容
针对现有技术中的不足，本发明的目的在于提供TFAM K76位点的乙酰化修饰在肝癌诊疗中的应用。本发明通过研究发现，TFAM K76位点在HCC的差异表达，表明其对HCC具有诊断及预后价值，同时发现通过调控TFAM K76位点可以对HCC的发生发展产生促进或抑制作用，从而表明TFAM K76位点在HCC中可实现治疗目的；并进一步筛选出治疗HCC的小分子化合物。基于上述研究成果，从而完成本发明。
具体的，本发明技术方案如下：
本发明的第一个方面，提供如下a1）-a4）任意一项在制备用于肝癌诊断或肝癌预后的药物中的应用：
a1）TFAM K76位点乙酰化修饰；
a2）编码TFAM K76位点乙酰化修饰的核酸；
a3）检测TFAM K76位点乙酰化修饰表达的试剂；
a4）检测编码TFAM K76位点乙酰化修饰的核酸的表达的试剂。
其中，所述肝癌预后包括对肝癌患者的生存期的评估。
本发明的第二个方面，提供促进TFAM K76位点乙酰化修饰表达水平的物质在如下b1）-b4）中至少一种中的应用：
b1）制备抑制肝癌细胞增殖的产品；
b2）制备抑制肝癌细胞迁移和侵袭的产品；
b3）制备抑制肝癌细胞的干性的产品；
b4）制备治疗肝癌的产品。
其中，所述b4）中，所述肝癌为肝细胞癌。
所述促进TFAM K76位点乙酰化修饰表达水平的物质可以为促进TFAM K76位点乙酰化修饰表达水平的小分子化合物，具体的，所述小分子化合物其分子式为C25H35N9O2S，其结构式如下所示：
。
本发明的第三个方面，提供一种药物组合物，其活性成分至少包括如下c1）或c2）：
c1）促进TFAM K76位点乙酰化修饰表达水平的物质；
c2）促进编码TFAM K76位点乙酰化修饰的核酸的表达水平的物质。
其中，所述c1）中，促进TFAM K76位点乙酰化修饰表达水平的物质可以为促进TFAMK76位点乙酰化修饰表达水平的小分子化合物，具体的，所述小分子化合物其分子式为C25H35N9O2S，其结构式如下所示：
。
在本发明中，如果没有特别说明，术语“肝癌”是指肝细胞癌。
本发明的第四个方面，提供一种肝癌治疗的方法，所述方法包括：对受试者施用促进TFAM K76位点乙酰化表达的物质。
其中，所述肝癌为肝细胞癌。
上述一个或多个技术方案的有益技术效果：
上述技术方案首次报道了TFAM K76位点在肝细胞癌的差异表达，表明其对HCC具有良好的诊断和预后作用；且经研究发现，通过调控TFAM K76位点特别是促进TFAM K76位点乙酰化修饰可用于肝细胞癌的治疗，同时筛选出治疗HCC的小分子化合物。
总之，上述技术方案为肝细胞癌发生发展提供了新的机制研究，并为肝细胞癌患者提供了有前景的治疗策略，因此具有良好的潜在实际应用之价值。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例1中HCC患者癌及癌旁TFAM K76位点乙酰化表达差异统计分析。
图2为本发明实施例1中HCC患者肿瘤TFAM K76位点乙酰化表达水平与预后相关性。
图3为本发明实施例2中TFAM K76突变体构建及其效果验证。
图4为本发明实施例2中CCK-8实验验证增殖作用。
图5为本发明实施例2中EDU实验验证增殖作用。
图6为本发明实施例2中TRANSWELL实验验证迁移和侵袭作用。
图7为本发明实施例2中细胞克隆实验验证干性表型。
图8为本发明实施例2中PCR技术检测mtDNA拷贝数。
图9为本发明实施例2中免疫荧光实验检测线粒体的活性。
图10为本发明实施例2中Western blot技术检测线粒体复合物的表达。
图11为本发明实施例3中小分子化合物筛选流程。
图12为本发明实施例3中分子对接模型。
图13为本发明实施例3中Western blot技术筛选小分子。
图14为本发明实施例3中测定小分子化合物使用浓度。
图15为本发明实施例3中CCK-8实验验证增殖作用。
图16为本发明实施例3中EDU实验验证增殖作用。
图17为本发明实施例3中TRANSWELL实验验证迁移和侵袭作用。
图18为本发明实施例3中细胞克隆实验验证干性表型。
图19为本发明实施例3中PCR技术检测mtDNA拷贝数。
图20为本发明实施例3中Western blot技术检测线粒体复合物的表达。
图21为本发明实施例3中PCR技术检测线粒体复合物的表达。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
现结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
如前所述，TFAM K76位点的乙酰化修饰在HCC中的作用尚不明确。
本发明的一个典型具体实施方式中，提供如下a1）-a4）任意一项在制备用于肝癌诊断（如早期诊断或辅助诊断）或肝癌预后的药物中的应用：
a1）TFAM K76位点乙酰化修饰；
a2）编码TFAM K76位点乙酰化修饰的核酸；
a3）检测TFAM K76位点乙酰化修饰表达的试剂；
a4）检测编码TFAM K76位点乙酰化修饰的核酸的表达的试剂。
其中，所述肝癌预后包括对肝癌患者的生存期的评估。
所述TFAM来源于受试者肝（癌）组织或肝（癌）细胞。
所述肝癌为肝细胞癌；
所述检测TFAM K76位点乙酰化修饰表达的试剂可以为基于免疫组化方法所需的试剂；
所述药物可以以检测试剂盒形式存在。
所述肝癌预后包括对肝癌患者的生存期的评估。
本发明通过免疫组化研究发现，与癌旁对照相比，TFAM K76位点乙酰化水平在HCC组织中表达显著下调；且生存分析结果显示，TFAM K76位点乙酰化水平低表达患者的生存期明显低于高表达患者。因此，TFAM K76位点乙酰化水平表明其具有良好的诊断和预后价值。
本发明的又一具体实施方式中，提供促进TFAM K76位点乙酰化修饰表达水平的物质在如下b1）-b4）中至少一种中的应用：
b1）制备抑制肝癌细胞增殖的产品；
b2）制备抑制肝癌细胞迁移和侵袭的产品；
b3）制备抑制肝癌细胞的干性的产品；
b4）制备治疗肝癌的产品。
其中，所述b4）中，所述肝癌为肝细胞癌。
所述促进TFAM K76位点乙酰化修饰表达水平的物质可以为促进TFAM K76位点乙酰化修饰表达水平的小分子化合物，具体的，所述小分子化合物其分子式为C25H35N9O2S，其结构式如下所示：
。
所述产品可以为药物或者实验试剂，所述实验试剂可供基础研究使用。比如该产品可用于在体外构建肝癌细胞模型，从而用于进一步研究肝癌（特别是肝细胞癌）及其相关机制。
根据本发明，当所述产品为药物时，所述药物还包括至少一种药物非活性成分。
所述药物非活性成分可以是药学上通常使用的载体、赋形剂及稀释剂等。而且，根据通常的方法，可以制作成粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂、喷雾剂等的口服剂、外用剂、栓剂及无菌注射溶液形式的剂型使用。
所述可以包含的载体、赋形剂及稀释剂等非药物活性成分在领域内是熟知的，本领域普通技术人员能够确定其符合临床标准。
本发明的又一具体实施方式中，所述载体、赋形剂及稀释剂包括但不限于有乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油等。
本发明的又一具体实施方式中，本发明的药物可通过已知的方式施用至体内。例如通过静脉全身递送或者局部注射递送到感兴趣组织中。可选地经由静脉内、经皮、鼻内、粘膜或其他递送方法进行施用。这样的施用可以经由单剂量或多剂量来进行。本领域技术人员理解的是，本发明中有待施用的实际剂量可以在很大程度上取决于多种因素而变化，如靶细胞、生物类型或其组织、待治疗受试者的一般状况、给药途径、给药方式等等。
本发明的又一具体实施方式中，所述药物施用对象可以是人和非人哺乳动物，如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、狗、猴、猩猩等。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种药物组合物，其活性成分至少包括如下c1）或c2）：
c1）促进TFAM K76位点乙酰化修饰表达水平的物质；
c2）促进编码TFAM K76位点乙酰化修饰的核酸的表达水平的物质。
其中，所述c1）中，促进TFAM K76位点乙酰化修饰表达水平的物质可以为促进TFAMK76位点乙酰化修饰表达水平的小分子化合物，具体的，所述小分子化合物其分子式为C25H35N9O2S，其结构式如下所示：
。
在本发明中，如果没有特别说明，术语“肝癌”是指肝细胞癌。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种肝癌治疗的方法，所述方法包括：对受试者施用促进TFAM K76位点乙酰化表达的物质。
其中，所述肝癌为肝细胞癌。
所述促进TFAM K76位点乙酰化表达的物质为小分子化合物，具体的，所述小分子化合物其分子式为C25H35N9O2S，结构式如下所示：
。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中为注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件进行。
实施例1 TFAM K76位点乙酰化水平在HCC组织中显著下调且与预后相关
1.实验方法
1.1免疫组化染色
1）将石蜡组织切片置于烤片机上烤片2小时，以防止脱片。
2）脱蜡：将切片置于铁架上依次放入二甲苯Ⅰ（15分钟）、二甲苯Ⅱ（15分钟）、二甲苯Ⅲ（15分钟）、100％乙醇（10分钟）、95％乙醇（10分钟）、85％乙醇（10分钟）、75％乙醇（10分钟）。
3）双蒸水冲洗2次，每次5分钟。
4）PBS冲洗5分钟。
5）高压修复：将切片置于IX抗原修复液中，放入高压锅内，待高压锅安全阀冒气后计时2分钟。等待高压锅限压阀降下后，打开锅盖，使切片自然冷却至室温。
6）双蒸水冲洗5分钟。
7）擦干切片上多余的水分，用免疫组化笔将组织圈起，立即加入试剂Ⅰ（内源性过氧化物酶阻断剂），置于37℃孵箱中孵育20分钟。
8）PBS冲洗3次，每次5分钟，擦干切片上多余水分，按照抗体说明书说明稀释一抗，将稀释好的一抗滴加到组织上，4℃冰箱中孵育过夜。
9）取出切片置于室温复温20分钟PBS冲洗3次，每次5分钟。
10）擦干切片上多余水分，立即加入试剂Ⅱ（封闭用正常山羊血清工作液），置于37℃孵箱中孵育30分钟。
11）PBS冲洗3次，每次5分钟。
12）擦干切片上多余水分，立即加入试剂Ⅲ（生物素标记山羊抗小鼠/兔IgG聚合物），置于37℃孵箱中孵育60分钟。
13）PBS冲洗3次，每次5分钟。
14）配制DAB显色液（比例：1滴DAB原液＋1ml稀释液），迅速滴加到组织上（注意：对照和实验组需同时滴加，同时终止），在显微镜下观察组织显色程度，在适宜情况下使用双蒸水同时终止显色。
15）使用苏木素染液染色2分钟，用自来水终止染色。
16）配制盐酸酒精溶液（75%乙醇99ml＋浓盐酸1ml），组织分化，将切片浸入配制好的盐酸酒精溶液中，快速三进三出。
17）将切片置于自来水下流水冲洗返蓝5分钟。
18）脱水：将切片置于铁架上依次放入70%乙醇（5分钟）、85%乙醇（5分钟）、95%乙醇（5分钟）、100%乙醇（5分钟）。
19）取出切片置于通风橱内晾干。
20）封片：将中性树胶滴在组织上，轻轻覆盖上盖玻片（注意避免气泡产生）。
21）显微镜下观察、采集图片。
1.2免疫组化评分
使用PANNORAMIC全景切片扫描仪将组织切片上机后切片会在扫描仪的镜头下逐步移动，一边移动一边成像进而将组织切片上所有的组织信息都扫描成像出来形成一个文件夹，该文件夹包含了组织切片上所有的组织信息。文件夹用CaseViewer2.2软件打开后可以 1-400 倍任意倍数放大后进行观察。使用Quant Center2.1分析软件中TMA插件设置好芯片组织点直径大小和行列数，软件会自动生成编号。使用QuantCenter2.1 分析软件中Densito quant 模块分别定量每张芯片每个点的目的区域的H-Score。（SCORE=∑（PI×I）=（弱强度细胞百分比 ×1)+(中强度细胞百分比×2)+(高强度细胞百分比×3)，式中PI表示阳性信号像素面积占比；I代表着色强度）。
1.3统计分析
应用SPSS 18.0软件进行数据处理。使用Kaplan-Meier方法评价生存分析，使用对数秩检验评价每个变量的结局差异。P值<0.05被认为具有统计学显著性。
2.实验结果
免疫组化结果表明，与癌旁对照相比，TFAM K76位点乙酰化水平在HCC组织中表达显著下调（图1）。
生存分析结果显示TFAM K76位点乙酰化水平低表达患者的生存期明显低于高表达患者（图2）。
实施例2 肝癌细胞中对TFAM K76位点进行干预可以抑制线粒体功能进而产生抑癌作用
1.实验方法
1.1细胞转染
1）细胞转染前，倒置显微镜观察细胞密度为80%左右，细胞状态良好，分布均匀。
2）根据实验所需要准备若干个高压灭菌后EP管，每管用125μl Opti-MEM稀释3.75μl lipo 3000，轻弹混匀。
3）分别用125ml Opti-MEM稀释2.5μg实验所需织里，轻弹混匀。
4）每管质粒稀释液加入125μl lipo 3000稀释液，轻弹混匀，室温等待5min后，加入到细胞中，做好标记后置于37℃细胞培养箱中培养。
5）24小时后倒置显微镜观察细胞状态并换液。
1.2细胞蛋白提取、蛋白浓度测定
1）弃掉旧完全培养基。
2）PBS提前放置冰箱冷却好，移液枪吸取1ml，轻柔冲洗三次，吸净。
3）每孔加入100μl蛋白裂解液，轻轻晃动，使裂解液充分浸润细胞，置于冰上裂解细胞，持续10min。
3）用刮刀将细胞刮下，用移液器将裂解液吸至EP管中，置于冰上继续裂解，持续30min。
4）每隔10min，需震荡5秒，使细胞充分裂解。
5）4℃离心机离心，设置12000rpm，离心30min。
6）每组样品取4μl上清液用于蛋白浓度测定。剩余上清吸取至新的EP管中，加入的4X上样缓冲液，混匀。
7）金属浴锅加热至100℃，放入样品加热变性，持续10min。
8）蛋白冷却至室温，继续进行western blotting实验。
1.3 CCK-8细胞增殖检测
1）种细胞在96孔板的密度103- 104细胞/100μL培养基。将细胞置于37℃ CO2培养箱中培养24，48，72和96小时。
2）每孔加入10μL CCK-8溶液。
3）在培养箱中培养1-4小时。
4）在读取印版之前，在轨道摇床上轻摇1分钟以确保颜色均匀分布。
5）使用微平板阅读器检测450nm处的吸光度。
1.4 EDU细胞增殖检测
1）细胞培养：取对数生长期细胞，以每孔4×103~1×105细胞接种于96孔板中，培养至正常生长阶段。
2）EdU标记：用细胞完全培养基按1000：1的比例稀释EdU溶液，制备适量50 μM EdU培养基。每孔加入100μl 50μM EdU培养基孵育2小时，弃培养基。PBS清洗细胞1~2次，每次5分钟。
3）细胞固定化：每孔加入50μl细胞固定液（含4%多聚甲醛的PBS)室温孵育30分钟，弃固定液。每孔加入50μl 2mg/ml 甘氨酸，脱色摇床孵育5分钟后，弃甘氨酸溶液。每孔加入100μl PBS，脱色摇床清洗5分钟，弃PBS。每孔加入100μl渗透剂（0.5%TritonX-100的PBS）脱色摇床孵育10分钟；PBS清洗1次，5分钟。
4）Apollo染色：每孔加入100μl的1×Apollo染色反应液，避光、室温、脱色摇床孵育30分钟后，弃染色反应液。加入100μl渗透剂（0.5%TritonX-100的PBS）脱色摇床清洗2~3次，每次10分钟，弃渗透剂。
5）DNA染色：用去离子水按100：1的比例稀释Hoechst33342溶液，制备适量1×Hoechst33342反应液，避光保存。每孔加入100μl 1X Hoechst 33342反应液，避光、室温、脱色摇床孵育30分钟后，弃染色反应液。每孔每次加入100 μl PBS清洗1~3次。每孔加入100μlPBS保存待用。
6）图像获取及分析：染色完成后，立即于荧光倒置显微镜进行观测。
1.5 Transwell细胞侵袭/迁移检测
1）4℃隔夜解冻Matrigengel，实验前转移到冰盒中。将提前准备好的冰放置冰盒中，凝胶前的操作均在冰上操作。将枪头、离心管与放有Transwell小室的24孔板放入冰盒预冷，并用预冷枪头将Matrigengel混匀。
2）基质胶铺板：稀释Matrigengel：先将8μl Matrigenge加入预冷的1.5ml EP管中，然后加入64μl预冷的无血清培养基，并用枪头吹打充分混匀。（Matrigenge和无血清培养基以1:8的比例稀释）吸取60μl稀释后的Matrigengel，垂直加入Transwewll上室中，均匀平铺在底部。放入37℃，5%CO2培养箱中孵育3小时，使Matrigengel聚合成薄膜。孵育后将上室中多余液体吸掉，在每孔中加入100 µL无血清培养基后，于培养箱放置30min，进行基底膜水化。
3）制作细胞悬液：制作细胞悬液前使细胞撤血清饥饿12-24小时，进一步去除血清的影响。取汇合度达70%-80%的细胞进行消化并离心弃废液，然后用无血清培养基重悬细胞，计数后调整细胞密度至2.5×105/ml。
4）接种细胞：在24孔板下室加入500μl含10%FBS培养基。然后用镊子将Transwell小室置于24孔板内。每孔加入200μl细胞悬液到Transwell上室中。培养箱培养24小时后可进行固定染色。
5）细胞固定：取出Transwell小室，吸走培养基，用棉签轻轻擦拭Matrigengel和上室内的细胞。在24孔板干净的孔中加入4％多聚甲醛600μl，将小室放入后固定20-30min。
6）细胞染色及计数：弃去固定液，将小室在盛有PBS的6cm皿中涮洗1遍。用0.1%结晶紫染色5-10分钟，PBS涮洗3遍，除去未与细胞结合的结晶紫，用棉签轻轻擦拭小室的上侧，将非特异性结合于小室上表面的染料擦掉，以便后续镜检。适当风干后，在10倍显微镜下选取5个视野观察细胞并计数。
1.6 细胞克隆存活检测
1）将处于对数生长期的细胞用PBS缓冲液洗一次，胰酶酶解细胞，加入完全培养基后将细胞吹打成单个细胞。
2）用血球计数板在显微镜下计数，在每个中型培养皿中种入300个细胞，每组设置3个重复。
3）37℃细胞克隆培养箱中培养8-10天。
4）吸去培养基，轻轻地用PBS洗两遍。
5）向培养皿中加入1ml固定液，固定20min。
6）吸去固定液，风干后，用结晶紫染液染色过夜。
7）用水小心地漂洗染色液后，待空气自然干燥。
8）用肉眼观察，并以倒置光学显微镜作为辅助，记录克隆数，要求每个克隆所包含的细胞数大于50个。
1.7 线粒体DNA拷贝数检测
提取细胞的全DNA，采用荧光定量PCR，利用检测mtDNA/nDNA比值估计相对线粒体DNA拷贝数。
1.8 免疫荧光实验
1）吸弃细胞培养基，用PBS洗三次，每次3分钟。
2）固定：加入4%多聚甲醛，室温孵育20分钟。
3）吸弃多聚甲醛，用PBS洗三次，每次3分钟。
4）破膜：加入0.5%TritonX-100，室温孵育15分钟。
5）用PBS洗三次，每次3分钟。
6）封闭：加入用PBS稀释的1%山羊血清，37℃孵育１小时。
7）加入用PBS稀释的一抗，4℃孵育过夜。
8）用PBS洗三次，每次3分钟。
9）加入用PBS稀释的荧光二抗，37℃孵育１小时（从此步骤开始避光）。
10）用PBS洗三次，每次3分钟。
11）加入用PBS稀释的DAPI，室温孵育20分钟。
12）用PBS洗三次，每次3分钟。
13）加适量抗淬灭剂进行封片。
14）荧光显微镜下进行观察。
1.9 免疫印迹（Western Blotting）
1）缓冲液配置
配制1X电泳缓冲液：称量2.265gTris、14.1g甘氨酸以及0.75gSDS，加蒸馏水定容至750ml，用磁力搅拌器搅拌至粉末完全溶解。
配制1X转膜缓冲液：称量3.03gTris、14.4g甘氨酸，加蒸馏水定容至800ml，用磁力搅拌器搅拌至粉末完全溶解，然后加入200ml甲醇并置于冰上保存备用。
配制1X TBST：分别称量2.42gTris和8.8gNaCl，加蒸馏水定容至1L，然后加入500μl Tween-20，用磁力搅拌器揽拌至粉末完全溶解。
2）制备SDS-PAGE凝胶
将玻璃板刷净晾干，置于配胶架上，加双蒸水静置10分钟，观察液面高度以检测密封效果。
弃去双蒸水，根据目的蛋白分子量选择合适的分离胶浓度配制分离胶加入玻璃板中，并加入双蒸水密封30分钟。
弃去上层双蒸水，加入配制好的浓缩胶，插入梳子室温静置30分钟。
3）电泳
预电泳：轻轻将梳子拔出，用空针吸取电泳液轻轻吹孔，以80V电压预电泳30分钟，将胶中杂质跑出。
上样：根据蛋白浓度计算蛋白上样量，每孔中加入30μg蛋白样品，并加入Marker分隔开。
电泳：第一阶段电泳：80V，30分钟；第二阶段电泳：120V，60分钟。
4）转膜（湿转）
根据胶的大小，裁剪合适大小的PVDF膜，将PVDF膜置于甲醇中浸泡5分钟活化。小心撬开凝胶玻璃板，将胶置于转膜缓冲液中，并根据需要切取胶块。将凝胶转移至事先用转膜液浸泡的转膜夹上，按照“黑胶白膜”的原则：以转膜夹黑色面、海绵网、滤纸、凝胶块、PVDF膜、滤纸、海绵网的顺序组装起来，夹紧转膜夹，放入转膜槽中，加入转膜液，转膜槽周围加冰维持低温环境，220mA恒流转膜，转膜时间由蛋白分子量大小决定。
5）封闭及抗体孵育
用TBST溶液配置5%的脱脂牛奶，将PVDF膜放入其中室温摇床上封闭1小时。
用TBST洗膜10分钟。
孵一抗，4℃摇床过夜。
用TBST洗膜3次，每次10分钟。
孵二抗，室温摇床１小时。
用TBST洗膜3次，每次10分钟。
6）显影
取适量ECL发光液A、B按照1:1的比例混合均匀，将PVDF膜转印有蛋白的面朝上置于显影托盘上，滤纸吸干膜表面水分，将显影液均匀滴加到膜上，置于显影仪上曝光显影。
2.实验结果
为了在体外模拟TFAM K76位点的乙酰化以及去乙酰化修饰作用，我们首先构建了将K76位点的赖氨酸突变为不可被乙酰化修饰的精氨酸（Arg，R），以及模拟乙酰化修饰后的谷氨酰胺（Gln，Q）。在TFAM−/−的MHCC-97H细胞中重新表达，TFAM K76Q突变与野生型TFAM相比显示出了K76位点乙酰化水平的上调，而TFAM K76R突变体仅显示出微弱的乙酰化作用（图3）。
通过CCK-8（图4）以及EDU（图5）验证了细胞的增殖能力变化，结果显示，TFAM K76Q突变抑制了MHCC-97H的细胞的增殖能力，反之，TFAM K76R突变增强了MHCC-97H的细胞的增殖能力。Transwell实验验证其迁移和侵袭能力变化。结果显示，与野生型相比，TFAM K76Q突变抑制了MHCC-97H的细胞的侵袭和迁移能力，TFAM K76R突变则促进了了MHCC-97H的细胞的侵袭和迁移能力（图6）。通过细胞克隆实验，我们发现TFAM K76Q突变显著抑制了MHCC-97H细胞的干性，TFAM K76R的结果则与之相反（图7）。
通过RT-PCR检测mtDNA拷贝数，结果显示，K76Q突变可以抑制mtDNA的扩增，而K76R突变则促进了mtDNA的扩增（图8）。对线粒体进行了Mitotracker染色，结果表明，TFAM K76Q显著抑制了线粒体的活性，TFAM K76R增强了线粒体的活性（图9）。Western blotting检测部分线粒体呼吸链复合物，结果显示，线粒体呼吸链复合物ND1、ND5、MT CO2、COXⅣ在K76Q突变后显示出了蛋白水平的下调，而K76R突变则上调了四个复合物的表达（图10）。
实施例3 小分子化合物可以针对TFAM K76位点有效抑癌
1.实验方法
1.1基于TFAM晶体结构的虚拟筛选（图11）
1）搭建以TFAM和DNA复合物晶体结构（PDB代码：3TMM）的虚拟筛选模型（图12）。
2）已证实K76位残基是TFAM功能的关键位点，因此以K76为中心定义分子对接位点，用Maestro软件生成相应的格点文件，然后对已有的化合物数据库（5000结构多样性高的小分子化合物）与该格点文件进行分子对接。根据对接打分的高低，挑选排名前150名的小分子。
3）对150个小分子进行聚类分析，根据聚类分析结果，最终挑选了68个小分子。用于后续的活性测试研究。
1.2利用CCK8实验初步筛选小分子药物使用浓度
1）CCK8检测每组细胞6个复孔，通过设计浓度梯度实验，加入10μL CCK8，孵育2 h，测定A450吸光度值，检测不同药物浓度处理后细胞的存活能力。
2）分析半数抑制浓度(IC50) 和剂量-效应曲线的形状。在一定药物浓度范围内，筛选出2种小分子化合物能显著降低细胞的存活能力（*P＜0.05）。
1.3细胞转染、细胞蛋白提取、蛋白浓度测定、CCK-8细胞增殖检测、 EDU细胞增殖检测、Transwell细胞侵袭/迁移检测、细胞克隆存活检测、线粒体DNA拷贝数检测、免疫荧光实验、免疫印迹（Western Blotting）实验方法同实施例2。
2.实验结果
对小分子化合物结构进行初步筛选后，我们通过Western blot从编号22-30共9种小分子化合物中进一步筛选对TFAM K76位点起上调作用的小分子化合物。结果如图13所示，编号为27的小分子化合物对TFAM K76位点上调作用最为显著。该小分子化合物的分子式为C25H35N9O2S，分子量为525.68，结构式如下所示：
。
通过CCK-8实验筛选出该化合物的使用浓度（图14），进一步进行表型实验。
通过CCK8（图15）和EDU（图16）实验表明，27小分子化合物可以显著抑制MHCC-97H细胞的增殖作用。Transwell实验证明，27小分子化合物合抑制MHCC-97H的迁移和侵袭作用（图17）。细胞克隆实验证明27小分子化合物能抑制细胞的干性（图18）。
通过检测mtDNA拷贝数证实27小分子化合物能够抑制mtDNA拷贝数（图19）。Western blot证明，27小分子化合物抑制了线粒体复合物的蛋白表达（图20）。同样，PCR也证明了27小分子化合物能下调线粒体复合物的转录水平（图21）。
本发明未尽事宜为公知技术。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.促进TFAM K76位点乙酰化修饰表达水平的物质在制备抑制肝癌细胞增殖的产品中的应用；
所述肝癌为肝细胞癌；
所述促进TFAM K76位点乙酰化修饰表达水平的物质为促进TFAM K76位点乙酰化修饰表达水平的小分子化合物，所述小分子化合物其分子式为C25H35N9O2S，结构式如下所示：
。
2.促进TFAM K76位点乙酰化修饰表达水平的物质在制备抑制肝癌细胞迁移和侵袭的产品中的应用；
所述肝癌为肝细胞癌；
所述促进TFAM K76位点乙酰化修饰表达水平的物质为促进TFAM K76位点乙酰化修饰表达水平的小分子化合物，所述小分子化合物其分子式为C25H35N9O2S，结构式如下所示：
。
3.促进TFAM K76位点乙酰化修饰表达水平的物质在制备治疗肝癌的产品中的应用；
所述肝癌为肝细胞癌；
所述促进TFAM K76位点乙酰化修饰表达水平的物质为促进TFAM K76位点乙酰化修饰表达水平的小分子化合物，所述小分子化合物其分子式为C25H35N9O2S，结构式如下所示：
。
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