WO2014102426A1 - Péptido neuroprotector así como su uso en el tratamiento de enfermedades cerebrovasculares y otras patologías del snc - Google Patents

Péptido neuroprotector así como su uso en el tratamiento de enfermedades cerebrovasculares y otras patologías del snc Download PDF

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peptide
bdnf
neuroprotective peptide
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PCT/ES2013/070913
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Margarita DÍAZ-GUERRA GONZÁLEZ
Gonzalo SÁNCHEZ TEJEDA
Oscar GÓMEZ VIDAURRE
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Consejo Superior De Investigaciones Científicas (Csic)
Universidad Autónoma de Madrid
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • NEUROPROTECTOR PEPTIDE AS WELL AS ITS USE IN THE TREATMENT OF CEREBROVASCULAR DISEASES AND OTHER CNS PATHOLOGIES
  • the present invention is encompassed in the pharmaceutical sector, and in the public, social and collective services sector. Specifically, the present invention is directed to pharmaceutical companies working in the field of neuroprotection, both referred to acute (ischemia, acute trauma) and chronic (neurodegenerative diseases).
  • Cerebrovascular diseases represent the second leading cause of death worldwide, with 6, 15 million deaths and 10.8% of the total (according to recent WHO data from year 201 1).
  • cerebral ischemia is the second cause of dementia after Alzheimer's disease, and the first reason for disability in adults.
  • Cerebral ischemia or stroke is a phenomenon that characterizes CVDs and is defined as the reduction by different causes of blood supply to insufficient levels to maintain the normal metabolism and functioning of brain cells.
  • the heart of the infarct which suffers the most severe reduction of blood flow and experiences irreversible damage
  • the area of ischemic penumbra characterized by being functionally silent but structurally intact.
  • this region may undergo secondary neuronal degeneration processes that cause the heart attack to expand to the area of ischemic penumbra.
  • the only treatment approved in clinical practice against ischemic stroke is thrombolysis with the tissue plasminogen activator (tPA), which contributes to the restoration of cerebral blood flow by dissolving the clot that obstructs the artery.
  • tPA tissue plasminogen activator
  • thrombolytic therapy results in relatively frequent symptomatic intracerebral hemorrhages and, in addition, tPA has an associated toxicity that increases neuronal degeneration in experimental models.
  • These adverse effects entail the existence of numerous contraindications for this type of therapy, which causes an additional problem: the therapeutic window in which the benefits of the treatment are greater than the risks narrows considerably, being within 3-4 hours after the onset of symptoms This means that in Spain only 4% of patients with an ischemic stroke can benefit from the use of thrombolytic compounds. Therefore, even improving the evolution of some patients, the use of tPA is not risk-free, has a very limited use and is only effective in a narrow therapeutic window.
  • excitotoxicity is a process induced by the increase in the concentration of the excitatory neurotransmitter glutamate in the extracellular space and the overactivation of its specific receptors, mainly those of the N-methyl-D- type. aspartate (NMDARs) (Olney, JW 1986). Therefore, excitotoxicity is a fundamental target in the search for neuroprotection strategies.
  • drugs were used especially when directly binding to NMDARs (antagonists) or indirectly (for example, glutamate release inhibitors, voltage-dependent calcium channel antagonists) decreased the NMDAR overactivation.
  • these drugs showed encouraging results in experimental models of ischemia but were ineffective in the treatment of cerebral ischemia in humans and, therefore, did not pass clinical trials (Ikonomidou, C. & L. Turski. 2002).
  • a common defect in most of these drugs is their lack of selectivity, mainly due to the lack of knowledge of the dual nature of NMDARs, receptors that are critical at the same time in processes of survival and cell death (Hardingham, GE, et al. . 2002).
  • NMDARs also play a preponderant role in the synaptic transmission and neuronal communication of the CNS, both during development and in their adult lives, and are critical in vital processes such as learning, memory, plasticity synaptic and synaptogenesis. Because of this, previously developed drugs in general block both the physiological activation of NMDAR and the pathological one and, therefore, have side effects on learning and produce drowsiness, hallucinations or even coma.
  • excitotoxicity is also critical in neurological disorders characterized by hyperexcitability or neuronal hypersensitization (some types of dyskinesias, neuropathic pain), and ocular pathologies (glaucoma, diabetic retinopathy, ischemic optic neuropathy and optic nerve trauma).
  • the C-terminal cytoplasmic regions of the NMDAR subunits are necessary for their recruitment and correct grouping in post-synaptic density (PSD) and functionality. Particularly important are the 4 C-terminal amino acids of the GluN2A and GluN2B subunits, which constitute a ligand capable of interacting with the PDZ domains present in various PSD proteins, such as PSD-95.
  • PSD-95 post-synaptic density
  • PSD-95 By connecting between membrane receptors, such as NMDAR, and multiple effector proteins, such as the enzyme neuronal nitric oxide synthase (nNOS), PSD-95 organizes the implementation of different intracellular signaling pathways as well as the interaction of NMDAR with the neuronal cytoskeleton. In cerebral ischemia, PSD-95 couples the over-activation of NMDAR with the activation of nNOS and the formation of NO, a critical molecule for neurotoxicity.
  • nNOS neuronal nitric oxide synthase
  • This small sequence of the Tat protein is capable of conferring permeability across the plasma membrane and the blood brain barrier (BHE) to those peptides that comprise it (Dietz & Bahr. 2004).
  • the generated neuroprotective peptide (Tat-NR2B9c or NA-1), when interacting with PSD-95, is able to dissociate the GluN2B-PSD-95-nNOS complex and reduce ischemic damage in murine and primate models (Aarts, M. , et al. 2002), being in the process of clinical validation (US 2010/0137224 A1 and Dolgin, E. 2012).
  • neurotrophins such as BDNF (brain-derived neurotrophlc factor) regulate fundamental CNS processes such as neuronal survival, neurotransmitter release, gene expression or synaptic transmission.
  • BDNF brain-derived neurotrophlc factor
  • TrkB-FL high affinity receptor By binding to its TrkB-FL high affinity receptor, BDNF induces dimerization and transphosphorylation thereof, and the activation of various pro-survival intracellular signaling cascades.
  • TrkB mRNA encodes the complete TrkB-FL isoform, which is the active TrkB receptor. But in addition, this mRNA encodes several truncated isoforms (TrkB-T1, TrkB-T2 and TrkB-T-Shc) lacking the tyrosine kinase domain that participate in the TrkB-FL receptor modulation. Particularly, the truncated isoform TrkB-T1 blocks the function of the active TrkB-FL receptor by competition for BDNF binding or the formation of inactive TrkB-FL / TrkB-T1 heterodimers.
  • TrkB-T1 truncated isoform appears to have other functions independent of the TrkB-FL active receptor that have not yet been fully defined, including: the control of cell morphology and the activation of own intracellular signaling pathways (Fenner BM 2012 ).
  • the truncated isoform TrkB-T1 comprises the same extracellular domain, transmembrane region and first 12 intracellular amino acids that the complete TrkB-FL isoform.
  • the 11 C-terminal amino acids of TrkB-T1 constitute a specific sequence of this truncated isoform, which is highly conserved in mammals (Shelton et al., 1995) and could have an important biological function in them.
  • TrkB-T1 the interaction of the 1-C-terminal amino acid sequence of the truncated isoform TrkB-T1 with the RhoGDH protein (Rho GDP dissociation inhibitor) mediates the inhibition of RhoA, a GTPase that regulates Ca 2+ -dependent on the activation of MAPK (mitogen-activated protein kinase) p38, coupled to neuronal death under conditions of excitotoxicity (Ohira et al., 2006).
  • RhoGDH protein Rho GDP dissociation inhibitor
  • the reduction of neurotrophic support is also an important component in the pathogenesis of numerous CNS pathologies.
  • neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease, Parkinson's, Huntington or amyotrophic lateral sclerosis
  • altered levels of BDNF and TrkB have been observed, and a decrease in signaling (Dawbarn & Alien 2003).
  • Alterations of the BDNF / TrkB pathway have also been observed in schizophrenia, Down syndrome models or depressive and stress states (Dawbarn & Alien 2003).
  • TrkB-FL and TrkB-T1 isoforms have been observed through two mechanisms: the inversion of the balance between the mRNAs of the TrkB-FL and TrkB-T1 isoforms gives rise to a increase in the expression of TrkB-T1, while the calpain proteolysis of TrkB-FL reduces the levels of the active receptor and produces a truncated protein of similar size to TrkB-T1 and that, like it, could act as a dominant negative (Vidaurre OG et al, 2012).
  • TrkB-T1 has also been observed in autopsies of deceased patients as a result of CVD.
  • lentiviral vectors that reverse the imbalance between TrkB isoforms it has been possible to partially prevent death by in vitro excitotoxicity, demonstrating that changes in TrkB expression are fundamental in this neuronal death process (Vidaurre OG et al, 2012).
  • TrkB-T1 As mechanisms responsible for neuronal death in excitotoxicity and ischemia, a negative dominant effect of TrkB-T1 on the function of TrkB-FL has been proposed, and perhaps also the processed form of TrkB-FL, the sequestration of neurotrophin or induced own mechanisms by TrkB-T1.
  • neurotrophin receptors such as BDNF
  • neuroprotective products such as peptides
  • CVD such as stroke or cerebral ischemia
  • Such therapeutic treatment and prevention methods could also be a complement and / or alternative to current thrombolytic therapies, the only ones currently available for stroke or cerebral ischemia.
  • the present invention demonstrates that when an increase in TrkB-T1 levels induced by excitotoxicity occurs, the negative effects on neuronal viability are at least partially mediated by specific protein interactions established by its unique C-terminal sequence of 11 amino acids (SEQ ID NO: 1). These interactions have been interfered with by a plasma membrane permeable neuroprotective peptide that comprises the C-terminal sequence of TrkB-T1 and foreseeably competes with TrkB-T1 itself for binding to its interacting protein (s).
  • the present invention demonstrates that the administration of this neuroprotective peptide to cortical neuron cultures prevents the decrease in neuronal viability produced by the alteration of the BDNF / TrkB survival pathway, demonstrating the neuroprotective effect of said peptide.
  • the present invention refers to a neuroprotective peptide, hereafter referred to as “neuroprotective peptide object of the present invention” or “neuroprotective peptide of the invention”, characterized in that it comprises the 11 C-terminal amino acids of TrkB- T1 (residues 466-476) (SEQ ID NO: 1).
  • the neuroprotective peptide of the invention has been designed to interfere with and / or inhibit the binding between TrkB-T1 and its interacting molecules in a neuron and / or glial cell, being potentially capable of reducing neuronal damage in mammals caused by pathologies of the SN in those that the BDNF / TrkB survival pathway is altered, such as CVD (cerebral ischemia) and other acute CNS pathologies (hypoglycemia, epilepsy and traumatic brain and / or spinal damage) or chronic CNS pathologies associated with a process of excitotoxicity (neurodegenerative diseases).
  • CVD Cerebral ischemia
  • other acute CNS pathologies hyperoglycemia, epilepsy and traumatic brain and / or spinal damage
  • chronic CNS pathologies associated with a process of excitotoxicity neurodegenerative diseases
  • neuroprotective peptide refers to an amino acid sequence capable of preventing, mitigating or delaying the biochemical processes that occur in the nervous system and cause neurodegeration or neuronal death of apoptotic type or necrotic.
  • the present invention is based on the discovery of the neuroprotective effect against neuronal damage in mammals mediated by the interference of protein interactions between TrkB-T1 and its interacting molecules.
  • molecules interacting with TrkB-T1 refers to those molecules capable of associating transiently or constitutively with the TrkB-T1 isoform of the TrkB neurotrophin receptor in a neuron and / or glial cell.
  • the interacting molecules with TrkB-T1 could also establish interactions with peptides whose amino acid sequence is identical or homologous to the sequences described in the present invention, as long as the aforementioned ability to maintain establish interactions with "interacting molecules with TrkB- ⁇ ".
  • the percentage of identity is between 70-95%, even more preferably the percentage of identity is between 90-95%.
  • said neuroprotective peptide comprises an internalizing agent, such as and not limited to, a basic domain of the HIV Tat transactivating protein that confers the permeability properties of this protein (amino acids 47-57) (SEQ ID NO: 3).
  • an internalizing agent such as and not limited to, a basic domain of the HIV Tat transactivating protein that confers the permeability properties of this protein (amino acids 47-57) (SEQ ID NO: 3).
  • the term: "internalization agent” refers to a molecule capable of facilitating the passage of a particular peptide through the blood brain barrier and the plasma membrane to allow access to the interior of neurons and / or cells glial.
  • said internalization agent is a basic domain of the HIV Tat transactivator protein that confers the permeability properties of this protein (amino acids 47-57) (SEQ ID NO: 3).
  • the neuroprotective peptide object of the present invention also comprises a linker or a binding molecule.
  • the linker or binding molecule is a short sequence of proline, threonine, serine or glycine amino acids, such as and not limited to two proline amino acid residues (P).
  • the sequence of said neuroprotective peptide is SEQ ID NO: 2.
  • the linker or binding molecule will facilitate the detection of the peptide produced, such as and not limited to, an influenza hemagglutinin HA epitope whose sequence is SEQ ID NO: 7.
  • the sequence of said neuroprotective peptide is SEQ ID NO: 8.
  • linker or binding molecule refers to a structurally rigid sequence that joins two elements of a chimeric peptide, such as the internalization sequence and C-terminal domain of TrkB-T1, to grant them Maximum functional independence.
  • linker is selected from the following: short sequence of amino acids proline, threonine, serine or glycine. Even more preferably, said linker or binding molecule are two proline amino acid residues (P).
  • the linker or binding molecule can facilitate the detection of the peptide produced, such as and not limited to, an epitope of hemagglutinin HA of the influenza virus whose sequence is SEQ ID NO: 7.
  • the neuroprotective peptide object of the present invention is a chimeric peptide and is characterized by comprising:
  • the neuroprotective peptide object of the present invention is characterized in that the amino acid sequence SEQ ID NO: 1 and the amino acid sequence SEQ ID NO: 3 are fused by a linker to a binding molecule.
  • the neuroprotective peptide object of the present invention is a chimeric peptide having the sequence SEQ ID NO: 2 of 24 amino acids consisting of:
  • linker binding molecule is two proline amino acid residues (P).
  • chimeric peptide or “fusion protein” is understood in the present invention, a peptide created from the binding in a fusion gene of two or more genes or gene fragments, originally encoding separate peptides, but whose Translation results in an individual peptide with functional properties derived from each of the original peptides.
  • peptides or polypeptides whose amino acid sequence is identical or homologous to the sequences described in the present invention, as long as the ability to interact with "the interacting molecules with TrkB- ⁇ is maintained. ".
  • the percentage of identity is between 70-95%, even more preferably the percentage of identity is between 90-95%.
  • Protein or peptide fusion is a technique that is frequently used in molecular biology. It is usually related to the production of proteins or peptides in living systems, such as, but not limited to, bacteria, yeasts, or mammalian cells. The inclusion of the coding sequence of interest in phase, respecting the reading pattern, allows the production of a chimeric protein or peptide.
  • a fusion or chimeric peptide such as that of the present invention, is easily purified, using the characteristics of the proteins and peptides to bind to a chromatographic matrix, or to precipitate under certain conditions. Purification of a fusion peptide is easy by, for example, but not limited to, sepharose-glutathione columns which are known to one skilled in the art.
  • nucleotide sequence of the invention which encodes the peptide of the invention, or the nucleotide sequence complementary to said nucleotide sequence.
  • SEQ sequences. ID. NO: 5 and SEQ. ID. NO: 6 describe the nucleotide sequences from which the SEQ amino acid sequences are derived. ID. NO: 1, and SEQ. ID. NO: 3, respectively.
  • nucleotide sequence refers to a polymeric form of nucleotides of any length that may or may not be chemical or biochemically modified. They refer, therefore, to any polyiribonucleotide or polydeoxyribonucleotide, both single-stranded and double-stranded.
  • the nucleotide sequence of the invention can be obtained artificially by conventional cloning and selection methods widely known in the state of the art.
  • nucleotide sequence of the invention in addition to the coding sequence, can carry other elements, such as, but not limited to, introns, non-coding sequences at the 5 'or 3' ends, ribosome binding sites, or stabilizing sequences.
  • These polynucleotides can additionally also include coding sequences for additional amino acids that may be useful, for example, but not limited, to increase the stability of the peptide generated from it or to allow a better purification thereof.
  • Cloning of the nucleotide sequence of the invention can be performed using an expression vector or a plasmid.
  • These vectors comprise the nucleotide sequence of the invention or, where appropriate, the polynucleotide sequence encoding a carrier protein and the nucleotide sequence of the invention, and a series of amino acid sequences that are protease cleavage targets.
  • the advantage of this structure is that, once the fusion protein or peptide is produced, the expression system is lysed and purified by, for example, although without limitation, affinity chromatography, the carrier protein of the peptide of the invention can be cleaved by digestion with a protease and repurifying the peptide of the invention by the same chromatographic system.
  • the nucleotide sequences of the SEQ invention. ID. NO: 5 and SEQ. ID. NO: 6 can be inserted into a replicating vector for cloning (amplification of DNA) or for expression.
  • expression vectors are, but are not limited to, plasmids, cosmids, viral particles, that is, viral DNA or RNA vectors, or phages.
  • the nucleotide sequences of the invention can be inserted into these vectors by a series of procedures known to those skilled in the art. For example, the polynucleotide sequence is inserted at sites suitable for restriction endonuclease enzymes by standard techniques.
  • Vector components generally include, but are not limited to, one or more signal sequences, an origin of replication, one or more genetic markers, an "enhancer” element, a promoter and / or a transcription termination sequence.
  • the construction of appropriate vectors containing one or more of these components comprises standard ligation techniques, which are known to one skilled in the art.
  • an expression vector or plasmid of the invention comprising the nucleotide sequences of the SEQ invention. ID. NO: 5 and SEQ.ID. NO 6.
  • the expression vector or plasmid of the invention can be introduced, for example, but not limited, by transfection or transformation, into host cells, such as, but not limited to, plant, mammalian, bacterial, yeast or cell cells. insect.
  • the introduction of the expression vector or plasmid of the invention into the host cell can be carried out by any of the physical or biological methods to give rise to transformed or transfected cells.
  • Such biological methods include, but are not limited to, the use of viral DNA and RNA vectors.
  • the main advantage of physical methods is that they are not associated with oncogenic or pathological virus processes. However, physical methods are less accurate and often result in insertions of multiple copies, random integrations, disruption of own and foreign genetic sequences, as well as unpredictable expression.
  • mRNA messenger RNA
  • expression can take place in a host cell, but also by any process of protein expression in vivo.
  • nucleotide sequence of the invention as well as the expression vector of the invention, they can be introduced into a host cell for amplification or expression, from now on "host cell of the invention". Therefore, another aspect of the invention relates to a host cell comprising the nucleotide sequence of the invention or the expression vector of the invention.
  • host cell refers to any prokaryotic or eukaryotic organism that is the recipient of an expression vector, cloning or any other DNA molecule.
  • the host cells can be prokaryotic cells or bacterial host cells, such as but not limited to E. coli, or they can be eukaryotic host cells such as, but not limited to, plant cells, yeasts, or mammalian cells.
  • composition or medicament of the invention comprising an element selected from the following: a. the neuroprotective peptide of the invention,
  • the present invention also refers to the neuroprotective peptide object of the invention, as well as to the nucleotide sequence, the expression vector or plasmid, and the host cell of the invention, for use in medicine. Likewise, the present invention also refers to the use of the neuroprotective peptide object of the invention, as well as the nucleotide sequence, the expression vector or plasmid, and / or the host cell of the invention for the preparation or manufacture of a composition. Pharmaceutical or medication.
  • composition or medicament characterized by comprising the peptide of the invention, or the nucleotide sequence, the expression vector or plasmid , or the host cell of the invention.
  • the term: "medicament or pharmaceutical composition”, as used refers to any substance used for prevention, relief, treatment or cure of diseases in man and / or animals.
  • a pharmaceutical composition or a medicament characterized by comprising the neuroprotective peptide, and / or the nucleotide sequence, the expression vector or plasmid, and the host cell of the invention.
  • the pharmaceutical composition or medicament of the invention further comprises a pharmaceutically acceptable carrier or excipient.
  • the pharmaceutical composition or medicament of the invention further comprises an adjuvant.
  • the pharmaceutical composition or medicament of the invention further comprises another active ingredient.
  • excipient refers to a substance that helps the absorption of the elements of the composition of the invention, stabilizes said elements, activates or aids the preparation of the composition in the sense of giving it consistency or providing flavors that make it nicer.
  • the excipients could have the function of keeping the ingredients together, such as, for example, starches, sugars or cellulose, the sweetening function, the coloring function, the protective function of the composition, for example, to isolate it from air and / or moisture, the filling function of a tablet, capsule or any other form of presentation, such as, for example, is the case of dibasic calcium phosphate, the disintegrating function to facilitate the dissolution of the components and its absorption in the intestine, without excluding other types of excipients not mentioned in this paragraph.
  • vehicle like the excipient, is a substance that is used in the pharmaceutical composition or medicament to dilute any of the components of the present invention comprised therein to a certain volume or weight.
  • pharmaceutically acceptable carrier is an inert substance or action analogous to any of the elements of the present invention.
  • the function of the vehicle is to facilitate the incorporation of other elements, allow a better dosage and administration or give consistency and form to the composition.
  • the pharmacologically acceptable carrier is the diluent.
  • adjuvant refers to an agent that does not have a neuroprotective effect by itself, but that may interfere with the signaling mediated by the TrkB-T1 isoform of the neurotrophin receptor by increasing the neuroprotection of the pharmaceutical composition object of the invention.
  • Another object of the present invention is the use of the pharmaceutical composition to inhibit the union between TrkB-T1 and its interacting molecules in a neuron and / or glial cell.
  • Another object of the present invention is the use of the pharmaceutical composition or medicament of the invention for the prevention and / or treatment of neuronal damage.
  • neuronal damage refers to the processes of degeneration and neuronal death produced by pathologies of the SN in which the BDNF / TrkB survival pathway is altered, such as CNS pathologies associated with an excitotoxicity process, CVD, such as stroke or cerebral ischemia, or neuronal damage caused by lack of neurotrophic support, hypoxia, disconnection or mechanical damage such as brain and / or spinal trauma.
  • a preferred embodiment of the present invention refers to the use of the pharmaceutical composition or medicament of the invention for the prevention and / or treatment of neuronal damage caused by a CNS pathology associated with excitotoxicity in which the BDNF / TrkB survival pathway It is altered or inhibited.
  • excitotoxicity refers to the pathological process induced by the excessive or prolonged activation of the receptors for the excitatory neurotransmitter glutamate and which leads to a specific form of neuronal death.
  • CNS diseases associated with excitotoxicity refers to all those diseases of the nervous system in which the excitotoxicity process participates in its pathogenesis.
  • CNS diseases associated with excitotoxicity are selected from the following: hypoglycemia, epilepsy, acute trauma; neurodegenerative diseases such as Alzheimer's, Parkinson's, Huntington's diseases and amyotrophic lateral sclerosis (ALS); Neurological disorders characterized by hyperexcitability or neuronal hypersensitization such as some types of dyskinesias or neuropathic pain, and eye diseases, such as glaucoma, diabetic retinopathy, ischemic optic neuropathy or optic nerve trauma.
  • Another preferred embodiment of the present invention refers to the use of the pharmaceutical composition or medicament of the invention for the prevention and / or treatment of neuronal damage caused by CVD in which the BDNF / TrkB survival pathway is altered or inhibited. .
  • CVD Cerebrovascular diseases
  • the invention refers to a set of disorders of the cerebral vasculature that produce a decrease in cerebral blood flow, either in a focal or global way, and the consequent affectation of brain function in a transient or permanent way.
  • CVDs are selected from the following: stroke or cerebral infarction, transient ischemic attack, intracerebral hemorrhages, including subarachnoid and vascular dementia.
  • Another preferred embodiment of the present invention refers to the use of the pharmaceutical composition or medicament of the invention for the prevention and / or treatment of neuronal damage caused by cerebral ischemia.
  • Cerebral ischemia refers to cellular damage caused by a transient or permanent decrease in cerebral blood flow and the consequent decrease in the supply of oxygen and nutrients to the tissue.
  • Another preferred embodiment of the present invention refers to the use of the pharmaceutical composition or medicament of the invention for the prevention and / or treatment of neuronal damage caused by stroke or cerebral infarction.
  • stroke or cerebral infarction refers to the disease or stroke in which the BDNF / TrkB survival pathway may be altered or inhibited.
  • Another preferred embodiment of the present invention refers to the use of the pharmaceutical composition or medicament of the invention for the prevention and / or treatment of neuronal damage caused by brain and / or spinal trauma.
  • traumatic damage or cerebral and / or spinal trauma refers to the brain and / or spinal cord injury caused respectively by acute head and / or spinal trauma, preferably the route of BDNF / TrkB survival may be altered or inhibited.
  • Another preferred embodiment of the present invention refers to the use of the pharmaceutical composition or medicament of the invention, characterized in that it is used alone or in combination with other medicaments for thrombolytic therapy or to prevent and / or treat ischemic damage, as per for example, and in a non-limiting manner a medicament comprising at least one other neuroprotective peptide, preferably Tat-NR2B9c or NA-1.
  • thrombolytic therapy is to prevent and / or treat a stroke or cerebral ischemia.
  • other medications for thrombolytic therapy refers to those medications, primarily tPA, used for the treatment of cerebral or heart infarction that attempt to break or dissolve thrombi or clots present inside the blood vessels to restore normal blood flow.
  • other medicaments for preventing and / or treating ischemic damage refers to any substance capable of preventing, mitigating, delaying or blocking the biochemical processes that occur in the nervous system and cause neurodegeration, damage or Neural death as a result of reduced cerebral blood flow to insufficient levels to maintain the normal metabolism and functioning of your cells.
  • a medicament comprising at least one other neuroprotective peptide, preferably Tat-NR2B9c or NA-1.
  • the pharmaceutical composition or medicament of the invention is used in medicine.
  • it is used in the prevention and / or treatment of neuronal damage.
  • said neuronal damage is caused by a CNS pathology associated with excitotoxicity in which the BDNF / TrkB survival pathway is altered or inhibited.
  • said neuronal damage is caused by CVD in which the BDNF / TrkB survival pathway is altered or inhibited, or said neuronal damage is caused by brain and / or spinal trauma in which the BDNF survival pathway / TrkB may be altered or inhibited.
  • the pharmaceutical composition or medicament of the invention is used alone or in combination with other medicaments for thrombolytic therapy or to prevent and / or treat ischemic damage, such as, and not limited to a medicament comprising the Tat-NR2B9c or NA-1 neuroprotective peptide.
  • the neuroprotective peptide of the invention is used alone or in combination with other medicaments as a complement or adjuvant in a thrombolytic therapy or to prevent and / or treat ischemic damage, as for example, and not limiting a medication comprising the neuroprotective peptide Tat-NR2B9c or NA-1.
  • the present invention also comprises the use of the nucleotide sequence of the invention, the vector of the invention, the cell of the invention as well as the composition of the invention, as a complement or adjuvant in a thrombolytic therapy or to prevent and / or treat the damage Ischemic, such as, and not limited to, a drug comprising the neuroprotective peptide Tat-NR2B9c or NA-1. Even more preferably, thrombolytic therapy is to prevent and / or treat a stroke or cerebral ischemia.
  • Another aspect of the present invention refers to a method for inhibiting the binding between TrkB-T1 and its interacting molecules in neuronal and / or glial cells, characterized in that said method comprises the administration of a therapeutically effective amount of the neuroprotective peptide of the invention. , or the nucleotide sequence of the invention, or the vector of the invention, or the cell of the invention or the pharmaceutical composition or medicament of the invention.
  • Another aspect of the present invention refers to a method for the prevention and / or treatment of neuronal damage characterized by understanding the administration of a therapeutically effective amount of the pharmaceutical composition of the invention.
  • said neuronal damage is caused by a CNS pathology associated with excitotoxicity in which the BDNF / TrkB survival pathway is altered or inhibited.
  • said neuronal damage is caused by a CVD in which the BDNF / TrkB survival pathway is altered or inhibited, or said neuronal damage is caused by brain and / or spinal trauma, in which the BDNF survival pathway / TrkB may be altered or inhibited.
  • the present invention also refers to a method for the prevention and / or treatment of CVDs and CNS diseases associated with excitotoxicity, characterized by comprising the administration to the patient of a therapeutically acceptable amount of the neuroprotective peptide of the invention, of the nucleotide sequence. of the invention, the vector or plasmid of the invention, the cell of the invention or the composition of the invention.
  • the present invention also refers to a method for the prevention and / or treatment of cerebral ischemia and traumatic brain or spinal damage, characterized by comprising the administration to the patient of a therapeutically acceptable amount of the neuroprotective peptide of the invention, of the nucleotide sequence. of the invention, the vector or plasmid of the invention, the cell of the invention or the composition of the invention.
  • prevention is to avoid or reduce the occurrence of neuronal damage whose cause is the increase in TrkB-T1 levels that occurs when the BDNF / TrkB survival pathway is found. altered
  • treatment means combating the neuronal damage caused as a result of the increase in TrkB-T1 levels that occur when the BDNF / TrkB survival path is altered, to stabilize the condition of individuals or prevent subsequent damage.
  • therapeutically effective amount refers to the amount of peptide of the invention, of the nucleotide sequence of the invention, the vector of the invention, the cell of the invention or the composition of the invention. the invention, which produces the desired effect.
  • Another aspect of the present invention refers to a method for thrombolytic treatment characterized by comprising the administration of a therapeutically effective amount of the pharmaceutical composition of the invention employed alone or in combination with other medicaments for thrombolytic therapy. Even more preferably, thrombolytic therapy is to prevent and / or treat a stroke or cerebral ischemia.
  • Another aspect of the present invention refers to a method for preventing and / or treating ischemic damage characterized by understanding the administration of a therapeutically effective amount of the pharmaceutical composition of the invention used alone or in combination with other medicaments to prevent and / or treat Ischemic damage, such as, and not limited to, a medicament comprising at least one other neuroprotective peptide, preferably Tat-NR2B9c or NA-1.
  • the present invention also refers to a method for obtaining the neuroprotective peptide object of the invention.
  • the neuroprotective peptide object of the present invention can chemically synthesize me by methods widely known to one skilled in the art, the advantages of this synthesis is that the product obtained has greater purity.
  • the peptide grows on an insoluble polymer.
  • the peptide is released from the resin on which the chemical synthesis has been performed and purified until a high degree of purity is achieved by high performance liquid chromatography (HPLC), before proceeding to its purity analysis by spectrometry of masses (MALDI / TOF).
  • the peptide of the invention can be produced through its expression in a biological organism, that is, by its expression in a host cell, preferably through a method of expression in bacteria, and more preferably through a method of expression in bacteria with high yield (Zhou et al., 2012).
  • the present invention also refers to a method for obtaining the peptide object of the invention by its expression in bacterial host cells.
  • Said method comprises the following essential steps: i) the expression vector pGEX-2T (GE Healthcare, Life Sciences), which expresses glutathione-S-transferase (GST) is mutagenized in vitro to eliminate the aspartic-proline peptide bond (DP) ) present in position 177-178 of its sequence, which is labile in acidic conditions.
  • GST glutathione-S-transferase
  • DP aspartic-proline peptide bond
  • the vector produced pGEX-M
  • pGEX-M is used as a template to amplify by means of successive PCRs the GST gene fused in the open reading phase with coding sequences comprising, in this order: a. an aspartic-proline dipeptide (D-P) with a labile peptide bond under acidic conditions,
  • Tat transactivation sequence SEQ ID NO: 3
  • TrkB-T1 SEQ ID NO: 1
  • the product of the above PCR is digested with two restriction enzymes whose recognition sequences have been introduced at the two ends of the amplified DNA and subsequently subcloned into the pGEX-M vector replacing the original GST gene.
  • the bacterial host cells are transformed with the above expression vector to produce the fusion protein formed by GST and the neuroprotective peptide of the invention, followed by its purification and proteolysis under acidic conditions, and v) the purification of the neuroprotective peptide of the invention, for example Tat-HA-TrkB-T1 (SEQ ID NO: 8), is carried out by conventional methods known to one skilled in the art.
  • said method is characterized in that it comprises the following steps: i) PCR amplification of the sequence of a GST protein, previously mutated to replace its aspartic-proline amino acids at position 177-178, cloned into an expression vector or plasmid under the control of the promoter for T7 RNA polymerase, using two oligonucleotides, one direct complementary to the coding sequences of its N-terminal end comprising a unique site for a restriction enzyme, and another reverse comprising the coding sequences of the C-terminal end fused to sequences encoding the aspartic-proline dipeptide (DP), labile peptide bond under acidic conditions, a glycine and the coding sequences for the protein transduction domain of the HIV Tat protein (SEQ ID NO: 3) ; ii) the purified product of the first PCR is subjected to another amplification with the same direct and reverse oligonucleotide comprising coding sequences for the same
  • FIGURE 1 Sequence of Tat-T1 and Tat-Myc peptides.
  • the TrkB-T1 sequence corresponds to the 11 amino acids of its C-terminal end, postulated as responsible for the activation of intracellular signaling pathways characteristic of said isoform.
  • the sequence of the Myc protein used in the control peptide design is also shown.
  • FIGURE 2 Immunofluorescence showing the permeability of the Tat-T1 peptide in neurons.
  • Primary cultures of rat embryonic cortical neurons of 14 DIVs were incubated for 3 h with the FITC-labeled Tat-T1 peptide (5M) (fluorescein isothiocyanate) and compared with untreated cultures.
  • the fixed and permeabilized cells were analyzed by immunofluorescence with antibodies to the neuronal protein NeuN and treated with the DNA intercalating agent, DAPI.
  • the images correspond to unique sections of confocal microscopy. Scale bar: 10 M.
  • FIGURE 3 The regulation of TrkB in excitotoxicity is not modified by Tat-T1.
  • FIGURE 4 Neuroprotective effect of transduction of Tat-T1 peptides on neuronal death induced under conditions of excitotoxicity.
  • Primary neuronal cultures of 14 DIVs were incubated with Tat-Myc and Tat-T1 (5 M) and treated for 4 h with NMDA (100 M) and glycine (10 M).
  • NMDA 100 M
  • glycine 10 M
  • Statistical calculations were performed using the unpaired Student's t test (* p ⁇ 0.05).
  • TrkB-T1 peptides To facilitate the passage of TrkB-T1 peptides through the BHE and the plasma membrane, difficult to traverse due to their low permeability, transduction mediated by membrane permeable peptides has been used (Dietz and Bahr. 2004).
  • This technology allows very efficient introduction of bioactive compounds (small peptides, proteins or interfering RNAs) into almost all tissues, including the brain, so it is being used in different areas of neuroscience research for therapeutic purposes.
  • Other alternative methods for the administration of molecules with therapeutic properties such as microinjection, electroporation or gene therapy with viral vectors present problems due to their low transfer efficiency, and because they affect the integrity of the neuronal membrane and can induce immune responses unwished.
  • transducer capacity peptides are those derived from the basic domain of the HIV Tat transcription transactivator protein, those from the Drosophila melanogaster homeodomain Antennapedia protein, and related sequences rich in arginine.
  • Tat peptides have the advantage of presenting high efficiency of transduction both in vitro and in vivo with a short peptide sequence. Through this type of approach, different intracellular signaling pathways, some protein-protein interactions in intracellular complexes, protein kinase activation or protein processing have already been able to interfere. Additionally, Tat peptides are capable of crossing cell membranes even when they are associated with large peptides (for example, anti-apoptotic factor Bcl-xL, neurotrophic factor GDNF, or neuroglobin).
  • large peptides for example, anti-apoptotic factor Bcl-xL, neurotrophic factor GDNF, or neuroglobin.
  • the Tat-T1 neuroprotective peptide (Fig. 1) SEQ ID NO: 2, comprises the 1 C-terminal amino acids of TrkB-T1 (residues 466-476) fused after a basic domain of HIV Tat transactivating protein, sufficient to confer its permeability properties, separated by two proline residues.
  • a SEQ ID NO: 4 control peptide was synthesized using the amino acid-bound Tat sequence of the Myc protein (Tat-Myc). These peptides were synthesized by conventional chemical methods and, once released from the resin on which the synthesis is performed, were purified by high performance liquid chromatography (HPLC) before proceeding to their purity analysis by mass spectrometry (MALDI / TOF). All the peptides used had a degree of purity greater than 95%.
  • the cell suspension was centrifuged 5 min at 1000 rpm at room temperature, resuspended in culture medium and the cells were seeded at a density of 0.22 x 10 6 cells / cm 2 on coverslips coated with poly-L-lysine ( 10 g / ml) and laminin (4 g / ml). These cultures were maintained at 37 ° C, 5% C0 2 and 95% humidity for 14 days in vitro (IVDs), keeping at all times the original culture medium conditioned by the cells themselves. In order to inhibit the growth of glial cells, at 7 DIVs, arabinoside C (AraC, 10 M) was added, which blocks the growth of proliferative cells.
  • arabinoside C AraC, 10 M
  • the cells were then incubated for 30 min at room temperature with a solution of BSA (bovine serum albumin) at 1%, Triton X-100 0.5% in PBS.
  • BSA bovine serum albumin
  • Triton X-100 0.5% in PBS.
  • Incubation with the monoclonal antibody specific for the neuronal protein NeuN (US Biologicals) was performed for 18 h at 4 ° C in 1% BSA, 0.5% Triton X-100 in PBS and immunoreactivity was detected with secondary antibodies conjugated with Alexa Fluor -
  • TCS SP5 Confocal Laser Microscope Leica Microsystems HD, Wetziar, Germany
  • a plan-apochromatic immersion objective of 63 magnifications, using each of the channels separately.
  • the images shown are individual sections 0.5-1 ⁇ thick and were processed with image acquisition and analysis programs (Zen2009), Adobe Photoshop version 7.0 (Adobe Systems Inc, CA, USA) and ImageJ (NIH).
  • Tat-T1-FITC is able to enter the neurons present in the primary cultures marked by the neurospecific antibody NeuN (Fig. 2).
  • the lysis of the primary cultures was performed in RIPA buffer (10 mM Na 2 HP04, pH 7.2, NaCI 150 mM, 1% sodium deoxycholate, 1% NP-40, 0.1% SDS) with protease inhibitors (Complete Protease Inhibitor Cocktail, Roche, Indianapolis, IN, USA) for 30 min at 4 ° C.
  • the cell debris was removed by centrifugation at 14000 rpm for 30 min at 4 ° C and the protein concentration was quantified by the BCA reagent (Pierce, Rockford, IL, USA).
  • Equivalent amounts of protein (40 g) prepared in loading buffer for electrophoresis were denatured for 5 min at 99 ° C.
  • the proteins were electrophoretically separated in 10% SDS-PAGE gels, according to the Laemmli method, and as the preferable molecular weight markers (BlenchMark TM) were used.
  • the proteins were transferred to nitrocellulose membranes in submerged form at a current intensity of 400 mA (150 V) for 1 h and the membranes were stained with a solution of 1% Ponceau red, prepared in 1% acetic acid, to verify Transfer efficiency
  • TrkB a polyclonal antibody (anti-panTrkB, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) that recognizes an extracellular region common to all of them and also present in the product resulting from the processing of TrkB-FL by calpain.
  • Immunodetection was performed using peroxidase-conjugated secondary antibodies and the Perkin-Elmer bioluminescence reagent.
  • TrkB-T this band corresponds to TrkB-T1, plus other forms truncated from TrkB
  • Tat-T1 neuroprotective peptide does not prevent the increase in the levels of the TrkB-T1 isoform induced by the conditions of excitotoxicity and its mechanism of action should affect later stages of the neurotoxic process.
  • EXAMPLE 4 Interference analysis of the association of TrkB-T1 with RhoGDM protein by the neuroprotective peptide Tat-T1 in neurons.
  • TrkB-T1 with the RhoGDM protein, described above in astrocytes, also takes place in neurons in basal conditions and, if if it exists, said interaction is blocked by the Tat-T1 peptide.
  • the primary cultures of cortical neurons of 14 DIVs prepared in MEM medium with serum as indicated above were incubated with the Tat-Myc or Tat-T1 peptides (5 M) for 6 h, before proceeding to immunoprecipitation of the Rho-GDI protein with its specific antibodies (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) and the analysis of immunoprecipitated proteins by immunoblot.
  • Total protein lysates (approximately 600 ⁇ g; LT), prepared as above, were incubated under stirring at 4 ° C for 18 h with 2 ⁇ of the RhoGDI antibody and 20 ⁇ of 50% A-Sepharose protein in PBS. The samples were then centrifuged for 30 s at 12,000 rpm and, after collecting the supernatant (SBTE), the immunocomplexes were washed six times with RIPA buffer. Finally, the immunoprecipitate (IP) complexes were denatured in loading buffer, their fractionation into SDS-PAGE gels and immunoblot analysis as indicated above.
  • IP immunoprecipitate
  • the antibodies used in the immunoblot were the same RhoGDI antibody used in immunoprecipitation, and a polyclonal antibody specific for the TrkB-T1 isoform (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) that recognizes the 11 specific C-terminal amino acids for this isoform
  • EXAMPLE 5 Analysis of the neuroprotective effect of transduction of Tat-T1 peptides on neuronal death induced under conditions of excitotoxicity.
  • MTT tetrazolium salt reduction test [D, 3- (4, 5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium]
  • adding this compound 0.5 mg / ml
  • MTT is reduced due to activity mitochondrial cells with active metabolism, forming formazan crystals that are solubilized by dimethylsulfoxide (DMSO).
  • DMSO dimethylsulfoxide
  • the quantification of the formazan salts produced is carried out by spectrometry at 570 nm.
  • the contribution to the absorbance of glial cells in mixed cultures was established by exposure of 5 parallel cultures for 24 h at NMDA 400 ⁇ and glycine 10 ⁇ .
  • the previous results obtained with the Tat-T1 peptide have been validated in vivo using a mouse model of cerebral ischemia induced by phototrombosis.
  • the method consists of the photochemical induction of an intravascular thrombosis by intraperitoneal administration (10 mg / kg) of a photosensitive contrast compound (Rose Bengal) and irradiation with cold light (600 Ims, 3000 K) of the cortical region, to through the pial surface and the skull.
  • a photosensitive contrast compound Rose Bengal
  • Phototrombosis ischemia is a model of permanent ischemia that has the advantage of being less invasive and easier to address than
  • MCA middle cerebral artery
  • TTC triphenyltetrazolium chloride
  • SEQ ID NO: 1 Identifies the 1-amino acid C-terminal amino acid sequence of the TrkB-T1 truncated isoform of the TrkB neurotrophin receptor (amino acids 466-476, FVLFHKIPLDG).
  • the origin of the sequence can be: human, rat, mouse, horse, bull, rooster.
  • SEQ ID NO: 2 Identifies a corresponding 24 amino acid artificial sequence with the Tat-TrkB-T1 neuroprotective peptide comprising the sequence of a basic domain of the HIV Tat protein (SEQ ID NO: 3) of 1 1 amino acids, and the 1 1 C-terminal amino acids of the TrkB-T1 isoform of TrkB (SEQ ID NO: 1), separated by a linker formed by two proline residues (YGRKKRRQRRRPPFVLFHKIPLDG).
  • SEQ ID NO: 3 Identifies 1 1 amino acids of a basic domain of the Tat transactivator protein of the human immunodeficiency virus (HIV) that confers the permeability properties of this protein (amino acids 47-57, YGRKKRRQRRR).
  • SEQ ID NO: 4 Identifies a corresponding artificial sequence with 25 amino acids of a basic domain of the HIV Tat protein (SEQ ID No 3) fused with amino acids 408-421 of the c-Myc transcription factor (YGRKKRRQRRRAEEQKLISEEDLLR).
  • SEQ ID NO: 5 Identifies a nucleotide sequence (coding DNA) of 33 nucleotides that codes for the 11 amino acids of the C-terminal end of the truncated isoform TrkB-T1 of the TrkB neurotrophin receptor (amino acids 466-476, FVLFHKIPLDG; SEQ ID NO: 1) human, rat, mouse, horse, bull or rooster.
  • SEQ ID NO: 6 Identifies a nucleotide sequence (coding DNA) of 33 nucleotides that encodes for 1 1 amino acids of a basic domain of the HIV Tat transactivator protein that confers the permeability properties of this protein (amino acids 47-57, YGRKKRRQRRR; SEQ ID No: 3).
  • SEQ ID NO: 7 Identifies the amino acid sequence of the haemagglutinin HA epitope of influenza virus (amino acids 98-106, YPYDVPDYA), which will facilitate the detection of the peptide produced.
  • SEQ ID NO: 8 Identifies a 35 amino acid sequence of the Tat-HA-TrkB-T1 neuroprotective peptide produced in bacterial host cells after acid hydrolysis of the fusion protein, which comprises the sequence of a basic domain of the Tat protein of HIV (SEQ ID NO: 3) of 11 amino acids, and the 11 C-terminal amino acids of the TrkB-T1 isoform of TrkB (SEQ ID NO: 1), separated by a linker formed by the haemagglutinin HA epitope of the virus flu (PGYGRKKRRQRRRGYPYDVPDYAG FVLFHKIPLDG).
  • NMDA receptor subunits have differential roles in mediating excitotoxic neuronal death both in vitro and in vivo. J Neurosci 27: 2846-2857.
  • TrkB-T1 regulates the RhoA signaling and actin cytoskeleton in glioma cells. Biochem Biophys Res Commun 342: 867-74.

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Abstract

La presente invención hace referencia a un péptido neuroprotector, caracterizado por comprender los 11 aminoácidos C-terminalesde TrkB-T1 (residuos 466-476) (SEQ ID NO: 1) y ser capaz de interferir y/o inhibir la unión entre TrkB-T1 y sus moléculas interaccionantes en una neurona y/o célula glial. Así mismo, en la presente invención se protege el uso de dicho péptido neuroprotector para prevenir y/o tratar el daño neuronal en mamíferos causado por una enfermedad cerebrovascular o isquemia cerebral y/o por otra patología del SNC asociada a excitotoxicidad, y/o daño traumático cerebral y/o medular. También se protege una composición farmacéutica o medicamento caracterizado por comprender dicho péptido neuroprotector, así como el uso de los mismos en el tratamiento de enfermedades cerebrovasculares y otras patologías del SNC. Finalmente, se protege el método de obtención de dicho péptido neuroprotector.

Description

PÉPTIDO NEUROPROTECTOR ASÍ COMO SU USO EN EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES CEREBROVASCULARES Y OTRAS PATOLOGÍAS DEL SNC
DESCRIPCIÓN
SECTOR DE LA TÉCNICA
La presente invención se engloba en el sector farmacéutico, y en el sector de servicios públicos, sociales y colectivos. En concreto, la presente invención se dirige a compañías farmacéuticas que trabajan en el campo de la neuroproteccion, tanto referida a daños agudos (isquemia, trauma agudo) como crónicos (enfermedades neurodegenerativas).
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR La industria farmacéutica tiene gran interés en las patologías humanas de alta incidencia y de prevalencia creciente debido a los cambios demográficos y las mayores expectativas de vida. Las enfermedades cerebrovasculares (ECV) representan la segunda causa de muerte mundial, con 6, 15 millones de defunciones y un 10,8% del total (según datos recientes de la OMS del año 201 1). Así mismo, la isquemia cerebral es la segunda causa de demencia tras la enfermedad de Alzheimer, y el primer motivo de incapacidad en adultos.
La isquemia cerebral o ictus es un fenómeno que caracteriza a las ECVs y se define como la reducción por diferentes causas del aporte sanguíneo hasta unos niveles insuficientes para mantener el metabolismo y funcionamiento normales de las células cerebrales. Existen dos tipos de ictus según su origen: ictus hemorrágico, generado por la ruptura de un vaso cerebral, el espasmo vascular asociado a una hemorragia subaracnoidea y la hipertensión intracraneal, y el ictus isquémico, producido por la falta de riego sanguíneo en una región del cerebro debido a la presencia de un trombo o placa aterosclerótica. En el tejido afectado podemos diferenciar dos áreas: el núcleo del infarto, que sufre la reducción más severa de flujo sanguíneo y experimenta un daño irreversible, y la zona de penumbra isquémica, caracterizada por ser funcionalmente silente pero intacta desde el punto de vista estructural. Sin embargo, si el flujo sanguíneo no se recupera en un periodo de tiempo denominado ventana terapéutica, esta región puede sufrir procesos de degeneración neuronal secundaria que provocan la expansión del núcleo del infarto hacia la zona de penumbra isquémica. El único tratamiento aprobado en la práctica clínica frente al ictus isquémico es la trombólisis con el activador tisular del plasminógeno (tPA), que contribuye a la restauración del flujo sanguíneo cerebral mediante la disolución del coágulo que obstruye la arteria. No obstante, la terapia trombolítica da lugar con relativa frecuencia a hemorragias intracerebrales sintomáticas y, además, el tPA presenta una toxicidad asociada que incrementa la degeneración neuronal en modelos experimentales. Estos efectos adversos conllevan la existencia de numerosas contraindicaciones para este tipo de terapia, lo cual ocasiona un problema adicional: la ventana terapéutica en la que los beneficios del tratamiento son superiores a los riesgos se estrecha considerablemente, estando dentro de las 3-4 horas tras el comienzo de los síntomas. Esto supone que en España únicamente un 4% de los pacientes de un ictus isquémico puede beneficiarse del uso de compuestos trombolíticos. Por tanto, aún mejorando la evolución de algunos pacientes, el uso del tPA no está exento de riesgos, tiene un uso muy limitado y solo es eficaz en una estrecha ventana terapéutica. Entre las alternativas terapéuticas que se están tratando de desarrollar está la interferencia de las cascadas de señalización bioquímica inducidas por la ECV que conducen al daño isquémico y la muerte neuronal secundaria de la zona de penumbra. Reducir esta muerte neuronal secundaria sería extremadamente beneficioso porque permitiría atenuar el daño neurológico y el grado de discapacidad de los pacientes. El mecanismo fundamental de la muerte neuronal secundaria es la excitotoxicidad, el cual es un proceso inducido por el aumento de la concentración del neurotransmisor excitatorio glutamato en el espacio extracelular y la sobreactivación de sus receptores específicos, principalmente los de tipo N- metil-D-aspartato (NMDARs) (Olney, J.W. 1986). Por ello, la excitotoxicidad es una diana fundamental en la búsqueda de estrategias de neuroprotección. En el pasado, como primera aproximación, se utilizaron sobre todo fármacos que al unirse directamente a los NMDARs (antagonistas) o de manera indirecta (por ejemplo, inhibidores de la liberación de glutamato, antagonistas de los canales de calcio dependientes de voltaje) disminuían la sobreactivación del NMDAR. Sin embargo, estos fármacos mostraron resultados esperanzadores en modelos experimentales de isquemia pero fueron ineficaces en el tratamiento de la isquemia cerebral en humanos y, por tanto, no superaron los ensayos clínicos (Ikonomidou, C. & L. Turski. 2002). Un defecto común a la mayoría de estos fármacos es su falta de selectividad, motivada fundamentalmente por el desconocimiento de la naturaleza dual de los NMDARs, receptores que son críticos a un tiempo en procesos de supervivencia y de muerte celular (Hardingham, G.E., et al. 2002). Además, los NMDARs juegan también un papel preponderante en la transmisión sináptica y la comunicación neuronal del SNC, tanto durante el desarrollo como en su vida adulta, y son críticos en procesos vitales como el aprendizaje, la memoria, la plasticidad sináptica y la sinaptogénesis. Debido a ello, los fármacos desarrollados anteriormente en general bloquean tanto la activación fisiológica del NMDAR como la patológica y, por tanto, tienen efectos secundarios sobre el aprendizaje y producen somnolencia, alucinaciones o incluso coma.
El interés por desarrollar nuevos fármacos capaces de reducir el proceso excitotóxico va mucho más allá de las ECVs, ya que las alteraciones funcionales del NMDAR son también causantes de la degeneración o muerte neuronal en un gran número de patologías neurológicas, como son la hipoglucemia, epilepsia y el trauma agudo (Choi, D.W. et al, 1988). Además, la excitotoxicidad también aparece asociada a ciertas enfermedades neurodegenerativas como las enfermedades de Alzheimer, Parkinson, Huntington y la esclerosis lateral amiotrófica (ALS). En general, todas estas enfermedades carecen de tratamientos etiológicos y las terapias utilizadas son sintomáticas o paliativas. Así, por ejemplo, en casos moderados o graves de la enfermedad de Alzheimer se está utilizando un antagonista no-competitivo del NMDAR de desarrollo más reciente, la memantina, que presenta cierta eficacia en la reducción de la excitotoxicidad asociada a dicha enfermedad (Chen, H.S. & S.A. Lipton. 2006). Por último, la excitotoxicidad también es crítica en trastornos neurológicos caracterizados por hiperexcitabilidad o hipersensibilización neuronal (algunos tipos de disquinesias, dolor neuropático), y patologías oculares (glaucoma, retinopatía diabética, neuropatía óptica isquémica y traumatismos del nervio óptico).
Las regiones citoplásmicas C-terminales de las subunidades del NMDAR son necesarias para su reclutamiento y agrupamiento correcto en la densidad posináptica (PSD) y su funcionalidad. Son particularmente importantes los 4 aminoácidos C-terminales de las subunidades GluN2A y GluN2B, que constituyen un ligando capaz de interaccionar con los dominios PDZ presentes en diversas proteínas de la PSD, como PSD-95. Esta proteína de andamiaje es muy abundante en la PSD y presenta diversos dominios de interacción proteína-proteína incluyendo 3 secuencias PDZ. Mediante la conexión entre receptores de membrana, como el NMDAR, y múltiples proteínas efectoras, como la enzima óxido nítrico sintasa neuronal (nNOS), PSD-95 organiza la puesta en marcha de distintas vías de señalización intracelular así como la interacción del NMDAR con el citoesqueleto neuronal. En isquemia cerebral, PSD-95 acopla la sobreactivación del NMDAR con la activación de la nNOS y la formación de NO, molécula crítica para la neurotoxicidad. Partiendo de la hipótesis de que los NMDARs formados por subunidades GluN2B están implicados mayoritariamente en la señalización hacia la muerte neuronal, mientras que los constituidos por subunidades GluN2A facilitan la supervivencia (Liu et al., 2007), se ha tratado de disociar específicamente los complejos GluN2B-PSD-95-nNOS como una forma de reducir el daño neuronal en modelos de isquemia cerebral. Para ello, se ha generado un péptido de 20 aminoácidos que contiene los últimos 9 aminoácidos del extremo C-terminal de las subunidades GluN2B fusionado al dominio de transducción de la proteína Tat del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) (Aarts, M., et al. 2002). Esta pequeña secuencia de la proteína Tat es capaz de conferir la permeabilidad a través de la membrana plasmática y la barrera hematoencefálica (BHE) a aquellos péptidos que la comprenden (Dietz & Bahr. 2004). El péptido neuroprotector generado (Tat-NR2B9c o NA-1), al interaccionar con PSD-95, es capaz de disociar el complejo GluN2B-PSD-95-nNOS y reducir el daño isquémico en modelos murinos y de primates (Aarts, M., et al. 2002), encontrándose en proceso de validación clínica (US 2010/0137224 A1 y Dolgin, E. 2012). Aunque prometedora, esta aproximación terapéutica no está exenta de posibles complicaciones ya que la asociación entre la sobreactivación de los NMDARs extrasinápticos, formados fundamentalmente por subunidades GluN2B, y la muerte neuronal es un tema controvertido (Papouin et al., 2012) y, además, esta subunidad tiene un papel importante en los potenciales beneficiarios de esta terapia en individuos adultos: la plasticidad sináptica y la formación de la memoria (Brigman et al., 2010).
En neuronas existen otros mecanismos alternativos de control de la supervivencia neuronal relacionados funcionalmente con los mecanismos regulados por el NMDAR, aunque diferentes a ellos, y que también resultan alterados en condiciones patológicas. Así, por ejemplo, las neurotrofinas, como el BDNF (brain-derived neurotrophlc factor), regulan procesos fundamentales del SNC como la supervivencia neuronal, la liberación de neurotransmisores, la expresión génica o la trasmisión sináptica. Mediante la unión a su receptor de alta afinidad TrkB-FL, el BDNF induce la dimerización y transfosforilación del mismo, y la activación de diversas cascadas de señalización intracelular pro-supervivencia.
El ARNm de TrkB codifica para la isoforma TrkB-FL completa, que es el receptor TrkB activo. Pero además, este ARNm codifica para varias isoformas truncadas (TrkB-T1 , TrkB-T2 y TrkB- T-Shc) carentes del dominio tirosina-quinasa que participan en la modulación del receptor TrkB- FL. Particularmente, la isoforma truncada TrkB-T1 bloquea la función del receptor activo TrkB- FL mediante la competición por la unión del BDNF o la formación de heterodímeros inactivos TrkB-FL/TrkB-T1. Sin embargo, la isoforma truncada TrkB-T1 parece tener otras funciones independientes del receptor activo TrkB-FL que aún no se han definido completamente, que incluyen: el control de la morfología celular y la activación de vías de señalización intracelular propias (Fenner B.M. 2012). En concreto, la isoforma truncada TrkB-T1 comprende el mismo dominio extracelular, región transmembrana y primeros 12 aminoácidos intracelulares que la isoforma TrkB-FL completa. Sin embargo, los 11 aminoácidos C-terminales de TrkB-T1 constituyen una secuencia específica de esta isoforma truncada, que se encuentra altamente conservada en mamíferos (Shelton et al., 1995) y podría tener una función biológica importante en los mismos. Por ejemplo, en astrocitos, la interacción de la secuencia de 1 1 aminoácidos C- terminales de la isoforma truncada TrkB-T1 con la proteína RhoGDH (Rho GDP dissociation inhibitor) media la inhibición de RhoA, una GTPasa que regula de forma Ca2+-dependiente la activación de la MAPK (mitogen-activated protein kinase) p38, acoplada a la muerte neuronal en condiciones de excitotoxicidad (Ohira et al., 2006). Sin embargo, la interacción de TrkB-T1 con RhoGDH u otras proteínas aún no ha sido investigada en neuronas.
Por otro lado, la reducción del soporte neurotrófico también es un componente importante en la patogénesis de numerosas patologías del SNC. En enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer, Parkinson, Huntington o esclerosis lateral amiotrófica se han observado niveles alterados de BDNF y TrkB, y una disminución en la señalización (Dawbarn & Alien 2003). También se han observado alteraciones de la vía BDNF/TrkB en esquizofrenia, modelos de síndrome de Down o estados depresivos y de estrés (Dawbarn & Alien 2003). Recientemente, se ha demostrado que la vía BDNF/TrkB está inhibida en situaciones de excitotoxicidad e isquemia cerebral transitoria (Vidaurre O.G. et al, 2012). En concreto, se ha observado la modificación en sentido opuesto de los niveles neuronales de las isoformas TrkB- FL y TrkB-T1 mediante dos mecanismos: la inversión del balance entre los ARNm de las isoformas TrkB-FL y TrkB-T1 da lugar a un aumento en la expresión de TrkB-T1 , mientras que la proteólisis por calpaína de TrkB-FL reduce los niveles del receptor activo y produce una proteína truncada de tamaño similar a TrkB-T1 y que, al igual que ella, podría actuar como un dominante negativo (Vidaurre O.G. et al, 2012). Además de en los modelos experimentales, el aumento de TrkB-T1 también ha podido observarse en necropsias de pacientes fallecidos a consecuencia de una ECV. Mediante el uso de vectores lentivirales que revierten el desbalance entre las isoformas de TrkB se ha conseguido prevenir parcialmente la muerte por excitotoxicidad in vitro, demostrando que los cambios en la expresión de TrkB son fundamentales en este proceso de muerte neuronal (Vidaurre O.G. et al, 2012). Como mecanismos responsables de la muerte neuronal en excitotoxicidad e isquemia se ha propuesto un efecto dominante negativo de TrkB-T1 sobre la función de TrkB-FL, y quizá también la forma procesada de TrkB-FL, el secuestro de la neurotrofina o mecanismos propios inducidos por TrkB-T1. Estos resultados apuntan a los receptores de neurotrofinas, como el BDNF, como posibles dianas terapéuticas en numerosas patologías del SNC con un componente excitotóxico. Actualmente sigue existiendo la necesidad de desarrollar productos neuroprotectores, como por ejemplo péptidos, para su uso en métodos de tratamiento y prevención del daño neuronal causado por patologías del SN en las que se encuentra alterada la vía de supervivencia BDNF/TrkB, como pueden ser patologías del SNC asociadas con un proceso de excitotoxicidad, las ECVs, como el ictus o la isquemia cerebral, o bien daño neuronal causado por falta de soporte neurotrófico, hipoxia, desconexión o daño mecánico como consecuencia de traumatismos cerebrales y/o medulares. Dichos métodos de tratamiento y prevención terapéuticos podrían constituir también un complemento y/o alternativa a las actuales terapias trombolíticas, las únicas existentes hoy en día para el ictus o la isquemia cerebral.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención demuestra que cuando se produce un aumento de los niveles de TrkB- T1 inducido por excitotoxicidad, los efectos negativos sobre la viabilidad neuronal están mediados al menos parcialmente por interacciones proteicas específicas establecidas por su secuencia C-terminal única de 11 aminoácidos (SEQ ID NO: 1). Estas interacciones han sido interferidas mediante un péptido neuroprotector permeable a la membrana plasmática que comprende la secuencia C-terminal de TrkB-T1 y previsiblemente compite con la propia TrkB- T1 por la unión a su/s proteína/s interaccionante/s. A pesar de que la excitotoxicidad sigue produciendo un desbalance entre las isoformas TrkB-FL y TrkB-T1 , en la presente invención se demuestra que la administración de este péptido neuroprotector a los cultivos de neuronas corticales previene la disminución de la viabilidad neuronal producida por la alteración de la vía de supervivencia BDNF/TrkB, demostrando el efecto neuroprotector de dicho péptido. Estos resultados desvelan una nueva estrategia de neuroproteccion para prevenir y/o tratar el daño neuronal causado por patologías del SN en las que se encuentra alterada la vía de supervivencia BDNF/TrkB, como pueden ser ECVs (isquemia cerebral) y otras patologías del SNC agudas (hipoglucemia, epilepsia y daño traumático cerebral y/o medular) o patologías del SNC crónicas asociadas con un proceso de excitotoxicidad (enfermedades neurodegenerativas).
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La presente invención hace referencia a un péptido neuroprotector, a partir de ahora denominado "péptido neuroprotector objeto de la presente invención" o "péptido neuroprotector de la invención", caracterizado por que comprende los 11 aminoácidos C-terminales de TrkB- T1 (residuos 466-476) (SEQ ID NO: 1). El péptido neuroprotector de la invención ha sido diseñado para interferir y/o inhibir la unión entre TrkB-T1 y sus moléculas interaccionantes en una neurona y/o célula glial, siendo potencialmente capaz de reducir el daño neuronal en mamíferos causado por patologías del SN en las que se encuentra alterada la vía de supervivencia BDNF/TrkB, como pueden ser ECVs (isquemia cerebral) y otras patologías agudas del SNC (hipoglucemia, epilepsia y daño traumático cerebral y/o medular) o patologías crónicas del SNC asociadas con un proceso de excitotoxicidad (enfermedades neurodegenerativas). La expresión: "péptido neuroprotector", tal y como se emplea en la presente invención, hace referencia a una secuencia de aminoácidos capaz de prevenir, mitigar o retrasar los procesos bioquímicos que ocurren en el sistema nervioso y originan neurodegeración o muerte neuronal de tipo apoptótica o necrótica. La presente invención se basa en el descubrimiento del efecto neuroprotector frente al daño neuronal en mamíferos mediado por la interferencia de las interacciones proteicas entre TrkB- T1 y sus moléculas interaccionantes.
La expresión: "moléculas interaccionantes con TrkB-T1", tal y como se emplea en la presente invención, hace referencia a aquellas moléculas capaces de asociarse de forma transitoria o constitutiva con la isoforma TrkB-T1 del receptor de neurotrofinas TrkB en una neurona y/o célula glial. Dentro del alcance de la presente invención, "las moléculas interaccionantes con TrkB-T1" también podrían establecer interacciones con los péptidos cuya secuencia de aminoácidos sea idéntica u homologa a las secuencias descritas en la presente invención, siempre y cuando se mantenga la citada capacidad de establecer interacciones con "las moléculas interaccionantes con TrkB-Τ ". Preferentemente, el porcentaje de identidad es entre 70-95%, aún más preferentemente el porcentaje de identidad es entre 90-95%.
Preferentemente dicho péptido neuroprotector comprende un agente de internalización, como por ejemplo y de forma no limitante, un dominio básico de la proteína transactivadora Tat del HIV que confiere las propiedades de permeabilidad propias de esta proteína (aminoácidos 47- 57) (SEQ ID NO: 3).
En la presente invención, el término: "agente de internalización" hace referencia a una molécula capaz de facilitar el paso de un péptido determinado a través de la barrera hematoencefálica y la membrana plasmática para permitir su acceso al interior de las neuronas y/o células gliales. Preferentemente, dicho agente de internalización es un dominio básico de la proteína transactivadora Tat del HIV que confiere las propiedades de permeabilidad propias de esta proteína (aminoácidos 47-57) (SEQ ID NO: 3). En una realización particular de la presente invención, el péptido neuroprotector objeto de la presente invención comprende también un linker o una molécula de unión. Preferentemente, el linker o molécula de unión es una secuencia corta de aminoácidos prolina, treonina, serina o glicina, como por ejemplo y de forma no limitante, dos residuos aminoacídicos de prolina (P). En una realización aún más preferente de la presente invención, la secuencia de dicho péptido neuroprotector es SEQ ID NO: 2.
De manera alternativa, el linker o molécula de unión facilitará la detección del péptido producido, como por ejemplo y de forma no limitante, un epítopo de hemaglutinina HA del virus de la gripe cuya secuencia es SEQ ID NO: 7. En una realización aún más preferente de la presente invención, la secuencia de dicho péptido neuroprotector es SEQ ID NO: 8.
En la presente invención, el término: linker o "molécula de unión" hace referencia a una secuencia estructuralmente rígida que une dos elementos de un péptido quimérico, como por ejemplo la secuencia de internalización y dominio C-terminal de TrkB-T1 , para concederles la máxima independencia funcional. Preferentemente dicho linker se selecciona de entre los siguientes: secuencia corta de aminoácidos prolina, treonina, serina o glicina. Aún más preferentemente, dicho linker o molécula de unión son dos residuos aminoacídicos de prolina (P). De manera alternativa, el linker o molécula de unión puede facilitar la detección del péptido producido, como por ejemplo y de forma no limitante, un epítopo de hemaglutinina HA del virus de la gripe cuya secuencia es SEQ ID NO: 7.
En otra realización particular de la presente invención, el péptido neuroprotector objeto de la presente invención, es un péptido quimérico y se caracteriza por comprender:
i. la secuencia de 1 1 aminoácidos de un dominio básico de la proteína Tat de HIV (SEQ ID NO: 3), fusionada con
¡i. la secuencia de 11 aminoácidos del dominio C-terminal de TrkB-T1 (SEQ ID NO:
1).
Preferentemente, el péptido neuroprotector objeto de la presente se caracteriza por que la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1 y la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 3 se encuentran fusionadas mediante un linkero una molécula de unión. Aún más preferente, el péptido neuroprotector objeto de la presente invención, es un péptido quimérico que presenta la secuencia SEQ ID NO: 2 de 24 aminoácidos que consiste en:
i. la secuencia de 1 1 aminoácidos de un dominio básico de la proteína Tat de HIV (SEQ ID NO: 3), fusionada con
¡i. la secuencia de 11 aminoácidos del dominio C-terminal de TrkB-T1 (SEQ ID NO:
1),
donde dicho linkero molécula de unión son dos residuos aminoacídicos de prolina (P). Como "péptido quimérico" o "proteína de fusión" se entiende en la presente invención, un péptido creado a partir de la unión en un gen de fusión de dos o más genes o fragmentos de genes, que originalmente codifican para péptidos separados, pero cuya traducción resulta en un péptido individual con propiedades funcionales derivadas de cada una de los péptidos originales. Dentro del alcance de la presente invención también se incluyen los péptidos o polipéptidos cuya secuencia de aminoácidos sea idéntica u homologa a las secuencias descritas en la presente invención, siempre y cuando se mantenga la capacidad de establecer interacciones con "las moléculas interaccionantes con TrkB-ΤΊ". Preferentemente, el porcentaje de identidad es entre 70-95%, aún más preferentemente el porcentaje de identidad es entre 90- 95%.
La fusión proteica o peptídica es una técnica que se emplea frecuentemente en biología molecular. Habitualmente está relacionada con la producción de proteínas o péptidos en sistemas vivos, como por ejemplo, aunque sin limitarnos, en bacterias, levaduras, o células de mamífero. La inclusión de la secuencia codificante de interés en fase, respetando la pauta de lectura, permite la producción de una proteína o péptido quimérico.
Un péptido de fusión o quimérico, como el de la presente invención, se purifica con facilidad, empleando para ello las características de las proteínas y los péptidos de unirse a una matriz cromatográfica, o de precipitar en ciertas condiciones. La purificación de un péptido de fusión es fácil mediante, por ejemplo, aunque sin limitarnos, columnas de sefarosa-glutation las cuales son conocidas por un experto en la materia.
Debido a la degeneración del código genético, en el cual diversos tripletes de nucleótidos dan lugar a un mismo aminoácido, existen diversas secuencias de nucleótidos que dan lugar a una misma secuencia aminoacídica. Por ello, otro aspecto de la invención se refiere a una secuencia nucleotídica aislada, de ahora en adelante "secuencia nucleotídica de la invención", que codifica para el péptido de la invención, o a la secuencia nucleotídica complementaria a dicha secuencia nucleotídica. Las secuencias SEQ. ID. NO: 5 y SEQ. ID. NO: 6 describen las secuencias nucleotídicas a partir de las cuales derivan las secuencias aminoacídicas SEQ. ID. NO: 1 , y SEQ. ID. NO: 3, respectivamente.
Los términos "secuencia nucleotídica", "secuencia de nucleótidos", "ácido nucleico", "oligonucleótido" y "polinucleótido" se usan aquí de manera intercambiable y se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud que pueden estar o no, química o bioquímicamente modificados. Se refieren, por tanto, a cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, tanto de cadena sencilla como de doble hebra.
La secuencia nucleotídica de la invención puede obtenerse de manera artificial mediante métodos de clonación y selección convencional ampliamente conocidos en el estado de la técnica.
La secuencia nucleotídica de la invención, adicionalmente a la secuencia codificante, puede llevar otros elementos, como por ejemplo aunque sin limitarse, intrones, secuencias no codificantes en los extremos 5' o 3', sitios de unión a ribosomas, o secuencias estabilizadoras. Estos polinucleótidos adicionalmente también pueden incluir secuencias codificantes para aminoácidos adicionales que pueden ser útiles, por ejemplo, aunque sin limitarse, para aumentar la estabilidad del péptido generado a partir de él o para permitir una mejor purificación del mismo.
El clonaje de la secuencia nucleotídica de la invención se puede realizar empleando un vector de expresión o un plásmido. Estos vectores comprenden la secuencia nucleotídica de la invención o, en su caso, la secuencia polinucleotídica codificante para una proteína portadora y la secuencia nucleotídica de la invención, y una serie de secuencias de aminoácidos que son dianas de corte de proteasas. La ventaja de esta estructura es que, una vez producida la proteína o péptido de fusión, lisado el sistema de expresión y purificada ésta mediante, por ejemplo, aunque sin limitarnos, cromatografía de afinidad, se puede escindir la proteína portadora del péptido de la invención mediante digestión con una proteasa y repurificar el péptido de la invención mediante el mismo sistema cromatográfico.
Las secuencias nucleotídicas de la invención SEQ. ID. NO: 5 y SEQ. ID. NO: 6 pueden ser insertadas en un vector replicante para su clonación (amplificación del ADN) o para su expresión. Ejemplos de vectores de expresión son, aunque sin limitarnos, plásmidos, cósmidos, partículas virales, es decir, vectores de ADN o ARN virales, o fagos. Las secuencias nucleotídicas de la invención pueden ser insertadas en estos vectores mediante una serie de procedimientos conocidos por el experto en la materia. Por ejemplo, la secuencia polinucleotídica se inserta en sitios adecuados para enzimas endonucleasas de restricción mediante técnicas estándar. Los componentes del vector generalmente incluyen, pero no están limitados a, una o más secuencia de señales, un origen de replicación, uno o más marcadores genéticos, un elemento "enhancer", un promotor y/o una secuencia de terminación de la transcripción. La construcción de vectores apropiados que contengan uno o más de estos componentes comprende técnicas de ligación estándar, las cuales son conocidas por un experto en la materia.
Por ello, otro aspecto de la invención se refiere a un vector de expresión o plásmido, de ahora en adelante "vector de expresión o plásmido de la invención", que comprenden las secuencias nucleotídicas de la invención SEQ. ID. NO: 5 y SEQ.ID. NO: 6.
El vector de expresión o plásmido de la invención puede ser introducido, por ejemplo, aunque sin limitarnos, mediante transfección o transformación, en células hospedadoras, como son, aunque sin limitarse a ellas, células vegetales, de mamífero, bacterias, levaduras o células de insecto. La introducción del vector de expresión o plásmido de la invención en la célula hospedadora se puede llevar a cabo mediante cualquiera de los métodos físicos o biológicos para dar lugar a células transformadas o transfectadas. Dichos métodos biológicos incluyen, pero sin limitarse, el uso de vectores de ADN y ARN virales. La principal ventaja de los métodos físicos reside en que éstos no están asociados con procesos oncogénicos ni patológicos de virus. Sin embargo, los métodos físicos son menos precisos y, a menudo, resultan en inserciones de múltiples copias, integraciones aleatorias, interrupción de secuencias genéticas propias y foráneas, así como expresión impredecible. Entre los vectores virales más usados para la introducción de genes en células de mamífero, se encuentran, vectores de poxvirus, de herpes simplex, adenovirus, vectores asociados a adenovirus, etc. El término "expresión" se refiere al proceso por el cual se sintetiza un polipéptido a partir de un polinucleótido. Incluye la transcripción del polinucleótido en un ARN mensajero (ARNm) y la traducción de dicho ARNm en una proteína, polipéptido o péptido. La expresión puede tener lugar en una célula hospedadora, pero también mediante cualquier proceso de expresión proteica in vivo.
La secuencia nucleotídica de la invención así como el vector de expresión de la invención, pueden introducirse en una célula hospedadora para su amplificación o expresión, a partir de ahora "célula hospedadora de la invención". Por ello, otro aspecto de la invención se refiere a una célula hospedadora que comprende la secuencia nucleotídica de la invención o el vector de expresión de la invención.
El término "célula hospedadora" o "célula huésped", tal y como se utilizan en la presente descripción se refiere a cualquier organismo procariota o eucariota que es recipiente de un vector de expresión, de clonación o de cualquier otra molécula de ADN. Las células hospedadoras pueden ser células procariotas o células hospedadoras bacterianas, como por ejemplo pero sin limitarse a, E. coli, o pueden ser células hospedadoras eucarióticas como por ejemplo, aunque sin limitarse a, células vegetales, levaduras, o células de mamífero.
Otro aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica o medicamento, de ahora en adelante "composición farmacéutica o medicamento de la invención", que comprende un elemento seleccionado de entre los siguientes: a. el péptido neuroprotector de la invención,
b. la secuencia nucleotídica de la invención,
c. el vector de expresión o plásmido de la invención, o
d. la célula hospedadora de la invención.
La presente invención también hace referencia al péptido neuroprotector objeto de la invención, así como a la secuencia nucleotídica, el vector de expresión o plásmido, y la célula hospedadora de la invención, para su uso en medicina. Así mismo, la presente invención también hace referencia al uso del péptido neuroprotector objeto de la invención, así como a la secuencia nucleotídica, el vector de expresión o plásmido, y/o la célula hospedadora de la invención para la preparación o fabricación de una composición farmacéutica o medicamento.
Por tanto, otro aspecto de la presente invención es una composición farmacéutica o medicamento, a partir de ahora "composición farmacéutica o medicamento de la invención", caracterizado por comprender el péptido de la invención, o la secuencia nucleotídica, el vector de expresión o plásmido, o la célula hospedadora de la invención.
En la presente invención, el término: "medicamento o composición farmacéutica", tal y como se usa hace referencia a cualquier sustancia usada para prevención, alivio, tratamiento o curación de enfermedades en el hombre y/o los animales. En el contexto de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica o un medicamento caracterizado por comprender el péptido neuroprotector, y/o la secuencia nucleotídica, el vector de expresión o plásmido, y la célula hospedadora de la invención. En una realización preferida, la composición farmacéutica o medicamento de la invención además comprende un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. En una realización más preferida, la composición farmacéutica o medicamento de la invención además comprende un adyuvante. En una realización aun más preferida, la composición farmacéutica o medicamento de la invención además comprende otro principio activo.
El término "excipiente" hace referencia a una sustancia que ayuda a la absorción de los elementos de la composición de la invención, estabiliza dichos elementos, activa o ayuda a la preparación de la composición en el sentido de darle consistencia o aportar sabores que la hagan más agradable. Así pues, los excipientes podrían tener la función de mantener los ingredientes unidos, como por ejemplo es el caso de almidones, azúcares o celulosas, la función de endulzar, la función de colorante, la función de protección de la composición, como por ejemplo, para aislarla del aire y/o la humedad, la función de relleno de una pastilla, cápsula o cualquier otra forma de presentación, como por ejemplo, es el caso del fosfato de calcio dibásico, la función desintegradora para facilitar la disolución de los componentes y su absorción en el intestino, sin excluir otro tipo de excipientes no mencionados en este párrafo.
El término "vehículo", al igual que el excipiente, es una sustancia que se emplea en la composición farmacéutica o medicamento para diluir cualquiera de los componentes de la presente invención comprendidos en ella hasta un volumen o peso determinado. El "vehículo farmacológicamente aceptable" es una sustancia inerte o de acción análoga a cualquiera de los elementos de la presente invención. La función del vehículo es facilitar la incorporación de otros elementos, permitir una mejor dosificación y administración o dar consistencia y forma a la composición. Cuando la forma de presentación es líquida, el vehículo farmacológicamente aceptable es el diluyente.
En esta memoria, el término "adyuvante" se refiere a un agente que no posea un efecto neuroprotector por sí mismo, pero que pueda interferir la señalización mediada por la isoforma TrkB-T1 del receptor de neurotrofinas incrementando la neuroprotección de la composición farmacéutica objeto de la invención.
Otro objeto de la presente invención es el uso de la composición farmacéutica para inhibir la unión entre TrkB-T1 y sus moléculas interaccionantes en una neurona y/o célula glial.
Otro objeto de la presente invención es el uso de la composición farmacéutica o medicamento de la invención para la prevención y/o tratamiento del daño neuronal.
La expresión: "daño neuronal", tal y como se emplea en la presente invención, hace referencia a los procesos de degeneración y muerte neuronal producidos por patologías del SN en las que se encuentra alterada la vía de supervivencia BDNF/TrkB, como pueden ser patologías del SNC asociadas con un proceso de excitotoxicidad, las ECVs, como el ictus o la isquemia cerebral, o bien daño neuronal causado por falta de soporte neurotrófico, hipoxia, desconexión o daño mecánico como traumatismos cerebrales y/o medulares.
Una realización preferente de la presente invención, hace referencia al uso de la composición farmacéutica o medicamento de la invención para la prevención y/o tratamiento del daño neuronal causado por una patología del SNC asociada a excitotoxicidad en la que la vía de supervivencia BDNF/TrkB se encuentra alterada o inhibida.
En la presente invención, el término: "excitotoxicidad" hace referencia al proceso patológico inducido por la activación excesiva o prolongada de los receptores para el neurotransmisor excitatorio glutamato y que conduce a una forma de muerte neuronal específica. La expresión: "enfermedades del SNC asociadas a excitotoxicidad", tal y como se emplea en la presente invención, hace referencia a todas aquellas enfermedades del sistema nervioso en las que el proceso de excitotoxicidad participa en su patogénesis. Preferentemente, las enfermedades del SNC asociadas a excitotoxicidad se seleccionan de entre las siguientes: hipoglucemia, epilepsia, trauma agudo; enfermedades neurodegenerativas como las enfermedades de Alzheimer, Parkinson, Huntington y la esclerosis lateral amiotrófica (ALS); trastornos neurológicos caracterizados por hiperexcitabilidad o hipersensibilización neuronal como son algunos tipos de disquinesias o el dolor neuropático, y patologías oculares, como el glaucoma, retinopatía diabética, neuropatía óptica isquémica o traumatismos del nervio óptico.
Otra realización preferente de la presente invención, hace referencia al uso de la composición farmacéutica o medicamento de la invención para la prevención y/o tratamiento del daño neuronal causado por una ECV en la que la vía de supervivencia BDNF/TrkB se encuentra alterada o inhibida.
La expresión: "enfermedades cerebrovasculares (ECVs)", tal y como se emplea en la presente invención, hace referencia a un conjunto de trastornos de la vasculatura cerebral que producen una disminución del flujo sanguíneo cerebral, ya sea de forma focal o global, y la consecuente afectación de la función cerebral de manera transitoria o permanente. Preferentemente, las ECVs se seleccionan de entre las siguientes: ictus o infarto cerebral, ataque isquémico transitorio, hemorragias intracerebrales, incluyendo la subaracnoidea y la demencia vascular.
Otra realización preferente de la presente invención, hace referencia al uso de la composición farmacéutica o medicamento de la invención para la prevención y/o tratamiento del daño neuronal causado por isquemia cerebral.
En la presente invención, el término: "isquemia cerebral" hace referencia al daño celular producido por una disminución transitoria o permanente del flujo sanguíneo cerebral y la consecuente disminución del aporte de oxígeno y nutrientes al tejido. Otra realización preferente de la presente invención, hace referencia al uso de la composición farmacéutica o medicamento de la invención para la prevención y/o tratamiento del daño neuronal causado por ictus o infarto cerebral.
En la presente invención, el término: "ictus o infarto cerebral" hace referencia a la enfermedad o accidente cerebrovascular en el que la vía de supervivencia BDNF/TrkB puede encontrarse alterada o inhibida.
Otra realización preferente de la presente invención, hace referencia al uso de la composición farmacéutica o medicamento de la invención para la prevención y/o tratamiento del daño neuronal causado por un traumatismo cerebral y/o medular.
En la presente invención, el término: "daño traumático o traumatismo cerebral y/o medular" hace referencia a la lesión cerebral y/o de la médula espinal causada respectivamente por un traumatismo agudo craneoencefálico y/o de columna vertebral, preferentemente la vía de supervivencia BDNF/TrkB puede encontrarse alterada o inhibida.
Otra realización preferente de la presente invención, hace referencia al uso de la composición farmacéutica o medicamento de la invención, caracterizado por que se emplea sólo o en combinación con otros medicamentos para terapia trombolítica o para prevenir y/o tratar el daño isquémico, como por ejemplo, y de manera no limitante un medicamento que comprenda al menos otro péptido neuroprotector, preferentemente Tat-NR2B9c o NA-1. En una realización aún más preferente, la terapia trombolítica es para prevenir y/o tratar un ictus o isquemia cerebral.
En la presente invención, el término: "otros medicamentos para terapia trombolítica" hace referencia a aquellos medicamentos, fundamentalmente el tPA, utilizados para el tratamiento del infarto cerebral o de corazón que tratan de romper o disolver trombos o coágulos presentes en el interior de los vasos sanguíneos para restablecer el flujo sanguíneo normal.
En la presente invención, el término: "otros medicamentos para prevenir y/o tratar el daño isquémico" hace referencia a cualquier sustancia capaz de prevenir, mitigar, retrasar o bloquear los procesos bioquímicos que ocurren en el sistema nervioso y originan neurodegeración, daño o muerte neuronal como consecuencia de la reducción del flujo sanguíneo cerebral hasta unos niveles insuficientes para mantener el metabolismo y funcionamiento normales de sus células. Como por ejemplo, y de manera no limitante un medicamento que comprenda al menos otro péptido neuroprotector, preferentemente Tat-NR2B9c o NA-1.
En una realización preferente, la composición farmacéutica o medicamento de la invención se usa en medicina. Preferentemente, se usa en la prevención y/o tratamiento del daño neuronal. Aún más preferentemente, dicho daño neuronal es causado por una patología del SNC asociada a excitotoxicidad en la que la vía de supervivencia BDNF/TrkB se encuentra alterada o inhibida. Alternativamente, dicho daño neuronal es causado por una ECV en la que la vía de supervivencia BDNF/TrkB se encuentra alterada o inhibida, o bien dicho daño neuronal es causado por un traumatismo cerebral y/o medular en el que la vía de supervivencia BDNF/TrkB puede encontrarse alterada o inhibida.
En otra realización preferente, la composición farmacéutica o medicamento de la invención se emplea sólo o en combinación con otros medicamentos para terapia trombolítica o para prevenir y/o tratar el daño isquémico, como por ejemplo, y de manera no limitante un medicamento que comprenda el péptido neuroprotector Tat-NR2B9c o NA-1. Así mismo, en otra realización preferente, el péptido neuroprotector de la invención se usa sólo o en combinación con otros medicamentos como complemento o adyuvante en una terapia trombolítica o para prevenir y/o tratar el daño isquémico, como por ejemplo, y de manera no limitante un medicamento que comprenda el péptido neuroprotector Tat-NR2B9c o NA-1. La presente invención también comprende el uso de la secuencia nucleotídica de la invención, el vector de la invención, la célula de la invención así como a la composición de la invención, como complemento o adyuvante en una terapia trombolítica o para prevenir y/o tratar el daño isquémico, como por ejemplo, y de manera no limitante un medicamento que comprenda el péptido neuroprotector Tat-NR2B9c o NA-1.. Aún más preferentemente, la terapia trombolítica es para prevenir y/o tratar un ictus o isquemia cerebral. Otro aspecto de la presente invención hace referencia a un método para inhibir la unión entre TrkB-T1 y sus moléculas interaccionantes en células neuronales y/o gliales, caracterizado por que dicho método comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva del péptico neuroprotector de la invención, o la secuencia nucleotídica de la invención, o el vector de la invención, o la célula de la invención o la composición farmacéutica o medicamento de la invención.
Otro aspecto de la presente invención hace referencia a un método para la prevención y/o el tratamiento del daño neuronal caracterizado por comprender la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición farmacéutica de la invención. Aún más preferentemente, dicho daño neuronal es causado por una patología del SNC asociada a excitotoxicidad en la que la vía de supervivencia BDNF/TrkB se encuentra alterada o inhibida. Alternativamente, dicho daño neuronal es causado por una ECV en la que la vía de supervivencia BDNF/TrkB se encuentra alterada o inhibida, o bien dicho daño neuronal es causado por un traumatismo cerebral y/o medular, en el que la vía de supervivencia BDNF/TrkB puede encontrarse alterada o inhibida.
La presente invención también hace referencia a un método para la prevención y/o el tratamiento de ECVs y enfermedades del SNC asociadas a excitotoxicidad, caracterizado por comprender la administración al paciente de una cantidad terapéuticamente aceptable del péptido neuroprotector de la invención, de la secuencia nucleotídica de la invención, el vector o plásmido de la invención, la célula de la invención o de la composición de la invención.
La presente invención también hace referencia a un método para la prevención y/o el tratamiento de isquemia cerebral y daño traumático cerebral o medular, caracterizado por comprender la administración al paciente de una cantidad terapéuticamente aceptable del péptido neuroprotector de la invención, de la secuencia nucleotídica de la invención, el vector o plásmido de la invención, la célula de la invención o de la composición de la invención.
El término "prevención", tal como se entiende en la presente invención, consiste en evitar o reducir la aparición de daños neuronales cuya causa es el aumento de los niveles de TrkB-T1 que se produce cuando la vía de supervivencia BDNF/TrkB se encuentra alterada. El término "tratamiento" supone combatir los daños neuronales causados como consecuencia del aumento de los niveles de TrkB-T1 que se produce cuando la vía de supervivencia BDNF/TrkB se encuentra alterada, para estabilizar el estado de los individuos o prevenir daños posteriores. En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad de péptido de la invención, de la secuencia nucleotídica de la invención, el vector de la invención, la célula de la invención o de la composición de la invención, que produzca el efecto deseado. Otro aspecto de la presente invención hace referencia a un método para el tratamiento trombolítico caracterizado por comprender la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición farmacéutica de la invención empleada sola o combinada con otros medicamentos para terapia trombolítica. Aún más preferentemente, la terapia trombolítica es para prevenir y/o tratar un ictus o isquemia cerebral.
Otro aspecto de la presente invención hace referencia a un método para prevenir y/o tratar el daño isquémico caracterizado por comprender la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición farmacéutica de la invención empleada sola o combinada con otros medicamentos para prevenir y/o tratar el daño isquémico, como por ejemplo, y de manera no limitante un medicamento que comprenda al menos otro péptido neuroprotector, preferentemente Tat-NR2B9c o NA-1.
La presente invención también hace referencia a un método para la obtención del péptido neuroprotector objeto de la invención.
El péptido neuroprotector objeto de la presente invención puede sintetizarme químicamente mediante métodos ampliamente conocidos por un experto en la materia, las ventajas de esta síntesis es que el producto obtenido presenta mayor pureza. En los métodos químicos convencionales, el péptido crece sobre un polímero insoluble. Una vez sintetizado, el péptido es liberado de la resina sobre la que se ha realizado la síntesis química y se purifica hasta conseguir un elevado grado de pureza mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), antes de proceder al análisis de su pureza mediante espectrometría de masas (MALDI/TOF). Alternativamente, el péptido de la invención puede producirse a través de su expresión en un organismo biológico, es decir, mediante su expresión en una célula hospedadora, preferentemente a través de un método de expresión en bacterias, y más preferentemente a través de un método de expresión en bacterias con alto rendimiento (Zhou et al., 2012).
Por tanto, la presente invención también hace referencia a un método para la obtención del péptido objeto de la invención mediante su expresión en células hospedadoras bacterianas. Dicho método comprende las siguientes etapas esenciales: i) el vector de expresión pGEX-2T (GE Healthcare, Life Sciences), que expresa la glutation-S-transferasa (GST) se mutageniza in vitro para eliminar el enlace peptídico aspártico-prolina (D-P) presente en posición 177-178 de su secuencia, que es lábil en condiciones ácidas. ii) el vector producido (pGEX-M) se utiliza como molde para amplificar mediante PCRs sucesivas el gen GST fusionado en fase de lectura abierta con secuencias codificantes que comprenden, en este orden: a. un dipéptido aspártico-prolina (D-P) con un enlace peptídico lábil en condiciones ácidas,
b. un aminoácido de glicina (G) utilizado como linker,
c. al menos una secuencia de transactivación de Tat (SEQ ID NO: 3),
d. otro aminoácido de glicina (G) utilizado también como linker,
e. al menos una secuencia del epítopo de hemaglutinina HA del virus de la gripe (aminoácidos 98-106), que facilitará la detección del péptido producido (SEQ ID NO: 7),
f. otro aminoácido de glicina (G) utilizado como linker,
g. al menos una secuencia correspondiente a los 11 aminoácidos C-terminales de TrkB-T1 (SEQ ID NO: 1), y
h. un codón para la terminación de la traducción. iii) el producto de la PCR anterior se digiere con dos enzimas de restricción cuyas secuencias de reconocimiento se han introducido en los dos extremos del DNA amplificado y posteriormente subclonado en el vector pGEX-M sustituyendo al gen GST original. iv) las células hospedadoras bacterianas se transforman con el vector de expresión anterior para producir la proteína de fusión formada por GST y el péptido neuroprotector de la invención, seguida de su purificación y proteólisis en condiciones ácidas, y v) la purificación del péptido neuroprotector de la invención, por ejemplo Tat-HA-TrkB-T1 (SEQ ID NO: 8), se realiza por métodos convencionales conocidos por un experto en la materia. En una realización preferente, dicho método se caracteriza por que comprende las siguientes etapas: i) amplificación mediante PCR de la secuencia de una proteína GST, previamente mutada para sustituir sus aminoácidos aspártico-prolina en posición 177-178, clonada en un vector de expresión o plásmido bajo el control del promotor para la RNA-polimerasa T7, usando dos oligonucleótidos, uno directo complementario a las secuencias codificantes de su extremo N- terminal comprendiendo un sitio único para una enzima de restricción, y otro reverso que comprende las secuencias codificantes del extremo C-terminal fusionado a secuencias que codifican el dipéptido aspártico-prolina (D-P), enlace peptídico lábil en condiciones ácidas, una glicina y las secuencias codificantes para el dominio de transduccion proteica de la proteína Tat de HIV (SEQ ID NO: 3); ii) el producto purificado de la primera PCR se somete a otra amplificación con el mismo oligonucleótido directo y otro reverso que comprende secuencias codificantes para la misma proteína Tat de HIV (SEQ ID NO: 3), una glicina y un epítopo de hemaglutinina HA (SEQ ID NO: 7) que facilitará la detección del péptido producido; iii) el producto purificado de la segunda PCR se somete a otra amplificación con los mismos oligonucleótidos directo y otro reverso que comprende parte de las secuencias codificantes para el epítopo HA (SEQ ID NO: 7) fusionadas a secuencias codificantes para una glicina y las secuencias codificantes para los 1 1 aminoácidos C-terminales de TrkB-T1 (SEQ ID NO: 1) y un sitio único de reconocimiento para una enzima de restricción; iv) digestión del producto de la tercera PCR con las dos enzimas de restricción introducidas mediante los oligonucleótidos, y subclonaje en el vector de expresión; v) comprobación del plásmido obtenido mediante secuenciación; vi) transformación de la cepa BL21 (DE3) pLysS de E. coli con el vector obtenido y aislamiento de una colonia; vii) crecimiento bacteriano e inducción de la expresión de la proteína GST fusionada al péptido neuroprotector objeto de la presente invención; viii) purificación de la proteína de fusión anterior; ix) separación mediante proteólisis ácida y purificación del péptido neuroprotector objeto de la presente invención.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Las siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
FIGURA 1. Secuencia de los péptidos Tat-T1 y Tat-Myc. Las secuencias correspondientes a la proteína Tat de HIV, común a los dos péptidos, se muestra en negrita. La secuencia de TrkB- T1 (caja gris) corresponde a los 11 aminoácidos de su extremo C-terminal, postulados como responsables de la activación de vías de señalización intracelular propias de dicha isoforma. Se muestra también la secuencia de la proteína Myc usada en el diseño del péptido control.
FIGURA 2. Inmunofluorescencia mostrando la permeabilidad del péptido Tat-T1 en neuronas. Cultivos primarios de neuronas corticales embrionarias de rata de 14 DIVs fueron incubados durante 3 h con el péptido Tat-T1 (5 M) marcado con FITC (isotiocianato de fluoresceina) y comparados con cultivos sin tratar. Las células fijadas y permeabilizadas se analizaron mediante inmunofluorescencia con anticuerpos para la proteína neuronal NeuN y se trataron con el agente intercalante de DNA, DAPI. Las imágenes corresponden a secciones únicas de microscopía confocal. Barra de escala: 10 M.
FIGURA 3. La regulación de TrkB en excitotoxicidad no se ve modificada por Tat-T1.
Cultivos primarios de neuronas corticales de 14 DIVs fueron tratados con NMDA (100 M) y glicina (10 M) durante 1 , 3 o 5 h en presencia de los péptidos Tat-Myc o Tat-T1 (5 M). Los extractos proteicos se analizaron por immunoblot con un anticuerpo que reconoce una región extracelular de TrkB presente en todas sus isoformas así como en las formas truncadas de TrkB-FL producidas por acción de la calpaína (TrkB-T).
FIGURA 4. Efecto neuroprotector de la transducción de los péptidos Tat-T1 sobre la muerte neuronal inducida en condiciones de excitotoxicidad. Cultivos primarios neuronales de 14 DIVs fueron incubados con Tat-Myc y Tat-T1 (5 M) y tratados durante 4 h con NMDA (100 M) y glicina (10 M). La viabilidad neuronal se midió por el ensayo de MTT y los resultados se presentan como valores relativos respecto a los obtenidos en los cultivos control no tratados con NMDA e incubados con el péptido control, a los que arbitrariamente se asignó un valor del 100%. Se muestran valores de viabilidad media ± s.e.m. (n=6). Los cálculos estadísticos se realizaron mediante el test de la t de Student desapareada (*p<0,05).
EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos específicos que se proporcionan en este documento de patente sirven para ilustrar la naturaleza de la presente invención. Estos ejemplos se incluyen solamente con fines ilustrativos y no han de ser interpretados como limitaciones a la invención que aquí se reivindica. Por tanto, los ejemplos descritos más adelante ilustran la invención sin limitar el campo de aplicación de la misma. EJEMPLO 1. Método de obtención del péptido neuroprotector Tat-T1
Para facilitar el paso de los péptidos de TrkB-T1 a través de la BHE y la membrana plasmática, difíciles de atravesar debido a su baja permeabilidad, se ha utilizado la transducción mediada por péptidos permeables a la membrana (Dietz and Bahr. 2004). Esta tecnología permite introducir de forma muy eficiente compuestos bioactivos (péptidos de pequeño tamaño, proteínas o RNAs interferentes) en casi todos los tejidos, incluyendo al cerebro, por lo que está siendo utilizada en distintas áreas de la investigación en neurociencias con fines terapéuticos. Otros métodos alternativos para la administración de moléculas con propiedades terapéuticas, como la microinyección, la electroporación o la terapia génica con vectores virales presentan problemas debido a su baja eficiencia de transferencia, y porque afectan a la integridad de la membrana neuronal y pueden inducir respuestas inmunes no deseadas.
Entre los péptidos con capacidad transductora más utilizados están los derivados del dominio básico de la proteína transactivadora de la transcripción Tat de HIV, los de la proteína homeodomínio Antennapedia de Drosophila melanogaster, y secuencias relacionadas ricas en arginina. Entre ellos, los péptidos Tat tienen la ventaja de presentar elevada eficiencia de transducción tanto in vitro como in vivo con una secuencia peptídica corta. Mediante este tipo de aproximación ya se han podido interferir distintas vías de señalización intracelular, algunas interacciones proteína-proteína en complejos intracelulares, la activación de proteínas quinasa o el procesamiento de proteínas. Adicionalmente, los péptidos Tat son capaces de cruzar las membranas celulares incluso cuando están asociados a péptidos grandes (por ejemplo, el factor anti-apoptótico Bcl-xL, el factor neurotrófico GDNF, o la neuroglobina).
El péptido neuroprotector Tat-T1 (Fig. 1) SEQ ID NO: 2, comprende los 1 1 aminoácidos C- terminales de TrkB-T1 (residuos 466-476) fusionados tras un dominio básico de la proteína transactivadora Tat de HIV, suficiente para conferir sus propiedades de permeabilidad, separados por dos residuos de prolina. Además, se sintetizó un péptido control SEQ ID NO: 4 utilizando la secuencia Tat unida a aminoácidos de la proteína Myc (Tat-Myc). Estos péptidos fueron sintetizados por métodos químicos convencionales y, una vez liberados de la resina sobre la que se realiza la síntesis, fueron purificados mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) antes de proceder al análisis de su pureza mediante espectrometría de masas (MALDI/TOF). Todos los péptidos utilizados presentaban un grado de pureza superior al 95%.
EJEMPLO 2. Comprobación de la permeabilidad del péptido neuroprotector Tat-T1 en neuronas
Los cultivos primarios de neuronas corticales se prepararon a partir de embriones de rata Wistar a día E18 siguiendo protocolos establecidos. Brevemente, tras la retirada de las meninges, las cortezas cerebrales se diseccionaron y disociaron mecánicamente en 4 mi de medio de cultivo MEM [complementado con NaHC03 28.5 mM, glucosa 22.2 mM, glutamax 0.1 mM, suero bovino fetal (FBS) 5% y suero de caballo (HS) 5%] con ayuda de una pipeta. A continuación, la suspensión celular se centrifugó 5 min a 1000 rpm a temperatura ambiente, se resuspendió en medio de cultivo y las células se sembraron a una densidad de 0.22 x 106 células/cm2 sobre cubreobjetos recubiertos con poli-L-lisina (10 g/ml) y laminina (4 g/ml). Estos cultivos se mantuvieron a 37°C, 5% C02 y 95% de humedad durante 14 días in vitro (DIVs), conservando en todo momento el medio de cultivo original condicionado por las propias células. Con objeto de inhibir el crecimiento de las células gliales, a los 7 DIVs se añadió arabinósido C (AraC, 10 M), que bloquea el crecimiento de las células proliferativas.
A continuación, para confirmar la permeabilidad a la membrana plasmática neuronal del péptido neuroprotector Tat-T1 , éste fue conjugado por métodos convencionales con el compuesto fluorescente FITC (Tat-T1-FITC) y añadido durante 3 h a los cultivos de 14 DIVs (5 μΜ) (Fig. 2). En paralelo, se procesaron cultivos iguales que no fueron tratados con péptido (control). Terminada la incubación, las células se fijaron con paraformaldehído 4% en PBS (NaCI 136 mM, KCI 2 mM, Na2HP04 8 mM, pH 7.4) durante 30 min a 37°C. Para conseguir su 5 permeabilización y bloqueo, las células se incubaron seguidamente durante 30 min a temperatura ambiente con una solución de BSA (albúmina de suero bovino) al 1 %, Tritón X-100 0.5% en PBS. La incubación con el anticuerpo monoclonal específico para la proteína neuronal NeuN (US Biologicals) se realizó durante 18 h a 4°C en BSA al 1 %, Tritón X-100 0.5% en PBS y la inmunoreactividad fue detectada con anticuerpos secundarios conjugados con Alexa Fluor-
10 546 (Molecular Probes, Invitrogen-Life Technologies, Carisbad, CA, EEUU) incubados durante 2 h a temperatura ambiente y diluidos de igual manera. Los núcleos celulares se tiñeron con el agente intercalante de DNA, DAPI. Los cubreobjetos se montaron con medio de montaje Prolong Gold (Invitrogen-Life Technologies, Carisbad, CA, EEUU) sobre los portaobjetos. Las imágenes de microscopía confocal se adquirieron con un microscopio confocal invertido Leica
15 TCS SP5 Láser Confocal Microscope (Leica Microsystems HD, Wetziar, Alemania) con un objetivo plan-apocromático de inmersión de 63 aumentos, utilizando cada uno de los canales de forma separada. Las imágenes que se muestran son secciones individuales de 0.5-1 μηι de grosor y fueron procesadas con los programas de adquisición y análisis de imagen (Zen2009), Adobe Photoshop versión 7.0 (Adobe Systems Inc, CA, EEUU) e ImageJ (NIH).
20
Se observó que, en estas condiciones, Tat-T1-FITC es capaz de introducirse en las neuronas presentes en los cultivos primarios marcadas por el anticuerpo neuroespecífico NeuN (Fig. 2).
EJEMPLO 3. Análisis de la alteración del balance TrkB-FL/TrkB-T1 inducida por la 25 sobreactivación del NMDAR en presencia del péptido neuroprotector Tat-T1
A continuación se analizó si la alteración del balance TrkB-FL/TrkB-T1 inducida por la sobreactivación del NMDAR (Vidaurre O.G. et al, 2012) era modificaba en algún modo por la presencia del péptido Tat-T1 (Fig. 3). Los cultivos primarios preparados como anteriormente y 30 crecidos en placa fueron tratados con los co-agonistas del NMDAR, NMDA (100 μΜ) y glicina (10μΜ) para inducir el proceso de excitotoxicidad in vitro durante tiempos variables (1-5 h). Los cultivos fueron incubados previamente con los péptidos Tat-Myc o Tat-T1 (5 μΜ) durante 30 min y permanecieron en el medio de cultivo durante el tratamiento con los agonistas del NMDAR.
35
La lisis de los cultivos primarios se realizó en tampón RIPA (Na2HP04 10 mM, pH 7.2, NaCI 150 mM, deoxicolato sódico 1 %, NP-40 1 %, SDS 0,1 %) con inhibidores de proteasas (Complete Protease Inhibitor Cocktail, Roche, Indianapolis, IN, EEUU) durante 30 min a 4°C. Los restos celulares se eliminaron mediante centrifugación a 14000 rpm durante 30 min a 4°C y la concentración proteica se cuantificó mediante el reactivo BCA (Pierce, Rockford, IL, EEUU). Cantidades equivalentes de proteína (40 g) preparadas en tampón de carga para electroforesis se desnaturalizaron durante 5 min a 99°C. Las proteínas se separaron electroforéticamente en geles de SDS-PAGE al 10%, según el método de Laemmli, y como marcadores de peso molecular se utilizaron proteínas preteñidas (BlenchMark™). Las proteínas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa en forma sumergida a una intensidad de corriente de 400 mA (150 V) durante 1 h y las membranas se tiñeron con una solución de rojo Ponceau al 1 %, preparado en ácido acético al 1 %, para verificar la eficiencia de la transferencia.
Una vez eliminada la tinción con rojo Ponceau, las membranas se lavaron con TBS-T (Tris-CI 20 mM, pH 7.5, NaCI 137 mM, Tween-20 005%) y se bloquearon a temperatura ambiente durante 30 min con solución de bloqueo (leche de vaca desnatada en polvo 5% preparada en TBS-T). A continuación, los niveles de las distintas isoformas de TrkB fueron analizados mediante incubación en solución de bloqueo con un anticuerpo policlonal (anti-panTrkB, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EEUU) que reconoce una región extracelular común a todas ellas y también presente en el producto resultante del procesamiento de TrkB-FL por calpaína. La inmunodeteccion se realizó utilizando anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa y el reactivo de bioluminiscencia de Perkin-Elmer.
Comparados con las células no tratadas con NMDA, la inducción del proceso de excitotoxicidad dio lugar a una reducción en los niveles de TrkB-FL y un aumento de las formas truncadas (TrkB-T, esta banda corresponde a TrkB-T1 , más otras formas truncadas de TrkB), de manera muy similar en los cultivos pre-tratados con el péptido Tat-Myc o Tat-T1. Por tanto, la presencia del péptido neuroprotector Tat-T1 no impide el aumento en los niveles de la isoforma TrkB-T1 inducida por las condiciones de excitotoxicidad y su mecanismo de acción debe afectar a etapas posteriores del proceso neurotóxico.
EJEMPLO 4. Análisis de interferencia de la asociación de TrkB-T1 con la proteína RhoGDM mediante el péptido neuroprotector Tat-T1 en neuronas.
Seguidamente se analizó si la interacción de TrkB-T1 con la proteína RhoGDM , descrita anteriormente en astrocitos, tiene también lugar en neuronas en condiciones básales y, caso de existir, dicha interacción es bloqueada por el péptido Tat-T1. Para ello, los cultivos primarios de neuronas corticales de 14 DIVs preparados en medio MEM con suero como se indicó anteriormente fueron incubados con los péptidos Tat-Myc o Tat-T1 (5 M) durante 6 h, antes de proceder a la inmunoprecipitación de la proteína Rho-GDI con sus anticuerpos específicos (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EEUU) y el análisis de las proteínas inmunoprecipitadas mediante immunoblot. Lisados proteicos totales (aproximadamente 600 μg; LT), preparados como anteriormente, fueron incubados en agitación a 4°C durante 18 h con 2 μΙ del anticuerpo RhoGDI y 20 μΙ de proteína A-Sepharosa al 50% en PBS. A continuación, las muestras se centrifugaron durante 30 s a 12000 rpm y, tras recoger el sobrenadante (SBTE), se procedió al lavado de los inmunocomplejos seis veces con tampón RIPA. Finalmente, se procedió a la desnaturalización de los complejos inmunoprecipitados (IP) en tampón de carga, su fraccionamiento en geles SDS-PAGE y análisis mediante immunoblot como se indicó anteriormente. Los anticuerpos utilizados en el immunoblot fueron el mismo anticuerpo RhoGDI utilizado en la inmunoprecipitación, y un anticuerpo policlonal específico para la isoforma TrkB- T1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EEUU) que reconoce los 11 aminoácidos C- terminales específicos para esta isoforma.
El mismo experimento se realizó en cultivos primarios crecidos como se indicó anteriormente pero usando el medio Neurobasal (NB; Invitrogen-Life Technologies, Carslbad, CA, USA) con suplemento B-27 y libre de suero. En estas condiciones se obtienen cultivos neuronales prácticamente puros, siendo el porcentaje de células gliales mucho menor que el obtenido en los cultivos mixtos preparados en medio MEM.
EJEMPLO 5. Análisis del efecto neuroprotector de la transducción de los péptidos Tat-T1 sobre la muerte neuronal inducida en condiciones de excitotoxicidad.
Investigamos seguidamente si, aún produciéndose el incremento en los niveles de TrkB-T1 , la interferencia mediante el péptido Tat-T1 de sus interacciones proteicas específicas era capaz de reducir la muerte neuronal inducida por excitotoxicidad (Fig. 5). Para ello se realizaron seis experimentos independientes en los que cultivos primarios neuronales preparados como se indicó en medio MEM con suero fueron pre-incubados durante 30 min con los péptidos Tat-Myc y Tat-T1 (5 μΜ), y tratados a continuación con NMDA (100 μΜ) y glicina (10 μΜ) durante 5 h para inducir el proceso de excitotoxicidad.
La viabilidad neuronal se estableció por el ensayo de reducción de la sal de tetrazolio MTT [D, 3-(4, 5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5-difeniltetrazolio], añadiendo este compuesto (0.5 mg/ml) al medio de cultivo e incubando las células durante 2 h a 37 °C. El MTT es reducido debido a la actividad mitocondrial de las células con metabolismo activo, formando cristales de formazán que son solubilizados mediante dimetilsulfóxido (DMSO). La cuantificación de las sales de formazán producidas se realiza mediante espectrometría a 570 nm. La contribución a la absorbancia de las células gliales existentes en los cultivos mixtos se estableció por exposición de cultivos 5 paralelos durante 24 h a NMDA 400 μΜ y glicina 10 μΜ. En estas condiciones se induce la muerte neuronal prácticamente por completo, sin afectar a la viabilidad de las células gliales. Posteriormente, para calcular la viabilidad de las neuronas sometidas o no a distintos tratamientos, dicho valor fue sustraído de todas las medidas realizadas. Para cada uno de los seis experimentos independientes, las medidas de viabilidad fueron realizadas en triplicado.
10 Los resultados se representan como valores relativos respecto a los obtenidos en los cultivos control tratados con Tat-Myc pero no NMDA. Como puede observarse, los datos obtenidos muestran que los cultivos tratados con Tat-T1 presentan a una mayor viabilidad neuronal respecto a los incubados con el péptido control. Así, la viabilidad de los cultivos tratados 4 h con NMDA en presencia de Tat-Myc es del 23 ± 7%, mientras que estos valores alcanzaron el
15 42 ± 9% en los cultivos tratados con Tat-T1 , siendo esta diferencia estadísticamente significativa (p<0.05).
EJEMPLO 6. Validación in vivo de los resultados obtenidos
20 Los resultados anteriores obtenidos con el péptido Tat-T1 se han validado in vivo utilizando un modelo en ratón de isquemia cerebral inducida por fototrombosis. El método consiste en la inducción fotoquímica de una trombosis intravascular por administración intraperitoneal (10 mg/kg) de un compuesto de contraste fotosensible (Rosa de Bengala) y la irradiación con luz fría (600 Ims, 3000 K) de la región cortical, a través de la superficie pial y el cráneo. El Rosa
25 Bengala es un fotosensibilizante muy potente que induce un daño endotelial y la formación de plaquetas, produciendo una trombosis y coagulación microvascular masiva en el tejido expuesto. De esta forma se imita la oclusión vascular y la formación de agregados plaquetarios producida durante la isquemia cerebral. La isquemia por fototrombosis es un modelo de isquemia permanente que tiene la ventaja de ser menos invasivo y más sencillo de abordar que
30 otras técnicas por oclusión de la arteria cerebral media (ACM). Se utilizaron ratones machos adultos Swiss (Harían) con un ámbito de peso de 35-40 g, que son anestesiados con isofluorano mediante mascarilla facial. Durante todo el proceso experimental se controla la temperatura corporal. El haz de luz se hace incidir en el hemisferio derecho a 3 mm a la derecha y 2 mm posterior a Bregma por un período de 20 min (hemisferio ipsilateral, I),
35 utilizándose como control las regiones equivalentes del hemisferio contralateral (C). A los 30 min de inducido el daño, los péptidos neuroprotectores y control (10 mg/kg) se inyectan de manera intravenosa y los animales son sacrificados a las 24 h. A continuación, los cerebros se cortan en rodajas coronales de 1 mm de grosor que son teñidas con una solución al 2% de cloruro de trifeniltetrazolio (TTC; Merck Bioscience, Darmstadt, Alemania) que permite comprobar la magnitud del infarto, cuyo volumen se cuantifica a continuación.
En conjunto, los resultados anteriores demuestran un efecto protector del péptido Tat-T1 sobre la excitotoxicidad in vitro e in vivo mediante la interferencia de la función de la proteína TrkB-T1 y desvelan una nueva estrategia de neuroproteccion para el ictus y otras patologías agudas y crónicas del SNC en las que la vía de supervivencia BDNF/TrkB se encuentra alterada. LISTA DE SECUENCIAS
SEQ ID NO: 1 : Identifica la secuencia aminoacídica C-terminal de 1 1 aminoácidos de la isoforma truncada TrkB-T1 del receptor de neurotrofinas TrkB (aminoácidos 466-476, FVLFHKIPLDG). El origen de la secuencia puede ser: humano, rata, ratón, caballo, toro, gallo.
SEQ ID NO: 2: Identifica una secuencia artificial de 24 aminoácidos correspondiente con el péptido neuroprotector Tat-TrkB-T1 que comprende la secuencia de un dominio básico de la proteína Tat de HIV (SEQ ID NO: 3) de 1 1 aminoácidos, y los 1 1 aminoácidos C-terminales de la isoforma TrkB-T1 de TrkB (SEQ ID NO: 1), separadas por un linker formado por dos residuos de prolina (YGRKKRRQRRRPPFVLFHKIPLDG).
SEQ ID NO: 3: Identifica 1 1 aminoácidos de un dominio básico de la proteína transactivadora Tat del virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) que confiere las propiedades de permeabilidad propias de esta proteína (aminoácidos 47-57, YGRKKRRQRRR).
SEQ ID NO: 4: Identifica una secuencia artificial correspondiente con 25 aminoácidos de un dominio básico de la proteína Tat de HIV (SEQ ID No 3) fusionada con los aminoácidos 408- 421 del factor de transcripción c-Myc (YGRKKRRQRRRAEEQKLISEEDLLR). SEQ ID NO: 5: Identifica una secuencia nucleotídica (DNA codificante) de 33 nucleotidos que codifica para los 11 aminoácidos del extremo C-terminal de la isoforma truncada TrkB-T1 del receptor de neurotrofinas TrkB (aminoácidos 466-476, FVLFHKIPLDG; SEQ ID NO: 1) de humano, rata, ratón, caballo, toro o gallo. Dicha secuencia es la siguiente: (TTYGTNYTNT TYCAYAARAT HCCNYTNGAY GGN), donde y=c/t, n=cualquier base, r=a/g, y h=a/c/t.
SEQ ID NO: 6: Identifica una secuencia nucleotídica (DNA codificante) de 33 nucleotidos que codifica para 1 1 aminoácidos de un dominio básico de la proteína transactivadora Tat de HIV que confiere las propiedades de permeabilidad propias de esta proteína (aminoácidos 47-57, YGRKKRRQRRR; SEQ ID No: 3). Dicha secuencia es la siguiente: (TAYGGNMGNA ARAARMGNMG NCARMGNMGN MGN), donde y=c/t, n=cualquier base, m=a/c, y r=a/g.
SEQ ID NO: 7: Identifica la secuencia aminoacídica del epítopo de hemaglutinina HA del virus de la gripe (aminoácidos 98-106, YPYDVPDYA), que facilitará la detección del péptido producido. SEQ ID NO: 8: Identifica una secuencia de 35 aminoácidos del péptido neuroprotector Tat-HA- TrkB-T1 producido en células hospedadoras bacterianas tras la hidrólisis ácida de la proteína de fusión, que comprende la secuencia de un dominio básico de la proteína Tat de HIV (SEQ ID NO: 3) de 11 aminoácidos, y los 11 aminoácidos C-terminales de la isoforma TrkB-T1 de TrkB (SEQ ID NO: 1), separadas por un linker formado por el epítopo de hemaglutinina HA del virus de la gripe (PGYGRKKRRQRRRGYPYDVPDYAG FVLFHKIPLDG).
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Claims

REIVINDICACIONES
1. Un péptido neuroprotector caracterizado por comprender la secuencia SEQ ID NO: 1 , capaz de impedir la unión entre TrkB-T1 y sus moléculas interaccionantes en células neuronales y/o gliales.
2. El péptido neuroprotector según la reivindicación 1 , caracterizado por comprender un agente de internalización.
3. El péptido neuroprotector según la reivindicación 2, caracterizado por que el agente de internalización es la secuencia SEQ ID NO: 3.
4. El péptido neuroprotector según las reivindicaciones 1-3, caracterizado por que comprende un linkero una molécula de unión.
5. El péptido neuroprotector según la reivindicación 4, caracterizado por que la secuencia de dicho péptido es SEQ ID NO: 2.
6. El péptido neuroprotector según la reivindicación 4, caracterizado por que la secuencia de dicho péptido es SEQ ID NO: 9.
7. Una secuencia nucleotídica que codifica para el péptido neuroprotector descrito en las reivindicaciones 1-6.
8. Un vector de expresión o plásmido caracterizado por comprender al menos una secuencia nucleotídica descrita en la reivindicación 7.
9. Una célula hospedadora caracterizada por expresar el vector de expresión descrito en la reivindicación 8.
10. Una composición farmacéutica o medicamento caracterizado por comprender el péptido neuroprotector descrito en las reivindicaciones 1-6, o la secuencia nucleotídica descrita en la reivindicación 7, o el vector de expresión o plásmido descrito en la reivindicación 8, o la célula hospedadora descrita en la reivindicación 9.
1 1. Uso del péptido neuroprotector descrito en las reivindicaciones 1-6 en la fabricación de una composición farmacéutica o medicamento.
12. Uso según la reivindicación 1 1 , caracterizado por que la composición farmacéutica o 5 medicamento es para la prevención y/o tratamiento del daño neuronal.
13. Uso según la reivindicación 12, caracterizado por que el daño neuronal es causado por una patología del SNC asociada a excitotoxicidad en la que la vía de supervivencia BDNF/TrkB se encuentra alterada o inhibida.
10
14. Uso según la reivindicación 12, caracterizado por que el daño neuronal es causado por una enfermedad cerebrovascular en la que la vía de supervivencia BDNF/TrkB se encuentra alterada o inhibida.
15 15. Uso según la reivindicación 12, caracterizado por que el daño neuronal es causado por un traumatismo cerebral y/o medular en el que la vía de supervivencia BDNF/TrkB se encuentra alterada o inhibida.
16. Uso según la reivindicación 1 1 , caracterizado por que la composición farmacéutica o 20 medicamento se emplea sólo o en combinación con otros medicamentos para terapia trombolítica o para prevenir y/o tratar el daño isquémico.
17. Uso según la reivindicación 16, caracterizado por que la terapia trombolítica es para prevenir y/o tratar un ictus o isquemia cerebral.
25
18. La composición farmacéutica descrita en la reivindicación 10, para su uso en medicina.
19. La composición farmacéutica según la reivindicación 18, caracterizado para su uso en la prevención y/o tratamiento del daño neuronal.
30
20. La composición farmacéutica según la reivindicación 19, caracterizado por que el daño neuronal es causado por una patología del SNC asociada a excitotoxicidad en la que la vía de supervivencia BDNF/TrkB se encuentra alterada o inhibida.
21. La composición farmacéutica según la reivindicación 19, caracterizado por que el daño neuronal es causado por una enfermedad cerebrovascular en la que la vía de supervivencia BDNF/TrkB se encuentra alterada o inhibida.
5 22. La composición farmacéutica según la reivindicación 19, caracterizado por que el daño neuronal es causado por un traumatismo cerebral y/o medular en el que la vía de supervivencia BDNF/TrkB se encuentra alterada o inhibida.
23. La composición farmacéutica según la reivindicación 18, caracterizado por que la 10 composición farmacéutica o medicamento se emplea sólo o en combinación con otros medicamentos para terapia trombolítica o para prevenir y/o tratar el daño isquémico.
24. La composición farmacéutica según la reivindicación 23, caracterizado por que la terapia trombolítica es para prevenir y/o tratar un ictus o isquemia cerebral.
15
25. Método para la prevención y/o el tratamiento del daño neuronal caracterizado por comprender la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición farmacéutica descrita en la reivindicación 10.
20 26. Método según la reivindicación 25, caracterizado por que el daño neuronal es causado por una patología del SNC asociada a excitotoxicidad en la que la vía de supervivencia BDNF/TrkB se encuentra alterada o inhibida.
27. Método según la reivindicación 25, caracterizado por que el daño neuronal es causado 25 por una enfermedad cerebrovascular en la que la vía de supervivencia BDNF/TrkB se encuentra alterada o inhibida.
28. Método según la reivindicación 25, caracterizado por que el daño neuronal es causado por un traumatismo cerebral y/o medular en el que la vía de supervivencia BDNF/TrkB se
30 encuentra alterada o inhibida.
29. Método de tratamiento trombolítico caracterizado por comprender la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición farmacéutica descrita en la reivindicación 10 empleada sola o combinada con otros medicamentos para terapia
35 trombolítica.
30. Método según la reivindicación 29, caracterizado por que la terapia trombolítica es para prevenir y/o tratar un ictus o isquemia cerebral.
31. Método para prevenir y/o tratar el daño isquémico caracterizado por comprender la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición farmacéutica descrita en la reivindicación 10 empleada sola o combinada con otros medicamentos para prevenir y/o tratar el daño isquémico.
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