CN111217894B - 具有神经保护活性的多二硫键长链肽及药物组合物和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及具有神经保护活性的多二硫键长链肽，以及其药学上可接受的盐和包含其的药物组合物。这些多二硫键长链肽能够通过对谷氨酸受体的抑制作用减少细胞钙内流，从而起到保护皮层神经元免受谷氨酸引发的兴奋性毒性，是一类非常有效的神经保护剂。

Description

具有神经保护活性的多二硫键长链肽及药物组合物和应用

技术领域

本发明涉及生物技术和制药工业领域，特别涉及一类具有神经保护活性多二硫键长链肽的设计和获得，所述多二硫键长链肽旨在用于神经保护用途的治疗。

背景技术

中风已成为导致死亡和残疾的主要原因之一，其中67.3-80.5％属于缺血性中风，即由于血栓或栓子阻塞脑动脉或其分支，脑血流下降造成脑损伤。目前，临床治疗中风的药物如组织型纤维蛋白溶酶原激活剂-阿替普酶，可以实现血管再通，使血流得到恢复，半影区不能转变为中心区，而且使应用神经保护剂挽救半影区细胞成为可能。然而，至今为止临床上还缺乏切实有效的神经细胞保护剂，也没有具有促进神经功能恢复的治疗药物。尽管经过几十年的努力，对中风诱发的内源性神经保护分子和机理的认识仍然很局限(Strokeepidemiology:A review of population-based studies of incidence,prevalence,andcase-fatality in the late 20th century.Feigin VL,Lawes CM,Bennett DA,AndersonCS(2003),Lancet Neurol 2：43-53；The science of stroke:mechanisms in search oftreatments.Moskowitz MA,Lo EH,Iadecola C(2010).Neuron 67:181-198)。

研究表明，脑缺血/再灌注导致脑损伤的级联反应中，谷氨酸介导的兴奋毒被认为是主要和关键部分。缺血性脑损伤的谷氨酸释放机制如下：(1)由于转运体蛋白表达的下降、谷氨酸转运体的反向逆转、谷氨酸转运体再摄取能力的下降，因而谷氨酸转运体触发的细胞外谷氨酸积累；(2)星形胶质细胞能通过钙依赖性胞吐进行谷氨酸的释放，因此在缺血条件下能导致这种释放方式的紊乱，引起谷氨酸释放增加，过度激活N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)型受体，是造成缺血性中风后神经元损伤的主要步骤；(3)脑缺血后导致星形胶质细胞的肿胀而产生脑水肿，进而引起谷氨酸的释放；(4)磷脂酶A2、磷脂酶C的激活，磷脂水解导致胞质膜的失衡、恶化，氨基酸因膜两侧的高浓度差引起跨膜弥散，导致氨基酸的释放。因此，在缺血引起的谷氨酸释放方式中，至少有四种不同的机制。在早期由于Ca²⁺内流、内质网/线粒体Ca²⁺外流，胞内Ca²⁺增加，诱导钙依赖的囊泡式释放；接着谷氨酸转运体、肿胀、磷脂酶激活等对缺血引起的谷氨酸释放起重要作用(Inhibition of glial glutamatetransporter glt-1augments brain edema after transient focal cerebral ischemiain mice.Namura S,Maeno H,Takami S,Jiang XF,Kamichi S,Wada K,Nagata I(2002)，Neurosci Lett 324：117-120；Glutamate-mediated astrocyte-neuronsignalling.Parpura V,Basarsky TA,Liu F,Jeftinija K,Jeftinija S,Haydon PG(1994),Nature 369：744-747；Inhibition of ischemia-induced glutamate release inrat striatum by dihydrokinate and an anion channel blocker.Seki Y,Feustel PJ,Keller RW,Tranmer BI,Kimelberg HK(1999),Stroke 30：433-440)。

在神经保护药物的研究中，NMDA型受体阻断剂一直是大家研究的目标。NMDA型受体是一异聚体，由NR1、NR2、NR3三个不同亚基组成，其中NR1亚基有八个来源于单一基因的不同剪接异构体，然而NR2亚基的四个不同类型(NR2A、NR2B、NR2C、NR2D)、NR3亚基的两个不同类型(NR3A、NR3B)是由六个各自不同的基因编码。典型的NMDA型受体包含具有甘氨酸结合点的NR1亚基两个，具有谷氨酸结合点的NR2亚基两个，其中后者能被NR3亚基替代。同时NR1是NMDA型受体的基本亚单位，NR2亚单位使NMDA型受体形成多元化结构，并表现出不同的受体功能。近期研究提示，含不同类型NR2亚单位的NMDA型受体激活对神经元损伤具有不同的作用。含NR2A亚基的NMDA型受体的激活能促进神经元的存活，能对NMDA受体介导的或非NMDA受体介导的神经元损伤具有保护作用；相反，含NR2B亚基的NMDA型受体的激活触发兴奋性神经毒性，导致神经元凋亡。另一方面，激活的NMDA受体所处的神经元部位也影响着其在神经元损伤过程中的作用。突触部位的NMDA受体激活具有抗凋亡作用，然而突触外部位的NMDA受体激活却能触发细胞死亡，全基因表达图谱结果也证实了这一结果。这也许能解释非选择性NMDA受体阻断剂在临床应用中疗效并不满意的事实，同时也为寻找和发现基于NMDA受体的、特异而有效地神经保护药物提供了科学依据(NMDA receptor subunits:Function and pharmacology.Paoletti P,Neyton J(2007)7:39-47；The dichotomy ofNMDA receptor signaling.Papadia S,Hardingham GE(2007),Neuroscientist 13:572-579；NMDA receptor subunits have differential roles in mediating excitotoxicneuronal death both in vitro and in vivo.Liu Y,Wong TP,Aarts M,Rooyakkers A,Liu L,Lai TW,Wu DC,Lu J,Tymianski M,Craig AM,Wang YT(2007),J Neurosci 27:2846-2857；Docoding NMDA receptor signaling:Identification of genomic programsspecifying neuronal survival and death.Zhang SJ,Steijaert MN,Lau D,Schutz G,Delucinge-Vivier C(2007),Neuron 53:549-562.)。

近年来，中国传统药物的研究，越来越受到研究者的青睐。牛膝(Achyranthesbidentata Blume)是一种常用的中草药之一，具有活血化瘀的功能，也应用于中风的治疗。牛膝提取液能促进周围神经再生、对缺血性脑损伤具有保护作用，能抑制PC12细胞由于血清剥夺引起的凋亡，并与Bax、Caspase-3相关，而且没有毒副作用。研究表明，牛膝提取液中分离出的有效成分为多肽成分，命名为牛膝活性肽(A.bidentata polypeptide,用ABPPk2指代),通过Edman降解和质谱方法鉴定了ABPPk2的一级序列，并进行了ABPPk2的药理学研究。同时，以ABPPk2为基础序列结构，通过与NMDA2B受体相互作用确定结构域，以ABPPk2结构域为基础进行衍生化修饰，使药物代谢动力学、生物分布、稳定性和其在临床前情景下的应用的新技术而进行改善(Stroke therapy in traditional Chinese medicine(TCM):Prospects for drug discovery and development.Gong X,Sucher NJ.(2002),Phytomedicine9:478-484；The repair effects of achyranthes bidentata extract onthe crushed common personal nerve of rabbits.Ding F,Cheng Q,Gu X(2007),Fitoterapia 79:161-167；Herbal medicine in stroke:Does it have a future？FeiginVL.(2007),Stroke 38:1734-1736.)。

发明描述

本发明通过提供具有神经保护活性的多二硫键长链肽而有助于解决上面提及的问题。在本文中，通过牛膝活性肽的提取纯化、结构表征、与NMDA2B受体分子对接、以结构域为基础进行衍生化修饰，以使该类多二硫键长链肽应用在缺血性中风的中枢神经保护剂、缺血缺氧导致的神经保护、及促神经生长的相关方面。

一种多二硫键长链肽的神经保护剂，牛膝活性肽(ABPPk2)的氨基酸一级序列为：

Cys-Leu-Glu-Ser-Gly-Thr-Ser-Cys-Ile-Pro-Gly-Ala-Gln-His-Asn-Cys-Cys-Ser-Gly-Val-Cys-Val-Pro-Ile-Val-Thr-Ile-Phe-Tyr-Gly-Val-Cys-Tyr

(即CLESGTSCIPGAQHNCCSGVCVPIVTIFYGVCY)。

在其中一个实施例中，牛膝活性肽通过提取，富集纯化的方法获得；

在其中一个实施例中，通过Edman降解与串联质谱表征牛膝活性肽的氨基酸一级序列；

在其中一个实施例中，通过分步还原及衍生化方式表征牛膝活性肽的二硫键连接方式；

在其中一个实施例中，NMR表征牛膝活性肽的立体空间结构；

在其中一个实施例中，牛膝活性肽与NMDA2B受体分子对接确定结构域；

在其中一个实施例中，牛膝活性肽(ABPPk2)对原代培养海马神经元NMDA损伤的影响；

在其中一个实施例中，牛膝活性肽对原代培养的SD胎鼠皮层神经元缺血缺氧损伤的保护作用；

在其中一个实施例中，牛膝活性肽对原代培养的海马神经元生长的影响；

在其中一个实施例中，通过同源建模模拟权利要求1中的多二硫键长链肽；

在其中一个实施例中，通过合成手段获得权利要求1中的多二硫键长链肽。

所述肽可能采取不同的结构。一种或多种其可能结构可以具有特定的生物学重要性。为了确定哪些构象是重要的，需要将所述肽限制于单一的构象空间区域，然后确定这是否是其有用的形式。通过检查许多这些构象，可能确定哪一个是生物学上重要的。

该多二硫键长链肽可以来源于牛膝(Achyranthes bidentata Blume)，或者来源于苋科(Amaranthaceae)、牛膝属(Achyranthes L.)植物。

该多二硫键长链肽可以通过生物材料中提取分离纯化，有机合成或基因工程等方法获得。

存在有新的用于产生更精确的合成结构的方法。应当考虑，它们应当保持某种柔韧性。即，如果所设计的结构过于刚性，就不可以采取具有对于其体内生物学活性而言希望的特性的其他结构，其中考虑到轻微柔韧的结构能够实现该调整。用适合于设计合成肽的技术和方法，获得了有价值的关于对于肽的受体、酶的活性位点和多种多样的其他生物学过程而言的必要条件的认识。

在生物系统中肽的特性取决于其结构。因此，使用合理的设计以产生有用的肽的能力取决于确定分子结构与生物学活性的特定关系的相应能力。辨识这些关系的能力由各种各样的不确定性决定，无论在生物学试验系统中还是在数据解释中。更复杂的因素是在测定肽本身的三维结构中的困难。许多肽固有地是柔韧的并因此在溶液中采取许多构象。问题在于测定这些构象中的哪个负责所观察到的肽活性，并且许多肽可以在超过一种的构象下是有活性的。构象约束的使用对于阐明这些结构-功能关系是有用的。如果肽被限制于特定的构象或与具有活性构象的家族紧密相关，那么所测得的活性就反映了该结构。尽管完全刚性的分子是不可能的，但是通过产生具有指定的结构基元的类似物，也可以开始将某些生物学活性归因于其构成原因的结构。

本发明的目标为具有神经保护活性的多二硫键长链肽，该多肽的氨基酸序列包含以下特征，或者为牛膝活性肽，或者具有一定的立体空间结构：

(1)具有神经保护活性的多二硫键长链肽，其特征在于，该多肽的氨基酸序列为：

Cys-X1-Ser-Cys-X2-Gln-His-Asn-Cys-Cys-Ser-Gly-Val-Cys-Val-X3-Phe-Tyr-Gly-Val-Cys-Tyr

其中，

X1为由4-6个氨基酸顺序连接成的四肽、五肽或六肽序列，其中的氨基酸选自Ser,Gly,Leu,Lys,Thr和Glu中的1-6种；

X2为由4-6个氨基酸顺序连接成的四肽、五肽或六肽序列，其中的氨基酸选自Gly,Ala,Ile,Arg和Pro中的1-5种；

X3为由4-6个氨基酸顺序连接成的四肽、五肽或六肽序列，其中的氨基酸选自Thr,Leu,Ile,Pro和Val中的1-5种。

(2)该多肽的氨基酸序列为牛膝(Achyranthes bidentata Blume)活性肽的氨基酸序列，

Cys-Leu-Glu-Ser-Gly-Thr-Ser-Cys-Ile-Pro-Gly-Ala-Gln-His-Asn-Cys-Cys-Ser-Gly-Val-Cys-Val-Pro-Ile-Val-Thr-Ile-Phe-Tyr-Gly-Val-Cys-Tyr

(即CLESGTSCIPGAQHNCCSGVCVPIVTIFYGVCY)。

(3)多二硫键长链肽的三对二硫键的连接方式为CysI-CysIV(即由第1个Cys中的硫与第4个Cys中的硫相连形成二硫键),CysII-CysV(即由第2个Cys中的硫与第5个Cys中的硫相连形成二硫键),CysIII-CysVI(即由第3个Cys中的硫与第6个Cys中的硫相连形成二硫键)。

(4)多二硫键长链肽的立体空间结构中包含两对或三对β-反平行结构，位于多二硫键长链肽的N端，中间序列及C端。

(5)牛膝活性肽与NMDA2B受体相互作用的作用位点,即Gln13、Asn15，Phe28和Tyr33。

(6)多二硫键长链肽的N-末端和C-末端的氨基基团和羰基基团而形成的线性肽，或该肽的N-末端和C-末端的氨基基团与羰基基团之间的肽键而形成的环状肽。

(7)多二硫键长链肽中的二硫化物共价键，其包含基团X1,X2,X3和除它们之外固定序列中的半胱氨酸，并且两个半胱氨酸间隔九个以上氨基酸残基时，相应的半胱氨酸形成二硫化物共价键。

(8)多二硫键长链肽中的糖苷键，其包含基团X1,X2,X3和除它们之外固定序列的侧链氨基基团(Lys和Arg)、羰基基团(Glu和Asp)和酰胺基团(Gln和Asn)，氨基基团、羰基基团或酰胺基团分别可以与如下单糖或二糖形成糖苷键，单糖包括阿拉伯糖，核糖，木糖，来苏糖，葡萄糖，甘露糖，果糖，半乳糖中的一种或二种以上，二糖包括麦芽糖，乳糖，蔗糖，海藻糖，纤维二糖，龙蛋二糖，蜜二糖中的一种或二种以上。

(9)多二硫键长链肽中的N-末端共价的连接至焦谷氨酸或乙酰基基团，乙酰基包括乙酰胆碱、对乙酰氨基酚、乙酰水杨酸、乙酸、乙酰胺和乙酸酐中的一种或二种以上。

本发明的另一个方面为用于神经保护的方法，其中向有此需要的个体施用包含有效量的至少一种本发明的多二硫键长链肽的药物组合物。包含至少一种本发明的多二硫键长链肽和药学上可接受的赋形剂或载体的药物组合物也是本发明的目标。

附图说明

图1为实施例的牛膝活性肽的纯化过程。(a)制备柱的初级分离；(b)分析柱的再次分离；(c)二醇型HILIC色谱柱分离牛膝活性肽单体。

图2为实施例的牛膝活性肽的Edman降解的氨基酸序列图。

图3为实施例的牛膝活性肽的串联质谱图。(a)牛膝活性肽的IAM衍生物；(b)牛膝活性肽的HCD碎裂图，蓝色线条代表PIVTIFYGV，桔黄色线条代表PGAQHN；(c)牛膝活性肽在酸水解5min的HCD碎裂的二级质谱图。

图4为实施例的牛膝活性肽的氨基酸一级序列图；(A)Edman降解数据，(B)牛膝活性肽IAM衍生物的HCD数据，(C)牛膝活性肽的HCD数据，(D)牛膝活性肽酸水解5min的数据。

图5为实施例的牛膝活性肽的二硫键连接方式。

图6为实施例的牛膝活性肽的立体空间结构图。

图7a.ABPPk2与NMDA2B结合三维构象(对接打分1249.709)。

图7b.ABPPk2与NMDA2B静电作用(A.NMDA2B静电表面；B.ABPPk2静电表面；C.ABPPk2&NMDA2B复合物静电表面)。

图7c.ABPPk2与NMDA2B结合模式。

图8a为实施例的不同浓度NMDA对培养海马神经元活力的影响(x±SD，n＝8)。*与正常对照组相比，p<0.05；#与正常对照组相比，p<0.01。

图8b为实施例的NMDA作用不同时间对培养海马神经元活力的影响(x±SD，n＝8)。*与正常对照组相比，p<0.05。

图8c为实施例的不同浓度牛膝活性肽对NMDA诱导海马神经元损伤的影响，(x±SD，n＝8)。*与NMDA损伤对照组相比，p<0.05；#与NMDA损伤对照组相比，p<0.01。

图8d为实施例的MK801对NMDA诱导海马神经元损伤的影响(x±SD，n＝8)。*与NMDA损伤对照组相比，p<0.05；#与NMDA损伤对照组相比，p<0.01。

图8e为实施例的牛膝活性肽对NMDA引起的培养海马神经元损伤的影响(x±SD，n＝8)。*与NMDA损伤对照组相比，p<0.05；#与NMDA损伤对照组相比，p<0.01。

图8f为实施例的牛膝活性肽对NMDA引起的培养海马神经元损伤的影响(x±SD，n＝8)。#与NMDA损伤对照组相比，p<0.01。

图9为实施例的光镜下观察OGD损伤及不同药物处理的皮层神经元。(A.正常神经元，B.OGD损伤2h，C.阳性对照组，D.牛膝活性肽低剂量组，E.牛膝活性肽中剂量组，F.牛膝活性肽高剂量组，x20)。

图10为实施例的牛膝活性肽(ABPPk2)对OGD损伤皮层神经元活力的影响。

图11为实施例的牛膝活性肽(ABPPk2)对OGD损伤皮层神经元凋亡小体的影响。

图12为实施例的牛膝活性肽(ABPPk2)对OGD损伤皮层神经元凋亡的影响。

图13为实施例的牛膝活性肽(ABPPk2)对OGD损伤皮层神经元线粒体膜电位的影响。

图14为实施例的牛膝活性肽(ABPPk2)对OGD损伤皮层神经元ROS含量的影响。

图15为实施例的牛膝活性肽(ABPPk2)对OGD损伤皮层神经元Bcl-2、Bax蛋白表达的影响。

图16为实施例的牛膝活性肽(ABPPk2)对OGD损伤皮层神经元Cleaved caspase-3蛋白表达的影响。

图17为实施例的牛膝活性肽(ABPPk2)对OGD损伤皮层神经元线粒体和胞浆中CytC表达的影响。

图18为实施例的牛膝活性肽(ABPPk2)对OGD损伤皮层神经元线粒体和细胞核中AIF表达的影响。

图19为实施例的牛膝活性肽对PI3K抑制剂处理后OGD损伤皮层神经元p-AKT表达的影响。

图20为实施例的牛膝活性肽对PI3K抑制剂处理后OGD损伤皮层神经元cleavedcaspase-3表达的影响。

图21为实施例的牛膝活性肽对原代胎鼠海马神经元生长的影响。

图22为实施例的活细胞工作站观察牛膝活性肽对原代胎鼠海马神经元生长的作用。

图23为实施例的牛膝活性肽处理24h对海马神经元突起生长锥和丝状伪足的影响。

图24为实施例的牛膝活性肽处理24h对海马神经元突起生长的影响。

图25为实施例的牛膝活性肽处理48h对海马神经元突起生长的影响。

图26为实施例的牛膝活性肽对海马神经元突触形成的影响。

图27为实施例的某多二硫键长链肽同源建模后的立体空间结构。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳的实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

以下为具体实施例部分：

实施例一、牛膝活性肽(ABPPk2)的提取分离和纯化过程

(1)牛膝活性肽(ABPPk2)的提取：

将单味药材怀牛膝饮片，用水溶液提取3次，合并提取液得牛膝水溶液液。该牛膝水溶液液于4℃加硫酸铵至质量浓度50％，15000rpm离心半小时，离心后的上清液继续于4℃加硫酸铵至质量浓度80％，15000rpm离心半小时，将沉淀移至截留最小分子量为1000的透析袋中，纯水透析，保留透析袋内的样品，将该样品冷冻干燥后得到牛膝粗提物。

(2)牛膝活性肽(ABPPk2)的富集：

对于牛膝粗提物，按照2g牛膝粗提物溶于100mL水的比例使其溶解，采用Sevage试剂法(组成为氯仿：正丁醇(体积比)＝5:1)，按Sevage试剂：样品＝1:3的体积比比例加入Sevage试剂。对水层萃取两次，合并中间固体层。

(3)牛膝活性肽(ABPPk2)的分离：

利用制备型C18色谱柱(Innoval ODS-P，5μm，

21.2×250mm，AgelaTechnologies)，采用70％体积比的甲醇水溶液(含0.5％甲酸)作为流动相，检测波长为254nm和277nm，流速为10mL/min，进行牛膝活性肽的初级分离，保留时间约为14min，按保留时间接取后合并浓缩。浓缩后的初级分离多肽，利用分析型C18色谱柱(Cosmosil，5μm，4.6×250mm)，采用二元流动相进行再次纯化，流动相A为含0.5％甲酸的水溶液，流动相B为乙腈，洗脱梯度为0-8min,30-70％B，8.1-9min,100％B，9.1-10min,30％B，流速1mL/min，保留时间约为6.5min，按保留时间接取后合并浓缩；用二醇型HILIC色谱柱(YMC-Pack Diol-NP，5μm，10×250mm)进行牛膝活性肽(ABPPk2)的单体分离，流动相为80:20的乙腈：200mM醋酸铵溶液，流速为4mL/min，保留时间约为26min，按保留时间接取后合并浓缩后除盐。上述分离结果见图1。

实施例二、牛膝活性肽(ABPPk2)的氨基酸序列分析

(1)牛膝活性肽(ABPPk2)氨基酸序列的Edman降解分析：

牛膝活性肽(ABPPk2)的Edman降解实验在PPSQ-51A系统200V(岛津，Japan)测序仪上进行，得到的氨基酸序列结果见图2。

(2)牛膝活性肽(ABPPk2)的质谱分析及一级氨基酸序列：

在正离子模式下，高分辨质谱Thermo-Orbitrap-Elite用于分析ABPPk2的氨基酸一级序列。经典的衍生化试剂DTT/IAM用于牛膝活性肽的二硫键中半胱氨酸的还原和衍生化，牛膝活性肽充分衍生化后每个二硫键处质量数增加2×58.0293。图3a为牛膝活性肽IAM衍生化物的HCD二级质谱图，可以确定一个肽段序列CVPIVTIFYGVCY，见表1，注亮氨酸L和异亮氨酸I由Edman降解确定，C端的CY序列由酸水解5min质谱数据确定。图3b为牛膝活性肽的HCD二级质谱图，可以确定两个肽段序列PIVTIFYGV和PGAQHN，见表2。图3c为牛膝活性肽酸水解5min时，LC-MS分析中某肽段的HCD二级质谱图，可以确定该肽段的序列为VPIVTIFYGVCY，见表3。综合Edman降解与质谱分析，得到牛膝活性肽的氨基酸一级序列为CLESGTSCIPGAQHNCCSGVCVPIVTIFYGVCY(见图4，含三对二硫键)。

牛膝活性肽SEQ ID No.1的信息：

(a)序列特征

长度：33个氨基酸

类型：氨基酸

链型：单链

(b)分子类型：多肽

特征名称关键词：DISULFID；DOMAIN；STRAND

最初来源：牛膝(Achyranthes bidentata Blume)。

表1.牛膝活性肽IAM衍生化物HCD二级质谱图推断出的氨基酸序列信息

表2.牛膝活性肽HCD二级质谱图推断出的氨基酸序列信息

离子系列组成	实验质荷比m/z	理论质荷比m/z
			PI	211.1451	211.1447
PIV	310.2140	310.2131
			PIVT	411.2621	411.2607
PIVTI	524.3465	524.3448
			PIVTIF	671.4155	671.4132
PIVTIFY	834.4795	834.4766
			PIVTIFYG	891.5008	891.4980
PIVTIFYGV	990.5696	990.5664
			PG	155.0823	155.0821
PGA	226.1197	226.1192
			PGAQ	354.1789	354.1777
PGAQH	491.2383	491.2367
			PGAQHN	605.2816	605.2796

表3.牛膝活性肽酸水解产物的二级质谱图推断出的氨基酸序列信息

离子系列组成	实验质荷比m/z	理论质荷比m/z
			VP	197.1284	197.1290
VPI	310.2125	310.2131
			VPIV	409.2809	409.2815
VPIVTI	623.4128	623.4132
			VPIVTIF	770.4816	770.4816
VPIVTIFY	933.5447	933.5450
			VPIVTIFYG	990.5665	990.5664
VPIVTIFYGV	1089.6349	1089.6349
			VPIVTIFYGVC-[H<sub>2</sub>]	1190.6302	1190.6284
VPIVTIFYGVC-[H<sub>2</sub>S]	1158.6558	1158.6563
			VPIVTIFYGVCY-[H<sub>2</sub>]	686.3555<sup>2+</sup>	686.3545<sup>2+</sup>

。

实施例三、牛膝活性肽二硫键的连接方式：

牛膝活性肽采用TCEP部分还原法，获得二硫键的连接方式。即室温下，采用TCEP部分还原牛膝活性肽的二硫键，NEM进行衍生化，最后在65℃下，TCEP还原全部二硫键变为巯基。Orbitrap的质谱碎裂数据，导入Peaks进行搜库(图5)，fasta文件为牛膝活性肽的一级序列，得到牛膝活性肽的三对二硫键的连接方式为Cys1-Cys17,Cys8-Cys21,Cys16-Cys32(表4),即CysI-CysIV,CysII-CysV,CysIII-CysVI。

表4.牛膝活性肽的TCEP/NEM分步还原，获得二硫键连接方式信息

实施例四、牛膝活性肽的立体空间结构：

牛膝活性肽的立体空间结构采用二维NMR技术获得，见图6。实验仪器为Bruker850MHz核磁谱仪配备低温探头，样品制备过程为约2mg牛膝活性肽溶于1mL磷酸钠缓冲溶液(50mM)中，溶剂为水：重水：氘代乙腈(体积比)为6:1:3。室温下采集的谱图包括NOESY,TOCSY,DQF-COSY,¹H-¹³C HSQC和¹H-¹⁵N HSQC。图中所示，牛膝活性肽是以loop结构为主，包含三个反平行的β折叠结构，分别位于Glu3-Ile9,Gly19-Pro23和Phe28-Cys32中。

实施例五、牛膝活性肽与NMDA2B受体相互作用的研究：

使用ZDOCK工具进行蛋白-蛋白分子对接，可以根据蛋白-蛋白不同的结合构象进行打分排序。ABPPk2与NMDA2B蛋白-蛋白结合三维构象如图7a所示。根据牛膝肽与NMDA2B受体复合物情况，小蛋白可以很好地契合在NMDA2B抑制剂配体口袋，两者具有很好的形状互补性。静电作用是蛋白-蛋白结合最重要的作用力之一。ABPPk2与NMDA2B的静电作用如图7b所示。图中，A代表NMDA2B的静电表面，B是ABPPk2小蛋白的静电表面，C是ABPPk2与NMDA2B复合物的静电表面。从图中可以看出，两个蛋白的接触面，能够通过静电作用相结合。特别是ABP前端的正电基团(蓝色)以及右侧的负电基团(红色)，都跟NMDA2B蛋白接触部位具有相反的电荷，可以形成很好的静电作用。图7c展示的是两个蛋白的氢键等相互作用模式。从图中可以看出，两个蛋白形成了3对氢键作用(ABPPk2的Gln13、Asn15和Phe28分别对应NMDA2B的Tyr179、Asp136和Met207)，此外，ABPPk2的Tyr33可以与Phe114形成π-π相互作用。因此与ABPPk2相互作用的NMDA2B受体的结构域位于其N端的ATD区，ABPPk2的关键残基为Gln13、Asn15，Phe28和Tyr33。

实施例六、牛膝活性肽(ABPPk2)对原代培养海马神经元NMDA损伤的影响：

(1)NMDA损伤模型的建立。海马神经元的原代培养：孕18～19天SD(Sprague-Dawley)雌性大鼠复合麻醉剂麻醉，无菌条件下取胎鼠脑，置于HBSS液(NaCl 8.4g/L，KCl0.224g/L，HEPES 2.38g/L，青霉素钠50万单位，硫酸卡那霉素50万单位，用1M NaOH将pH调至7.1～7.2，再用超纯水将渗透压调至290±10m Osm左右，过滤后4℃储存)，体视解剖显微镜下去除脑膜，取出双侧海马，于0.125％的胰腺蛋白酶37℃消化10min，用完全培养基(90％DMEM培养基+10％FBS)(FBS:胎牛血清)终止消化，用完全培养基洗3次后，制成单细胞悬液，调整细胞密度大约为7-8×10⁵/ml，接种于用L-多聚赖氨酸包被过的6孔/96孔细胞培养板/60mm的培养皿/玻片。24小时后全换成无血清的神经元培养基(Neurobasal medium培养基，GIBCO公司)，置5％CO₂、37℃培养箱培养，每三天半量换液。培养直至形成丰富的神经网路，表明神经元成熟。

(2)海马神经元NMDA损伤处理①吸出原来的培养基，无镁细胞外液洗涤细胞三次，每次5分钟。②以无镁细胞外液配制10mM NMDA(N-甲基-D-天冬氨酸)、10mM Gly(甘氨酸)，将NMDA用无镁细胞外液配成不同浓度，其中Gly的终浓度为10μM。正常对照组无镁细胞外液中不含有NMDA和Gly，其余均和实验组一致。损伤后用DMEM基培洗涤细胞三次，每次5分钟。③重新加入原来的培养基，继续培养24小时。

(3)NMDA损伤后海马神经元的活力检测①海马神经元以8×10 ⁵个/ml接种细胞96孔培养板中，每孔0.1ml。5％CO 2培养箱中培养7～8天。②NMDA损伤处理，继续培养24小时后，将培养液吸除。③每孔加100μl含MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，0.5mg/ml)的DMEM基培，放入37℃，5％CO₂培养箱中培养4h。④每孔加入100μl 20％SDS(20g十二烷基硫酸钠溶于50ml ddH₂O+50ml N,N二甲基甲酰胺)，37℃20h。⑤在水平摇床上摇匀5分钟。⑥酶标仪上570nm(参考波长490nm)处测定光密度值(OD)。

(4)不同浓度NMDA作用1小时对海马神经元活力的影响。实验分为6实验组：正常组、10μM NMDA组、30μM NMDA组、100μM NMDA组、300μM NMDA组、1000μM NMDA组。其余同上。结果显示：与正常对照组相比，随着NMDA浓度的增加，海马神经元活力显著下降，呈剂量依赖性，结果见图8a。

(5)NMDA(100μM)作用不同时间对海马神经元活力的影响。实验分为5实验组：正常组、NMDA(100μM)15分钟组、NMDA(100μM)30分钟组、NMDA(100μM)60分钟组、NMDA(100μM)90分钟组。其余同上。结果表明，随着100μM NMDA损伤时间的延长，海马神经元活力逐渐下降。结果见图8b。在后续实验中选择NMDA(100μM)30min作为NMDA损伤模型。

(6)牛膝活性肽(ABPPk2)对NMDA引起海马神经元活力下降的影响。不同浓度牛膝活性肽对NMDA(100μM，30min)引起的海马神经元损伤的影响。实验分9实验组：正常组、NMDA(100μM，30min)组(作为对照组)、牛膝活性肽(0.01μg/ml)组、牛膝活性肽(0.1μg/ml)组、牛膝活性肽(0.3μg/ml)组、牛膝活性肽(1μg/ml)组、牛膝活性肽(3μg/ml)组、牛膝活性肽(10μg/ml)组、MK801(地卓西平，10μM)组(作为阳性对照组)。牛膝活性肽给予方式分三种：①牛膝活性肽于NMDA损伤前12小时及损伤中给予。②牛膝活性肽于NMDA损伤中给予。③牛膝活性肽于NMDA损伤后培养24小时中给予。

(7)预先给予牛膝活性肽(ABPPk2)对NMDA引起的培养海马神经元损伤的影响。采用MTT法观察牛膝活性肽对NMDA引起的培养海马神经元损伤的影响。NMDA损伤前应用含不同浓度的牛膝活性肽(0.01-10μg/ml)的无血清神经元培养基或含MK801(10μM)无血清神经元培养基培养12小时后，NMDA(100μM)损伤神经元0.5小时(损伤时含每组相应的不同浓度的牛膝活性肽(0.01-10μg/ml)或MK801(10μM))，继续无血清神经元培养基中培养24小时，进行MTT检测，观察各组细胞活力，结果显示：NMDA损伤组，海马神经元活力明显下降，将NMDA损伤组作为对照组；与NMDA损伤组相比，正常组的海马神经元活力明显增高(p<0.01)；牛膝活性肽对NMDA引起的培养海马神经元损伤的影响具有浓度依赖性，其中牛膝活性肽0.1μg/ml组、牛膝活性肽0.3μg/ml组、牛膝活性肽1μg/ml组能有效减少NMDA损伤所引起的海马神经元活力的下降，结果见图8c。MK801(10μM)组作为阳性对照组，能有效减少NMDA损伤所引起的海马神经元活力的下降，结果见图8d。

(8)同时给予牛膝活性肽(ABPPk2)对NMDA引起的培养海马神经元损伤的影响。采用MTT法观察牛膝活性肽对NMDA引起的培养海马神经元损伤的影响。NMDA(100μM)损伤神经元0.5h(损伤时含不同浓度的牛膝活性肽(0.01-10μg/ml)或MK801(10μM))，继续于原培养基中培养24小时，进行MTT检测，观察各组细胞活力，结果显示：NMDA损伤组，海马神经元活力明显下降，将NMDA损伤组作为对照组；与NMDA损伤组相比，正常组的海马神经元活力明显增高(p<0.01)；牛膝活性肽对NMDA引起的培养海马神经元损伤的影响具有浓度依赖性，其中、牛膝活性肽1μg/ml组、牛膝活性肽10μg/ml组能有效减少NMDA损伤所引起的海马神经元活力的下降，结果见图7。MK801(10μM)组作为阳性对照组，能有效减少NMDA损伤所引起的海马神经元活力的下降；另一方面，损伤时无镁细胞外液中的钙离子被钡离子代替的Ba²⁺，能有效抑制NMDA引起的培养海马神经元损伤(p<0.01)，结果见图8e。

(9)NMDA损伤后予牛膝活性肽(ABPPk2)对NMDA引起的培养海马神经元损伤的影响。采用MTT法观察牛膝活性肽对NMDA引起的培养海马神经元损伤的影响。NMDA(100μM)损伤神经元0.5小时后，继续于含不同浓度的牛膝活性肽(0.1-10μg/ml)或MK801(10μM)原培养基中培养24小时，进行MTT检测，观察各组细胞活力，结果显示：NMDA损伤组，海马神经元活力明显下降，将NMDA损伤组作为对照组；与NMDA损伤组相比，正常组的海马神经元活力明显增高(p<0.01)；牛膝活性肽能有效减少NMDA损伤所引起的海马神经元活力的下降。MK801(10μM)组作为阳性对照组，能有效减少NMDA损伤所引起的海马神经元活力的下降，结果见图8f。

(10)结果表明，牛膝活性肽(ABPPk2)对NMDA诱导的原代培养海马神经元损伤具有保护作用。

实施例七、牛膝活性肽对原代培养的SD胎鼠皮层神经元缺血缺氧损伤的保护作用：

(1)皮层神经元的正常培养：取孕17天SD大鼠的胚胎，解剖显微镜下分离大脑皮层，经0.125％胰腺蛋白酶37℃消化8min，用含10％胎牛血清(FBS)的DMEM完全培养基终止消化，轻柔吹打成单细胞悬液，400目筛网过滤后，1000rpm离心5min，再次吹打成单细胞悬液。用DMEM高糖完全培养基(含10％胎牛血清)接种于预先用多聚赖氨酸(PLL)包被过的培养皿或培养板中，置于5％CO₂、饱和湿度、37℃培养箱内培养。培养4h细胞贴壁后，换神经元培养液(Neurobasal+2％B27)培养3d，观察神经元生长状况。换用含阿糖胞苷的培养液(阿糖胞苷终浓度2.5μg/ml)半量换液，培养3d以抑制神经胶质细胞及杂细胞生长，获得单纯培养的原代皮层神经细胞。采用免疫细胞化学染色鉴定皮层神经元的纯度达到90％以上。

(2)皮层神经元氧糖剥夺(OGD)损伤模型及药物处理

皮层神经元培养至第7天，吸出原来的培养基，用无糖DMEM基础培养基漂洗细胞两次，每次5min。各OGD损伤组均加入DMEM无糖培养基，置于Billups-Rothenberg厌氧培养小室中，充以95％N₂/5％CO₂平衡15min并密闭作用2h，构建OGD模型。OGD结束后进行分组处理如下：OGD损伤组：弃DMEM无糖培养基，加入Neurobasal完全培养基；OGD+牛膝活性肽低剂量组：弃DMEM无糖培养基，加入牛膝活性肽终浓度为8ng/ml的Neurobasal完全培养基；OGD+牛膝活性肽中剂量组：弃DMEM无糖培养基，加入牛膝活性肽终浓度为40ng/ml的Neurobasal完全培养基；OGD+牛膝活性肽高剂量组：弃DMEM无糖培养基，加入牛膝活性肽终浓度为200ng/ml的Neurobasal完全培养基；OGD+BDNF组：弃DMEM无糖培养基，加入BDNF终浓度为10ng/ml的Neurobasal完全培养基培养基，作为阳性对照组。另设正常对照组，细胞正常培养，不做任何损伤或药物处理。将加药处理好的细胞放回37℃、5％的CO₂培养箱，复氧复糖24h，行后续实验。

(3)OGD损伤及药物处理后皮层神经元的镜下观察：如图9所示(×20)，A为正常皮层神经元胞体表面光洁，突起交织成网络状，胞体透亮，折光性明显，B为OGD损伤组，可见部分细胞胞体固缩，细胞突起淡化、减少或消失，折光性下降，已有部分细胞死亡，C、E、F分别为阳性对照组、牛膝活性肽中、高剂量处理组，与OGD损伤组相比，也有部分细胞突起回缩，但细胞胞体皱缩较少，贴壁较多，细胞死亡数明显减少。

OGD损伤及药物处理后皮层神经元的活力分析：皮层神经元以1×10⁶个/ml接种于96孔板，每孔加入100μl细胞悬液，正常培养到第7d后行OGD损伤及加药处理，复氧复糖24h后，每孔加入含有10μl CCK-8的Neurobasal基本培养基100μl，放入37℃、5％的CO₂培养箱孵育2h，于酶标仪上450nm波长下测定每孔样品的吸光度(OD)值。每个实验组设10个复孔，实验重复3次。结果如图10所示：OGD损伤后2h，皮层神经元活力明显下降(与正常对照组相比，#P<0.01)；牛膝活性肽可有效拮抗OGD损伤所引起的皮层神经元活力的下降，在观察的测量范围内，随着牛膝活性肽剂量的增加，其保护作用越明显(与OGD损伤组相比，*P<0.05，**P<0.01)。

(4)牛膝活性肽对OGD损伤皮层神经元凋亡的影响：将预先用PLL包被过的圆玻片置于24孔培养板中，皮层神经元以1×10⁵个/ml的密度接种于其上，每孔加入500μl细胞悬液，培养到第7d后分组及处理方法同上，复氧复糖24h后弃去培养液，用PBS(1X，NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄ 1.44g，KH₂PO₄ 0.24g，加dd H2O至1000ml)漂洗一遍，每孔加入300μl4％多聚甲醛(PFA)室温下固定20min，弃去固定液，用PBS(1X)洗3遍，每遍5min，每孔加入300μl Hoechst33258工作液，室温下避光染色15min，弃去染色液，用PBS(1X)洗3遍，每遍5min。逐一挑出圆玻片，将接种有细胞的一面倒扣在滴加有荧光封片剂的载玻片上，封片，室温下避光干燥2h，激光共聚焦显微镜下观察拍照，每组设4个复孔，实验重复3次。结果如图11所示，A为正常对照组皮层神经元，可见细胞核形态及大小规则，多呈圆形，几乎没有凋亡小体，B为OGD损伤后的神经元，可见细胞核形态不规则，大小不一，固缩、断裂，染色质凝聚，凋亡小体增多；C、D、E、F分别为低、中、高浓度牛膝活性肽及阳性对照BDNF处理后的神经元，可见细胞核形态有所改善，凋亡小体减少。统计凋亡细胞核占总细胞核的比例，结果如图12，与正常对照组相比，OGD损伤后皮层神经元细胞核凋亡小体显著增多(与正常对照组相比，#P<0.01)；不同浓度的牛膝活性肽处理后，皮层神经元细胞核凋亡小体均减少(与OGD损伤组相比，*P<0.05，**P<0.01)，且具有剂量依赖性，提示牛膝活性肽能减少OGD损伤诱导的皮层神经元凋亡小体的形成。

(5)牛膝活性肽对OGD损伤皮层神经元线粒体膜电位的影响：皮层神经元以1×10⁶个/ml接种于六孔板，每孔加入2ml细胞悬液，培养到第7d，分组及处理方法如上所述，复氧复糖24h后弃细胞培养基置于冰上，用PBS(1X)漂洗两遍。采用JC-1染色试剂盒及流式细胞仪检测OGD损伤皮层神经元线粒体膜电位，结果如图13所示，牛膝活性肽处理可减轻OGD损伤的皮层神经元线粒体膜电位下降，且呈现明显的剂量效应关系。(左图为JC-1染色，A.Control,B.OGD,C.ABPPk2 8ng/ml,D.ABPPk2 40ng/ml,E.ABPPk2 200ng/ml,F.BDNF10ng/ml，右图为流式细胞仪检测结果，与OGD损伤组相比，*P<0.05)

(6)牛膝活性肽对OGD损伤皮层神经元ROS含量的影响：皮层神经元以1×10⁶个/ml接种于六孔板，每孔加入2ml细胞悬液，培养到第7d，分组及处理方法如上所述，复氧复糖24h后弃细胞培养基置于冰上，用PBS(1X)漂洗两遍。采用活性氧检测试剂盒检测牛膝活性肽对OGD损伤的皮层神经元ROS含量的影响，结果如图14所示，牛膝活性肽处理可减轻OGD损伤的皮层神经元ROS含量，且呈现明显的剂量效应关系(与正常对照组相比，#P<0.01；与OGD损伤组相比，*P<0.05)

(7)牛膝活性肽对OGD损伤皮层神经元凋亡相关蛋白表达的影响。

细胞总蛋白的提取：皮层神经元以1×10⁶个/ml接种于六孔板，每孔加入2ml细胞悬液，培养到第7d，分组及处理方法如上所述，复氧复糖24h后弃细胞培养基置于冰上，用PBS(1X)漂洗两遍。每孔加入细胞蛋白裂解液(哺乳动物蛋白酶抑制剂：哺乳动物细胞蛋白提取试剂，1:100)80μl，冰上裂解30min，用蛋白刮子将孔内物质刮下转移至1.5ml离心管内，在涡旋振荡器上震荡1min左右，将1.5ml离心管置于4℃离心机以12,000rpm离心30min，将上清转移至新的0.6ml离心管中，即为细胞总蛋白。

线粒体蛋白及去除线粒体胞浆蛋白的提取：皮层神经元以1×10⁶个/ml接种于六孔板，每孔加入2ml细胞悬液，培养到第7d，分组及处理方法如上所述，24h后弃去培养基，用PBS(1X)漂洗细胞后加入0.25％的胰酶消化贴壁皮层神经元，待神经元突起收缩时，弃去胰酶，加入DMEM完全培养基终止消化，于室温下100g离心5-10min，弃上清，加冰浴的PBS(1X)重悬漂洗细胞，取10μl细胞悬浮液用血球计数板计数，其余细胞于4℃、600g离心5min，按照每2～5×10⁷个细胞加1～2.5ml含1mM苯甲基磺酰氟(Phenylmethylsulfonyl fluoride,PMSF)的线粒体分离试剂，轻轻重悬细胞，置冰上10～15min，将细胞悬液转移至合适的玻璃匀浆器中，冰上匀浆到一定次数后，取适量匀浆液进行台盼蓝染色，于显微镜下观察，至蓝色细胞即台盼蓝染色阳性细胞的比例超过50％时，停止匀浆。将匀浆液于4℃、1000g离心10min，以沉降未裂解的细胞、膜碎片及细胞核，转移上清，于4℃、3500g离心10min，沉降线粒体，转移上清于另一离心管中，于4℃离心机中12,000g离心10min，分离上清即为去除线粒体的胞浆蛋白，沉淀物即为线粒体，向其中加入150～200μl含1mM PMSF的线粒体裂解液进行裂解，即获得线粒体蛋白。

细胞核和细胞浆蛋白的提取：皮层神经元以1×10⁶个/ml接种于六孔板，每孔加入2ml细胞悬液，培养到第7d，分组及处理方法如上所述，24h后弃去培养基，加PBS(1X)漂洗一遍，用细胞刮子将细胞刮下，离心，收集细胞，按每20μl细胞加200μl含1mM PMSF的细胞浆蛋白抽提试剂A，涡旋几秒，至沉淀的细胞完全分散，置冰中10～15min，再加细胞浆蛋白抽提试剂B，涡旋5s后于4℃、12,000～16,000g离心5min，上清转移至另一离心管中，即为细胞浆蛋白。沉淀中加入50μl含1mM PMSF的细胞核蛋白抽提试剂，涡旋至沉淀物分散，置冰中30min，期间每隔1～2min取出涡旋15～30s，于4℃、12,000～16,000g离心10min，将上清转移至另一离心管中，即为细胞核蛋白。

Western blot分析：采用BCA法测定蛋白浓度，向蛋白样品中加入SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)稀释至1X，震荡，金属浴内煮沸5min。各取上清10μl进行12％SDS-PAGE。在冰水浴中湿转至PVDF膜，转膜结束后，室温下用25ml TBS/T漂洗5min后，将PVDF膜放入含有5％脱脂奶粉的TBS/T室温封闭1h。用5％脱脂奶粉稀释一抗，除GADPH 1:10000、Bax 1:2000、Cyt C 1:500稀释外，H1、COX、AIF、Bcl-2、Cleaved Caspase-3、Akt、p-Akt均以1:1000稀释，4℃摇床孵育过夜。TBS/T漂洗5min×3次。用TBS-T稀释二抗，Anti-Mouse IgG H&L(HRP)1:10000，Anti-Mouse IgG H&L(HRP)1:20000，室温下摇床孵育2h。TBS/T洗5min×5次，将PVDF膜放入全自动化学发光/荧光图像分析系统，加BeyoECL Star于膜上，进行灰度扫膜。用Image J进行灰度统计，Cyt C以COX或β-actin作内参，AIF以H1或COX作内参，p-AKT以AKT作内参，其余蛋白以GAPDH作内参，进行比较分析。实验重复3批蛋白样品，每批蛋白样品重复3次。结果显示：与正常对照组相比，OGD损伤后皮层神经元细胞总蛋白中抑凋亡蛋白Bcl-2的表达显著下调，促凋亡蛋白Bax、Cleavedcaspase-3表达显著上调(#P<0.05，##P<0.01)，与OGD损伤组相比，牛膝活性肽高剂量组的Bcl-2表达显著上调，而中、高剂量组的促凋亡蛋白Bax、Cleaved caspase-3的表达显著下调(*P<0.05，**P<0.01)，如图15、图16所示。

与正常对照组相比，OGD损伤的皮层神经元线粒体中Cyt C、AIF的表达显著下调，胞浆中Cyt C及胞核中的AIF表达显著上调(#P<0.05，##P<0.01)，牛膝活性肽处理后，线粒体中Cyt C的表达显著上调，胞浆中Cyt C的表达显著下调(如图17)，线粒体中AIF的表达显著上调，而细胞核中AIF的表达显著下调(*P<0.05，**P<0.01)(如图18)。提示牛膝活性肽可下调OGD损伤后皮层神经元促凋亡蛋白的表达，上调抑凋亡蛋白的表达，抑制OGD损伤后皮层神经元线粒体中的Cyt C释放到胞浆中，抑制OGD损伤后皮层神经元线粒体中的AIF释放到细胞核中，进而抑制OGD损伤诱导的皮层神经元凋亡。

在OGD损伤的皮层神经元培养体系中加入PI3K抑制剂LY-294002处理30min后再加入不同浓度的牛膝活性肽和BDNF进行处理，复氧复糖24h，采用Western Blot检测分析p-AKT、Cleaved caspase-3的表达情况，结果显示，与正常对照组相比，OGD损伤后p-AKT表达下调，牛膝活性肽高剂量处理后，p-AKT表达显著上调(P<0.05)；OGD及LY-294002处理后，与OGD组相比，p-AKT表达显著下调(P<0.05)，而牛膝活性肽高剂量组p-AKT表达显著上调(P<0.05)(如图19)。与正常对照组相比，OGD损伤后Cleaved caspase-3表达显著上调(P<0.05)，牛膝活性肽高剂量处理后，Cleaved caspase-3表达显著下调(P<0.01)；OGD及LY-294002处理后，与OGD组相比，Cleaved caspase-3表达显著上调(P<0.01)，而牛膝活性肽高剂量组Cleaved caspase-3表达显著下调(P<0.01)(图20)。提示牛膝活性肽可能通过PI3K/AKT信号通路拮抗OGD损伤诱导的皮层神经元凋亡，进而对OGD损伤诱导的皮层神经元具有保护作用。

实施例八、牛膝活性肽对原代培养的海马神经元生长的影响

(1)胎鼠海马神经元的原代培养：孕17天的大鼠麻醉后于无菌条件下取胎鼠，冰上取出胎鼠大脑，解剖镜下仔细取出海马，除去血管膜。0.125％胰酶/EDTA于37℃消化10min，加入含有10％FBS的DMEM完全培养基终止消化。1000rpm离心5min除去细胞碎片，加入DMEM完全培养基重新悬浮细胞，轻柔吹打至形成单细胞悬液，将细胞以合适密度接种于预先用多聚赖氨酸(PLL)包被的培养板(皿)上，37℃，5％CO₂培养箱培养。4h后细胞贴壁，弃去DMEM完全培养基，换成含有不同浓度牛膝活性肽的neurobasal基础培养基(牛膝活性肽浓度分别为4ng/ml,20ng/ml,100ng/ml),以含有10ng/ml BDNF的neurobasal培养基作为阳性对照组，以neurobasal作为阴性对照组。

(2)采用无标记细胞实时分析(Real time cell analysis,RTCA)系统观察神经元生长：将如(1)所获得的海马神经元单细胞悬液以1×10⁶的细胞密度接种在预先包被过PLL的E-plate培养板上，4h后细胞贴壁，弃去DMEM完全培养基，换成含有不同浓度牛膝活性肽的neurobasal基础培养基(牛膝活性肽浓度分别为4ng/ml,20ng/ml,100ng/ml)，以含有10ng/ml BDNF的neurobasal培养基作为阳性对照组，以neurobasal作为阴性对照组，实时观察细胞生长曲线，细胞指数越高，代表细胞生长越好，对神经元而言，代表神经元胞体的生长及轴突的延伸越多。每个实验组设2个复孔，实验重复3次。结果显示，牛膝活性肽处理能促进海马神经元的生长和突起的延展，如图21。

(3)采用活细胞工作站(Live cell station)观察神经元生长：将如(1)所获得的海马神经元单细胞悬液以5×10⁵的细胞密度接种在预先包被过PLL的培养板上，4h后细胞贴壁，弃去DMEM完全培养基，换成含有100ng/ml牛膝活性肽的neurobasal基础培养基，以含有10ng/ml BDNF的neurobasal培养基作为阳性对照组，以neurobasal作为阴性对照组，将培养板置于活细胞工作站细胞培养小室中，连续观察48h，每两分钟自动拍摄视野下的神经元。每个实验组设2个复孔，实验重复3次。结果显示，牛膝活性肽处理能促进海马神经元的生长和突起的延展，如图22。

(4)采用免疫细胞化学染色法观察牛膝活性肽对原代胎鼠海马神经元突起生长锥的作用。原代海马神经元按(1)中所述步骤培养，细胞以5×10⁴密度接种于预先用PLL包被的小圆玻片上，置于24孔培养板培养，分组处理同上。24h后进行β-tubulin3(TRITC)和F-actin(FITC)双标免疫细胞荧光化学染色，激光共聚焦显微镜下观察神经元生长的情况，统计神经元生长锥面积和丝足长度，如图23。结果显示，牛膝活性肽作用12h能显著增加生长锥面积，增加丝状伪足的长度(与阴性对照组相比，***P<0.001)。

(5)采用免疫细胞化学染色法观察牛膝活性肽对原代胎鼠海马神经元突起生长的作用。原代海马神经元按(1)中所述步骤培养，细胞以5×10⁴密度接种于预先用PLL包被的小圆玻片上，置于24孔培养板培养，分组处理同上。24h后进行β-tubulin3免疫细胞化学染色，激光共聚焦显微镜下观察神经元突起生长的情况，统计神经元突起长度和从神经元胞体发出的突起数。突起长度从胞体轴丘部位起至轴突顶端，从神经元胞体发出的突起数指直接与胞体相连的突起延伸，如图24。结果显示，牛膝活性肽作用24h能显著促进海马神经元突起延伸，显著增加从神经元胞体发出的突起数目(与阴性对照组相比，***P<0.001)。

(6)对药物作用48h的海马神经元进行β-tubulin3免疫细胞化学染色，激光共聚焦显微镜下观察神经元突起生长的情况，统计神经突起分支数目及不同长度突起的神经元所占比例，神经突起分支数目指以神经元胞体为圆心，100μm为半径的圆形范围内神经突起的分支数，结果如图25。作用48h，牛膝活性肽处理组海马神经元突起分支显著增多，长突起神经元所占比例显著高于阴性对照组(与阴性对照组相比，***P<0.001，*P<0.05)。

(7)牛膝活性肽对原代培养的海马神经元突触形成的促进作用。如上所述培养原代海马神经元，细胞经药物处理8d，进行突触前膜标记蛋白Synaptotagamin1/2(SYN)和突触后膜标记蛋白post synapse density protein 95(PSD95)双标免疫荧光细胞化学染色，SYN与PSD95共定位的小嵴则为一个突触结构，激光共聚焦显微镜下随机选取视野拍照，统计每100μm的神经突起上突触小嵴的数量。采用Western blot分析牛膝活性肽对PSD95表达的影响。步骤如下：提取总蛋白并用Bradford法测定总蛋白浓度，将蛋白上清溶于1×SDS上样缓冲液，煮沸5min，进行12％SDS-PAGE电泳，再将蛋白湿法转移至PVDF膜，5％脱脂奶粉封闭后，依次加入一抗(mouse anti monoclonal PSD95,1:1000)及二抗(HRP goat-anti-mouse IgG,1:200)，以GAPDH(1:200)作为内参，最后用ECL法显色，压片、曝光、显影，GS800Calibrated Densitometer扫描仪(BIO-RAD)进行灰度扫描，PDQuest7.2.0软件分析。结果如图26，牛膝活性肽处理8d，能显著增加突触形成的数量，上调PSD95蛋白表达。

实施例九、采取同源建模方式，多二硫键长链肽的立体空间结构

针对多二硫键长链肽的序列CLETSGSCIPGAQHNCCSGVCVPLVTLFYGVCY，在PDB数据库中进行同源性检索(BLAST)，结果显示，PDB编号为1Q3J的蛋白晶体结构A链片段与该序列同源性最高，整体结构相似性为48％(见Scheme1)，覆盖率也比较理想(96％)。因此，选择该晶体结构(1Q3J_A)做为该序列结构同源模建的模板。

Scheme1.某多二硫键长链肽与1Q3J的A链片段序列比对结果

使用SWISS-MODEL工具进行了该序列多肽3D结构的同源模建。由于模板结构限制，同源模建得到的该序列结构只有1-32位残基，Tyr33是缺失的。这里，我们先补充上Tyr33，然后，使用分子动力学模拟软件Amber软件对该序列结构进行优化，模拟时长为20ns，删除其中的水分子和Na离子后，保存相应PDB文件。该PDB文件通过Pymol软件打开。图27显示了经过分子动力学优化后的该序列的三维结构模型。从图中可以看出，该序列的三维结构是以loop结构为主，此外有两个较短的β折叠结构(分别由Cys21-Pro23和Gly30-Cys32构成)。

实施例十、牛膝活性肽衍生化物的合成及活性研究

将上述改变序列后的多二硫键长链肽，由上海波泰公司进行合成。合成过程使用Fmoc/tBu策略，在Fmoc-AM-MBHA树脂上以固相来进行所述肽的合成(Barany,G.和Merrifield,R.B.J Am Chem Soc.99(1977)7363-7365)。使用DIC/HOBt进行活化的方法来偶联氨基酸，并且采用水合茚三酮试验来验证偶联反应的完成(Kaiser,E.,Colescott,R.L.,Bossinger,C.D.,Cook,P.I.Anal Biochem.34(1970)595-598)。通过用TFA/EDT/H2O/TIS(94％/2.5％/2.5％/1％)溶液进行处理来使所述肽从树脂上分离，用醚进行沉淀，并冻干72小时。通过经用二甲亚砜(DMSO)进行氧化而形成二硫桥来实现环化(PeptideSynthesis Protocols,Methods in Molecular Biology,Totowa,NJ,1994,第91-169页)，并且通过RP-HPLC进行纯化。在分析型RP-HPLC上独立地分析所收集的级分，并且通过合并具有大于95％纯度的级分来制作牛膝肽衍生化物的最终制备物。获得序列CLETSGSCIPGAQHNCCSGVCVPLVTLFYGVCY的多二硫键长链肽，二硫键的连接方式为CysI-CysIV,CysII-CysV,CysIII-CysVI。该多二硫键长链肽，进行对原代海马神经元NMDA损伤影响的实验，实验方案同实施例六。实验结果表明，该多二硫键长链肽可以有效减少NMDA损伤引起的海马神经元活力下降，从而证明该修饰后的多肽对NMDA引起的原代海马神经元损伤有保护作用。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (16)

1.具有神经保护活性的多二硫键长链肽，其特征在于，该多肽的氨基酸序列为牛膝（AchyranthesbidentataBlume）活性肽的氨基酸序列，

Cys-Leu-Glu-Ser-Gly-Thr-Ser-Cys-Ile-Pro-Gly-Ala-Gln-His-Asn-Cys-Cys-Ser-Gly-Val-Cys-Val-Pro-Ile-Val-Thr-Ile-Phe-Tyr-Gly-Val-Cys-Tyr。

2.根据权利要求1所述的多二硫键长链肽，其特征在于，三对二硫键的连接方式为：CysI-CysIV即由所述活性肽的氨基酸序列的第1个Cys中的硫与第4个Cys中的硫相连形成二硫键, CysII-CysV即由所述活性肽的氨基酸序列的第2个Cys中的硫与第5个Cys中的硫相连形成二硫键, CysIII-CysVI即由所述活性肽的氨基酸序列的第3个Cys中的硫与第6个Cys中的硫相连形成二硫键。

3.根据权利要求1或2 所述的多二硫键长链肽，其特征在于，立体空间结构中包含两对或三对β-反平行结构，位于多二硫键长链肽的N端，中间序列及C端。

4.根据权利要求1所述的多二硫键长链肽，其特征在于，其中保留牛膝肽与NMDA2B受体相互作用的作用位点, 即Gln13、Asn15，Phe28和Tyr33。

5.根据权利要求1所述的多二硫键长链肽，其特征在于，其包含该肽的N-末端和C-末端的氨基基团和羰基基团而形成的线性肽，或该肽的N-末端和C-末端的氨基基团与羰基基团之间的肽键而形成的环状肽。

6.根据权利要求1所述的多二硫键长链肽，其特征在于，其包含基团Leu-Glu-Ser-Gly-Thr, Ile-Pro-Gly-Ala, Pro-Ile-Val-Thr-Ile和除它们之外固定序列中的半胱氨酸，并且两个半胱氨酸间隔九个以上氨基酸残基时，相应的半胱氨酸形成二硫化物共价键。

7.根据权利要求1或6所述的多二硫键长链肽，其特征在于，其包含基团Leu-Glu-Ser-Gly-Thr, Ile-Pro-Gly-Ala, Pro-Ile-Val-Thr-Ile和除它们之外固定序列Lys和Arg的侧链氨基基团、Glu和Asp的侧链羰基基团、Gln和Asn的侧链酰胺基团，所述的氨基基团、羰基基团或酰胺基团分别可以与如下单糖或二糖形成糖苷键，单糖包括阿拉伯糖，核糖，木糖，来苏糖，葡萄糖，甘露糖，果糖，半乳糖中的一种或二种以上，二糖包括麦芽糖，乳糖，蔗糖，海藻糖，纤维二糖，龙蛋二糖，蜜二糖中的一种或二种以上。

8.根据权利要求1所述的多二硫键长链肽，其特征在于，该多肽的N-末端共价的连接至焦谷氨酸或乙酰基基团，乙酰基包括乙酰胆碱、对乙酰氨基酚、乙酰水杨酸、乙酸、乙酰胺和乙酸酐中的一种或二种以上。

9.药物组合物，其包含至少一种根据权利要求1～8任一所述多二硫键长链肽。

10.根据权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中还包括药学上可接受的载体。

11.根据权利要求10所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中还包括药学上可接受的溶剂、赋形剂。

12.一种权利要求1～8任一所述多二硫键长链肽在制备治疗缺血性脑中风的中枢神经保护剂中的应用。

13.一种权利要求1～8任一所述多二硫键长链肽在制备治疗神经元缺血缺氧损伤药物中的应用。

14.一种权利要求1～8任一所述多二硫键长链肽在制备促进海马神经元生长药物中的应用。

15.根据权利要求12～14任一所述的应用，其特征在于，所述药物中还包括药学上可接受的载体。

16.根据权利要求15所述的应用，其特征在于，所述药物中还包括药学上可接受的溶剂、赋形剂。

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