CN101921314B - 脑靶向防治老年性痴呆的神经营养因子融合多肽及制备方法 - Google Patents
脑靶向防治老年性痴呆的神经营养因子融合多肽及制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了脑靶向防治老年性痴呆的神经营养因子融合多肽，该融合多肽由神经营养因子活性肽段和11肽，以及位于神经营养因子活性肽段和11肽中间的6-氨基己酰(6-aminohexanoyl，Ahx)构成，11肽的氨基酸序列为YGRKKRRQRRR，神经营养因子活性肽段是脑源性神经营养因子(BDNF)、神经生长因子(NGF)或睫状神经营养因子(CNTF)。该融合多肽能透过血脑屏障，可用于老年性痴呆的预防和治疗。
Description
技术领域
发明属于生物医药技术领域，具体涉及能穿过血脑屏障、防治老年性痴呆的神经营养因子多肽类药物。
背景技术
老年性痴呆是最常见的神经退行性病，严重威胁人类健康的疾病，其病理学特征是大量神经元内形成以过度磷酸化的微管相关蛋白tau为主要成分的神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles，NFTs)及由β-淀粉样多肽(β-amyloid，Aβ)沉积与神经元外形成的大量老年斑(senile plaques，SP)，同时伴有胆碱能神经元数量、神经元突触数量的大量减少，临床上表现为进行性认知功能表减退。
目前尚没有针对老年性痴呆病理特征的治疗药物和方法。美国FDA通过治疗老年性痴呆的药物主要有乙酰胆碱酯酶(AChE)抑制剂和NMDA受体拮抗剂两类，这两类药物仅对中晚期老年性痴呆患者的痴呆症状有所轻度改善或延缓痴呆进展。因此研发新的针对老年性痴呆病理学特征的药物，成为全球的期待。
大量研究资料已证实神经营养因子具有神经保护、防治老年性痴呆的作用。如神经生长因子(NGF)是研究得最早、最多的一种神经营养因子。神经元存活、生长、迁移、分化，神经元与其它神经元建立功能性、结构性联系，神经元损伤后修复与再生，神经元退行性变性等过程均受到NGF的影响。NGF是典型的靶向性神经营养因子，能促进神经元分化、维持神经元的生长和功能、促进损伤 后修复。给老年性痴呆模型大鼠脑内注射NGF，阻止了90-100％的胆碱能神经元的丢失，并改善了大鼠的学习记忆能力。
目前，神经营养因子已作为外周神经损伤治疗药物在临床使用，作为蛋白类药物，由于其分子量大不能通过血脑屏障大大限制了其临床应用价值，尽管有报道采用脑室穿刺给药，但这种方法因操作复杂且容易感染不被广泛应用。因此，突破血脑屏障并定向作用于神经元将使神经营养因子在脑内发挥其完美的生物学效应。
如何让药物进入中枢，是制约中枢药物研发的瓶颈。神经营养因子最有可能通过特异性载体进入中枢。目前已知的载体存在着明显的局限性和缺点。如：TFR缺乏中枢定向性并可引起免疫反应；0X26/8D3易导致免疫反应；M6P受体只在哺乳动物幼年才有表达；RAP易被体内清除机制清除。1988年科学家发现1型人类免疫缺陷病毒(HIV-1)所编码的一种转录激活蛋白(11肽)具有很强的穿透生物膜的特性，可作为异种蛋白透膜的一种载体并能保持其生物学活性。
发明内容
本发明的任务是提供一种脑靶向防治老年性痴呆的神经营养因子融合多肽，该融合多肽由神经营养因子活性肽段和11肽，以及位于神经营养因子活性肽段和11肽中间的6-氨基己酰(6-aminohexanoyl，Ahx)构成，所述的11肽的氨基酸序列为YGRKKRRQRRR，所述的神经营养因子活性肽段是脑源性神经营养因子(BDNF)、神经生长因子(NGF)或睫状神经营养因子(CNTF)。所述的脑源性神经营养因子(BDNF)是DPAKR或PAAKR；所述的神经生长因子(NGF)是KGKE或TDEKQ；所述的睫状神经营养因子(CNTF)是LFEKKL。
据文献报道，神经营养因子活性肽段在氧化成环的情况下效能更高。因此， 本发明在制备融合多肽过程中，在神经营养因子活性片段两端设计加入了成环氨基酸序列C。[二硫键成环的方法参见：王良友，潘和平，陈正英：肽合成中几种形成二硫键方法的介绍[J].有机化学，1998，18(6)：576-580)]。
本发明提供的融合多肽的具体氨基酸序列如下：
①CDPAKRC-Ahx-YGRKKRRQRRR(命名为PAD1)；
②CPAAKRC-Ahx-YGRKKRRQRRR(命名为PAD2)；
③CKGKEC-Ahx-YGRKKRRQRRR(命名为PAD3)；
④CTDEKQC-Ahx-YGRKKRRQRRR(命名为PAD4)；
⑤CLFEKKLC-Ahx-YGRKKRRQRRR(命名为PAD5)。
本发明融合多肽中的神经营养因子可来源于鼠、人或重组合成。
以本发明融合多肽为活性成份，可制备防治老年性痴呆的药物。
本发明融合多肽可采用化学合成方法制备，也可采用如下方法制备：构建神经营养因子活性肽段-连接片段(Ahx)-11肽(YGRKKRRQRRR)融合基因的大肠杆菌表达载体以及神经营养因子-11肽(YGRKKRRQRRR)融合基因的大肠杆菌定向多拷贝表达载体，在大肠杆菌中表达后纯化。
本发明的特点是：构建神经营养因子和11肽的融合多肽，利用11肽穿透生物膜的优势，使神经营养因子透过血脑屏障在中枢神经元富集并发挥对老年性痴呆的防治作用，且可以外采用周静脉注射方式给药。所构建的融合多肽保留了神经营养因子的生物学活性、能穿透血脑屏障直接作用于脑，发挥防治作用。
实验资料
一、PAD1对AD大鼠模型的神经保护作用
1.实验对象
SD大鼠(华中科技大学同济医学院实验动物中心提供)，体重250-300g，雄性。随机分为三组：正常对照组、模型组、融合多肽组，每组10只。
2.实验模型制备氢溴酸东莨菪碱(武汉远城科技有限公司提供)腹腔注射
正常对照组：给予11肽和生理盐水
模型组：给予11肽和氢溴酸东莨菪碱造模
PAD1组：给予PAD1和氢溴酸东莨菪碱造模，连续给药7天
3.研究方法
外周注射的PAD1在脑组织神经元中的表达：荧光标记多肽
大鼠学习记忆能力：Morris水迷宫
P-ERK/ERK和P-P38/P38的含量比：蛋白免疫印迹
大鼠脑组织中丙二醛的含量测定
4.PAD1序列为：CDPAKRC-Ahx-YGRKKRRQRRR
5.实验结果
(一)PAD1的制备、纯度及结构的鉴定
PAD1直接通过化学合成和纯化，经高效液相色谱法(HPLC)和质谱分析(MS)得到PAD1的纯度为98.95％(见图1)，其分子量为612.3Da(见图2)。
(二)PAD1功能鉴定
①外周注射的PAD1在脑组织神经元中的表达
将绿色荧光标记的PAD1经腹腔注射(5mg/kg)SD大鼠体内，0.5h后取脑，脑组织固定后振荡切片，脑片厚度为50um，共聚焦显微镜下观察发现融合多肽 能透过血脑屏障到达中枢部位并进入神经元细胞体内。荧光标记的PAD1由Louisiana State University School of Medicine的Youming Lu教授提供。箭头所示绿色显示的为荧光标记的PAD1，蓝色显示的为Hoechset染的细胞核(见图3)。
②PAD1改善东莨菪碱致痴呆模型的学习记忆能力
Morris水迷宫的测试结果显示模型组和正常对照组相比，找到平台的潜伏期明显延长(p＜0.01)，穿越平台区域次数显著减少(p＜0.001)，在平台所在的目标象限的时间和路程也明显减少(p＜0.05)，表明东莨菪碱致痴呆模型的建立达到了预期效果。PAD1组和模型组相比，找到平台的潜伏期明显缩短(p＜0.01)，穿越平台区域次数明显增多(p＜0.01)，在平台所在的目标象限的时间和路程明显增加(p＜0.01和p＜0.05)，提示PAD1能改善东莨菪碱致痴呆模型的学习记忆能力(见图4)。
③PAD1恢复脑组织中P-ERK/ERK和P-P38/P38信号途径
免疫印迹的结果显示，对脑组织中P-ERK/ERK和P-P38/P38的比值进行比较，模型组比正常对照组均有所下降，而PAD1组比模型组又有所上升，提示PAD1能有效激活细胞信号转导因子而促进细胞的生长、增殖和分化。见图5。
④PAD1能降低机体内脂质过氧化
丙二醛的含量可反映机体内脂质过氧化的程度，间接地反映出细胞损伤的程度。大鼠脑组织中丙二醛(MDA)的含量测定结果显示：模型组和正常对照组相比，丙二醛的含量有明显升高(p＜0.05)，提示东莨菪碱致痴呆模型造成了一定程度的细胞损伤，给予PAD1治疗后，可见丙二醛的含量有显著的下降(p＜0.01)，表明此PAD1能降低机体内脂质过氧化的水平而达到修复细胞损伤的作用(见图6)。
二、PAD4对AD小鼠模型的神经保护作用
1.实验对象
Balb/c小鼠(华中科技大学同济医学院实验动物中心提供)，体重25±2g，雄性。随机分为三组：正常对照组，模型组，融合多肽组，每组10只。
2.实验模型制备D-半乳糖颈部皮下注射(120mg/kg)，每天一次连续六周注射
正常对照组：给予11肽和生理盐水
模型组：给予11肽和D-半乳糖造模
PAD4组：给予PAD4和D-半乳糖造模，多肽自造模后第五周每天连续给药一周。
3.研究方法
小鼠学习记忆能力：电跳台
脑组织中信号转导相关因子含量测定：蛋白免疫印迹
4.实验结果
①PAD4改善D-半乳糖致痴呆模型的学习记忆能力
电跳台测试结果显示模型组和正常对照组相比，其潜伏期明显缩短(p＜0.05)，错误次数明显增多(p＜0.05)，给予PAD4治疗后，PAD4组比模型组的潜伏期显著延长(p＜0.01)，错误次数也显著降低(p＜0.01)，提示PAD4能改善D-半乳糖致痴呆模型的学习记忆能力(见图7)。
②蛋白免疫印迹
免疫印迹的结果显示，对脑组织中P-ERK/ERK和P-AKT/AKT的比值进行比较，模型组比正常对照组均有所下降，而PAD4组比模型组又有所上升，提示PAD4 能有效激活细胞信号转导因子而促进细胞的生长、增殖和分化。见图8。
用PAD2、PAD3和PAD5进行以上实验，结果证明有相同效果。
附图说明
图1HPLC分析PAD1纯度为98.95％；
图2质谱分析PAD1分子量为612.3Da；
图3外周注射PAD1进入脑组织并在神经元中表达(箭头所示)；
图4PAD1改善东莨菪碱致痴呆模型的学习记忆能力；
图5PAD1恢复脑组织中P-ERK/ERK和P-P38/P38信号途径；
图6PAD1能降低机体内脂质过氧化；
图7PAD4改善D-半乳糖致痴呆模型的学习记忆能力；
图8PAD4恢复脑组织中P-ERK/ERK和P-AKT/AKT信号途径。
具体实施方式
实施例 本发明融合多肽的制备
1.神经营养因子活性肽段-连接片段(Ahx)-11肽(YGRKKRRQRRR)融合基因的大肠杆菌表达载体以及神经营养因子-连接片段(Ahx)-11肽(YGRKKRRQRRR)融合基因的大肠杆菌定向多拷贝表达载体，在大肠杆菌中表达、纯化。
1.1在人类基因库中筛选目标神经营养因子及其可能的活性片段；
1.2确定目标神经营养因子及其可能的活性片段的序列；
1.3构建目标神经营养因子及其可能的活性片段与-11肽的融合基因大肠杆菌表达载体；
1.4构建目标神经营养因活性片段与-连接片段(Ahx)-11肽的大肠杆菌定 向多拷贝表达载体。
1.5在大肠杆菌中表达、纯化。
在大肠杆菌中表达目标神经营养因子及其可能的活性片段与-11肽的融合基因；
1.6收获、并纯化上述融合肽；筛选高效定向多拷贝表达载体。
2.直接化学合成神经营养因子活性肽段-连接片段(Ahx)-11肽(YGRKKRRQRRR)融合多肽。
2.1合成方法是用经典的SPPS合成方法：在合成时选用0.21mmol/g的G]y-WangResin以5的投料比在0.1mmo]的合成规模下进行，首先应用Asn的偶联选用HBTU、HOBT、DIEA反应，在茚检呈透明时用DMF、甲醇和DMF洗涤，再选用20％六氢吡啶溶液脱除Fmos并继续用DMF、甲醇、二氯甲烷洗涤。重复偶联和洗涤脱除Foms后依次偶联剩余氨基酸，在最后一个AA偶联完全后脱除Fmoc并用DMF洗涤，最后用甲醇收缩，抽干树脂。再使用经典裂解液裂解2h后用冰乙醚沉降即可获得粗肽。
2.2纯化方法：应用30*250mm的C18色谱柱进行纯化，其中A相选用0.1％TFA，B相用100％ACN，20ml/min的流速下在230nm下进行纯化。
序列表
<110>华中科技大学
<120>脑靶向防治老年性痴呆的神经营养因子融合多肽
<130>/
<160>5
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>19
<212>PRT
<213>人工
<220>
<221>6-aminohexanoyl
<222>(8)..(8)
<220>
<221>DISULFID
<222>(1)..(7)
<400>1
Cys Asp Pro Ala Lys Arg Cys Xaa Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln
1 5 10 15
Arg Arg Arg
<210>2
<211>19
<212>PRT
<213>人工
<220>
<221>6-aminohexanoyl
<222>(8)..(8)
<220>
<221>DISULFID
<222>(1)..(7)
<400>2
Cys Pro Ala Ala Lys Arg Cys Xaa Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln
1 5 10 15
Arg Arg Arg
<210>3
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
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20
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<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>6-aminohexanoyl
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<220>
<221>DISULFID
<222>(1)..(7)
<400>4
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1 5 10 15
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<210>5
<211>20
<212>PRT
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<220>
<221>6-aminohexanoyl
<222>(9)..(9)
<220>
<221>DISULFID
<222>(1)..(8)
<400>5
Cys Leu Phe Glu Lys Lys Leu Cys Xaa Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg
1 5 10 15
Gln Arg Arg Arg
20
Claims (3)
1. 一种融合多肽，所述融合多肽为CDPAKRC-Ahx-YGRKKRRQRRR或CTDEKQC-Ahx-YGRKKRRQRRR,其中Ahx是6-氨基己酰。
2.一种防治老年性痴呆的药物，其特征在于，含有权利要求1所述的融合多肽。
3.权利要求1所述的融合多肽的制备方法，其特征在于采用化学合成方法制备。
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