CN105985410B

CN105985410B - 芋螺肽、其药物组合物及用途

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Publication number: CN105985410B
Application number: CN201510081894.6A
Authority: CN
Inventors: 罗素兰; 长孙东亭; 朱晓鹏; 吴勇; 胡远艳; 李晓丹; J·迈克尔·麦金托什; 戴维·J·克雷克
Original assignee: Hainan University
Current assignee: Hainan University
Priority date: 2015-02-16
Filing date: 2015-02-16
Publication date: 2019-11-29
Anticipated expiration: 2035-02-16
Also published as: CN105985410A

Abstract

本发明属于生物化学和分子生物学领域，涉及一种新芋螺毒素肽、其药物组合物、其制备方法及用途。本发明还涉及所述芋螺毒素肽的核酸构建体、其表达载体和转化的细胞、以及其融合蛋白。本发明还涉及一种阻断乙酰胆碱受体的方法、以及所述芋螺毒素肽的制药用途。本发明的新芋螺毒素肽K41JM及其类似物能够特异地阻断乙酰胆碱受体(nAChRs)(例如α9α10nAChR)，并且具有治疗神经痛、癌症化疗、乳腺癌、肺癌、伤口愈合、脑脊髓炎、癫痫、局部缺血等的活性，具有在制备镇痛药物、抗癌药物等，以及神经科学工具药等方面的良好应用前景。

Description

芋螺肽、其药物组合物及用途

技术领域

本发明属于生物化学和分子生物学领域，涉及一种新芋螺肽、其药物组合物、其制备方法及用途。本发明还涉及所述芋螺肽的类似物。本发明还涉及一种阻断烟碱乙酰胆碱受体(nAChRs)的方法、以及所述芋螺肽的制药用途。

背景技术

烟碱型乙酰胆碱受体(nAChRs)是动物界普遍存在的离子通道型受体，从低等的线虫到高等的哺乳动物都含有该类受体(Nicke,A. (2004)Learning about structure andfunction of neuronal nicotinic acetylcholine receptors.Lessons fromsnails.European journal of biochemistry/FEBS 271,2293)。nAChRs受体位于神经-肌肉(和/或) 神经-神经接头的突触内和突触外，激活多巴胺、去甲肾上腺素、五羟色胺、γ-氨基丁酸等多种神经递质的释放。nAChRs介导众多中枢和外周神经系统的生理功能，包括学习、记忆、应答、镇痛、感觉信号加工和运动控制等，它们具有重要的生理功能和临床研究意义。大量研究显示nAChRs是筛选诊断和治疗一大类重要疾病药物的关键靶点，这些疾病包括疼痛、成瘾、癌症、智障、帕金森症、精神病、抑郁、重症肌无力等疑难杂症等。

nAChRs是由5个亚基组成的五聚体跨膜蛋白，分为肌肉型和神经型两大类，其中神经型nAChRs异常复杂，它们由不同的α和β亚基组成异源或同源型的功能性受体亚型，在脊椎动物中，至少有12 个亚基，即α2–α10,β2–β4。虽然这些亚型的药理学功能截然不同，但其结构非常相似，极难区分，以致各个亚型的生理功能和药理学作用至今尚不很清楚。由于缺乏针对各种亚型的高选择性配体化合物，要研究和阐明各种各样的nAChRs亚型的精细结构和功能面临诸多挑战。因而，发现和开发各个亚型的特异性分子探针，将有利于揭示和阐释它们在生命体内的功能，同时有可能研发出针对上述不同疾病的治疗药物(Livett BG,Sandall DW,Keays D,Down J,Gayler KR, Satkunanathan N,Khalil Z.Therapeuticapplications of conotoxins that target the neuronal nicotinic acetylcholinereceptor.Toxicon. 2006,48(7):810-829.Nicke,A.,Wonnacott,S.&Lewis,R.J. Alpha-conotoxins as tools for the elucidation of structure and function of neuronalnicotinic acetylcholine receptor subtypes.European journal of biochemistry/FEBS 271,2004,2305-2319.Dani,J.A.& Bertrand,D.Nicotinic acetylcholinereceptors and nicotinic cholinergic mechanisms of the central nervoussystem.Annual review of pharmacology and toxicology 2007,47:699-729)。

在神经型nAChRs的各种亚型中，α9α10亚型在生物医药领域越来越备受关注。研究表明，α9α10 nAChR是治疗神经痛药物的新靶点(McIntosh,J.M.；Absalom,N.；Chebib,M.；Elgoyhen,A.B.； Vincler,M.,Alpha9 nicotinic acetylcholine receptors and thetreatment of pain.Biochemical pharmacology 2009,78(7),693-702. Satkunanathan,N.；Livett,B.；Gayler,K.；Sandall,D.；Down,J.； Khalil,Z.,Alpha-conotoxin Vc1.1alleviates neuropathic pain and accelerates functional recovery of injuredneurones.Brain research 2005,1059(2),149-58.)。α9α10 nAChR阻断剂具有治疗神经痛、预防神经受伤、和加速受伤神经恢复的功能，可能是通过免疫机制发挥作用(Holtman,J.R.；Dwoskin,L.P.；Dowell,C.；Wala,E.P.；Zhang, Z.；Crooks,P.A.；McIntosh,J.M.,Thenovel small molecule alpha9alpha10 nicotinic acetylcholine receptorantagonist ZZ-204G is analgesic.European journal of pharmacology 2011,670(2-3),500-8. Zheng,G.；Zhang,Z.；Dowell,C.；Wala,E.；Dwoskin,L.P.；Holtman, J.R.；McIntosh,J.M.；Crooks,P.A.,Discovery of non-peptide,small molecule antagonistsof alpha9alpha10 nicotinic acetylcholine receptors as novel analgesics forthe treatment of neuropathic and tonic inflammatory pain.Bioorganic&medicinalchemistry letters 2011,21(8),2476-9)。角化细胞上的α9α10 nAChR在伤口愈合的病理生理学过程中起着很重要的作用(Chernyavsky,A.I.；Arredondo, J.；Vetter,D.E.；Grando,S.A.,Central role of alpha9 acetylcholine receptor in coordinatingkeratinocyte adhesion and motility at the initiation ofepithelialization.Experimental cell research 2007,313(16), 3542-55)。新近研究表明，α9nAChR亚基在乳腺癌组织中过表达，减缓乳腺癌的发生(Chen,C.S.,Lee,C.H.,Hsieh,C.D.,Ho,C.T., Pan,M.H.,Huang,C.S.,Tu,S.H.,Wang,Y.J.,Chen,L.C.,Chang,Y.J.,Wei,P.L.,Yang,Y.Y.,Wu,C.H.,and Ho,Y.S.(2011) Nicotine-induced humanbreast cancer cell proliferation attenuated by garcinol through down-regulation of the nicotinic receptor and cyclin D3 proteins.Breast cancerresearch and treatment 125,73-87. Lee,C.H.,Huang,C.S.,Chen,C.S.,Tu,S.H.,Wang,Y.J.,Chang,Y. J.,Tam,K.W.,Wei,P.L.,Cheng,T.C.,Chu,J.S.,Chen,L.C.,Wu, C.H.,andHo,Y.S.(2010)Overexpression and activation of the alpha9-nicotinic receptorduring tumorigenesis in human breast epithelial cells.Journal of the NationalCancer Institute 102, 1322-1335)。α9亚基变体影响支气管细胞的转化与增殖，该亚基在肺癌的治疗中具有非常重要的意义(Chikova,A.；Grando,S.A., Naturally occurringvariants of human Alpha9nicotinic receptor differentially affect bronchialcell proliferation and transformation. PloS one 2011,6(11),e27978.)。

α9α10乙酰胆碱受体亚型(α9α10 nAChR)最早是因为其在橄榄耳蜗传出神经纤维和耳蜗毛细胞之间介导突触传导而知名(Elgoyhen,A. B.,and Katz,E.(2012)Theefferent medial olivocochlear-hair cell synapse.Journal of physiology,Paris106,47-56)。近来，又发现α9α10 nAChR存在于肾上腺嗜铬细胞，可能调节紧张胁迫反应(Colomer,C., Olivos-Ore,L.A.,Vincent,A.,McIntosh,J.M.,Artalejo,A.R.,andGuerineau,N.C.(2010)Functional characterization of alpha9-containingcholinergic nicotinic receptors in the rat adrenal medulla:implication instress-induced functional plasticity.The Journal of neuroscience 30,6732-6742)。此外，α9和/或α10转录本已报道存在于各种各样的非神经细胞中，包括免疫细胞在内。减弱α9α10 nAChR的功能产生有益的效果，如在动物慢性痛(顽固性痛、神经痛)动物模型上可改变免疫功能产生镇痛效果(McIntosh,J.M., Absalom,N.,Chebib,M.,Elgoyhen,A.B.,and Vincler,M.(2009) Alpha9 nicotinic acetylcholine receptors and thetreatment of pain. Biochemical pharmacology 78,693-702)；在实验性自身免疫性脑脊髓炎动物模型上改变免疫功能产生疗效(Simard,A.R.,Gan,Y., St-Pierre,S.,Kousari,A.,Patel,V.,Whiteaker,P.,Morley,B.J., Lukas,R.J.,and Shi,F.D.(2013)Differential modulation of EAE by alpha9*-and beta2*-nicotinic acetylcholinereceptors.Immunology and cell biology 91,195-200)。在脊椎动物体内，α9和/或α10亚基或许是乙酰胆碱受体家族中的原始祖先(10,11 Lipovsek,M.,Im,G.J., Franchini,L.F.,Pisciottano,F.,Katz,E.,Fuchs,P.A.,and Elgoyhen, A.B.(2012)Phylogeneticdifferences in calcium permeability of the auditory hair cell cholinergicnicotinic receptor.Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America 109, 4308-4313。Franchini,L.F.,and Elgoyhen,A.B.(2006)Adaptive evolution in mammalian proteins involved in cochlear outerhair cell electromotility.Molecular phylogenetics and evolution 41,622-635)。正因为如此，α9α10 nAChR是海洋生物芋螺猎食脊椎动物鱼类和更原始的无脊椎动物的合理靶标。

α9α10 nAChR参与疼痛信号的传递，阻断α9α10 nAChR的α-芋螺毒素，在慢性挤压伤神经伤害模型(CCI)上具有镇痛效果，以α9 α10 nAChR为靶点的神经痛治疗药物可通过肌肉注射发挥镇痛效应 (Vincler,M.Wittenauer,S.Parker,R.Ellison,M.Olivera,B.M.McIntosh,J.M.Molecular mechanism for analgesia involving specific antagonismof alpha9alpha10 nicotinic acetylcholine receptors.Proc Natl Acad Sci U S A，2006,103(47)：17880-4.Holtman,J.R.； Dwoskin,L.P.；Dowell,C.；Wala,E.P.；Zhang,Z.；Crooks,P.A.； McIntosh,J.M.,The novel small molecule alpha9alpha10 nicotinicacetylcholine receptor antagonist ZZ-204G is analgesic.European journal ofpharmacology 2011,670(2-3),500-8.)，比目前商业化的ω -CTX MVIIA镇痛药物-奇考诺肽给药途径更简便，奇考诺肽需通过编程泵内置于人体内直接给药至脊髓，给药途径很麻烦，该给药泵非常昂贵，目前仅限于美欧等发达国家应用，很难在广大的发展中国家使用(Kress HG,Simpson KH,Marchettini P,Ver Donck A,Varrassi G. Intrathecaltherapy:what has changed with the introduction of ziconotide.Pain Pract.2009；9(5):338-47.Burton AW,Deer TR, Wallace MS,Rauck RL,Grigsby E.Considerationsand methodology for trialing ziconotide.Pain Physician.2010；13(1):23-33.Wallace MS, Rauck RL,Deer T.Ziconotide combination intrathecal therapy:rationale and evidence.Clin J Pain.2010；26(7):635-44)。

据调查，疼痛影响1/6的人群，包括关节炎、神经痛、肿痛。其中神经痛影响4-8％的人群。现有治疗神经痛的方法，主要是局部麻醉用药，来阻断由于外周神经、神经丛、背根神经、交感神经系统等产生的疼痛信号。但这些治疗只能短时间有镇痛效果，但并不能根治神经痛。很多疾病都会引起神经痛，包括癌症与癌症化疗、酒精中毒、坐骨神经痛、糖尿病、三叉神经痛、硬化症、带状疱疹、机械伤和手术伤、艾滋病、头部神经瘫痪、药物中毒、工业污染中毒、淋巴神经痛、骨髓瘤、多点运动神经痛、慢性先天性感觉神经病、急性剧烈自发性神经痛、挤压神经痛、脉管炎(血管炎)/局部缺血、尿毒症、儿童胆汁肝脏疾病、慢性呼吸障碍、复合神经痛、多器官衰竭、脓毒病/ 脓血症、肝炎、卟啉症、维生素缺乏、慢性肝脏病、原生胆汁硬化、高血脂症、麻疯病、莱姆关节炎、感觉神经束膜炎、过敏症等。

目前，生活在热带海洋中的肉食性软体动物芋螺毒液中产生的毒素(芋螺肽conopeptide，或称芋螺毒素conotoxin)备受关注。芋螺毒素具有特异结合动物体内各种离子通道和受体的特殊功能。目前，α*-芋螺毒素更加受到关注，已被用于系统地研究与开发nAChRs各种亚型的特异阻断剂。

芋螺毒素(conopeptide,conotoxin)大多是由7－50个氨基酸残基组成的、富含半胱氨酸(Cys)的神经肽毒素。芋螺毒素按其前体蛋白的内质网信号肽序列的相似性，以及半胱氨酸模式，分为不同的基因家族，至今，所有已知的芋螺毒素可分为18个超家族，分别为A、 B、C、D、S、M、I1、I2、I3、J、L、O1、O2、O3、P、T、V、Y (Kaas Q,Yu R,Jin AH,Dutertre S,Craik DJ(2012)ConoServer: updated content,knowledge,and discovery tools inthe conopeptide database.Nucleic Acids Res 40:D325-330.Sulan Luo,SeanChristensen,Dongting Zhangsun,Yong Wu,Yuanyan Hu,Xiaopeng Zhu,SandeepChhabra,Raymond S.Norton,and J.Michael McIntosh.A Novel Inhibitor of α9α10Nicotinic Acetylcholine Receptors from Conus vexillum Delineates a NewConotoxin Superfamily.PLoS ONE,8(1):e54648(1-10),2013)。芋螺毒素(肽) 按其受体靶位可分为α、ω、μ、δ等多种药理学家族。其中的α类芋螺毒素(α*-Conotoxins)具有阻断烟碱乙酰胆碱受体(nAChRs)的功能；不含有半胱氨酸的芋螺毒素肽Conantokins具有阻断N-甲基-D- 天冬氨酸受体(NMDA受体，N-methyl-D-aspartic acid receptor， NMDAR)的特殊功能。每个超家族芋螺毒素根据受体靶类型，又可分为α、αA、κA(A-超家族)，ω、δ、κ、μO(O-超家族)，μ、ψ、κM(M-超家族)等家族(亚型)。

近来，α9α10 nAChR在生物医药领域引起了广泛兴趣，新的α9α10 nAChR阻断剂是很有价值的工具药，可用来研究分析这个受体亚型的结构与功能，并且还是与该受体有关的疾病，如神经痛、癌症化疗、乳腺癌、肺癌、伤口愈合、实验性自身免疫性脑脊髓炎等的潜在治疗药物。

目前，尚需要开发新的具有活性的芋螺毒素肽或其代替多肽，特别是序列短，不含有二硫键，人工合成更容易，成本更低的多肽。

发明内容

本发明人经过深入的研究和创造性的劳动，人工合成了一类新的多肽。本发明人将这些多肽称为芋螺毒素肽(芋螺肽)，但是尽本发明人的知识而言，并没有发现这些多肽在天然的芋螺或者其它海洋软体动物中存在，并且这些多肽不含有半胱氨酸。本发明人惊奇地发现，本发明的新芋螺毒素肽能够特异性地阻断乙酰胆碱受体(nAChRs)，特别是对神经痛药物靶点、乳腺癌、肺癌等的靶点α9α10 nAChR的阻断活性最强，具有在制备镇痛药物或抗癌症的药物，以及神经科学工具药等方面的良好应用前景。由此提供了下述发明：

本发明的一个方面涉及一种多肽，其为或者包含一个或多个相同或者不同的选自如下的(1)至(3)中任一项所述的氨基酸序列：

(1)SEQ ID NO：1－14中任一序列所示的氨基酸序列；

(2)与上述(1)所述氨基酸序列至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、尤其优选至少95％、最优选至少97％相同的氨基酸序列；或

(3)被1－5个、优选1－3个、更优选1－2个、最优选1个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加而与上述(1)所述序列有所不同的氨基酸序列。

其中，SEQ ID NO：1命名为K41JM，其余为该肽的类似物，命名详见表1。

为了本发明的一个目的，两个或更多个氨基酸序列之间的相同程度是通过BLAST2.0蛋白质数据库查询程序(Aaltschul等，1997，核酸研究25：3389－3402)并采用下列参数确定的：blastall–p blastp-a4-e10-E0-v500-b250-I[查询文档]-d prot_all，其中-p指程序名称，-a指将要用到的服务器数，-e指期望值，-E指延伸缺口的代价， -v指单线描述(one-line description)数,-b指将要显示的比对数，-I指查询文档，-d指用于查询的数据库。

同源多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：1－4中任一氨基酸序列不同之处可能在于取代、插入、添加和/或缺失了1或多个、优选1－5 个、更优选1－3个、尤其优选1－2个、最优选1个氨基酸残基。优选地，氨基酸改变是性质改变较小的变化，即是不会显著影响蛋白质的折叠和/或活性的保守性氨基酸取代；小片段缺失，通常是1到大约 5个、优选1－3个、更优选1个氨基酸的缺失；小的氨基或羧基末端延伸，如氨基端添加的甲硫氨酸残基；有多达大约20－25个残基的小连接肽；或可通过改变净电荷或者其它功能而有助于纯化的小延伸如多聚组氨酸片段、抗原表位或结合区。

保守性取代的例子是在碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、形状相似的氨基酸(精氨酸和丝氨酸之间)、与半胱氨酸密码子相差一个碱基的氨基酸(半胱氨酸、精氨酸、丝氨酸、色氨酸、甘氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)内进行的取代。通常不会改变特异活性的氨基酸取代是本领域已知的，并且由例如H.Neurath和R.L.Hill，1979，在《蛋白质》一书，Academic Press,New York中描述过。最常见的替换是Ala/Ser,Val/Ile,Asp/Glu,Thr/Ser,Ala/Gly,Ala/Thr,Ser/Asn, Ala/Val,Ser/Gly,Arg/Ser,Cys/Ser,Arg/Cys,Arg/Ala,Tyr/Phe, Ala/Pro,Lys/Arg,Asp/Asn,Leu/Ile,Leu/Val,Ala/Glu和Asp/Gly等以及反向进行的替换。

本发明还包括在本发明芋螺毒素肽K41JM及其类似物的N-末端和/或C-末端融合了其它肽/多肽的融合多肽或可裂解的融合多肽。产生融合多肽的技术为本领域内已知，包括连接编码本发明肽的编码序列与编码所述其它肽/多肽的编码序列，使它们在同一读框中，并且融合多肽的表达受控于相同的启动子和终止子。

本发明的另一方面涉及本发明任一项所述的多肽的制备方法，包括下述步骤：

1)在多肽合成仪上或者手工方法合成多肽，Fmoc氨基酸的侧链保护基为:Pmc(Arg)、Trt(Cys)、But(Thr、Ser、Tyr)、OBut(Asp)、Boc(Lys)；或者用tBoc多肽合成方法合成。

2)将步骤1)中得到的线性多肽从树脂上切割下来，并用冰乙醚沉淀和洗涤回收线性多肽粗品,用制备型反向HPLC C18柱纯化。

具体地，步骤1)所述多肽合成仪为ABI Prism 433a多肽合成仪；

具体地，步骤2)所述制备型反向HPLC C18柱为Vydac制造。

本发明的再一方面涉及一种药物组合物，其包含本发明任一项所述的多肽，或者包含本发明的融合蛋白；可选地，其还包含药学上可接受的载体或辅料。

本发明的再一方面涉及一种在体内或体外阻断乙酰胆碱受体的方法，包括使用有效量的本发明任一项所述的多肽或者融合蛋白的步骤；具体地，所述乙酰胆碱受体是α9α10乙酰胆碱受体，或其他乙酰胆碱受体亚型。

在本发明的一个实施方案中，所述在体外阻断乙酰胆碱受体的方法是非治疗目的的。

本发明的再一方面涉及一种确定乙酰胆碱受体亚型的方法，该方法包括将乙酰胆碱受体亚型与本发明任一项所述的多肽或者融合蛋白进行接触的步骤；具体地，所述方法为确定乙酰胆碱受体是否是α9 α10乙酰胆碱受体。当芋螺肽K41JM或其类似物在低浓度下能够特异阻断α9α10乙酰胆碱受体时，则推断该乙酰胆碱受体是α9α10 亚型的乙酰胆碱受体。

本发明的再一方面涉及本发明任一项所述的多肽或者融合蛋白用于阻断乙酰胆碱受体的用途；具体地，所述乙酰胆碱受体是α9α10 乙酰胆碱受体，或其他乙酰胆碱受体亚型。

本发明的再一方面涉及本发明任一项所述的多肽或者融合蛋白在制备阻断乙酰胆碱受体的药物或试剂中的用途；具体地，所述乙酰胆碱受体是α9α10乙酰胆碱受体。

本发明的再一方面涉及本发明任一项所述的多肽或者融合蛋白在制备治疗和/或预防和/或辅助治疗神经系统疾病例如神经痛、成瘾、帕金森症、癫痫症、局部缺血、兴奋性神经元细胞死亡、痴呆、乳腺癌、肺癌、脑脊髓炎，或者制备治疗伤口愈合或者镇痛的药物中的用途；具体地，所述神经痛由如下因素中的一种或多种导致：癌症与癌症化疗、酒精中毒、坐骨神经痛、糖尿病、三叉神经痛、硬化症、带状疱疹、机械伤和手术伤、艾滋病、头部神经瘫痪、药物中毒、工业污染中毒、淋巴神经痛、骨髓瘤、多点运动神经痛、慢性先天性感觉神经病、急性剧烈自发性神经痛、挤压神经痛、脉管炎、血管炎、局部缺血、尿毒症、儿童胆汁肝脏疾病、慢性呼吸障碍、复合神经痛、多器官衰竭、脓毒病/脓血症、肝炎、卟啉症、维生素缺乏、慢性肝脏病、原生胆汁硬化、高血脂症、麻疯病、莱姆关节炎、感觉神经束膜炎或过敏症。

本发明的再一方面涉及一种治疗和/或预防和/或辅助治疗神经系统疾病例如神经痛、成瘾、帕金森症、癫痫症、局部缺血、兴奋性神经元细胞死亡、痴呆、乳腺癌、肺癌、脑脊髓炎，或者治疗伤口愈合或者镇痛的方法，包括给予有效量的本发明的多肽(芋螺肽或其类似物)或者融合蛋白或者本发明的药物组合物的步骤；具体地，所述神经痛由如下原因导致：癌症与癌症化疗、酒精中毒、坐骨神经痛、糖尿病、三叉神经痛、硬化症、带状疱疹、机械伤和手术伤、艾滋病、头部神经瘫痪、药物中毒、工业污染中毒、淋巴神经痛、骨髓瘤、多点运动神经痛、慢性先天性感觉神经病、急性剧烈自发性神经痛、挤压神经痛、脉管炎、血管炎、局部缺血、尿毒症、儿童胆汁肝脏疾病、慢性呼吸障碍、复合神经痛、多器官衰竭、脓毒病/脓血症、肝炎、卟啉症、维生素缺乏、慢性肝脏病、原生胆汁硬化、高血脂症、麻疯病、莱姆关节炎、感觉神经束膜炎或过敏症。

具体地，所述脑脊髓炎是自身免疫性脑脊髓炎，更具体地，是实验性自身免疫性脑脊髓炎。

本发明的芋螺毒素肽可通过结合α9α10乙酰胆碱受体(nAChR) 发挥作用，具有镇痛活性。可应用于研究、诊断和治疗神经痛、乳腺癌、肺癌、脑脊髓炎等多种疾病、以及作为有用的分子探针用于研究等方面。不同的α类芋螺毒素对脊椎动物受体的亲和性不同,有时相差几个数量级。这种种系间的差异使得α类芋螺毒素可作为有用的探针用于研究脊椎动物nAChR的种系发生，可作为分子探针来确定 nAchR的不同亚型，及其结构与功能。它们是新药开发的候选药物、先导药物和治疗药物。

下面给出了本发明涉及的术语的解释。

神经痛

本发明所述多肽涉及到治疗各种神经痛的用途。神经痛是周围或中枢神经系统原发或继发性损害或功能障碍或短暂紊乱引起的疼痛，表现为自发性疼痛、痛觉超敏、痛觉过敏等。很多疾病都会引起神经痛，包括癌症与癌症化疗、酒精中毒、坐骨神经痛、糖尿病、三叉神经痛、硬化症、带状疱疹、机械伤和手术伤、艾滋病、头部神经瘫痪、药物中毒、工业污染中毒、淋巴神经痛、骨髓瘤、多点运动神经痛、慢性先天性感觉神经病、急性剧烈自发性神经痛、挤压神经痛、脉管炎(血管炎)/局部缺血、尿毒症、儿童胆汁肝脏疾病、慢性呼吸障碍、复合神经痛、多器官衰竭、脓毒病/脓血症、肝炎、卟啉症、维生素缺乏、慢性肝脏病、原生胆汁硬化、高血脂症、麻疯病、莱姆关节炎、感觉神经束膜炎、过敏症等。

药物组合物

本发明还涉及含有本发明肽和药学可接受载体和/或赋形剂的药物组合物。所述药物组合物可用于研究、诊断、缓解或治疗与神经痛、乳腺癌、肺癌、智障、成瘾、疼痛、帕金森症、精神病、抑郁、重症肌无力、癫痫症、局部缺血等有关的疾病或病症。在一个实施方案中，含有治疗有效量的本发明肽的药物组合物以利于药用的方式配制和给药，并需考虑到个体病人的临床状况、运送位点、给药方法、给药日程安排和医生已知的其它因素。因此用于本文目的的“有效量”由这些方面的考虑决定。

含治疗有效量的本发明多肽的药物组合物非肠道给药、口服、脑池内给药、鞘内给药等。“药学可接受载体”指无毒的固体、半固体或液体填充物、稀释液、胶囊材料或任何类型的配方辅助物。本文所用术语“非肠道的”表示的给药方式包括静脉内、肌肉内、腹膜内、胸骨内、皮下、鞘内和关节内注射和输注。本发明多肽还可通过缓释系统恰当地给药。

本发明还涉及特异阻断nAChRs受体的药物组合物。

可应用本发明的芋螺毒素肽作为有用的探针来用于研究动物 nAChRs的种系发生；作为分子探针来确定nAChRs的不同亚型；作为分子模型,设计新药；作为研究、诊断神经性疾病如帕金森氏病、行动障碍、精神分裂症、癫痫症、局部缺血等的工具药和治疗药物；治疗神经痛、成瘾、乳腺癌、肺癌、小细胞肺癌、脑脊髓炎、癫痫症、局部缺血等的侯选药物。

发明的有益效果

本发明的芋螺毒素肽能够特异地阻断乙酰胆碱受体(nAChRs)，并且具镇痛活性和抑制乳腺癌和肺癌细胞生长的功效，以及治疗脑脊髓炎、癫痫症、局部缺血等的功效。

附图说明

注：若图中没有标明的各种nAChRs受体的亚型来源，均为大鼠的相应受体，图注和图中对大鼠的受体类型来源进行省略。

图1：10μM K41JM对大鼠α9α10 nAChR的电流影响情况。图中“C”是指的对照电流，箭头所指的是10μM K41JM温育5分钟后，第一个Ach脉冲形成的电流轨迹(～0nA),Ach脉冲时间为1s；纵坐标是电流大小，单位为nA，横坐标为累计时间，单位为ms，温育前后每相邻2个电流轨迹之间相隔时间为60s。10μM K41JM完全阻断了α9α10 nAChR电流，且洗脱速度很快。

图2.K41JM对大鼠α9α10 nAChR的浓度剂量反应曲线。横坐标为所用多肽的摩尔浓度(M)的对数值；纵坐标为剂量反应百分数(％ Response)，是相应浓度的毒素作用下乙酰胆碱受体电流与对照电流的比值百分数，每个剂量反应百分数为5－6个非洲爪蟾卵母细胞记录的数据平均值(mean)，曲线同时显示标准误(SEM)。

图3：10μM K41JM对人类α9α10 nAChR的电流影响情况。图中“C”是指的对照电流，箭头所指的是10μM K41JM温育5分钟后，第一个Ach脉冲形成的电流轨迹(～0nA),Ach脉冲时间为1s；纵坐标是电流大小，单位为nA，横坐标为累计时间，单位为ms，温育前后每相邻2个电流轨迹之间相隔时间为60s。10μM K41JM几乎完全阻断了α9α10 nAChR电流，且洗脱速度很快。

图4.K41JM对人类α9α10 nAChR的浓度剂量反应曲线。横坐标为所用多肽的摩尔浓度(M)的对数值；纵坐标为剂量反应百分数 (％Response)，是相应浓度的毒素作用下乙酰胆碱受体电流与对照电流的比值百分数，每个剂量反应百分数为4－6个非洲爪蟾卵母细胞记录的数据平均值(mean)，曲线同时显示标准误(SEM)。

图5：10μM K41JMX1对大鼠α9α10 nAChR的电流影响情况。图中“C”是指的对照电流，箭头所指的是10μM K41JM X1温育5 分钟后，第一个Ach脉冲形成的电流轨迹,Ach脉冲时间为1s；纵坐标是电流大小，单位为nA，横坐标为时间，单位为ms，温育前后每相邻2个电流轨迹之间相隔时间为60s。下述图6－10的坐标和方法与此图相同。

图6：10μM K41JM13对大鼠α9α10 nAChR的电流影响情况。图中“C”是指的对照电流，箭头所指的是10μM K41JM13温育5分钟后，第一个Ach脉冲形成的电流轨迹。

图7：10μM K41JM19对大鼠α9α10 nAChR的电流影响情况。图中“C”是指的对照电流，箭头所指的是10μM K41JM19温育5分钟后，第一个Ach脉冲形成的电流轨迹。

图8：10μM K41JM31对大鼠α9α10 nAChR的电流影响情况。图中“C”是指的对照电流，箭头所指的是10μM K41JM31温育5分钟后，第一个Ach脉冲形成的电流轨迹。

图9：10μM K41JM14对大鼠α9α10 nAChR的电流影响情况。图中“C”是指的对照电流，箭头所指的是10μM K41JM14温育5分钟后，第一个Ach脉冲形成的电流轨迹。

图10：10μM K41JM28对大鼠α9α10 nAChR的电流影响情况。图中“C”是指的对照电流，箭头所指的是10μM K41JM28温育5分钟后，第一个Ach脉冲形成的电流轨迹。

图11：10μM K41JM18对大鼠α9α10 nAChR的电流影响情况。图中“C”是指的对照电流，箭头所指的是10μM K41JM18温育5分钟后，第一个Ach脉冲形成的电流轨迹。

图12：10μM K41JM24对大鼠α9α10 nAChR的电流影响情况。图中“C”是指的对照电流，箭头所指的是10μM K41JM24温育5分钟后，第一个Ach脉冲形成的电流轨迹。

图13：10μM K41JM X4对大鼠α9α10 nAChR的电流影响情况。图中“C”是指的对照电流，箭头所指的是10μM K41JMX4温育5 分钟后，第一个Ach脉冲形成的电流轨迹。

图14：10μM K41JM1对大鼠α9α10 nAChR的电流影响情况。图中“C”是指的对照电流，箭头所指的是10μM K41JM1温育5分钟后，第一个Ach脉冲形成的电流轨迹。

图15：10μM K41JM25对大鼠α9α10 nAChR的电流影响情况。图中“C”是指的对照电流，箭头所指的是10μM K41JM25温育5分钟后，第一个Ach脉冲形成的电流轨迹。

图16：10μM K41JM23对大鼠α9α10 nAChR的电流影响情况。图中“C”是指的对照电流，箭头所指的是10μM K41JM23温育5分钟后，第一个Ach脉冲形成的电流轨迹。

图17：10μM K41JM22对大鼠α9α10 nAChR的电流影响情况。图中“C”是指的对照电流，箭头所指的是10μM K41JM22温育5分钟后，第一个Ach脉冲形成的电流轨迹。

图18：10μM K41JM6对大鼠α9α10 nAChR的电流影响情况。图中“C”是指的对照电流，箭头所指的是10μM K41JM6温育5分钟后，第一个Ach脉冲形成的电流轨迹。

图19：10μM K41JM20对大鼠α9α10 nAChR的电流影响情况。图中“C”是指的对照电流，箭头所指的是10μM K41JM20温育5分钟后，第一个Ach脉冲形成的电流轨迹。

图20：10μM K41JM21对大鼠α9α10 nAChR的电流影响情况。图中“C”是指的对照电流，箭头所指的是10μM K41JM21温育5分钟后，第一个Ach脉冲形成的电流轨迹。

图21：10μM K41JM30对大鼠α9α10 nAChR的电流影响情况。图中“C”是指的对照电流，箭头所指的是10μM K41JM30温育5分钟后，第一个Ach脉冲形成的电流轨迹。

图22：每只大鼠给药剂量为15nmol K41JM时，在CCI神经痛模型上的镇痛作用。图中阴性对照Saline为生理盐水，大鼠体重范围 250－300g。图中各个点的纵坐标为痛阈值(PWT)的平均值和标准误(Mean±SD),单位为克(g)。横坐标是给药后的时间，单位为小时(h)。显著性差异比较概率为*p<0.05,极显著差异比较概率为 **p<0.01。

图23：每只大鼠给药剂量为20nmol K41JM时，在CCI神经痛模型上的镇痛作用。图中阴性对照Saline为生理盐水，大鼠体重范围 250－300g。图中各个点的纵坐标为痛阈值(PWT)的平均值和标准误(Mean±SD),单位为克(g)。横坐标是给药后的时间，单位为小时(h)。显著性差异比较概率为*p<0.05,极显著差异比较概率为**p<0.01。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：新的芋螺毒素肽K41JM及其类似物的序列与人工合成

K41JM及其系列类似物的氨基酸序列和命名见下面的表1。表1 中的氨基酸序列可以委托公司进行人工合成，也可以采用下面的方法：

采用Fmoc化学方法人工合成树脂肽。用reagent K (trifluoroacetic acid/water/ethanedithiol/phenol/thioanisole；90: 5:2.5:7.5:5,v/v/v/v/v)将多肽从树脂上切割下来，并用冰乙醚沉淀和洗涤回收线性肽粗品,用制备型反向HPLC C18柱(Vydac)纯化，洗脱线性梯度为在40min内10-50％B60.溶剂B是60％ACN (acetonitrile),40％H20,0.92％TFA(trifluoroacetic acid)；溶剂 A是1％TFA的水溶液。纯化后的多肽用分析型的HPLC C18柱 (Vydac)进行纯度检测，其纯度达到HPLC色谱检测单一峰，质谱 (MS)检测也是单一峰，方可用于后续实验。

表1.芋螺肽K41JM及其类似物(突变体)的名称和氨基酸序列

SEQ ID NO：	多肽命名	序列
			1	K41JM	RSPYDRRRRY
2	K41JMX4	RSPADRRRRY
			3	K41JM1	RSPYDRRRKY
4	K41JM25	RSPYARRRRY
			5	K41JM23	RSPYDRRRRA

6	K41JM22	RSAYDRRRRY
			7	K41JM19	RS{Hyp}YDRRRRY
8	K41JMX1	RSPFDRRRRY
			9	K41JM31	RAPYDRRRRY
10	K41JM13	RTPYDRRRRY
			11	K41JM14	KSPYDRRRRY
12	K41JM28	RSPYDRRRRF
			13	K41JM18	RSPYDKRRRY
14	K41JM24	RSPYERRRRY
			15	K41JM6	ASPYDRRRRY
16	K41JM20	RSPYDRKRRY
			17	K41JM21	RSPYDRRARY
18	K41JM30	RSPYDARRRY

注：Hyp是羟脯氨酸(4-trans hydroxyproline)。

实施例2：大鼠、小鼠和人类nAChRs各种亚型在非洲爪蟾卵母细胞中的表达

参照文献(Azam L,Yoshikami D,McIntosh JM.Amino acid residues thatconfer high selectivity of the alpha6 nicotinic acetylcholine receptorsubunit to alpha-conotoxin MII[S4A,E11A,L15A].J Biol Chem.2008；283(17):11625-32.)中的方法，以及体外转录试剂盒(mMessage mMachine in vitro transcription kit(Ambion,Austin,TX))说明书，制备各种大鼠神经型nAChRs亚型(α3β2，α6/α3β2β3，α6/α3β4，α9α10，α4β2，α4β4，α3β4，α2β2，α2β4，α7)、人类神经型nAChRs亚型(α9 α10，α6/α3β2β3，α7)，以及小鼠和人类肌肉型nAChRs(α1 β1δε)的cRNA，其浓度用UV 260nm下的OD值进行测算。解剖收集非洲爪蟾(Xenopus laveis)卵母细胞(蛙卵)，将cRNA注射入蛙卵中，每个亚基的注射量为5ng cRNA。肌肉nAChR每个亚基注射0.5-2.5ng DNA。蛙卵在ND-96中培养。蛙卵收集后的1－2天内注射cRNA，注射后1－4天内用于nAChRs的电压钳记录。制得的样品用于下面的实施例。

实施例3：芋螺肽K41JM阻断大鼠各种nAChRs亚型的实验

将1个注射过cRNA的蛙卵置于30μL的Sylgard记录槽中(直径4mm×深度2mm)，重力灌注含有0.1mg/ml BSA(bovine serum albumin)的ND96灌流液(96.0mM NaCl,2.0mM KCl,1.8mM CaCl₂, 1.0mM MgCl₂,5mM HEPES,pH 7.1－7.5)或含有1mM atropine 的ND96(ND96A)，流速为1ml/min。所有的芋螺毒素溶液也含有0.1 mg/ml BSA以减少毒素的非特异性吸附，用转换阀(SmartValve, Cavro Scientific Instruments,Sunnyvale,CA)可以在灌注毒素或乙酰胆碱(ACh)之间进行自由切换，以及一系列三通螺线阀(solenoid valves,model 161TO31,Neptune Research,Northboro,MA)使灌注ND96与 ACh等之间进行自由切换。Ach门控的电流由双电极电压箝放大器 (model OC-725B,Warner Instrument Corp.,Hamden,CT)设置在“慢”箝，以及clamp gain在最大值(×2000)位置时进行在线记录。用1mm外径×0.75内径mm的玻璃毛细管(fiber-filled borosilicate capillaries，WPI Inc.,Sarasota,FL)拉制玻璃电极，并充满3M KCl 作为电压和电流电极。膜电压箝制在-70mV.整个系统均由电脑控制和记录数据。ACh脉冲为每隔5min自动灌注1s的ACh。ACh的浓度分别为，表达肌肉型的nAChRs和神经型α9α10 nAChRs卵为10μ M；表达神经型的nAChRs之α7为200μM,其他的亚型都为100μ M。至少记录4个卵表达某个亚型对不同毒素浓度的电流反应情况，以及电流轨迹。

测试的电流数据用GraphPad Prism软件(San Diego,CA)进行统计分析，绘制剂量反应曲线，计算芋螺毒素的半阻滞浓度IC₅₀等多种有关毒素阻断nAChRs的各种参数。

结果表明，10μM K41JM(实施例1制备)完全阻断了由Ach 门控的大鼠α9α10 nAChR开放产生的电流,且洗脱很快，阻断是可逆的(图1)。它对α9α10 nAChR的半阻断剂量IC₅₀和误差范围为 167.5nM(129－217nM)(表2，图2)。K41JM剂量反应曲线的斜率 (Hillslope)及误差范围为0.93(0.71－1.15)(表2，图2)。K41JM 对α7和Mouse α1β1δε(肌肉型)亚型具有微弱阻断活性，其半阻断剂量IC₅₀＞3μM，而对其他亚型在10μM高浓度下均没有阻断活性，这些亚型包括α3β2，α3β4，α6/α3β2β3，α6/α3β4，α4β2，α4β4，α2β2，α2β4。因而，K41JM是α9α10nAChR的高选择性强阻断剂。

表2：K41JM对大鼠(Rat)各种nAChRs亚型的半阻断剂量IC₅₀和剂量反应曲线的斜率

注：a括号中的数值是置信度为95％的区间。

实施例4：芋螺肽K41JM阻断人类各种nAChRs亚型的实验

按照实施例3的方法，检测了K41JM对人类(Human)各种nAChRs亚型的阻断活性。结果表明，10μM K41JM(实施例1制备)几乎完全阻断了由Ach门控的人类α9α10 nAChR开放产生的电流,且洗脱很快，阻断是可逆的(图3)。它对人类α9α10 nAChR 的半阻断剂量IC₅₀和误差范围为351.5nM(249－496nM)(表2，图 2)。K41JM对人类α9α10 nAChR剂量反应曲线的斜率(Hillslope) 及误差范围为0.83(0.62－1.04)(表3，图4)。K41JM对hα7,hα3β2, hα6/α3β2β3和hα1β1δε，(肌肉型)亚型具有很微弱阻断活性，其半阻断剂量IC₅₀＞5μM，而在10μM高浓度下对人类其他亚型均没有阻断活性，这些亚型包括α3β4，α6/α3β4，α4β2，α4β4，α2 β2，α2β4。因而，K41JM也是人类α9α10 nAChR的高选择性强阻断剂，其阻断活性与大鼠的接近。

表3：K41JM对人类(Human)各种nAChRs亚型的半阻断剂量IC₅₀和剂量反应曲线的斜率

注：a括号中的数值是置信度为95％的区间。

实施例5：芋螺肽K41JM类似物阻断大鼠α9α10 nAChR亚型的实验

按照实施例3的方法，发现了另外13个K41JM的类似物(表1，SEQ ID NO：2－14，实施例1制备)对大鼠α9α10 nAChR亚型都有阻断活性。在10μM浓度下，K41JM类似物对α9α10nAChR亚型都具有很强的阻断活性。其中特别是K41JMX1、K41JM13、K41JM19、 K41JM31、K41JM14、K41JM28、K41JM18、K41JM24(表1，SEQ ID NO：7－14，实施例1制备)的活性明显强于K41JM以及其它的类似物，图5－12分别显示了10μM浓度下，它们对α9α10 nAChR 亚型阻断的电流轨迹图。其它5个类似物的活性与K41JM相当，即 K41JMX4、K41JM1、K41JM25、K41JM23、K41JM22(表1，SEQ ID NO：2－6，实施例1制备)，图13－17分别显示了10μM浓度下，它们对α9α10 nAChR亚型阻断的电流轨迹图。它们都是α9α10 nAChR的有效阻断剂。

另外，本发明人还发现，其余的K41JM的4个类似物，K41JM6， K41JM20，K41JM21，K41JM30(表1，SEQ ID NO：15－18，实施例1制备)对α9α10 nAChR没有阻断活性，图18－21分别显示了10 μM浓度下，它们作用于α9α10 nAChR亚型的电流轨迹图。

实施例6：K41JM的镇痛活性实验

利用大鼠CCI神经痛模型(坐骨神经慢性挤压伤模型)测定了 K41JM的镇痛活性，结果显示其镇痛活性很强。

利用SD(Sprague Dawley)大鼠，制作坐骨神经慢性挤压伤模型 (ChronicConstriction Injury model，CCI模型)，用压力痛觉测试仪(大鼠800G，型号为美国IITC2391)测定所试芋螺毒素对神经痛的镇痛活性。SD(Sprague Dawley)大鼠，体重约250－300克。购自广东省医学实验动物中心，大鼠实验动物质量合格证明许可证号： SCXK(粤)2008-0002(大小鼠饲料亦购自广东省医学实验动物中心)。 CCI模型的制作参照Bennett等(Bennett G J,Xie Y K.A peripheral mononeuropathy in rat that producesdisorders of pain sensation like those seen in man[J].Pain,1988,33(1):87)的方法。经腹腔注射戊巴比妥钠80mg/kg麻醉后，无菌条件下切开右下肢，暴露坐骨神经主干，用4-0铬制羊肠线松扎四道，间距为1mm，结扎线的松紧以不影响神经外膜的血运为度，逐层缝合。右侧伤口缝合前均在局部涂以青霉素粉剂。术后腹腔注射青霉素1次/d，8万单位/次，连续3d。大鼠置管前每笼5只，置管后单笼饲养。将初选合格的大鼠按随机数字表分成 3组。分别在手术之前、手术后三天、一周、两周测大鼠患足和对侧足(左足)的机械痛觉刺激值，经检测证明坐骨神经慢性挤压伤模型 (CCI)模型建立成功，可用作筛选神经痛药物的整体动物模型。

建模成功的3组CCI大鼠，分别肌肉注射生理盐水(第1组)和不同剂量的K41JM(第2-4组)。给药剂量分别为每只15nmol和 20nmol K41JM。各组肌肉注射给药后的痛阈值随时间变化的曲线如图22－23所示。

每只15nmol K41JM剂量组(图22)与生理盐水组痛阈值相比，在给药后的1－6h内都有显著性差异(p<0.05)，每只20nmol K41JM 剂量组(图23)与生理盐水组痛阈值相比，在给药后的1－6h内都有极显著性差异(p<0.01)。提示本发明人所试的K41JM芋螺肽对大鼠的坐骨神经慢性挤压伤疼痛有很强的镇痛效果，且是通过简便的肌肉注射发挥药效。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims

1.一种多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NOs：1－14中任一序列所示。

2.一种多核苷酸，其编码权利要求1所述多肽的氨基酸序列。

3.一种核酸构建体，其包含权利要求2所述的多核苷酸。

4.一种重组表达载体，其包含权利要求3所述的核酸构建体。

5.一种转化的细胞，其包含权利要求4所述的重组表达载体。

6.一种融合蛋白，其包含权利要求1所述的多肽。

7.一种药物组合物，其包含权利要求1所述的多肽，或者包含权利要求6所述的融合蛋白。

8.根据权利要求7所述的药物组合物，其还包含药学上可接受的辅料。

9.一种确定乙酰胆碱受体亚型的方法，包括将乙酰胆碱受体与权利要求1所述的多肽或者权利要求6所述的融合蛋白进行接触的步骤；其中，所述方法为确定乙酰胆碱受体是否是α9α10乙酰胆碱受体的方法。

10.一种在体外阻断乙酰胆碱受体或者调节乙酰胆碱水平的方法，包括使用有效量的权利要求1所述的多肽或者权利要求6所述的融合蛋白的步骤；其中，所述乙酰胆碱受体是α9α10乙酰胆碱受体。

11.权利要求1所述的多肽或者权利要求6所述的融合蛋白在制备阻断乙酰胆碱受体的药物或试剂中的用途；其中，所述乙酰胆碱受体是α9α10乙酰胆碱受体。

12.权利要求1所述的多肽或者权利要求6所述的融合蛋白在制备治疗和/或预防神经系统疾病、乳腺癌或肺癌的药物中的用途，或者在制备镇痛的药物中的用途。

13.根据权利要求12所述的用途，其中，所述神经系统疾病为神经痛、成瘾、帕金森症、癫痫症、痴呆或脑脊髓炎。

14.根据权利要求13所述的用途，其中，所述神经痛由如下因素中的一种或多种导致：癌症与癌症化疗、酒精中毒、坐骨神经痛、糖尿病、三叉神经痛、硬化症、带状疱疹、机械伤和手术伤、艾滋病、头部神经瘫痪、药物中毒、工业污染中毒、淋巴神经痛、骨髓瘤、多点运动神经痛、慢性先天性感觉神经病、急性剧烈自发性神经痛、挤压神经痛、脉管炎、血管炎、局部缺血、尿毒症、儿童胆汁肝脏疾病、慢性呼吸障碍、复合神经痛、多器官衰竭、脓毒病/脓血症、肝炎、卟啉症、维生素缺乏、慢性肝脏病、原生胆汁硬化、高血脂症、麻疯病、莱姆关节炎、感觉神经束膜炎或过敏症。

15.权利要求1所述的多肽的制备方法，包括下述步骤：

1)在多肽合成仪上或者手工方法合成线性多肽，Fmoc氨基酸的侧链保护基为:Pmc(Arg)、Trt(Cys)、But(Thr、Ser、Tyr)、OBut(Asp)、Boc(Lys)；或者用tBoc多肽合成方法合成；

2)将步骤1)中得到的线性多肽从树脂上切割下来，并用冰乙醚沉淀和洗涤回收线性多肽粗品，用制备型反向HPLC C18柱纯化。

16.根据权利要求15所述的制备方法，其中，步骤1)中所述多肽合成仪为ABIPrism433a多肽合成仪。

17.根据权利要求15所述的制备方法，其中，步骤2)中所述制备型反向HPLC C18柱为Vydac制造。