CN103483439A

CN103483439A - αO-超家族芋螺毒素肽、其药物组合物及用途

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Publication number: CN103483439A
Application number: CN201210197589.XA
Authority: CN
Inventors: 罗素兰; 长孙东亭; 吴勇; 朱晓鹏; 胡远艳; J·迈克尔·麦金托什
Original assignee: Hainan University
Current assignee: Hainan University
Priority date: 2012-06-15
Filing date: 2012-06-15
Publication date: 2014-01-01
Anticipated expiration: 2032-06-15
Also published as: JP2015522564A; US9718864B2; CN103483439B; EP2889308A4; US20150158921A1; JP6324952B2; EP2889308B1; WO2013185572A1; EP2889308A1

Abstract

本发明属于生物化学和分子生物学领域，涉及一种αO-超家族芋螺毒素肽、其药物组合物、其制备方法及用途。本发明还涉及所述芋螺毒素肽的前肽、其核酸构建体、其表达载体和转化的细胞、以及其融合蛋白。本发明还涉及一种阻断乙酰胆碱受体的方法、以及所述芋螺毒素肽的制药用途。本发明的αO-新超家族芋螺毒素肽能够特异地阻断乙酰胆碱受体（nAChRs）（例如α9α10 nAChR），以及NMDA受体（例如NR2C NMDAR)，并且具有治疗神经痛、成瘾的活性、以及癌症化疗、乳腺癌、肺癌、伤口愈合、癫痫、局部缺血等的活性，具有在制备镇痛药物、治疗成瘾的药物以及神经科学工具药等方面的良好应用前景。

Description

αO-超家族芋螺毒素肽、其药物组合物及用途

技术领域

本发明属于生物化学和分子生物学领域，涉及一种αO-超家族芋螺毒素肽、其药物组合物、其制备方法及用途。本发明还涉及所述芋螺毒素肽的前肽、其核酸构建体、其表达载体和转化的细胞、以及其融合蛋白。本发明还涉及一种阻断烟碱乙酰胆碱受体（nAChRs）或NMDA受体（NMDAR)的方法、以及所述芋螺毒素肽的制药用途。

背景技术

烟碱乙酰胆碱受体(nAChRs)是动物界普遍存在的具有重要生理作用和临床研究意义的细胞膜蛋白，其介导众多中枢和外周神经系统的生理功能，包括学习、记忆、应答、镇痛和运动控制等。nAChRs激活多巴胺、去甲肾上腺素、五羟色胺、γ-氨基丁酸等多种神经递质的释放。已证实nAChRs是筛选诊断和治疗一大类重要疾病药物的关键靶点，这些疾病包括成瘾、疼痛、癌症、智障、帕金森症、精神病、抑郁、重症肌无力等疑难杂症。至今对于上述疾病还没有对症治疗的药物。常用的非选择性的nAChR激动剂如烟碱，虽然可以缓解上述神经疾病的症状，但它们对心脏和胃肠道产生强烈的副作用，且有成瘾性。因此，开发针对nAChRs各种亚型具有高选择性的配体药物是治疗上述疾病的关键所在（Livett BG,Sandall DW,Keays D,Down J,GaylerKR,Satkunanathan N,Khalil Z.Therapeutic applications ofconotoxins that target the neuronal nicotinic acetylcholinereceptor.Toxicon.2006,48(7):810-829.Nicke,A.,Wonnacott,S.& Lewis,R.J.Alpha-conotoxins as tools for the elucidationof structure and function of neuronal nicotinic acetylcholinereceptor subtypes.European journal of biochemistry/FEBS 271,2004,2305-2319.Dani,J.A.& Bertrand,D.Nicotinicacetylcholine receptors and nicotinic cholinergic mechanismsof the central nervous system.Annual review of pharmacologyand toxicology 2007,47:699-729）。

然而，要开发这样的药物的前提是，要获得可以特异结合nAChRs各种亚型的选择性化合物，或直接作为相关疾病的治疗药物，或作为工具药来研究和鉴定各种亚型的精细组成和生理功能。此外，在乳腺癌与小细胞肺癌中，肿瘤细胞膜上烟碱乙酰胆碱受体的激活促进肿瘤细胞增殖，用药物阻断这些受体的激活，可有效地进行早期诊断，或治疗这些灾难性癌症。

nAChRs由不同的α和β亚基组装成多种亚型，每种亚型都有截然不同的药理学特征。由于缺乏针对各种亚型的高选择性配体化合物，要研究和阐明各种各样的nAChRs亚型的精细结构和功能面临诸多挑战。

研究表明，α9α10nAChR是治疗神经痛药物的新靶点(McIntosh,J.M.;Absalom,N.;Chebib,M.;Elgoyhen,A.B.;Vincler,M.,Alpha9 nicotinic acetylcholine receptors and the treatment ofpain.Biochemical pharmacology 2009,78(7),693-702.Satkunanathan,N.;Livett,B.;Gayler,K.;Sandall,D.;Down,J.;Khalil,Z.,Alpha-conotoxin Vc1.1 alleviates neuropathic painand accelerates functional recovery of injured neurones.Brainresearch 2005,1059(2),149-58.)。α9α10 nAChR阻断剂具有治疗神经痛和加速受伤神经恢复的功能，可能是通过免疫机制发挥作用（Holtman,J.R.;Dwoskin,L.P.;Dowell,C.;Wala,E.P.;Zhang,Z.;Crooks,P.A.;McIntosh,J.M.,The novel small moleculealpha9alpha10 nicotinic acetylcholine receptor antagonistZZ-204G is analgesic.European journal of pharmacology 2011,670(2-3),500-8.Zheng,G.;Zhang,Z.;Dowell,C.;Wala,E.;Dwoskin,L.P.;Holtman,J.R.;McIntosh,J.M.;Crooks,P.A.,Discovery of non-peptide,small molecule antagonists ofalpha9alpha10 nicotinic acetylcholine receptors as novelanalgesics for the treatment of neuropathic and tonicinflammatory pain.Bioorganic & medicinal chemistry letters 2011,21(8),2476-9.）角化细胞上的α9α10 nAChR在伤口愈合的病理生理学过程中起着很重要的作用（Chernyavsky,A.I.;Arredondo,J.;Vetter,D.E.;Grando,S.A.,Central role of alpha9 acetylcholinereceptor in coordinating keratinocyte adhesion and motility atthe initiation of epithelialization.Experimental cell research2007,313(16),3542-55）。新近研究表明，α9 nAChR亚基在乳腺癌组织中过表达。α9亚基变体影响支气管细胞的转化与增殖，该亚基在肺癌的治疗中具有非常重要的意义（Chikova,A.;Grando,S.A.,Naturally occurring variants of human Alpha9 nicotinic receptordifferentially affect bronchial cell proliferation andtransformation.PloS one 2011,6(11),e27978.）。

据调查，疼痛影响1/6的人群，包括关节炎、神经痛、肿痛。其中神经痛影响4-8％的人群。现有治疗神经痛的方法，主要是局部麻醉用药，来阻断由于外周神经、神经丛、背根神经、交感神经系统等产生的疼痛信号。但这些治疗只能短时间有镇痛效果，但并不能根治神经痛。很多疾病都会引起神经痛，包括癌症与癌症化疗、酒精中毒、坐骨神经痛、糖尿病、三叉神经痛、硬化症、带状疱疹、机械伤和手术伤、艾滋病、头部神经瘫痪、药物中毒、工业污染中毒、淋巴神经痛、骨髓瘤、多点运动神经痛、慢性先天性感觉神经病、急性剧烈自发性神经痛、挤压神经痛、脉管炎（血管炎）/局部缺血、尿毒症、儿童胆汁肝脏疾病、慢性呼吸障碍、复合神经痛、多器官衰竭、脓毒病/脓血症、肝炎、卟啉症、维生素缺乏、慢性肝脏病、原生胆汁硬化、高血脂症、麻疯病、莱姆关节炎、感觉神经束膜炎、过敏症等。

以α9α10 nAChR为靶点的神经痛治疗药物可通过肌肉注射发挥镇痛效应(Vincler,M.Wittenauer,S.Parker,R.Ellison,M.Olivera,B.M.McIntosh,J.M.Molecular mechanism for analgesiainvolving specific antagonism of alpha9alpha10 nicotinicacetylcholine receptors.Proc Natl Acad Sci U S A，2006,103（47）：17880-4.)，比目前商业化的ω-CTX MVIIA镇痛药物-奇考诺肽给药途径更简便，奇考诺肽需通过编程泵内置于人体内直接给药至脊髓，给药途径很麻烦，该给药泵非常昂贵，目前仅限于美欧等发达国家应用，很难在广大的发展中国家使用（Kress HG,Simpson KH,Marchettini P,VerDonck A,Varrassi G.Intrathecal therapy：what has changed withthe introduction of ziconotide.Pain Pract.2009;9(5):338-47.Burton AW,Deer TR,Wallace MS,Rauck RL,Grigsby E.Considerationsand methodology for trialing ziconotide.Pain Physician.2010;13(1):23-33.Wallace MS,Rauck RL,Deer T.Ziconotidecombination intrathecal therapy：rationale and evidence.Clin JPain.2010;26(7):635-44）。

烟瘾是由烟草中的烟碱（尼古丁）引起的，其体内受体就是烟碱乙酰胆碱受体（nAChRs）（Azam L,McIntosh JM.Alpha-conotoxinsas pharmacological probes of nicotinic acetylcholine receptors.Acta Pharmacol Sin.2009;30(6):771-783.）。多种nAChRs亚型不但是尼古丁成瘾的药物作用靶点，还是滥用药物吗啡、可卡因等成瘾的药物作用靶点。

NMDA受体（N-methyl-D-aspartate receptor）是中枢神经系统内一类重要的兴奋性氨基酸受体，是一类配体门控离子通道型受体，具有广泛的生理学和药理学意义。NMDA受体不仅在神经系统发育过程中发挥着重要的生理作用，如可调节神经元的存活，调节神经元树突、轴突结构发育及参与突触可塑性的形成等；在神经元回路的形成中NMDA受体亦起着关键作用。在局部缺血集中部位，NMDA受体被激活，使细胞外钙离子内流，从而导致细胞死亡（Twede,V.D.,Miljanich,G.,Olivera,B.M.& Bulaj,G.Neuroprotective andcardioprotective conopeptides：an emerging class of drug leads.Current opinion in drug discovery & development 2009，12：231-239)。通过大鼠实验的研究表明，NMDA受体主要分布在中枢系统中,如大脑、脊髓;NMDA受体在外周也有分布,如NR3B主要在运动神经元处表达,而外周NMDA受体在面部肌肉痛感以及水肿形成中起到了很重要的作用。

研究表明，NMDA受体是学习、记忆、疼痛等过程中一类至关重要的受体,也是诸多神经疾病发病与治疗的作用靶点，包括顽固性疼痛、药物和酒精成瘾、癫痫症、局部缺血、帕金森症、痴呆、兴奋性神经元细胞死亡等等(Sattler,R.et al.Specific coupling of NMDAreceptor activation to nitric oxide neurotoxicity by PSD-95protein.Science(New York，N.Y.)1999，284,1845-1848.Lewis,R.J.&Garcia,M.L.Therapeutic potential of venom peptides.Nature reviews.Drug discovery，2003，2：790-802.Sheng,Z.,Liang,Z.,Geiger,J.H.,Prorok,M.& Castellino,F.J.Theselectivity of conantokin-G for ion channel inhibition of NR2Bsubunit-containing NMDA receptors is regulated by amino acidresidues in the S2 region of NR2B.Neuropharmacology，2009，57,127-136.Meldrum,B.S.The role of glutamate in epilepsyand other CNS disorders.Neurology，1994,44:S14-23.Ulas,J.etal.Selective increase of NMDA-sensitive glutamate binding in thestriatum of Parkinson's disease,Alzheimer's disease,and mixedParkinson's disease/Alzheimer's disease patients:anautoradiographic study.The Journal of neuroscience，1994,14,6317-6324.Ozawa,S.,Kamiya,H.& Tsuzuki,K.Glutamatereceptors in the mammalian central nervous system.Progress inneurobiology，1998,54:581-618.Bisaga,A.& Popik,P.In searchof a new pharmacological treatment for drug and alcohol addiction:N-methyl-D-aspartate(NMDA)antagonists.Drug and alcoholdependence，2000,59:1-15).

目前，生活在热带海洋中的肉食性软体动物芋螺毒液中产生的毒素（芋螺毒素，conopeptide,conotoxin，CTX）备受关注，已被用于系统地研究与开发nAChRs各种亚型的特异阻断剂。

芋螺毒素（conopeptide,conotoxin，CTX）大多是由7－50个氨基酸残基组成的、富含半胱氨酸（Cys）的神经肽毒素。芋螺毒素按其前体蛋白的内质网信号肽序列的相似性，以及半胱氨酸模式，分为不同的基因家族，至今，所有已知的芋螺毒素可分为17个超家族，分别为A、C、D、S、M、I1、I2、I3、J、L、O1、O2、O3、P、T、V、Y（Kaas Q,Yu R,Jin AH,Dutertre S and Craik DJ.ConoServer:updated content,knowledge,and discovery tools in theconopeptide database.Nucleic Acids Research(2012)[Ahead ofprint]）。芋螺毒素（肽）按其受体靶位可分为α、ω、μ、δ等多种药理学家族。其中的α类芋螺毒素（α*-CTX）具有阻断烟碱乙酰胆碱受体(nAChRs)的功能；不含有半胱氨酸的芋螺毒素肽Conantokins具有阻断N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDA受体，N-methyl-D-asparticacid receptor，NMDAR)的特殊功能。每个超家族芋螺毒素根据受体靶类型，又可分为α、αA、κA（A-超家族），ω、δ、κ、μO（O-超家族），μ、ψ、κM（M-超家族）等家族（亚型）。

芋螺毒素具有特异结合动物体内各种离子通道的特殊功能。目前，芋螺毒素备受关注，已被用于系统地研究与开发nAChRs各种亚型的特异阻断剂。

发明内容

本发明人经过深入的研究和创造性的劳动，发现了一类新的αO-超家族芋螺毒素肽。本发明人惊奇地发现，本发明的αO-超家族芋螺毒素肽能够特异性地阻断乙酰胆碱受体和NMDA受体，特别是对神经痛药物靶点、乳腺癌、肺癌靶点α9α10 nAChR的阻断活性最强，具有在制备镇痛药物，抗成瘾、癫痫、或癌症的药物，以及神经科学工具药等方面的良好应用前景。由此提供了下述发明：

本发明的一个方面涉及一种多肽，其为或者包含一个或多个相同或者不同的选自如下的（1）至（3）中任一项所述的氨基酸序列：

（1）SEQ ID NO：7－12中任一序列所示的氨基酸序列;

（2）与上述（1）所述氨基酸序列至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、尤其优选至少95％、最优选至少97％相同的氨基酸序列；或

（3）被1－5个、优选1－3个、更优选1－2个、最优选1个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加而与上述（1）所述序列有所不同的氨基酸序列。

其中，SEQ ID NO：7或8是命名为GeXIVAWT的野生型的前体肽；SEQ ID NO：9是其成熟肽。

SEQ ID NO：10或11是命名为GeXIVA的突变型的前体肽；SEQ IDNO：12是其成熟肽。

GeXIVA及其野生型GeXIVAWT的前体肽含有信号肽、前肽和成熟肽3个区域，它们的具体序列及其分析如实施例1－2中所述。野生型成熟肽具有5个半胱氨酸，与以前发现的所有芋螺毒素的偶数个半胱氨酸模式都不同，是一个αO-超家族新芋螺毒素，由于该毒素阻断α9α10nAChR的活性最强，所以命名为αO-超家族芋螺毒素（αO-conotoxin）。

为了本发明的一个目的，两个或更多个氨基酸序列之间的相同程度是通过BLAST2.0蛋白质数据库查询程序(Aaltschul等，1997，核酸研究25：3389－3402)并采用下列参数确定的：blastall pblastp-a4-e10-E0-v500-b250-I[查询文档]-d prot_all，其中-p指程序名称，-a指将要用到的服务器数，-e指期望值，-E指延伸缺口的代价，-v指单线描述(one-line description)数,-b指将要显示的比对数，-I指查询文档，-d指用于查询的数据库。

同源多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：1－4中任一氨基酸序列不同之处可能在于取代、插入、添加和/或缺失了1或多个、优选1－5个、更优选1－3个、尤其优选1－2个、最优选1个氨基酸残基。优选地，氨基酸改变是性质改变较小的变化，即是不会显著影响蛋白质的折叠和/或活性的保守性氨基酸取代；小片段缺失，通常是1到大约5个、优选1-3个、更优选1个氨基酸的缺失；小的氨基或羧基末端延伸，如氨基端添加的甲硫氨酸残基；有多达大约20-25个残基的小连接肽；或可通过改变净电荷或者其它功能而有助于纯化的小延伸如多聚组氨酸片段、抗原表位或结合区。

保守性取代的例子是在碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)内进行的取代。通常不会改变特异活性的氨基酸取代是本领域已知的，并且由例如H.Neurath和R.L.Hill，1979，在《蛋白质》一书，Academic Press,New York中描述过。最常见的替换是Ala/Ser,Val/Ile,Asp/Glu,Thr/Ser,Ala/Gly,Ala/Thr,Ser/Asn,Ala/Val,Ser/Gly,Tyr/Phe,Ala/Pro,Lys/Arg,Asp/Asn,Leu/Ile,Leu/Val,Ala/Glu和Asp/Gly以及反向进行的替换。

本发明还包括在本发明αO-芋螺毒素肽的N-末端和/或C-末端融合了其它肽/多肽的融合多肽或可裂解的融合多肽。产生融合多肽的技术为本领域内已知，包括连接编码本发明肽的编码序列与编码所述其它肽/多肽的编码序列，使它们在同一读框中，并且融合多肽的表达受控于相同的启动子和终止子。

根据本发明任一项所述的多肽，其中，SEQ ID NO：12中的N末端的第一个半胱氨酸与第二个半胱氨酸形成二硫键，并且第三个半胱氨酸与第四个半胱氨酸形成二硫键；或者第一个半胱氨酸与第三个半胱氨酸形成二硫键，并且第二个半胱氨酸与第四个半胱氨酸形成二硫键；或者第一个半胱氨酸与第四个半胱氨酸形成二硫键，并且第二个半胱氨酸与第三个半胱氨酸形成二硫键。

本发明的上述多肽即为芋螺毒素肽；具体地，是αO-芋螺毒素肽。

上述芋螺毒素肽可以从我国海南产的将军芋螺(Conus C.generalis)中提取。也可以化学合成氨基酸序列（例如参考实施例3中的方法）；或者通过基因重组的手段表达其核苷酸（核苷酸序列的制备参考实施例1-2或者直接人工合成），得到多肽。也可以参考下面的方法：

本发明的另一方面涉及本发明任一项所述的多肽的制备方法，包括下述步骤：

1）在ABI Prism 433a多肽合成仪上或者手工方法合成线性多肽，Fmoc氨基酸的侧链保护基为：Pmc(Arg)、Trt(Cy s)、But(Thr、Ser、Tyr),OBut(Asp),Boc(Lys)；半胱氨酸用Trt或Acm保护基团，分别在相应的半胱氨酸之间定点形成二硫键；或所有半胱氨酸都用Trt保护基团，通过一步法氧化折叠随机形成二硫键。

2）将步骤1）中得到的线性多肽从树脂上切割下来，并用冰乙醚沉淀和洗涤回收线性多肽粗品,用制备型反向HPLC C18柱（Vydac)纯化；

3）将步骤2）中得到的产物进行两步或一步氧化折叠。

本发明的另一方面涉及一种多核苷酸，其编码本发明任一项所述多肽的氨基酸序列。

根据本发明任一项所述的多核苷酸，其为包含或者一个或多个相同或不同的选自如下的（1）至（3）中任一项所述的核苷酸序列：

（1）SEQ ID NO：1－6中任一序列所示的核苷酸序列；

（2）SEQ ID NO：1－6中任一序列的互补序列；或

（3）在严谨条件下能够与上述（1）或（2）中所述的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。

SEQ ID NO：1－6分别是SEQ ID NO：7－12的编码序列。

其中，SEQ ID NO：1或2编码命名为GeXIVAWT的野生型的前体肽；SEQ ID NO：3编码其成熟肽。

SEQ ID NO：4或5编码命名为GeXIVA的突变型的前体肽；SEQ IDNO：6编码其成熟肽。

SEQ ID NO：1－6具体序列及其分析如实施例1－2中所述。

关于多核苷酸之间的杂交，在现有技术中有众多的文献可供参考，包括例如Sambrook等，分子克隆实验室手册，第二版，冷泉港实验室，冷泉港，1989。杂交中可以应用各种程度的严谨条件，例如中度、中度－高度，或者高度严谨条件。越严谨的条件，形成双螺旋要求的互补程度越高。可以通过温度、探针浓度、探针长度、离子强度、时间等等控制严谨程度。对于双链DNA基因探针，杂交于低于DNA杂合体熔解温度[melting temperature，Tm])20—25℃下在6X SSPE、5XDenhardt氏溶液、0.1％SDS、0.1mg/ml变性DNA中进行过夜。清洗通常如下进行：于Tm-20℃在0.2X SSPE、0.1％SDS中一次15分钟(中度严谨条件清洗)。

本发明的再一方面涉及一种引物对，其为或者包含SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示的核苷酸序列。所述引物对能够用于PCR扩增，得到SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的多核苷酸序列。

本发明的再一方面涉及一种核酸构建体，其包含本发明任一项所述的多核苷酸。

本发明的再一方面涉及一种重组表达载体，其包含本发明的核酸构建体；具体地，所述重组载体是重组pET22b(+)载体。

本发明的再一方面涉及一种转化的细胞，其包含本发明的重组表达载体；具体地，所述转化的细胞为转化的Sf9细胞。

本发明的再一方面涉及一种融合蛋白，其包含本发明任一项所述的多肽。

本发明的再一方面涉及一种药物组合物，其包含本发明任一项所述的多肽，或者包含本发明的融合蛋白；可选地，其还包含药学上可接受的载体或辅料。

本发明的再一方面涉及一种阻断乙酰胆碱受体和NMDA受体的方法，包括使用有效量的本发明任一项所述的多肽的步骤；具体地，所述乙酰胆碱受体是α9α10乙酰胆碱受体，或其他乙酰胆碱受体亚型和NMDA受体。

本发明的再一方面涉及一种筛选乙酰胆碱受体抑制剂和NMDA受体或者确定乙酰胆碱受体和NMDA受体亚型的方法，该方法包括：通过在存在和不存在候选化合物存在的情况下将乙酰胆碱受体或NMDA受体亚型与本发明任一项所述的多肽进行接触的步骤；具体地，所述乙酰胆碱受体为α9α10乙酰胆碱受体；或所述NMDA受体为NR2C NMDA受体。当αO-芋螺毒素GeXIVA在很低浓度下能够特异阻断α9α10乙酰胆碱受体时，则推断该乙酰胆碱受体是α9α10亚型的乙酰胆碱受体;或当αO-芋螺毒素GeXIVA在较低浓度下能够特异阻断NR2C NMDA受体时，则推断该NMDA受体是NR2C NMDA受体。

本发明的再一方面涉及本发明任一项所述的多肽用于阻断乙酰胆碱受体和NMDA受体的用途；具体地，所述乙酰胆碱受体是α9α10乙酰胆碱受体，或其他乙酰胆碱受体亚型；以及NR2C NMDA受体或其他亚型。

本发明的再一方面涉及本发明任一项所述的多肽在制备阻断乙酰胆碱受体和NMDA受体的药物或试剂中的用途；具体地，所述乙酰胆碱受体是α9α10乙酰胆碱受体，与NR2C NMDA受体。

本发明的再一方面涉及本发明任一项所述的多肽在制备治疗或预防神经系统疾病例如神经痛、乳腺癌、肺癌、成瘾、癫痫症、局部缺血、帕金森症、痴呆、或兴奋性神经元细胞死亡等的药物，或者用于制备杀灭害虫（例如鳞翅目秋粘夜蛾）、镇痛、戒烟、或戒毒的药物的用途；具体地，所述神经痛由如下原因导致：癌症与癌症化疗、酒精中毒、坐骨神经痛、糖尿病、三叉神经痛、硬化症、带状疱疹、机械伤和手术伤、艾滋病、头部神经瘫痪、药物中毒、工业污染中毒、淋巴神经痛、骨髓瘤、多点运动神经痛、慢性先天性感觉神经病、急性剧烈自发性神经痛、挤压神经痛、脉管炎、血管炎、局部缺血、尿毒症、儿童胆汁肝脏疾病、慢性呼吸障碍、复合神经痛、多器官衰竭、脓毒病/脓血症、肝炎、卟啉症、维生素缺乏、慢性肝脏病、原生胆汁硬化、高血脂症、麻疯病、莱姆关节炎、感觉神经束膜炎、过敏症等。

本发明的再一方面涉及一种治疗和/或预防神经系统疾病例如神经痛、乳腺癌、肺癌、成瘾、癫痫症、局部缺血、帕金森症、痴呆、或兴奋性神经元细胞死亡等的方法，或者一种杀灭害虫（例如鳞翅目秋粘夜蛾）、镇痛、戒烟、或戒毒的方法，包括给予有效量的本发明的多肽（芋螺毒素肽或其前肽）或者本发明的药物组合物的步骤；具体地，所述神经痛由如下原因导致：癌症与癌症化疗、酒精中毒、坐骨神经痛、糖尿病、三叉神经痛、硬化症、带状疱疹、机械伤和手术伤、艾滋病、头部神经瘫痪、药物中毒、工业污染中毒、淋巴神经痛、骨髓瘤、多点运动神经痛、慢性先天性感觉神经病、急性剧烈自发性神经痛、挤压神经痛、脉管炎、血管炎、局部缺血、尿毒症、儿童胆汁肝脏疾病、慢性呼吸障碍、复合神经痛、多器官衰竭、脓毒病/脓血症、肝炎、卟啉症、维生素缺乏、慢性肝脏病、原生胆汁硬化、高血脂症、麻疯病、莱姆关节炎、感觉神经束膜炎、过敏症等。

本发明的芋螺毒素肽可通过结合α9α10乙酰胆碱受体(nAChR)或/和NR2C NMDA受体发挥作用，具有镇痛活性。可应用于研究、诊断和治疗神经痛、乳腺癌、肺癌、帕金森症、痴呆、成瘾、癫痫症、局部缺血等神经系统疾病、以及作为有用的分子探针用于研究等方面。不同的α类CTX对脊椎动物受体的亲和性不同,有时相差几个数量级。这种种系间的差异使得α类CTX可作为有用的探针用于研究脊椎动物nAChR的种系发生，可作为分子探针来确定nAchR的不同亚型。它们是新药开发的候选药物、先导药物和治疗药物。

下面给出了本发明涉及的术语的解释。

神经痛

本发明所述多肽涉及到治疗各种神经痛的用途。神经痛是周围或中枢神经系统原发或继发性损害或功能障碍或短暂紊乱引起的疼痛，表现为自发性疼痛、痛觉超敏、痛觉过敏等。很多疾病都会引起神经痛，包括癌症与癌症化疗、酒精中毒、坐骨神经痛、糖尿病、三叉神经痛、硬化症、带状疱疹、机械伤和手术伤、艾滋病、头部神经瘫痪、药物中毒、工业污染中毒、淋巴神经痛、骨髓瘤、多点运动神经痛、慢性先天性感觉神经病、急性剧烈自发性神经痛、挤压神经痛、脉管炎（血管炎）/局部缺血、尿毒症、儿童胆汁肝脏疾病、慢性呼吸障碍、复合神经痛、多器官衰竭、脓毒病/脓血症、肝炎、卟啉症、维生素缺乏、慢性肝脏病、原生胆汁硬化、高血脂症、麻疯病、莱姆关节炎、感觉神经束膜炎、过敏症等。

核酸构建体

本发明还涉及包含本发明所述核酸序列及与之可操作连接的1个或多个调控序列的核酸构建体，所述调控序列在其相容条件下能指导编码序列在合适的宿主细胞中进行表达。表达应理解为包括多肽生产中所涉及的任何步骤，包括，但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。

“核酸构建体”在文中定义为单链或双链核酸分子，它们分离自天然基因，或者经修饰而含有以非天然方式组合和并列的核酸片段。当核酸构建体包含表达本发明所述编码序列必需的所有调控序列时，术语核酸构建体与表达盒同义。术语“编码序列”在文中定义为核酸序列中直接确定其蛋白产物的氨基酸序列的部分。编码序列的边界通常是由紧邻mRNA 5’端开放读码框上游的核糖体结合位点(对于原核细胞)和紧邻mRNA 3’端开放读码框下游的转录终止序列确定。编码序列可以包括，但不限于DNA、cDNA和重组核酸序列。

可以以多种方式操作编码本发明所述肽的分离的核酸序列，使其表达所述肽。可能期望或必须在插入载体之前对核酸序列进行加工，这取决于表达载体。应用重组DNA方法修饰核酸序列的技术为本领域所熟知。

本文中术语“调控序列”定义为包括表达本发明肽所必需或有利的所有组分。每个调控序列对于编码多肽的核酸序列可以是天然含有的或外来的。这些调控序列包括，但不限于，前导序列、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号序列和转录终止子。最低限度，调控序列要包括启动子以及转录和翻译的终止信号。为了导入特定的限制位点以便将调控序列与编码多肽的核酸序列的编码区进行连接，可以提供带接头的调控序列。术语“可操作连接”在文中定义为这样一种构象，其中调控序列位于相对DNA序列之编码序列的适当位置，以使调控序列指导多肽的表达。

调控序列可以是合适的启动子序列，即可被表达核酸序列的宿主细胞识别的核酸序列。启动子序列含有介导多肽表达的转录调控序列。启动子可以是在所选宿主细胞中有转录活性的任何核酸序列，包括突变的、截短的和杂合的启动子，可以得自编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因。

调控序列还可以是合适的转录终止序列，即能被宿主细胞识别从而终止转录的一段序列。终止序列可操作连接在编码多肽的核酸序列的3’末端。在所选宿主细胞中可发挥功能的任何终止子都可以用于本发明。

调控序列还可以是合适的前导序列，即对宿主细胞的翻译十分重要的mRNA非翻译区。前导序列可操作连接于编码多肽的核酸序列的5’末端。在所选宿主细胞中可发挥功能的任何前导序列均可用于本发明。

调控序列还可以是信号肽编码区，该区编码一段连在多肽氨基端的氨基酸序列，能引导编码多肽进入细胞分泌途径。核酸序列编码区的5’端可能天然含有翻译读框一致地与分泌多肽的编码区片段自然连接的信号肽编码区。或者，编码区的5’端可含有对编码序列是外来的信号肽编码区。当编码序列在正常情况下不含有信号肽编码区时，可能需要添加外来信号肽编码区。或者，可以用外来的信号肽编码区简单地替换天然的信号肽编码区以增强多肽分泌。但是，任何能引导表达后的多肽进入所用宿主细胞的分泌途径的信号肽编码区都可以用于本发明。

调控序列还可以是肽原编码区，该区编码位于多肽氨基末端的一段氨基酸序列。所得多肽被称为酶原或多肽原。多肽原通常没有活性，可以通过催化或自我催化而从多肽原切割肽原而转化为成熟的活性多肽。

在多肽的氨基末端即有信号肽又有肽原区时，肽原区紧邻多肽的氨基末端，而信号肽区则紧邻肽原区的氨基末端。

添加能根据宿主细胞的生长情况来调节多肽表达的调控序列可能也是需要的。调控系统的例子是那些能对化学或物理刺激物(包括在有调控化合物的情况下)作出反应，从而开放或关闭基因表达的系统。调控序列的其他例子是那些能使基因扩增的调控序列。在这些例子中，应将编码多肽的核酸序列与调控序列可操作连接在一起。

表达载体

本发明还涉及包含本发明核酸序列、启动子和转录及翻译终止信号的重组表达载体。可以将上述各种核酸和调控序列连接在一起来制备重组表达载体，该载体可以包括1或多个方便的限制位点，以便在这些位点插入或取代编码多肽的核酸序列。或者，可以通过将核酸序列或包含该序列的核酸构建体插入适当表达载体而表达本发明所述核酸序列。制备表达载体时，可使编码序列位于载体中以便与适当的表达调控序列可操作连接。

重组表达载体可以是任何便于进行重组DNA操作并表达核酸序列的载体(例如质粒或病毒)。载体的选择通常取决于载体与它将要导入的宿主细胞的相容性。载体可以是线性或闭环质粒。

载体可以是自主复制型载体(即存在于染色体外的完整结构，可独立于染色体进行复制)，例如质粒、染色体外元件、微小染色体或人工染色体。载体可包含保证自我复制的任何机制。或者，载体是一个当导入宿主细胞时，将整合到基因组中并与所整合到的染色体一起复制的载体。此外，可应用单个载体或质粒，或总体包含将导入宿主细胞基因组的全部DNA的两个或多个载体或质粒，或转座子。

优选本发明所述载体含有1或多个便于选择转化细胞的选择标记。选择标记是这样一个基因，其产物赋予对杀生物剂或病毒的抗性、对重金属的抗性，或赋予营养缺陷体原养型等。细菌选择标记的例子如枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或者抗生素如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素的抗性标记。

优选本发明所述载体包含能使载体稳定整合到宿主细胞基因组中，或保证载体在细胞中独立于细胞基因组而进行自主复制的元件。

就进行自主复制的情况而言，载体还可以包含复制起点，使载体能在目标宿主细胞中自主地复制。复制起点可以带有使其在宿主细胞中成为温度敏感型的突变(参见例如，fEhrlich,1978，美国国家科学院学报75：1433)。

可以向宿主细胞插入1个以上拷贝的本发明核酸序列以提高该基因产物的产量。该核酸序列的拷贝数增加可以通过将该序列的至少1个附加拷贝插入宿主细胞基因组中，或者与该核酸序列一起插入一个可扩增的选择标记，通过在有合适选择试剂存在下培养细胞，挑选出含有扩增拷贝的选择性标记基因、从而含有附加拷贝核酸序列的细胞。

用于连接上述各元件来构建本发明所述重组表达载体的操作是本领域技术人员所熟知的(参见例如Sambrook等，分子克隆实验手册，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1989)。

宿主细胞

本发明还涉及包含可用来重组生产多肽的本发明所述核酸序列的重组宿主细胞。可将包含本发明之核酸序列的载体导入宿主细胞，从而使该载体以上述染色体整合体或自我复制的染色体外载体形式得以维持。术语“宿主细胞”涵盖任何由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的后代。宿主细胞的选择很大程度上取决于多肽编码基因及其来源。

宿主细胞可以是原核细胞或者真核细胞，例如细菌或酵母细胞。可以通过本领域技术人员熟知的技术将载体导入宿主细胞。

制备方法

本发明还涉及重组制备本发明肽的方法，该方法包括：(a)在适于产生所述肽的条件下，培养含有核酸构建体的宿主细胞，该核酸构建体包含编码所述肽的核酸序列；和(b)回收该肽。

在本发明所述制备方法中，用本领域已知方法在合适多肽产生的营养培养基中培养细胞。例如，可以在合适的培养基中，在允许多肽表达和/或分离的条件下，通过摇瓶培养、实验室或工业发酵罐中小规模或大规模发酵(包括连续、分批、分批加料或固态发酵)来培养细胞。在包含碳和氮源以及无机盐的合适的培养基中，采用本领域已知的步骤进行培养。合适的培养基可由供应商提供或者可以参照公开的组成(例如，美国典型培养物保藏中心的目录中所述)来制备。如果多肽被分泌到培养基中，则可以直接从培养基中回收多肽。如果多肽不分泌，可以从细胞裂解物中回收。

可以用本领域已知方法回收所产生的多肽。例如，可以通过常规操作(包括，但不限于离心、过滤、抽提、喷雾干燥、蒸发或沉淀)从培养基中回收多肽。

可以通过各种本领域已知的操作来纯化本发明所述多肽，这些操作包括，但不限于层析(例如，离子交换层析、亲和层析、疏水作用层析、层析聚焦、和大小排阻层析)、HPLC、电泳(例如，制备性等电点聚焦)、差示溶解度(例如硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或抽提(参见例如，蛋白质纯化，J.C.Janson和Lars Ryden编，VCH Publishers,New York,1989)。

用于控制害虫的方法和制剂

可以通过本领域技术人员知道的多种方法，使用本发明的芋螺毒素肽或多核苷酸来实现控制害虫。这些方法包括例如将重组微生物应用于害虫(或它们的所在地)、和用编码本发明的芋螺毒素肽的基因转化植物。转化可以由本领域技术人员使用常规技术进行。此处公开了用于这些转化的必要物质，或者熟练的技术人员可以通过其它方法容易的获得。

可以将配制的含有芋螺毒素肽、或包含本发明所述多核苷酸的重组微生物的制剂应用于土壤。还可以将配制的产品作为种子覆料或根部处理或作物生长周期晚期的完整植株处理应用。制剂可以包括扩散－增稠佐剂、稳定剂、其它杀虫添加剂、或表面活性剂。液体制剂可以是基于水的或非水的，并以泡沫、凝胶、悬浮液、可乳化浓缩物等等形式使用。成分可以包括流变剂、表面活性剂、乳化剂、分散剂、或聚合物。

本领域技术人员可以理解，杀虫剂浓度将由于特殊制剂的本性广泛变化，特别是可作为浓缩物或直接使用。杀虫剂将以至少1％(重量计)存在，而且可能是100%(重量计)。干燥制剂通常有大约1－95％(重量计)的杀虫剂，而液体制剂将通常是液相中固体重量大约1—60%。含有细胞的制剂将通常含有大约10²—大约10⁴个细胞/mg。这些制剂将以每公顷大约50mg(液体的或干的)—1kg或更多的量使用。通过喷、撒、洒、等等，可以将制剂应用于害虫环境，例如土壤和植物。

药物组合物

本发明还涉及含有本发明肽和药学可接受载体和/或赋形剂的药物组合物。所述药物组合物可用于研究、诊断、缓解或治疗与神经痛、乳腺癌、肺癌、智障、成瘾、疼痛、帕金森症、精神病、抑郁、重症肌无力、癫痫症、局部缺血等有关的疾病或病症。在一个实施方案中，含有治疗有效量的本发明肽的药物组合物以利于药用的方式配制和给药，并需考虑到个体病人的临床状况、运送位点、给药方法、给药日程安排和医生已知的其它因素。因此用于本文目的的“有效量”由这些方面的考虑决定。

含治疗有效量的本发明多肽的药物组合物非肠道给药、口服、脑池内给药、鞘内给药等。“药学可接受载体”指无毒的固体、半固体或液体填充物、稀释液、胶囊材料或任何类型的配方辅助物。本文所用术语“非肠道的”表示的给药方式包括静脉内、肌肉内、腹膜内、胸骨内、皮下、鞘内和关节内注射和输注。本发明多肽还可通过缓释系统恰当地给药。

本发明还涉及特异阻断nAChRs或/和NMDA受体的药物组合物。

可应用本发明的芋螺毒素肽作为有用的探针来用于研究动物nAChRs或/和NMDARs的种系发生；作为分子探针来确定nAChRs或/和NMDARs的不同亚型；作为分子模型,设计新药;作为研究、诊断神经性疾病如帕金森氏病、行动障碍、精神分裂症、癫痫症、局部缺血等的工具药和治疗药物；治疗神经痛、成瘾、乳腺癌、肺癌、小细胞肺癌、癫痫症、局部缺血等的侯选药物。作为多肽杀虫剂，开发为新型生物农药等。

发明的有益效果

本发明的αO-芋螺毒素肽能够特异地阻断乙酰胆碱受体（nAChRs）和NMDA受体，并且具镇痛活性和抑制乳腺癌和肺癌细胞生长的功效，以及治疗成瘾、癫痫症与局部缺血等的功效。

附图说明

注：若图中没有标明的各种nAChRs与NMDA受体的亚型来源，均为大鼠的相应受体，图注和图中对大鼠的受体类型来源进行省略。

图1：显示的是αO-GeXIVA成熟肽序列（SEQ ID NO：1）以及具有3种可能的二硫键连接方式的异构体。其中GeXIVA12的二硫键连接方式是I-II,III-IV；GeXIVA13的二硫键连接方式是I-III,II-IV；GeXIVA14的二硫键连接方式是I-IV,II-III。

图2：A显示的是33nM αO-GeXIVA12对α9α10nAChR的电流影响情况。图A中“C”是指的对照电流，箭头所指的是33nM αO-GeXIVA12温育5分钟后，第一个Ach脉冲形成的电流轨迹（～0nA）,Ach脉冲时间为1s；纵坐标是电流大小，单位为nA，横坐标为累计时间，单位为ms，温育前后每相邻2个电流轨迹之间相隔时间为60s。33nM αO-GeXIVA12完全阻断了α9α10 nAChR电流，且洗脱速度很快。图中B、C、D分别为3种异构体αO-GeXIVA12、αO-GeXIVA13、αO-GeXIVA14对α9α10 nAChR的浓度剂量反应曲线。图B、C、D中横坐标为所用αO-GeXIVA异构体的摩尔浓度（M）的对数值（Log[ToxinConcentration]M）;纵坐标为剂量反应百分数（%Response），是相应浓度的毒素作用下乙酰胆碱受体电流与对照电流的比值百分数，每个剂量反应百分数为6-12个非洲爪蟾卵母细胞记录的数据平均值（mean），曲线同时显示标准误（SEM）。

图3：αO-GeXIVA12对其他nAChRs亚型的浓度剂量反应曲线(A-E)。图中横坐标为所用αO-GeXIVA12的摩尔浓度（M）的对数值（Log[Toxin Concentration]M）;纵坐标为剂量反应百分数（%Response），是相应浓度的毒素作用下乙酰胆碱受体电流与对照电流的比值百分数，每个剂量反应百分数为6-12个非洲爪蟾卵母细胞记录的数据平均值（mean），曲线同时显示标准误（SEM）。图上标示了相应的nAChRs亚型以及对该亚型的半阻断剂量（IC₅₀）。αO-GeXIVA12对α*β4与α*β2 nAChRs的阻断活性差异较大，对α*β2 nAChRs的阻断活性远高于对α*β4 nAChRs；对小鼠肌肉型nAChR（Mα1β1δε）与α7 nAChR亚型的阻断活性较接近。

图4：显示的是用钡离子ND96灌流液（Ba⁺⁺-ND96）代替常规ND96灌流液时，3种异构体αO-GeXIVA12，GeXIVA13与GeXIVA14对α9α10nAChR的浓度剂量反应曲线，图中横坐标为所用3个αO-GeXIVA异构体的摩尔浓度（M）的对数值（Log[Toxin Concentration]M）;纵坐标为剂量反应百分数（%Response），是相应浓度的毒素作用下乙酰胆碱受体电流与对照电流的比值百分数。每个剂量反应百分数为9个非洲爪蟾卵母细胞记录的数据平均值（mean），曲线同时显示标准误（SEM）。图上标示了相应的异构体对α9α10 nAChR亚型的半阻断剂量（IC₅₀）。

图5：αO-GeXIVA12对NMDA受体各种亚型的浓度剂量反应曲线。图中横坐标为所用αO-GeXIVA12的摩尔浓度（M）的对数值;纵坐标为剂量反应百分数（%Response），是相应浓度的毒素作用下NMDA受体电流与对照电流的比值百分数，每个剂量反应百分数为3-5个非洲爪蟾卵母细胞记录的数据平均值（mean），曲线同时显示95%置信区间的标准误（SEM）。图上标示了相应的NMDARs亚型以及对该亚型的半阻断剂量（IC₅₀）。

图6：异构体αO-GeXIVA12、αO-GeXIVA13与αO-GeXIVA14对nAChR受体其他各种亚型的浓度剂量反应曲线(A-J)。图中各种标示含义与图3相同。

图7：3种异构体αO-GeXIVA12、αO-GeXIVA13与αO-GeXIVA14对人类nAChR受体有关亚型的浓度剂量反应曲线(A-F)。图中各种标示含义与图3相同。

图8：3种异构体αO-GeXIVA12、αO-GeXIVA13与αO-GeXIVA14对大鼠α9α10 nAChR受体的各种突变型的浓度剂量反应曲线(A-K)。图中各种标示含义与图3相同。

图9：显示的是αO-GeXIVA12阻断α9α10 nAChR后，不能阻止α-CTX RgIA[S4T;R9Cit;Y10Iodo,R11Q]对α9α10 nAChR的阻断作用，证明两者之间结合α9α10 nAChR的位点完全不同。A.1μM αO-GeXIVA12 5min;B.20nM α-CTX RgIA[S4T;R9Cit;Y10Iodo,R11Q]5min;C.1μM αO-GeXIVA12 1min+【1μM αO-GeXIVA12+20nM α-CTX RgIA[S4T;R9Cit;Y10Iodo,R11Q]5min】。

图10：显示的是重组αO-超家族芋螺毒素野生型GeXIVAWT（rCTX-K41）对Sf9细胞的抑制效果。图中横坐标为重组GeXIVAWT的浓度，单位为μg/ml,Control为不加重组GeXIVAWT的阴性对照；纵坐标是在酶标免疫测定仪(BIO-RAD MODEL 550)上测定的490nm波长下的吸光度值。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件（例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社）、相应的参考文献、或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：新的αO-超家族芋螺毒素基因野生型（GeXIVAWT）的克隆和序列分析

以从海南岛、西沙群岛等沿海采集的将军芋螺（C.generalis）活体为材料。用小量柱离心式组织/细胞总RNA抽提试剂盒(上海华舜生物工程有限公司)，按操作手册提取总RNA，然后进行cDNA的合成。具体步骤可以参照文献（例如权娅茹，罗素兰，林秋金，长孙东亭，张本。芋螺毒素RNA的提取及其cDNA合成的研究，中国海洋药物，2005，24（2）:1-5）进行。

以上述合成的cDNA为模版，根据O1-基因超家族前体基因的非翻译区序列设计引物，进行RT-PCR扩增，获取特异性PCR扩增产物。所用引物序列为：

引物1：5’-CATCGTCAAGATGAAACTGACGTG-3’(SEQ ID NO：13);

引物2：5’-CACAGGTATGGATGACTCAGG-3’(SEQ ID NO：14)。

RT-PCR循环程序为：94℃预变性3分钟，94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸30秒，30个循环后，72℃再延伸2分钟。

回收上述特异PCR产物，与T-easy载体(Promega)连接后转化大肠杆菌XL1菌株（也可以使用其它的商业化感受态大肠杆菌细胞），利用蓝白菌落和氨苄青霉素抗性挑选重组子，抽提纯化重组子质粒用于测序，同一PCR产物选取不同的克隆（例如3－5个不同的克隆）进行测序、分析。

经序列分析比较，获得了本发明所述的O1-超家族芋螺毒素新成员，即野生型前体肽GeXIVAWT的cDNA基因。GeXIVAWT前体肽基因经DNAStar软件分析，获知其开放阅读框（ORF）序列即SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，如下：

编码GeXIVAWT前体蛋白的开放阅读框（ORF）（存在等位基因变异，加边框的第19位T与G表示其单碱基突变位点；下划线部分表示编码成熟肽的DNA序列）：

ATGAAACTGACGTGCGTG

TGATCATCACCGTGCTGTTCCTGACGGCCTGTCAACTCACTACAGCTGTGACTTACTCCAGAGGTGAGCATAAGCATCGTGCTCTGATGTCAACTGGCACAAACTACAGGTTGCCCAAGACGTGCCGTAGTTCCGGTCGTTATTGTCGCTCACCTTATGA TTGCCGCAGAAGATATTGCAGACGCATTACGGATGCGTGCGTATAG（SEQ ID NO：1）；或

ATGAAACTGACGTGCGTG

TGATCATCACCGTGCTGTTCCTGACGGCCTGTCAACTCACTACAGCTGTGACTTACTCCAGAGGTGAGCATAAGCATCGTGCTCTGATGTCAACTGGCACAAACTACAGGTTGCCCAAGACGTGCCGTAGTTCCGGTCGTTATTGTCGCTCACCTTATGA TTGCCGCAGAAGATATTGCAGACGCATTACGGATGCGTGCGTATAG（SEQ ID NO：2）

上面的序列编码的O1-超家族芋螺毒素新成员，即野生型前体肽GeXIVAWT（下文中也称为αO-conotoxin GeXIVAWT precursor或αO-GeXIVAWT precursor或GeXIVAWT precursor）的氨基酸序列如下（加边框的第7位L与V表示突变位点的氨基酸，下划线部分表示信号肽的氨基酸序列，箭头↓表示成熟肽前后翻译后修饰加工位点,斜体表示N-末端前肽区）：

MKLTCV

IITVLFLTACQLTTA

↓TCRSSGRYCRSPYDCRRRYCRRITDACV（SEQ ID NO：7）；或

MKLTCV

IITVLFLTACQLTTA

↓TCRSSGRYCRSPYDCRRRYCRRITDACV（SEQ ID NO：8）。

野生型GeXIVAWT的前体肽cDNA基因编码产生的信号肽和成熟肽通过在线的ProP 1.0 Server分析预测(Duckert,P.;Brunak,S.;Blom,N.,Prediction of proprotein convertase cleavage sites.Proteinengineering，design & selection:PEDS 2004,17(1),107-12.)。

编码GeXIVAWT成熟肽的核苷酸序列如下（加边框部分表示编码半胱氨酸的密码子）：

ACG

CGTAGTTCCGGTCGTTAT

CGCTCACCTTATGAT

CGCAGAAGATAT

AGACGCATTACGGATGCGGTATAG（SEQ ID NO：3）。

GeXIVAWT野生型成熟肽（下文中也称为αO-conotoxin GeXIVAWT或αO-GeXIVAWT或GeXIVAWT）的氨基酸序列如下（加边框部分为半胱氨酸）：

T

RSSGRY

RSPYD

RRRY

RRITDA

V（SEQ ID NO：9）。

野生型GeXIVAWT前体肽含有信号肽、前肽和成熟肽3个区域，信号肽中第7位的氨基酸残基为亮氨酸或缬氨酸（L或V），对应的密码子为TTG或GTG。野生型成熟肽区域（SEQ ID NO：9）含有5个半胱氨酸（Cys），这与以往发现的芋螺毒素都不相同，与相关基因超家族的成员比较见表1。

表1：与αO-基因超家族相关的芋螺毒素前体蛋白序列比较

上表中，字符底纹表示信号肽，斜体表示N-末端前肽区，下划线表示成熟肽，箭头↓表示成熟肽前后翻译后修饰加工位点；加边框部分表示突变位点氨基酸。

实施例2：新的αO-超家族芋螺毒素基因突变型（GeXIVA）的制备和序列分析

野生型GeXIVAWT前体肽基因的第181－183碱基TGC编码半胱氨酸Cys，对此进行点突变（也可通过直接人工化学合成SEQ ID NO：4获得），即单碱基突变为编码精氨酸Arg(R)的密码子CGC（

GC→GC），即第181位的T变为C（T181C），该点突变体命名为GeXIVA前体肽基因，其序列如下：

编码GeXIVA前体蛋白的开放阅读框（ORF）（存在等位基因变异，加边框的第19位T与G表示其单碱基突变位点；双下划线部分表示第181位的突变位点，下划线部分表示编码成熟肽的DNA序列）：

ATGAAACTGACGTGCGTG

TGATCATCACCGTGCTGTTCCTGACGGCCTGTCAACTCACTACAGCTGTGACTTACTCCAGAGGTGAGCATAAGCATCGTGCTCTGATGTCAACTGGCACAAACTACAGGTTGCCCAAGACGTGCCGTAGTTCCGGTCGTTATTGTCGCTCACCTTATGA T

GCCGCAGAAGATATTGCAGACGCATTACGGATGCGTGCGTATAG（SEQ ID NO：4）；或

ATGAAACTGACGTGCGTG

GCCGCAGAAGATATTGCAGACGCATTACGGATGCGTGCGTATAG（SEQ ID NO：5）。

上述序列编码O1-超家族芋螺毒素新成员，即突变型前体肽GeXIVA（下文中也称为αO-conotoxin GeXIVA precursor或αO-GeXIVAprecursor或GeXIVA precursor）的氨基酸序列（加边框的第7位L与V表示突变位点的氨基酸，双下划线部分表示第61位的人工突变位点，下划线部分表示信号肽的氨基酸序列，箭头↓表示成熟肽前后翻译后修饰加工位点,斜体表示N-末端前肽区）;

MKLTCV

IITVLFLTACQLTTA

↓TCRSSGRYCRSPYD

RRRYCRRITDACV（SEQ ID NO：10）。

MKLTCV

IITVLFLTACQLTTA

↓TCRSSGRYCRSPYD

RRRYCRRITDACV（SEQ ID NO：11）。

突变型GeXIVA的前体肽cDNA基因编码产生的信号肽和成熟肽通过在线的ProP 1.0 Server分析预测(Duckert,P.;Brunak,S.;Blom,N.,Prediction of proprotein convertase cleavage sites.Proteinengineering，design & selection:PEDS 2004,17(1),107-12.)。

编码GeXIVA成熟肽的核苷酸序列如下（加边框部分表示编码半胱氨酸的密码子；双下划线的字母C表示点突变氨基酸对应的单碱基突变位点）：

ACG

CGTAGTTCCGGTCGTTATCGCTCACCTTATGAT

CGCAGAAGATAT

AGACGCATTACGGATGCGGTATAG（SEQ ID NO：6）。

GeXIVA突变型成熟肽（下文中也称为αO-conotoxin GeXIVA或αO-GeXIVA或GeXIVA）的氨基酸序列如下（加边框部分为半胱氨酸，双下划线的字母R表示点突变氨基酸）：

T

RSSGRY

RSPYD

RRRY

RRITDA

V（SEQ ID NO：12）。

突变型GeXIVA前体肽含有信号肽、前肽和成熟肽3个区域，信号肽中第7位的氨基酸残基为亮氨酸或缬氨酸（L或V），对应的密码子为TTG或GTG。突变型成熟肽区域（SEQ ID NO：12）含有4个半胱氨酸（Cys），这与以往发现的芋螺毒素都不相同，与相关基因超家族的成员比较见上面的表1。

下面的研究表明，GeXIVA是nAChRs和NMDARs的阻断剂，且对α9α10 nAChR的阻断活性最强，所以正式命名为αO-conotoxin GeXIVA，简写为αO-GeXIVA或GeXIVA。

实施例3：αO-芋螺毒素GeXIVA的人工合成

根据αO-芋螺毒素GeXIVA成熟肽的氨基酸序列（SEQ ID NO：12），采用Fmoc方法人工合成GeXIVA三种可能的异构体线性肽GeXIVA12、GeXIVA13、GeXIVA14（图1）。具体方法如下。

三个异构体的树脂肽采用Fmoc化学方法进行人工合成，除了半胱氨酸外，其余氨基酸用标准的侧链保护基团。GeXIVA12的第3和第4个半胱氨酸（Cys）的-SH用Trt(S-trityl)保护，第1和第2个半胱氨酸的-SH用Acm(S-acetamidomethyl)成对保护；GeXIVA13的第2和第4个半胱氨酸（Cys）的-SH用Trt(S-trityl)保护，第1和第3个半胱氨酸的-SH用Acm(S-acetamidomethyl)成对保护；GeXIVA14的第2和第3个半胱氨酸（Cys）的-SH用Trt(S-trityl)保护，第1和第4个半胱氨酸的-SH用Acm(S-acetamidomethyl)成对保护。其合成步骤为：采用固相合成法中的Fmoc与FastMoc方法，在ABI Prism 433a多肽合成仪上合成了3个异构体线性肽。Fmoc氨基酸的侧链保护基为：Pmc(Arg)、Trt(Cys)、But(Thr、Ser、Tyr),OBut(Asp),Boc(Lys).采用Fmoc HOBT DCC方法,合成步骤参考仪器合成手册进行。为反应完全,在哌啶脱保护及偶合时间上分别适当延长,对难接氨基酸采用双偶合，获得树脂肽。用reagent K(trifluoroacetic acid/water/ethanedithiol/phenol/thioanisole;90:5:2.5:7.5:5,v/v/v/v/v)将线性肽从树脂上切割下来，并用冰乙醚沉淀和洗涤回收线性肽粗品,用制备型反向HPLC C18柱（Vydac)纯化，洗脱线性梯度为在0-40min内10-50%B60.溶剂B是60%ACN（acetonitrile）,40%H20,0.92%TFA（trifluoroacetic acid）;溶剂A是1%TFA的水溶液。

纯化后的线性肽用分析型的HPLC C18柱（Vydac）进行纯度检测，其纯度达96%以上，方可用于氧化折叠。参照文献（Dowell,C.;Olivera,B.M.;Garrett,J.E.;Staheli,S.T.;Watkins,M.;Kuryatov,A.;Yoshikami,D.;Lindstrom,J.M.;McIntosh,J.M.,Alpha-conotoxin PIA is selective for alpha6 subunit-containingnicotinic acetylcholine receptors.The Journal of neuroscience2003,23(24),8445-52.）对3个异构体GeXIVA12、GeXIVA13和GeXIVA14的线性肽进行两步氧化折叠反应，过程简述如下：

首先通过铁氰化钾氧化法（20mM potassium ferricyanide,0.1M Tris,pH 7.5，30min）在Trt保护基团的两个半胱氨酸之间形成第一对二硫键。单环肽经反相HPLC C18柱（Vydac)纯化后，进行碘氧化（10mM iodine in H₂O:trifluoroacetic acid:acetonitrile(78:2:20 by volume，10min），移去另外2个半胱氨酸上的Acm,同时在这2个半胱氨酸之间形成第二对二硫键。二环肽再经反相HPLCC18柱（Vydac)纯化，即获得按照从N端至C端的顺序在相应的半胱氨酸之间定向形成二硫键的αO-芋螺毒素，并通过质谱(MS)鉴定为正确。氧化折叠后的3个异构体的理论分子量(monoisotopic mass)为3451.96Da,GeXIVA12的测定分子量为3451.83Da；GeXIVA13的测定分子量为3451.72Da；GeXIVA14的测定分子量为3452.05Da。多肽浓度用280nm波长下比色测定，根据Beer-Lambert方程（equation）计算多肽浓度和质量。这些定量过的异构体继续用于后续的活性测试（例如实施例5-10）。

实施例4：大鼠、小鼠和人类nAChRs各种亚型在非洲爪蟾卵母细胞中的表达

参照文献（Azam L,Yoshikami D,McIntosh JM.Amino acidresidues that confer high selectivity of the alpha6 nicotinicacetylcholine receptor subunit to alpha-conotoxinMII[S4A,E11A,L15A].J Biol Chem.2008;283(17):11625-32.）中的方法，以及体外转录试剂盒（mMessage mMachine in vitrotranscription kit(Ambion,Austin,TX)）说明书，制备各种大鼠神经型nAChRs亚型（α3β2，α6/α3β2β3，α6/α3β4，α9α10，α4β2，α4β4，α3β4，α2β2，α2β4，α7）、人类神经型nAChRs亚型（α9α10，α6/α3β2β3，α7）、大鼠α9α10 nAChR的各种突变体，以及小鼠和人类肌肉型nAChRs（α1β1δε）的cRNA，其浓度用UV 260nm下的OD值进行测算。解剖收集非洲爪蟾（Xenopuslaveis）卵母细胞（蛙卵），将cRNA注射入蛙卵中，每个亚基的注射量为5ng cRNA。肌肉nAChR每个亚基注射0.5-2.5ng DNA。蛙卵在ND-96中培养。蛙卵收集后的1－2天内注射cRNA，注射后1－4天内用于nAChRs的电压钳记录。含有Ba²⁺的ND-96缓冲液是用等摩尔浓度的BaCl₂代替CaCl₂。制得的样品用于例如下面的实施例5-10。

实施例5：αO-芋螺毒素GeXIVA三种异构体阻断各种大鼠nAChRs 的实验

将1个注射过cRNA的蛙卵置于30uL的Sylgard记录槽中（直径4mm×深度2mm），重力灌注含有0.1mg/ml BSA(bovine serum albumin)的ND96灌流液（96.0mM NaCl,2.0mM KCl,1.8mM CaCl₂,1.0mM MgCl₂,5mM HEPES,pH 7.1-7.5)或含有1mM atropine的ND96(ND96A)，流速为1ml/min。所有的芋螺毒素溶液也含有0.1mg/ml BSA以减少毒素的非特异性吸附，用转换阀(SmartValve,Cavro ScientificInstruments,Sunnyvale,CA)可以在灌注毒素或乙酰胆碱(ACh)之间进行自由切换，以及一系列三通螺线阀（solenoid valves,model161TO31,Neptune Research,Northboro,MA)使灌注ND96与ACh等之间进行自由切换。Ach门控的电流由双电极电压箝放大器（modelOC-725B,Warner Instrument Corp.,Hamden,CT）设置在“慢”箝，以及clamp gain在最大值（×2000）位置时进行在线记录。用1mm外径×0.75内径mm的玻璃毛细管（fiber-filled borosilicatecapillaries，WPI Inc.,Sarasota,FL）拉制玻璃电极，并充满3MKCl作为电压和电流电极。膜电压箝制在-70mV.整个系统均由电脑控制和记录数据。ACh脉冲为每隔5min自动灌注1s的ACh。ACh的浓度分别为，表达肌肉型的nAChRs和神经型α9α10 nAChRs卵为10μM；表达神经型的nAChRs之α7为200μM,其他的亚型都为100μM。至少记录4个卵表达某个亚型对不同毒素浓度的电流反应情况，以及电流轨迹。

测试的电流数据用GraphPad Prism软件(San Diego,CA)进行统计分析，绘制剂量反应曲线，计算芋螺毒素的半阻滞浓度IC₅₀等多种有关毒素阻断nAChRs的各种参数。

结果表明，33nM αO-GeXIVA12（实施例3制备）完全阻断了由Ach门控的α9α10 nAChR开放产生的电流,且洗脱很快，阻断是可逆的（图2A）。3个异构体对α9α10 nAChR均有很强的阻断活性，在这3个异构体中，αO-GeXIVA12的活性最强，αO-GeXIVA14的活性次之，αO-GeXIVA13的活性相对最弱（图2B,C,D）。它们的半阻断剂量IC₅₀和误差范围分别为：GeXIVA12,4.6nM(3.18-6.65nM);GeXIVA13,22.7nM(11.8-43.5nM);GeXIVA14,7nM(3.6-13.4nM).3种异构体剂量反应曲线的斜率（Hillslope）及误差范围分别为：GeXIVA12,0.56(0.44-0.69);GeXIVA13,0.78(0.29-1.26),GeXIVA14,0.79(0.23-1.36).αO-GeXIVA12对各种nAChRs亚型均有不同程度的阻断活性，其半阻断剂量IC₅₀和剂量反应曲线的斜率如表2所示。

表2：αO-GeXIVA12对各种nAChRs亚型的半阻断剂量IC₅₀和剂量反应曲线的斜率

αO-GeXIVA12对α*β4与α*β2 nAChRs的阻断活性差异较大，对α*β2 nAChRs的阻断活性远高于对α*β4 nAChRs（图3，A－E）；对小鼠肌肉型nAChR（Mα1β1δε）与α7 nAChR亚型的阻断活性较接近。αO-GeXIVA12更偏爱阻断含有β2的nAChRs，包括α6/α3β2β3，α4β2，α3β2与α2β2。αO-GeXIVA12对α9α10 nAChR的阻断活性至少比其他亚型强56-663倍。在小于200nM低浓度下,αO-GeXIVA12是α9α10 nAChR的特异阻断剂，对其他nAChRs亚型的阻断活性很弱，或几乎没有。αO-GeXIVA12与其他超家族芋螺毒素的作用靶点生物活性比较列于表3。

表3：αO-GeXIVA与其他有关芋螺毒素的特性比较

已知α9α10 nAChR对钙离子（Ca⁺⁺）具有很高的通透性。通过nAChRs的钙离子内流可激活产生氯离子（Cl^-）外流电流，在非洲爪蟾卵母细胞上，这种电流占观察到的α9α10 nAChR开放电流的90%以上。相反，与钙离子接近的钡离子（Ba⁺⁺）不会激活产生氯离子电流。因而，我们用钡离子ND96灌流液（Ba⁺⁺-ND96，1.8mM BaCl₂代替CaCl₂）代替常规ND96灌流液，观察到的α9α10 nAChR开放电流比用常规ND96灌流液的电流小了很多，这与以往的研究一致。在钡离子ND96灌流液条件下，GeXIVA12对α9α10 nAChR的阻断活性最强，GeXIVA14次之，GeXIVA13活性相对最低（图4）。具有I-II;III-IV二硫键连接方式的异构体αO-GeXIVA12对α9α10 nAChR的半阻断剂量（IC₅₀）及误差范围为3.8nM(3.1-4.8nM)，曲线斜率（Hillslope，nH）及误差范围为0.71(0.58-0.84)；具有I-III;II-IV二硫键连接方式的异构体αO-GeXIVA13对α9α10 nAChR的半阻断剂量（IC₅₀）及误差范围为37nM(25.0-55.7nM)，曲线斜率（Hillslope）及误差范围为0.54(0.42-0.65)；具有I-IV;II-III二硫键连接方式的异构体αO-GeXIVA14对α9α10 nAChR的半阻断剂量（IC₅₀）及误差范围为5.8nM(4.7-7.1nM)，曲线斜率（Hillslope）及误差范围为0.65(0.56-0.73)。在钡离子ND96灌流液条件下，αO-GeXIVA的3个异构体的活性与在含有钙离子的正常ND96灌流液条件下的结果相似，且在钡离子-ND96下，αO-GeXIVA12与αO-GeXIVA14的活性比在含有钙离子的正常ND96下更强一点，钡离子-ND96下的αO-GeXIVA13的活性却要比正常ND96下弱一些。因此，GeXIVA三种异构体的确是阻断了α9α10 nAChR，而不是阻断因钙离子激活的氯离子电流。

实施例6：αO-芋螺毒素GeXIVA三种异构体阻断大鼠NMDA受体的实验

参照文献（Twede,V.D.et al.Conantokin-Br from Conusbrettinghami and selectivity determinants for the NR2D subunitof the NMDA receptor.Biochemistry，2009，48：4063-4073）的方法，采用与nAChRs在非洲爪蟾卵母细胞上表达类似的方法，制备大鼠NMDA受体4种亚型NR1-2b/NR2A,NR1-2b/NR2B,NR1-2b/NR2C,NR1-2b/NR2D的相应cRNA，其浓度用UV 260nm下的OD值进行测算。解剖收集非洲爪蟾（Xenopus laveis）卵母细胞（蛙卵），将cRNA注射入蛙卵中，每个亚基的注射量为5ng cRNA。蛙卵在ND-96中培养。蛙卵收集后的1－2天内注射cRNA，注射后1－5天内用于NMDA受体的电压钳记录。用与nAChRs相同的记录方式进行电压钳记录NMDA受体的电流，只是所用的灌流液是不含镁离子的ND96灌流液（Mg²⁺-free ND96buffer），其组成为96.0mM NaCl,2.0mM KCl,1.8mM CaCl2,5mMHEPES(pH 7.2-7.5)。因为Mg²⁺在-70mV钳制电压下，会阻断NMDA受体。NMDA受体激动剂溶液是含有终浓度为200μM的谷氨酸（glutamate）和20μM甘氨酸（glycine）的Mg²⁺-free ND96。αO-GeXIVA12对NR2C NMDAR亚型的阻断活性最强，洗脱较快。αO-GeXIVA12对4种NMDA受体亚型的半阻断剂量（IC₅₀）及误差范围分别为：NR2C,0.66μM(0.38-1.1μM);NR2B,4.0μM(2.2-7.3μM);NR2A,3.7μM(2.8-5.0μM);NR2D,5.2μM(1.7-15.7μM)；αO-GeXIVA12对4种NMDA受体亚型剂量反应曲线斜率（Hillslope）及误差范围分别为：NR2C,0.13(0.42-0.97);NR2B,0.22(0.36-1.3);NR2A,0.10(0.61-1.07);NR2D,0.15(0.10-0.78)（图5）.αO-GeXIVA三种异构体对各种NMDARs亚型的半阻断剂量IC₅₀和剂量反应曲线的斜率列于表4。

表4：αO-GeXIVA三种异构体对各种NMDARs亚型的半阻断剂量IC₅₀和剂量反应曲线的斜率

αO-GeXIVA12对4种NMDA受体亚型的活性由强到弱的顺序为：NR2C＞NR2A＞NR2B＞NR2D。αO-GeXIVA14对2种NMDA受体亚型NR2B与NR2A有较弱的阻断活性，而αO-GeXIVA13对4种NMDA受体亚型的阻断活性很弱或没有。

实施例7：αO-芋螺毒素GeXIVA三种异构体阻断其它的大鼠 nAChRs和小鼠肌肉型nAChRs的实验

采用与实施例4和5相同的实验方法，研究了αO-芋螺毒素GeXIVA三种异构体阻断其它的大鼠nAChRs的和小鼠肌肉型nAChRs作用。3种异构体αO-GeXIVA12、αO-GeXIVA13与αO-GeXIVA14对nAChR受体其它各种亚型的浓度剂量反应曲线如图6（A－J）所示。总的来说，3种异构体对α*β2 nAChRs的阻断活性高于对α*β4 nAChRs（图6）；3种异构体对小鼠肌肉型nAChR（Mα1β1δε）的阻断活性较接近，它们的半阻断剂量IC₅₀分别为：αO-GeXIVA12，394nM;αO-GeXIVA13，671nM;αO-GeXIVA14，473nM.但对于与α7 nAChR亚型的阻断活性，3个异构体之间差异很大，其IC₅₀活性顺序为αO-GeXIVA12，415nM＞αO-GeXIVA14，1740nM＞αO-GeXIVA13，4960nM.αO-GeXIVA12＞GeXIVA14＞GeXIVA13这种活性顺序也出现在小鼠肌肉型nAChR与神经型α3β2 nAChR的活性顺序上，但这3种异构体对Mα1β1δε和α3β2 nAChRs的阻断活性彼此之间差异很小。

可是对于α2β2，α2β4，α4β2，α4β4 nAChRs的阻断活性来说，GeXIVA14的阻断活性是最强的，对α2β2的IC₅₀仅为122nM，对α4β2的IC₅₀为200nM。对于α3β4，α6/α3β4 nAChR的阻断活性来说，GeXIVA13的阻断活性是最强的，其IC₅₀为483nM；GeXIVA14的阻断活性次之，IC₅₀为611nM；GeXIVA12的阻断活性最弱，其IC₅₀为806nM。不过3种异构体对其他所有的nAChRs亚型的阻断活性都远小于对α9α10 nAChR的阻断活性。3种异构体对不同的nAChRs亚型的差异性阻断，可为进一步以GeXIVA为模版，设计改造出一系列针对不同亚型的选择性阻断剂突变体提供了理论基础。

实施例8：αO-芋螺毒素GeXIVA三种异构体阻断人类nAChRs的实验

采用与实施例4和5相同的实验方法，研究了αO-芋螺毒素GeXIVA三种异构体阻断人类nAChRs的作用。3个异构体中，αO-GeXIVA12和GeXIVA14对人类α9α10 nAChR均有很强的阻断活性，αO-GeXIVA12的活性最强，αO-GeXIVA14的活性次之，αO-GeXIVA13的活性相对最弱（图7，A－F）。它们的半阻断剂量IC₅₀和误差范围分别为：GeXIVA12,20nM(12.4-33.2nM);GeXIVA13,116nM(65.4-204nM);GeXIVA14,47nM(29.7-75.3nM).3种异构体剂量反应曲线的斜率（Hillslope）及误差范围分别为：GeXIVA12,0.91(0.49-1.32);GeXIVA13,0.73(0.45-1.01),GeXIVA14,0.67(0.46-0.88).3种异构体对人类肌肉型nAChR（Human α1β1δε）的阻断活性较接近，它们的半阻断剂量IC₅₀分别为：αO-GeXIVA12，497nM;αO-GeXIVA13，485nM;αO-GeXIVA14，365nM.但对于与α7 nAChR亚型的阻断活性，3个异构体之间差异很大，其IC₅₀活性顺序为αO-GeXIVA12，555nM＞αO-GeXIVA14，865nM＞αO-GeXIVA13，3300nM.对人类α9α10与α7 nAChRs的阻断活性顺序αO-GeXIVA12＞GeXIVA14＞GeXIVA13与对大鼠α9α10与α7 nAChRs的阻断活性顺序一致。但这3种异构体对人类α6/α3β2β3 nAChR的阻断活性顺序是αO-GeXIVA13≧GeXIVA14＞GeXIVA12，它们的半阻断剂量IC₅₀分别为：αO-GeXIVA13，141nM;αO-GeXIVA14，197nM;αO-GeXIVA12，505nM。3种异构体对不同的人类nAChRs亚型的差异性阻断，有利于设计改造出一系列αO-GeXIVA类似物，获得对不同亚型的选择性阻断剂。

实施例9：αO-芋螺毒素GeXIVA三种异构体阻断大鼠α9α10 nAChR受体的各种突变型的实验

将芋螺毒素与野生型α9α10 nAChR受体相结合部位的可能的关键氨基酸进行点突变，即单个氨基酸改变，制备α9α10 nAChR受体的各种突变型，突变位点在图8中标明，例如，“rα9R71Gα10”表示大鼠（r）野生型α9α10 nAChR受体的α9亚基上，第71位的精氨酸R(Arg)突变为甘氨酸G(Gly),其余突变体的表示方法以此类推。受体突变体的制作是通过PCR方法，突变野生型α9α10 nAChR受体的α9或α10亚基基因上，对应编码点突变氨基酸的密码子来实现的。所获突变型，按照与实施例4和5相同的实验方法，研究了αO-芋螺毒素GeXIVA三种异构体阻断各种α9α10 nAChRs突变型的作用（图8）。

测试了3种异构体αO-GeXIVA12、αO-GeXIVA13与αO-GeXIVA14对11个大鼠α9α10 nAChR受体的突变型的阻断活性。其浓度剂量反应曲线如图8（A－K）所示。总的趋势是，3种异构体对α9α10 nAChR的各种突变型均有很强的阻断活性，αO-GeXIVA12与αO-GeXIVA14对各种突变型的阻断活性接近，且都比αO-GeXIVA13的活性要强，这与对野生型α9α10 nAChR的阻断活性与顺序一致。3种异构体的阻断活性顺序为αO-GeXIVA12≧GeXIVA14＞GeXIVA13。活性变化较大的突变型有5个，αO-GeXIVA12的半阻断剂量IC₅₀在46-59nM之间；αO-GeXIVA14的半阻断剂量IC₅₀在34-96nM之间；αO-GeXIVA13的半阻断剂量IC₅₀在106-232nM之间。3种异构体对这5个α9α10 nAChR突变型的半阻断剂量IC₅₀分别为：(1)rα9R71Gα10,αO-GeXIVA12，59nM;αO-GeXIVA13，232nM;αO-GeXIVA14，61nM。（2）α9S14Nα10,αO-GeXIVA12，53nM;αO-GeXIVA13，108nM;αO-GeXIVA14，60nM。（3）α9A24Kα10,αO-GeXIVA12，52nM;αO-GeXIVA13，170nM;αO-GeXIVA14，96nM。（4）α9E192Qα10,αO-GeXIVA12，50nM;αO-GeXIVA13，143nM;αO-GeXIVA14，63nM。（5）α9S136Nα10,αO-GeXIVA12，46nM;αO-GeXIVA13，106nM;αO-GeXIVA14，34nM。

活性变化很小的突变型有6个，αO-GeXIVA12的半阻断剂量IC₅₀在14-32nM之间；αO-GeXIVA14的半阻断剂量IC50在24-55nM之间；αO-GeXIVA13的半阻断剂量IC₅₀在68-182nM之间。对于rα9S136Nα10与rα9α10E56S两个突变型来说，3种异构体的阻断活性顺序为αO-GeXIVA14≧GeXIVA12＞GeXIVA13。对于rα9S136Nα10突变型，αO-GeXIVA14（IC₅₀，34nM）表现出比GeXIVA12（IC₅₀，46nM）更强的阻断活性。3种异构体对这6个α9α10 nAChR突变型的半阻断剂量IC₅₀分别为：(1)rα9S117Aα10,αO-GeXIVA12，32nM;αO-GeXIVA13，182nM;αO-GeXIVA14，47nM。（2）αα10D116L,αO-GeXIVA12，28nM;αO-GeXIVA13，122nM;αO-GeXIVA14，45nM。（3）α9α10E56S,αO-GeXIVA12，25nM;αO-GeXIVA13，68nM;αO-GeXIVA14，24nM。（4）α9T56Iα10,αO-GeXIVA12，23nM;αO-GeXIVA13，76nM;αO-GeXIVA14，33nM。（5）α9S6Nα10,αO-GeXIVA12，20nM;αO-GeXIVA13，119nM;αO-GeXIVA14，55nM。（6）α9T64Iα10,αO-GeXIVA12，14nM;αO-GeXIVA13，79nM;αO-GeXIVA14，24nM。

这些α9α10 nAChR突变型的突变位点，是以往发现的α-芋螺毒素与该受体相互结合的关键氨基酸（Ellison M,Feng ZP,Park AJ,Zhang X,Olivera BM,McIntosh JM,Norton RS.Alpha-RgIA,a novelconotoxin tha tblocks the alpha9alpha10 nAChR:structure andidentification of key receptor-binding residues.J Mol Biol.2008;377(4):1216-27），αO-GeXIVA的3种异构体对这些突变型的活性影响不大，活性变化是对野生型α9α10 nAChR的10倍左右或以下。说明αO-GeXIVA与α9α10 nAChR的结合位点或部位与以往发现的α-芋螺毒素的结合部位完全不同，是新的作用位点。

实施例10：αO-芋螺毒素GeXIVA12特异阻断α9α10 nAChR的新颖位点

αO-GeXIVA12阻断α9α10 nAChR的洗脱很快（图9A）。α-CTX RgIA[S4T;R9Cit;Y10Iodo,R11Q]（简称RgIAM）是α9α10 nAChR的特异阻断剂，但洗脱恢复非常慢（实验证实），也就是当毒素RgIAM被洗脱后，α9α10 nAChR回复至ACh正常门控开放状态非常慢（图9B）。

根据二者洗脱速度的不同，本发明人设计了竞争性实验（图9C）。即先用1μM αO-GeXIVA12温育阻断α9α10 nAChR 1min后，再用20nM α-CTX RgIAM与1μMαO-GeXIVA12在同一蛙卵的细胞槽中继续温育阻断α9α10 nAChR 5min，Ach门控电流记录显示其洗脱速度很慢，且与单独用20nM α-CTX RgIAM的洗脱情形一样。同时设置ND96分别替换αO-GeXIVA12与α-CTX RgIAM，作为正负对照。该结果表明，αO-GeXIVA12不能阻止α-CTX RgIA M对α9α10 nAChR的阻断作用，证明两者结合α9α10 nAChR的位点完全不同,αO-芋螺毒素GeXIVA12结合的是α9α10 nAChR的新颖位点，与以前发现的α-芋螺毒素的结合位点不同，且没有重叠。

研究表明，α9α10 nAChR是治疗神经痛、癌症化疗、乳腺癌、肺癌、伤口愈合等的新靶点(McIntosh,J.M.;Absalom,N.;Chebib,M.;Elgoyhen,A.B.;Vincler,M.,Alpha9 nicotinic acetylcholinereceptors and the treatment of pain.Biochemical pnarmacology2009,78(7),693-702.Satkunanathan,N.;Livett,B.;Gayler,K.;Sandall,D.;Down,J.;Khalil,Z.,Alpha-conotoxin Vc1.1alleviates neuropathic pain and accelerates functional recoveryof injured neurones.Brain research 2005,1059(2),149-58.Holtman,J.R.;Dwoskin,L.P.;Dowell,C.;Wala,E.P.;Zhang,Z.;Crooks,P.A.;McIntosh,J.M.,The novel small moleculealpha9alpha10 nicotinic acetylcholine receptor antagonistZZ-204G is analgesic.European journal of pharmacology 2011,670(2-3),500-8.Zheng,G.;Zhang,Z.;Dowell,C.;Wala,E.;Dwoskin,L.P.;Holtman,J.R.;McIntosh,J.M.;Crooks,P.A.,Discovery of non-peptide,small molecule antagonists ofalpha9alpha10 nicotinic acetylcholine receptors as novelanalgesics for the treatment of neuropathic and tonicinflammatory pain.Bioorganic & medicinal chemistry letters 2011,21(8),2476-9.Chernyavsky,A.I.;Arredondo,J.;Vetter,D.E.;Grando,S.A.,Central role of alpha9 acetylcholine receptorin coordinating keratinocyte adhesion and motility at theinitiation of epithelialization.Experimental cell research 2007,313(16),3542-55;Chikova,A.;Grando,S.A.,Naturallyoccurring variants of human Alpha9 nicotinic receptordifferentially affect bronchial cell proliferation andtransformation.PloS one 2011,6(11),e27978.)。因此，本发明的αO-新超家族芋螺毒素GeXIVA在上述疾病的机理研究、诊断、治疗方面具有极高的应用价值。

实施例11：重组αO-芋螺毒素GeXIVAWT抑制Sf9细胞生长的实验

将野生型毒素（αO-GeXIVAWT）基因插入大肠杆菌表达载体pET22b(+)的酶切位点Nco I和Xho I之间，构建出N端融合了pelBleader，C端带有His-tag纯化标签的融合蛋白表达载体。按常规方法进行αO-GeXIVAWT重组蛋白的分离纯化和制备。通过MTT法研究了重组芋螺毒素αO-GeXIVAWT对Sf9细胞（Spodoptera frugiperda 9(Sf9)cells,购自美国Invitrogen公司）生长状况的影响（图10）。该法是根据MTT可透过细胞膜进入细胞内，活细胞线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性MTT还原为难溶于水的蓝紫色的针状甲臜结晶并沉积在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色的深浅与所含的甲臜量成正比。用酶标仪在570nm波长处测定其光吸收值（OD值），可间接反映细胞数量。实验结果表明，重组αO-GeXIVAWT能显著抑制Sf9细胞的生长，且存在剂量效应，在较高浓度下（＞10μg/ml）可杀死Sf9细胞。Sf-9昆虫细胞系来自农业害虫鳞翅目秋粘夜蛾（Spodoptera Frugiperda）的卵巢细胞系Sf-21，该昆虫细胞极易与作为生物农药的苜蓿加州核型多角体病毒（AcMNPV杆状病毒）感染，并且可以与所有杆状病毒表达载体使用。因而，野生型重组芋螺毒素αO-GeXIVAWT在害虫控方面具有很好的应用潜力(Bruce C,Fitches EC,Chougule N,Bell HA,Gatehouse JA(2011)Recombinant conotoxin,TxVIA,produced in yeast has insecticidalactivity.Toxicon 58:93-100.)。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims

1.一种多肽，其为或者包含一个或多个相同或者不同的选自如下的（1）至（3）中任一项所述的氨基酸序列：

（1）SEQ ID NO：7－12中任一序列所示的氨基酸序列;

2.根据权利要求1所述的多肽，其中，SEQ ID NO：12中的N末端的第一个半胱氨酸与第二个半胱氨酸形成二硫键，并且第三个半胱氨酸与第四个半胱氨酸形成二硫键；或者第一个半胱氨酸与第三个半胱氨酸形成二硫键，并且第二个半胱氨酸与第四个半胱氨酸形成二硫键；或者第一个半胱氨酸与第四个半胱氨酸形成二硫键，并且第二个半胱氨酸与第三个半胱氨酸形成二硫键。

3.一种多核苷酸，其编码权利要求1或2所述多肽的氨基酸序列。

4.根据权利要求3所述的多核苷酸，其为包含或者一个或多个相同或不同的选自如下的（1）至（3）中任一项所述的核苷酸序列：

（1）SEQ ID NO：1－6中任一序列所示的核苷酸序列；

（2）SEQ ID NO：1－6中任一序列的互补序列；或

5.一种核酸构建体，其包含权利要求3或4所述的多核苷酸。

6.一种重组表达载体，其包含权利要求5所述的核酸构建体；具体地，所述重组载体是重组pET22b(+)载体。

7.一种转化的细胞，其包含权利要求6所述的重组表达载体；具体地，所述转化的细胞为转化的Sf9细胞。

8.一种融合蛋白，其包含权利要求1或2所述的多肽。

9.一种药物组合物，其包含权利要求1或2所述的多肽，或者包含权利要求8所述的融合蛋白；可选地，其还包含药学上可接受的载体或辅料。

10.一种在体内或体外阻断乙酰胆碱受体或者调节乙酰胆碱水平的方法，包括使用有效量的权利要求1或2所述的多肽的步骤；具体地，所述乙酰胆碱受体是α9α10乙酰胆碱受体。

11.一种在体内或体外阻断NMDA受体或者调节NMDA受体水平的方法，包括使用有效量的权利要求1或2所述的多肽的步骤；具体地，所述NMDA受体是NR2C NMDA受体。

12.一种筛选乙酰胆碱受体抑制剂或确定乙酰胆碱受体亚型的方法，或者一种筛选NMDA受体抑制剂或确定NMDA受体亚型的方法，该方法包括：在存在和不存在候选化合物存在的情况下将乙酰胆碱受体或NMDA受体与权利要求1或2所述的多肽进行接触的步骤；具体地，所述乙酰胆碱受体是α9α10乙酰胆碱受体；具体地，所述NMDA受体是NR2CNMDA受体。

13.权利要求1或2所述的多肽用于阻断乙酰胆碱受体或NMDA受体的用途；具体地，所述乙酰胆碱受体是α9α10乙酰胆碱受体；具体地，所述NMDA受体是NR2C NMDA受体。

14.权利要求1或2所述的多肽在制备阻断乙酰胆碱受体的药物或试剂中的用途或者在制备阻断NMDA受体的药物或试剂中的用途；具体地，所述乙酰胆碱受体是α9α10乙酰胆碱受体；具体地，所述NMDA受体是NR2C NMDA受体。

15.权利要求1或2所述的多肽在制备治疗和/或预防神经系统疾病例如神经痛、癌症化疗、乳腺癌、肺癌、伤口愈合、成瘾、帕金森症、癫痫症、局部缺血、兴奋性神经元细胞死亡或痴呆等的药物的用途，或者用于制备杀灭害虫（例如鳞翅目秋粘夜蛾）、镇痛、戒烟、或戒毒的药物的用途；具体地，所述神经痛由如下因素中的一种或多种导致：癌症与癌症化疗、酒精中毒、坐骨神经痛、糖尿病、三叉神经痛、硬化症、带状疱疹、机械伤和手术伤、艾滋病、头部神经瘫痪、药物中毒、工业污染中毒、淋巴神经痛、骨髓瘤、多点运动神经痛、慢性先天性感觉神经病、急性剧烈自发性神经痛、挤压神经痛、脉管炎、血管炎、局部缺血、尿毒症、儿童胆汁肝脏疾病、慢性呼吸障碍、复合神经痛、多器官衰竭、脓毒病/脓血症、肝炎、卟啉症、维生素缺乏、慢性肝脏病、原生胆汁硬化、高血脂症、麻疯病、莱姆关节炎、感觉神经束膜炎、或过敏症。

16.权利要求1或2所述的多肽的制备方法，包括下述步骤：

1）在ABI Prism 433a多肽合成仪上或者手工方法合成线性多肽，Fmoc氨基酸的侧链保护基为:Pmc(Arg)、Trt(Cys)、But(Thr、Ser、Tyr),OBut(Asp),Boc(Lys)；半胱氨酸用Trt或Acm保护基团，分别在相应的半胱氨酸之间定点形成二硫键；

3）将步骤2）中得到的产物进行两步氧化折叠。