CN102127160B - 蝎活性多肽及其制备方法与应用 - Google Patents

蝎活性多肽及其制备方法与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN102127160B
CN102127160B CN201010588272.XA CN201010588272A CN102127160B CN 102127160 B CN102127160 B CN 102127160B CN 201010588272 A CN201010588272 A CN 201010588272A CN 102127160 B CN102127160 B CN 102127160B
Authority
CN
China
Prior art keywords
admr
seq
active polypeptide
scorpion active
scorpion
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201010588272.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN102127160A (zh
Inventor
李文鑫
吴英亮
曹志贱
韩松
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
WUHAN MORE BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Original Assignee
WUHAN MORE BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by WUHAN MORE BIOTECHNOLOGY CO Ltd filed Critical WUHAN MORE BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority to CN201010588272.XA priority Critical patent/CN102127160B/zh
Publication of CN102127160A publication Critical patent/CN102127160A/zh
Priority to PCT/CN2011/081920 priority patent/WO2012079435A1/zh
Priority to EP11847902.1A priority patent/EP2653477B1/en
Application granted granted Critical
Publication of CN102127160B publication Critical patent/CN102127160B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43513—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from arachnidae
    • C07K14/43522—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from arachnidae from scorpions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了三种蝎活性多肽及其制备方法与应用。本发明三种蝎活性多肽分别为具有如SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的ADMR-011、具有如SEQ ID NO：5所示氨基酸序列的ADMR-016和具有如SEQID NO：9所示氨基酸序列的ADMR-019。本发明所述制备方法为获取具有编码蝎活性多肽的DNA分子与表达载体融合构建重组表达载体转化宿主细胞，诱导表达融合蛋白，分离纯化表达的融合蛋白。本发明还提供了所述蝎活性多肽在制备治疗或预防钾通道Kv1.3相关疾病中的应用。

Description

蝎活性多肽及其制备方法与应用
本发明所述制备方法步骤2所述宿主细胞为大肠杆菌表达菌株，包括 Rosetta系列和BL21系列菌株。在一个优选实施方案中，宿主细胞为Rosetta(DE3)菌株。 
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体的说是涉及蝎活性多肽及其制备方法与应用。 
背景技术
自身免疫性疾病(autoimmune disease)是机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害所引起的疾病，即人体免疫系统攻击自身的组织。全球约有5～8％的人口受到约40多种自身免疫性疾病的威胁，包括T细胞介导的类风湿性关节炎、多发性硬化症、系统性红斑狼疮、白塞病、自身免疫性甲状腺病和I型糖尿病等。在类风湿性关节炎中免疫系统攻击病患的关节部位，多发性硬化症是神经细胞的神精髓鞘(myelin sheaths)受到攻击。这些疾病涉及全身一种或多种组织和器官，严重影响人体健康及生命。针对自身免疫性疾病，目前无有效疗法，且病情反复发作。目前常用对抗自体免疫性疾病的方法，一是利用类固醇来减缓因免疫系统攻击组织所造成的炎症反应，二是使用免疫抑制药物，抑制免疫系统的作用，但这两种方法都会造成严重的副作用，而且都只能减缓病情的发展速度，不能根治疾病。为了改变自身免疫性疾病药物治疗的落后现状，急需探索新的疾病预防和治疗方法。 
原态( )T细胞被特异性的抗原物质激活后，进行增殖和分化，一般形成在功能上各异的两类细胞，即效应型记忆T细胞(effector memory，TEM)和中央型记忆T细胞(central memory，TCM)。在人体T细胞膜上存在两种钾通道，一种是电压门控钾通道Kv1.3，另一种是中等电导钙激活钾通道IKCa1。近年来，研究发现钾通道Kv1.3在不同类型T细胞上具有显著的时空表达差异性，当T细胞被激活后，只有发挥免疫功能的TEM细胞可显著地表达1500～2000个Kv1.3钾通道。这种钾通道Kv1.3高表达情况相继在患不同自身免疫性疾病的病人的TEM细胞中得到证实。因此，T细胞膜上钾通道Kv1.3给治疗自身免疫性疾病带来新的希望[J.Clin.Invest.，2003，111：1703；Immunity，2008，29：602]。 
有机小分子药物首先受到更多的关注。如Merck公司、澳大利亚Walter andEliza Hall药物研发中心、美国加利福尼亚大学等机构筛选、分离、合成、改造和鉴定了大量的有机小分子药物候选物[Mol.Pharmacol，2004，65：1364；Journal of Medicinal Chemistry，2006，49(4)：1433；Mol.Pharmacol，2005，68：1254]。但有机小分子候选药物几乎均作用钾通道Kv1.3和其它相似钾通道，因而极可能造成作用较强的毒副反应，如有机小分子药物作用同源Kv1.1、Kv1.2、Kv1.4、Kv1.5等活性比Kv1.3通道低2～70倍。由于筛选设计有机小分子候选药物具有巨大的挑战性，筛选设计多肽将成为新的趋势。 
中国传统医药常用“以毒攻毒”的策略治疗人类的疑难杂症，有毒动物，如蝎、蛇、蜘蛛、蟾蜍、蜈蚣等是首选。现代研究已表明这些有毒动物的毒液中富含动物活性多肽，这些多肽可特异性作用细胞膜上离子通道。当今，这些动物活性多肽已成为全球竞争研发的重要药物资源[Nat.Rev.Drug.Discov.2003 2：63]。 
发明内容
本发明目的是提供稳定的治疗自身免疫性疾病的蝎活性多肽。 
为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案： 
本发明通过筛选我国蝎活性多肽基因库，得到了许多具有重要药用前景的多肽基因，通过已建立的计算机辅助筛选与设计技术[Biophysical Journal，2004，87：105；Proteins，2008，70：744；Journal of Proteome Research，2010，9：3118]，虚拟筛选到3个可能特异性作用钾通道Kv1.3的蝎活性肽新基因。通过基因工程技术，获得了三种蝎活性多肽，这三种蝎活性多肽分子内均含有3对二硫键，在体外稳定性强，易于长期保存。根据蝎活性多肽在分类学上的结构特征，三者属于同一亚型的α-KTX家族，且都作用于钾通道Kv1.3。 
在一个实施方案中，本发明提供了具有如SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的蝎活性肽，命名为ADMR-011。 
在一个实施方案中，本发明提供了具有如SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蝎活性多肽，命名为ADMR-016。 
在另一个实施方案中，本发明提供了具有如SEQ ID NO：3所示氨基酸序列 的蝎活性多肽，命名为ADMR-019。 
本发明还提供了具有通过在SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基所得到的氨基酸序列的多肽。 
本发明也提供了编码本发明所述蝎活性多肽ADMR-011、ADMR-016和ADMR-019的DNA分子。由于密码子的简并性，可以存在很多种能够编码本发明所述的特定多肽的核苷酸序列。 
在一个实施方案中，本发明提供了可以编码具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的蝎活性多肽ADMR-011的DNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。 
在一个实施方案中，本发明提供了可以编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蝎活性多肽ADMR-016的DNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。 
在另一个实施方案中，本发明提供了可以编码具有SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的蝎活性多肽ADMR-019的DNA分子，其核苷酸序列如SEQ IDNO：6所示。 
同时本发明提供了具有编码本发明所述蝎活性多肽ADMR-011、ADMR-016和ADMR-019DNA分子的载体。 
在一个实施方案中，本发明提供了一种载体，其具有可以编码本发明所述蝎活性多肽ADMR-011的DNA分子。其中，作为优选，所述载体为具有可以编码所述蝎活性多肽ADMR-011的DNA分子的pGEX-6p-1。更优选地是，所述载体为具有如SEQ ID NO：4所示核苷酸序列的pGEX-6p-1。 
在一个实施方案中，本发明提供了一种载体，其具有可以编码本发明所述蝎活性多肽ADMR-016的DNA分子。其中，作为优选，所述载体为具有可以编码所述蝎活性多肽ADMR-016的DNA分子的pGEX-6p-1。更优选地是，所述载体为具有如SEQ ID NO：5所示核苷酸序列的pGEX-6p-1。 
在另一个实施方案中，本发明提供了一种载体，其具有可以编码本发明所述蝎活性多肽ADMR-019的DNA分子。其中，作为优选，所述载体为具 有可以编码所述蝎活性多肽ADMR-011的DNA分子的pGEX-6p-1。更优选地是，所述载体为具有如SEQ ID NO：6所示核苷酸序列的pGEX-6p-1。 
本发明也提供了所述蝎活性多肽ADMR-011、ADMR-016和ADMR-019的制备方法，包括： 
步骤1：获取具有可以编码SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的DNA分子； 
步骤2：将步骤1所获得的DNA分子与表达载体融合，构建重组表达载体，并转化宿主细胞； 
步骤3：诱导含重组表达载体的宿主细胞表达融合蛋白，分离纯化表达的融合蛋白。 
目前利用基因工程技术获得DNA分子的方法有很多种，包括利用限制性内切酶酶切具有编码所述蝎活性多肽DNA分子的载体或以具有编码所述蝎活性多肽的DNA分子的cDNA为模板PCR扩增。 
在一个实施方案中，本发明所述蝎活性多肽ADMR-011的制备方法所述步骤1具体为以具有编码SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的cDNA为模板，用具有SEQ ID NO：7所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO：8所示核苷酸序列的下游引物扩增。 
在一个实施方案中，本发明所述蝎活性多肽ADMR-016的制备方法所述步骤1具体为以具有编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的cDNA为模板，用具有SEQ ID NO：9所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO：10所示核苷酸序列的下游引物扩增。 
在另一个实施方案中，本发明所述蝎活性多肽ADMR-019的制备方法所述步骤1具体为以具有编码SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的cDNA为模板，用具有SEQ ID NO：11所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO：12所示核苷酸序列的下游引物扩增。 
本发明所述制备方法步骤2所述表达载体包括pGEX系列、pET系列、pQE系列和pMAL系列。在一个优选实施方案中，表达载体为pGEX系列中的pGEX-6p-1。 
实验表明，本发明所述蝎活性多肽ADMR-011、ADMR-016和ADMR-019可特异性作用于钾通道Kv1.3，并可在大鼠动物水平有效地治疗多发性硬化症和类风湿性关节炎等自身免疫性疾病。因此本发明还提供了所述蝎活性多肽在制备治疗或预防钾通道Kv1.3相关疾病药物中的应用，所述钾通道Kv1.3相关疾病包括自身免疫性疾病，具体为多发性硬化症或类风湿性关节炎。 
附图说明
图1示重组蝎活性多肽ADMR-011及其GST融合表达蛋白的电泳检测图，其中，泳道1为蛋白质分子量Marker；2泳道为ADMR-011未经IPTG诱导的全细胞蛋白；泳道3为ADMR-011经IPTG诱导的全细胞蛋白；泳道4为亲和层析后的融合蛋白GST-ADMR-011；泳道5为超滤脱盐浓缩后的融合蛋白GST-ADMR-011；泳道6为融合蛋白GST-ADMR-011经EK酶切后的产物；泳道7为经HPLC分离纯化的ADMR-011多肽； 
图2示重组蝎活性多肽ADMR-016及其GST融合表达蛋白的电泳检测图，其中，泳道1为ADMR-016未经IPTG诱导的全细胞蛋白；泳道2为ADMR-016经IPTG诱导的全细胞蛋白；泳道3为超滤脱盐浓缩后的融合蛋白GST-ADMR-016；泳道4为融合蛋白GST-ADMR-016经EK酶切后的产物；泳道5为经HPLC分离纯化的ADMR-016多肽； 
图3示重组蝎活性多肽ADMR-019及其GST融合表达蛋白的电泳检测图，其中，泳道1为超滤脱盐浓缩后的融合蛋白GST-ADMR-019；泳道2为融合蛋白GST-ADMR-019经EK酶切后的产物；泳道3为经HPLC分离纯化的ADMR-019多肽，泳道4为蛋白质分子量Marker； 
图4示重组蝎活性多肽ADMR-011与GST蛋白质的色谱分离纯化图； 
图5示重组蝎活性多肽ADMR-016与GST蛋白质的色谱分离纯化图； 
图6示重组蝎活性多肽ADMR-019与GST蛋白质的色谱分离纯化图； 
图7示重组蝎活性多肽ADMR-011质谱分析图； 
图8示重组蝎活性多肽ADMR-016质谱分析图； 
图9示重组蝎活性多肽ADMR-019质谱分析图； 
图10示100pM蝎活性多肽ADMR-011对钾通道Kv1.3电流的抑制示意图； 
图11示1nM蝎活性多肽ADMR-016对钾通道Kv1.3电流的抑制示意图；图12示1nM蝎活性多肽ADMR-019对钾通道Kv1.3电流的抑制示意图。 
具体实施方式
本发明实施例公开了蝎活性多肽及其制备方法与应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品、方法和应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品、方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。 
依照本发明，通过筛选我国蝎活性多肽基因库，利用基因工程技术，获得了三种新型蝎活性多肽，分子内均具有3对二硫键，在体外稳定性强，易于长期保存。在一个实施方案中，本发明提供了具有如SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的蝎活性多肽命名为ADMR-011。在一个实施方案中，本发明提供了具有如SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蝎活性多肽命名为ADMR-016。在另一个实施方案中，本发明提供了具有如SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的蝎活性多肽命名为ADMR-019。 
本发明还提供了具有通过在SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基所得到的氨基酸序列的多肽。 
本发明也提供了编码本发明所述蝎活性多肽ADMR-011、ADMR-016和ADMR-019的DNA分子。由于密码子的简并性，可以存在很多种能够编码本发明所述的特定多肽的核苷酸序列。 
在一个实施方案中，本发明提供了可以编码蝎活性多肽ADMR-011的DNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。 
在一个实施方案中，本发明提供了可以编码蝎活性多肽ADMR-016的DNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。 
在另一个实施方案中，本发明提供了可以编码蝎活性多肽ADMR-019的DNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。 
同时本发明提供了具有编码本发明所述蝎活性多肽ADMR-011、ADMR-016和ADMR-019DNA分子的载体。 
在一个实施方案中，本发明提供了一种载体，其具有可以编码本发明所述蝎活性多肽ADMR-011的DNA分子。其中，在一个实施方案中，所述载体为具有可以编码所述蝎活性多肽ADMR-011的DNA分子的pGEX-6p-1。更优选地是，所述载体为具有如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列的pGEX-6p-1。 
在一个实施方案中，本发明提供了一种载体，其具有可以编码本发明所述蝎活性多肽ADMR-016的DNA分子。其中，在一个实施方案中，所述载体为具有可以编码所述蝎活性多肽ADMR-016的DNA分子的pGEX-6p-1。更优选地是，所述载体为具有如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的pGEX-6p-1。 
在一个实施方案中，本发明提供了一种载体，其具有可以编码本发明所述蝎活性多肽ADMR-019的DNA分子。其中，在一个实施方案中，所述载体为具有可以编码所述蝎活性多肽ADMR-011的DNA分子的pGEX-6p-1。更优选地是，所述载体为具有如SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列的pGEX-6p-1。 
为了制备本发明所述蝎活性多肽，本发明也提供了所述蝎活性多肽的制备方法，包括： 
步骤1：获取具有编码所述蝎活性多肽ADMR-011、ADMR-016或ADMR-019的DNA分子； 
步骤2：将步骤1所获得的DNA分子与表达载体融合，构建重组表达载体，并转化宿主细胞； 
步骤3：诱导含重组表达载体的宿主细胞表达融合蛋白，分离纯化表达的融合蛋白。 
目前利用基因工程技术获得DNA分子的方法有很多种，包括利用限制性内切酶酶切具有编码所述蝎活性多肽DNA分子的载体或以具有编码所述蝎 活性多肽DNA分子的cDNA为模板PCR扩增。 
在一个实施方案中，本发明提供了以具有编码所述蝎活性多肽ADMR-011的cDNA为模板，用具有SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列的下游引物扩增，获取具有编码所述蝎活性多肽ADMR-011DNA。 
在一个实施方案中，本发明提供了以具有编码权利所述蝎活性多肽ADMR-016的cDNA为模板，用具有SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列的下游引物扩增，获取具有编码所述蝎活性多肽ADMR-016DNA分子。 
在另一个实施方案中，本发明提供了以具有编码所述蝎活性多肽ADMR-019的cDNA为模板，用具有SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列的下游引物扩增，获取具有编码所述蝎活性多肽ADMR-019DNA分子。 
本发明所述制备方法步骤2所述将步骤1所获得的DNA分子与表达载体融合，构建重组表达载体，并转化宿主细胞具体为步骤1所得DNA分子通过凝胶电泳回收和双酶切插入表达载体，构建重组表达质粒，转化大肠杆菌。 
其中，本发明所述表达载体包括pGEX系列、pET系列、pQ E系列和pMAL系列。在一个优选实施方案中，表达载体为pGEX系列中的pGEX-6p-1。 
本发明所述转化宿主细胞为大肠杆菌表达菌株，包括Rosetta系列和BL21系列菌株。在一个优选实施方案中，宿主细胞为Rosetta(DE3)菌株。真核细胞偏爱的密码子和原核系统有不同，因此，在用原核系统表达真核基因的时候，真核基因中的一些密码子对于原核细胞来说可能是稀有密码子，从而导致表达效率和表达水平很低。Rosetta(DE3)是携带pRARE2质粒的BL21衍生菌，可以补充大肠杆菌缺乏的七种稀有密码子(AUA，AGG，AGA，CUA，CCC，GGA及CGG)对应的tRNA，提高外源基因尤其是真核基因在原核系统中的表达水平。 
本发明所述制备方法所述步骤3具体为IPTG诱导培养含重组表达载体的宿主细胞，收集菌体超声波破碎，取上清亲和层析得到融合蛋白，再经脱盐浓缩、小肠激酶酶切和色谱分离，获取色谱纯的蝎活性多肽。其中，所述亲 和层析的层析介质为根据表达载体的选择性标签选择的与之相匹配的层析介质。在一个优选实施方案中，表达载体为pGEX-6p-1，亲和层析的层析介质为GST亲和层析胶。 
在具体实施方案中，本发明所述制备方法具体为以具有编码所述蝎活性多肽ADMR-011、ADMR-016或ADMR-019的DNA分子的cDNA为模板，用根据编码成熟肽部分的核苷酸序列设计的引物，获取具有编码所述蝎活性多肽ADMR-011、ADMR-016或ADMR-019的DNA分子，凝胶电泳回收和双酶切获取的DNA分子及表达载体pGEX-6p-1，连接构建重组表达质粒，转化大肠杆菌Rosetta(DE3)获得重组菌。然后IPTG诱导培养含重组表达载体的宿主细胞，收集菌体超声波破碎，取上清GST亲和层析得到融合蛋白，再经脱盐浓缩、小肠激酶酶切和色谱分离，获取色谱纯的蝎活性多肽ADMR-011、ADMR-016或ADMR-019。 
本发明通过膜片钳技术鉴定了所述蝎活性多肽ADMR-011、ADMR-016和ADMR-019对钾通道Kv1.3的药理学活性。结果显示，所述蝎活性多肽ADMR-011、ADMR-016和ADMR-019可特异性抑制钾通道Kv1.3电流，抑制电流半数的多肽浓度(IC50值)分别为91pM、2.58nM、1.41nM，表明蝎活性多肽ADMR-011、ADMR-016和ADMR-019可特异性作用自身免疫疾病的靶标钾通道Kv1.3。 
本发明通过在大鼠动物水平上模拟治疗多发性硬化症和类风湿性关节炎检测蝎活性多肽ADMR-011、ADMR-016和ADMR-019药物治疗效果。结果显示，蝎活性多肽ADMR-011、ADMR-016和ADMR-019治疗后，大鼠多发性硬化症和类风湿性关节炎的症状得到显著改善，表明蝎活性多肽ADMR-011、ADMR-016和ADMR-019能有效地治疗多发性硬化症和类风湿性关节炎。 
本发明通过对蝎活性多肽ADMR-011、ADMR-016和ADMR-019的毒性作用研究，发现蝎活性多肽ADMR-011、ADMR-016和ADMR-019在超过自身免疫疾病动物模型治疗剂量100倍的剂量下对小鼠无明显毒性，表明蝎活性多肽ADMR-011、ADMR-016和ADMR-019毒副作用小。 
因此本发明还提供了所述蝎活性多肽在制备治疗或预防钾通道Kv1.3相 关疾病药物中的应用，所述钾通道Kv1.3相关疾病包括自身免疫性疾病，具体为多发性硬化症或类风湿性关节炎。 
本发明所述蝎活性多肽ADMR-011、ADMR-016和ADMR-019分子内均具有3对二硫键，在体外稳定性好，易于长期保存。膜片钳技术鉴定显示可特异性作用钾通道Kv1.3，特异性强，是目前国际上已发现的活性强的多肽。动物实验表明，重组多肽ADMR-011、ADMR-016和ADMR-019可以有效治疗大鼠的多发性硬化症和类风湿性关节炎，药物效果显著，并且对实验动物毒副作用小。本发明所述蝎活性多肽的制备方法简单易行，操作方便，易于生产和制备高纯度的ADMR-011、ADMR-016和ADMR-019蝎活性多肽。 
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的蝎活性多肽及其制备方法与应用进行详细说明。 
实施例1：蝎活性多肽ADMR-011、ADMR-016和ADMR-019基因的获取 
取40只海南斑等蝎(Isometrus maculates)蝎尾腺，用Trizol试剂(Invitrogen)提取总RNA，提取方法参照Trizol试剂盒说明书。用Poly A TractmRNA Isolation System(Promega)试剂盒纯化mRNA，并采用SuperscriptPlasmid System cDNA library construction kit(Gibco/BRL)试剂盒构建cDNA文库。将cDNA克隆到pSPORT1载体中，并转化大肠杆菌DH5α，随机挑选cDNA克隆进行测序。对测序的结果进行序列分析，共获得可能与钾离子通道相互作用的236个蝎活性肽新基因。通过建立的计算机辅助筛选与设计技术[Biophysical Journal，2004，87：105；Proteins，2008，70：744；Journal of ProteomeResearch，2010，9：3118]，分别预测136个蝎活性肽基因编码多肽的空间结构，然后通过计算机虚拟筛选它们与钾通道Kv1.3的相互作用，获得了具有编码蝎活性多肽ADMR-011、ADMR-016和ADMR-019DNA分子的cDNA基因，所编码的成熟肽分别为具有如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的蝎活性多肽ADMR-011、ADMR-016和ADMR-019。 
实施例2：扩增编码蝎活性多肽ADMR-011、ADMR-016和ADMR-019的DNA分子 
1、引物设计： 
分别以蝎活性多肽ADMR-011、ADMR-016和ADMR-019的cDNA基因序列中编码成熟肽部分的核苷酸序列作为PCR反应的模板序列设计引物。设计的引物为： 
ADMR-011上游引物为SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列； 
ADMR-011下游引物为SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列； 
ADMR-016上游引物为SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列； 
ADMR-016下游引物为SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列； 
ADMR-019上游引物为SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列； 
ADMR-019下游引物为SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列； 
2、扩增DNA分子： 
以蝎毒cDNA为模板，用具有SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列的下游引物进行PCR扩增。 
PCR扩增反应体系为： 
10×taq buffer(with 1.5mM Mg2+)    5μl 
dNTP(5mM)                          4μl 
上游引物(100ng/ul)                 1μl 
下游引物(100ng/ul)                 1μl 
模板(5-50ng/μl)                   1μl 
Taq酶(2U/μl)                      0.5μl 
加入灭菌蒸馏水补足体系总量50ul。 
PCR反应程序为： 
94℃预变性                                 300s 
72℃延伸                                   200s 
3、重组表达载体构建： 
将PCR扩增产物凝胶电泳回收，用EcoRI和XhoI双酶切，将酶切后的 片段插入经EcoRI和XhoI双酶切的表达载体pGEX-6p-1(购自Pharmacia公司)，构建重组表达质粒，转化大肠杆菌DH5α(中国典型培养物保藏中心)。从含氨苄青霉素的LB平板中挑取单菌落，在含氨苄青霉素的LB液体培养基中37℃培养5小时，然后用PCR扩增的方法对这些培养物进行鉴定。PCR扩增模板用培养获得的菌液，扩增的引物、反应条件和反应过程同DNA分子扩增过程。选取PCR鉴定正确的菌种进行测序，获得序列正确的含重组表达载体的菌种，提取质粒，转化大肠杆菌Rosetta(DE3)(中国典型培养物保藏中心)。 
蝎活性多肽ADMR-016和ADMR-019的DNA分子扩增反应体系和反应程序以及重组表达载体构建与ADMR-011相同。 
实施例3蝎活性多肽ADMR-011、ADMR-016和ADMR-019的表达和纯化 
提取测序序列正确的含重组表达载体的pGEX-6p-1-ADMR-011菌种的质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3)。IPTG(华美生物工程公司)诱导培养转化的大肠杆菌，收集菌体，悬浮于缓冲液(50mM Tris-Cl，1.0mM EDTA，pH8.0)中，超声波破碎菌体，离心收集上清。所得上清通过GST亲和层析得到融合蛋白。收集得到的融合蛋白溶液脱盐浓缩、小肠激酶(EK)酶切，获得蝎活性多肽ADMR-011。利用高效液相色谱对ADMR-011多肽进一步分离，去除GST蛋白质，得到色谱纯ADMR-011多肽。ADMR-011多肽理论分子量为4258.7Da，经质谱分析显示它的分子量为4258.8Da，与根据氨基酸序列推断的分子量一致。其中，对不同阶段得到的ADMR-011多肽及其与GST融合蛋白进行了PAGE电泳检测，结果见图1，高效液相色谱分离纯化和质谱分析结果见图4和图7。ADMR-011多肽理论分子量为4258.7Da，经质谱分析显示它的分子量为4258.8Da，与根据氨基酸序列推断的分子量一致。 
蝎活性多肽ADMR-016和ADMR-019的表达和纯化方法和步骤与ADMR-011多肽相同，相关的多肽的分离纯化和质谱检测结果见图2、图3图5、图6、图8和图9。ADMR-016和ADMR-019多肽理论分子量分别为3912.6Da、3940.6Da，经质谱分析，它们分子量分别为3912.9Da、3940.7Da，与根据氨基酸序列推断的分子量一致。 
实施例4：蝎活性多肽ADMR-011、ADMR-016和ADMR-019对钾通道Kv1.3的药理学活性分析 
将COS-7细胞在含10％的胎牛血清的DMEM培养基37℃、5％CO2条件下培养，将钾通道Kv1.3重组质粒分别用SofastTM的转染试剂盒转染，转染细胞在0.8mg/mL Geneticin培养基上选择性培养。利用全细胞膜片钳用仪器(EPC-10双通道膜片钳放大器HEKA，Elektronik，Lambrecht，Germany)，对重组蝎活性多肽ADMR-011、ADMR-016和ADMR-019的药理学活性进行测定和分析。实验参数的设置、数据的采集和刺激的施加均通过Pulse软件(Elektronik，Lambrecht，Germany)来控制。仪器的滤波器设置为10kHz(Bessel)，电极阻抗为2-5MΩ，在电极与细胞膜之间形成高阻(1-5GΩ)封接后，进行快电容自动补偿(c-fast)，稍加负压破膜后，进行慢电容自动补偿(c-slow)，在-70mV的钳制电位下，从-60mV起给予10mV步幅递增、80ms步宽的去极化脉冲刺激至+50mV，观察电流情况，将多肽ADMR-011、ADMR-016和ADMR-019通过MPS-2(INBIO Inc，Wuhan，China)灌注系统实现精确灌注。将3种蝎活性多肽溶解后，经DAD给药系统(ALA)喷射给药，给药管尖端距记录细胞100μm左右，结果见图10、图11和图12。 
由图10、图11和图12可知ADMR-011对钾通道Kv1.3的药理学活性为91pM，ADMR-016对钾通道Kv1.3的药理学活性为2.58nM，ADMR-019对钾通道Kv1.3的药理学活性为1.41nM，是目前国际上已发现的活性强的多肽。 
实施例5：蝎活性多肽ADMR-011、ADMR-016和ADMR-019治疗多发性硬化症的药效实验 
实验动物：选取近交系雌性Wistar大鼠(6-8周龄，体重150±10g)，豚鼠(300-400g购自武汉大学实验动物中心)。 
主要试剂：福氏完全佐剂(Gibcol/BRL)，卡介苗、百日咳疫苗(上海生物制品所)，豚鼠MBP(Sigma)。 
全脊髓匀浆-福氏完全佐剂混合乳剂(GPSCH-CFA)的配制：将豚鼠处死后，迅速取出脊髓，用超声破碎仪(Sonics & Materials Inc，America)制成50％的PBS匀浆，与等量的福氏完全佐剂(卡介苗10mg/ml)混合，用注射器抽打至油包水乳剂。 
EAE的诱导Wistar大鼠EAE模型：Wistar大鼠双后腿足垫皮内注射0.4mlGPSCH-CFA乳剂，或同时皮内注射约1×1010百日咳疫苗。每日称重，观察神经症状。饲养2周即出现实验性自身免疫性脑脊髓炎。 
将实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)大鼠随机分为分为五组：正常对照组(阴性对照组)、模型对照阴(模型鼠+生理盐水)、A给药组(模型鼠+ADMR-011多肽)、B给药组(模型鼠+ADMR-016多肽)和C给药组(模型鼠+ADMR-019多肽)，每组10只。给药组将多肽ADMR-011、ADMR-016和ADMR-019分别按100μg·kg-1剂量皮下注射，每天上午1次，正常对照组和模型对照阴皮下注射等量生理盐水，连续给药。给药14天后，观察大鼠患实验性自身免疫性脑脊髓炎状况，根据大鼠状况评分，记录每只动物最高临床评分，取它们的均值为平均临床评分，结果见表1。 
评分标准为：无任何临床症状，0分；尾部张力消失，可见轻度步态笨拙，1分；双后肢无力，被动翻身后可以恢复，2分；双后肢瘫痪，被动翻身后不能恢复，3分；四肢瘫痪伴尿、便失禁，4分；濒死状态或死亡，5分。 
表1EAE模型中各实验组大鼠的评分 
实验结果表明：在没有药物治疗情况下，模型对照组得分最高(2.93±0.16)；蝎活性多肽ADMR-011、ADMR-016和ADMR-019治疗后，大鼠的症状得到显著改善，平均临床评分分别为0.95±0.37、1.21±0.49、1.37±0.34。由此可见，蝎活性多肽ADMR-011、ADMR-016和ADMR-019能 有效地治疗多发性硬化症。 
实施例6：蝎活性多肽ADMR-011、ADMR-016和ADMR-019治疗类风湿性关节炎的药效实验 
选取无特定病原体(SPF)级近交系SD大鼠(武汉大学实验动物中心)40只，♀，体重150±10g，在清洁级环境条件下适应性饲养1周后，以0.2ml/只剂量的降植烷(pristane)在实验组大鼠尾根部皮内注射。饲养2周即出现类风湿性关节炎症状。 
将关节炎大鼠随机分为：正常对照组(阴性对照组)、模型阴性对照组(模型鼠+生理盐水)、模型阳性对照组(模型鼠+氨甲喋呤)、A给药组(模型鼠+ADMR-011多肽)、B给药组(模型鼠+ADMR-016多肽)和C给药组(模型鼠+ADMR-019多肽)，每组10只。给药组按100μg·kg-1剂量皮下注射，每天上午1次，连续给药；正常对照组和模型阴性对照组皮下注射等量生理盐水；模型阳性对照组按1.75mg·kg-1剂量皮下注射氨甲喋呤(MTX)，每天1次，连续给药。 
给药21天后，观察大鼠患关节炎状况。观察大鼠患类风湿性关节炎状况，根据大鼠状况评分，记录每只动物最高临床评分，取它们的均值为平均临床评分，结果见表2。评分标准为：大鼠一个关节红肿，1分；大鼠二个关节红肿，2分；大鼠各个关节红肿，3分；大鼠整个肢体严重关节炎，4分。 
表2各实验组大鼠的关节炎评分 
从实验第8天起，隔日测1次大鼠后足跖容积并记录，并根据足跖在造模前后容积之差计算肿胀度(mL)，连续观察21天，结果见表3。 
表3各实验组大鼠的足跖肿胀度 
由表2可知，在没有药物治疗情况下，模型阴性对照组关节评分最高(3.67±0.85)；蝎活性多肽ADMR-011、ADMR-016和ADMR-019治疗后，大鼠的症状得到显著改善，评分分别为1.62±0.59、1.96±0.62、1.81±0.77，与氨甲喋呤治疗组结果相近(1.67±0.82)。表3测量各实验组大鼠的足跖肿胀度的结果显示，三种蝎活性多肽给药组的大鼠足跖肿胀度与模型阴性对照组相比显著降低。结果表明，蝎活性多肽ADMR-011、ADMR-016和ADMR-019能有效地治疗类风湿性关节炎。 
实施例7：蝎活性多肽ADMR-011、ADMR-016和ADMR-019的毒性作用研究 
选取18-20g昆明小鼠，分4组，每组雌雄各8只。将蝎活性多肽ADMR-011、ADMR-016和ADMR-019冻干粉分别用生理盐水溶解，以10mg/kg的剂量(动物模型给药剂量的100倍)分别对3组小鼠进行一次腹腔注射多肽溶液，第4组注射等量生理盐水做对照。给药后连续观察7天，评 价给药后药物对动物呼吸中枢，心肺功能，中枢神经系统CNS的影响。 
各组动物在给药后，呼吸，运动，心跳正常，无明显的异常反应。给药7天后将所有动物进行大体解剖，观察主要脏器(心，肝，脾，肺，肾)的体积，颜色，质地，未见明显改变，无肉眼可见的病变，给药组3组动物与生理盐水组无明显差别。实验结果表明，蝎活性多肽ADMR-011、ADMR-016和ADMR-019在超过自身免疫疾病动物模型治疗剂量100倍的剂量下对小鼠无明显毒性。 
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。 

Claims (12)

1.作用于钾通道Kv1.3的α-KTX家族蝎活性多肽，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.编码权利要求1所述蝎活性多肽的DNA分子。
3.编码SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的DNA分子，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
4.具有权利要求3所述DNA分子的载体。
5.根据权利要求4所述载体，其特征在于，所述载体为pGEX-6p-1。
6.权利要求1所述蝎活性多肽的制备方法，包括：
步骤1：获取可以编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的DNA分子；
步骤2：将步骤1所获得的DNA分子与表达载体融合，构建重组表达载体，并转化宿主细胞；
步骤3：诱导含重组表达载体的宿主细胞表达融合蛋白，分离纯化表达的融合蛋白。
7.根据权利要求6所述制备方法，其特征在于，所述步骤1具体为以编码SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的cDNA为模板，用SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列的上游引物和SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列的下游引物扩增。
8.根据权利要求6所述制备方法，其特征在于，步骤2所述表达载体为pGEX-6p-1。
9.根据权利要求6所述制备方法，其特征在于，步骤2所述宿主细胞为Rosetta(DE3)菌株。
10.权利要求1所述蝎活性多肽在制备治疗或预防钾通道Kv1.3相关疾病药物中的应用。
11.根据权利要求10所述应用，其特征在于，所述钾通道Kv1.3相关疾病为自身免疫性疾病。
12.根据权利要求11所述应用，其特征在于，所述自身免疫性疾病为多发性硬化症或类风湿性关节炎。
CN201010588272.XA 2010-12-14 2010-12-14 蝎活性多肽及其制备方法与应用 Active CN102127160B (zh)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201010588272.XA CN102127160B (zh) 2010-12-14 2010-12-14 蝎活性多肽及其制备方法与应用
PCT/CN2011/081920 WO2012079435A1 (zh) 2010-12-14 2011-11-08 蝎活性多肽及其制备方法与应用
EP11847902.1A EP2653477B1 (en) 2010-12-14 2011-11-08 Scorpion active peptides and preparation methods and applications thereof

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201010588272.XA CN102127160B (zh) 2010-12-14 2010-12-14 蝎活性多肽及其制备方法与应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102127160A CN102127160A (zh) 2011-07-20
CN102127160B true CN102127160B (zh) 2014-07-16

Family

ID=44265460

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201010588272.XA Active CN102127160B (zh) 2010-12-14 2010-12-14 蝎活性多肽及其制备方法与应用

Country Status (3)

Country Link
EP (1) EP2653477B1 (zh)
CN (1) CN102127160B (zh)
WO (1) WO2012079435A1 (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102127160B (zh) * 2010-12-14 2014-07-16 武汉摩尔生物科技有限公司 蝎活性多肽及其制备方法与应用
CN102617723B (zh) * 2012-04-10 2013-06-19 武汉大学 蝎活性多肽及其制备方法与应用
CN107987145B (zh) * 2017-12-18 2021-04-16 武汉大学 蝎活性多肽adp-7及其应用
CN110357950B (zh) * 2019-07-29 2023-04-25 武汉大学 酸性氨基酸扫描法设计的免疫抑制多肽及应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006002850A2 (en) * 2004-06-25 2006-01-12 Cellpep Sa OsK1 DERIVATIVES

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101422600A (zh) * 2008-12-04 2009-05-06 武汉莫尔元药科技有限公司 蝎源免疫调节多肽在治疗多发性硬化症的药物中的应用
CN101422599B (zh) * 2008-12-04 2011-08-17 武汉摩尔生物科技有限公司 蝎源免疫调节多肽在治疗类风湿性关节炎的药物中的应用
CN102127160B (zh) * 2010-12-14 2014-07-16 武汉摩尔生物科技有限公司 蝎活性多肽及其制备方法与应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006002850A2 (en) * 2004-06-25 2006-01-12 Cellpep Sa OsK1 DERIVATIVES

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HAN, S.等.Structural Basis of a Potent Peptide Inhibitor Designed for Kv1.3 Channel, a Therapeutic Target of Autoimmune Disease..《THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》.2008,参见摘要，第19058页右栏第3段-第19064页右栏第2段，尤其是图1中的BmKTx.
RENISIO, J. G.等.Solution Structure of BmKTX, a K1 Blocker Toxin From the Chinese Scorpion Buthus Martensi..《PROTEINS》.2000,参见摘要，第71页左栏第2段-第78页左栏第1段，尤其是图1中的BmKTx.
Solution Structure of BmKTX, a K1 Blocker Toxin From the Chinese Scorpion Buthus Martensi.;RENISIO, J. G.等;《PROTEINS》;20000101;参见摘要，第71页左栏第2段-第78页左栏第1段，尤其是图1中的BmKTx *
Structural Basis of a Potent Peptide Inhibitor Designed for Kv1.3 Channel, a Therapeutic Target of Autoimmune Disease.;HAN, S.等;《THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》;20080514;参见摘要，第19058页右栏第3段-第19064页右栏第2段，尤其是图1中的BmKTx *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2012079435A1 (zh) 2012-06-21
EP2653477A4 (en) 2014-10-29
EP2653477B1 (en) 2018-10-24
CN102127160A (zh) 2011-07-20
EP2653477A1 (en) 2013-10-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102127160B (zh) 蝎活性多肽及其制备方法与应用
US20090209468A1 (en) Alpha-neurotoxin proteins with anti-inflammatory properties and uses thereof
WO2021204170A1 (zh) 一种中华冀土鳖虫来源的具有降血脂功能的活性肽及其制备方法和应用
CN104211795B (zh) 靶向钾离子通道Kv1.3活性多肽的分子设计及制备与应用
CN114599670B (zh) 一种角蛋白bd-13、制法和其药物组合物与用途
CN102617723B (zh) 蝎活性多肽及其制备方法与应用
CN103848914B (zh) 一种具抗凝活性的菲牛蛭素多肽及其制备方法与用途
CN101423550B (zh) 基因工程免疫抑制多肽及制备方法和用途
CN103665133A (zh) α-芋螺毒素肽LvIA/LvD21、其药物组合物及用途
WO2020259109A1 (zh) 植物生产的epo与转铁蛋白的融合蛋白及其应用
CN107987145B (zh) 蝎活性多肽adp-7及其应用
CN110041404B (zh) 瓜氨酸化抗原修饰肽及其应用
CN101422600A (zh) 蝎源免疫调节多肽在治疗多发性硬化症的药物中的应用
TW200906433A (en) Therapeutic agent for acute hepatitis or prophylactic and/or therapeutic agent for fulminant hepatitis
CN116970594B (zh) 一种表达酪氨酸和苯丙氨酸解氨酶的重组菌株及其应用
CN113929769B (zh) 一种促进成肌细胞增殖的活性肽及其应用
CN116769007B (zh) 蜈蚣镇痛多肽PvTx及其编码基因和应用
CN110357950B (zh) 酸性氨基酸扫描法设计的免疫抑制多肽及应用
WO2005066201A1 (fr) Sequences d'acides amines provenant d'un principe actif du musc et sel acetique de ces sequences, procede de preparation et d'utilisation de ces sequences d'acides amines
CN116855434B (zh) 一种重组大肠杆菌及其在制备酪氨酸血症药物中的应用
CN112724224B (zh) 一种角蛋白bd-15、制法和其药物组合物与用途
CN112724229B (zh) 一种角蛋白bd-4、制法和其药物组合物与用途
CN112724228B (zh) 一种角蛋白bd-14、制法和其药物组合物与用途
CN109369778B (zh) 一种三肽及其制备方法与用途
CN116396361A (zh) 芋螺毒素肽CTX-gta01及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant