CN104211795B - 靶向钾离子通道Kv1.3活性多肽的分子设计及制备与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及靶向钾离子通道Kv1.3活性多肽的分子设计及制备与应用。本发明提供的多肽具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。该多肽比现有技术中作为钾离子通道Kv1.3阻断剂应用的多肽具有更高选择性和更低的潜在毒性作用，是靶向钾离子通道Kv1.3的高效低毒的阻断剂。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及靶向钾离子通道Kv1.3活性多肽的分子设计及制备与应用。
背景技术
钾离子通道Kv1.3是一种位于细胞膜上的蛋白质，它在淋巴结、血管内皮、脾等不同组织中均有分布，并执行相关的生理功能。近年来，不同病理研究发现了钾离子通道Kv1.3具有显著的表达上调现象，并成为了治疗不同疾病的药物靶标。例如，在T细胞介导的自身免疫性疾病多发性硬化症中，效应记忆T细胞（effector memory，TEM）活化后，细胞膜上钾离子通道Kv1.3表达数目从约300个上调到约1500个。同样，在T细胞介导的自身免疫性疾病类风湿性关节炎和I型糖尿病中，TEM细胞活化后细胞膜上钾离子通道Kv1.3表达数目从约300个上调到约1500个。在器官移植免疫排斥反应中活化后的TEM细胞膜上也发现了钾离子通道Kv1.3的高表达现象。此外，在血管内膜增生过程中和急性冠状动脉综合症，研究发现了血管平滑肌细胞和T细胞膜上钾离子通道Kv1.3的差异表达。鉴于钾离子通道Kv1.3在不同疾病中功能，筛选设计高效低毒靶向钾离子通道Kv1.3的药物成为新药研发新方向。
蝎活性肽BmKTX是于1997年从蝎毒液中分离发现的多肽，它作用于钾离子通道Kv1.3的IC50为0.2nM（Biochemistry,1997,36:13473-13482），它的氨基酸序列如SEQ IDNO：20所示。
在2007年，基于蝎活性肽BmKTX作为结构模板，申请人运用计算机辅助设计的方法替换BmKTX中的3个氨基酸残基，即同时将Gly11、Ile28、Asp33分别替换为Arg11、Thr28、His33，设计了高效作用于钾离子通道Kv1.3的多肽ADWX-1，活性IC50为1.89pM，比其结构模板蝎活性肽BmKTX活性提高了约50倍（在专利ZL200710053679.0中ADWX-1多肽名称为LWX-1；Structural Basis of a Potent Peptide Inhibitor Designed for Kv1.3 Channel,aTherapeutic Target of Autoimmune Disease.J Biol Chem,2008,283:19058-19065）。但是，试验发现ADWX-1多肽同时高效作用于钾离子通道Kv1.3同源的钾离子通道Kv1.1，作用活性IC50为0.65nM。由于ADWX-1多肽作用钾离子通道Kv1.1高达0.65nM，说明ADWX-1多肽对于钾离子通道Kv1.3的选择性不强，在高剂量使用时具有潜在的毒副作用。相关多肽作用于钾离子通道Kv1.1毒性也被观察到。如多肽ShL(L5)作用于钾离子通道Kv1.1和Kv1.3活性IC50分别为7.4nM和69pM，当治疗大鼠多发性硬化症的剂量达到600微克/千克/天时，40%的大鼠在治疗的第5天发生了死亡。证明作用于钾离子通道Kv1.3的多肽在高剂量使用时可能会作用于钾离子通道Kv1.1并产生毒性。可见，筛选与设计高效低毒（即高活性且高选择性）靶向钾离子通道Kv1.3多肽药物仍具有挑战性。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供靶向钾离子通道Kv1.3活性多肽的分子设计及制备与应用，本发明提供的钾离子通道Kv1.3活性多肽不作用于除Kv1.3以外的其他钾离子通道。
本发明提供了一种多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，具体为Val-Gly-Ile-Asn-Val-X1-Cys-Lys-His-Ser-Gly-Gln-Cys-Leu-Lys-Pro-Cys-Lys-X2-Ala-Gly-Met-Arg-Phe-Gly-Lys-Cys-Ile-Asn-Gly-Lys-Cys-X3-Cys-Thr-Pro-Lys；
其中，X1为-Asp、-Glu、-Lys或-Arg；
X2为-Lys、-Arg、-Asp或-Glu；
X3为-His、-Asp和-Glu。
基于申请人建立的多肽-靶标蛋白质相互作用的“人工控制识别”新分子工程技术(Journal of Proteome Research,2010,9:3118-3125），本发明以含有37个氨基酸残基的蝎活性肽BmKTX为模板，计算机辅助分别设计了与BmKTX模板酸性氨基酸残基分布不同、活性表面各不相同但序列高度相似具有如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽。
作为优选，本发明提供的多肽具有如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的多肽序列中只在第19位上含有1个酸性氨基酸残基-Asp；具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的多肽序列中只在第33位上含有1个酸性氨基酸残基-Asp；而具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的多肽序列中包含两个酸性氨基酸残基，分别是位于第6位的-Asp和位于第33位的-Asp。具有如SEQ ID NO:2、SEQID NO:3或SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的多肽与模板BmKTX多肽相比都具有各不相同的活性表面。模板BmKTX多肽的氨基酸序列中，主要以重要功能氨基酸残基：位于第23位的-Arg（为堵塞钾离子通道孔的氨基酸残基）和位于第24位的-Phe附近区域的alpha螺旋和beta折叠间的转角结构区域为活性表面识别钾离子通道Kv1.3；而具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的多肽主要以重要功能氨基酸残基位于第23位的-Arg和位于第26位的-Lys（为堵塞钾离子通道孔的氨基酸残基）、位于第29位的-Asn等反向平行的beta折叠结构区域为活性表面识别钾离子通道Kv1.3；具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的多肽主要以重要功能氨基酸残基：位于第8位的-Lsy（为堵塞钾离子通道孔的氨基酸残基）、位于第9位的-His和位于第15位的-Lys等alpha螺旋的前半部分结构区域为活性表面识别钾离子通道Kv1.3（具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的多肽的alpha螺旋在钾离子通道Kv1.3上方呈“竖立”状态）；具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的多肽主要以重要功能氨基酸残基：位于第15位的-Lsy（为堵塞钾离子通道孔的氨基酸残基）、位于第18位的-Lys和位于第19位的-Lys等alpha螺旋的后半部分结构区域为活性表面识别钾离子通道Kv1.3（具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的多肽的alpha螺旋在钾离子通道Kv1.3上方呈“水平”状态）。
由于具有SEQ ID NO:2～4所示氨基酸序列的多肽与模板BmKTX多肽以各不相同的活性表面识别钾离子通道Kv1.3，它们活性也发生了显著变化：BmKTX模板多肽IC50为0.91nM、具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的多肽IC50为0.015nM、具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的多肽IC50为0.375nM、具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的多肽IC50为7.3nM。通过对其它不同钾离子通道活性测试发现，3个新设计的多肽均不作于钾离子通道Kv1.1、Kv1.2、Kv7.1、Kv11.1、Kca2.2、Kca2.3、Kca3.1等，比现有技术中作为钾离子通道Kv1.3阻断剂应用的多肽具有更高选择性和更低的潜在毒性作用。因此，本发明提供的多肽是靶向钾离子通道Kv1.3的高效低毒的阻断剂。
作为优选，本发明提供的多肽还包括如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸的多肽。
优选的，修饰包括磷酸化、甲基化、乙酰化、泛素化、糖基化或羰基化。
优选地，如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中取代一个氨基酸的多肽具有如SEQ IDNO:21～44中任一项所示的氨基酸序列。
本发明提供的多肽作为钾离子通道Kv1.3阻断剂的应用。
动物实验表明，本发明提供的多肽可以有效治疗大鼠的多发性硬化症和类风湿性关节炎。鉴于钾离子通道Kv1.3在不同疾病药物治疗中的靶标功能，因此本发明提供的多肽可作为钾离子通道Kv1.3阻断剂的应用。因此，本发明提供的多肽可以用于制备治疗或预防钾离子通道Kv1.3相关疾病的药物。钾离子通道Kv1.3相关疾病包括迟发性超敏反应相关疾病、血管内膜增生相关的心血管疾病或自身免疫性疾病。
本发明还提供了上述多肽在制备治疗或预防迟发性超敏反应相关疾病、血管内膜增生相关的心血管疾病或自身免疫性疾病的药物中的应用。
本发明提供的多肽治疗或预防的迟发性超敏反应相关疾病包括器官移植免疫排斥、接触性皮炎或肉芽肿病。
本发明提供的多肽治疗或预防的血管内膜增生相关的心血管疾病为动脉粥样硬化、急性冠状动脉综合症或血管成形术后再狭窄。
本发明提供的多肽治疗或预防的自身免疫性疾病为多发性硬化症、类风湿性关节炎、I型糖尿病、自身免疫性肝炎、红斑狼疮或银屑病。
作为优选，用于治疗或预防迟发性超敏反应相关疾病、血管内膜增生相关的心血管疾病或自身免疫性疾病的药物包括本发明提供的多肽及药学上可接受的辅料。
优选的，本发明提供的药物为口服制剂或注射制剂。
更优选的，口服制剂为片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、汤剂、膏剂、露剂、口服液剂、滴丸剂、糖浆剂、酊剂、散剂或冲剂。
更优选的，注射制剂为粉针剂或注射液。
本发明还提供了能够编码本发明提供多肽的DNA分子。
由于密码子的简并性，可以存在很多种能够编码本发明提供的多肽的核苷酸序列，均在本发明的保护范围内，本发明在此不做限定。
在本发明的实施例中，编码具有如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列多肽的DNA分子具有如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列。
编码具有如SEQ ID NO:3所示氨基酸序列多肽的DNA分子具有如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。
编码具有如SEQ ID NO:4所示氨基酸序列多肽的DNA分子具有如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列。
本发明还提供了一种包括能够编码本发明提供多肽的DNA分子的重组载体。
作为优选，本发明提供的重组载体中表达载体选自pGEX系列、pET系列、pQE系列或pMAL系列中的任一种。
优选的，本发明提供的重组载体中表达载体选自pGEX系列。
更优选的，本发明提供的重组载体中表达载体为pGEX-6p-1。
本发明还提供了一种包括本发明提供的重组载体的转化体。
本发明提供的转化体的宿主细胞为大肠杆菌、酵母菌或真核细胞表达体系。
作为优选，本发明提供的转化体的宿主细胞为大肠杆菌。
优选的，本发明提供的转化体的宿主细胞为大肠杆菌Rosetta系列菌株或BL21系列菌株。
更优选的，本发明提供的转化体的宿主细胞为宿主细胞为Rosetta系列的DE3菌株。
本发明提供的多肽的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：将编码本发明提供的多肽的DNA分子克隆到表达载体获得重组载体；
步骤2：将重组载体转化入宿主细胞，获得转化体；
步骤3：培养转化体，经诱导表达、分离、纯化，即得。
本发明提供的多肽的制备方法中，编码多肽的DNA分子具有SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6或SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列。
本发明提供的多肽的制备方法中，克隆如SEQ ID NO:5所示核苷酸序列的DNA分子采用的引物序列如SEQ ID NO:8～11所示。
本发明提供的多肽的制备方法中，克隆如SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的DNA分子采用的引物序列如SEQ ID NO:12～15所示。
本发明提供的多肽的制备方法中，克隆如SEQ ID NO:7所示核苷酸序列的DNA分子采用的引物序列如SEQ ID NO:16～19所示。
作为优选，本发明提供的多肽的制备方法，步骤1具体包括如下步骤：
步骤a：以蝎毒cDNA为模板，扩增编码本发明提供的多肽的DNA分子，经纯化获得扩增产物；
步骤b：取扩增产物及表达载体，经分别双酶切后连接，即得。
优选的，扩增反应体系为：
优选的，扩增反应程序为：
优选的，纯化具体为凝胶电泳回收。
优选的，双酶切采用的限制性内切酶为EcoR I和Xho I。
作为优选，本发明提供的多肽的制备方法的步骤2中，在将重组载体转化入宿主细胞前，将重组载体首先转化入大肠杆菌DH5α，筛选出转化入重组载体的阳性菌株，培养并提取质粒，将质粒转化入宿主细胞。
作为优选，本发明提供的多肽的制备方法的步骤3中，诱导表达采用的诱导剂为IPTG。
作为优选，本发明提供的多肽的制备方法的步骤3中，分离具体为：取诱导表达的转化体，收集菌体，经破碎后取上清液，经亲和层析获得融合蛋白溶液。
作为优选，本发明提供的多肽的制备方法的步骤3中，纯化具体为：取融合蛋白溶液，经浓缩、酶切后，除杂。
优选的，酶切采用小肠激酶。
优选的，除杂采用高效液相色谱法。
本发明提供了一种多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，具体为Val-Gly-Ile-Asn-Val-X1-Cys-Lys-His-Ser-Gly-Gln-Cys-Leu-Lys-Pro-Cys-Lys-X2-Ala-Gly-Met-Arg-Phe-Gly-Lys-Cys-Ile-Asn-Gly-Lys-Cys-X3-Cys-Thr-Pro-Lys；其中，X1为-Asp、-Glu、-Lys或-Arg；X2为-Lys、-Arg、-Asp或-Glu；X3为-His、-Asp和-Glu。本发明提供的多肽是以蝎活性肽BmKTX为模板，计算机辅助分别设计的与BmKTX模板酸性氨基酸残基分布不同、活性表面各不相同但序列高度相似的多肽。在多肽或蛋白质的结构与功能关系的经典概念上，具有相似的氨基酸残基序列便具有相同的活性表面和相似的功能。在本发明中，申请人突破多肽或蛋白质的结构与功能关系的经典概念，设计具有相似的氨基酸残基序列多肽具有截然不同的活性表面。在多肽空间结构水平上，本发明提供的多肽中酸性氨基酸残在处于分子表面三角形不同位置。与野生型BmKTX多肽相比，由于仅替换了几个氨基酸残基，圆二色谱实验显示了本发明提供多肽的结构与野生型BmKTX多肽相似。但当它们与靶标离子通道Kv1.3的“酸性”孔区（带有20个酸性氨基酸残基结构区域）相互作用时，运用不同多肽酸性氨基酸残基与靶标钾离子通道“酸性”孔区差异的静电排斥原理，使本发明提供的多肽将分别采用与野生型BmKTX多肽不同的“活性表面”识别靶标钾离子通道，从而具有不同的药理学功能。通过生物学试验证实了本发明提供的多肽均以各不相同的活性表面识别钾离子通道Kv1.3，它们活性也发生了显著变化：BmKTX野生型多肽IC50为0.91nM、具有如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽只在第19位含有1个酸性氨基酸残基的，其IC50为0.015nM；具有如SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的多肽只在第33位含有1个酸性氨基酸残基，其IC50为0.375nM、具有如SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的多肽在第6位和第33位含有两个酸性氨基酸残基，其IC50为7.3nM。通过对其它不同钾离子通道活性测试发现，且新设计的多肽均不作于钾离子通道Kv1.1、Kv1.2、Kv7.1、Kv11.1、Kca2.2、Kca2.3、Kca3.1等，比现有技术中作为钾离子通道Kv1.3阻断剂应用的多肽具有更高选择性和更低的潜在毒性作用。因此，本发明提供的多肽是靶向钾离子通道Kv1.3的高效低毒的阻断剂。
附图说明
图1示本发明提供的重组多肽以及重组野生型BmKTX模板多肽的色谱分离纯化图；其中，图1（a）示采用与本发明实施例1～3提供的方法制备的重组野生型BmKTX模板多肽的色谱分离纯化图，12.6min对应的色谱峰为BmKTX模板多肽；图1（b）示本发明实施例1～3制备的具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的重组多肽的色谱分离纯化图，12.9min对应的色谱峰为SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的重组多肽；图1（c）示本发明实施例1～3制备的具有SEQID NO:3所示氨基酸序列的重组多肽的色谱分离纯化图，13.1min对应的色谱峰为SEQ IDNO:3所示氨基酸序列的重组多肽；图1（d）示本发明实施例1～3制备的具有SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的重组多肽的色谱分离纯化图，12.6min对应的色谱峰为SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的重组多肽；
图2示本发明提供的重组多肽以及重组野生型BmKTX模板多肽的质谱分析图；其中，图2（a）示采用与本发明实施例1～3提供的方法制备的重组野生型BmKTX模板多肽的质谱分析图；图2（b）示本发明实施例1～3制备的具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的重组多肽的质谱分析图；图2（c）示本发明实施例1～3制备的具有SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的重组多肽的质谱分析图；图2（d）示本发明实施例1～3制备的具有SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的重组多肽的质谱分析图；
图3示酸性氨基酸残基在本发明提供的多肽以及野生型BmKTX模板多肽结构中的分布特点；其中，图3（a）示野生型BmKTX模板多肽中酸性氨基酸的分布特点；图3（b）示具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽中酸性氨基酸的分布特点；图3（c）示具有SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的多肽中酸性氨基酸的分布特点；图3（d）示具有SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的多肽中酸性氨基酸的分布特点；
图4示本发明提供的多肽以及野生型BmKTX模板多肽的圆二色谱分析图；其中，图4（a）示野生型BmKTX模板多肽的圆二色谱分析图；图4（b）示具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽的圆二色谱分析图；图4（c）示具有SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的多肽的圆二色谱分析图；图4（d）示具有SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的多肽的圆二色谱分析图；
图5示本发明提供的多肽以及野生型BmKTX模板多肽的阻断靶标钾离子通道Kv1.3电流与多肽浓度依赖关系分析图，其中，曲线1示野生型BmKTX模板多肽阻断靶标钾离子通道Kv1.3电流与多肽浓度依赖关系曲线；曲线2示具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽阻断靶标钾离子通道Kv1.3电流与多肽浓度依赖关系曲线；曲线3示具有SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的多肽阻断靶标钾离子通道Kv1.3电流与多肽浓度依赖关系曲线；曲线4示具有SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的多肽阻断靶标钾离子通道Kv1.3电流与多肽浓度依赖关系曲线；
图6示本发明提供的多肽及其突变体对钾离子通道Kv1.3电流的抑制作用；其中，纵坐标为突变体多肽的药理学活性除以野生型多肽药理学活性的比值；图6（a）示野生型BmKTX模板多肽及其突变体对钾离子通道Kv1.3电流的抑制作用，其中，柱1示野生型BmKTX模板多肽对钾离子通道Kv1.3电流的抑制作用；柱2～15依次示具有SEQ ID NO:21～34所示氨基酸序列的多肽对钾离子通道Kv1.3电流的抑制作用；图6（b）示具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽及其突变体对钾离子通道Kv1.3电流的抑制作用，其中，柱1示具有SEQ IDNO:2所示氨基酸序列的多肽对钾离子通道Kv1.3电流的抑制作用；柱2～8依次示具有SEQID NO:35～41所示氨基酸序列的多肽对钾离子通道Kv1.3电流的抑制作用；图6（c）示具有SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的多肽及其突变体对钾离子通道Kv1.3电流的抑制作用，其中，柱1示具有SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的多肽对钾离子通道Kv1.3电流的抑制作用；柱2～11依次示具有SEQ ID NO:42～51所示氨基酸序列的多肽对钾离子通道Kv1.3电流的抑制作用；图6（d）示具有SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的多肽及其突变体对钾离子通道Kv1.3电流的抑制作用，其中，柱1示具有SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的多肽对钾离子通道Kv1.3电流的抑制作用；柱2～8依次示具有SEQ ID NO:52～58所示氨基酸序列的多肽对钾离子通道Kv1.3电流的抑制作用；
图7示本发明提供的多肽以及野生型BmKTX模板多肽以各不相同的活性表面识别靶标钾离子通道Kv1.3的复合物结构图；其中，图7（a）示野生型BmKTX模板多肽的活性表面识别靶标钾离子通道Kv1.3的复合物结构图；图7（b）示具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽的活性表面识别靶标钾离子通道Kv1.3的复合物结构图；图7（c）示具有SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的多肽的活性表面识别靶标钾离子通道Kv1.3的复合物结构图；图7（d）示具有SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的多肽的活性表面识别靶标钾离子通道Kv1.3的复合物结构图；
图8示本发明提供的多肽对不同钾通道电流的抑制作用图；其中，图8（a）中曲线1示阴性对照对钾离子通道Kv1.1电流的抑制作用，曲线2示具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽对钾离子通道Kv1.1电流的抑制作用；图8（b）中曲线1示阴性对照对钾离子通道Kv1.1电流的抑制作用，曲线2示具有SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的多肽对钾离子通道Kv1.1电流的抑制作用；图8（c）中曲线1示阴性对照对钾离子通道Kv1.1电流的抑制作用，曲线2示具有SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的多肽对钾离子通道Kv1.1电流的抑制作用；图8（d）中曲线1示阴性对照对钾离子通道Kv1.2电流的抑制作用，曲线2示具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽对钾离子通道Kv1.2电流的抑制作用；图8（e）中曲线1示阴性对照对钾离子通道Kv1.2电流的抑制作用，曲线2示具有SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的多肽对钾离子通道Kv1.2电流的抑制作用；图8（f）中曲线1示阴性对照对钾离子通道Kv1.2电流的抑制作用，曲线2示具有SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的多肽对钾离子通道Kv1.2电流的抑制作用；图8（g）中曲线1示阴性对照对钾离子通道Kv7.1电流的抑制作用，曲线2示具有SEQ IDNO:2所示氨基酸序列的多肽对钾离子通道Kv7.1电流的抑制作用；图8（h）中曲线1示阴性对照对钾离子通道Kv7.1电流的抑制作用，曲线2示具有SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的多肽对钾离子通道Kv7.1电流的抑制作用；图8（i）中曲线1示阴性对照对钾离子通道Kv7.1电流的抑制作用，曲线2示具有SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的多肽对钾离子通道Kv7.1电流的抑制作用；图8（j）中曲线1示阴性对照对钾离子通道Kv11.1电流的抑制作用，曲线2示具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽对钾离子通道Kv11.1电流的抑制作用；图8（k）中曲线1示阴性对照对钾离子通道Kv11.1电流的抑制作用，曲线2示具有SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的多肽对钾离子通道Kv11.1电流的抑制作用；图8（l）中曲线1示阴性对照对钾离子通道Kv11.1电流的抑制作用，曲线2示具有SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的多肽对钾离子通道Kv11.1电流的抑制作用；图8（m）中曲线1示阴性对照对钾离子通道Kv2.2电流的抑制作用，曲线2示具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽对钾离子通道Kv2.2电流的抑制作用；图8（n）中曲线1示阴性对照对钾离子通道Kv2.2电流的抑制作用，曲线2示具有SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的多肽对钾离子通道Kv2.2电流的抑制作用；图8（o）中曲线1示阴性对照对钾离子通道Kv2.2电流的抑制作用，曲线2示具有SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的多肽对钾离子通道Kv2.2电流的抑制作用；图8（p）中曲线1示阴性对照对钾离子通道Kv2.3电流的抑制作用，曲线2示具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽对钾离子通道Kv2.3电流的抑制作用；图8（q）中曲线1示阴性对照对钾离子通道Kv2.3电流的抑制作用，曲线2示具有SEQ IDNO:3所示氨基酸序列的多肽对钾离子通道Kv2.3电流的抑制作用；图8（r）中曲线1示阴性对照对钾离子通道Kv2.3电流的抑制作用，曲线2示具有SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的多肽对钾离子通道Kv2.3电流的抑制作用；图8（s）中曲线1示阴性对照对钾离子通道Kv3.1电流的抑制作用，曲线2示具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽对钾离子通道Kv3.1电流的抑制作用；图8（t）中曲线1示阴性对照对钾离子通道Kv3.1电流的抑制作用，曲线2示具有SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的多肽对钾离子通道Kv3.1电流的抑制作用；图8（u）中曲线1示阴性对照对钾离子通道Kv3.1电流的抑制作用，曲线2示具有SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的多肽对钾离子通道Kv3.1电流的抑制作用。
具体实施方式
本发明提供了靶向钾离子通道Kv1.3活性多肽的分子设计及制备与应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试剂皆为普通市售品，皆可于市场购得。
其中，Taq酶采用购自TakaRa公司的TaKaRa TaqTM-附加反应用缓冲液、dNTP混合液；
表达载体pGEX-6p-1购自Pharmacia公司；
大肠杆菌DH5α、大肠杆菌Rosetta(DE3)购自中国典型培养物保藏中心；
限制性内切酶购自TakaRa公司；
T4连接酶购自Fermentas公司；
回收采用的试剂盒为购自Fermentas公司的DNA Extraction Kit；
测序工作由华在基因公司完成；
质粒快速提取试剂盒购自武汉摩尔肽公司；
小肠激酶（EK）购自武汉摩尔肽公司；
IPTG（异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷）购自华美生物工程公司。
本发明实施例中的回收、双酶切、连接、转化步骤，皆参照上述产品的说明书进行。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1：具有如SEQ ID NO:5～7所示的核苷酸序列的DNA分子的获得
1、扩增引物设计：
以具有如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列为模板序列设计扩增引物，扩增如SEQID NO:5所示核苷酸序列的DNA分子采用的引物序列如SEQ ID NO:8～11所示；
以具有如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列为模板序列设计扩增引物，扩增如SEQID NO:6所示核苷酸序列的DNA分子采用的引物序列如SEQ ID NO:12～15所示；
以具有如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列为模板序列设计扩增引物，扩增如SEQID NO:7所示核苷酸序列的DNA分子采用的引物序列如SEQ ID NO:16～19所示。
在设计引物过程中，添加连接载体所需的酶切位点及用于切割融合蛋白的蛋白酶酶切位点。
具体引物序列如表1所示：
表1扩增引物序列
注：其中下划线表示限制性酶切位点，方框表示蛋白酶酶切位点对应的核苷酸序列。
2、扩增具有如SEQ ID NO:5～7所示的核苷酸序列的DNA分子：
以蝎毒cDNA为模板，以序列如SEQ ID NO:8～11所示的引物扩增具有如SEQ IDNO:5所示的核苷酸序列；以序列如SEQ ID NO:12～15所示的引物扩增具有如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；以序列如SEQ ID NO:16～19所示的引物扩增具有如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列；
PCR扩增反应体系为以对具有SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列扩增为例：
对具有SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列扩增的扩增体系与此相似。
对具有SEQ ID NO:5～7所示的核苷酸序列扩增的PCR反应程序为：
实施例2：包括如SEQ ID NO:5～7所示的核苷酸序列DNA分子的转化体构建
以包括如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列DNA分子的转化体构建过程为例：
将对具有SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收大小为111bp的目的片段，得到具有如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列的DNA分子。
采用EcoR I和Xho I对回收得到的DNA分子进行双酶切，凝胶电泳并回收获得具有粘性末端的如SEQ ID NO:5所示核苷酸序列的DNA分子。双酶切步骤参照产品说明书进行。采用T4连接酶，将其连接入经EcoR I和Xho I双酶切的表达载体pGEX-6p-1，获得包括如SEQID NO:5所示的核苷酸序列DNA分子的重组载体。采用热激法，将包括如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列DNA分子的重组载体转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于含氨苄青霉素的LB平板培养基上，37℃培养12小时后，从含氨苄青霉素的LB平板中挑取单菌落，将每个单菌落分别在含氨苄青霉素的LB液体培养基中37℃培养5小时，然后用PCR扩增的方法对每个单菌落的液体培养物进行鉴定。鉴定采用的引物为本发明提供的扩增引物中的两条，具体鉴定PCR扩增体系为：
鉴定PCR扩增程序为：
采用琼脂糖凝胶电泳对鉴定结果进行分析，扩增出现大小为111bp的片段单菌落液体培养物为阳性菌种，选取阳性菌种进行测序，选取测序结果与SEQ ID NO：5所示核苷酸序列一致的菌种，培养后提取质粒，将提取得到的质粒采用热激法转化入大肠杆菌Rosetta(DE3)的感受态细胞，涂布于含氨苄青霉素的LB平板培养基上，37℃培养12小时后，从含氨苄青霉素的LB平板中挑取单菌落，将每个单菌落分别在含氨苄青霉素的LB液体培养基中37℃培养5小时，然后用PCR扩增的方法对每个单菌落的液体培养物进行鉴定。鉴定PCR的体系和程序与前相同，鉴定为阳性的菌种即为包含如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列DNA分子的转化体。
包括如SEQ ID NO:6～7所示的核苷酸序列DNA分子的转化体构建过程与构建包括如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列DNA分子的转化体的过程一致。
实施例3：具有如SEQ ID NO:2～4所示的氨基酸序列多肽的表达和纯化
以具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列多肽的表达和纯化为例：
将实施例2中鉴定结果为阳性的菌株接种于3mL含有100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养12小时后，将培养液转接至1L新鲜的含有100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养4小时后，加入IPTG使终浓度为0.1mM，37℃条件下诱导表达4小时。
收集诱导后菌液中的菌体，悬浮于缓冲液(50mM Tris-Cl,1.0mM EDTA，pH8.0)中，超声波破碎菌体，离心收集上清。所得上清通过GST亲和层析，洗脱得到融合蛋白溶液，收集得到的融合蛋白溶液脱盐浓缩。采用小肠激酶（EK）酶切融合蛋白，获得具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列多肽粗品，利用高效液相色谱对其多肽进一步分离，去除GST蛋白质，得到色谱纯具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列多肽。
具有如SEQ ID NO:3～4所示的氨基酸序列多肽的表达和纯化过程与具有如SEQID NO:2所示的氨基酸序列多肽的表达和纯化的步骤一致。
分离谱图如图1所示。图1-a中12.6min对应的色谱峰为BmKTX模板多肽；图1-b中12.9min对应的色谱峰为SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的重组多肽；图1-c中13.1min对应的色谱峰为SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的重组多肽；图1-d中12.6min对应的色谱峰为SEQID NO:4所示氨基酸序列的重组多肽。
实施例4：具有如SEQ ID NO:2～4所示的氨基酸序列多肽的鉴定
采用质谱对本发明提供的具有如SEQ ID NO：2～4所示氨基酸序列的多肽及野生型BmKTX模板多肽进行质谱分析，结果如图2所示，其中，图2-a示野生BmKTX模板多肽的质谱分析结果；图2-b示具有如SEQ ID NO：2所示氨基酸序列多肽的质谱分析结果；图2-c示具有如SEQ ID NO：3所示氨基酸序列多肽的质谱分析结果；图2-d示具有如SEQ ID NO：4所示氨基酸序列多肽的质谱分析结果。结果显示：野生型BmKTX模板多肽的分子量为3962.53Da；具有如SEQ ID NO：2所示氨基酸序列多肽的理论分子量为3985.12Da，经质谱分析显示它的分子量为3985.99Da;具有如SEQ ID NO：3所示氨基酸序列多肽的理论分子量为3975.10Da，经质谱分析显示它的分子量为3975.77Da;具有如SEQ ID NO：4所示氨基酸序列多肽的理论分子量为3962.01Da，经质谱分析显示它的分子量为3962.56Da，三者均与根据氨基酸序列推断的分子量一致。
对本发明提供的具有如SEQ ID NO:2～4所示的氨基酸序列多肽及野生型BmKTX模板多肽的空间结构进行分析，其中酸性氨基酸残基在不同多肽结构中的分布特点如图3所示。其中，图3-a示野生型BmKTX模板多肽的空间结构；图3-b示具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列多肽的空间结构；图3-c示具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列多肽的空间结构；图3-d示具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列多肽的空间结构。结果显示：本发明提供的具有如SEQ ID NO:2～4所示的氨基酸序列多肽及野生型BmKTX模板多肽中的酸性氨基酸残在处于分子表面三角形不同位置。
利用圆二色谱分析本发明提供的具有如SEQ ID NO:2～4所示的氨基酸序列多肽及野生型BmKTX模板多肽的空间结构结果如图4所示；其中，图4-a示野生型BmKTX模板多肽的圆二色谱分析结果；图4-b示具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列多肽圆二色谱分析结果；图4-c示具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列多肽圆二色谱分析结果；图4-d示具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列多肽圆二色谱分析结果。结果显示：与野生型BmKTX多肽相比，由于仅替换了1个或2个氨基酸残基，因此，圆二色谱实验显示，本发明提供的具有SEQID NO：2～4所示氨基酸序列的多肽结构与野生型BmKTX模板多肽相似。
结合图3和图4，在多肽或蛋白质的结构与功能关系的经典概念上，具有相似的氨基酸残基序列便具有相同的活性表面和相似的功能。在本发明中，设计具有相似的氨基酸残基序列多肽具有截然不同的活性表面。在多肽空间结构水平上，本发明提供的多肽中酸性氨基酸残在处于分子表面三角形不同位置。与野生型BmKTX多肽相比，由于仅替换了几个氨基酸残基，圆二色谱实验显示了本发明提供多肽的结构与野生型BmKTX多肽相似。但当它们与靶标离子通道Kv1.3的“酸性”孔区（带有20个酸性氨基酸残基结构区域）相互作用时，运用不同多肽酸性氨基酸残基与靶标钾离子通道“酸性”孔区差异的静电排斥原理，使本发明提供的多肽将分别采用与野生型BmKTX多肽不同的“活性表面”识别靶标钾离子通道，从而具有不同的药理学功能。
实施例5：具有如SEQ ID NO:2～4所示的氨基酸序列的多肽对钾通道Kv1.3的药理学活性分析
将HEK-293T细胞在含10%的胎牛血清的DMEM培养基37℃、5%CO2条件下培养，将钾通道Kv1.3重组质粒分别用SofastTM的转染试剂盒转染，转染细胞在0.8mg/mL Geneticin培养基上选择性培养。利用全细胞膜片钳用仪器（EPC-10双通道膜片钳放大器HEKA，Elektronik,Lambrecht，Germany），对具有如SEQ ID NO:2～4所示的氨基酸序列的多肽的药理学活性进行测定和分析。实验参数的设置、数据的采集和刺激的施加均通过Pulse软件（Elektronik，Lambrecht，Germany）来控制。仪器的滤波器设置为10kHz(Bessel)，电极阻抗为2～5MΩ，在电极与细胞膜之间形成高阻(1～5GΩ)封接后，进行快电容自动补偿(c-fast)，稍加负压破膜后，进行慢电容自动补偿(c-slow)，在-70mV的钳制电位下，从-60mV起给予10mV步幅递增、80ms步宽的去极化脉冲刺激至+50mV，观察电流情况，将多肽通过MPS-2(INBIO Inc，Wuhan，China)灌注系统实现精确灌注。将3种活性多肽溶解后，经DAD给药系统(ALA)喷射给药，给药管尖端距记录细胞100μm左右。具有如SEQ ID NO:2～4所示的氨基酸序列的多肽与野生型BmKTX多肽阻断靶标钾离子通道Kv1.3电流的浓度依赖关系如图5所示。由图5计算获得抑制电流半数的多肽药理学活性（IC50值），结果表明：BmKTX野生型多肽IC50为0.91nM、具有如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽只在第19位含有1个酸性氨基酸残基的，其IC50为0.015±0.004nM；具有如SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的多肽只在第33位含有1个酸性氨基酸残基，其IC50为0.375nM、具有如SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的多肽在第6位和第33位含有两个酸性氨基酸残基，其IC50为7.3±0.85nM。表明本发明提供的具有如SEQ ID NO:2～4所示的氨基酸序列的多肽可有效作用靶标钾离子通道Kv1.3，但活性具有较大差异。这些结果说明了多肽中差异的酸性氨基酸残基分布导致了多肽活性的显著差异性。
实施例6：具有如SEQ ID NO:2～4所示的氨基酸序列的多肽识别靶标钾离子通道Kv1.3活性验证
为了进一步证明本发明提供的多肽与靶标钾离子通道“人工控制识别”的可靠性。采用经典氨基酸残基定点突变技术，对野生型BmKTX多肽和本发明提供的具有如SEQ IDNO:2～4所示的氨基酸序列的多肽通过氨基酸替换的方式设计了一系列多肽突变体，各突变体的命名如表2所示。
表2用于测试的多肽突变体序列
注：方框表示发生突变的氨基酸
运用利用全细胞膜片钳用仪器检测表2中所列举的多肽的药理学活性，检测结果如表3所示，为了更直观的观察检测结果，将各多肽及其突变体IC50(mut)/IC50(wt)值绘制成柱形图，如图6所示。
表3本发明提供的多肽及其突变体对靶标离子通道Kv1.3的药理学活性
表3中n代表样本数，IC50(mut)/IC50(wt)代表以突变体多肽药理学活性除以野生型多肽药理学活性的数值。由表3和图6可见，本发明提供的具有SEQ ID NO：2～4所示的多肽对靶标离子通道Kv1.3的药理学活性要显著高于其突变体，说明本发明通过运用蛋白质-蛋白质相互作用的“控制识别”新分子工程技术，精巧地调节BmKTX多肽中酸性残基的分布特点，成功的改变了多肽对靶标离子通道Kv1.3的抑制活性。
为了便于理解本发明“人工控制识别”新技术在多肽药物设计中的合理性，通过蛋白质-蛋白质相互作用计算机模拟技术分别计算模拟了野生型BmKTX模板多肽和本发明提供的具有SEQ ID NO：2～4所示氨基酸序列的多肽与靶标钾离子通道Kv1.3的相互作用。模拟结果如图7所示。从图7中不同多肽与靶标钾离子通道Kv1.3复合物结构可见，野生型BmKTX模板多肽及具有SEQ ID NO：2～4所示氨基酸序列的多肽使用了截然不同的多肽结构区域识别靶标钾离子通道Kv1.3：
由于第33位多肽酸性残基-Asp与靶标钾离子通道Kv1.3孔区大量酸性残基的“静电排斥”作用，野生型BmKTX模板多肽主要使用以第23位氨基酸残基-Arg（为堵塞钾离子通道孔的氨基酸残基）和第24为氨基酸残基-Phe中心附近结构区域的alpha螺旋和beta折叠间的转角结构区域为活性表面识别钾离子通道Kv1.3；
本发明提供的具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽主要使用以第23位氨基酸残基-Arg、第26位氨基酸残基-Lys（为堵塞钾离子通道孔的氨基酸残基）和第29位氨基酸残基-Asn附近反向平行的beta折叠结构区域为活性表面识别钾离子通道Kv1.3；
本发明提供的具有SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的多肽主要使用以第8位氨基酸残基-Lys（为堵塞钾离子通道孔的氨基酸残基）、第9位氨基酸残基-His和第15位氨基酸残基-Lys等alpha螺旋的前半部分结构区域为活性表面识别钾离子通道Kv1.3，该多肽中的alpha螺旋在钾离子通道Kv1.3上方呈“竖立”状态；
由于第6位酸性氨基酸残基-Asp与靶标钾离子通道Kv1.3孔区大量酸性残基的“静电排斥”作用，本发明提供的具有SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的多肽主要使用以第15位氨基酸残基-Lys、第18位氨基酸残基-Lys、第19位氨基酸-Lys等alpha螺旋的后半部分结构区域为活性表面识别钾离子通道Kv1.3，该多肽alpha螺旋在钾离子通道Kv1.3上方呈“水平”状态。
可见，同野生型BmKTX模板多肽相比，本发明提供的具有SEQ ID NO：2～4所示氨基酸序列的3个新型多肽在靶标钾离子通道Kv1.3孔区上方发生了相对“结构翻转”，采用了截然不同的多肽空间结构区域作用靶标钾离子通道Kv1.3。这些结果再次表明了通过“人工控制识别”新技术设计的3个多肽采用了与野生型BmKTX多肽互不相同的分子机制作用靶标钾离子通道Kv1.3。
实施例7：具有如SEQ ID NO:2～4所示的氨基酸序列的多肽选择性作用靶标钾离子通道Kv1.3活性验证
基于具有如SEQ ID NO:2～4所示的氨基酸序列的多肽对靶标钾离子通道Kv1.3的药理学活性，本发明进一步调查它对不同类型钾离子通道的活性。作为先导多肽药物，一般来说它们不但需要具有良好的药理学活性，而且也要具有良好的选择性，从而具有更低的毒副作用。因此，本发明同样测试了本发明提供的具有如SEQ ID NO:2～4所示的氨基酸序列的多肽对常见的几种钾离子通道的药理学活性。
取实施例1～3制备的具有如SEQ ID NO:2～4所示的氨基酸序列的多肽分别配制成浓度为1微摩尔/升的溶液，用于检测对对钾离子通道Kv1.1、Kv1.2、Kv7.1、Kv11.1、Kca2.2、Kca2.3、Kca3.1的活性以正常激活条件下的电流为阴性对照。检测结果如图8示。由图8可知，本发明提供的具有如SEQ ID NO:2～4所示的氨基酸序列的多肽对钾离子通道Kv1.1、Kv1.2、Kv7.1、Kv11.1、Kca2.2、Kca2.3、Kca3.1等几乎没有药理学活性，不能阻断它们的钾离子电流。这些试验数据说明了本发明提供的具有如SEQ ID NO:2～4所示的氨基酸序列的多肽都能够选择性作用靶标钾离子通道Kv1.3。这种高药理学活性和高选择性使它具有成为治疗靶标钾离子通道Kv1.3相关疾病的先导药物。
实施例8：具有如SEQ ID NO:2～4所示的氨基酸序列的多肽治疗多发性硬化症的药效实验
实验动物：选取近交系雌性Wistar大鼠（6-8周龄,体重150±10g），豚鼠（300g～400g购自武汉大学实验动物中心）。
主要试剂：福氏完全佐剂(Gibcol/BRL)，卡介苗、百日咳疫苗(购自上海生物制品所)，豚鼠MBP(购自Sigma)。
全脊髓匀浆-福氏完全佐剂混合乳剂(GPSCH-CFA)的配制：将豚鼠处死后，迅速取出脊髓，用超声破碎仪(Sonics&Materials Inc,America)制成50%的PBS匀浆，与等量的福氏完全佐剂(卡介苗10mg/mL)混合，用注射器抽打至油包水乳剂。
诱导Wistar大鼠EAE模型：Wistar大鼠双后腿足垫皮内注射0.4mL GPSCH-CFA乳剂，或同时皮内注射约1×1010百日咳疫苗。每日称重，观察神经症状。饲养2周即出现实验性自身免疫性脑脊髓炎。
将实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)大鼠随机分为三组：正常对照组（阴性对照组为健康大鼠）、模型对照组（模型鼠，给予生理盐水）、给药组（模型鼠给予本发明提供的具有如SEQ ID NO:2～4所示的氨基酸序列的多肽，每组10只。给药组将具有如SEQ ID NO:2～4所示的氨基酸序列的多肽按100μg·kg-1剂量分别对模型树进行皮下注射，每天上午1次，正常对照组和模型对照组皮下注射等量生理盐水，连续给药。给药14天后，观察大鼠患实验性自身免疫性脑脊髓炎状况，根据大鼠状况评分，记录每只动物最高临床评分，取它们的均值为平均临床评分，结果见表4。
评分标准为:无任何临床症状，0分；尾部张力消失，可见轻度步态笨拙，1分；双后肢无力，被动翻身后可以恢复，2分；双后肢瘫痪，被动翻身后不能恢复，3分；四肢瘫痪伴尿、便失禁，4分；濒死状态或死亡，5分。
表4EAE模型中各实验组大鼠的评分
实验结果表明：在没有药物治疗情况下，模型对照组得分最高（2.97±0.44）；给予本发明提供的具有如SEQ ID NO:2～4所示的氨基酸序列的多肽治疗后，大鼠的症状均得到显著改善，平均临床评分依次为1.32±0.38，1.38±0.35和1.52±0.27。由此可见，本发明提供的具有如SEQ ID NO:2～4所示的氨基酸序列的多肽能有效地治疗多发性硬化症。
实施例9：具有如SEQ ID NO:2～4所示的氨基酸序列的多肽治疗类风湿性关节炎的药效实验
选取无特定病原体（SPF）级近交系Wistar大鼠（购自武汉大学实验动物中心）40只，♀，体重150±10g，在清洁级环境条件下适应性饲养1周后，以0.2mL/只剂量的降植烷（pristane）在实验组大鼠尾根部皮内注射。饲养2周即出现类风湿性关节炎症状。
将关节炎大鼠随机分为：正常对照组（阴性对照组为健康大鼠）、模型阴性对照组（模型鼠给予生理盐水）、模型阳性对照组（模型鼠给予氨甲喋呤）、给药组（模型鼠给予本发明提供的具有如SEQ ID NO:2～4所示的氨基酸序列的多肽），每组10只。给药组按100μg·kg-1剂量皮下注射，每天上午1次，连续给药；正常对照组和模型阴性对照组皮下注射等量生理盐水；模型阳性对照组按1.75mg·kg-1剂量皮下注射氨甲喋呤(MTX)，每天1次，连续给药。
给药21天后，观察大鼠患关节炎状况。观察大鼠患类风湿性关节炎状况，根据大鼠状况评分，记录每只动物最高临床评分，取它们的均值为平均临床评分，结果见表5。
评分标准为:大鼠一个关节红肿，1分；大鼠二个关节红肿，2分；大鼠各个关节红肿，3分；大鼠整个肢体严重关节炎，4分。
表5各实验组大鼠的关节炎评分
从实验第8天起，每周测1次大鼠后足跖容积并记录，并根据足跖在造模前后容积之差计算肿胀度(mL)，连续观察28天，结果见表6。
表6各实验组大鼠的足跖肿胀度
由表5可知，在没有药物治疗情况下，模型阴性对照组关节评分最高（3.72±0.74）；给予本发明提供的具有如SEQ ID NO:2～4所示的氨基酸序列的多肽治疗后，大鼠的症状得到显著改善，评分依次为1.76±0.49，1.85±0.35和1.98±0.42，与氨甲喋呤治疗组结果相近（1.72±0.65）。表6测量各实验组大鼠的足跖肿胀度的结果显示，给予本发明提供的具有如SEQ ID NO:2～4所示的氨基酸序列的多肽的大鼠足跖肿胀度与模型阴性对照组相比显著降低。结果表明，本发明提供的具有如SEQ ID NO:2～4所示的氨基酸序列的多肽能有效地治疗类风湿性关节炎。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (23)
1.一种多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示。
2.如权利要求1所述多肽作为钾离子通道Kv1.3阻断剂的应用。
3.如权利要求1所述的多肽在制备治疗或预防迟发性超敏反应相关疾病、血管内膜增生相关的心血管疾病或自身免疫性疾病的药物中的应用。
4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述迟发性超敏反应相关疾病包括器官移植免疫排斥、接触性皮炎或肉芽肿病。
5.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述的血管内膜增生相关的心血管疾病为动脉粥样硬化、急性冠状动脉综合症或血管成形术后再狭窄。
6.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述自身免疫性疾病为多发性硬化症、类风湿性关节炎、I型糖尿病、自身免疫性肝炎、红斑狼疮或银屑病。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述药物包括所述多肽及药学上可接受的辅料。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述药物为口服制剂或注射制剂。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述口服制剂为片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、汤剂、膏剂、露剂、口服液剂、滴丸剂、糖浆剂、酊剂、散剂或冲剂。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述注射制剂为粉针剂或注射液。
11.编码如权利要求1所述多肽的DNA分子。
12.根据权利要求11所述的DNA分子，其特征在于，编码具有如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列多肽的DNA分子具有如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列。
13.根据权利要求11所述的DNA分子，其特征在于，编码具有如SEQ ID NO:3所示氨基酸序列多肽的DNA分子具有如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。
14.根据权利要求11所述的DNA分子，其特征在于，编码具有如SEQ ID NO:4所示氨基酸序列多肽的DNA分子具有如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列。
15.一种包括如权利要求11～14任一项所述DNA分子的重组载体。
16.根据权利要求14所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体中的表达载体选自pGEX系列、pET系列、pQE系列或pMAL系列中的任一种。
17.一种包括如权利要求15或16所述重组载体的转化体。
18.根据权利要求17所述的转化体，其特征在于，所述转化体的宿主细胞为大肠杆菌、酵母菌或真核细胞表达体系。
19.如权利要求1所述多肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：将编码所述多肽的DNA分子克隆到表达载体获得重组载体；
步骤2：将所述重组载体转化入宿主细胞，获得转化体；
步骤3：培养转化体，经诱导表达、分离、纯化，即得。
20.根据权利要求19所述的制备方法，其特征在于，编码所述多肽的DNA分子具有SEQID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列。
21.根据权利要求19或20所述的制备方法，其特征在于，克隆所述如SEQ ID NO:5所示核苷酸序列的DNA分子采用的引物序列如SEQ ID NO:8～11所示。
22.根据权利要求19或20所述的制备方法，其特征在于，克隆所述如SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的DNA分子采用的引物序列如SEQ ID NO:12～15所示。
23.根据权利要求19或20所述的制备方法，其特征在于，克隆所述如SEQ ID NO:7所示核苷酸序列的DNA分子采用的引物序列如SEQ ID NO:16～19所示。
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