DE69626789T2

DE69626789T2 - Isolierte und verkürzte nukleinsäuremoleküle kodierend für gage-tumorabstossungsantigen

Info

Publication number: DE69626789T2
Application number: DE69626789T
Authority: DE
Inventors: Pierre Van Der Bruggen; Benoit Van Den Eynde; Olivier Debacker; Thierry Boon-Falleur
Original assignee: Ludwig Institute for Cancer Research Ltd; Ludwig Institute for Cancer Research New York
Current assignee: Ludwig Institute for Cancer Research Ltd; Ludwig Institute for Cancer Research New York
Priority date: 1995-01-10
Filing date: 1996-01-11
Publication date: 2004-03-04
Anticipated expiration: 2016-01-12
Also published as: JP3180123B2; DE69626789D1; CN1176647A; CA2210318A1; DK0804467T3; ES2192602T3; ATE234858T1; AU708840B2; WO1996021673A1; HK1008228A1; EP0804467A1; US5858689A; EP0804467A4; CN1110503C; NZ302821A; PT804467E; AU4897096A; EP0804467B1; JPH10511401A

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft ein Nukleinsäuremolekül, welches für einen Tumorabstoßungsantigenvorläufer codiert. Insbesondere betrifft die Erfindung Gene, deren Tumorabstoßungsartigenvorläufer inter alia in wenigstens ein Tumorabstoßungsantigen prozessiert wird, das durch HLA-Cw6-Moleküle präsentiert wird. Die fraglichen Gene scheinen nicht mit anderen bekannten Tumorabstoßungsantigenvorläufer-codierenden Sequenzen verwandt zu sein. Die Erfindung betrifft auch Peptide, die durch die HLA-Cw6-Moleküle präsentiert werden und deren Verwendungen. Ebenso ein Teil der Erfindung sind Peptide, die durch HLA-A29-Moleküle präsentiert werden und deren Verwendungen.
Hintergrund und Stand der Technik
Das Verfahren, mit dem das menschliche Immunsystem fremde oder auswärtige Materialien erkennt und auf sie reagiert, ist kompliziert. Ein wichtige Facette dieses Systems ist die T-Lymphocyte oder "T-Zell"-Antwort. Diese Antwort erfordert, daß T-Zellen Komplexe aus Zelloberflächenmolekülen, die humane Leukozytenantigene ("HLA"), oder Haupthistokompatibilitätskomplexe ("MHCs") genannt werden, und Peptide erkennt und mit ihnen interagiert. Diese Peptide sind von größeren Molekülen abgeleitet, die durch die Zellen prozessiert werden, welche ebenso das HLA/MHC-Molekül präsentieren. Siehe in diesem Bezug Male et al., Advanced Immunology (J. P. Lipincott Company, 1987), insbesondere Kapitel 6–10. Die Interaktion von T- Zellen und HLA/Peptid-Komplexen ist begrenzt und erfordert eine T-Zelle, die spezifisch für eine bestimmte Kombination eines HLA-Moleküls und eines Peptids ist. Wenn eine spezifische T-Zelle nicht vorhanden ist, gibt es keine T-Zell-Antwort, sogar wenn dessen Partnerkomplex vorhanden ist. Auf ähnliche Weise gibt es keine Antwort, wenn der spezifische Komplex abwesend ist, aber die T-Zelle vorhanden ist. Dieser Mechanismus ist in die Antwort des Immunsystems auf fremde Materialien in Autoimmunpathologien und in Antworten auf zelluläre Abnormalitäten involviert. Viel Arbeit war gerichtet auf die Mechanismen, durch die Proteine in HLA- bindende Peptide prozessiert werden. Siehe in diesem Zusammenhang Barinaga, Science 257: 880 (1992); Fremont et al., Science 257: 919 (1992), Matsumura et al., Science 257: 927 (1992); Latron et al., Science 257: 964 (1992). Siehe ebenfalls Engelhard, Ann. Rev. Immunol. 12: 181–207 (1994).
Der Mechanismus, durch den T-Zellen zelluläre Abnormalitäten erkennen, ist ebenso in Krebs involviert. Zum Bespiel in der PCT-Anmeldung US 5 925 729 , eingereicht Mai 22, 1992, publiziert am 26. November 1992, ist eine Genfamilie offenbart, welche in Peptide prozessiert werden, welche darauf wiederum auf Zelloberflächen exprimiert werden, welche zu der Lysis der Tumorzellen durch spezifische CTLs zytolytische T-Lymphozyten, oder "CTLs" hiernach, führen können. von den Genen wird gesagt, daß sie für "Tumorabstoßungsantigenvorläufer" oder "TRAP"-Moleküle kodieren und die Peptide, die davon abgeleitet sind, werden "Tumorabstoßungsantigene" oder "TRAs" genannt. Siehe Traversari et al., Immunogenetics 35: 145 (1992); van der Bruggen et al., Science 254 1643 (1991), für weitere Informationen über diese Genfamilie. Siehe auch U.S. Patent-Anmeldungsseriennummer 807 043, eingereicht am 12. Dezember 1991, nun U.S. Patent Nr. 5 342 774.
In der U.S. Patentanmeldung Seriennummer 938 334, nun U.S. Patent Nr. 5 405 940 ist erklärt, daß das MAGE-1-Gen für einen Tumorabstoßungsantigenvorläufer codiert, welcher in Nonapeptide prozessiert wird, welcher durch das HLA-A1-Molekül präsentiert wird.
Diese Referenz lehrt, daß, gegeben die bekannte Spezifität von bestimmten Peptiden für bestimmte HLA-Moleküle, man erwarten sollte, daß ein bestimmtes Peptid an ein HLA-Molekül bindet, aber nicht an andere. Dies ist wichtig, da unterschiedliche Individuen unterschiedliche HLA-Phenotypen besitzen. Als ein Ergebnis hieraus, während die Identifizierung eines bestimmten Peptids als ein Partner für ein spezifisches HLA-Molekül diagnostische und therapeutische Auswirkungen hat, sind diese nur relevant für Individuen mit dem bestimmten HLA-Phenotyp. Es gibt einen Bedarf für weitere Arbeit auf dem Gebiet, da zelluläre Abnormalitäten nicht auf einen bestimmten HLA-Phenotyp begrenzt sind und gezielte Therapie einiges Wissen über den Phenotyp der abnormalen Zellen, um die es geht, erfordert.
In U.S. Patent Nummer US 5 629 166 , eingereicht am 22. Januar 1993, ist die Tatsache, daß MAGE-1-Expressionsprodukt in ein zweiten TR prozessiert wird, offenbart. Dieses zweite TRA wird durch HLA-C-Klon-10-Moleküle präsentiert. Die Offenbarung zeigt, daß ein gegebenes TRAP eine Vielzahl von TRAB ergeben kann.
U.S. Patent Nummer 5 487 974, eingereicht Dezember 22, 1992, lehrt, daß Tyrosinase, ein Molekül, welches durch einige normale Zellen produziert wird (z. B. Melanozyten) in Tumorzellen prozessiert wird, um Peptide zu ergeben, die durch HLA-A2-Moleküle präsentiert werden.
In U.S. Patent Nummer US 5 620 886 , eingereicht März 18, 1993, wird ein zweites TRA gelehrt, das nicht von Tyrosinase abgeleitet ist, was durch HLA-A2-Moleküle präsentiert wird. Das TRA ist abgeleitet von einem TRAP, aber wird durch ein Nicht-MAGE-Gen codiert. Diese Offenbarung zeigt, daß ein bestimmtes HLA-Molekül TRAB präsentieren kann, die von unterschiedlichen Quellen abstammen.
In U.S. Patent Nummer US 5 571 711 , eingereicht Juni 17, 1993, wird ein unverwandter Tumorabstoßungsantigenvorläufer, der sogenannte "BAGE"-Vorläufer beschrieben Der BAGE-Vorläufer ist nicht mit der MAGE-Familie verwandt.
Die Arbeit, die durch die Publikationen, Patente und Patentanmeldungen, die oben zitiert sind, präsentiert ist, beschäftigt sich zum großen Teil mit der MAGE-Genfamilie, und dem unverwandten BAGE-Gen. Es wurde jedoch nicht gefunden, daß zusätzliche Tumorabstoßungsantigenvorläufer durch Zellen exprimiert werden. Diese Tumorabstoßungsantigenvorläufer werden "GAGE"-Tumorabstoßungsantigenvorläufer genannt. Sie zeigen keine Homologie mit weder der MAGE-Genfamilie noch mit dem BAGE-Gen. Daher betrifft die vorliegende Erfindung Gene, die für solche TRASs codieren, die Tumorabstoßungsantigenvorläufer selbst, ebenso wie die Anwendungen von beidem.
Daher ist ein weiterer Gegenstand der Erfindung ein isoliertes Peptid ausgewählt aus
Diese Peptide binden an HLA-A29-Moleküle und/oder werden prozessiert zu Peptiden, welche an HLA-A29-Moleküle binden.
Die Erfindung wird weiter ausgeführt in der Offenbarung, welche folgt.
Kurze Beschreibung der Zeichnung
1 führt Lysisstudien unter Verwendung des CTL-Klons 76/6 aus.
2 zeigt Tumornekrosisfaktor-("TNF")-Freisetzungs-Assays, erhalten mit verschiedenen Transfektanten und Kontrollen.
3 vergleicht Lysis, induziert durch zytolytische T-Lymphozyten von Klon CTL 76/6. Peptide mitverschiedener Länge wurden getestet, einschließlich SEQ ID NR.: 4.
4 stellt ein cDNA-Alignment der sechs GAGE-Gene, die hierin diskutiert sind, dar. In der Figur werden identische Bereiche durch Kästchen umgeben. Translationsinitiierungsorte und Stop-Codons sind ebenso angezeigt. Primer, die bei der Polymerase-Kettenreaktion, wie in den Beispielen beschrieben, verwendet werden, sind durch Pfeile bezeichnet.
5 führt das Alignment der abgeleiteten Aminosäuresequenzen für die Mitglieder der GAGE-Familie aus. Identische Bereiche sind durch Kästchen angezeigt, und das antigene Peptid von SEQ ID NR.: 4 ist gezeigt.
6 zeigt die Ergebnisse, die erhalten werden, wenn jedes der GAGE cDNAs in COS-Zellen transfiziert wird, gemeinsam mit HLA-Cw6 cDNA. Vierundzwanzig Stunden später wurden Proben von CTL 76/6 hinzugefügt und die TNF-Freisetzung wurde nach vierundzwanzig Stunden gemessen.
9 vergleicht die Stimulierung von CTL 22/23 durch COS-7-Zellen, transfiziert mit HLA-A29 cDNA, einer MAGE-, BAGE- oder GAGE-Sequenz, wie gezeigt. Kontrollwerte werden durch MZ2-MEL.43 und COS-Zellen als Stimulatoren zur Verfügung gestellt.
8 stellt Ergebnisse dar, die erhalten werden durch ⁵¹Cr-Freisetzungsstudien, unter Verwendung unterschiedlicher Peptide einschließlich SEQ ID NR.: 22 und verschiedenen Peptiden, die davon abgeleitet sind.
Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Beispiel 1
Eine Melanomzellinie MZ2-MEL wurde etabliert aus Melanomzellen, entnommen von einem Patent MZ2, unter Verwendung von Standardverfahren. Diese Zellinie ist beschrieben, z. B. in PCT-Anmeldung US 5 425 729 , eingereicht Mai 22, 1992, publiziert November 26, 1992, und die hiermit per Referenz in ihrer Gesamtheit mit aufgenommen ist. Als die Zellinie etabliert war, wurde eine Probe daraus bestrahlt, um sie so nicht-proliferativ zu machen. Diese bestrahlten Zellen wurden dann verwendet, um zytolytische T-Zellklone ("CTLs"), die spezifisch dafür sind, zu isolieren.
Eine Probe aus periphären mononuklearen Blutzellen ("PBMCs") wurde dem Patent MZ2 entnommen und mit den bestrahlten Melanomzellen in Kontakt gebracht. Die Mischung wurde hinsichtlich der Lysis der Melanomzellen beobachtet, welche anzeigte, daß CTLs, spezifisch für einen Komplex von Peptid und HLA-Molekül, präsentiert durch die Melanomzellen in der Probe vorhanden waren.
Der Lysis-Assay, der verwendet wurde, war ein Chromfreisetzungs-Assay, folgend Herin et al., Int J. Cancer 39: 390–396 (1987), dessen Offenbarung hiermit per Referenz mit aufgenommen ist. Der Assay ist jedoch hierin beschrieben. Die Ziel-Melanomzellen wurden in vitro wachsen gelassen und dann bis zu 10⁷ Zellen/ml in DMEM, angereichert mit 10 mM HEPES und 30% FCS resuspendiert und 45 Minuten bei 37°C mit 200 μCi/ml Na(⁵¹Cr)O₄ inkubiert. Markierte Zellen wurden dreimal mit DMEM gewaschen, angereichert mit 10 mM Hepes. Diese wurden dann in DMEM, angereichert mit 10 mM Hepes und 10% FCS resuspendiert, nachdem 100 μ1 Aliquots, enthaltend 10³ Zellen in 96 Loch-Mikroplatten verteilt wurden. Proben von PBLs wurden in 100 μ1 desselben Mediums hinzugefügt, und die Assays wurden doppelt ausgeführt. Die Platten wurden 4 Minuten bei 100 g zentrifugiert und für vier Stunden bei 37°C in einer 8%igen CO₂ Atmosphäre inkubiert.
Die Platten wurden erneut zentrifugiert und 100 μl Aliquots des Überstandes wurden gesammelt und gezählt. Die Prozentzahl der ⁵¹Cr-Freisetzung wurde wie folgt errechnet:
wo ER beobachtet wurde, experimentell ⁵¹Cr-Freisetzung, SR ist die spontane Freisetzung, gemessen durch Inkubieren von 10³ markierten Zellen in 200 μl eines Mediums alleine und MR ist die maximale Freisetzung, erhalten durch Hinzufügen von 100 μl 0,3% Triton X-100 zu den Targetzellen.
Diese mononuklearen Blutproben, welche hohe CTL-Aktivität zeigten, wurden erweitert und über limitierende Verdünnung kloniert und wurden erneut gescreent unter Verwendung desselben Verfahrens. Der CTL-Klon MZ2-CTL 76/6 wurde so isoliert. Der Klon wird hier nach "76/6" genannt.
Dasselbe Verfahren wurde verwendet, um Target K562-Zellen zu testen, ebenso wie die Melanomzellinie. 1 zeigt, daß dieser CTL-Klon die Melanomzellinie erkennt und lysiert, d. h., MZ2-MEL, aber nicht K562. Der Klon wurde dann getestet gegen andere Melanomzellinien und gegen autologe EBV-transformierte B-Zellen auf dieselbe Art und Weise, wie oben beschrieben. 1 zeigt, daß autologe B-Zellen, transformiert durch Epstein Barr Virus ("EBV") nicht lysiert wurden, und daß während MZ2-MEL 3.0 durch CTL-Klon 76/6 lysiert wurde, die Zellinie MZ2-MEL.4F, eine Variante, welche das Antigen F nicht exprimiert, nicht lysiert wurde. Daher scheint der Klon spezifisch für dieses Antigen zu sein.
Die Resultate, die hierüber beschrieben wurden, sind nicht schlüssig in Bezug auf welches HLA-Molekül das TRA präsentiert. Die lysierte Zellinie, d. h., MZ2-MEL, ist bekannt dafür, HLA-A1, HLA-A29, HLA-B37, HLA-B44, HLA-Cw6 und HLA-C Klon 10 zu exprimieren. In Experimenten, über hier nicht berichtet ist, aber welche dem Protokoll dieses Beispieles folgten, wurde eine Sublinie von MZ2-MEL getestet, welche die Expression von HLA-Molekülen A29, B44 und C-Klon 10 verloren hatte. Diese Sublinie wurde lysiert, was so anzeigte, daß das präsentierende Molekül eins von A1, B37 oder Cw6 sein sollte.
Beispiel 2
Weitere Studien wurden ausgeführt um zu bestimmen, ob 76/6 ebenso Tumornekrosisfaktor ("TNF") produzierte, wenn er mit Targetzellen in Kontakt gebracht wurde. Das verwendete Verfahren war das, das durch Traversare et al., Immunogenetics 35: 145–152 (1992) beschrieben wurde, dessen Offenbarung hiermit durch Referenz mit aufgenommen ist. Kurz zusammengefaßt wurden die Proben der CTL-Linie mit den Proben der Targetzellen von Interesse in einem Kulturmedium kombiniert. Nach 24 Stunden wurde der Überstand der Kulturen entfernt und dann auf TNFsensitive WEHI-Zellen getestet. Zellinie MZ2-MEL.43, ein Subklon von der MZ2-MEL-Zellinie, die oben, ebenso wie in den zitierten Referenzen, diskutiert wurde, ergab eine extrem starke Reaktion, und wurde in den folgenden Experimenten verwendet.
Beispiel 3
Die Ergebnisse aus Beispiel 2 zeigten an, daß MZ2-MEL.43 das Targetantigen von Interesse präsentierte. Als solches wurde sie als eine Quelle von Gesamt-mRNA verwendet, um eine cDNA-Bibliothek herzustellen.
Gesamt-RNA wurde aus der Zellinie isoliert. Die mRNA wurde unter Verwendung eines Oligo-dT-Bindekits, gut bekannten Techniken folgend isoliert. Sobald die mRNA gesichert war, wurde sie in cDNA, über reverse Transkription unter Verwendung eines Oligo-dT-Primers enthaltend eine NotI-Site, gefolgt durch Sekundärstrangsynthese, transkribiert. Die cDNA wurde dann auf einen BstXI-Adapter ligiert, verdaut mit NotI, größenfraktioniert durch eine Sephacryl 5–500 HR-Säule und dann kloniert, eindirektional, in die BstXI- und NotI-Sites von pcDNA I/Amp. Der rekombinante Plasmid wurde dann in DHSα E. coli-Bakterien elektroporiert. Eine Gesamtmenge von 1500 Pools von 100 rekombinanten Bakterien wurde in Mikrowells geseedet. Jedes enthielt etwa 100 cDNAs, da annähernd alle Bakterien ein Insert enthielten.
Jeder Pool wurde bis zur Sättigung amplifiziert und Plasmid-DNA wurde durch alkalische Lysis und Kaliumazetat-Präzipitierung ohne Phenolextraktion extrahiert.
Beispiel 4
Folgend auf die Herstellung der Bibliothek, beschrieben in Beispiel 3, wurde die cDNA in eukaryontische Zellen transfiziert. Die Transfektionen, die hierin beschrieben sind, wurden doppelt ausgeführt. Proben der COS-7-Zellen wurden geseedet bei 15.000 Zellen/well in Flachbodengewebekultur-Mikrowells, in Dulbecco's modfiziertem Eagles Medium ("DMEM"), angereichert mit 10% fetalem Kalbserum. Die Zellen wurden über Nacht bei 37°C inkubiert, Medium wurde entfernt und dann durch 50 μl/well DMEM-Medium enthaltend 10 Nu-Serum, 400 μg/ml DEAE-Destran, und 100 μM Chloroquine, plus 100 ng der Plasmide ersetzt. Wie oben angezeigt wurde, etablierten die Lysisstudien nicht, welches HLA-Molekül das Antigen präsentiert. Als ein Ergebnis wurde cDNA für jedes der HLA-Moleküle, welches das Antigen präsentieren könnte (A1, B37, Cw6), separat verwendet, um die Zellen zu co-transfizieren. Spezifisch eins von 28 ng des Gens, das, HLA-A1 codiert, kloniert in pCD-SRα, 50 ng cDNA für HLA-B37 in pcDNA I/Amp oder 75 ng der cDNA für HLA-Cw6 in pcDNA-I-Amp unter Verwendung desselben Protokolls, das für die Transfektion mit der Bibliothek verwendet wurde.
Transfektion wurde in doppelten Wells ausgeführt, aber nur 500 Pools der HLA-Cw6-Transfektanten konnten in einzelnen Wells getestet werden. Folgend auf vier Inkubationsstunden bei 37°C wurde das Medium entfernt und durch 50 μl PBS enthaltend 10% DMSO ersetzt. Dieses Medium wurde nach zwei Minuten entfernt und durch 100 μl DMEM, angereichert mit 10% FCS, ersetzt.
Folgend auf diesen Mediumaustausch wurden COS-Zellen 24–48 Stunden bei 37°C inkubiert. Das Medium wurde dann verworfen und 1000–3000 Zellen des CTL-Klons 76/6 wurden hinzugegeben, in 100 μl Iscove's Medium enthaltend 10% gepooltes humanes Serum, angereichert mit 20–30 U/ml rekombinantem IL-2. Der Überstand wurde nach 24 Stunden entfernt und der TNF-Gehalt wurde in einem Assay auf WEHI-Zellen bestimmt, wie beschrieben durch Traversari et al., Immonogenetics 35: 145–152 (1992), dessen Offenbarung hiermit per Referenz mit einbezogen ist.
Die 1500 Pools transfiziert mit HLA-A1 und die 1500 Pools transfiziert mit HLA-B37 stimulierten TNF-Freisetzung bis zu einer Konzentration von 15– 20 pg/ml, oder 2–6 pg/ml respektive. Die meisten der HLR-Cw6-Transfektanten ergaben 3–20 pg/ml, mit Ausnahme eines Pools, der mehr als 60 pg/ml ergab. Dieser Pool wurde für die weitere Arbeit ausgewählt.
Beispiel 5
Die Bakterien des ausgewählten Pools wurden kloniert und 600 Klone wurde getestet. Plasmid DNA wurde davon extrahiert, in eine neue Probe COS-Zellen auf dieselbe Art und Weise, wie oben beschrieben, transfiziert, und die Zellen wurden erneut hinsichtlich der Stimulierung des CTL-Klons 76/6 getestet. Vierundneunzig positive Klone wurden gefunden. Einer dieser, der cDNA- Klon 2D6 genannt wird, wurde weiterhin getestet. In einem Vergleichstest wurden COS-Zellen mit cDNA-Klon 2D6 und der HLA-Cw6 cDNR, HLA-Cw6 cDNA alleine oder cDNA 2D6 alleine transfiziert. Kontrollzellinien MZ2-MEL F und MZ2-MEL F⁺ wurden ebenso verwendet. TNF-Freisetzung in den CTL-Überstand wurde gemessen durch Testen der TNF-Freisetzung mit WEHI-Zellen, auf die oben Bezug genommen wird. Die Anzahl der überlebenden WEHI-Zellen wurde durch optische Dichte nach der Inkubation der Zellen mit MTT gemessen. 2 zeigt, daß die COS-Zellen, mit HLA-Cw6 und cDNA-2D6 transfiziert worden sind und die Zellinie MZ2-MEL F+ TNF-Freisetzung aus CTL-Klon 76/6 stimulierten, was anzeigte, daß HLA-Cw6 das TRA, um das es geht, präsentiert.
Beispiel 6
Die cDNA 2D6 wurde sequenziert unter Befolgung von Techniken, die in der Technik bekannt sind. Eine Sequenzsuche ergab, daß das Plasmid-Insert keine Homologie zu bekannten Genen oder Proteinen zeigte. SEQUENZ ID Nr: 1 präsentiert cDNA-Nukletid-Information für das identifizierte Gen, das hiernach als "GAGE" bezeichnet wird. Ein putativer Open Reading Frame befindet sich bei den Basen 51–467 des Moleküls. Die ersten zwei Basen dieser Sequenz stammen von dem Vektor, der die cDNA-Sequenz trägt und sind daher nicht selbst Teil der cDNA.
Beispiel 7
Folgend auf das Sequenzieren der cDNA nach Beispiel 6 wurden Experimente ausgeführt, um zu bestimmen, ob Zellen aus normalem Gewebe dieses Gen exprimieren. Um dies zu bestimmen, wurde Northern Blotting auf Gewebe und Tumorzellinien ausgeführt, wie hierunter angezeigt. Die Blotting-Experimente verwendeten cDNA für die vollständige Sequenz von. SEQ ID NR: 1. PCR wurde dann verwendet, um die Ergebnisse zu bestätigen.
Tabelle 1 Expression des GAGE-Gens Normale Gewebe

PHA aktivierte T-Zellen –

CTL-Klon 82/30 –

Leber –

Muskel –

Lunge –

Gehirn –

Niere –

Plazenta –

Herz –

Haut –

Hoden –
Tumorzellinien

Melanom 7/16

Lungenkarzinom 1/6

Sarkom 0/1

Thyroid meldulläres Karzinom 0/1
Tumorproben

Melanom 1/1
Beispiel 8
Detaillierte Analyse von normalen Geweben und Tumoren wurde ausgeführt durch Anwenden der Polymerase-Kettenreaktion ("PCR") und der GAGE-Geninformation, die oben beschrieben ist.
Zunächst wurde Gesamt-RNA aus der bestimmten Probe entnommen, unter Verwendung von Techniken, die in der Technik bekannt sind. Diese wurde verwendet, um cDNA herzustellen. Das zur Herstellung der cDNA verwendete Protokoll beinhaltete Zusammenführen von 4 μl reverse Transkriptasepuffer 5×, 1 μl jedes dNTP, (10 mM), 2 μl Dithiothreitol (100 mM), 2 μl dT-15-Primer (20 μm), 0,5 μl Rnasin (40 units/μl) und 1 μl MOMLV reverse Transkriptase (200 units /μl). Als nächstes wurden 6,5 μl der Template-RNA (1 μg/3,25 μl Wasser, oder 2 μg Gesamt-Template-RNA) hinzugefügt. Das Gesamtvolumen der Mischung betrug 20 μl. Diese wurde vermischt und bei 42°C 60 Minuten lang inkubiert, wonach sie auf Eis abgekühlt wurde. Eine Gesamtmenge von 80 μl Wasser wurde dann hinzugefügt, um eine Gesamtmenge von 100 μl zu ergeben. Diese Mischung wurde bei –20°C gelagert, bis sie bei der PCR verwendet wurde.
Um die PCR auszuführen, wurden die Primer
SEQ ID NRN: 2 und 3, respektive, verwendet. Die Reagenzien enthielten 30,5 μl Wasser, 5 μl PCR-Puffer 10x, 1 μl jedes dNTP (10 μM), 2,5 μl jedes Primers (20 μM), und 0,5 μl polymerisierenden Enzyms Dynazyms (2 Units/μl). Das Gesamtvolumen betrug 45 μl. Eine Gesamtmenge von 5 μl cDNA wurde hinzugefügt (dies entsprach 100 ng Gesamt-RNA). Die Mischung wurde kombiniert und mit einem Tropfen Mineralöl überschichtet. Die Mischung wurde auf einen Thermocycler-Block übertragen, vorerhitzt auf 94°C und die Amplifizierung wurde 30 Zyklen lang ausgeführt, wobei jeder Zyklus aus dem folgenden bestand:

erste Denaturierung:	94°C, 4 Min.
Denaturierung:	94°C, 1 Min.
Annealing:	55°C, 2 Min.
Extension:	72°C, 3 Min.
Finalextension:	72°C, 15 Min.

Folgend auf das Zyklieren wurden 10 μl Aliquots auf einem 1,5%gen Agarose-Gel laufen gelassen, gefärbt mit Ethidium Bromid.
Die unter Verwendung der Primer, die oben ausgeführt sind, amplifizierte cDNA ergab ein 280-Basenpaarfragment. Es gibt keine Amplifizierung von kontaminierender genomischer DNA, wenn sie vorhanden ist.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt, welche folgt. Sie bestätigen, daß das einzige normale Gewebe, welches GAGE exprimiert, Hoden ist, während eine Anzahl von Tumoren, einschließlich Melanom, Lunge, Brust, Larynx, Pharynx, Sarkom, testikuläres Seminom, Blase und Dickdarm das Gen exprimieren. Daher kann jeder dieser Tumore hinsichtlich der Expression des GAGE-Gens experimentell untersucht werden.

Tabelle 2 RT-PCR-Analyse der Expression des GAGE-Gens NORMALE GEWEBE

Herz	–
Gehirn	–
Leber	–
Lunge	–
Niere	–
Milz	–
Lymphozyten	–
Knochenmark	–
Haut	–
Naevus	–
Melanozyten	–
Fibroblasten	–
Prostata	–
Hoden	+
Eierstock	–
Brust	–
Nebennieren	–
Muskel	–
Plazenta	–
Nabelschnur	–

TUMORE
Beispiel 9
Die Identifizierung des Nukleinsäuremoleküls, auf das in den vorherigen Beispielen Bezug genommen wurde führte zu weiterer Arbeit, die sich auf die Bestimmung der Tumorabstoßungsantigene richtete, die durch HLA-Cw6-Moleküle präsentiert werden und die von dem GAGE-Gen abgeleitet sind.
Die vollständige cDNA von GAGE im Expressionsvektor pcDNA/Rmp wurde mit Restriktions-Endonukleasen NotI und SpHI und dann mit Exonuklease III folgend den Anweisungen des Herstellers (Erase-a-base System, Promega) verdaut. Diese Behandlung ergab eine Serie von progessiven Deletionen, beginnend an dem 3'-Ende.
Diese Deletionsprodukte wurden zurück in pcDNAI/AMP ligiert und dann in den E. Coli-Strang DHSalpha'IQ elektroporiert, unter Verwendung gutbekannter Techniken. Die Transformanten wurden mit Ampicillin (50 Mikrogramm/ml) ausgewählt.
Plasmid-DNA wurde aus jedem rekombinanten Klon extrahiert und wurde dann in COS-7-Zellen transfiziert, gemeinsam mit einem Vektor, welcher für HLA-Cw6 kodierte. Die verwendeten Protokolle folgten den Protokollen, die oben beschrieben wurden.
Die Transfektanten wurden dann in dem TNF-Freisetzungs-Assay getestet. Dies erlaubte die Trennung von positivem und negativem Klonen. Alle negative Klone zeigten eine Deletion der gesamten GRGE-Sequenz. Der kleinste positive Klon enthielt die ersten 170 Nukleotide von SEQ ID NR: 1. Die Analyse dieser Sequenz, siehe oben, zeigt, daß der Open-Reading-Frame bei Nukleotid 51 beginnt. Daher enthält dieses Fragment eine Sequenz, welche für die ersten 40 Aminosäuren des GAGE TRAP codiert.
Beispiel 10
Zusätzliche Beispiele wurden dann ausgeführt, um die Region genauer zu bestimmen, die für das TRA-Peptid codiert. Polymerase Kettenreaktion-("PCR")-Amplifizierung wurde verwendet, um dieses zu tun.
Zwei Primer wurden synthetisiert. Der erste Primer war ein 22-mer, der komplementär zu einer Sequenz innerhalb des Plasmid-Vektors pcDNAI/Rmp ist, die strangaufwärts der BamHI-Site angeordnet ist. Der zweite Primer war ein 29-mer, der an dem 3'-Ende die Nukleotide 10- 119 der SEQ ID NR: 1 enthielt und an dem 5'-Ende eine Extension von 11 Nukleotiden, die eine XbaI-Restriktions-Site enthielten, enthielt.
Folgend auf die Amplifizierung wurde das PRC-Produkt durch BamHI und XbaI verdaut und in die BamHI-XbaI-Sites von Plasmid pcDNA-3 kloniert. Die rekombinanten Kolonien wurden co-transfiziert in COS-7-Zellen mit cDNA, die für HLA-Cw6 codierte, in Übereinstimmung mit Beispiel 4, und ein TNF-Freisetzungs-Assay, ebenso wie oben beschrieben, wurde ausgeführt, unter Verwendung von CTL 76/6.
TNF-Freisetzung wurde beobachtet, was anzeigte, daß das "Minigen" in ein TRA prozessiert wurde. Das Minigen, d. h., Nukleotide 1–119 von SEQ ID NR: 1, dessen codierende Region von Nukleotid 51 bis Nukleotid 119 läuft, codierte für die ersten 23 Aminosäuren der cDNA von SEQ ID NR: 1. Diese Information diente als die Basis für den nächsten Satz Experimente.
Beispiel 11
Zwei Peptide wurden synthetisiert, basierend auf den ersten 23 Aminosäuren von SEQ ID NR: 1. Diese waren:
Jedes Peptid wurde in COS-7-Zellen gepulst, die vorher mit HLA-Cw6 cDNA transfiziert wurden und mit CTL 76/6 kombiniert, um zu bestimmen, ob eine TNF-Freisetzung induziert werden würde. Peptide (20 μg/ml) wurden zu COS-7-Zellen hinzugefügt, welche mit der HLA-Cw6 cDNA vierundzwanzig Stunden vorher transfiziert worden sind. Nach der Inkubation bei 37°C für 90 Minuten wurde das Medium verworfen und 3000 CTLs wurden in 100 Mikroliter Medium hinzugefügt, enthaltend 25 Units/ml IL-2. Achtzehn Stunden später wurde der TNF-Gehalt des Überstandes über die Bestimmung der Toxizität auf WEHI-164-13-Zellen getestet. Das zweite Peptid (SEQ ID NR: 13) wurde gefunden, über 30 pg/ml TNF zu induzieren, während das erste Peptid (SEQ ID NR: 12) gefunden wurde, weniger als 10 pg/ml TNF zu induzieren. Das zweite Peptid wurde für die weiteren Experimente verwendet.
Beispiel 12
Verschiedene Peptide, basierend auf SEQ ID NR: 13 wurden synthetisiert und getestet, von denen einige hierunter angegeben sind. Um diese Tests auszuführen, wurden ⁵¹Cr-markierte LB33-EVB-Zellen, welche HLA-Cw6-positiv sind, mit einem der folgenden Peptide inkubiert:
Die Peptid-Konzentration variierte, wie angezeigt in 3, und das Verhältnis von CTL : LB33-EBV ("Effektor : Targetverhältnis"), war 10 : 1. Die ⁵¹Cr-Freisetzung wurde bestimmt nach vier Stunden Inkubierung bei 37°C. Die Level der Lysis für positive ("F⁺", MZ2-Me1.3.1), und negative ("F"; MZ2-MEL.2.2.5) Kontrollzellen sind in 3 angegeben.
Es wurde relativ überraschenderweise gefunden, daß der Octamer von SEQ ID NR: 4 das beste Peptid war, und schien das Tumorabstoßungsantigen zu sein. Dies ist das erste Mal, wo berichtet wird, daß ein Octamer in die Präsentation durch ein humanes MHC-Molekül involviert ist. Es gibt einige Präzedenzfälle für ein murines System, wie berichtet durch Engelhard, supra, bei 199, für H-2K^b- und H- 2K^K-Moleküle. Die Nonamere von SEQ ID NR: 5 und SEQ ID NR: 6 induzierten ebenso CTL-Lysierung, jedoch in einem geringeren Ausmaß als das Octamer von SEQ ID NR: 4.
In Ergebnissen, die hier nicht angegeben sind, wurde ein zweites CTL getestet (CTL 82/31). Von diesem CTL war bekannt, daß es Zellen lysiert, die MZ2-F präsentieren. Es lysierte auch HLA-Cw6-positive Zellen, folgend auf das Pulsen mit dem Peptid von SEQ ID NR: 4.
Beispiel 13
Um herauszufinden, ob die GAGE DNA, die oben ausgeführt ist, einzigartig ist, wurde eine aus RNA aus MZ2-MEL.43 angelegte cDNA-Bibliothek (die gleiche Bibliothek, die beim Klonieren von GAGE verwendet wurde) mit einer Sonde hybridisiert, die von der GAGE cDNA abgeleitet ist. Die Sonde war ein PCR-Fragment mit einer Länge von 308 Basenpaaren zwischen den Positionen 20, und 328 von SEQ ID NR: 1. 20 positive cDNAs wurden erhalten. Sechs von denen wurden vollständig sequenziert. Sie waren alle stark verwandt mit der GAGE-Sequenz, aber waren geringfügig, verschieden von ihr. Zwei der sechs Klone waren miteinander identisch aber alle anderen unterschieden sich voneinander. So wurden fünf neue Sequenzen, die von GAGE verschieden aber stark verwandt mit GAGE sind, identifiziert. Sie werden GAGE-2, 3, 4, 5 und 6 genannt (4) und werden als SEQ ID NRN: 14–18, respektive, dargestellt. Die vierzehn anderen Klone wurden teilweise am 5'-Ende sequenziert und deren Sequenz entsprach einem der sechs GAGE cDNAs.
Der Hauptunterschied zwischen diesen cDNAs und GAGE-1 ist die Abwesenheit von einem 143-Basenstück, angeordnet an Postion 379 bis 521 der GAGE-Sequenz von SEQ ID NR: 1. Der Rest der Sequenzen zeigt nur an 19 unterschiedlichen Positionen Mismatches, mit der Ausnahme von GAGE-3, dessen 5'-Ende vollständig verschiedenen ist von den anderen GAGE für die ersten 112 Basen. Dieser Bereich der GAGE-3 cDNA enthält eine lange Wiederholung und eine Hairpin-Struktur.
Das abgeleitete GAGE-1-Protein entsprechend einem Tumorabstoßungsantigenvorläufer ist etwa 20 Rminosäuren länger als die anderen 5 Proteine, deren letzten sieben Reste ebenfalls von den homologen Resten von GAGE-1 unterschiedlich sind (5). Der Rest der Proteinsequenzen zeigt nur 10 Mismatches. Einer dieser ist die Region entsprechend dem antigenen Peptid SEQ ID NR: 4. Die Sequenz des Peptids ist in GAGE-3, 4, 5 und 6 modifiziert, so daß Position 2 nun ein w anstelle eines R ist.
Beispiel 14
Um herauszufinden, ob die Veränderung an Position 2 die Antigenizität des Peptids beeinflußt, wurde cDNA der 6 GAGE cDNAs individuell in COS-Zellen gemeinsam mit der cDNA von HLA-Cw6 transfiziert und die Transfektanten wurden hinsichtlich der Erkennung durch CTL 76/6, wie oben beschrieben, getestet. Nur GAGE-1- und GAGE-2-transfizierte Zellen wurden erkannt, was anzeigte, daß das modifizierte Peptid, für das GAGE-3, 4, 5 und 6 codierten, nicht im Kontext dieses Experimentes antigen sind. Eine Sequenzanalyse des 5'-Endes der anderen 14 Klone, die oben erwähnt worden sind, zeigte, daß 7 von ihnen die Sequenz enthielten, die das antigene Peptid codierten und daher wahrscheinlich entweder GAGE-1 oder GAGE-2 entsprachen.
Beispiel 15
Die PRC-Primer, die oben verwendet wurden, um die Expression von GAGE in Tumorproben zu überprüfen, unterscheiden nicht zwischen GAGE-1 oder 2 und den vier anderen GAGE cDNAs, die Antigen MZ2F nicht codieren. Ein neuer Satz Primer wurde hergestellt, welcher spezifisch GAGE-1 und 2 amplifiziert, und nicht GAGE-3, 4, 5 und 6. Diese Primer sind:
Die Primer wurden verwendet, wie oben beschrieben, in einer RT-PCR-Reaktion unter Verwendung eines Polymerase-Enzyms bei den folgenden Temperaturbedingungen:

40 Min. bei 94°C
30 Zyklen mit	1 Min. bei 94°C
	2 Min. bei 56°C
	3 Min. bei 72°C
15 Min. bei 72°C

Die Ergebnisse dieser Analyse sind in Tabelle 3 ausgeführt.
Tabelle 3 Expression von GAGE-Genen durch Tumorproben und Tumorzellinien
In der weiteren Arbeit wurden neue Primer entworfen, welche alle GAGE-Gene amplifizierten, um sicherzustellen, daß es keinerlei Expression von denen in normalen Geweben gab. Diese Primer sind
Diese wurden genauso verwendet wie für die PCR unter Verwendung der VDE44- und VDE24-Primer. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt. Sie bestätigen, daß die normalen Gewebe negativ sind, mit Ausnahme der Hoden.

Tabelle 4 Expression von GAGE-Genen in normalen adulten und fötalen Geweben

Adulte Gewebe Expression*	GAGE
Adrenaldrüse	–
Benigner Naevus	–
Knochenmark	–
Gehirn	–
Brust	–
Zerebellum	–
Dickdarm	–
Herz	–
Niere	–
Leber	–
Lunge	–
Melanozyten	–
Muskeln	–
Eierstock	–
Prostata	–
Haut	–
Splenozyten	–
Magen	–
Hoden	+
Thymozyten	–
Harnblase	–
Uterus	–
Plazenta	–
Rückenmark	–

Fetale Gewebe*

Fibroblasten –

Gehirn –

Leber –

Milz –

Thymus –

Hoden +
Beispiel 16
Bei Arbeit, die hier nicht wiedergegeben ist, wurde bestätigt, daß der zytolytische T-Zell-Klon CTL 22/23 (Van der Eynde, et al., Int. J. Cancer 44: 634–640 (1989) die Melanomzelle MZ2-MEL.3.1 nicht erkannte. Von dieser Melanomzellinie wurde berichtet durch Van der Bruggen, et al., Eur. J. Immunol.24: 2134–2140 (1994), daß sie die Expression von MHC-Molekülen HLA-A29, HLA-B24 und HLA-Cw*1601 verloren hat. Studien wurden unternommen, um zu bestimmen, ob die Transfektion mit einem dieser MHC-Moleküle die Linie sensibel für CTL 22/23 machen könnte. HLA-A29 war das erste Molekül, das getestet wurde. Um dies zu tun, wurde Poly A⁺ RNA aus der HLA-A29⁺-Zellinie MZ2-MEL.43 extrahiert, unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Extraktions-Kits und folgend den Anweisungen des Herstellers. Die mRNA wurde dann zu cDNA konvertiert unter Verwendung von Standardverfahren, größenfraktioniert und dann eindirektional in die BstI- und NotI-Sites von Plasmid pcDNA-I/Rmp inseriert. Die Plasmide wurden in E. coli-Strang DH5α5'IQ elektroplattiert und mit Ampicillin (50 μg/ml) ausgewählt. Die Bakterien wurden auf Nitrozellulosefilter plattiert und dupliziert. Die Filter wurden hergestellt und hybridisiert über Nacht in 6xSSC/0,1% SDS/1x Denhardt's Lösung bei 40°C unter Verwendung der ³²P-markierten Sonde:
Die Sonde ist eine Sequenz, welche das Start-Codon der meisten HLA-Sequenzen umgibt.
Die Filter wurden bei Raumtemperatur 5 Minuten jeweils in 6xSSC und zweimal in 6xSSC bei 43°C gewaschen. Positive Sequenzen wurden dann mit der Sonde
welche mit ³²P markiert war, gescreent. Diese Sequenz ist spezifisch für HLA-A29, wie durch Referenz zu der Kabat Database von Sequenzen und Proteinen von immunologischen Interesse, hiermit durch Referenz mit eingeschlossen, bestimmt wurde. Diese Datenbank ist erhältlich bei NCBI (USA) oder auf Webseite (Internet) www.NCBI.NLM.HIH.GOV. Die Filter wurden zweimal bei Raumtemperatur 5 Minuten jedes Mal in 6xSSC gewaschen, gefolgt durch zwei Waschungen mit 6xSSC (5 Minuten pro Waschung) bei 42°C.
Beispiel 17
Sobald positive HLA-A29-Klone isoliert worden waren, wurden diese in COS-7 transfiziert unter, Verwendung des DEAE-Dextran-Chloroquine-Verfahrens, siehe oben. In Kürze, 1,5 × 10⁴ COS-7-Zellen wurden mit 50 ng Plasmid pcDNA-I/Amp enthaltend HLA-A29 und 100 ng cDNR enthaltend die cDNR für eine der GAGE-Sequenzen, die oben erwähnt sind, behandelt, oder mit einer der MAGE oder BAGE-Sequenzen des Standes der Technik in Plasmid pcDNAα-I/Amp oder pcDSR-α, respektive. Die Transfektanten wurden dann 24 Stunden bei 37°C inkubiert.
Die Transfektanten wurden dann für deren Fähigkeit, TNF-Produktion durch CTLs zu stimulieren, unter Verwendung des Assays, der am Ende von Beispiel 4, oben, erklärt ist, getestet.
9, welche die Ergebnisse dieser Studie darstellt, zeigt, daß hohe Spiegel der TNF-Produktion unter Verwendung von irgendeinem von GAGE-3, 4, 5 oder 6 und HLA-A29 als Transfektanten erreicht wurden. GRGE-1 und GAGE-2 im Kontrast dazu stimulierten CTL-Klon 22/23 nicht, was daher zum Schluß führt, daß GAGE-3, 4, 5 und 6 in ein Antigen oder in Antigene prozessiert werden, die durch HLA-A29-Moleküle präsentiert und durch CTL 22/23 erkannt werden.
Beispiel 18
Die Tatsache, daß GAGE-3, 4, 5 und 6 in Peptide prozessiert werden, die durch HLA-A29+-Zellen präsentiert werden, während GAGE-1 und GAGE-2 dies nicht wurden, suggerierte die Überprüfung der abgeleiteten Aminosäuresequenzen hinsichtlich diejenigen, die gleich für GRGE-3, 4, 5 und 6 und unterschiedlich von GAGE-1 und 2 sind. Die Sequenz:
wurde identifiziert. Das Peptid wurde synthetisiert, lyophilisiert und dann in einem Volumen-DMSO, 9 Volomen 10 mM Essigsäure in Wasser gelöst. Dieses Verfahren wurde für die anderen synthetisierten Peptide, die hiernach diskutiert werden, verwendet.
Das Peptid (SEQ ID NR: 21) wurde in einem ⁵¹Cr-Freisetzungsexperiment getestet, folgend dem Verfahren, das oben beschrieben ist.
Es wurde gefunden, daß dieses Peptid Lysis nicht provozierte. Anschließende Deletionen wurden hergestellt und hinsichtlich ihrer Fähigkeit getestet, dieses zu provozieren, wiederum unter Verwendung der ⁵¹CR-lytischen Assays. Diese Arbeit ist in 9 dargestellt. Es wurde gefunden, daß das kürzeste Peptid, das Lysis provozierte,
(SEQ ID NR: 22) war, welches gemeinsam in allen von GAGE-3 bis zu GAGE-6 vorhanden ist. Insbesondere Aminosäuren 10–18 von GAGE-3 und Aminosäuren 9– 17 von GAGE-4, 5 und 6 entsprechen diesem Peptid.
Die Mitglieder der Peptidfamilie, die in 9 gezeigt und dargestellt ist, z. B. durch SEQ ID NRn: 21 und 22, stimmen nicht mit den Daten überein, die durch Toubert, et al., "HLA-A29 Peptid-Bindemotiv", Abstrakt Nr. 4183, Neunter Internationaler Kongreß über Immunologie, 23.–29. Juli 1995, San Francisco, CA, präsentiert wurden. Nach Toubert, et al., ist wenigstens ein Phe residue an der dritten Position jedes Peptids erforderlich, welches HLA-A29 bindet. Wie hierin gezeigt, ist dies nicht der Fall.
Die vorangegangenen Beispiele zeigen die Isolation von Nukleinsäuremolekülen, welche für Tumorabstoßungsantigenvorläufer und Tumorabstoßungsantigene codieren. Diese Moleküle sind jedoch nicht homolog zu irgendeinem der vorher offenbarten MAGE- und BAGE-codierenden Sequenzen, die in den Referenzen beschrieben sind, die oben aufgeführt sind.
Es kann ebenso aus den Beispielen gesehen werden, daß die Erfindung die Verwendung der Sequenzen in Expressionsvektoren umfaßt, ebenso wie Wirtszellen und Zellinien damit zu transformieren oder zu transfizieren, seien diese prokaryotisch (z. B. E. Coli) oder eukaryontisch (z. B. CHO- oder COS-Zellen). Die Expressionsvektoren erfordern, daß die pertinente Sequenz, d. h., diejenigen, die oben beschrieben sind, operabel mit einem Promoter verbunden ist. Wie es herausgefunden wurde, daß sowohl humane Leukozytenantigene HLA-Cw6 und HLA-A29 Tumorabstoßungsantigene, die von diesen Genen abgeleitet sind, präsentieren, kann der Expressionsvektor ebenso ein Nukleinsäuremolekül enthalten, das für eins von HLA-Cw6 oder HLA-A29 codiert. In einer Situation, wo der Vektor beide codierenden Sequenzen enthält, kann er verwendet werden, um eine Zelle zu transfizieren, welche normalerweise keines von beiden exprimiert. Die Tumorabstoßungsantigenvorläufer-codierenden, Sequenzen können alleine verwendet werden, wenn z. B. die Wirtszelle bereits eine oder beide von HLA-Cw6 und HLA-A29 exprimiert. Natürlich gibt es keine Limitierung auf die Wirtszelle, die verwendet werden kann. Ebenso können die Vektoren, die die zwei codierenden Sequenzen enthalten, in HLA-A29 oder HLA-Cw6 präsentierenden Zellen, wenn gewünscht, verwendet werden, und das Gen für Tumorabstoßungsantigenvorläufer kann in Wirtszellen verwendet werden, welche wieder HLA-A29 oder HLA-Cw6 exprimieren.
Die Erfindung umfaßt ebenso sogenannte Expressions-Kits, welche dem Fachmann erlauben, einen gewünschten Expressions-Vektor oder -Vektoren herzustellen. Solche Expressions-Kits beinhalten wenigstens separate Teile von jeder der vorher diskutierten codierenden Sequenzen. Andere Bestandteile können wie gewünscht hinzugefügt werden, solange wie die vorher erwähnten Sequenzen, welche erforderlich sind, beinhaltet sind.
Um die Nukleinsäuremoleküle und die TRAPs der Erfindung von vorher beschriebenen MAGE- und BAGE-Materialen zu unterscheiden, soll die Erfindung als GAGE-Gen-Familie und TRAPs bezeichnet werden. Daher, wann immer "GAGE" hierin verwendet wird, bezeichnet es den Tumorabstufungsantigenvorläufer, für den die vorher beschriebenen Sequenzen codieren. "GAGE- codierendes Molekül" und ähnliche Begriffe werden verwendet, um die Nukleinsäuremoleküle selbst zu beschreiben.
Die Erfindung, wie sie hierin beschrieben ist, hat eine Vielzahl von Verwendungen, von denen einige hierin beschrieben sind. Zunächst erlaubt die Erfindung dem Fachmann, einen ungewöhnlichen Zustand, so wie ein Melanom, zu diagnostizieren, der durch die Expression von TRAP oder durch die Präsentation des Tumorabstoßungsantigens charakterisiert ist. Diese Verfahren beinhalten Bestimmen der Expression des TRAP-Gens und/oder der TRAB abgeleitet davon, solche wie ein TRA präsentiert durch HLA-Cw6 oder HLA-A29. In der vorherigen Situation können solche Bestimmungen über jeglichen Standard – Nukleinsäurebestimmungs-Assay ausgeführt werden, einschließlich der Polymerase-Kettenreaktion, oder des Assays mit markierten Hybridisierungssonden. In der letzteren Situation ist das Durchführen eines Assays mit Bindepartnern für Komplexe von TRA und HLA sowie Antikörpern insbesondere bevorzugt. Ein alternatives Verfahren für die Bestimmung ist ein TNF-Freisetzungs-Assay von dem Typ, der oben beschrieben ist. Um diesen Assay auszuführen, ist es bevorzugt, sicherzustellen, daß Hodenzellen nicht vorhanden sind, da diese normalerweise GAGE exprimieren. Dies ist jedoch nicht essentiell, da man routinegemäß zwischen Hodenzellen und anderen Zelltypen unterscheiden kann. Auch ist es praktisch unmöglich, Hodenzellen in einer Nicht-Hodenprobe vorhanden zu haben.
Die Isolation des TRAP-Gens macht es ebenso möglich, das TRAP-Molekül selbst zu isolieren, insbesondere TRAP-Moleküle, die die Aminosäuresequenz enthalten, für die irgendeine von SEQ ID NRn: 2–6 codiert. Diese isolierten Moleküle, wenn sie als TRA oder als Komplexe aus TRA und HLA, so wie HLA-Cw6 oder HLA-A29 präsentiert sind, können mit Materialien, so wie Hilfsstoffen kombiniert sein, um Vakzine herzustellen, die bei der Behandlung von unnormalen Zuständen, die durch die Expression des TRAP-Moleküls gekennzeichnet sind, nützlich sind.
Beispielhafte Hilfsstoffe beinhalten Freund's vollständiges und unvollständiges Adjuvans, getötete B. Pertussis-Organismen, "BCG" oder Bacille Calmente-Guerin, Al(OH)₃, Muramyl-Dipeptid und dessen Derivate, welche in metabolisierbaren Ölen, so wie Squalen, Monophosphoryl Lipid A (MPL), Keyhole Limpet Homocyanin (KLH), Saponin-Extrakte sowie QA-7, QA-19 und QA-21 (auch QS-21 genannt), die in U.S. Patent Nr. 5 057 540 von Kensil, et al., beschrieben sind, MTP-MF59, N-[1-(2,3- Dioleoyloxy)Propyl]-N,N,N-Trimethylammonium-Methylsulfat (DOTAP), dem kationischen Amphiphil DOTMR, den neutralen Phospholipiden sowie DOPE und Kombinationen dieser emulgiert sein können. Diese Auflistung ist auf keinen Fall vollständig und der Fachmann von durchschnittlicher Begabung wird in der Lage sein, diese Auflistung zu vervollständigen. Alle zusätzlichen Hilfsstoffe sind hierin eingeschlossen.
Zusätzlich können Vakzine aus Zellen hergestellt werden, welche die TRA-HLA-Komplexe auf ihre Oberfläche präsentieren sowie nicht-proliferative Krebszellen, nicht-proliferative Transfektanten, etc. In allen Fällen, wo Zellen als Vakzine verwendet werden, können dies Zellen sein, die mit codierenden Sequenzen für eine oder beide der erforderlichen Komponenten transfiziert sind, um eine CTL-Antwort hervorzurufen, oder können Zellen sein, die beide Moleküle ohne Transfektion exprimieren. Weiterhin kann das TRAP-Molekül, dessen damit verbundene TRAs, ebenso wie Komplexe aus TRA und HLA verwendet werden, um Antikörper zu produzieren, unter Verwendung von Standardtechniken, die in der Technik bekannt sind.
Wenn "vom normalen Zustand abweichend" hierin verwendet wird, bezieht es sich auf jeden pathologischen Umstand, wo der Tumorabstoßungsantigenvorläufer exprimiert wird. Ein Beispiel eines solchen vom normalen abweichenden Zustandes ist Krebs, Melanom insbesondere. Melanom ist gutbekannt als ein Krebs von pigmentproduzierenden Zellen.
Wie oben aufgezeigt, sind Tumorabstoßungsantigene, so wie diejenigen, die in SEQ ID NR: 4 dargestellt sind, ebenso Teil der Erfindung. Auch ein Teil der Erfindung sind Polypeptide sowie Moleküle, die von 8 bis zu 16 Aminosäuren enthalten, wobei die Polypeptide die Aminosäuresequenzen enthalten, die in SEQ ID NR: 4 ausgeführt sind. Wie die Beispiele aufzeigen, werden die Peptide, die länger sind als der Octamer von SEQ ID NR: 4 zu den Tumorabstoßungsantigenen von SEQ ID NR: 4 durch die HLA-Cw6-präsentierenden Krebszellen prozessiert und durch sie präsentiert. Die Präsentation führt zur Lysis durch zytolytische T-Lymphozyten, die in einer Körperflüssigkeitsprobe enthalten sind, die in Kontakt mit den Zellen steht, die den Komplex präsentieren. Auf ähnliche Art und Weise werden die Peptide, die länger sind als SEQ ID NR: 22 sowie SEQ ID NR: 21 in dementsprechende TRAs prozessiert, und werden durch Kebszellen präsentiert, so wie als HLA-A29-positive Zellen.
Daher sind ein weiterer Gegenstand der Erfindung Peptide, welche eine Länge aufweisen, die irgendwo zwischen 9 und 16 Aminosäuren liegt, und die die Sequenz:
umfassen, wobei Xaa eine Aminosäure ist. Diese Peptide formen sich zu oder werden verarbeitet zu Peptiden, welche an HLA-A29-Moleküle binden. Die Tatsache, daß diese Peptide zu den Tumorabstoßungsantigenen verarbeitet werden, ist durch die Beispiele dargelegt.
Diese Eigenschaft kann im Kontext anderer Parametern bei einem Bestätigen von Diagnosen von pathologischen Umständen, so wie Krebs, Melanom insbesondere, ausgenutzt werden. Beispielsweise kann der Fachmann Antigene studieren, die im Blut oder Urin enthalten sind, physiologische Veränderungen beobachten und dann unter Verwendung der hierin beschriebenen CTL-Proliferationsverfahren eine Melanomdiagnose bestätigen.
Alleine können Peptide dieser Erfindung verwendet werden, um HLA-Typing-Assays auszuführen. Es ist gut bekannt, daß, wenn eine Hauttransplantation, Organtransplantation, usw. erforderlich ist, man HLA-Typing ausführen muß, um so die Möglichkeit der Implantatabstoßung zu minimieren. Die Peptide der Erfindung können verwendet werden um zu bestimmen, ob ein Individuum HLA-Cw6- oder HLA-A29-positiv ist, so daß entsprechende Spender ausgewählt werden können. Diese Art Assay ist einfach auszuführen. Peptide der Erfindung werden mit einer Probe von Interesse in Kontakt gebracht und Binden an Zellen in dieser Probe zeigt an, ob das Individuum, von welchem die Probe entnommen wurde, HLA-Cw6- oder HLA-A29-positiv ist, oder nicht. Man kann die Peptide selbst markieren, konjugieren oder auf andere Weise sie an Linker binden, welche markiert sind, sie an feste Phasen immobilisieren und so weiter, um so solch einen Assay zu optimieren. Andere Standardverfahren werden dem Fachmann klar sein und brauchen hierin nicht aufgeführt zu werden.
Therapeutische Herangehensweisen, die auf dieser Offenbarung beruhen, unterliegen der Premisse einer Antwort durch das Immunsystem eines Subjektes, welches zur Lysis der TRA-präsentierenden Zellen führt, so wie HLA-A29- oder HLA-Cw6-Zellen. Eine solche Herangehensweise ist die Verabreichung von CTLs, die spezifisch für den Komplex sind, an ein Subjekt mit abnormalen Zellen des Phenotyps, um den es geht. Es befindet sich innerhalb der Fähigkeit des Fachmanns, solche CTLs in vitro zu entwickeln. Spezifisch wird eine Zellprobe, so wie Blutzellen, in Kontakt gebracht mit einer Zelle, die den Komplex präsentiert und in der Lage ist, eine spezifische CTL-Zelle zu provozieren, so daß sie proliferiert. Die Target-Zelle kann ein Transfektant sein, so wie eine COS-Zelle des Typs, der oben beschrieben ist. Diese Transfektanten präsentieren den gewünschten Komplex auf ihrer Oberfläche, und wenn sie mit einem CTL von Interesse kombiniert werden, stimulieren sie dessen Proliferation.
COS-Zellen, so wie diese, die hierin verwendet werden, sind vielfältig erhältlich, wie auch andere geeignete Wirtszellen.
Um die therapeutische Verfahrensweise, die als adaptiver Transfer bezeichnet wird, detailliert darzustellen (Greenberg, J. Immunol. 126(5): 1917 (1986); Riddel et al., Science 257: 238 (7-10-92); Lynch. et al., Eur. J. Immunol. 21: 1403–1410 (1991); Kast et al., Cell 59: 603–614 (11-17-89)), Zellen, die den gewünschten Komplex präsentieren, werden mit CTLs kombiniert, was zur Proliferation der CTLs führt, die spezifisch dafür sind. Die proliferierten CTLs werden dann einem Subjekt mit einer zellulären Abnormalität, welche dadurch gekennzeichnet ist, daß gewisse abnormale Zellen den bestimmten Komplex präsentieren, wobei der Komplex das pertinente HLA-Molekül enthält, verabreicht. Die CTLs lysieren dann die abnormalen Zellen und erreichen dadurch das gewünschte therapeutische Ziel.
Die vorangegangene Therapie nimmt an, daß wenigstens einige der abnormalen Zellen des Subjektes den relevanten HLA/TRA-Komplex präsentieren. Dies kann sehr einfach bestimmt werden, da verfahren zum Identifizieren von Zellen, welche ein bestimmtes HLA-Molekül präsentieren im Stand der Technik sehr gut bekannt sind. Es ist ebenso bekannt, wie man Zellen identifiziert, die RNA der pertinenten Sequenzen, in diesem Falle eine GAGE-Sequenz, exprimieren. Sobald Zellen, die den relevanten Komplex präsentieren, über das vorangegangene Screening-Verfahren identifiziert worden sind, können sie mit einer Probe des Patienten kombiniert werden, wobei die Probe CTL enthält. Wenn die Zellen, die den Komplex präsentieren, durch die gemischte CTL-Probe lysiert werden, kann angenommen werden, daß ein GAGE- abgeleitetes Tumorabstoßungsantigen präsentiert wird und daß das Subjekt ein angemessener Kandidat für die therapeutische Herangehensweise ist, die oben ausgeführt wurde.
Adoptiver Transfer ist nicht die einzige Therapieform, die in Übereinstimmung mit der Erfindung erhältlich ist. CTLs können ebenso in vivo provoziert werden unter Verwendung einer Anzahl von Herangehensweisen. Eine Herangehensweise, d. h. die Verwendung von nicht-proliferativen Zellen, die den Komplex exprimieren, ist oben genauer ausgeführt worden. Die Zellen, die bei dieser Herangehensweise verwendet werden, können diese sein, die normalerweise den Komplex exprimieren, so wie bestrahlte Melanomzellen oder Zellen, die mit einem oder beiden der erforderlichen Gene für die Präsentation des Komplexes transfiziert worden sind.
Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 110–114 (Januar 1991) führt diese Herangehensweise beispielhaft aus, wobei die Verwendung von transfizierten Zellen, die HPV E7-Peptide in einem therapeutischen Umfeld gezeigt wird. Verschiedene Zellarten können verwendet werden. Auf gleiche Weise können Vektoren verwendet werden, die eines oder beide der Gene von Interesse tragen. Virale oder bakterielle Vektoren sind insbesondere bevorzugt. In diesen Systemen wird das Gen von Interesse durch beispielsweise ein Vakzinia-Virus oder das Bakterium BCG getragen, und die Materialien "infizieren" de facto Wirtszellen. Die Zellen, welche resultieren, präsentieren den Komplex von Interesse und werden durch autologe CTLs erkannt, welche dann proliferieren. Ein ähnlicher Effekt kann durch Kombinieren des Tumorabstoßungsantigen oder des Vorläufers selbst mit einem Hilfsstoff erreicht werden, um die Inkorporation in HLAL,-Cw6-präsentierende Zellen zu erleichtern, welche dann den HLA/Peptid-Komplex von Interesse präsentieren. Der TRAP wird prozessiert, um den Peptidpartner des HLA-Moleküls zu ergeben, während das TRA präsentiert wird, ohne daß weiteres Prozessieren erforderlich ist.

Claims

Isoliertes Peptid, ausgewählt aus:
Isoliertes Peptid nach Anspruch 1, wobei das Peptid durch seine Bindung an das HLA-A29-Molekül charakterisiert ist.
Verfahren zum Feststellen der Anwesenheit von zytolytischen T-Lymphozyten, die für Komplexe aus HLA-A29-Molekülen und der Peptidsequenz:
spezifisch sind, in einer Körperflüssigkeitsprobe, umfassend das In-Kontakt-Bringen einer Probe von Zellen, die HLA-A29 auf ihrer Oberfläche präsentieren, mit einem SEQ ID NO: 23 umfassenden Polypeptid unter Bedingungen, die die Prozessierung dieses Polypeptids zum Polypeptid SEQ ID NO: 23 und das Binden von SEQ ID NO: 23 an die HLA-A29-Moleküle begünstigen, In-Kontakt-Bringen einer Körperflüssigkeitsprobe, die die zytolytischen T-Lymphozyten enthalten soll, mit den Zellen, die Komplexe aus SEQ ID NO: 23 und HLA-A29 auf ihrer Oberfläche präsentieren, und Nachweis von wenigstens einem von (i) Tumornekrosefaktor, der von zytolytischen T-Lymphozyten freigesetzt wird, oder (ii) Lyse der die Komplexe präsentierenden Zellen, als Nachweis der Anwesenheit der zytolytischen T-Lymphozyten in der Probe.
Verfahren nach Anspruch 3, welches den Nachweis der Freisetzung von Tumornekrosefaktor umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, welches den Nachweis der Lyse durch Nachweis der Freisetzung von radiomarkiertem Chrom umfaßt.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Nukleinsäuresequenzen, die durch SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 oder SEQ ID NO: 18 dargestellt sind
Expressionsvektor, enthaltend ein Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 6, das operabel mit einem Promotor verknüpft ist.
Zelle oder Zellinie, transformiert oder transfiziert mit dem Nukleinsäuremolekül oder dem Vektor nach Anspruch 6 oder 7.
Impfstoff, welcher die Aminosäuresequenz umfaßt, die von irgendeinem der Nukleinsäuremoleküle, wie sie durch SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 oder SEQ ID NO: 18 dargestellt sind, codiert wird.
Impfstoff, welcher die Aminosäuresequenz umfaßt, wie sie durch SEQ ID NO: 21 oder SEQ ID NO: 22 dargestellt ist.
Impfstoff nach Anspruch 9 oder 10, wobei der Impfstoff ferner ein Adjuvans umfaßt.