DE69530410T2

DE69530410T2 - Methoden zur identifizierung von individuen, die an einer zellulären abnormalität leiden

Info

Publication number: DE69530410T2
Application number: DE69530410T
Authority: DE
Inventors: Pierre Van Der Bruggen; Jean-Pierre Szikora; Pierre Coulie; Claude Wildmann; Pascale Boel; Thierry Boon-Falleur
Original assignee: Ludwig Institute for Cancer Research Ltd; Ludwig Institute for Cancer Research New York
Current assignee: Ludwig Institute for Cancer Research Ltd; Ludwig Institute for Cancer Research New York
Priority date: 1994-02-14
Filing date: 1995-01-26
Publication date: 2004-03-25
Anticipated expiration: 2015-01-27
Also published as: WO1995021630A1; DE69530410D1; US6328971B1; NZ282938A; FI963170A; EP0789591A4; NO963347D0; ES2197196T3; EP0789591B1; ATE237685T1; AU2089995A; FI963170A0; PT789591E; AU697246B2; EP0789591A1; JP2002502224A; DK0789591T3; CA2182969A1; NO963347L

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft verschiedene therapeutische Methodenwege, die aus der Erkenntnis entstanden sind, dass gewisse abnormale Zellen Komplexe von HLA-Cw*1601 (bisher als HLA-C-Klon 10 bezeichnet) (Bodmer et al., Tissue Antigens 44 1 (1994)) und Peptide, die von einem Molekül, das als MAGE-1 bezeichnet wird, abgeleitet sind, auf ihren Oberflächen präsentieren. Außerdem betrifft sie die Möglichkeit, solche Individuen zu identifizieren, bei denen Krankheitsbilder diagnostiziert sind, die durch Zellenabnormitäten, deren abnorme Zellen diesen Komplex präsentieren, charakterisiert sind.
Hintergrund und Stand der Technik
Das Prozess, mit dem das Immunsystem des Säugers fremdes Material oder von außen kommende Materialien erkennt und darauf reagiert, ist komplex. Eine wichtige Facette dieses Systems ist die T-Zellenantwort. Diese Antwort erfordert, dass die T-Zellen mit Komplexen von Zelloberflächenmolekülen, die als humane Leukocytenantigene ("HLA") oder Haupthistokompatibilitätskomplexe ("MHCs") bezeichnet werden und Peptide erkennt und damit in Wechselwirkung tritt. Die Peptide sind von größeren Molekülen, die von Zellen hergestellt werden, die ebenfalls das HLA/MHC-Molekül präsentieren, abgeleitet. Es wird hierzu auf Male et al., Advanced Immunology (J. P. Lipincott Company, 1987), insbesondere Kapitel 6–10, verwiesen. Die Wechselwirkung der T-Zelle und der Komplexe des HLA/Peptids ist eingeschränkt, da eine T-Zelle erforderlich ist, die für eine besondere Kombination aus einem HLA-Molekül und einem Peptid spezifisch ist. Wenn eine spezifische T-Zelle nicht vorhanden ist, gibt es keine T-Zellenantwort, selbst wenn ihr Partnerkomplex vorhanden ist. Es gibt in ähnlicher Weise keine Antwort, wenn der spezifische Komplex nicht vorhanden ist und die T-Zelle jedoch vorhanden ist. Dieser Mechanismus ist bei der Antwort des Immunsystems auf fremde Materialien, bei Immunpathologien und bei Antworten auf Zellabnormitäten beteiligt. Erst kürzlich hat sich viel Arbeit auf die Mechanismen konzentriert, mit denen die Proteine in die HLA-Bindungspeptide verarbeitet werden. Hierzu wird auf Barinaga, Science 257: 880 (1992); Fremont at al., Science 257: 919 (1992); Matsumura et al., Science 257: 927 (1992); Latron et al., Schience 257: 964 (1992) verwiesen.
Der Mechanismus, mit dem die T-Zellen Zellabnormitäten erkennen, ist ebenfalls bei Krebs beteiligt. Beispielsweise ist in der PCT-Anmeldung PCT/US92/04354, eingereicht am 22. Mai 1992 und am 26. November 1992 als W092/20356 veröffentlicht eine Genfamilie beschrieben, die zu Peptiden, die wiederum auf Zelloberflächen exprimiert werden, verarbeitet werden und zur Lyse von Tumorzellen durch spezifische CTLs führen können. Diese Gene werden als die "MAGE"-Familie bezeichnet, und es wird gesagt, dass sie für "tumor rejection antigen precursors" oder "TRAP"-Moleküle kodieren, und die davon abgeleiteten Peptide werden als "tumor rejection antigens" und "TRAs" bezeichnet. Siehe hierzu für weitere Informationen über diese Genfamilie Traversari et al., Immunogenetics 35: 145 (1992); van der Bruggen et al., Science 254: 1643 (1991).
In der internationalen Patentanmeldung WO 94/05304 werden Nonapeptide beschrieben, die an das HLA-A1-Molekül binden. Diese Referenz lehrt, dass bei einer gegebenen bekannten Spezifität von bestimmten Peptiden für bestimmte HLA-Moleküle man ein bestimmtes Peptid erwarten sollte, das ein HLA-Molekül, allerdings nicht andere, bindet. Dieses ist wichtig, weil verschiedene Individuen unterschiedliche HLA-Phänotypen besitzen. Während die Identifizierung eines bestimmten Peptids als Partner für ein spezifisches HLA-Molekül diagnostische und therapeutische Verzweigungen aufweist, sind diese im Ergebnis nur für Individuen mit diesem speziellen HLA-Phänotyp relevant. Es besteht daher ein Bedarf hinsichtlich weiterer Arbeit auf diesem Gebiet, weil Zellabnormitäten nicht auf einen speziellen HLA-Phänotyp beschränkt sind und eine zielgerechte Therapie einige Kenntnis des Phänotyps der abnormen Zellen im Gewebe erfordert.
In einer Patentanmeldung, die am 22. Dezember 1992 im Namen von Boon-Falleur et al. mit dem Titel "Method for Identifying Individuals Suffering From a Cellular Abnormality, Some of Whose Abnormal Cells Present Complexes of HLA-A2/Tyrosinase Derived Peptides and Methods for Treating said Individuals" eingereicht worden ist, wurde der Komplex des Titels so identifiziert, dass er bei bestimmten Zellabnormitäten beteiligt ist. Die Anmeldung schlägt allerdings nicht vor, dass irgendwelche anderen HLA-Moleküle bei Zellabnormitäten beteiligt sein könnten.
Die bisherige Präsentierung von MAGE-1 durch ein HLA-A-Molekül, was oben beschrieben wurde, schlägt nicht vor, dass das Protein durch ein anderes HLA-Molekül präsentiert werden kann. Demzufolge ist es überraschend, dass das MAGE-Molekül selbst, das durch HLA-A1 präsentiert wird, nun durch HLA-Cw*1601 präsentiert werden kann. Während die bisherige Forschung dafür gut ist, dieses Phänomen zu verstehen, gibt sie dem Fachmann hinsichtlich der folgenden Beschreibung keine Hinweise.
Zusammenfassung der Erfindung
Nach einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das für die Bestimmung der Expression von HLA-Cw*1601 geeignet ist und aus der Gruppe gewählt ist, die aus SEQ ID NR: 6, SEQ ID NR: 7, SEQ ID NR: 8 und SEQ ID NR: 9 gewählt ist, zur Verfügung gestellt.
In einem zweiten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Kit zur Verfügung, das für die Bestimmung der Expression von HLA-Cw*1601 geeignet ist und folgendes umfasst:

(a) ein erstes Reagenz, das SEQ ID NR: 6 und SEQ ID NR: 7 enthält;
(b) ein zweites Reagenz, das SEQ ID NR: 8 und SEQ ID NR: 9 enthält; und
(c) ein Verpackungsmittel zum Halten der ersten und zweiten Reagenzien.

Nach einem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Substanzzusammensetzung zur Verfügung gestellt, die für die Bestimmung der Expression von HLA-Cw*1601 in einer Probe geeignet ist und folgendes umfasst:

(a) eine Mischung aus SEQ ID NR: 6 und SEQ ID NR: 7 oder
(b) eine Mischung aus SEQ ID NR: 8 und SEQ ID NR: 9.

In einem vierten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung eines Kandidaten für die Behandlung mit einem therapeutischen Mittel, das für Komplexe von HLA-Cw*1601 und das Peptid mit SEQ ID NR: 4 spezifisch ist, zur Verfügung, das folgendes umfasst:

(i) Bestimmen der Expression von HLA-Cw*1601 in einem Individuum mit einem Verfahren, bei dem ein Molekül nach dem ersten Aspekt eingesetzt wird, mit einem Kit, das nach dem zweiten Aspekt zur Verfügung gestellt wird oder einer Substanzzusammensetzung, die nach dem dritten Aspekt zur Verfügung gestellt wird;
(ii) Inkontaktbringen einer abnormalen Zellprobe von dem Individuum mit einer cytolytischen T-Zelle, die für diese Komplexe spezifisch ist und
(iii) Bestimmen der Lyse von mindestens einem Teil der abnormen Zellprobe als Indiz auf einen Kandidaten für diese Behandlung.

Nach einem fünften Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Zusammensetzung zur Verfügung gestellt, die mindestens ein Mittel, das eine cytolytische T-Zellenantwort auf Zellen, die Komplexe von HLA-Cw*1601 und Peptide mit SEQ ID NR: 4 auf ihren Oberflächen präsentieren, hervorruft, umfasst, und die dafür ausreichend ist, eine Antwort auf abnorme Zellen, die diese Komplexe auf ihren Oberflächen präsentieren, hervorzurufen.
In einem sechsten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung zur Verfügung, die eine Menge cytolytischer T-Zellen, die spezifisch für Komplexe von SEQ ID Nr: 4 und HLA-Cw*1601 sind, umfasst und dafür ausreicht, eine therapeutische Wirkung auszuüben.
Nach einem siebten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine isolierte cytolytische T-Zelle zur Verfügung gestellt, die für einen Komplex von HLA-Cw*1601 und das Peptid mit SEQ ID NR: 4 ist.
In einem achten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung einer abnormen Zelle zur Verfügung, die einen Komplex von HLA-Cw*1601 und das Peptid mit SEQ ID NR: 4 auf ihrer Oberfläche präsentiert, wobei eine Probe mit abnormen Zellen mit einer cytolytischen T-Zelle, die für diesen Komplex spezifisch ist, in Kontakt gebracht wird und die Lyse dieser abnormen Zelle als Bestimmung von Zellen, die diesen Komplex präsentieren, bestimmt wird.
Nach einem neunten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein isoliertes Peptid zur Verfügung gestellt, das aus der Gruppe gewählt ist, die aus folgendem besteht:
SEQ ID NR: 2,
SEQ ID NR: 3 und
SEQ ID NR: 4.
In einem zehnten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung einen isolierten Komplex von HLA-Cw*1601 und dem isolierten Peptid mit SEQ ID NR: 4 zur Verfügung.
Nach einem elften Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein isoliertes Nonapeptid der Formel
(SEQ ID NR: 10) zur Verfügung gestellt, worin Xaa eine Aminosäure bedeutet, mindestens zwei der folgenden Bedingungen erfüllt sind: Position 1 ist Ser, Position 3 ist Tyr, Position 4 Gly, Position 5 ist Glu, Position 6 ist Pro, Position 7 ist Arg und Position 8 ist Lys und das Nonapeptid in der Lage ist, an HLA-Cw*1601 zu binden.
Weitere bevorzugte Merkmale der Erfindung sind in den anliegenden abhängigen Patentansprüchen ausgeführt.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 zeigt Experimente, bei denen die Transfektion von COS-7 mit kodierenden Sequenzen für MAGE-1 und HLA-Cw*1601 beteiligt ist.
2A zeigt die Ergebnisse eines ⁵¹Cr-Freisetzungsassays mit MZ2-Zellen, die mit dem Epstein Barr Virus infiziert sind und mit dem Peptid mit SEQ ID NR: 4 für 30 Minuten inkubiert worden sind. Die Effektorzellen waren aus CTL 81/12.
2B entspricht fast der 2A, wobei der einzige Unterschied darin liegt, dass der Effektor CTL 82/35 war.
Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Beispiel 1
In den nun folgenden Experimenten wurden verschiedene Melanomzelllinien verwendet. Diese wurden von Melanompatienten erhalten und als MZ2 und LB73 identifiziert. Die Zelllinien MZ2-MEL.43, MZ2-MEL-3.0 und MZ2-MEL 3.1 sind klonierte Sublinien von MZ2-MEL und in Van den Eynde et al., Int. J. Canc. 44: 634 (1989), als auch in der PCT-Patentanmeldung W092/20356 (26. November 1992) beschrieben. Die Zelllinie LB73-MEL wurde aus dem Patienten LB73 in der gleichen Weise wie die anderen hier beschriebenen Zelllinien gewonnen.
Proben, die mononukleare Blutzellen enthielten, wurden dem Patienten MZ2 entnommen. Eine Probe der Melanomzelllinie MZ2-MEL.43 wurde bestrahlt und dann mit den Proben, die die mononuklearen Blutzellen enthielten, in Kontakt gebracht. Die Mischungen wurden auf die Lyse mit der Melanomzelllinien beobachtet, wobei diese Lyse anzeigte, dass cytolytische T-Zellen ("CTLs"), die spezifisch für einen Komplex aus einem Peptid und einem HLA-Molekül, die durch die Melanomzellen präsentiert wurden, in der Probe zugegen waren.
Der verwendete Lyseassay war ein Chromfreisetzungsassay nach Herin et al., Int. J. Cancer 39: 390–396 (1987). Der Assay ist allerdings darin beschrieben. Die Zielmelanomzellen wurden in vitro wachsen gelassen und dann bei 10⁷ Zellen/ml in DMEM resuspendiert, mit 10 mMol HEPES und 30% FCS ergänzt und über 45 Minuten bei 37°C mit 200 μCi/ml Na(⁵¹Cr)O₄ inkubiert. Die markierten Zellen wurden drei Mal mit DMEM, das mit 10 mMol HEPES ergänzt war, gewaschen. Diese wurden dann in DMEM, das mit 10 mMol HEPES und 10% FCS ergänzt war, resuspendiert, wonach dann 100 μl Aliquots, die 10³ Zellen enthielten, auf 96-Loch Mikrotiterplatten verteilt wurden. Die PBL-Proben wurden in 100 μl des gleichen Mediums hinzugegeben, und die Assays wurden doppelt durchgeführt. Die Platten wurden für 4 Minuten bei 100 g zentrifugiert und für 4 Stunden bei 37°C in einer 5,5 %igen CO₂-Atmosphäre inkubiert.
Die Platten wurden wieder zentrifugiert, und es wurden 100 μl Aliquote Überstand gesammelt und gezählt. Die Prozentzahl für die ⁵¹Cr-Freisetzung wurde wie folgt berechnet:
worin ER die beobachtete experimentelle ⁵¹Cr-Freisetzung bedeutet, SR die spontane Freisetzung, die durch Inkubieren von 103 markierten Zellen in 200 μl Medium allein gemessen wird, bedeutet und MR die maximale Freisetzung, die durch Zugabe von 100 μl 0,3% Triton X-100 zu den Targetzellen erhalten wurde, bedeutet.
Diese mononuklaren Blutproben, die eine hohe CTL-Aktivität zeigten, wurden gestreckt und über eine Grenzverdünnung kloniert und wieder nach der gleichen Methode durchgeprüft.
Diese Experimente führten zu der Isolierung von verschiedenen CTL-Klonen aus dem Patienten MZ2, wozu auch der CTL-Klon "81/12" zählte.
Das Experiment wurde wie beschrieben wiederholt, wobei beide Zelllinien MZ2-MEL 3.0 und MZ-MEL 3.1 verwendet wurden. Die Ergebnisse zeigten, dass der Klon 81/12 sowohl MZ2-MEL.43 und MZ2-MEL 3.0, allerdings nicht MZ2-MEL 3.1 erkannte. Das Antigen, das von 81/12 erkannt worden ist, wird nachfolgend als "Antigen Bb" bezeichnet.
Beispiel 2
Im Hinblick auf die früheren Arbeiten, die oben zusammengefasst worden sind, war es von Interesse, das Profil der HLA-Klasse 1 für den Patienten MZ2 zu bestimmen. Dieses wurde nach Standardmethoden, die nun nachfolgend aufgeführt sind, bestimmt. Zur Herstellung von cDNA-Klonen, die für die Gene der Moleküle der HLA Klasse 1 des Patienten kodierten, wurde eine cDNA-Bibliothek hergestellt, wobei von der gesamten mRNA, die aus der Zelllinie MZ2-MEL.43 extrahiert wurde, unter Anwendung gut bekannter Techniken, die hier nicht wiederholt werden, ausgegangen wurde. Die Bibliothek wurde in das Plasmid pcD-SRα inseriert und dann überprüft, wobei eine Oligonukleotidsonde verwendet worden ist, die eine Sequenz enthielt, die allen Genen der HLA 1 Klasse gemeinsam ist, das heißt.
(SEQ ID NR: l)
Einer der identifizierten Klone war der Klon IC4A7, der, wie man bei der Sequenzierung festgestellt hatte, funktionell äquivalent – wenn nicht sogar identisch zu HLA-Cw*1601, ein gut bekanntes humanes Leukocytenantigenmolekül, war. Die Sequenz der DNA, die für HLA-Cw*1601 kodiert, ist beispielsweise bei Cianetti et al., Immunogenetics 29: 80–91 (1989) angegeben, wo sie als HLA-C-Klone 10 bezeichnet ist, und die Sequenz ist bei GENBANK mit der Zugangsnummer HUMMHCACA erhältlich. Eine aktu elle Sequenz wird von Zemmour et al., Immunogenetics 37: 239– 250 (1993) Cianetti et al., supra berichtet. Die Zemmour-Sequenz ist ebenfalls in der EMBL-Sequenzbank erhältlich.
Beispiel 3
Es war von Interesse zu bestimmen, ob das oben identifizierte HLA-Molekül ein MAGE, das vom "tumor rejection"-Antigen stammt, präsentiert und ob der entstehende Komplex aus Antigen und HLA-Molekül vom CTL-Klone des Patienten MZ2 erkannt wurde. Zur Bestimmung wurden die Empfängerzellen mit cDNA, die für HLA-Cw*1601 kodiert und mit einer c-DNA von MAGE-1, MAGE-2 oder MAGE-3 transfiziert. Die MAGE-1-cDNA wurde in das Plasmid pcDNA I/Amp inseriert, während die cDNAs MAGE-2 und MAGIE-3 in das Plasmid pcD-SRα inseriert wurde.
Proben von COS-7-Empfängerzellen wurden bei 15.000 Zellen/Loch in Flachbodenmikrolöchern für die Gewebekultur in Dulberco's modifiziertem Eagle-Medium ("DMEM"), das mit 10% fötalem Kalbsserum ergänzt war, geimpft. Die Zellen wurden über Nacht bei 37°C inkubiert, das Medium wurde entfernt und dann durch 30 μl/Loch DMEM-Medium, das 10% Nu-Serum, 400 μg/ml DEAE-Dextran, 100 μMol Chloroquin und 100 ng des jeweiligen Plasmids (das heißt, 100 ng des IC4A7-Klons und 100 ng des MAGE-cDNA-Plasmids) enthielt, ersetzt. Nach vier Stunden Inkubation bei 37°C wurde das Medium entfernt und durch 50 μl PBS, das 10% DMSO enthielt, ersetzt. Dieses Medium wurde nach zwei Minuten entfernt und durch 200 μl DMEM, das mit 10% FCS ergänzt war, ersetzt.
Nach diesem Mediumwechsel wurden die COS-Zellen für 48 Stunden bei 37°C inkubiert. Das Medium wurde dann verworfen, und es wurden 2.000 Zellen des CTL-Klons 81/12 in 100 μl Iscove-Medium, das 10% kombiniertes humanes Serum enthielt, hinzugegeben. Der Überstand wurde nach 24 Stunden entfernt, und der TNF-Gehalt wurde in einem Assay mit WEHI-Zellen, wie von Traversari et al., Immunogenetics 35: 145–152 (1992) beschrieben worden sind, bestimmt.
Die Ergebnisse, die in 1 gezeigt sind, zeigen, dass ein tumor rejection Antigen, das von MAGE-1 abgeleitet ist, von HLA-Cw*1601 präsentiert wird und von dem CTL-Klone 81/12 erkannt wird, während die Expression von MAGE-2 und MAGIE-3 nicht zur Präsentation des geeigneten Antigens führt.
Beispiel 4
Nach den oben diskutierten Experimenten wurde eine weitere Arbeit durchgeführt, um das Peptid, das HLA-Cw*1601 präsentierte, zu bestimmen.
MAGE-1-cDNA in dem Expressionsvektor pcDNA I/Amp wurde mit den Restriktionsendonukleasen NotI und SphI nach den Anweisungen des Herstellers und dann mit Exonuklease III verdaut. Diese Behandlung erzeugte eine Serie von fortschreitenden Deletionen der MAGE-1-cDNA, die am 3'Ende anfingen.
Die Delektionsprodukte wurden in pcDNAI/Amp rücklegiert und dann in dem E. coli Stamm DH5αF'IQ elektrophoretisch nach bekannten Techniken aufgetrennt. Die Transformanten wurden mit Ampicillin (50 μg/ml) selektiert, und man erhielt 600 Klone.
Die Plasmid-DNA wurde von jedem Klone entfernt und dann in COS-7-Zellen zusammen mit einem Vektor, der für HLA-Cw*1601 kodiert, transfiziert. Das verwendete Protokoll geht nach den oben beschriebenen Protokollen vor sich.
Die Transfektanten wurden dann in dem TNF-Freisetzungsassay, der in Beispiel beschrieben ist, getestet. Dieses erlaubt die Trennung von positiven und negativen Klonen. Der Vergleich zeigte, dass einer der positiven Klone Nukleotide 1-730 vom MAGE-1-Gen enthielt, während ein Negativklon die Nukleotide 1-706 enthielt. Die Sequenz der positiven und negativen Klone wurde verglichen, und ein Bereich von 16 Aminosäuren wurde als ein solcher identifiziert, der höchstwahrscheinlich das Antigenpeptid enthielt. Die Sequenz lautet folgendermaßen:
(SEQ ID NR: 2)
Auf der Basis dieser Sequenz wurde ein erster Satz von Experimenten durchgeführt, wo synthetische Peptide hergestellt wurden und auf ihre Fähigkeit getestet wurden, COS-7-Zellen, die mit HLA-Cw*1601 transfiziert sind, die Fähigkeit zu geben, die Lyse zu stimulieren. Ein positives 12-mer wurde identifiziert, das heißt:
(SEQ ID NR: 3)
Das Stumpfmachen dieses 12-mers führte zur Identifizierung des Nonapeptids
(SEQ ID NR :4) als bester Stimulator für die Lyse. Eine halbmaximale Lyse wurde bei Peptidkonzentrationen von 10 nMol beobachtet.
In Experimenten, die hier nicht gezeigt werden, die allerdings in der Serien-Nr. 08/196,630, eingereicht am 15. Februar 1994 aufgeführt sind, ist festgestellt worden, dass das Peptid
(SEQ ID NR :5) ebenfalls durch HLA-Cw*1601 präsentiert wird und von verschiedenen cytolytischen T-Zellklonen, wie CTL 82/82 lysiert wird.
Beispiel 5
Die Identifizierung von zwei getrennten Peptiden, die durch HLA-Cw*1601 präsentiert werden, zeigten an, dass ein Assay zur Bestimmung der Expression von HLA-Cw*1601 in Patienten gewünscht ist. Ein serologisches Testen ist keine favorisierte Möglichkeit, weil die Antikörper gegenüber HLA-Cw*1601 nicht verfügbar sind. Allerdings erbrachte die Polymerase-Kettenreaktion ("PCR") eine Alternative. Die Entwicklung eines realisierbaren geeigneten PCR-Assay für die Expression von HLA-Cw*1601 auf der Basis eines Satzes von Primersystemen wird nun nachfolgend dargestellt.
Das Modell, das im Allgemeinen von Browning et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2842 (1993) beschrieben wurde, wurde angewendet. Diese Referenz diskutiert die Verwendung von Oligonukleotidprimern, deren 3'-Enden für die Kodierungssequenz für das HLA-Molekül spezifisch sind. Mit diesem Methodenansatz wurden die Primer:
(SEQ ID NR: 6) und
(SEQ ID NR: 7) synthetisiert. Zum Austesten der Methode wurden verschiedene Zellproben von Patienten verwendet. Es wurde die gesamte RNA extrahiert unter Anwendung der gut bekannten Guanidinisothiocyanatmethode von Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (Elsevier, New York, 1986), S. 130. Für die cDNA-Synthese wurden 2 μg RNA mit Wasser und 4 μl 5 × reverse Transkriptasepuffer verdünnt. Es wurden 1 μl jeweils 10 mMol dNTP, 2 μl einer 20 μMol Lösung Oligo (dT), 20 U Rnasin, 2 μl 0,1 Mol Dithiothreit und 200 U MoMLV reverse Transkriptase in einem 20 μl Reaktionsvolumen hinzugegeben. Die Mischung wurde für 60 Minuten bei 42°C inkubiert. Zur Amplifizierung der cDNA wurde 1% der cDNA-Reaktion mit 5 μl 10 × thermostabilem DNA-Polymerasepuffer, 1 μl jeweils 10 mMol dNTP, 0,5 μl jeweils 80 μMol Lösung von Primern (SEQ ID NR: 6 und 7), 1U DynaZyme und Wasser bis zu einem Endvolumen von 50 μl ergänzt. Die PCR wurde 30 Zyklen lang (1 Minute bei 95°C, 1 Minute bei 62°C, 2 Minuten bei 72°C) durchgeführt. Die Produkte wurden auf 1/500 verdünnt. Dann wurde eine zweite PCR mit 1 μl verdünntem PCR-Produkt, das mit 5 μl 10 × thermostabilem DNA-Polymerase-pulver, 1 μl jeweils 10 mMol dNTP, 0,5 μMol jeweils einer 80 μMol-Lösung der Primer:
(SEQ ID NR: 8) und
(SEQ ID NR: 9) und 1U DynaZyme ergänzt war, durchgeführt. SEQ ID NR: 8 und SEQ ID NR: 9 stellen Nukleotidsequenzen dar, die sich intern am ersten Satz der Primer, das heißt, SEQ ID NRN: 6 und 7 befinden. Es wird Wasser bis auf 50 μl hinzugegeben, und es wurden 20 Zyklen PCR durchgeführt (eine Minute 95°C; eine Minute bei 65°C; zwei Minuten bei 72°C). Die PCR-Produkte wurden dann auf einem 1,5% Agarosegel in TAE-Puffer der Größe nach fraktioniert.
Diese Methode wurde in zwei getrennten Sätzen von Experimenten angewendet. Bei dem ersten wurden Transfektanten, die wie oben beschrieben, hergestellt und mit cytolytischen T-Zellklonen gegenüber entweder SEQ ID NR: 4 oder SEQ ID NR: 5, die an ein HLA-Molekül komplexiert sind, lysiert wurden, getestet. Es wurde festgestellt, dass alle positiven Transfektanten das HLA-Cw*1601-Molekül auf ihren Oberflächen präsentierten. Jede Probe, die keine PCR-Produkte hervorbrachte, wurde als negativ angesehen. In weiteren Experimenten mit den negativen Proben wurde das oben verwendete PCR-Protokoll ein zweites Mal verwendet, allerdings basierten die Primer auf Sequenzen, die allen HLA-C-Sequenzen gemeinsam waren. Es wird hierzu auf Zemmour et al., J. Exp. Med. 176: 937 (1992) verwiesen. Es hat sich herausgestellt, dass die Negativproben Zellen waren, die andere das heißt, nicht HLA-Cw*1601 HLA-C-Subtypen exprimierten.
Beispiel 6
In dem zweiten Satz der Experimente wurde die Fähigkeit der Zellen, entweder PBL oder Tumor, Peptide über HLA-Cw*1601 zu präsentieren, getestet. Dafür wurden Zellen, die von Patienten entnommen wurden, in Hank's Lösung gewaschen und bei 5 × 10⁶ Zellen/ml resuspendiert. Sie wurden dann fixiert, indem sie für 10 Minuten bei Raumtemperatur mit 1% Paraformaldehyd behandelt wurden. Nach der Fixierung wurden sie zweimal in Hank's-Lösung gewaschen und in Isocove-Medium mit hinzugefügtem 10 %igem humanen Serum resuspendiert.
Die Zellen wurden dann in 96 V-Bodenlöchern bei entweder 3 × 10⁴ PBLs oder 1 × 10⁴ Tumorzellen verteilt und mit verschiedenen Peptidkonzentrationen versetzt. Nach zwei Stunden Inkubation bei 37°C wurden die Zellen zwei Mal gewaschen, bevor CTLs (1.500, 100 μl Isocove-Medium, 10 s Humanserum, 20 U/ml rekombinantes humanes IL-2) hinzugefügt worden sind, und die TNF-Freisetzung aus WEHI-164-Zellen wurde gemessen. Hierzu wird beispielsweise auf Traversari et al., Immunogenetics 35: 145 (1992) verwiesen, worauf hier insbesondere für Einzelheiten des Assays Bezug genommen wird. Die Effektorzellen in dem Assay waren von CTL 82/35.
Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst. TNF wurde nur in Gegenwart von Zielzellen, die von Patienten stammten, die positiv auf HLA-Cw*1601 auf der Basis des oben aufgeführten PCR-Assays, die mit Peptid versetzt worden sind, getestet worden waren, produziert.
Die in Tabelle 1 zusammengefassten Experimente verwendeten Zellen, die mit Glutaraldehyd fixiert worden waren, mit dem Peptid gepulst worden waren, und dann im Hinblick auf die Erkennung von der cytolytischen T-Zelllinie CTL 82/35 getestet worden waren. Wie die Tabelle zeigt, wurde TNF nur in Gegenwart der Peptid gepulsten Zielzellen produziert, die positiv auf HLA-Cw*1601 in dem oben diskutierten PCR Assay getestet worden waren.
Tabelle 1
Beispiel 7
Etwa 8% der Proben (7 von 99) waren für diesen HLA-Typ positiv, und fünf der Positiven wurden auf die CTL-Lyse wie oben beschrieben, getestet. Alle lösten Lysen aus, was in Tabelle 1 aufgeführt ist. Im Gegensatz dazu lösten Proben von vier Patienten, die nicht positiv auf HLA-Cw*1601 waren, keine Lyse durch CTLs aus.
Beispiel 8
In einem anderen Experiment wurden MZ2 Lymphoplastoidzellen, die mit dem Epstein Barr Virus infiziert waren, in einem ⁵¹Cr-Freisetzungsassay verwendet. Die infizierten Zellen, die als "MZ2-EBV" bezeichnet waren, wurden mit ⁵¹Cr markiert und dann für 30 Minuten in Gegenwart des MAGE-1 Peptids bei Konzentrationen im Bereich von 1 bis 5.000 nMol inkubiert. Die CTLs (entweder CTL 81/12 oder CTL 82/35) wurden bei einem Verhält nis von Effektor/Ziel von 3 : 1 hinzugegeben. Die Chromfreisetzung wurde nach vier Stunden gemessen.
Die Ergebnisse sind in den 2A und 2B gezeigt, die die Lyse mit CTL 81/12 (2A) und CTL 82/35 (2B) zeigen. Die Pfeile bedeuten den Grad der Lyse von MZ2-MEL 43(B⁺) und MZ2 Lymphoplastoidzellen (B^–), die ohne Peptide inkubiert sind.
Die oben aufgeführten Experimente lassen vermuten, dass ein Peptid mit einem bestimmten Bindungsmotiv für die Bindung an HLA-Cw*1601 erforderlich ist. Peptide dieser Formel, das heißt:
Xaa Ala (Xaa)₆ Leu
(SEQ ID NR: 10) sind ein Merkmal der Erfindung. In SEQ ID NR: 10 bezieht sich Xaa auf jede Aminosäure, mit den folgenden Präferenzen:
Ala oder Ser bei Position 1
Tyr oder Arg bei Position 3
Gly oder Ala bei Position 4
Glu oder Val bei Position 5
Pro oder Phe bei Position 6
Arg oder Leu bei Position 7
Lys oder Ala bei Position 8
Isolierte Peptide dieser Formel sind beispielsweise bei der Diagnose von Krebs von Nutzen, was nun erklärt werden wird. Es ist, wie man von den hier zitierten Referenzen weiß, bekannt, dass Patienten cytolytische T-Zellen gegen ihre eigenen Tumore entwickeln. Für HLA-Cw*1601 positive Patienten erkennen diese cytolytischen T-Zellen jede Zelle, die Komplexe aus HLA-Cw*1601 und ein Peptid der Formel in SEQ ID NR: 10, insbesondere SEQ ID NR: 4 oder SEQ ID NR: 5 präsentieren, und reagieren damit. Die Erkennung kann über die TNF-Freisetzung durch die CTLs, Proliferation der CTLs und/oder Freisetzung irgendeines Mittels, das in den Zielzellen enthalten ist, beispielsweise radioaktives Chrom (⁵¹Cr) überwacht werden. Deswegen steht in einem Aspekt der Erfindung eine Blutprobe von einem Patienten, die PBLs enthält, im Kontakt mit den HLA-Cw*1601 präsentierenden Zellen. Diese Zellen werden, z. B. durch Pulsen mit einem Peptid gemäß SEQ ID NR: 10 in Kontakt gebracht. Dieser Peptidkomplex mit den HLA-Cw*1601-Molekülen und jede CTL in der PBL enthaltenden Proben reagieren damit. Demzufolge ist ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ein diagnostischer Assay für die Bestimmung von tumorspezifischen CTLs, wobei festgesetzt worden ist, dass nur Tumorzellen TRAB, die von MAGE abgeleitet sind, präsentieren. Die einzige Ausnahme scheinen Hodenzellen zu sein, allerdings ist es eine einfache Sache, die Möglichkeit ohne weiteres auszuschließen, dass die CTLs im Blut des Patienten mit Hodenzellen reagieren. Man kann ebenfalls eine HLA-Cw*1601 positive Zelle mit einem MAGE-Gen, z. B. MAGE-1 transfizieren, um die gewünschten Komplexe herzustellen.
In einem anderen Aspekt der Erfindung können die hier beschriebenen Peptide allein oder im Komplex an Trägerproteine verwendet werden und dann als Immunogene eingesetzt werden. Diese Immunogene können allein oder bevorzugt mit einem pharmazeutisch annehmbaren Adjuvans eingesetzt werden. Die Antikörper sind auch in diagnostischen Assay dafür geeignet, zu bestimmen, ob und wenn die speziellen Peptide auf den Zellen präsentiert werden. Somit ist eine solche Präsentation wieder ein Indiz für Krebs.
Die isolierten Nukleinsäuremoleküle der Erfindung sind ebenfalls, wie bereits gezeigt worden, als Sonden für die Bestim mung der Expression von HLA-Cw*1601 geeignet. Es braucht kaum gesagt werden, dass die HLA-Typisierung wichtig ist, beispielsweise bei der Gewebetypisierung für die Transplantation und auf anderen Gebieten. Es ist daher nützlich, verfügbare Materialien, die in diesem Zusammenhang verwendet werden können, vorliegen zu haben. Die bei der PCR-Arbeit verwendeten Primer können allein oder in Kombination in Amplifizierungsassays, wie bei der Polymerase-Kettenreaktion, eingesetzt werden. Sie können ebenfalls, wenn sie markiert sind, beispielsweise radioaktiv oder nicht-radioaktiv, als Sonden für die Bestimmung, ob HLA-Cw*1601 exprimiert wird oder nicht, in anderen diagnostischen Assays eingesetzt werden. Demzufolge können Kombinationen aus zwei oder mehreren der SEQ ID NRN: 6, 7, 8 und 9 in "Eintopf"- oder Kitformen als diagnostische Reagenzien eingesetzt worden. Eine Kitform ist ausdrücklich bevorzugt, worin separate Portionen von SEQ ID NRN: 6 und 7 und SEQ ID NRN: 8 und 9 in einem Verpackungsmittel zur Verwendung für die Amplifizierung oder anderen Formaten vorliegen. Die Kits können ebenfalls Polymerasen, wie die Taq-Polymerase in spezifischen Ausführungsformen umfassen.
Die vorangegangenen Experimente zeigen, dass HLA-Cw*1601 ein von MAGE-1 stammendes Peptid als tumor rejektion Antigen präsentiert, was zur Lyse der präsentierenden Zellen führt. Es gibt für diese Feststellung, wie bereits diskutiert wurde, weitere Verästelungen. Beispielsweise ist der CTL-Klon 81/12 für CTLs, die spezifisch für den hier gefragten Komplex ist, repräsentativ. Die Verabreichung dieser CTLs an einen Patienten soll therapeutisch nützlich sein, wenn der Patient einen HLA-Cw*1601-Phänotyp auf abnormen Zellen präsentiert. Es liegt innerhalb der Routine des Fachmanns, in vitro die notwendigen CTLs zu entwickeln. Insbesondere wird eine Zellprobe, wie Blutzellen, mit einer Zelle, die den Komplex präsentiert und in der Lage ist, ein spezifisches CTL für die Proliferation hervorzurufen, in Kontakt gebracht. Die Zielzelle kann ein Transfektant, wie eine COS-Zelle des oben beschriebenen Typs sein. Diese Transfektanten präsentieren den gewünschten Komplex auf ihrer Oberfläche und bei der Kombination mit einem CTL von Interesse stimulieren sie seine Proliferation. Es ist herausgestellt worden, dass die Sequenz für HLA-Cw*1601 im Stand der Technik durch GENBANK und EMBL bekannt ist, und die Sequenz für MAGE-1 zusammen mit einem detaillierten Protokoll für seine Isolierung von der PCT-Anmeldung und Van den Bruggen et al., zur Verfügung gestellt wird. COS-Zellen, solche, die hier verwendet werden, sind im großen Umfang verfügbar, wie andere geeignete Wirtszellen auch.
Hinsichtlich Einzelheiten der therapeutischen Methodik, die als adoptive Übertragung (Greenberg, J. Immunol. 136(5): 1917 (1986); Riddel et al., Science 257: 238 (7-10-92); Lynch et al., Eur. J. Immunol., 21: 1403–1410 (1991); Kast et al., Cell 59: 603–614 (11-17-89)) bezeichnet wird, werden Zellen, die den gewünschten Komplex präsentieren, mit CTLs kombiniert, was zur Proliferation der CTLs, die spezifisch dazu sind, führt. Die proliferierten CTLs werden dann an ein Individuum mit einer Zellenabnormität, die durch abnorme Zellen, die den bestimmten Komplex präsentieren, charakterisiert sind, verabreicht. Die CTLs lysieren dann die abnormen Zellen und erreichen somit das gewünschte therapeutische Ziel.
Die vorangegangene Therapie setzt voraus, dass die abnormen Zellen des Patienten, den Peptidkomplex, der von HLA-Cw*1601/MAGE-1 abgeleitet ist, präsentieren. Dieses kann sehr einfach bestimmt werden. Beispielsweise werden die CTLs mit den oben diskutierten Transfektanten identifiziert, und wenn sie einmal isoliert sind, können sie mit einer Probe der abnormen Zellen des Patienten verwendet werden, um in vitro die Lyse zu bestimmen. Wenn eine Lyse beobachtet wird, dann die Verwendung spezifischer CTLs in dieser Therapie den Zustand, der mit den abnormen Zellen verbunden ist, lindern. Eine weniger eingesetzte Methodik untersucht die abnormen Zellen auf die HLA-Phänotypisierung unter Anwendung von Standardassays und bestimmt die Expression von MAGE-1 über die Amplifizierung unter Anwendung von z. B. PCR.
Die adoptive Übertragung ist nicht die einzige Therapieform, die erfindungsgemäß verfügbar ist. CTLs können ebenfalls in vivo unter Anwendung einer Vielzahl von Methoden hervorgerufen werden. Ein Methodenansatz, das heißt, die Verwendung von nicht-proliferativen Zellen, die den Komplex exprimieren, ist oben ausgearbeitet worden. Die in dieser Methode verwendeten Zellen können solche sein, die normalerweise den Komplex exprimieren, wie bestrahlte Melanomzellen oder Zellen, die mit einem oder beiden Genen, die für die Präsentation des Komplexes notwendig sind, transfiziert sind. Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 110–114 (January, 1991) zeigen diese Methode, wobei die Verwendung von transfizierten Zellen, die HPVE7-Peptide in einem therapeutischen Konzept exprimieren, zeigt. Verschiedene Zelltypen können verwendet werden. In ähnlicher Weise können Vektoren, die ein oder beide Gene von Interesse tragen, eingesetzt werden. Virale oder bakterielle Vektoren sind insbesondere bevorzugt. In diesen Systemen wird das Gen von Interesse beispielsweise von einem Vaccinia Virus oder dem Bakterium BCG getragen, und die Materialien "infizieren" de facto die Wirtszellen. Die Zellen, die entstehen, präsentieren den Komplex von Interesse und werden von autologen CTLs erkannt, die dann proliferieren. Ein ähnlicher Effekt kann durch Kombination von MAGE-1 selbst mit einem Adjuvans erreicht werden, um die Inkorporation in die HLA-Cw*1601 präsentierenden Zellen zu erleichtern. Das Enzym wird dann verarbeitet und ergibt dann den Peptidpartner des HLA-Moleküls.
Die vorangegangene Diskussion betrifft "abnorme Zellen" und "Zellabnormitäten". Diese Ausdrücke werden in ihrer breitesten Interpretation angewendet und beziehen sich auf jede Situation, wo die in Frage kommenden Zellen mindestens eine Eigenschaft aufweisen, die anzeigt, dass sie sich von normalen Zellen ihres spezifischen Typs unterscheiden. Beispiele für abnorme Eigenschaften schließen morphologische und biochemische Änderungen ein. Zum Beispiel umfassen Zellabnormalitäten Tumore, wie Melanom, Autoimmunerkrankungen usw.
Andere Aspekte der Erfindung sind für den Fachmann klar und deutlich und brauchen hier nicht wiederholt zu werden.
Die Fachausdrücke und die anderen Ausdrücke, die vorliegend verwendet worden sind, werden als Ausdrücke für die Beschreibung und nicht zum Zwecke der Einschränkung darauf verwendet, und es ist überhaupt nicht bei der Verwendung dieser Fachausdrücke und Ausdrücke beabsichtigt, irgendwelche Äquivalente von Merkmalen, die gezeigt und beschrieben sind, oder gar Teile davon auszuschließen, wobei auch zu erkennen ist, dass verschiedene Modifikationen innerhalb des Umfangs der Erfindung möglich sind.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes Nukleinsäuremolekül, das zur Bestimmung der Expression von HLA-Cw*1601 geeignet ist und aus der Gruppe gewählt ist, die aus SEQ ID NR: 6, SEQ ID NR: 7, SEQ ID NR: 8 und SEQ ID NR: 9 besteht.
Kit, das für die Bestimmung der Expression von HLA-Cw*1601 geeignet ist und folgendes aufweist: (a) ein erstes Reagenz, das SEQ ID NR: 6 und SEQ ID NR: 7 enthält; (b) ein zweites Reagenz, das SEQ ID NR: 8 und SEQ ID NR: 9 enthält; und (c) ein Verpackungsmittel zum Halten des ersten und zweiten Reagenz.
Kit nach Anspruch 2, das weiterhin eine separate Menge einer Polymerase umfasst.
Substanzzusammensetzung, die zur Bestimmung der Expression von HLR-Cw*1601 in einer Probe geeignet ist und folgendes umfasst: (a) eine Mischung aus SEQ ID NR: 6 und SEQ ID NR: 7 oder; (b) eine Mischung aus SEQ ID NR: 8 und SEQ ID NR: 9.
Verfahren zur Identifizierung eines Kandidaten zur Behandlung mit einem therapeutischen Mittel, das für Kom plexe von HLA-Cw*1601 und für das Peptid von SEQ ID NR: 4 spezifisch ist, welches folgende Schritte aufweist: (i) Bestimmen der Expression von HLA-Cw*1601 in einem Individium nach einem Verfahren, bei dem ein Molekül nach Anspruch 1 verwendet wird, mit einem Kit nach Anspruch 2 oder 3 oder mit einer Substanzzusammensetzung nach Anspruch 4, (ii) Inkontaktbringen einer abnormen Zellprobe von diesem Individium mit einer cytolytischen T-Zelle, die für diese Komplexe spezifisch ist, und (iii) Bestimmen der Lyse von mindestens einem Teil dieser abnormen Zellprobe als Hinweis auf einen Kandidaten für diese Behandlung.
Zusammensetzung, die mindestens ein Mittel, das eine cytolytische T-Zellen-Antwort auf Zellen, die Komplexe von HLA-Cw*1601 und das Peptid von SEQ ID NR: 4 auf ihren Oberflächen präsentieren, hervorruft, die dafür ausreicht, eine Antwort auf abnorme Zellen, die diese Komplexe auf ihren Oberflächen präsentieren, hervorzurufen.
Zusammensetzung nach Anspruch 6, worin diese Zellabnormalität Krebs ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 7, worin der Krebs ein Melanom ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 6, 7 oder 8, worin das Mittel einen Vektor umfasst, der für das Peptid von SEQ ID NR: 4 codiert.
Zusammensetzung nach Anspruch 9, worin das Mittel weiterhin einen Vektor umfasst, der für HLA-Cw*1601 codiert.
Zusammensetzung nach Anspruch 9, worin der Vektor ebenfalls für HLA-Cw*1601 codiert.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 6 bis 10, worin das Mittel eine Probe von nicht proliferativen Zellen ist, die diese Komplexe auf ihren Oberflächen präsentieren.
Zusammensetzung, die eine Menge von cytolytischen T-Zellen, die für Komplexe von SEQ ID NR: 4 und HLA-Cw*1601 spezifisch sind, umfasst, die dafür ausreicht, eine therapeutische Wirkung auszuüben.
Zusammensetzung nach Anspruch 13, worin diese cytolytischen T-Zellen autolog sind.
Isolierte cytolytische T-Zelle, die für einen Komplex von HLA-Cw*1601 und das Peptid von SEQ ID NR: 4 spezifisch ist.
Verfahren zur Identifizierung einer abnormen Zelle, die auf ihrer Oberfläche einen Komplex aus HLA-Cw*1601 und dem Peptid von SEQ ID NR: 4 präsentiert, wobei eine Probe mit abnormen Zellen mit einer cytolytischen T-Zelle, die für diesen Komplex spezifisch ist, in Kontakt gebracht wird und die Lyse dieser abnormen Zellen als Bestimmung von Zellen, die diesen Komplex präsentieren, bestimmt wird.
Isoliertes Peptid, das aus der Gruppe gewählt ist, die aus folgendem besteht: SEQ ID NR: 2, SEQ ID NR: 3 und SEQ ID NR: 4.
Isolierter Komplex aus HLA-Cw*1601 und dem isolierten Peptid von SEQ ID NR: 4.
Isoliertes Nonapeptid der Formel:
(SEQ ID NR: 10) worin Xaa jede Aminosäure ist und mindestens zwei der folgenden Bedingungen erfüllt sind: Position 1 ist Ser, Position 3 ist Tyr, Position 4 ist Gly, Position 5 ist Glu, Position 6 ist Pro, Position 7 ist Arg und Position 8 ist Lys und welches Nonapeptid in der Lage ist, an HLA-Cw*1601 zu binden.
Immunogene Zusammensetzung, die das isolierte Nonapeptid von Anspruch 19 und ein pharmazeutisch annehmbares Adjuvans umfasst.
Immunogene Zusammensetzung nach Anspruch 20, worin das isolierte Nonapeptid mit einem Trägerprotein komplexiert ist.
Immunogene Zusammensetzung nach Anspruch 20 oder 21 für die Anwendung in der Therapie.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 6 bis 14, eine isolierte cytolytische T-Zelle nach Anspruch 15 oder ein isoliertes Peptid nach Anspruch 17 oder 19 für die Anwendung bei der Behandlung eines Individiums mit einer Zellenabnormalität.
Isolierte cytolytische T-Zelle nach Anspruch 15 oder isoliertes Peptid nach Anspruch 17 oder 19 für die Anwendung in der Diagnose.
Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 6 bis 14, einer isolierten cytolytischen T-Zelle nach Anspruch 15, eines isolierten Peptids nach Anspruch 17 oder 19 für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Individiums mit einer Zellenabnormalität.
Verwendung nach Anspruch 25, worin die Zellenabnormalität Krebs ist.
Verwendung nach Anspruch 26, worin der Krebs ein Melanom ist.