DE69433342T2

DE69433342T2 - Methode zur markierung von eukaryotischen zellen mittels verwendung von rezeptoren der zelloberfläche als marker

Info

Publication number: DE69433342T2
Application number: DE69433342T
Authority: DE
Inventors: Claudio Bordignon; Fulvio Mavilio
Original assignee: Roche Diagnostics GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1993-09-01
Filing date: 1994-08-11
Publication date: 2004-09-09
Anticipated expiration: 2014-08-12
Also published as: DK0724634T3; WO1995006723A1; PT724634E; CA2170757C; ITRM930587A1; ATE254660T1; EP0724634A1; IT1261847B; ITRM930587A0; US6074836A; ES2210260T3; EP0724634B1; IL147557A; CA2170757A1; IL110815A0; JP2781276B2; JPH09501569A; DE69433342D1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Markierung eukaryotischer (Säuger-)Zellen durch Verwendung eines Zelloberflächenrezeptors mit einer modifizierten intrazellulären Domäne als selektierbarer Marker.
Die Identifizierung von Zellen, in die eine DNA-Sequenz erfolgreich eingebracht wurde, ist ein wesentlicher Schritt in der rekombinanten DNA-Technologie. Da die DNA-Sequenz, die eingeführt wird, nicht notwendigerweise zu einem Phänotyp führt, der auf einfache Weise selektiert werden könnte, wird normalerweise eine zusätzliche DNA-Sequenz eingeführt, die für einen selektierbaren Phänotyp kodiert. Noch immer gibt es nur eine sehr beschränkte Zahl von solchen selektierbaren Markergenen zur Verwendung in der rekombinanten DNA-Technologie von eukaryotischen Zellen. Die meisten dieser zur Verfügung stehenden Markergene wie z. B. die Herpes simplex-Virus Typ 1 Thymidinkinase (Wigler et al., Cell 1 (1977) 223) oder Hypoxanthinphosphoribosyltransferase (Jolly et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 80 (1983) 477) entsprechen Genen oder sind stark verwandt mit Genen, die in der Mehrzahl von normalen Zellen konstitutiv exprimiert werden oder mit solchen Genen identisch sind.
Daher können diese Markergene nur in speziellen mutierten Zellen verwendet werden, die das entsprechende Gen nicht exprimieren. Auf der anderen Seite sollte ein bevorzugtes Markergen nicht in der Mehrzahl von Säugerzellen exprimiert werden oder wenigstens nicht in bestimmten Geweben oder Zelltypen exprimiert werden, so dass sie als selektierbare Markergene in der rekombinanten DNA-Technologie verwendet werden können, die diese Zellen einbezieht.
Pawlink et al. haben die Verwendung des CD24-Zelloberflächenantigens als einen dominanten selektierbaren Marker in retroviral vermitteltem Gentransfer beschrieben (Journal of Cellular Biochemistry, Supplement 17 E, Seite 203, Zusammenfassung S210). Mit diesem Marker konnten NIH-3T3-Fibroblasten, BAF-3-B-Zellvorläuferzellen als auch Knochenmarkszellen der Maus durch retrovirale Infektion markiert werden, und die markierten Zellen wurden durch Analyse mit fluoreszenzaktivierter Zellsortierung detektiert. Da jedoch das CD24-Zelloberflächenantigen normalerweise auf einigen Säugerzellen exprimiert wird, ist die Verwendung dieses Markers durch die Schwierigkeit beschränkt, zwischen Zellen, die normalerweise das CD24-Zelloberflächenantigen exprimieren und Zellen, die mit diesem Marker markiert sind, zu unterscheiden.
Außerdem wurde gefunden, dass das CD24-Zelloberflächenantigen nach der heterologen Expression auf der Zelloberfläche nur in einem geringen Ausmaß präsentiert wird.
Die Europäische Patentanmeldung EP 0 455 460 beschreibt das thyrosinkinasenegative trkB-Protein, das ein Zelloberflächenrezeptor ist, dem eine katalytische Thyrosinkinasedomäne fehlt und die daher kein trkB-Signal in den Zellen auslöst. EP 0 455 460 beschreibt die Isolierung und Identifizierung dieses Rezeptors.
Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Markierung einer eukaryotischen (Säuger-)Zelle durch Exprimieren einer Nukleinsäure in dieser Zelle, wobei die Nukleinsäure für einen Zelloberflächenrezeptor kodiert, und durch Präsentieren des Rezeptors auf der Zelloberfläche, gekennzeichnet durch die Verwendung einer Nukleinsäure, in welcher die Region kodierend für die intrazelluläre Domäne des Rezeptors derartig vollständig oder teilweise deletiert oder modifiziert wird, dass der auf der Oberfläche präsentierte Rezeptor nach Bindung an seinen Bindungspartner keine Signaltransduktion bewirken kann.
Vorzugsweise wird die intrazelluläre Domäne vollständig deletiert, oder einzelne Nukleotide werden modifiziert.
Vorzugsweise wird eine Nukleinsäure kodierend den NGF-, CD24- oder den LDL- Rezeptor verwendet.
Die Sequenz des humanen NGF-Rezeptors, der im Folgenden als "Rezeptor für den Wachstumsfaktor mit niedriger Affinität (low affinity nerve growth factor receptor, LNGFR)" bezeichnet wird, ist in D. Johnson, Cell 47 (1986) 545–554 beschrieben. Vorzugsweise wird eine Nukleinsäure verwendet, in der die DNA-Region kodierend die Aminosäuren 245 (beginnend mit Nukleotid 930) bis zum C-Terminus deletiert wurde (vergleiche SEQ ID NO: 1).
In SEQ ID NO: 1 wird die extrazelluläre Domäne durch die Nukleotide 114(ATG)-863 kodiert, die Transmembrandomäne wird durch die Nukleotide 864–929 kodiert und die intrazelluläre Domäne wird durch die Nukleotide 930–1394 kodiert (Reddy et al., Molecular Brain Research 8 (1990) 137–141).
Es ist möglich, für die Deletion der intrazellulären Domäne die vollständige Domäne oder nur einen funktionellen Teil zu deletieren, so dass der auf der Oberfläche präsentierte Rezeptor nach Bindung an seinen Bindungspartner keine Signaltransduktion bewirken kann. Es ist z. B. möglich, die Nukleotide 943–1512 durch Restriktion mit PvuIII und SstI zu deletieren.
Die Nukleinsäure kann in die Zielzelle z. B. durch einen viralen Vektor (vorzugsweise einen Retrovirus) mittels Lipofektion oder Elektroporation eingebracht werden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine DNA, die ein modifiziertes LNGFR kodiert und die in SEQ ID NO: 1 dargestellt ist, als auch eine eukaryotische Zelle, die eine derartige Nukleinsäure enthält.
Eine Nukleinsäure dieses Typs kann verwendet werden, um einen derartig modifizierten Zelloberflächenrezeptor zu exprimieren und den Rezeptor auf der Zelloberfläche zu präsentieren, derartig, dass der Rezeptor als ein selektierbarer Marker für transfizierte eukaryotische Zellen verwendet werden kann.
Die DNA, die einen Rezeptor oder ein Derivat davon kodiert, wird in einen eukaryotischen Expressionsvektor durch im Stand der Technik bekannte Verfahren eingebracht. Geeignete Expressionsvektoren sind dem Fachmann bekannt, vorzugsweise werden retrovirale Vektoren verwendet. Ebenso können andere virale Vektoren gemäß dem Stand der Technik für den Transfer der Rezeptor-DNA verwendet werden (z. B. Herpesviren, Adenoviren, Vakziniaviren). Mit einem bestimmten Retrovirustyp, den sogenannten Doppelkopienvektoren (Yu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 83 (1986) 3194–3198), wurde eine große Häufigkeit des rearrangierten Provirus und ein signifikant niedrigerer Virustiter beobachtet. XSN-Vektorviren (Bio-Techniques 7 (1989) 980–990) sind bevorzugt.
Die rekombinanten eukaryotischen Expressionsvektoren werden dann in eine eukaryotische Wirtszelle eingebracht, entweder alleine für ein Genmarkierungsprotokoll oder in Kombination mit einer weiteren DNA, die transduziert werden soll, die aber keinen selektierbaren Phänotyp hat. Das Einbringen der DNA in die Wirtszelle wird durch Methoden zur viralen Infektion ausgeführt, die im Stand der Technik bekannt sind. Des Weiteren kann der Transfer des Rezeptorgens ebenso durch Verwendung nichtviraler Transfermethoden erzielt werden (z. B. Elektroporation, liposomaler Transfer, Kalziumpräzipitation). Zellen, die die exogene DNA enthalten, können dann durch ihre Fähigkeit, einen Rezeptor in großen Mengen zu produzieren, erkannt werden. Rekombinante eukaryotische Zellen, die eine erfindungsgemäße DNA kontrollieren, können noch leichter durch ihre Fähigkeit detektiert werden, ein Derivat des Rezeptors zu produzieren.
Die Rezeptormarkierung der eukaryotischen Zellen, die wie oben beschrieben erhalten wurde, erlaubt eine leichte Selektion und Trennung von solchen Zellen durch Verwendung von Antikörpern, die an den verwendeten Rezeptor binden. Derartige Antikörper sind im Stand der Technik bekannt und z. B. von A. Ross et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. 81 (1984) 6681–6685, EP-A 0 202 055) beschrieben. Außerdem können Antikörper gegen die Rezeptoren durch Verfahren, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, erhalten werden, indem ein Tier mit einem Protein, das durch erfindungsgemäße DNA kodiert wird, immunisiert wird, und Isolieren der Antikörper aus dem Serum des immunisierten Tieres, oder indem Milzzellen des immunisierten Tieres mit immortalen Zellen wie z. B. einer Myeloma-Zelllinie der Maus fusioniert werden, um monoklonale Anitkörper zu erhalten. Diese Antikörper können durch Verfahren, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, markiert werden (wie z. B. in J. H. Peters beschrieben, Monoklonale Antikörper, Springer-Verlag, 2. Auflage, 1988, Seiten 285–315). Geeignete Marker sind Enzyme, Fluoreszenz- oder Chemilumineszenzfarbstoffe.
Es ist möglich, die markierten Zellen durch Immunoselektion zu isolieren, indem eine derartige Nukleinsäure in eine eukaryotische Zelle eingebracht wird. Zu diesem Zweck werden transfizierte Zellen identifiziert, mit einem markierten Antikörper selektiert, der spezifisch an den verwendeten erfindungsgemäßen Rezeptor bindet, und isoliert, indem der Antikörper/Zellkomplex gespalten wird.
Durch Verwendung eines immobilisierten Antikörpers anstatt eines markierten Antikörpers können transfizierte Zellen selektiert werden. Daher wird die feste Phase mit dem immobilisierten Antikörper gegen den Rezeptor als Matrix in der Affinitätschromatographie verwendet. Nach der Trennung von nichttransfizierten Zellen, die den Rezeptor nicht exprimieren, werden gebundene Zellen z. B. kultiviert und dann auf Petrischalen über Nacht vermehrt.
Die oben beschriebenen Verfahren sind als diagnostische Werkzeuge für die Identifizierung von Zellen besonders wichtig, die in einen Säugerorganismus durch Gentherapieprotokolle eingebracht wurden. Für einige Anwendungen wie z. B. Knochenmarkstransplantationen ist es von diagnostischem Wert, zwischen Zellen zu unterscheiden, die aus der Knochenmarkstransplantation stammen und Zellen, die sich von verbleibenden Zellen des Wirts ableiten. In diesem Falle werden Knochenmarkszellen transplantiert, die DNA enthalten, die für den Rezeptor kodiert, um diese Zellen mit einem Zelloberflächenmarker auszustatten. Vorzugsweise werden Vorläufer- oder Stammzellen transplantiert, die gemäß dem Stand der Technik angereichert wurden (z. B. immobilisierte Anti-CD34-Antikörper) und die das erfindungsgemäße Gen enthalten. Nach der Transplantation können Zellen, insbesondere möglicherweise auftretende Tumorzellen unterschieden werden, ob sie sich von transplantierten Zellen oder verbleibenden Zellen des Wirtsorganismus ableiten.
Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform ist daher die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Immunoselektion von transfizierten Zellen zur diagnostischen Identifizierung von Zellen, die durch Einbringen einer DNA kodierend einen Rezeptor, insbesondere einer erfindungsgemäßen DNA, markiert wurden.
Die Hauptanwendung der Markierung von Blutzellen/Knochenmarkszellen mit den beschriebenen modifizierten Rezeptoren ist die Beobachtung von Zellen von autologen und ebenso von allogenen Transplantaten. Bei der Behandlung von Leukämien und Lymphomen ist es oft notwendig, die Patienten mit einer sublethalen Dosis von zytostatischen Pharmazeutika oder mit vergleichbaren Dosen von Strahlung oder mit Kombinationen davon zu behandeln. Um die Knochenmarksfunktion wiederherzustellen, wird den Patienten entweder autologes Knochenmark reimplantiert, das vor der Behandlung explantiert wurde, oder allogenes Mark von einem Spender mit übereinstimmendem HLA wird implantiert.
Im Falle einer autologen Knochenmarkstransplantation könnte die Kontamination mit Tumorzellen im reimplantierten Material zu einem Tumorrückfall führen. Reinigungsmethoden, um das Mark von Tumorzellen zu reinigen (klonogene Tumorzellen) werden eingesetzt, aber diese Techniken sind gegenwärtig nicht zuverlässig. Im Falle eines Rückfalls ist es natürlich nicht möglich, zwischen diesen möglicherweise kontaminierenden Tumorzellen und einem Rückfall aufgrund von verbleibenden Zellen nach der Behandlung zu unterscheiden. Im Falle von allogenen Knochenmarkstransplantationen ist die Abstoßung des allogenen Marks das Hauptproblem. Reinigungstechniken sind in E. M. Areman et al. beschrieben: Bone Marrow and Stem Cell Processing: A Manual of Current Techniques, F. A. Davies Co., Philadelphia (1992), welches hier durch die Referenz eingefügt wird.
Die Erfindung umfasst weiterhin ein Verfahren zur Präparation einer hematopoietischen Zellpräparation (z. B. Knochenmark oder mobilisierte periphere Blutvorläuferzellen und/oder Stammzellen), wobei die Zellen mit einem Zelloberflächenrezeptor markiert sind und wobei die Zellpräparation im Wesentlichen frei von klonogenen Tumorzellen ist, durch Reinigung unter Verwendung zytotoxischer Mittel oder Strahlung, durch Transduzieren von den Zellen mit einer Nukleinsäure, welche für einen Zelloberflächenrezeptor kodiert und in welcher vorzugsweise die Region kodierend für die intrazelluläre Domäne derartig vollständig oder teilweise deletiert oder modifiziert wurde, dass die Domäne im Wesentlichen nicht länger eine Signaltransduktion bewirken kann, und durch Separieren der transduzierten von nicht-transduzierten Zellen. Die Separation wird vorzugsweise durch Inkubieren der Zellen mit einem Antikörper gegen den Rezeptor ausgeführt, der vor oder nach der Inkubation immobilisiert wird, durch Separieren der durch den Antikörper immobilisierten Zellen von ungebundenen Zellen und durch Isolieren der hematopoietischen Zellpräparation durch Spaltung der Antikörper-Rezeptorbindung.
Wenn nach autologer Transplantation die transplantierten Zellen mit einem Gen und folglich mit dem davon abgeleiteten Genprodukt markiert sind, welches in diesen Zellen nicht vorhanden ist, ist es möglich, die Zellen direkt nach einer Transplantation zu verfolgen und im Falle eines Rückfalls zwischen Tumorzellen, die sich vom transplantierten Material und verbleibenden Tumorzellen ableiten, zu unterscheiden. Diese Kenntnis führt zu einer sehr frühen Bestimmung der weiteren Behandlung auf Basis der Ursache des Rückfalls. Über diesen diagnostischen Zweck hinaus erlaubt die Genmarkierung in autologen Transplantationen ebenso die Beobachtung und den Vergleich der Effizienz von verschiedenen Reinigungsmethoden in relativ kleinen Patientengruppen.
Für autologe und vorzugsweise allogene Transplantationen ist das Hauptanwendungsgebiet die Beobachtung der Abstoßung von transplantierten Zellen.
Das klinische Protokoll enthält die folgenden Schritte:

a) Explantation von Patientenzellen.
b) Reinigung von explantierten Zellen gemäß dem Stand der Technik
c) Transduktion von Patientenzellen mit einem Vektor, der die modifizierten erfindungsgemäßen Rezeptorgene enthält.
d) Fakultative Vermehrung der Patientenzellen unter Selektionsbedingungen, z. B. mit G418 unter Verwendung der Expression des Neomycinresistenzgens, das auf dem Vektor kodiert ist, der das modifizierte Rezeptorgen enhält.
e) Immunoselektion der markierten Zellen, die das modifizierte Gen exprimieren und den Rezeptor auf der Oberfläche der Zellen präsentieren.
f) Reimplantation der angereicherten und markierten Zellen in den Patienten.
g) Beobachtung von Knochen/Markproben des Patienten auf das Markergen durch FACS-Analyse oder ELISA-Techniken.

Schematisches Flussdiagramm für das Genmarkierungsprotokoll
Die Erfindung umfasst weiterhin ein Verfahren zur Immunoselektion von transfizierten Zellen durch Einbringen einer Nukleinsäure in die Zellen, welche für einen Zelloberflächenrezeptor kodiert, in welchem die Region kodierend für die intrazelluläre Domäne des Rezeptors derartig vollständig oder teilweise deletiert oder modifiziert wurde, dass der auf der Oberfläche präsentierte Rezeptor nach Bindung an seinen Bindungspartner keine Signaltransduktion bewirken kann, durch Identifizieren der transfizierten Zellen durch Inkubation der Zellen mit einem markierten Antikörper, der spezifisch an den Rezeptor bindet, und durch Zurückgewinnen der Zellen durch Spaltung vom Antikörper/Zellkomplex.
Die Erfindung umfasst weiterhin ein Verfahren zur Immunotrennung von transfizierten Zellen durch Einbringen einer DNA in die Zellen, welche für einen Zelloberflächenrezeptor kodiert, in welchem die Region kodierend für die intrazelluläre Domäne des Rezeptors derartig vollständig oder teilweise deletiert oder modifiziert wurde, dass der auf der Oberfläche präsentierte Rezeptor nach Bindung an seinen Bindungspartner keine Signaltransduktion bewirken kann, durch Inkubieren der Zellen mit einem Antikörper gegen den Rezeptor, der vor oder nach der Inkubation immobilisiert wird, durch Separieren der durch den Antikörper immobilisierten Zellen von ungebundenen Zellen, und durch Isolieren der Zellen durch Spalten der Anitkörper-Rezeptorbindung.
Eine große Zahl von Studien hat gezeigt, dass retrovirale Vektoren ein effizientes Werkzeug zum Transfer von exogener DNA in somatische Zellen sind¹. Im hematopoietischen System der Maus wurde ein effizienter Gentransfer und eine Expression sowohl in Vorläufer- als auch pluripotenten Stammzellen sowohl in vitro als auch in vivo erzielt. Niedrigere Gentransferspiegel wurden in hematopoietischen Vorläufern des Hundes und des Menschen in Kultur erhalten, in denen signifikante Expressionsspiegel der transduzierten Gene demonstriert wurden (zusammengestellt in²). Retrovirus-vermittelter Gentransfer wird zur Zeit in Gentherapieprotokollen zur Behandlung von angeborenen oder erworbenen Krankheiten verwendet, wie z. B. adenosindeaminasedefizienter (ADA^–) schwerer kombinierter Immundefizienz (SCID) und fortgeschrittenem Krebs (zusammengestellt in³). Obwohl signifikante Anstrengungen unternommen wurden, um die Verfahren zur Reinigung von menschlichen hematopoietischen Stammzellen zu optimieren und effiziente Bedingungen für Gentransfer und -expression zu finden, werden periphere Blutlymphozyten (PBLs) immer noch als sicherstes zelluläres Verabreichungsvehikel für die menschliche Gentherapie betrachtet.
Eine Anzahl unterschiedlicher retroviraler Vektoren wurde konstruiert und für den Gentransfer in menschliche hematopoietische Zellen verwendet, die alle auf dem Gerüst des Moloney-Leukämievirus der Maus (Moloney murine leukemia virus, MoMLV) basieren. Die Verwendung unterschiedlicher Promotoren, die die Expression des interessierenden Gens antreiben und die Position dieser Sequenzen in Bezug auf die virale Transkriptionseinheit waren einige der Parameter, die bei der Generierung alternativer Vektorkonstrukte in Betracht gezogen wurden^4,5,6. Einige dieser Vektoren wurden verwendet, um menschliche lymphoide Zellen unter verschiedenen Bedingungen zu transduzieren. Menschliche tumorinfiltrierende Lymphozyten (tumor-infiltrating lymphocytes, TILs) wurden mit dem retroviralen Vektor N2 transduziert, der ein Neomycinphosphotransferase (Neo)-Gen trägt und in vitro normale phänotypische und funktionelle Eigenschaften beibehält^7,8. Bis zu 64 Tage nach in vivo-Verabreichung von Zellen an Melanompatienten wurden transduzierte Zellen von Tumororten zurückgewonnen⁹. Sowohl in menschlichen CD4⁺ als auch CD8⁺ T-Zellteilmengen, die von TILs und PBLs abgeleitet wurden, wurde Gentransfer erzielt¹⁰. Ein retroviraler Vektor zur Expression eines funktionellen CD18-Gens, das durch einen viralen LTR-Promotor angetrieben wurde, wurde erfolgreich in Lymphozyten von Patienten transduziert, die durch Leukozytenadhäsionsdefizienz (LAD) betroffen waren und führte zur Korrektur von LAD in vitro. Die Expression von menschlichem ADA, die durch einen ADA-Promotor in einem Doppelkopienvektor⁶ in PBLs angetrieben wurde, die von Patienten erhalten wurden, die durch ADA^– SCID betroffen sind, führte ebenso zur Korrektur der Enzymdefizienz und erlaubte eine Rekonstitution von Immunfunktionen^12,13. Schließlich wurden retrovirale Konstrukte zur Überexpression von strukturellen HIV-RNA-Sequenzen (transaktives responsives Element (trans-acting responsive element TAR) und Rev-responsives Element RRE), die durch einen RNA- Polymerase 3-Promotor angetrieben wurden, erfolgreich in eine T-lymphoide Zelllinie eingebracht und induzierten eine teilweise intrazelluläre Immunisierung gegen HIV^14,15. Obwohl in all diesen Fällen gezeigt wurde, dass retrovirale Vektoren menschliche lymphoide Zellen transduzieren und die transferierten Gene exprimieren, wurde noch kein Versuch unternommen, um die unterschiedlichen Vektorkonstrukte auf Stabilität, Effizienz des Gentransfers und Expression des transduzierten Gens zu vergleichen.
Der menschliche Rezeptor für den Wachstumsfaktor mit niedriger Affinität (LNGFR) wird in der Mehrzahl der menschlichen hematopoietischen Zellen nicht exprimiert und erlaubt daher eine quantitative Analyse der transduzierten Genexpression für jeden Vektor und jedes Zellziel durch Immunfluoreszenzanalyse, sogar auf der Einzelzellebene. Verschiedene menschliche hematopoietische Zelllinien myeloiden oder lymphoiden Ursprungs als auch normale mononukleäre Zellen des Blutes (PBMC) wurden mit vier Vektorkonstrukten transduziert und auf Stabilität und Zahl von viralen Integrationen und LNGFR-Expression sowohl auf der RNA- als auch auf der Proteinebene analysiert. Eine FACS-Analyse von transduzierten T-Zelllinien und Klonen auf Koexpression von LNGFR und Zelloberflächenmarkern wurde ausgeführt, um Genexpression in einer spezifischen T-Zellsubpopulation zu studieren. Unter geeigneten hocheffizienten Infektionsbedingungen konnten alle retroviralen Vektoren eine T-Zellpopulation aus dem normalen Immunrepertoire transduzieren. Erfindungsgemäß ist daher LNGFR (in seiner verkürzten Form ohne die intrazelluläre Domäne oder in seiner (im Wesentlichen) nicht modifizierten Form) ein bevorzugter Marker zur Zellmarkierung, indem die Zellen mit einer Nukleinsäure transfiziert werden, die für LNGFR kodiert. Zur Transfektion werden z. B. Vektoren wie z. B. retrovirale Vektoren oder auch nackte DNA verwendet, z. B. mit Liposomen als Transfektionsmittel. LNGFR-Marker wird bevorzugt zur Markierung von Zellen des hematopoietischen Systems verwendet, insbesondere von hematopoietischen Stammzellen. Insbesondere ist die Verwendung zur Markierung in der Gentherapie und bei Reinigungsverfahren bevorzugt.
Effizienter Gentransfer mit einem retroviralen Vektor in hematopoietische Stammzellen ist immer noch das erste Ziel der Gentherapie für viele angeborene und erworbene Erkrankungen. Als Vehikel sind gegenwärtig retrovirale Vektoren das sicherste und effektivste Werkzeug zum Transfer und zur Expression exogener DNA in menschlichen hemato-lymphopoietischen Zellen. Gegenwärtig basieren alle zugelassenen klinischen Protokolle zum Gentransfer in Mark- oder Blutzellen auf retroviralen Vektoren^1,3. Obwohl die pluripotente Stammzelle die ideale Zielzelle repräsentiert, gibt es keine schlüssige Evidenz über die Fähigkeit von retroviralen Vektoren, derartige Zellen mit einer angemessenen Effizienz zu transduzieren und in ihren Nachkommen eine stabile Genexpression zu erhalten. Die Ergebnisse der Fortschritte klinischer Protokolle, die auf Knochenmarksgentransfer basieren, können diese Probleme klarstellen^1,3,10. Zweifellos kann Gentransfer leichter in peripheren Blutlymphozyten erzielt werden, einer möglichen Alternative zu Knochenmarkszellen wenigstens für angeborene und erworbene Krankheiten des Immunsystems. Jedoch ist es für diesen Zweck notwendig zu definieren, welcher Anteil von PBLs transduziert werden muss, um das gesamte Immunrepertoire zu repräsentieren, und ob dies in vivo stabil gehalten werden kann, was beides notwendige Voraussetzungen für ein Gentransferverfahren sind, das von therapeutischer Relevanz ist. Für diesen Zweck sind die Effizienz des Gentransfers und das Vektorkonstrukt, die sowohl die Persistenz als auch die Genexpressionsspiegel beeinflussen, kritische Faktoren.
Die gesamte Effizienz des Gentransfers in menschliche PBLs war strikt vom Infektionsprotokoll abhängig. Beschränkte Zellvermehrung durch kurzzeitige in vitro-Aktivienang von Lymphozyten, gefolgt von Gentransfer in PBLs durch Aussetzen gegenüber Überständen von Erzeugerzellen führte zu einem begrenzten Anteil von G418-resistenten Zellen (annähernd 1% pro Infektionszyklus), wobei eine zusätzliche Variabilität durch den Titer von Vektorüberständen eingebracht wurde. Die Effizienz des Gentransfers kann durch stärkere in vitro-Vermehrung von Zielzellen erhöht werden.
Die Analyse des Repertoires der Vβ-Verwendung in der PBL-Population nach drei Infektionszyklen von PBLs mit vektorenthaltenden Überständen, gefolgt von einer Selektion von transduzieren Zellen durch G418, ergab ein intaktes Repertoire im Vergleich mit der originalen Kontrollpopulation von untransduzierten/unselektierten Lymphozyten. Diese Daten zeigen, dass eine begrenzte Vermehrung von Zielzellen und Verwendung von vektorenthaltenden Überständen einen adäquaten Gentransfer ergab, unabhängig von der relativ niedrigen Gentransferhäufigkeit, wenigstens wenn die Vektorüberstände gute Virustiter haben (> 5 × 10⁵). Niedrige Virustiter in Vektorüberständen ergaben jedoch begrenzte Vβ-Repertoires. Dies wurde durch Southern-Blot-Analyse des TCR-β-Ketten-Rearrangements bestätigt, das ein oligoklonales Muster in der transduzierten/selektierten Population zeigte. Diese Beschränkung wurde durch Kokultur von PBLs mit bestrahlten vektorproduzierenden Zellen umgangen. Dieses Gentransferverfahren ist unabhängig vom Virustiter signifikant um wenigstens eine Größenordnung effektiver. Durch Ausnutzen der hohen Effizienz des Gentransfers durch Kokultivieren und der LNGFR-Expression in transduzierten Lymphozyten wurde ein einfaches Protokoll erstellt, das Kokultivieren und Immunoselektion einbezieht und die Herstellung von homogen transduzierten Zellen ermöglicht.
Da Kokulturprotokolle immer noch für eine klinische Verwendung als unsicher betrachtet werden, wurden Kokulturbedingungen geschaffen, in denen vektorproduzierende Zellen und PBLs durch eine poröse Membran getrennt gehalten wurden, die eine Viruspassage ermöglicht, während sie einen Zell-zu-Zell-Kontakt vermeidet. Diese Vorgehensweise hat einige Vorteile im Vergleich zur Infektion mit Überstand.
Eine Doppelfluoreszenzanalyse von G418-selektierten T-Zellen zur Koexpression von LNGFR und verschiedenen T-Zelloberflächenmarkern zeigte eine ähnliche Empfänglichkeit von allen getesteten Subpopulationen mit offenbar gleicher Gentransfereffizienz. Außerdem erhielten wir wenige, aber eindeutige Hinweise auf Gentransfer in unreifen CD4⁺/CD8⁺-Zellen. Wir haben früher einen retroviralen vektorvermittelten Gentransfer in T-Zell-Vorläuferzellen gezeigt, der einem TCR-Rearrangement vorausgeht¹³. Die erfindungsgemäßen Daten zeigen, dass retrovirale Infektion von PBMCs Gentransfer in zirkulierende Vorläufer mit niedriger, aber detektierbarer Häufigkeit erlaubt. Dies könnte ein weiterer Vorteil von Gentransferprotokollen sein, die kurzzeitige in vitro-Kultur und beschränkte Vermehrung von Ziellymphozyten einbeziehen.
Weiterhin wird die Wirkung von Vektorkonstrukten auf die Gentransfereffizienz und Expression analysiert. In den verwendeten Vektorkonstrukten wurde das Reportergen alternativ in die retrovirale Transkriptionseinheit unter die Kontrolle des internen SV40- oder HSV-TK-Promotors (NSV-N bzw. NTK-N Vektoren) unter dem MoMLV-viralen LTR (LNSN/SFCM) oder außerhalb der retroviralen Transkriptionseinheit unter die Kontrolle des menschlichen ADA-Promotors (der "Doppelkopie"-Vektor-DCN) gebracht. Die Verwendung eines erfindungsgemäßen Rezeptors als ein Reportergen ermöglicht das Studium von Genexpressionsspiegeln in unterschiedlichen PBL-Subpopulationen mit Einzelzellauflösung.
Die viralen Titer, die für unterschiedliche Vektoren in den selektierten Produktionsklonen erhalten wurden, waren vergleichbar mit Ausnahme der DCN-Produktionszellen, die durchgängig bis zu fünffach niedrigere Titer ergaben als diejenigen der anderen drei Vektoren, was nahelegt, dass die Extrasequenz in der viralen LTR die Transduktionseffizienz reduzieren könnte, wahrscheinlich durch Wechselwirken mit dem reversen Transkriptions-/Integrationsprozess. Dies wird ebenso durch die relativ hohe Tendenz von DCN zur Integration als ein rearrangierter Provirus wiedergespiegelt, der weiterhin die gesamte Gentransfereffizienz reduziert, die mit diesem Vektortyp erhalten werden kann. Ein Rearrangement von integrierten Proviren wurde in den drei anderen Vektoren mit vernachlässigbarer Häufigkeit beobachtet.
Die Genexpressionspiegel zeigten, dass Vektoren basierend auf internen Transkriptionseinheiten bei sowohl der mRNA-Akkumulation als auch der Proteinexpression wenigstens ebenso effizienz waren. Die einzige Ausnahme war der sehr hohe Spiegel von Transkripten, die durch den SV-40-Promotor in zwei unterschiedlichen Vektoren (NSV-N und LNSN/SFCM) in der EBV-infizierten B- Zelllinie RIM erzeugt wurden. Die Ursache könnte eine Wechselwirkung von transaktivierenden EBV-Proteinen mit dem SV-40-Enhancer sein. Auf der anderen Seite arbeiteten die Vektoren basierend auf dem MoMLV-LTR- und dem menschlichen ADA-Promotor zur Expression des Reportergens in allen hematopoietischen Linien sehr effizient. Die Analyse von T-Zelllinien und -klonen führte im Wesentlichen zu denselben Ergebnissen. Sowohl LNSN- als auch DCN-Vektoren waren bei der Schaffung hoher Genexpressionsspiegel in allen T-Zellsubpopulationen einschließlich unreifer Vorläufer sehr effizient und hielten diese Spiegel unverändert durch eine hohe Passagenzahl.
Es wird geschlussfolgert, dass der LTR-basierte retrovirale Vektor wahrscheinlich der zuverlässigste und effizienteste Vektor zum Gentransfer in menschliche PBLs und zur Expression in menschlichen PBLs ist, während das DC-Konstrukt generell zu niedriger Gentransfereffizienz aufgrund von sowohl dem niedrigen Titer als auch der Tendenz zum genomischen Rearrangement führt, obwohl er sehr gut ist, wenn allein die Genexpression betrachtet wird. Dieser Konstrukttyp könnte jedoch der Vektor der Wahl sein, wenn gewebespezifische, induzierbare oder anderweitig LTR-unabhängige Genexpression eine vorgeschriebene Notwendigkeit ist, oder auch in Geweben, in denen LTR-Inaktivierung auftreten könnte. Auch wenn wir diesen Punkt in der vorliegenden Studie nicht betrachtet haben, könnten menschliche hematopoietische Stammzellen analog zu dem, was in dem hematopoietischen System der Maus beobachtet wurde, unter diesen Geweben sein.
Die Verwendung eines Gens, das für das Zelloberflächenmolekül LNGFR kodiert oder für ein Zelloberflächenmolekül kodiert, indem die intrazelluläre Domäne des Rezeptors derartig vollständig oder teilweise deletiert oder modifiziert wurde, dass der auf der Oberfläche präsentierte Rezeptor nach Bindung an seinen Bindungspartner keine Signaltransduktion zur retroviralen vektorvermittelten Zellmarkierung bewirken kann, stellt klar einen wichtigen Vorteil gegenüber Vektoren dar, die in früheren Genmarkierungsexperimenten verwendet wurden, die ein Markergen verwendeten, normalerweise das NeoR-Gen, das nicht auf der Zellmembran exprimiert wird. Dieser Vektortyp würde einen möglichen Vorteil für präklinische und klinische in vivo-Studien zur Zellmarkierung darstellen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1: Retrovirale Vektoren zur LNGFR-Expression (A, C, E, G). Gezeigt sind schematische Karten von integrierten proviralen Genomen NSV-N (A), NTK-N (C), LNSN (E) und DCN (G), die die internen Promotoren SV40 (SV), HSV-TK (TK) und ADA (ADAp) des Menschen anzeigen. Schwarze Kästen bezeichnen LTR-Sequenzen. Restriktionsstellen von XbaI und HindIII (H) sind angezeigt.
Die RNA-Spezies, die von jedem Vektor abstammen, sind durch nummerierte Pfeile auf den Karten dargestellt.
2: Southern-Blot-Analyse der Integration der vier retroviralen Vektoren (A-D) in einem XbaI-Verdau von DNA der Zelllinien K562 (1), KG1 (2), Raji (3), Daudi (4), RIM (5), MOLT-4 (6) und J.M. (7), die mit der Neo-Sonde hybridisiert sind. Es sind die Banden zusammen mit ihrem Molekulargewicht (in kb) angezeigt, die intakten integrierten Proviren entsprechen. Rearrangement-Banden sind durch Pfeile angezeigt.
3 und 4: Unterschiedliche Vektorkonstrukte. (L: Leadersequenz; EXTR: extrazelluläre Domäne; T: Transmembrandomäne; INTR: intrazelluläre Domäne; schwarze Kästen: LTR, ψ: Verpackungssignal)
Beispiele
Beispiel 1
Retrovirale Vektoren
Verschiedene retrovirale Vektoren zur Expression von LNGFR als Reportergen wurden unter Verwendung des vollständig kodierenden 1,5 kb-SstI-Fragmentes der menschlichen LNGFR-cDNA¹⁶ oder einer abgeschnittenen LNGFR-cDNA ohne eine intrazelluläre Domäne (z. B. durch Restriktion mit PvuII und SstI) erzeugt. Die NSV-N- und NTK-N-Vektoren wurden durch Klonieren der LNGFR-cDNA in die alleinigen HindIII und BglII-Stellen des NSV- bzw. NTK-Vektors erhalten. Der NSV-Vektor wurde aus dem originalen N2-Vektor¹⁷ durch Insertion des 0,4 kb KpnI/HindIII-Fragmentes, das den frühen SV40-Promotorenhancer und -Replikationsursprung enthält, in die einzige XhoI-Klonierungsstelle abgeleitet. Der NTK-Vektor wurde ebenso von N2 durch Insertion des 852 by Thymidinkinase (TK)-Promotors vom Herpes-Simplex-Virus (HSV) abgeleitet.
Der LNSN-Vektor wurde durch Insertion der LNGFR-cDNA in die HpaI-Stelle des LXSN-Vektors⁵ konstruiert.
Die LNGFR-cDNA wurde in den DCN-Vektor (2 Kopien LNGFR) unter der Kontrolle des 0,8 kb SspI/NcoI-Fragmentes des menschlichen Adenosindeaminase (ADA)-Promotors¹⁸ in die BglII/SnaBI-Stellen des retroviralen N2A Vektors/Polylinkers⁶ kloniert.
Es ist möglich, auf ähnliche Weise eine abgeschnittene LNGFR-cDNA (ΔLNGFR) in NSV-N-, NTK-N-, LNSN- und DCN-Vektoren anstatt der LNGFR-cDNA zu verwenden.
Verschiedene erfindungsgemäße Vektorkonstrukte sind in den 3 und 4 gezeigt.
Vektor-DNAs wurden in entsprechende Viren durch das Transinfektionsprotokoll umgewandelt. Kurz zusammengefaßt wurde Vektor-DNA in die ektopische ψ2- Verpackszelllinie¹⁹ durch standardmäßige Kalziumphosphat-Kopräzipitation²⁰ transfiziert. 48 Stunden nach der Transfektion wurden ψ2-Überstände geerntet und zur Infektion der amphotropischen Verpackungszelllinien PA317²¹ für 16 Stunden in der Anwesenheit von 8 μg/ml Polybren verwendet. Infizierte PA317-Zellen wurden in DMEM (GIBCO, Grand Island, NY), das mit 10% FCS (Hyclone, Logan, UT) supplementiert war und 0,8 mg/ml G418 (GIBCO) enthielt, selektiert und dann zum Erzeugen von helferfreien virusenthaltenden Überständen mit Titern von 10⁴ bis 5 × 10⁵ cfu/ml verwendet. Alle Vektoren enthalten das NeoR-Gen, das für Neomycin-Phosphotransferase kodiert, das eine in vitro-Resistenz gegen das Neomycin analog G418 verleiht.
Infektion von hematopoietischen Zelllinien
Alle in dieser Studie beschriebenen Zelllinien mit der Ausnahme von RIM und J.M. wurden von ATCC erhalten und in RPMI 1640 (GIBCO) gehalten, das mit 10% FCS supplementiert war. K562 und KG1 sind myeloide Zelllinien, die aus chronischen bzw. akuten myelogenen Leukämien stammen; Raji und Daudi entstammen aus zwei Burkitt-Lymphomen; MOLT-4 wird als eine stabile T-Zellleukämie (CD8⁺) betrachtet; RIM ist eine EBV-transformierte lymphoblastoide Zelllinie; J.M. ist eine CD4⁺/CD8⁺-T-lymphoblastoide Zelllinie; A875 ist eine Zelllinie eines menschlichen Melanoms, die ungefähr 10⁶ LNGFRs/Zelle exprimiert.
5 × 10⁵ Zielzellen wurden für 16 Stunden mit unverdünnten viralen Überständen infiziert, die 8 μg/ml Polybren enthielten, wuchsen für weitere 24 Stunden in komplettem Medium und wurden dann in der Anwesenheit der vorher bestimmten G418-Dosis (0,5–1,5 mg/ml) selektiert. Weitere Analysen wurden mit Großkulturen von G418-selektierten Zellen durchgeführt.
Infektion von menschlichen PBMCs
Periphere mononukleäre Blutzellen (peripheral blood mononuclear cells, PBMC) wurden von gesunden Spendern durch Ficoll-Hypaque-Grandientenseparation (Pharmacia, Uppsala, Schweden) erhalten und für 72 Stunden unter Stimulation mit Phytohämagglutinin (PHA) und mit menschlichem rekombinantem Interleukin2 (hu-rIL2) gehalten (2 μg/ml gereinigtes PHA, Wellcome, Labs., Dartford, UK; 100 U/ml hu-rIL2, Roche, Nutley, NJ). Die virale Infektion wurde durch Aussetzen von stimulierten PBLs gegenüber einem zellfreien viralen Stamm für 6 Stunden in der Anwesenheit von Polybren (8 μg/ml) ausgeführt. 48 Stunden nach der Infektion wurden PBLs in RPMI 1640 selektiert, das mit 2 mM L-Glutamin, 1 nichtessentiellen Aminosäuren, 1% Natriumpyruvat, 5% humanem Serum (HS) und 100 U/ml hu-rIL2 (komplettes Medium) supplementiert war, das 0,4 mg/ml G418 enthielt. Die Zelldichte wurde während der zweiwöchigen G418-Selektion konstant gehalten (5 × 10⁵ Zellen/ml). Retrovirus-transduzierte menschliche T-Lymphozyten wurden ebenso in Terasaki-Platten mit verschiedenen Zellkonzentrationen (1 – 10³ Zellen/Loch) in komplettem Medium enthaltend 0,4 mg/ml G418 in der Anwesenheit von bestrahlten menschlichen PBLs als Feederzellen kloniert.
Um die retrovirale Infektionseffizienz zu verbessern, wurden menschliche PBLs mit virusproduzierenden Zellen für 48–72 Stunden in komplettem Medium kokultiviert. Die Kokultivierung wurde ebenso in Transwell-Platten (Costar, Cambridge, MA) ausgeführt, um Zell-zu-Zell-Kontakte zu vermeiden. 3 × 10⁵ Produktionszellen wurden in den Clusterplattenlöchern von 6-Loch-Schalen ausgesäht und bei 37°C O/N inkubiert. 5 × 10⁵ stimulierte PBLs wurden in die Transwells hinzugegeben und für 48– 72 Stunden in der Anwesenheit von 8 μg/ml Polybren wachsen gelassen.
Retrovirus-transduzierte Zellen wurden durch Durchflusszytometrie auf Rezeptorexpression untersucht und für weitere Analysen vermehrt.
DNA-Analyse
DNA mit hohem Molekulargewicht wurde aus Zellen durch standardmäßige Phenol/Chloroformextraktion²⁰ erhalten, vollständig in 5-μg-Aliquots mit passenden Restriktionsenzymen (GIBCO-BRL) verdaut, in 0,8%igen Agarosegelen bei 1,5 V/cm in Tris-Acetat-EDTA-Puffer elektrophorisiert, unter Verwendung von Southern- Kapillarblotting²⁰ auf eine Nylonmembran (Hybond-N, Amersham, Buckinghamshire, UK) übertragen und mit einer Sonde hybridisiert, die mit 10⁷ dpm [³²P] markiert war.
Southern-Blot zur DNA-Analyse
Sonden:

1) pSV-neo-Fragment und
2) Fragment, dass die konstante TCR-β-Region enthält

DNA-Sonden waren das 1,2 kb-HindIII/SmaI-Fragment von pSV2-neo²² und das HincII-3'-Fragment des YTJ-2-cDNA-Klons, das die konstante Region des menschlichen TCR-β enthielt²³. Die Filter wurden unter hochstringenten Bedingungen gewaschen und mit Kodak X-AR 5-Filmen bei –70°C exponiert.
Northern-Blot zur RNA-Analyse
Sonden:

1) pSV2-neo-Fragment und
2) Fragment der LNGFR-cDNA

Die zelluläre Gesamt-RNA wurde mit der Guanidin-Isothiocyanattechnik²⁴ extrahiert und nach poly(A)⁺ durch Oligo-(dT)-Cellulosechromatographie²⁰ selektiert. 5 μg poly(A)⁺-RNA wurde auf einem 1%igem Agarose-Formaldehydgel nach Größe fraktioniert, durch Northern-Kapillarblotting²⁵ auf eine Nylonmembran übertragen und hybridisiert, gewaschen und wie für Southern-Blots beschrieben exponiert. DNA-Sonden waren ein 1,2 kb-HindIII-SmaI-Fragment von pSV2-neo und das 1,5 kb Sst I-Fragment der LNGFR-cDNA¹⁶.
Zelloberflächenphänotyp
Die LNGFR-Expression wurde durch Durchflusszytometrie beobachtet unter Verwendung von

1) antihumanem LNGFR mit einer Fluoresceinmarkierung und
2) PE-konjugiertem antihumanem MoAbs.

Die LNGFR-Expression auf der Zelloberfläche wurde mittels Durchflusszytometrie unter Verwendung des antihumanen monoklonalen LNGFR-Antikörpers 20.4 (ATCC) der Maus mit einem indirekten Fluoreszenzmarkierungsverfahren beobachtet. Der Zelloberflächenphänotyp von T-lymphozytären Linien und Klonen wurde mittels Durchflusszytometrie unter Verwendung von PE-konjugierten antihumanen CD4 (T4)-, CD8 (T8)-, CD5-, B4-, CD25R-, Leu7-, CD34-monoklonalen Antikörpern (MoAb) (Coulter Immunology, Hialeah, FL) bestimmt. Kurz zusammengefasst wurden 5 × 10⁵ Zellen mit 100 μl verdünnten Antikörpern für 30 min bei 4°C gefärbt, 2 × in Medium ohne FCS gewaschen und in 0,5 ml PBS zur FACS-Analyse oder in 100 μl verdünntem FITC-konjugiertem sekundärem Antikörper resuspendiert. Eine Doppelfärbungsanalyse wurde durch aufeinanderfolgende Inkubation mit FITC- und PE-konjugierten Antikörpern durchgeführt.
Analyse der Verwendung der TCR-Vβ-Kette mittels PCR
Aus PBLs und T-Zelllinien wurde die Gesamt-RNA unter Verwendung von GTC extrahiert,²⁶ unter Verwendung von Oligo-dt- und dG-Schwänzen in cDNA revers transkribiert,²⁷ ein Zwanzigstel der erhaltenen DNA wurde unter Verwendung von Vβ-Cβ-spezifischen Oligonukleotiden einer PCR unterworfen,²⁸ und einer Anker-PCR unter Verwendung eines Cβ-spezifischen Oligonukleotids (5'-TGCTGACCCCACTGTCGACCTCCTTCCCATT-3') (SEQ ID NO: 2) wie in Referenz 27 beschrieben unterworfen. Die PCR-Amplifikationszyklen wurden bei 94°C für 45'', 57°C für 45'' und 72°C für 1' durchgeführt. Das amplifizierte Produkt wurde gelgereinigt und in einen Bluescript-Plasmidvektor kloniert. Cβ-positive Kolonien wurden auf verschiedene Platten repliziert und auf Nitrocellulosefilter übertragen und mit Vβ-spezifischen Oligonukleotiden^28,29 unter den folgenden Bedingungen hybridisiert: 6 × SSC, 1% Blotto, 0,1% SDS und 5 mM EDTA bei 42°C für 3–6 Stunden, für 1 Stunde bei derselben Temperatur in 6 × SSC gewaschen und gegenüber einem Röntgenfilm bei Raumtemperatur für 6–12 Stunden exponiert.
Ergebnisse
Erzeugung von rekombinanten Retroviren zur Expression von LNGFR
Verschiedene retrovirale Vektorkonstrukte zur LNGFR-Expression wurden entwickelt und zur Erzeugung von virusproduzierenden Zelllinien verwendet. Das NSV-N-Konstrukt (1A) und das NTK-N-Konstrukt (1C) basieren auf internen Promotoren, die die LNGFR-cDNA treiben, z. B. der frühe SV40-Promotor bzw. der HSV-TK-Promotor. Im LNSN-Vektor (1E) wird das LNGFR-Gen vom viralen LTR exprimiert. Im DCN-Konstrukt (1G) ist die LNGFR-cDNA unter der Kontrolle des menschlichen ADA-Promotors innerhalb der U3-Region des 3'-LTR. Die SFCN-Konstrukte enthalten ein abgeschnittenes LNGFR-Gen, worin die intrazelluläre Domäne deletiert ist (ΔLNGFR). Nach Infektion von Zielzellen wird das transduzierte Gen dupliziert und zum 5'-LTR übertragen⁶, wobei ein Provirus erzeugt wird, der zwei Kopien des ADA-LNGFR-Minigens enthält. Alle Vektoren trugen das NeoR-Gen unter der Kontrolle von entweder dem vitalen LTR (NSV-N, NTK-N und DCN) oder dem frühen SV40-Promotor (LNSN und SFCM).
Die Vektoren wurden zur Transduktion des LNGFR-Gens (bzw. des abgeschnittenen LNGFR-Gens) in menschliche hematopoietische Zelllinien unterschiedlicher Herkunft und zur Transduktion in menschliche PBLs verwendet, und sie sind alle in der Lage,

1) menschliche Zielzellen zu transduzieren,
2) zu integrieren und intakte Proviren zu bilden, und
3) das Reportergen zu exprimieren.

Die vitalen Titer der amphotropischen Produktionszelllinien betrug von 1 × 10⁴ bis 5 × 10⁵ cfu/ml für NSV-N-, NTK-N-, LNSN- und SFCM-Vektoren und von 5 × 10³ bis 1 × 10⁴ cfu/ml für DCN.
Molekulare Analyse der viralen Integration in menschliche hematopoietische Zelllinien
Zur initialen Musterung der unterschiedlichen Vektoren wurde eine Anzahl von Tumorzelllinien hemato-lymphopoietischen Ursprungs als Zielzellen zum Gentransfer verwendet. Zwei myeloide Zelllinien (K562 und KG1), zwei Burkitt-Lymphome (Raji und Daudi), eine EBV-transformierte lymphoblastoide Zelllinie (RIM) und zwei T-lymphoblastoide Zelllinien (MOLT-4 und J.M.) wurden mit den vier retroviralen Vektoren transduziert und in der Anwesenheit von G418 selektiert. Eine molekulare Analyse von retroviralen Integrationen wurde durch Southern-Blotting ausgeführt, um die Größe des integrierten Virus und die Kopienzahl (ungefähr 1–5 Kopien/Zelle) zu detektieren. Genomische DNAs wurden mit XbaI verdaut, das sowohl 5'- als auch 3'-LTRs aller Vektoren schneidet (1) und die Detektion der Größe der integrierten Proviren ermöglicht, und wurden mit BglII verdaut, das nur in genomischen DNAs schneidet und die Abschätzung der Zahl der Integrationsstellen erlaubt. XbaI- und BglII-verdaute DNAs wurden nacheinander mit Sonden hybridisiert, die für die NeoR- und LNGFR-Gene spezifisch waren.
Die Integration des NSV-N-Vektors erzeugte in allen G418-selektierten Zelllinien eine einzige XbaI-Bande der erwarteten Größe von 5,1 kb, die einem intakten Provirus entspricht (2A). In den Raji-Zellen wurde eine zusätzliche Bande mit geringerer Größe beobachtet, was die Integration eines rearrangierten Provirus anzeigt (2A, Spur 3).
Auf ähnliche Weise erzeugte XbaI-Verdau in den DNAs aller NTK-N-infizierten Zelllinien eine einzelne Bande der erwarteten Größe von 5,4 kb (2B). Eine zusätzliche Bande wurde nur in der RIM-Probe detektiert (2B, Spur 5), wahrscheinlich aufgrund der Anwesenheit eines rearrangierten Provirus. Eine einzige Bande von 4,3 kb wurde in allen Proben gesehen, die mit dem LNSN- und SFCM-Vektor transduziert wurden, wobei kein Hinweis auf virale Rearrangements gefunden wurden (2C). Im Gegensatz dazu waren die Muster viraler Integrationen in DNAs von Zellen, die mit DCN infiziert wurden, durch häufige Rearrangements gekennzeichnet (2D). Alle DCN-transduzierten Zelllinien zeigten die Anwesenheit einer 5,4 kb-Bande, die dem intakten Provirus entspricht, aber in allen Zelllinien bis auf eine (KG1) wurde eine zusätzliche Bande von 3,2 kb detektiert. Der relative Anteil der beiden Banden war in den analysierten Proben verschieden und bewegte sich vom Vorherrschen des intakten Provirus (MOLT 4, 2D, Spur 6) bis zum Überwiegen des rearrangierten Provirus (Raji, 2D, Spur 3). Wiederholte Infektionen mit demselben retroviralen Stamm zeigte an, dass das Verhältnis zwischen intaktem und rearrangiertem Provirus ein zufälliges nichtzellspezifisches Ereignis ist.
Wie in den Zelllinien beobachtet wurde, die mit allen anderen Vektoren transduziert wurden, zeigte das BglII-Muster, dass eine DCN-Infektion polyklonale Integration in allen Zelllinien bewirkte.
Um die Natur und den Mechanismus zu untersuchen, der für die Erzeugung des rearrangierten Provirus verantwortlich ist, führten wir zusätzliche Verdaue von genomischen DNAs mit HindIII durch, das zweimal im ADA-LNGFR-Minigen schneidet, gefolgt von Hybridisieren mit der LNGFR-Sonde. Die vergleichende Analyse der Restriktionsmuster von XbaI und XbaI/HindIII mit beiden Sonden zeigte an, dass die 3,2 kb-Bande einem rearrangierten Provirus entsprach, dem das ADA-LNGFR-Minigen von beiden LTRs fehlte. Ebenso wurden während der Selektion der DCN-Produktionszelllinien defekte Proviren mit großer Häufigkeit detektiert. Die Klone, die in allen unseren Experimenten verwendet wurden, enthielten nur das intakte Provirus, was anzeigt, dass die Erzeugung von defekten Proviren während der Integration in der Zielzelle auftritt und nicht aufgrund von Defekten in der Produktionszelllinie.
Zusammenfassend führte die Infektion aller Zelllinien mit NSV-N, NTK-N, LNSN und SFCM zu G418-resistenten Populationen, die eine niedrige Kopienzahl von meistens nichtrearrangierten Proviren trugen, während Infektion mit dem DCN-Vektor mit großer Häufigkeit einen gängigen rearrangierten Provirus erzeugte, der höchstwahrscheinlich vom Verlust des ADA-LNGFR-Minigens vom 3'-LTR des retroviralen Vektors während des Integrationsprozesses herrührte. Dieses Problem könnte durch die Größe und Natur des inserierten Gens im viralen LTR verursacht sein, ähnliche Beschränkungen mit anderen "Doppelkopie"-Vektorkonstrukten wurden nicht beobachtet^12–14.
Vektorvermittelte LNGFR-Expression in menschlichen hematopoietischen Zelllinien
Die Expression von LNGFR, das von unterschiedlichen retroviralen Vektoren transduziert wurde, wurde sowohl auf der Protein- als auch auf der mRNA-Ebene untersucht. Die LNGFR-Expression auf der Zelloberfläche in den G418-selektierten Zelllinien wurde quantitativ durch Durchflusszytometrie mit einem Anti-LNGFR-MoAb analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengefasst. Die meisten der NSV-N- und NTK-N-transduzierten Zelllinien zeigten einen niedrigen bis mittleren Spiegel des Oberflächen-LNGFR, der als relative mittlere Fluoreszenz ausgedrückt ist (< 100 willkürliche Einheiten). Hohe LNGFR-Expression (202 willkürliche Einheiten) wurde nur in der EBV-infizierten RIM-Zelllinie beobachtet, die mit NSV-N transduziert war. LNGFR-Expression wurde nicht in der NTK-N-transduzierten MOLT-4-Zelllinie detektiert, obwohl kein Rearrangement des proviralen Genoms in XbaI-verdauter genomischer DNA detektiert wurde (2B, Spur 6). Wiederholter Gentransfer mit diesem Vektor in derselben Zelllinie ergab übereinstimmend negative Ergebnisse.
Alle Zelllinien, die mit LNSN- und SFCM-retroviralen Vektoren transduziert waren, exprimierten LNGFR bei mittleren bis hohen Spiegeln (50–200 willkürliche Einheiten) (Tabelle I).
Tabelle I FACS-Analyse der LNGFR-Expression in menschlichen hematopoietischen Zelllinien transduziert durch die vier retroviralen Vektoren
Die meisten der DCN-transduzierten Zelllinien exprimierten mittlere oder hohe LNGFR-Spiegel (50–200 w. E.). Die FACS-Profile von DCN-transduzierten Zelllinien korrelierten mit Ergebnissen, die aus einer Southern-Analyse erhalten wurden, die besagen, dass Zelllinien, die zusätzlich zu einem intakten ein rearrangiertes Provirus enthielten, biphasische Kurven mit einem negativen und einem positiven Peak proportional zu der relativen Intensität der Banden zeigten, die intakten bzw. rearrangierten Proviren entsprachen.
Die Expression von vektorspezifischen RNAs in transduzierten Zellen (K562) wurde durch Northern-Blotting von poly(A)⁺-RNA bestimmt, die aus G418-selektierten Zelllinien isoliert wurde und mit LNGFR- und Neo-Sonden hybridisiert wurde. Die erhaltenen Muster stimmten mit den erwarteten Transkriptionsprofilen aller retroviralen Vektoren überein. In den NSV-N- und NTK-N-transduzierten Zellen hybridisierte eine ungespleißte und eine gespleißte RNA-Spezies sowohl mit der LNGFR- als auch der Neo-Sonde. Die SV-40- und TK-abgeleiteten subgenomischen Transkripte, die die LNGFR-spezifische mRNA enthielten, wurde nur nach Hybridisierung mit der LNGFR-Sonde beobachtet. LNSN- oder SFCM-transduzierte Zellen exprimierten nur die ungespleißte RNA-Form, die sowohl mit der NeoR- als auch der LNGFR-Sonde hybridisierte. Dies stimmt mit der beschriebenen Inaktivierung der Spleißungsdonorstelle im LXSN-Vektor überein, von dem LNSN und SFCM abgeleitet wurden⁵. Ein kürzeres Transkript, das der SV40-abgeleiteten NeoR-mRNA entsprach, hybridisierte nur mit der NeoR-Sonde.
Der DCN-Vektor erzeugte zwei LTR-abgeleitete genomische Transkripte, eine ungespleißte bzw. eine gespleißte Form. Eine dritte RNA-Spezies wurde vom ADA-Promotor transkribiert und höchstwahrscheinlich als das hauptsächliche mRNA-Template zur LNGFR-Synthese verwendet. Der relative Beitrag des ADA-Promotors im 5'- oder im 3'-LTR zum LNGFR-Transkript kann durch diese Technik nicht beurteilt werden. Eine langsam wandernde RNA-Form könnte ein Durchlesetranskript darstellen, das vom ADA-Promotor im 5'-LTR iniziiert wurde und an der poly(A)-Bindungsstelle im 3'-LTR terminierte. Ebenso wurden zwei zusätzliche unerklärliche RNA-Spezies detektiert, die nur mit der NeoR-Sonde hybridisierten. Diese Transkripte, die in allen DCN-transduzierten Zelllinien vorhanden waren, waren die einzige RNA-Spezies, die in Raji-Zellen detektiert wurden, die LNGFR nicht exprimierten und nur rearrangierte Proviren trugen, wie durch Southern-Blot-Analyse gezeigt wurde. Es ist daher wahrscheinlich, dass diese Transkripte für den rearrangierten Provirus spezifisch sind, dem das ADAp-LNGFR-Minigen fehlt.
Das RNA-Expressionsmuster, das in den anderen Zelllinien beobachtet wurde, war mit demjenigen vergleichbar, das mit K562 erhalten wurde, mit der einzigen Ausnahme der EBV-infizierten RIM-Zelllinie, die übereinstimmend hohe Spiegel SV40-abgeleiteter Transkripte von NSV-N, LNSN und SFCM zeigte.
Effektivität von vektorvermitteltem Gentransfer in menschliche PBLs
Menschliche PBLs wurden mit retroviralen Vektoren unter PHA- und IL-2-Stimulation infiziert. Um die Infektionshäufigkeiten abzuschätzen, wurden menschliche T-Zellen 48 Stunden nach der Infektion unter beschränkenden Verdünnungsbedingungen (1– 103 Zellen/Loch) kultiviert. Infizierte und nichtinfizierte Kontrollzellen wurden in der Anwesenheit oder Abwesenheit von 0,4 mg/ml G418 kultiviert. Das Zellwachstum wurde 14 Tage nach Platieren ausgewertet, als keine überlebenden Zellen in Löchern detektiert werden konnten, die uninfizierte Zellen in Anwesenheit von G418 enthielten. Die gesamte Infektionshäufigkeit bewegte sich von weniger als 1% bis 5,1% abhängig vom viralen Titer der Vektorüberstände. Jedoch wurde eine signifikante Variabilität zwischen unterschiedlichen Donoren beobachtet. Die Effizienz des Gentransfers kann durch mehrfache Infektionszyklen oder durch Kokultivieren erhöht werden. Kokultivieren von PBLs mit bestrahlten virusproduzierenden Zelllinien für 48 Stunden ermöglicht übereinstimmend eine gute Gentransfereffektivität (10–15%). Eine Doppelfluoreszenzanalyse von LNGFR und T-Zellmarkern schloss die Möglichkeit einer Kontamination durch vektorproduzierende Zellen in der LNGFR-positiven Population aus. In dem Experiment wurde die Häufigkeit der LNGFR-Expression vollständig durch die Expression der transduzierten Gene von infizierten PBLs verursacht, da alle in der FACS-Analyse positiven Zellen das menschliche CD3 koexprimierten. Unabhängig von der anfänglichen Effizienz des Gentransfers können transduzierte PBLs bis zur Homogenität entweder durch negative Selektion mit G418 oder durch positive Immunoselektion mit magnetischen Kügelchen selektiert werden, die an einen monoklonalen Antikörper gekoppelt sind, der gegen das LNGFR gerichtet ist. In dem repräsentativen Experiment war eine einzige Immunoselektionsrunde ausreichend, um die Population transduzierter Zellen von uninfizierten PBLs zu trennen. Nachdem die magnetischen Kügelchen entfernt waren, wurde eine homogene Population von transduzierten Lymphozyten ohne signifikanten Verlust an transduzierten Zellen erhalten.
Um die Effizienz von viralen Vektoren zur Infektion humaner PBLs zu untersuchen, wurde eine Anzahl von PBL-Großkulturen unabhängig voneinander transduziert, indem sie Überständen ausgesetzt wurden, die die unterschiedlichen retroviralen Vektoren enthielten und indem sie mit G418 auf die Anwesenheit des Vektors und die Expression selektiert wurden. 10 der vektortransduzierten Kulturen (2 durch NSV-N, 3 durch NTK-N, 2 durch LNSN/SFCM und 3 durch DCN) wurden auf die proviralen Integrationen durch Southern-Blotting analysiert. Eine Hybridisierung mit der NeoR-Sonde des repräsentativen XbaI, das sowohl 5'- als auch 3'-LTRs aller Vektoren schneidet (1), ermöglicht die Detektion der Größe von integrierten Proviren, und eine Hybridisierung mit BglII, das nur in genomischen DNAs schneidet, erlaubt die Bestimmung der Zahl der Integrationsstellen. In allen Lymphozytenkulturen, die mit NSV-N, NTK-N und LNSN/SFCM transduziert wurden, wurden nur Banden detektiert, die dem intakten integrierten Provirus entsprachen, während eine zusätzliche Bande in allen DCN-transduzierten Kulturen beobachtet wurde, die einem rearrangierten Provirus entsprach.
Schließlich ergab die Analyse der proviralen Integrationen, dass NSV-N-, NTK-N- und LNSN-/SFCM-transduzierte T-Zellkulturen weitgehend polyklonal waren, während DCN-transduzierte Kulturen im Wesentlichen oligoklonal waren, wie es durch die Anwesenheit einer vorherrschenden und nur wenigen kleinen Banden angezeigt wird. Wie weiter oben vorgeschlagen ist dies wahrscheinlich durch einen niedrigeren viralen Titer verursacht und könnte durch unterschiedliche Gentransferprotokolle umgangen werden, die eine Kokultivierung von Zielzellen mit vektorproduzierenden Zelllinien einschließen.
Vektorvermittelte Expression des LNGFR in menschlichen T-Lymphozyten
Die LNGFR-Expression auf der Zelloberfläche wurde durch FACS-Analyse in insgesamt 23 retroviralen vektortransduzierten T-Lymphozytenkulturen analysiert (5 NSV-N-, 8 NTK-N-, 5 LNSN- und 5 DCN-transduzierte Zelllinien) detektiert. LNGFR-Expression war in allen NSV-N-transduzierten Zellen und in sechs von acht NTK-N-transduzierten Zellkulturen niedrig. Die verbleibenden zwei NTK-N-transduzierten T-Zelllinien zeigten mittlere LNGFR-Expressionsspiegel. Heterogene Expressionsspiegel wurden in LNSN-SFCM-Zellkulturen beobachtet, wobei zwei Linien niedrige Spiegel exprimierten, zwei mittlere Spiegel und eine hohe Spiegel von LNGFR. In DCN-transduzierten Zellen exprimierten vier von fünf Linien niedrige Spiegel und eine einen mittleren Spiegel von LNGFR.
Um die infizierten Zellen zu charakterisieren, testeten wir 13 transduzierte Zelllinien auf Expression von lymphozytären Differenzierungsantigenen der Zelloberfläche unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern Anti-CD4, -CD8, -CDS, -B4, -Leu7, -CD25R und -CD34. Alle getesteten Zelllinien waren positiv für CD5- und CD25R-Expression und negativ für Leu7-, B4- und CD34-Expression (Daten nicht gezeigt). Acht von dreizehn analysierten Kulturen waren LNGFR⁺/CD8⁺, eine war LNGFR⁺/CD4⁺ und vier waren positiv für LNGFR und enthielten unterschiedliche Prozentwerte von Zellen, die CD8 und CD4 koexprimierten. Ein Vorherrschen des CD8⁺-Phänotyps in den mit PHA und IL-2 stimulierten Kulturen wurde ebenso in den uninfizierten Kontrollzelllinien beobachtet und stellt wahrscheinlich eine konstante Tendenz des T-Zellkulturverfahrens dar. Im Allgemeinen beobachteten wir keine bevorzugte Transduktion bestimmter zellulärer Teilmengen durch irgendeinen der vier retroviralen Vektoren.
T-Zellklone wurden aus vektortransduzierten T-Zellkulturen durch Platieren von Zellen in begrenzender Verdünnung erhalten (1000, 100 und 10 Zellen/Loch), wobei eine mittlere Infektionshäufigkeit von ungefähr 1% berücksichtigt wurde. 72% aller untersuchten Klone waren LNGFR⁺/CD4⁺ und 28% LNGFR⁺/CD8⁺. Ein Vorherrschen des CD4⁺-Phänotyps wurde ebenso in nichtinfizierten Kontroll-T-Zellen beobachtet, die von denselben Donoren kloniert wurden, und dies wird als Standardbefund unter unseren Klonierungsbedingungen betrachtet. Außerdem wurde eine retrovirale Transduktion und eine LNGFR-Expression in doppelpositiven CD4⁺/CD8⁺-Klonen erzielt. Diese Ergebnisse zeigen, dass eine retrovirale Infektion nicht nur in reifen CD4⁺- und CD8⁺-Zellen auftreten könnte, sondern ebenso in unreifen CD4⁺/CD8⁺-doppelpositiven peripheren Blutlymphozyten.
Analyse des T-Zell-Repertoirs in vektortransduzierten T-Lymphozyten
Wie oben gezeigt, zeigte eine Southern-Blot-Analyse von viralen Integrationen die polyklonale Natur der vektorinfizierten T-Zellkulturen. Dies wurde weiterhin durch eine molekulare Analyse von T-Zellrezeptor-(TCR)β-Kettenrearrangements mit Xba I-verdauten DNA-Proben bestätigt, die mit einer Sonde hybridisierten, die spezifisch für die konstante Region der TCR β-Kette waren. Ein polyklonales Muster ohne vorherrschende Banden zusätzlich zum Keimbahnmuster wurde in T-Zellkulturen detektiert, die mit NSV, NTK-N und LNSN/SFCM transduziert waren. Die Anwesenheit begrenzter Anzahlen vorherrschender Rearrangementsbanden wurde wie für oligonale Zellpopulationen in DCN-infizierten Kulturen beobachtet.
Eine weitere Bestätigung dieser Beobachtungen wurde durch eine systematische Analyse der Verwendung der TCR Vβ-Kette in transduzierten Lymphozyten erhalten. Nach einem einzigen Infektionszyklus von PBLs durch vektorenthaltende Überstände, gefolgt von Selektion von transduzierten Zellen durch G418 wurde die Gesamt-RNA der selektierten Lymphozytenpopulation revers transkribiert, und die erhaltene DNA wurde einer PCR unter Verwendung von Vβ-Cβ-spezifischen Oligonukleotiden und einer Anker-PCR unterworfen, die ein Cβ-spezifisches Oligonukleotid wie im Methodenabschnitt beschrieben verwendete. Die Analyse der durch Vβ-spezifische Oligonukleotide amplifizierten Produkte zeigte ein identisches Repertoir im Vergleich zu der originalen Kontrollpopulation von untransduzierten/unselektierten Lymphozyten. Ähnlich zu den Ergebnissen der Southern-Blot-Analyse von Rearrangements der TCR-β-Kette produzieren niedrige virale Titer in Vektorüberständen ein beschränktes Vβ-Repertoir (Daten nicht gezeigt). Diese Beschränkung von Vektoren mit niedrigen Titern könnte durch mehrfache Infektionszyklen oder durch Kokultivieren von PBLs mit der Produktionszellllinie umgangen werden.
Referenzen

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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Markierung einer Blutzelle oder Knochenmarkszelle eines Säugetiers durch Expression einer Nukleinsäure in dieser Zelle, wobei die Nukleinsäure für einen Zelloberflächenrezeptor kodiert, und durch nachfolgendes Präsentieren des Rezeptors auf der Zelloberfläche, gekennzeichnet durch Verwendung einer Nukleinsäure, in welcher die Region kodierend für die intrazelluläre Domäne des Rezeptors derartig vollständig oder teilweise deletiert oder modifiziert wurde, dass der auf der Oberfläche präsentierte Rezeptor nach Bindung an seinen Bindungspartner keine Signaltransduktion bewirken kann.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die für die intrazelluläre Domäne kodierende Region durch Substitution von Nukleotiden modifiziert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass eine Nukleinsäure kodierend den NGF-, CD24- oder den LDL-Rezeptor verwendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass als Nukleinsäure die Nukleinsäure des NGF-Rezeptors verwendet wird, in der die Region kodierend die Aminosäuren 245 bis zum C-Terminus deletiert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure mittels eines viralen Vektors oder durch Lipofektion in die Zelle eingebracht wird.
Verwendung einer Nukleinsäure, welche für einen Zelloberflächenrezeptor kodiert und in welcher die Region kodierend für die intrazelluläre Domäne derartig vollständig oder teilweise deletiert oder modifiziert wurde, dass die Domäne im Wesentlichen nicht länger eine Signaltransduktion bewirken kann, zur Expression eines derartig modifizierten Zelloberflächenrezeptors und zur Präsentation des Rezeptors auf der Zelloberfläche derartig, dass der Rezeptor als eine selektierbare Markierung für transfizierte Blutzellen oder Knochenmarkszellen eines Säugetieres verwendet wird.
Verfahren zur Immunoselektion von transfizierten Blutzellen oder Knochenmarkszellen eines Säugetiers durch Einbringen einer Nukleinsäure in die Zelle, welche für einen Zelloberflächenrezeptor kodiert, in welchem die Region kodierend für die intrazelluläre Domäne des Rezeptors derartig vollständig oder teilweise deletiert oder modifiziert wurde, dass der auf der Oberfläche präsentierte Rezeptor nach Bindung an seinen Bindungspartner keine Signaltransduktion bewirken kann, durch Identifizieren der transfizierten Zellen durch Inkubation der Zellen mit einem markierten Antikörper, der spezifisch an den Rezeptor bindet, und durch Zurückgewinnen der Zellen durch Spaltung vom Antikörper/Zellkomplex.
Verfahren zur Immunotrennung von transfizierten Blutzellen oder Knochenmarkszellen eines Säugetiers durch Einbringen einer DNA in die Zelle, welche für einen Zelloberflächenrezeptor kodiert, in welchem die Region kodierend für die intrazelluläre Domäne des Rezeptors derartig vollständig oder teilweise deletiert oder modifiziert wurde, dass der auf der Oberfläche präsentierte Rezeptor nach Bindung an seinen Bindungspartner keine Signaltransduktion bewirken kann, durch Inkubieren der Zellen mit einem Antikörper gegen den Rezeptor, der vor oder nach der Inkubation immobilisiert wird, durch Separieren der durch den Antikörper immobilisierten Zellen von ungebundenen Zellen, und durch Isolieren der Zellen durch Spaltung der Antikörper-Rezeptorbindung.
Verfahren zur Präparation einer hematopoietischen Zellpräparation, wobei die Zellen mit einem Zelloberflächenrezeptor markiert sind und wobei die Zellpräparation im Wesentlichen frei von klonogenen Tumorzellen ist, durch Reinigen unter Verwendung zytotoxischer Agentien oder Strahlung, durch Transduzieren von den Zellen mit einer Nukleinsäure, welche für einen Zelloberfächenrezeptor kodiert und in welcher die Region kodierend für die intrazelluläre Domäne derartig vollständig oder teilweise deletiert oder modifiziert wurde, dass die Domäne im Wesentlichen nicht länger eine Signaltransduktion bewirken kann, und durch Separieren der transduzierten Zellen von nicht-transduzierten Zellen.
Verwendung einer modifizierten LNGFR-Nukleinsäure wie in SEQ ID NO. 1 dargestellt zur Markierung von transfizierten Blutzellen oder Knochenmarkszellen eines Säugetiers durch Transfizieren der Zellen mit der Nukleinsäure.
Verwendung nach Anspruch 10 zur Markierung von humanen hematopoietischen Zellen.