JP2781276B2 - マーカーとしての細胞表面レセプターの使用による真核細胞のマーキング方法 - Google Patents
マーカーとしての細胞表面レセプターの使用による真核細胞のマーキング方法Info
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
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-
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、選択マーカーとしての修飾された細胞内ド
メインをもつ細胞表面レセプターの使用による真核（哺
乳類）細胞のマーキング方法に関する。
メインをもつ細胞表面レセプターの使用による真核（哺
乳類）細胞のマーキング方法に関する。
あるDNA配列がその中に首尾よく導入された細胞の同
定は、組換えDNA技術において不可欠の段階である。導
入されるべきDNA配列は、必ずしも、簡単なやり方で選
択されることができる表現型を導びかないであうから、
選択可能な表現型をコードする追加のDNA配列が通常導
入される。真核細胞の組換えDNA技術における使用のた
めのこのような選択マーカー遺伝子の数は未だひじょう
に限定されている。これらの利用可能なマーカー遺伝子
のほとんど、例えば、単純ヘルペス・ウイルスＩ型チミ
ジン・キナーゼ（Wigler et al.,Cell l（1977）223）
又はヒポキサンチン・ホスホリボシル・トランスフェラ
ーゼ（Jolly et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.80（1983）47
7）は、遺伝子に対応し、又は遺伝子に高く関連し、こ
れらは、ほとんどの正常細胞の内で構成的に発現され又
はこのような遺伝子と同一である。
定は、組換えDNA技術において不可欠の段階である。導
入されるべきDNA配列は、必ずしも、簡単なやり方で選
択されることができる表現型を導びかないであうから、
選択可能な表現型をコードする追加のDNA配列が通常導
入される。真核細胞の組換えDNA技術における使用のた
めのこのような選択マーカー遺伝子の数は未だひじょう
に限定されている。これらの利用可能なマーカー遺伝子
のほとんど、例えば、単純ヘルペス・ウイルスＩ型チミ
ジン・キナーゼ（Wigler et al.,Cell l（1977）223）
又はヒポキサンチン・ホスホリボシル・トランスフェラ
ーゼ（Jolly et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.80（1983）47
7）は、遺伝子に対応し、又は遺伝子に高く関連し、こ
れらは、ほとんどの正常細胞の内で構成的に発現され又
はこのような遺伝子と同一である。
それ故、これらのマーカー遺伝子は、その対応遺伝子
を発現しない特殊な突然変異細胞内でのみ使用されるこ
とができる。好ましいマーカー遺伝子は、他方におい
て、それらがこれらの細胞に関連する組換えDNA技術に
おける選択マーカー遺伝子として使用されることができ
るように、ほとんどの哺乳類細胞内で発現されてはなら
ず、又は特定の組織と細胞タイプ内で少なくとも発現さ
れてはならない。
を発現しない特殊な突然変異細胞内でのみ使用されるこ
とができる。好ましいマーカー遺伝子は、他方におい
て、それらがこれらの細胞に関連する組換えDNA技術に
おける選択マーカー遺伝子として使用されることができ
るように、ほとんどの哺乳類細胞内で発現されてはなら
ず、又は特定の組織と細胞タイプ内で少なくとも発現さ
れてはならない。
Pawlink et al.は、レトロウイルス仲介遺伝子移入に
おける優性選択マーカーとしてのCD24細胞表面抗原の使
用について記載している（Journal of Cellular Bioche
mistry,Supplement 17 E,page 203,abstract S210）。
このマーカーを用いて、NIH−3T3線維芽細胞、BAF−3pr
e−Ｂ細胞並びにネズミ骨髄細胞がレトロウイルス感染
によりラベルされることができ、そしてこれらのラベル
された細胞は、蛍光活性化細胞セル・ソーティング分析
により検出された。しかしながら、このCD24細胞表面抗
原は通常いくつかの哺乳類細胞上で発現されるので、こ
のマーカーの使用は、このCD24細胞表面抗原を通常発現
する細胞とこのマーカーによりラベルされた細胞との間
を識別することの困難性により限定されるであろう。
おける優性選択マーカーとしてのCD24細胞表面抗原の使
用について記載している（Journal of Cellular Bioche
mistry,Supplement 17 E,page 203,abstract S210）。
このマーカーを用いて、NIH−3T3線維芽細胞、BAF−3pr
e−Ｂ細胞並びにネズミ骨髄細胞がレトロウイルス感染
によりラベルされることができ、そしてこれらのラベル
された細胞は、蛍光活性化細胞セル・ソーティング分析
により検出された。しかしながら、このCD24細胞表面抗
原は通常いくつかの哺乳類細胞上で発現されるので、こ
のマーカーの使用は、このCD24細胞表面抗原を通常発現
する細胞とこのマーカーによりラベルされた細胞との間
を識別することの困難性により限定されるであろう。
さらに、異種発現後、CD24細胞表面抗原は、ほんの僅
かな程度にその細胞表面に提示されることが見出されて
いる。
かな程度にその細胞表面に提示されることが見出されて
いる。
それ故、本発明の目的は、細胞表面レセプターがその
細胞表面にかなりの程度に提示され、それによりマーク
された細胞の選択及び検出感度が増加されることができ
るような方法による、その細胞表面レセプターの使用に
より、真核細胞をマーキングする方法を提供することで
あった。
細胞表面にかなりの程度に提示され、それによりマーク
された細胞の選択及び検出感度が増加されることができ
るような方法による、その細胞表面レセプターの使用に
より、真核細胞をマーキングする方法を提供することで
あった。
この目的は、細胞表面レセプターをコードする核酸を
その細胞内で発現させ、そしてその細胞表面にそのレセ
プターを提示することによる真核（哺乳類）細胞のマー
キング方法であって、その方法が、その表面に提示され
たレセプターがその結合性パートナーへの結合後にいず
れのシグナル伝達をももたらすことができないようにそ
のレセプターの細胞内ドメインをコードする領域が完全
に又は部分的に欠失され、又は修飾されている核酸の使
用を特徴とする方法により、達成される。
その細胞内で発現させ、そしてその細胞表面にそのレセ
プターを提示することによる真核（哺乳類）細胞のマー
キング方法であって、その方法が、その表面に提示され
たレセプターがその結合性パートナーへの結合後にいず
れのシグナル伝達をももたらすことができないようにそ
のレセプターの細胞内ドメインをコードする領域が完全
に又は部分的に欠失され、又は修飾されている核酸の使
用を特徴とする方法により、達成される。
好ましくは、この細胞内ドメインは完全に欠失され、
又は個体のヌクレオチドは修飾される。
又は個体のヌクレオチドは修飾される。
好ましくは、NGF−,CD24−若しくはLDL−レセプター
をコードする核酸が使用される。
をコードする核酸が使用される。
以下、“低アフィニティー神経成長因子レセプター、
LNGFR"というヒトNGFレセプターの配列は、D.Johnson,C
ell 47（1986）545−554中に記載されている。好ましく
は、（ヌクレオチド930に始まり）そのＣ−末端までの
アミノ酸245をコードするDNA領域が欠失されている核酸
（配列番号:1参照）が使用される。
LNGFR"というヒトNGFレセプターの配列は、D.Johnson,C
ell 47（1986）545−554中に記載されている。好ましく
は、（ヌクレオチド930に始まり）そのＣ−末端までの
アミノ酸245をコードするDNA領域が欠失されている核酸
（配列番号:1参照）が使用される。
配列番号:1においては、その細胞外ドメインはヌクレ
オチド114（ATG）−863によりコードされ、そのトラン
スメンブラン・ドメインはヌクレオチド864−929により
コードされ、そしてその細胞内ドメインはヌクレオチド
930−1394によりコードされている（Reddy et al.,Mole
cular Brain Research 8（1990）137−141）。
オチド114（ATG）−863によりコードされ、そのトラン
スメンブラン・ドメインはヌクレオチド864−929により
コードされ、そしてその細胞内ドメインはヌクレオチド
930−1394によりコードされている（Reddy et al.,Mole
cular Brain Research 8（1990）137−141）。
その細胞内ドメインの欠失のために、その表面に提示
されたレセプターがその結合性パートナーへの結合後に
いずれのシグナル伝達をももたらすことができないよう
に、そのドメイン全体又は機能的部分だけを欠失させる
ことができる。例えば、Pvu IIIとSst Iによる制限酵素
処理によりヌクレオチド943−1512を欠失させることが
できる。
されたレセプターがその結合性パートナーへの結合後に
いずれのシグナル伝達をももたらすことができないよう
に、そのドメイン全体又は機能的部分だけを欠失させる
ことができる。例えば、Pvu IIIとSst Iによる制限酵素
処理によりヌクレオチド943−1512を欠失させることが
できる。
この核酸は、リポフェクション又はエレクトロポレー
ションにより、例えば、ウイルス・ベクター（好ましく
は、レトロウイルス）を介して標的細胞内に導入される
ことができる。
ションにより、例えば、ウイルス・ベクター（好ましく
は、レトロウイルス）を介して標的細胞内に導入される
ことができる。
さらなる本発明の対象は、修飾されたLNGFRをコード
し、そして配列番号:1に図示されるDNA、並びにこのよ
うな核酸を含む真核細胞である。
し、そして配列番号:1に図示されるDNA、並びにこのよ
うな核酸を含む真核細胞である。
このタイプの核酸は、そのレセプターがトランスフェ
クトされた真核細胞のための選択マーカーとして使用さ
れることができるような方法で、そのように修飾された
細胞表面レセプターを発現し、そしてその細胞表面にそ
のレセプターを提示するために使用されることができ
る。
クトされた真核細胞のための選択マーカーとして使用さ
れることができるような方法で、そのように修飾された
細胞表面レセプターを発現し、そしてその細胞表面にそ
のレセプターを提示するために使用されることができ
る。
レセプターをコードするDNA又はその誘導体は、本分
野において公知の方法により真核発現ベクター内に導入
されるであろう。好適な発現ベクターは、当業者に知ら
れており、好ましくは、レトロウイルス・ベクターが使
用される。また、他のウイルス・ベクターも本分野の技
術水準に従って、レセプターDNAの伝達のために使用さ
れることができる（例えば、ヘルペス・ウイルス、アデ
ノ−ウイルス、ワクシニア・ウイルス）。特定タイプの
レトロウイルス、いわゆるダブル・コピー・ベクター
（Yu et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.83（1986）3194−319
8）を用いて、高頻度の再編成プロウイルス及びかなり
低いウイルス・タイターが観察されている。XSNベクタ
ー・ウイルス（Bio−Techniques 7（1989）980−990）
が好ましい。
野において公知の方法により真核発現ベクター内に導入
されるであろう。好適な発現ベクターは、当業者に知ら
れており、好ましくは、レトロウイルス・ベクターが使
用される。また、他のウイルス・ベクターも本分野の技
術水準に従って、レセプターDNAの伝達のために使用さ
れることができる（例えば、ヘルペス・ウイルス、アデ
ノ−ウイルス、ワクシニア・ウイルス）。特定タイプの
レトロウイルス、いわゆるダブル・コピー・ベクター
（Yu et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.83（1986）3194−319
8）を用いて、高頻度の再編成プロウイルス及びかなり
低いウイルス・タイターが観察されている。XSNベクタ
ー・ウイルス（Bio−Techniques 7（1989）980−990）
が好ましい。
この組換え真核発現ベクターは、その後真核宿主細胞
内に、遺伝子マーキング・プロトコールのために単独
で、又は形質導入されることを予定されているが選択可
能な表現型を全くもたないさらなるDNAとの組合せのい
ずれかにおいて、導入される。さらに、このレセプター
遺伝子の伝達は、非ウイルス移入法（例えば、エレクト
ロポレーション、リポソーム伝達、カルシウム沈降）を
使用することにより達成されることもできる。外因性DN
Aを含む細胞は、次に、高レベルでレセプターを生産す
るそれらの能力により認識されることができる。本発明
に従ってDNAを制御する組換え真核細胞は、さらに、そ
のレセプターの誘導体を生産するそれらの能力によりよ
り容易に検出されることができる。
内に、遺伝子マーキング・プロトコールのために単独
で、又は形質導入されることを予定されているが選択可
能な表現型を全くもたないさらなるDNAとの組合せのい
ずれかにおいて、導入される。さらに、このレセプター
遺伝子の伝達は、非ウイルス移入法（例えば、エレクト
ロポレーション、リポソーム伝達、カルシウム沈降）を
使用することにより達成されることもできる。外因性DN
Aを含む細胞は、次に、高レベルでレセプターを生産す
るそれらの能力により認識されることができる。本発明
に従ってDNAを制御する組換え真核細胞は、さらに、そ
のレセプターの誘導体を生産するそれらの能力によりよ
り容易に検出されることができる。
上述のように得られた真核細胞のレセプター・ラベル
は、使用したレセプターに結合する抗体を使用すること
により、このような細胞の容易な選択及び分離を許容す
る。このような抗体は、本分野において公知であり、そ
して例えば、A.Ross et al.（Proc.Natl.Acad.Sci.81
（1984）6681−6685,EP−A 0 202 055）により記載され
ている。さらに、これらのレセプターに対する抗体は、
本発明に係るDNAによりコードされたタンパク質により
動物を免疫感作し、そしてその免疫感作された動物の血
清からそれらの抗体を単離することにより、又は不死化
細胞、例えばネズミ・ミエローマ・セルラインとその免
疫感作動物の脾臓細胞を融合してモノクローナル抗体を
得ることによって本分野において公知の方法により得ら
れることができる。これらの抗体は、（例えば、J.H.Pe
ters.Monoklonale Artikrper,Springer Verlag,2nd e
dition,1988,page 285 to 315中に記載されたような）
本分野において公知の方法によりラベルされることがで
きる。好適なラベルは酵素、蛍光又は化学発光染料であ
ろう。
は、使用したレセプターに結合する抗体を使用すること
により、このような細胞の容易な選択及び分離を許容す
る。このような抗体は、本分野において公知であり、そ
して例えば、A.Ross et al.（Proc.Natl.Acad.Sci.81
（1984）6681−6685,EP−A 0 202 055）により記載され
ている。さらに、これらのレセプターに対する抗体は、
本発明に係るDNAによりコードされたタンパク質により
動物を免疫感作し、そしてその免疫感作された動物の血
清からそれらの抗体を単離することにより、又は不死化
細胞、例えばネズミ・ミエローマ・セルラインとその免
疫感作動物の脾臓細胞を融合してモノクローナル抗体を
得ることによって本分野において公知の方法により得ら
れることができる。これらの抗体は、（例えば、J.H.Pe
ters.Monoklonale Artikrper,Springer Verlag,2nd e
dition,1988,page 285 to 315中に記載されたような）
本分野において公知の方法によりラベルされることがで
きる。好適なラベルは酵素、蛍光又は化学発光染料であ
ろう。
免疫選択により、このような核酸を真核細胞内に導入
することによりマークされた細胞を単離することができ
る。この目的のために、トランスフェクトされた細胞は
同定され、本発明に従って使用されたレセプターに特異
的に結合するマークされた抗体により選択され、そして
抗体／細胞複合体の分割により単離される。
することによりマークされた細胞を単離することができ
る。この目的のために、トランスフェクトされた細胞は
同定され、本発明に従って使用されたレセプターに特異
的に結合するマークされた抗体により選択され、そして
抗体／細胞複合体の分割により単離される。
マーク（ラベル）された抗体の代わりに固定化された
抗体を使用することにより、トランスフェクトされた細
胞を選択することができる。それ故、レセプターに対す
る固定化抗体をもつ固相がアフィニティー・クロマトグ
ラフィーにおけるマトリックスとして使用される。レセ
プターを発現しない非トランス・フェクト細胞の分離後
に、結合した細胞を、例えば、培養し、そして次にペト
リ皿上で一夜増殖させる。
抗体を使用することにより、トランスフェクトされた細
胞を選択することができる。それ故、レセプターに対す
る固定化抗体をもつ固相がアフィニティー・クロマトグ
ラフィーにおけるマトリックスとして使用される。レセ
プターを発現しない非トランス・フェクト細胞の分離後
に、結合した細胞を、例えば、培養し、そして次にペト
リ皿上で一夜増殖させる。
上述のような方法は、遺伝子治療プロトコールにより
哺乳類生物に導入された細胞の同定のための診断ツール
として特に重要であろう。いくつかの用途、例えば、骨
髄移植のために、それは、骨髄移植に起源をもつ細胞と
宿主の残りの細胞から得られる細胞との間を分けるため
の診断的価値を有するであろう。この場合において、レ
セプターをコードするDNAを含む骨髄細胞が、移植され
て、これらの細胞に細胞表面ラベルを提供する。好まし
くは、本発明に係る遺伝子を含む本分野の技術水準に従
って濃縮された前駆又は幹細胞（例えば、固定化抗−CD
34抗体）が移植されるであろう。移植後、細胞、特に最
終的には生じた腫瘍細胞は、その移植された細胞又はそ
の宿主生物の残りの細胞から生じるときに分けられるこ
とができる。
哺乳類生物に導入された細胞の同定のための診断ツール
として特に重要であろう。いくつかの用途、例えば、骨
髄移植のために、それは、骨髄移植に起源をもつ細胞と
宿主の残りの細胞から得られる細胞との間を分けるため
の診断的価値を有するであろう。この場合において、レ
セプターをコードするDNAを含む骨髄細胞が、移植され
て、これらの細胞に細胞表面ラベルを提供する。好まし
くは、本発明に係る遺伝子を含む本分野の技術水準に従
って濃縮された前駆又は幹細胞（例えば、固定化抗−CD
34抗体）が移植されるであろう。移植後、細胞、特に最
終的には生じた腫瘍細胞は、その移植された細胞又はそ
の宿主生物の残りの細胞から生じるときに分けられるこ
とができる。
本発明のさらなる態様は、それ故、レセプターをコー
ドするDNAの、特に本発明に係るDNAの導入によりラベル
されている細胞の診断的同定のための、本発明に係るト
ランスフェクトされた細胞の免疫選択方法の使用であ
る。
ドするDNAの、特に本発明に係るDNAの導入によりラベル
されている細胞の診断的同定のための、本発明に係るト
ランスフェクトされた細胞の免疫選択方法の使用であ
る。
上記の修飾レセプターによる血液細胞／骨髄細胞のマ
ーキングの主要な用途は、自己（autologous）移植から
の、そしてまた同種（allogenic）移植からの細胞のモ
ニタリングであろう。白血病とリンパ腫の治療において
は、細胞静止医薬の致死下投与量又は照射の妥当な投与
量又はそれらの組合せにより患者を治療することがしば
しば必要である。骨髄機能を回復するためには、治療前
に移植される自己骨髄がその患者に移植されるか又はHL
A適合ドナーからの同種骨髄が移植されるかのいずれか
であろう。
ーキングの主要な用途は、自己（autologous）移植から
の、そしてまた同種（allogenic）移植からの細胞のモ
ニタリングであろう。白血病とリンパ腫の治療において
は、細胞静止医薬の致死下投与量又は照射の妥当な投与
量又はそれらの組合せにより患者を治療することがしば
しば必要である。骨髄機能を回復するためには、治療前
に移植される自己骨髄がその患者に移植されるか又はHL
A適合ドナーからの同種骨髄が移植されるかのいずれか
であろう。
自己骨髄移植の場合においては、その再移植された材
料中の腫瘍細胞の汚染は腫瘍の再発を導くことができる
であろう。腫瘍細胞（クローン原性の腫瘍細胞）からそ
の骨髄を精製するためのパージング方法が使用される
が、これらの技術は、今日、信頼できるものではない。
再発の場合においては、腫瘍細胞を潜在的に含有するも
のと治療後に残った細胞により引き起こされた再発との
間を区別することはもちろん不可能である。同種骨髄移
植の場合においては、同種骨髄の拒絶が主要な問題であ
る。パージング技術（Purging techniques）は、Areman
E.M.et al:Bone Marrow and Stem Cell Processing:A
Manual of Current Techniques,F.A.Davies Co.,Philad
elphia（1992）（これを引用により本明細書中に取り込
む。）中に記載されている。
料中の腫瘍細胞の汚染は腫瘍の再発を導くことができる
であろう。腫瘍細胞（クローン原性の腫瘍細胞）からそ
の骨髄を精製するためのパージング方法が使用される
が、これらの技術は、今日、信頼できるものではない。
再発の場合においては、腫瘍細胞を潜在的に含有するも
のと治療後に残った細胞により引き起こされた再発との
間を区別することはもちろん不可能である。同種骨髄移
植の場合においては、同種骨髄の拒絶が主要な問題であ
る。パージング技術（Purging techniques）は、Areman
E.M.et al:Bone Marrow and Stem Cell Processing:A
Manual of Current Techniques,F.A.Davies Co.,Philad
elphia（1992）（これを引用により本明細書中に取り込
む。）中に記載されている。
本発明は、さらに、造血細胞調製物（すなわち、骨髄
又は移動性末梢血液前駆細胞及び／又は幹細胞）の調製
方法であって、細胞毒性剤又は照射を使用してパージ
し、細胞表面レセプターをコードしている核酸及び、好
ましくは、その細胞内ドメインをコードしている領域が
そのドメインが本質的にもはやいずれのシグナル変換を
ももたらすことができないような方法で全体的に又は部
分的に欠失又は修飾されているようなものによりそれら
の細胞を形質導入し、そして非形質導入された細胞から
その形質導入された細胞を分離することにより、それら
の細胞が細胞表面レセプターによりマークされ、そして
それによりその細胞調製物が実質的にクローン原性腫瘍
細胞を含まないような方法を含んで成る。この分離は、
好ましくは、インキュベーションの前又は後に固定化さ
れたレセプターに対する抗体と共にそれらの細胞をイン
キュベートし、非結合細胞から抗体により固定化された
細胞を分離し、そして抗体−レセプター結合の解裂によ
りその造血細胞調製物を単離することにより達成され
る。
又は移動性末梢血液前駆細胞及び／又は幹細胞）の調製
方法であって、細胞毒性剤又は照射を使用してパージ
し、細胞表面レセプターをコードしている核酸及び、好
ましくは、その細胞内ドメインをコードしている領域が
そのドメインが本質的にもはやいずれのシグナル変換を
ももたらすことができないような方法で全体的に又は部
分的に欠失又は修飾されているようなものによりそれら
の細胞を形質導入し、そして非形質導入された細胞から
その形質導入された細胞を分離することにより、それら
の細胞が細胞表面レセプターによりマークされ、そして
それによりその細胞調製物が実質的にクローン原性腫瘍
細胞を含まないような方法を含んで成る。この分離は、
好ましくは、インキュベーションの前又は後に固定化さ
れたレセプターに対する抗体と共にそれらの細胞をイン
キュベートし、非結合細胞から抗体により固定化された
細胞を分離し、そして抗体−レセプター結合の解裂によ
りその造血細胞調製物を単離することにより達成され
る。
自己移植後に、その移植された細胞がこれらの細胞に
一般的でない遺伝子により及びその後にそれから誘導さ
れた遺伝子生成物によりマークされる場合、移植後に直
接的にこれらの細胞をトレースすることができ、そして
再発の場合には、その移植された材料から誘導された腫
瘍細胞と残りの腫瘍細胞との間を区別することができ
る。この知識は、再発の源に基づくさらなる治療のひじ
ょうに早期の決定を導くであろう。この診断目的の他
に、自己移植における遺伝子マーキングは、比較的小さ
な患者群における異なる除去方法の効力をモニターし、
そして比較することも許容するであろう。
一般的でない遺伝子により及びその後にそれから誘導さ
れた遺伝子生成物によりマークされる場合、移植後に直
接的にこれらの細胞をトレースすることができ、そして
再発の場合には、その移植された材料から誘導された腫
瘍細胞と残りの腫瘍細胞との間を区別することができ
る。この知識は、再発の源に基づくさらなる治療のひじ
ょうに早期の決定を導くであろう。この診断目的の他
に、自己移植における遺伝子マーキングは、比較的小さ
な患者群における異なる除去方法の効力をモニターし、
そして比較することも許容するであろう。
自己及び好ましくは同種移植のために、主要な適用分
野は、移植された細胞の拒絶のモニタリングであろう。
野は、移植された細胞の拒絶のモニタリングであろう。
この臨床的なプロトコールは以下の段階を含むであろ
う。
う。
ａ）患者細胞の体外移植。
ｂ）公知技術に従う体外移植された細胞のパージング。
ｃ）本発明に係る修飾されたレセプター遺伝子を含むベ
クターによる上記患者細胞の形質導入。
クターによる上記患者細胞の形質導入。
ｄ）選択的条件下、例えば、修飾レセプター遺伝子を含
むベクター上にコードされたネオマイシン耐性遺伝子の
発現を使用するG418を用いて、上記患者細胞の通性培
養。
むベクター上にコードされたネオマイシン耐性遺伝子の
発現を使用するG418を用いて、上記患者細胞の通性培
養。
ｅ）上記修飾遺伝子を発現し、そして上記細胞の表面上
に上記レセプターを提示するマークされた細胞の免疫選
択。
に上記レセプターを提示するマークされた細胞の免疫選
択。
ｆ）上記の濃縮され且つマークされた細胞の上記患者内
への再移植。
への再移植。
ｇ）FACS分析又はELISA技術による上記マーキング遺伝
子についての上記患者の血液／骨髄サンプルのモニタリ
ング。
子についての上記患者の血液／骨髄サンプルのモニタリ
ング。
本発明は、トランスフェクトされた細胞の免疫選択方
法であって、その結合パートナーへの結合後に、その表
面に提示されたレセプターがいずれのシグナル伝達をも
もたらすことができないような方法でそのレセプターの
細胞内ドメインをコードする領域が全体的に又は部分的
に欠失又は修飾されている細胞表面レセプターをコード
する核酸をその細胞内に導入し、そのレセプターに特異
的に結合するマークされた抗体と共にそれらの細胞をイ
ンキュベーションすることによりそのトランスフェクト
された細胞を同定し、そしてその抗体／細胞複合体から
の解裂によりそれらの細胞を回収することによる、よう
な方法をさらに含んで成る。
法であって、その結合パートナーへの結合後に、その表
面に提示されたレセプターがいずれのシグナル伝達をも
もたらすことができないような方法でそのレセプターの
細胞内ドメインをコードする領域が全体的に又は部分的
に欠失又は修飾されている細胞表面レセプターをコード
する核酸をその細胞内に導入し、そのレセプターに特異
的に結合するマークされた抗体と共にそれらの細胞をイ
ンキュベーションすることによりそのトランスフェクト
された細胞を同定し、そしてその抗体／細胞複合体から
の解裂によりそれらの細胞を回収することによる、よう
な方法をさらに含んで成る。
本発明は、さらに、トランスフェクトされた細胞の免
疫分離方法であって、その結合パートナーへの結合後
に、その表面に提示されたレセプターがいずれのシグナ
ル変換をももたらすことができないような方法で、その
レセプターの細胞内ドメインをコードする領域が全体的
に又は部分的に欠失又は修飾されている細胞表面レセプ
ターをコードするDNAをその細胞内に導入し、インキュ
ベーションの前又は後に固定化されたレセプターに対す
る抗体と共にそれらの細胞をインキュベートし、非結合
細胞から上記抗体により固定化された細胞を分離し、そ
して抗体−レセプター結合を解裂させることによりそれ
らの細胞を単離することによる、ような方法を含んで成
る。
疫分離方法であって、その結合パートナーへの結合後
に、その表面に提示されたレセプターがいずれのシグナ
ル変換をももたらすことができないような方法で、その
レセプターの細胞内ドメインをコードする領域が全体的
に又は部分的に欠失又は修飾されている細胞表面レセプ
ターをコードするDNAをその細胞内に導入し、インキュ
ベーションの前又は後に固定化されたレセプターに対す
る抗体と共にそれらの細胞をインキュベートし、非結合
細胞から上記抗体により固定化された細胞を分離し、そ
して抗体−レセプター結合を解裂させることによりそれ
らの細胞を単離することによる、ような方法を含んで成
る。
ひじょうに多くの研究が、レトロウイルス・ベクター
が体細胞内への外来DNAの移入のための効率のよい道具
であることを立証した１。マウス造血系においては、効
率のよい遺伝子移入及び発現は、インビトロ及びインビ
ボにおいて、前駆及び多能性幹細胞の両方において達成
されている。低レベルの遺伝子移入は、培養におけるイ
ヌとヒトの造血前駆細胞内で得られており、ここでは、
形質導入された遺伝子のかなりのレベルの発現が立証さ
れている（２中にレビューされる）。レトロウイルス−
仲介遺伝子移入は、先天及び後天的疾患、例えば、アデ
ノシン・デアミナーゼ−欠損（ADA-）重度合併免疫不全
（SCID）及び進行癌の治療のための遺伝子治療プロトコ
ールにおいて最近使用されている（３中にレビューされ
る。）。かなりの努力が、ヒト造血幹細胞の精製並びに
遺伝子移入及び発現のための効率的な条件の発見のため
の手順を最適化するために捧げられているけれども、末
梢血液リンパ球（PBLs）は、未だ、ヒトの遺伝子治療の
ための最も安全な細胞デリバリー媒質として考えられて
いる。
が体細胞内への外来DNAの移入のための効率のよい道具
であることを立証した１。マウス造血系においては、効
率のよい遺伝子移入及び発現は、インビトロ及びインビ
ボにおいて、前駆及び多能性幹細胞の両方において達成
されている。低レベルの遺伝子移入は、培養におけるイ
ヌとヒトの造血前駆細胞内で得られており、ここでは、
形質導入された遺伝子のかなりのレベルの発現が立証さ
れている（２中にレビューされる）。レトロウイルス−
仲介遺伝子移入は、先天及び後天的疾患、例えば、アデ
ノシン・デアミナーゼ−欠損（ADA-）重度合併免疫不全
（SCID）及び進行癌の治療のための遺伝子治療プロトコ
ールにおいて最近使用されている（３中にレビューされ
る。）。かなりの努力が、ヒト造血幹細胞の精製並びに
遺伝子移入及び発現のための効率的な条件の発見のため
の手順を最適化するために捧げられているけれども、末
梢血液リンパ球（PBLs）は、未だ、ヒトの遺伝子治療の
ための最も安全な細胞デリバリー媒質として考えられて
いる。
多数の異なるレトロウイルス・ベクターが、全てMolo
neyネズミ白血病ウイルス（MoMLV）背骨に基づき、ヒト
造血細胞内への遺伝子移入のために遺伝子操作され、そ
して使用されてきた。着目の遺伝子の発現を駆動する異
なるプロモーターの用い方、及びウイルス転写単位に関
してこれらの配列の位置は、別のベクターのデザインの
作出において考慮に入れられたパラメーターの中のいく
つかであった4 5 6。これらのベクターのいくつかが、
異なる条件下でヒト・リンパ球細胞を形質導入するため
に使用された。ヒト腫瘍浸潤性リンパ球（TILs）は、ネ
オマイシン・ホスホトランスフェラーゼ（Neo）遺伝子
を担持する、N2レトロウイルス・ベクターにより形質導
入され、そしてインビトロにおいて正常な表現型及び機
能特性を保持された7 8。形質導入された細胞は、メラ
ノーマ患者へのインビボにおける細胞投与の64日後まで
に腫瘍部位から回収された９。遺伝子伝達は、TILsとPB
Lsから得られたCD4+とCD8+のヒトＴ−細胞サブセットの
両方において得られた10。ウイルスLTRプロモーターに
より駆動される、機能的CD18遺伝子の発現のためのレト
ロウイルス・ベクターは、リンパ球接着不全（LAD）を
患った患者からのリンパ球を首尾よく形質導入し、そし
てインビトロにおいてLADの矯正を導いた。ADA-SCIDを
患った患者から得られたPBLs中のダブル・コピー・ベク
ター６内へのADAプロモーターにより駆動されるヒトADA
の発現も、この酵素の欠陥の矯正を導びき、免疫機能の
再構築を許容する12 13。最後に、RNAポリメラーゼIII
プロモーターにより駆動される、HIV構造RNA配列（トラ
ンス作用性応答性要素、TAR、及びRev−応答性要素、RR
E）の過剰発現のためのレトロウイルス構築物が、Ｔ−
リンパ球セルライン内に首尾よく導入されて、HIVに対
する部分的免疫感作を誘導した14 15。すべてのこれら
の場合において、レトロウイルス・ベクターは、ヒト・
リンパ球を形質導入し、そしてその伝達された遺伝子を
発現することが示されたけれども、その形質導入された
遺伝子の安定性、遺伝子移入の効率、及び発現について
異なるベクター・デザインを直接的に比較する試みは未
だ全く行われていない。
neyネズミ白血病ウイルス（MoMLV）背骨に基づき、ヒト
造血細胞内への遺伝子移入のために遺伝子操作され、そ
して使用されてきた。着目の遺伝子の発現を駆動する異
なるプロモーターの用い方、及びウイルス転写単位に関
してこれらの配列の位置は、別のベクターのデザインの
作出において考慮に入れられたパラメーターの中のいく
つかであった4 5 6。これらのベクターのいくつかが、
異なる条件下でヒト・リンパ球細胞を形質導入するため
に使用された。ヒト腫瘍浸潤性リンパ球（TILs）は、ネ
オマイシン・ホスホトランスフェラーゼ（Neo）遺伝子
を担持する、N2レトロウイルス・ベクターにより形質導
入され、そしてインビトロにおいて正常な表現型及び機
能特性を保持された7 8。形質導入された細胞は、メラ
ノーマ患者へのインビボにおける細胞投与の64日後まで
に腫瘍部位から回収された９。遺伝子伝達は、TILsとPB
Lsから得られたCD4+とCD8+のヒトＴ−細胞サブセットの
両方において得られた10。ウイルスLTRプロモーターに
より駆動される、機能的CD18遺伝子の発現のためのレト
ロウイルス・ベクターは、リンパ球接着不全（LAD）を
患った患者からのリンパ球を首尾よく形質導入し、そし
てインビトロにおいてLADの矯正を導いた。ADA-SCIDを
患った患者から得られたPBLs中のダブル・コピー・ベク
ター６内へのADAプロモーターにより駆動されるヒトADA
の発現も、この酵素の欠陥の矯正を導びき、免疫機能の
再構築を許容する12 13。最後に、RNAポリメラーゼIII
プロモーターにより駆動される、HIV構造RNA配列（トラ
ンス作用性応答性要素、TAR、及びRev−応答性要素、RR
E）の過剰発現のためのレトロウイルス構築物が、Ｔ−
リンパ球セルライン内に首尾よく導入されて、HIVに対
する部分的免疫感作を誘導した14 15。すべてのこれら
の場合において、レトロウイルス・ベクターは、ヒト・
リンパ球を形質導入し、そしてその伝達された遺伝子を
発現することが示されたけれども、その形質導入された
遺伝子の安定性、遺伝子移入の効率、及び発現について
異なるベクター・デザインを直接的に比較する試みは未
だ全く行われていない。
ヒト低アフィニティー神経成長因子レセプター（LNGF
R）は、ほとんどのヒト造血細胞上で発現されず、これ
故、単一細胞レベルにおいてさえ、免疫蛍光分析による
各々のベクター及び各々の細胞標的についての形質導入
された遺伝子発現の定量分析を許容する。骨髄及びリン
パ起源の異なるヒト造血セルライン、並びに正常な末梢
血液単核細胞（PBMC）が、４つのベクターにより形質導
入され、そしてRNAとタンパク質レベルの両方におい
て、ウイルス組み込み及びLNGFR発現の安定性と数につ
いて分析された。LNGFRと細胞表面マーカーの同時発現
についての形質導入されたＴ−セルラインとクローンの
FACS分析が特定のＴ細胞サブ集団内での遺伝子発現を研
究するために行われた。適当な、高効率の感染条件下
で、全てのレトロウイルス・ベクターが、正常な免疫能
力をもつＴ細胞集団を形質導入することができた。それ
故、本発明に従って、（その細胞内ドメインをもたない
切り詰められた形態、又はその（本質的に）修飾されて
いない形態における）LNGFRは、それらの細胞をLNGFRを
コードする核酸によりトランスフェクトすることによ
り、細胞マーキングするための好ましいマーカーであ
る。トランスフェクションのために、例えば、ベクタ
ー、例えば、レトロウイルス・ベクター又は生DNAが、
例えばトランスフェクト剤としてリポソームを用いて使
用される。LNGFRマーカーは、好ましくは、造血系の細
胞の、特に造血幹細胞の、マーキングのために、使用さ
れる。特に好ましいのは、遺伝子治療及びパージング方
法におけるマーキングのための使用である。
R）は、ほとんどのヒト造血細胞上で発現されず、これ
故、単一細胞レベルにおいてさえ、免疫蛍光分析による
各々のベクター及び各々の細胞標的についての形質導入
された遺伝子発現の定量分析を許容する。骨髄及びリン
パ起源の異なるヒト造血セルライン、並びに正常な末梢
血液単核細胞（PBMC）が、４つのベクターにより形質導
入され、そしてRNAとタンパク質レベルの両方におい
て、ウイルス組み込み及びLNGFR発現の安定性と数につ
いて分析された。LNGFRと細胞表面マーカーの同時発現
についての形質導入されたＴ−セルラインとクローンの
FACS分析が特定のＴ細胞サブ集団内での遺伝子発現を研
究するために行われた。適当な、高効率の感染条件下
で、全てのレトロウイルス・ベクターが、正常な免疫能
力をもつＴ細胞集団を形質導入することができた。それ
故、本発明に従って、（その細胞内ドメインをもたない
切り詰められた形態、又はその（本質的に）修飾されて
いない形態における）LNGFRは、それらの細胞をLNGFRを
コードする核酸によりトランスフェクトすることによ
り、細胞マーキングするための好ましいマーカーであ
る。トランスフェクションのために、例えば、ベクタ
ー、例えば、レトロウイルス・ベクター又は生DNAが、
例えばトランスフェクト剤としてリポソームを用いて使
用される。LNGFRマーカーは、好ましくは、造血系の細
胞の、特に造血幹細胞の、マーキングのために、使用さ
れる。特に好ましいのは、遺伝子治療及びパージング方
法におけるマーキングのための使用である。
造血幹細胞内への効率的なレトロウイルス・ベクター
遺伝子伝達は、多くの先天的及び後天的失調のための遺
伝子治療の主要な目的を未だ残したままである。媒体と
して、レトロウイルス・ベクターは、今日、ヒトの血液
−リンパ球産生細胞内への外来DNAの伝達及び発現のた
めの最も安全且つ有効なツールである。実際に、骨髄又
は血液細胞内での遺伝子移入のための認可された臨床的
プロトコールのすべてがレトロウイルス・ベクターに頼
っている1,3。理想的な標的細胞は多能性幹細胞により
代表されるけれども、適当な効率においてこのような細
胞を形質導入し、そしてそれらの子孫において安定した
遺伝子発現を維持する、そのレトロウイルス・ベクター
の能力について決定的な証拠は全くない。骨髄遺伝子伝
達に基づく進行中の臨床プロトコールの結果はこれらの
問題を明確にするかもしれない1,3,30。
遺伝子伝達は、多くの先天的及び後天的失調のための遺
伝子治療の主要な目的を未だ残したままである。媒体と
して、レトロウイルス・ベクターは、今日、ヒトの血液
−リンパ球産生細胞内への外来DNAの伝達及び発現のた
めの最も安全且つ有効なツールである。実際に、骨髄又
は血液細胞内での遺伝子移入のための認可された臨床的
プロトコールのすべてがレトロウイルス・ベクターに頼
っている1,3。理想的な標的細胞は多能性幹細胞により
代表されるけれども、適当な効率においてこのような細
胞を形質導入し、そしてそれらの子孫において安定した
遺伝子発現を維持する、そのレトロウイルス・ベクター
の能力について決定的な証拠は全くない。骨髄遺伝子伝
達に基づく進行中の臨床プロトコールの結果はこれらの
問題を明確にするかもしれない1,3,30。
明らかに、少なくとも、免疫系の先天及び後天疾患の
ために、遺伝子移入は、末梢血液リンパ球、骨髄細胞に
対する可能性のある代替物内で、より容易に達成される
ことができる。しかしながら、この目的のためには、そ
の全免疫レパートリーを提示するためにPBLsのどれ程の
割合が形質導入される必要があるか、そして、これがイ
ンビボにおいて安定して維持されることができるかどう
か、この両方が治療関連にあるための遺伝子移入手順の
ための必要な先行条件である、を決定することが必要で
ある。この目的のために、遺伝子発現の持続性とレベル
の両方に影響する、遺伝子移入の効率とベクター・デザ
インが決定的な要因である。
ために、遺伝子移入は、末梢血液リンパ球、骨髄細胞に
対する可能性のある代替物内で、より容易に達成される
ことができる。しかしながら、この目的のためには、そ
の全免疫レパートリーを提示するためにPBLsのどれ程の
割合が形質導入される必要があるか、そして、これがイ
ンビボにおいて安定して維持されることができるかどう
か、この両方が治療関連にあるための遺伝子移入手順の
ための必要な先行条件である、を決定することが必要で
ある。この目的のために、遺伝子発現の持続性とレベル
の両方に影響する、遺伝子移入の効率とベクター・デザ
インが決定的な要因である。
ヒトPBLs内への遺伝子移入の全体的な効率は、その感
染プロトコールに厳密に依存した。リンパ球のインビト
ロにおける短期間活性化による限定された細胞増殖、そ
の後の、産生細胞上清への暴露によるPBLs内への遺伝子
移入は、限定された割合のG418−耐性細胞（感染サイク
ル当り約１％）をもたらした。追加の活性はベクター上
清のタイターにより導入された。遺伝子移入の効率は、
標的細胞のより延長されたインビトロにおける増殖によ
り増加されることができる。
染プロトコールに厳密に依存した。リンパ球のインビト
ロにおける短期間活性化による限定された細胞増殖、そ
の後の、産生細胞上清への暴露によるPBLs内への遺伝子
移入は、限定された割合のG418−耐性細胞（感染サイク
ル当り約１％）をもたらした。追加の活性はベクター上
清のタイターにより導入された。遺伝子移入の効率は、
標的細胞のより延長されたインビトロにおける増殖によ
り増加されることができる。
ベクター含有上清による３サイクルのPBLs感染の後
の、PBLsの集団におけるＶβ用法のレパートリーの分
析、その後の、G418による形質導入された細胞の選択
は、非形質導入／非選択のリンパ球の元の対照集団に比
べてたとき、無傷のレパートリーを作り出した。これら
のデータは、標的細胞の限定された増殖とベクター含有
上清の使用は、少なくとも、ベクター上清が良好なウイ
ルス・タイター（＞５×105）をもつとき、その比較的
低頻度の遺伝子移入から独立して、適当な遺伝子移入を
作り出す。しかしながら、ベクター上清中の低ウイルス
・タイターは、限定されたＶβレパートリーを作り出し
た。これは、TCR−β鎖再編成のサザン・ブロット分析
により、形質転換され／選択された集団においてオリゴ
クローンのパターンを示したということが確認された。
この限定は、照射されたベクター産生細胞とのPBLsの同
時培養により回避された。ウイルス・タイターとは独立
して、この遺伝子伝達手順は、少なくとも１の大きさの
オーダー程、有意により有効である。同時培養による高
効率の遺伝子移入及び形質導入された発現LNGFRを利用
して、簡単なプロトコールが、均質な形質導入された細
胞の生産を許容する同時培養と免疫選択に関して改作さ
れた。
の、PBLsの集団におけるＶβ用法のレパートリーの分
析、その後の、G418による形質導入された細胞の選択
は、非形質導入／非選択のリンパ球の元の対照集団に比
べてたとき、無傷のレパートリーを作り出した。これら
のデータは、標的細胞の限定された増殖とベクター含有
上清の使用は、少なくとも、ベクター上清が良好なウイ
ルス・タイター（＞５×105）をもつとき、その比較的
低頻度の遺伝子移入から独立して、適当な遺伝子移入を
作り出す。しかしながら、ベクター上清中の低ウイルス
・タイターは、限定されたＶβレパートリーを作り出し
た。これは、TCR−β鎖再編成のサザン・ブロット分析
により、形質転換され／選択された集団においてオリゴ
クローンのパターンを示したということが確認された。
この限定は、照射されたベクター産生細胞とのPBLsの同
時培養により回避された。ウイルス・タイターとは独立
して、この遺伝子伝達手順は、少なくとも１の大きさの
オーダー程、有意により有効である。同時培養による高
効率の遺伝子移入及び形質導入された発現LNGFRを利用
して、簡単なプロトコールが、均質な形質導入された細
胞の生産を許容する同時培養と免疫選択に関して改作さ
れた。
同時培養プロトコールは臨床的使用のためには未だ安
全でないと考えられているけれども、細胞と細胞の接触
を回避しながらウイルスの通過を許容する、細孔生膜に
よりベクター産生細胞及びPBLsが分離されて維持される
ような同時培養条件が案出された。このアプローチは、
上清感染と比べたとき、いくつかの利点を提供する。
全でないと考えられているけれども、細胞と細胞の接触
を回避しながらウイルスの通過を許容する、細孔生膜に
よりベクター産生細胞及びPBLsが分離されて維持される
ような同時培養条件が案出された。このアプローチは、
上清感染と比べたとき、いくつかの利点を提供する。
LNGFRと異なるＴ細胞表面マーカーの同時発現のため
のG418−選択Ｔ細胞の２重蛍光分析は、見かけの等しい
効率の遺伝子移入をもつすべてのテストされたサブ集団
の同様の感受性を示した。さらに、我々は、遺伝子移入
が未熟になる決定的な証拠を通じて散発的な、CD4+/CD8
+細胞を得た。我々は、先に、TCR再編成に先行するＴ細
胞前駆細胞内へのレトロウイルス・ベクター仲介遺伝子
移入について示した13。本発明のデータは、低いが検出
可能な頻度において循環前駆細胞内への遺伝子移入をPB
MCsのレトロウイルス感染が許容するということを示
す。これは、インビトロにおける短時間培養と標的リン
パ球の限定増殖を含む遺伝子移入プロトコールの追加の
利点であることができる。
のG418−選択Ｔ細胞の２重蛍光分析は、見かけの等しい
効率の遺伝子移入をもつすべてのテストされたサブ集団
の同様の感受性を示した。さらに、我々は、遺伝子移入
が未熟になる決定的な証拠を通じて散発的な、CD4+/CD8
+細胞を得た。我々は、先に、TCR再編成に先行するＴ細
胞前駆細胞内へのレトロウイルス・ベクター仲介遺伝子
移入について示した13。本発明のデータは、低いが検出
可能な頻度において循環前駆細胞内への遺伝子移入をPB
MCsのレトロウイルス感染が許容するということを示
す。これは、インビトロにおける短時間培養と標的リン
パ球の限定増殖を含む遺伝子移入プロトコールの追加の
利点であることができる。
さらに、遺伝子移入及び発現の効率に対するベクター
構築物の影響を分析した。使用されたベクター構築物内
では、そのリポーター遺伝子は、あるいは、内部SV40又
はHSV−TKプロモーターの制御下のレトロウイルス転写
ユニット内（それぞれ、NSV−ＮとNTK−Ｎベクター）内
に、MoMLVウイルスLTR下（LNSN/SFCM）、又はヒトADAプ
ロモーターの制御下のレトロウイルス転写ユニット外
（“ダブル・コピー”ベクターDCN）に置かれた。リポ
ーター遺伝子としての本発明に係るレセプターの使用
は、単一細胞分割により、異なるPBLサブ集団内の遺伝
子発現レベルの研究を許容した。
構築物の影響を分析した。使用されたベクター構築物内
では、そのリポーター遺伝子は、あるいは、内部SV40又
はHSV−TKプロモーターの制御下のレトロウイルス転写
ユニット内（それぞれ、NSV−ＮとNTK−Ｎベクター）内
に、MoMLVウイルスLTR下（LNSN/SFCM）、又はヒトADAプ
ロモーターの制御下のレトロウイルス転写ユニット外
（“ダブル・コピー”ベクターDCN）に置かれた。リポ
ーター遺伝子としての本発明に係るレセプターの使用
は、単一細胞分割により、異なるPBLサブ集団内の遺伝
子発現レベルの研究を許容した。
選択された産生体クローンにおける異なるベクターに
ついて得られたウイルス・タイターは、かなりのもので
あった。但し、そのDCN産生体細胞は一貫して他の３つ
のベクターについてのものよりも５倍まで低いタイター
を作り出し、これは、ウイルスLTR内の余分の配列が、
たぶん逆転写／組み込み工程を妨害することにより、そ
の形質導入効率を減少させることができることを示唆し
ている。これは、再編成プロウイルスとして組み込まれ
るDCNの比較的高い傾向をも反映し、この再編成プロウ
イルスはさらに、このタイプのベクターにより得られる
ことができる全体的な遺伝子移入効率をさらに減少させ
る。
ついて得られたウイルス・タイターは、かなりのもので
あった。但し、そのDCN産生体細胞は一貫して他の３つ
のベクターについてのものよりも５倍まで低いタイター
を作り出し、これは、ウイルスLTR内の余分の配列が、
たぶん逆転写／組み込み工程を妨害することにより、そ
の形質導入効率を減少させることができることを示唆し
ている。これは、再編成プロウイルスとして組み込まれ
るDCNの比較的高い傾向をも反映し、この再編成プロウ
イルスはさらに、このタイプのベクターにより得られる
ことができる全体的な遺伝子移入効率をさらに減少させ
る。
遺伝子発現のレベルは、内部転写単位に基づくベクタ
ーがmRNA蓄積とタンパク質発現の両方に関して最小効率
であったことを示した。この唯一の例外は、EBV−感染
Ｂ−細胞系RIMにおける２つの異なるベクター（NSV−Ｎ
とLNSN/SFCM）内のSV−40プロモーターにより作られた
ひじょうに高レベルの転写であった。これは、SV−40エ
ンハンサーによるEBVトランス−作用性タンパク質の相
互作用を原因とすることができる。これに反し、報告さ
れた遺伝子の発現のためのMoMLV LTR及びヒトADAプロモ
ーターに基づくベクターは全造血系においてひじょうに
効率的に働いた。Ｔ−セルラインとクローンの分析は本
質的に同じ結果を与えた。LNSNとDCNベクターの両方
が、未熟前駆体を含む全Ｔ細胞サブ集団内の高レベルの
遺伝子発現の指令においてひじょうに効率的であり、そ
して高数の継代を通じてこれらのレベルは変化せずに維
持された。
ーがmRNA蓄積とタンパク質発現の両方に関して最小効率
であったことを示した。この唯一の例外は、EBV−感染
Ｂ−細胞系RIMにおける２つの異なるベクター（NSV−Ｎ
とLNSN/SFCM）内のSV−40プロモーターにより作られた
ひじょうに高レベルの転写であった。これは、SV−40エ
ンハンサーによるEBVトランス−作用性タンパク質の相
互作用を原因とすることができる。これに反し、報告さ
れた遺伝子の発現のためのMoMLV LTR及びヒトADAプロモ
ーターに基づくベクターは全造血系においてひじょうに
効率的に働いた。Ｔ−セルラインとクローンの分析は本
質的に同じ結果を与えた。LNSNとDCNベクターの両方
が、未熟前駆体を含む全Ｔ細胞サブ集団内の高レベルの
遺伝子発現の指令においてひじょうに効率的であり、そ
して高数の継代を通じてこれらのレベルは変化せずに維
持された。
結論として、LTR−ベース・レトロウイルス・ベクタ
ーは、ヒトPBLs内への遺伝子移入及び発現のためにたぶ
ん最も信頼性があり、そして効率的であり、一方、遺伝
子発現に関してはひじょうに良好であるが、上記DCデザ
インは、低タイターとゲノム再編成への傾向の両方によ
り一般的に低い遺伝子移入効率をもたらす。しかしなが
ら、このタイプの構築物は、組織特異的、誘導性、又は
その他LTR−独立遺伝子発現が強制的な要求であり、又
はその他LTR失活が生じることができるかもしれない組
織内にあるとき、選ばれるベクターであることができ
た。我々は本研究においてこの論点について言及しなか
ったけれども、ヒト造血幹細胞は、ネズミ造血系内で観
察されたものに対する類似性により、これらの組織の中
にあるであろう。
ーは、ヒトPBLs内への遺伝子移入及び発現のためにたぶ
ん最も信頼性があり、そして効率的であり、一方、遺伝
子発現に関してはひじょうに良好であるが、上記DCデザ
インは、低タイターとゲノム再編成への傾向の両方によ
り一般的に低い遺伝子移入効率をもたらす。しかしなが
ら、このタイプの構築物は、組織特異的、誘導性、又は
その他LTR−独立遺伝子発現が強制的な要求であり、又
はその他LTR失活が生じることができるかもしれない組
織内にあるとき、選ばれるベクターであることができ
た。我々は本研究においてこの論点について言及しなか
ったけれども、ヒト造血幹細胞は、ネズミ造血系内で観
察されたものに対する類似性により、これらの組織の中
にあるであろう。
レトロウイルス・ベクター−仲介細胞マーキングにつ
いて、いずれのシグナル伝達をも、その表面上に存在す
るレセプターがその結合性パートナーへの結合の後には
っきりと、もたらすことができるような方法で、そのレ
セプターの細胞内ドメインが全体的に又は部分的に欠失
又は修飾されている細胞表面分子をコードし又は細胞表
面分子LNGFRをコードする遺伝子の使用は、その細胞膜
上で発現されないマーカー遺伝子、通常NeoR遺伝子を使
用する先の遺伝子マーキング実験において使用されたベ
クターを超える重要な利点を提示した。このタイプのベ
クターは、細胞マーキングのインビボにおける臨床前及
び臨床研究のための潜在的な利点を提示するであろう。
いて、いずれのシグナル伝達をも、その表面上に存在す
るレセプターがその結合性パートナーへの結合の後には
っきりと、もたらすことができるような方法で、そのレ
セプターの細胞内ドメインが全体的に又は部分的に欠失
又は修飾されている細胞表面分子をコードし又は細胞表
面分子LNGFRをコードする遺伝子の使用は、その細胞膜
上で発現されないマーカー遺伝子、通常NeoR遺伝子を使
用する先の遺伝子マーキング実験において使用されたベ
クターを超える重要な利点を提示した。このタイプのベ
クターは、細胞マーキングのインビボにおける臨床前及
び臨床研究のための潜在的な利点を提示するであろう。
図面の簡単な説明 図1:LNGFR発現のためのレトロウイルス・ベクター
（A,C,E,G）。組み込まれたNSV−Ｎ（Ａ）,NTK−Ｎ
（Ｃ）,LNSN（Ｅ）及びDCN（Ｇ）プロウイルス・ゲノム
の概略マップを示す。SV40（SV）,HSV−TK（TK）及びヒ
トADA（ADAp）内部プロモーターも示す。ブラック・ボ
ックスはLTR配列を表す。Xba IとHind III（Ｈ）制限部
位も示す。各々のベクターから得られるRNA種をこれら
のマップ上に番号を付けた矢印で示す。
（A,C,E,G）。組み込まれたNSV−Ｎ（Ａ）,NTK−Ｎ
（Ｃ）,LNSN（Ｅ）及びDCN（Ｇ）プロウイルス・ゲノム
の概略マップを示す。SV40（SV）,HSV−TK（TK）及びヒ
トADA（ADAp）内部プロモーターも示す。ブラック・ボ
ックスはLTR配列を表す。Xba IとHind III（Ｈ）制限部
位も示す。各々のベクターから得られるRNA種をこれら
のマップ上に番号を付けた矢印で示す。
図2:K562（１）,KG1（２）,Raji（３）,Daudi（４）,
RIM（５）,MOLT−４（６）及びJ.M.（７）セルラインの
DNAのXba I消化における４つのレトロウイルス・ベクタ
ー（Ａ−Ｄ）の組み込みのサザン・ブロット分析であっ
てNeoプローブによりハイブリダイズされたもの。無傷
で組み込まれたプロウイルスに対応するバンドを、それ
らの分子量（kb）と一緒に示す。再編成バンドを矢印に
より示す。
RIM（５）,MOLT−４（６）及びJ.M.（７）セルラインの
DNAのXba I消化における４つのレトロウイルス・ベクタ
ー（Ａ−Ｄ）の組み込みのサザン・ブロット分析であっ
てNeoプローブによりハイブリダイズされたもの。無傷
で組み込まれたプロウイルスに対応するバンドを、それ
らの分子量（kb）と一緒に示す。再編成バンドを矢印に
より示す。
図３と4:さまざまなベクター構築物。（L:リーダー配
列;EXTR:細胞外ドメイン;T:トランスメンブラン・ドメ
イン;INTR:細胞内ドメイン；ブラック・ボックス:LTR;
ψ：パッケージング・シグナル）。
列;EXTR:細胞外ドメイン;T:トランスメンブラン・ドメ
イン;INTR:細胞内ドメイン；ブラック・ボックス:LTR;
ψ：パッケージング・シグナル）。
実施例 実施例１ レトロウイルス・ベクター リポーター遺伝子としてのLNGFRの発現のためのさま
ざまなレトロウイルス・ベクターを、（例えば、Pvu II
とSst Iによる制限酵素処理により）ヒトLNGFR cDNA16
の全体コード1.5kb Sst I断片又は細胞内ドメインをも
たない切断LNGFR cDNAを使用して、作った。NSV−ＮとN
TK−Ｎベクターを、それぞれ、NSVとNTKベクターのユニ
ークHind IIIとBgl II部位内にそのLNGFR cDNAをクロー
ニングすることにより得た。NSVベクターを、SV40の初
期プロモーター・エンハンサー及び上記ユニークXho I
クローニング部位への複製起点を含む0.4kb Kpn I/Hind
III断片の挿入によりその元のN2ベクター17から得た。
このNTKベクターも、852塩基対の単純ヘルペス・ウイル
ス（HSV）チミジン・キナーゼ（TK）プロモーターの挿
入によりN2から得た。
ざまなレトロウイルス・ベクターを、（例えば、Pvu II
とSst Iによる制限酵素処理により）ヒトLNGFR cDNA16
の全体コード1.5kb Sst I断片又は細胞内ドメインをも
たない切断LNGFR cDNAを使用して、作った。NSV−ＮとN
TK−Ｎベクターを、それぞれ、NSVとNTKベクターのユニ
ークHind IIIとBgl II部位内にそのLNGFR cDNAをクロー
ニングすることにより得た。NSVベクターを、SV40の初
期プロモーター・エンハンサー及び上記ユニークXho I
クローニング部位への複製起点を含む0.4kb Kpn I/Hind
III断片の挿入によりその元のN2ベクター17から得た。
このNTKベクターも、852塩基対の単純ヘルペス・ウイル
ス（HSV）チミジン・キナーゼ（TK）プロモーターの挿
入によりN2から得た。
このLNSNベクターを、LXSNベクター５のHpa I部位内
への上記LNGFR cDNAに挿入により構築した。
への上記LNGFR cDNAに挿入により構築した。
DCNベクター（ダブル・コピーLNGFR）においては、こ
のLNGFR cDNAは、N2Aレトロウイルス・ベクター／ポリ
リンカー６のBal II/SnaB I部位内にヒト・アデノシン
・デアミナーゼ（ADA）プロモーター18の0.8kb Ssp I/N
co I断片の制御下で、クローン化された。
のLNGFR cDNAは、N2Aレトロウイルス・ベクター／ポリ
リンカー６のBal II/SnaB I部位内にヒト・アデノシン
・デアミナーゼ（ADA）プロモーター18の0.8kb Ssp I/N
co I断片の制御下で、クローン化された。
全く同様に、NSV−N,NTK−N,LNSNとDCNベクターにお
いて、LNGFR cDNAの代わりに切断LNGFR cDNA（ΔLNGF
R）を使用することができる。
いて、LNGFR cDNAの代わりに切断LNGFR cDNA（ΔLNGF
R）を使用することができる。
本発明に係るさまざまなベクター構築物を図３と４中
に示す。
に示す。
ベクターDNAを上記トランス感染プロトコールにより
対応のベクターに変換した。簡単に言えば、ベクターDN
Aを、トランスフェクション後48時間標準的なリン酸カ
ルシウム共沈法20によりψ２環境向性（ecotropic）パ
ッケージング・セルライン19内にトランスフェクトし、
ψ２上清を収穫し、そして８μg/mlのポリブレンの存在
中16時間両向性（amphotropic）パッケージング・セル
ラインPA31721を感染させるために使用した。感染され
たPA317細胞を、10％FCS（Hyclone,Logan,UT）を補わ
れ、そして0.8mg/ml G418（GIBCO）を含むDMEM（GIBCO,
Grand Island,NY）中で選択し、そして次に104〜５×10
5cfu/mlのレンジにあるタイターをもつヘルパー不含ウ
イルス含有上清を作るために使用した。全てのベクター
が、ネオマイシン・アナログG418に対する耐性をインビ
トロにおいて付与するネオマイシン・ホスホトランスフ
ェラーゼをコードする遺伝子NeoR遺伝子を含む。
対応のベクターに変換した。簡単に言えば、ベクターDN
Aを、トランスフェクション後48時間標準的なリン酸カ
ルシウム共沈法20によりψ２環境向性（ecotropic）パ
ッケージング・セルライン19内にトランスフェクトし、
ψ２上清を収穫し、そして８μg/mlのポリブレンの存在
中16時間両向性（amphotropic）パッケージング・セル
ラインPA31721を感染させるために使用した。感染され
たPA317細胞を、10％FCS（Hyclone,Logan,UT）を補わ
れ、そして0.8mg/ml G418（GIBCO）を含むDMEM（GIBCO,
Grand Island,NY）中で選択し、そして次に104〜５×10
5cfu/mlのレンジにあるタイターをもつヘルパー不含ウ
イルス含有上清を作るために使用した。全てのベクター
が、ネオマイシン・アナログG418に対する耐性をインビ
トロにおいて付与するネオマイシン・ホスホトランスフ
ェラーゼをコードする遺伝子NeoR遺伝子を含む。
造血セルラインの感染 この研究において記載される全てのセルラインは、RI
MとJ.M.を除いて、ATCCから得て、そして10％FCSを補っ
たRPMI 1640（GIBCO）中で培養した。K562とKG1は、そ
れぞれ、慢性と急性骨髄原性白血病から得た骨髄セルラ
インであり;MOLT−４は、安定性Ｔ細胞白血病（CD8+）
であると考えられ;RIMはEBV−形質転換リンパ芽セルラ
インであり;J.M.はCD4+/CD8+T−リンパ芽セルラインで
あり;A875は〜106LNGFR/細胞を発現するヒト・メラノー
マ・セルラインである。
MとJ.M.を除いて、ATCCから得て、そして10％FCSを補っ
たRPMI 1640（GIBCO）中で培養した。K562とKG1は、そ
れぞれ、慢性と急性骨髄原性白血病から得た骨髄セルラ
インであり;MOLT−４は、安定性Ｔ細胞白血病（CD8+）
であると考えられ;RIMはEBV−形質転換リンパ芽セルラ
インであり;J.M.はCD4+/CD8+T−リンパ芽セルラインで
あり;A875は〜106LNGFR/細胞を発現するヒト・メラノー
マ・セルラインである。
５×105標的細胞を、８μg/mlポリブレンを含む非希
釈ウイルス上清により16時間感染させ、完全培地中でさ
らに24時間増殖させ、そして次にG418の先に決定した投
与量（0.5〜1.5mg/ml）の存在中で選択した。さらなる
分析をG418選択細胞のバルク・カルチャーに対して行っ
た。
釈ウイルス上清により16時間感染させ、完全培地中でさ
らに24時間増殖させ、そして次にG418の先に決定した投
与量（0.5〜1.5mg/ml）の存在中で選択した。さらなる
分析をG418選択細胞のバルク・カルチャーに対して行っ
た。
ヒトPBMCの感染 末梢血液単核細胞（PBMC）をFicoll−Hypaque（Pharm
acia,Uppsala,Sweden）グラジエント分離により健康な
ドナーから得て、そしてフィトヘマグルチニン（phytoh
emagglutinin（PHA））とヒト組換えインターロイキン
２（hu−rIL2）刺激（２μg/mlの精製PHA,Wellcome,Lab
s.,Dartford,UK;100U/mlのhu−rIL2,Roche,Nutley,NJ）
の下で72時間増殖させた。ウイルス感染を、ポリブレン
（８μg/ml）の存在中６時間無細胞ウイルス・ストック
に刺激されたPBLを晒すことにより行った。感染48時間
後に、PBLを、2mM L−グルタミン、１％非−必須アミノ
酸、１％ピルビン酸Na、５％ヒト血清（HS）と100U/ml
hu−rIL2（完全培地）を補い、0.4mg/ml G418を含むRPM
I 1640中で選択した。細胞密度を、G418選択の２週間の
間に一定（５×105細胞/ml）に維持した。レトロウイル
ス形質導入ヒトＴ−リンパ球も、支持細胞として照射ヒ
トPBLの存在中0.4mg/ml G418を含む完全培地中各種細胞
濃度（１−103細胞／ウェル）においてTerasakiプレー
ト内でクローン化した。
acia,Uppsala,Sweden）グラジエント分離により健康な
ドナーから得て、そしてフィトヘマグルチニン（phytoh
emagglutinin（PHA））とヒト組換えインターロイキン
２（hu−rIL2）刺激（２μg/mlの精製PHA,Wellcome,Lab
s.,Dartford,UK;100U/mlのhu−rIL2,Roche,Nutley,NJ）
の下で72時間増殖させた。ウイルス感染を、ポリブレン
（８μg/ml）の存在中６時間無細胞ウイルス・ストック
に刺激されたPBLを晒すことにより行った。感染48時間
後に、PBLを、2mM L−グルタミン、１％非−必須アミノ
酸、１％ピルビン酸Na、５％ヒト血清（HS）と100U/ml
hu−rIL2（完全培地）を補い、0.4mg/ml G418を含むRPM
I 1640中で選択した。細胞密度を、G418選択の２週間の
間に一定（５×105細胞/ml）に維持した。レトロウイル
ス形質導入ヒトＴ−リンパ球も、支持細胞として照射ヒ
トPBLの存在中0.4mg/ml G418を含む完全培地中各種細胞
濃度（１−103細胞／ウェル）においてTerasakiプレー
ト内でクローン化した。
レトロウイルス感染効率を改善するために、ヒトPBL
を完全培地中で48−72時間ウイルス産生細胞と同時培養
した。この同時培養を、細胞と細胞の接触を妨ぐために
Transwellプレート（Costar,Cambridge,MA）内でも行っ
た。３×105産生体細胞を６ウェル皿のクラスター・プ
レート・ウェル内に接種し、そして37℃において一夜イ
ンキュベートした。５×105刺激PBLをそのTranswell内
に添加し、そして８μg/mlポリブレンの存在中で48−72
時間培養した。
を完全培地中で48−72時間ウイルス産生細胞と同時培養
した。この同時培養を、細胞と細胞の接触を妨ぐために
Transwellプレート（Costar,Cambridge,MA）内でも行っ
た。３×105産生体細胞を６ウェル皿のクラスター・プ
レート・ウェル内に接種し、そして37℃において一夜イ
ンキュベートした。５×105刺激PBLをそのTranswell内
に添加し、そして８μg/mlポリブレンの存在中で48−72
時間培養した。
レトロウイルス形質導入細胞を、レセプター発現のた
めのフロー・サイトメトリーにより分析し、そしてさら
なる分析のために増殖させた。
めのフロー・サイトメトリーにより分析し、そしてさら
なる分析のために増殖させた。
DNA分析 高分子量DNAを、標準的なフェノール／クロロホルム
抽出20により細胞から得て、適当な制限酵素（GIBCO−B
RL）を含む５μｇアリコート中で完全に消化し、トリス
−アセテート−EDTAバッファー中1.5V/cmにおいて0.8％
アガロース・ゲル中で電気泳動し、サザン・キャピラリ
ー・ブロッティング20によりナイロン膜（Hybond−N,Am
ersham,Buckinghamshire,UK）に移写し、そして107dpm
の〔32P〕−標識・プローブにハイブリダイズさせた。
抽出20により細胞から得て、適当な制限酵素（GIBCO−B
RL）を含む５μｇアリコート中で完全に消化し、トリス
−アセテート−EDTAバッファー中1.5V/cmにおいて0.8％
アガロース・ゲル中で電気泳動し、サザン・キャピラリ
ー・ブロッティング20によりナイロン膜（Hybond−N,Am
ersham,Buckinghamshire,UK）に移写し、そして107dpm
の〔32P〕−標識・プローブにハイブリダイズさせた。
DNA分析−サザン・ブロット プローブ： １）pSV2−neoの断片及び ２）TCR−β−定常領域を含む断片。
DNAプローブは、ヒトTCR−β定常領域23を含む、pSV2
−neo22の1.2kb Hind III/Sma I断片及びYTJ−2 cDNAク
ローンのHinc II 3′断片であった。フィルターを高ス
トリンジェント条件下で洗浄し、そして−70℃において
Kodak X−AR 5フィルムに露出させた。
−neo22の1.2kb Hind III/Sma I断片及びYTJ−2 cDNAク
ローンのHinc II 3′断片であった。フィルターを高ス
トリンジェント条件下で洗浄し、そして−70℃において
Kodak X−AR 5フィルムに露出させた。
RNA分析−ノーザン・ブロット プローブ： １）pSV2neoの断片及び ２）LNGFR cDNAの断片。
全細胞RNAを、グアニジン−イソチオシアネート技術
24により抽出し、そしてオリゴ（dT）−セルロース・ク
ロマトグラフィー20によりpoly（Ａ）＋について選択し
た。５μｇのpoly（Ａ）+RNAを、１％アガロース−ホル
ムアルデヒド・ゲル上でサイズ分画し、ノーザン・キャ
ピラリー・ブロッティング25によりナイロン膜上に転写
し、そしてサザン・ブロットについて記載したようにハ
イブリダイズさせ、洗浄し、そして露出させた。DNAプ
ローブは、pSV2−neoの1.2kb Hind III/Sma I断片とLNG
FR cDNA16の1.5kb Sst I断片であった。
24により抽出し、そしてオリゴ（dT）−セルロース・ク
ロマトグラフィー20によりpoly（Ａ）＋について選択し
た。５μｇのpoly（Ａ）+RNAを、１％アガロース−ホル
ムアルデヒド・ゲル上でサイズ分画し、ノーザン・キャ
ピラリー・ブロッティング25によりナイロン膜上に転写
し、そしてサザン・ブロットについて記載したようにハ
イブリダイズさせ、洗浄し、そして露出させた。DNAプ
ローブは、pSV2−neoの1.2kb Hind III/Sma I断片とLNG
FR cDNA16の1.5kb Sst I断片であった。
細胞表面表現型 １）蛍光標識をもつ抗ヒトLNGFR及び ２）PE結合抗−ヒトMoAbs を使用してフロー・サイトメトリーによりモニターされ
たLNGFRの発現。
たLNGFRの発現。
LNGFRの細胞表面発現を、間接蛍光標識法によるネズ
ミ抗−ヒトLNGFRモノクローナル抗体20.4（ATCC）を使
用したフロー・サイトメトリーによりモニターした。Ｔ
−リンパ球系及びクローンの細胞表面表現型を、PE−結
合抗−ヒト−CD4（T4）、CD8（T8）,CD5,B4,CD25R,Leu
7、CD34モノクローナル抗体（MoAb）（Coulter Immunol
ogy,Hialeah,FL）によるフロー・サイトメトリーにより
測定した。簡単に言えば、５×105細胞を30分間で４℃
において100μｌの希釈抗体により染色し、FCSを含まな
い培地中で２回洗浄し、そしてFACS分析のために0.5ml
のPBS中に又は100μｌの希釈FITC−結合２次抗体中に再
懸濁した。２重染色分析をFITC−及びPE−結合抗体の順
番のインキュベーションにより行った。
ミ抗−ヒトLNGFRモノクローナル抗体20.4（ATCC）を使
用したフロー・サイトメトリーによりモニターした。Ｔ
−リンパ球系及びクローンの細胞表面表現型を、PE−結
合抗−ヒト−CD4（T4）、CD8（T8）,CD5,B4,CD25R,Leu
7、CD34モノクローナル抗体（MoAb）（Coulter Immunol
ogy,Hialeah,FL）によるフロー・サイトメトリーにより
測定した。簡単に言えば、５×105細胞を30分間で４℃
において100μｌの希釈抗体により染色し、FCSを含まな
い培地中で２回洗浄し、そしてFACS分析のために0.5ml
のPBS中に又は100μｌの希釈FITC−結合２次抗体中に再
懸濁した。２重染色分析をFITC−及びPE−結合抗体の順
番のインキュベーションにより行った。
PCRを介してのTCR Vβ−鎖用法の分析 全RNAを、GTCを使用してPBLとＴセルラインから抽出
し26、オリゴdTとdGテイルを使用してcDNAに逆転写
し27、得られたDNAの1/20をＶβ−Ｃβ特異的オリゴヌ
クレオチドの使用によりPCRに供し28、そして参考文献
27中に記載されたような、Ｃβ−特異的オリゴヌクレオ
チド （配列番号:2）を使用してアンカーPCRに供した。PCR増
幅サイクルを、94℃において45分間、57℃において45分
間、そして72℃において１時間で行った。増幅された生
成物をゲル精製し、そしてブルースクリプト・プラスミ
ド・ベクター内にクローン化した。Ｃβ陽性コロニーを
異なるプレート上に複製し、そしてニトロセルロース・
フィルターに転写し、そして以下の条件:6×SSC、１％b
lotto、0.1％SDS及び5mM EDTA、42℃、３−６時間、の
下でＶβ−特異的オリゴヌクレオチド28,29にハイブリ
ダイズし、そして６×SSC中で同一温度において１時間
洗浄し、そして室温においてＸ−線フィルムに６−12時
間露出させた。
し26、オリゴdTとdGテイルを使用してcDNAに逆転写
し27、得られたDNAの1/20をＶβ−Ｃβ特異的オリゴヌ
クレオチドの使用によりPCRに供し28、そして参考文献
27中に記載されたような、Ｃβ−特異的オリゴヌクレオ
チド （配列番号:2）を使用してアンカーPCRに供した。PCR増
幅サイクルを、94℃において45分間、57℃において45分
間、そして72℃において１時間で行った。増幅された生
成物をゲル精製し、そしてブルースクリプト・プラスミ
ド・ベクター内にクローン化した。Ｃβ陽性コロニーを
異なるプレート上に複製し、そしてニトロセルロース・
フィルターに転写し、そして以下の条件:6×SSC、１％b
lotto、0.1％SDS及び5mM EDTA、42℃、３−６時間、の
下でＶβ−特異的オリゴヌクレオチド28,29にハイブリ
ダイズし、そして６×SSC中で同一温度において１時間
洗浄し、そして室温においてＸ−線フィルムに６−12時
間露出させた。
結 果 LNGFRの発現のための組換えレトロウイルスの作出 LNGFR発現のためのさまざまなレトロウイルス・ベク
ター構築物を開発し、そしてウイルス産生セルラインの
作出のために使用した。NSV−Ｎ（図1A）とNTK−Ｎ（図
1C）構築物は、LNGFR cDNAを駆動するプロモーター、す
なわち、それぞれ、SV40初期プロモーターとHSV−TKプ
ロモーターに基づくものであった。LNSNベクター（図1
E）においては、そのLNGFR遺伝子はそのウイルスのLTR
から発現される。DCN構築物（図1G）においては、そのL
NGFR cDNAは、その３′LTRのV3領域内の、ヒトADAプロ
モーターの制御下にある。SFCM構築物は、その細胞内ド
メインが欠失している（ΔLNGFR）、切断LNGFR遺伝子を
含む。標的細胞の感染後、その切断遺伝子を２本鎖と
し、そしてその５′LTRに転移させ６、このように、ADA
−LNGFRミニ遺伝子の２コピーを含むプロウイルスを作
出する。全てのベクターが、ウイルスLTR（NSV−N,NTK
−ＮとDCN）又はSV40初期プロモーター（LNSNとSFCM）
のいずれかの制御下に、NeoR遺伝子を担持していた。
ター構築物を開発し、そしてウイルス産生セルラインの
作出のために使用した。NSV−Ｎ（図1A）とNTK−Ｎ（図
1C）構築物は、LNGFR cDNAを駆動するプロモーター、す
なわち、それぞれ、SV40初期プロモーターとHSV−TKプ
ロモーターに基づくものであった。LNSNベクター（図1
E）においては、そのLNGFR遺伝子はそのウイルスのLTR
から発現される。DCN構築物（図1G）においては、そのL
NGFR cDNAは、その３′LTRのV3領域内の、ヒトADAプロ
モーターの制御下にある。SFCM構築物は、その細胞内ド
メインが欠失している（ΔLNGFR）、切断LNGFR遺伝子を
含む。標的細胞の感染後、その切断遺伝子を２本鎖と
し、そしてその５′LTRに転移させ６、このように、ADA
−LNGFRミニ遺伝子の２コピーを含むプロウイルスを作
出する。全てのベクターが、ウイルスLTR（NSV−N,NTK
−ＮとDCN）又はSV40初期プロモーター（LNSNとSFCM）
のいずれかの制御下に、NeoR遺伝子を担持していた。
これらのベクターを、異なる系統のヒト造血セルライ
ン及びヒトPBL内にLNGFR遺伝子（及びその切断LNGFR遺
伝子のそれぞれ）を形質導入するために使用し、そして
それらは全て、 １）ヒト標的細胞を形質導入し、 ２）組み込み、そして無傷のプロウイルスを形成し、
そして ３）リポーター遺伝子を発現する、 ことができる。
ン及びヒトPBL内にLNGFR遺伝子（及びその切断LNGFR遺
伝子のそれぞれ）を形質導入するために使用し、そして
それらは全て、 １）ヒト標的細胞を形質導入し、 ２）組み込み、そして無傷のプロウイルスを形成し、
そして ３）リポーター遺伝子を発現する、 ことができる。
両向性産生体セルラインのウイルス・タイターは、NS
V−N,NTK−N,LNSNとSFCMベクターについて１×104〜５
×105cfu/mlの、そしてDCNについて５×103〜１×104cf
u/mlのレンジにあった。
V−N,NTK−N,LNSNとSFCMベクターについて１×104〜５
×105cfu/mlの、そしてDCNについて５×103〜１×104cf
u/mlのレンジにあった。
ヒト造血セルラインにおけるウイルス組み込みの分子分
析 各種ベクターの開始スクリーニングのために、血液−
リンパ球産生起源をもつ多数の腫瘍セルラインを遺伝子
移入のための標的細胞として使用した。２つの骨髄セル
ライン（K562とKG1）、２つのバーキット・リンパ腫（R
ajiとDaudi）、１つのEBV−形質転換リンパ芽セルライ
ン（RIM）、及び２つのＴ−リンパ芽セルライン（MOLT
−４とJ.M.）を４つのレトロウイルス・ベクターを用い
て形質導入し、そしてG418の存在中で選択した。レトロ
ウイルス組み込みの分子分析を、サザン・ブロッティン
グにより行って、組み込まれたウイルスのサイズとコピ
ー数を検出した（約１〜５コピー／細胞）。ゲノムDNA
を、全てのベクターの５′と３′LTRの両方内で切断す
るXba Iにより消化して（図１）、組み込まれたプロウ
イルスのサイズを検出し、そしてゲノムDNA内でのみ切
断するBgl IIにより消化して、組み込み部位の数を推定
した。Xba I−及びBgl II消化DNAを順番にNeoRとLNGFR
遺伝子特異的プローブにハイブリダイズさせた。
析 各種ベクターの開始スクリーニングのために、血液−
リンパ球産生起源をもつ多数の腫瘍セルラインを遺伝子
移入のための標的細胞として使用した。２つの骨髄セル
ライン（K562とKG1）、２つのバーキット・リンパ腫（R
ajiとDaudi）、１つのEBV−形質転換リンパ芽セルライ
ン（RIM）、及び２つのＴ−リンパ芽セルライン（MOLT
−４とJ.M.）を４つのレトロウイルス・ベクターを用い
て形質導入し、そしてG418の存在中で選択した。レトロ
ウイルス組み込みの分子分析を、サザン・ブロッティン
グにより行って、組み込まれたウイルスのサイズとコピ
ー数を検出した（約１〜５コピー／細胞）。ゲノムDNA
を、全てのベクターの５′と３′LTRの両方内で切断す
るXba Iにより消化して（図１）、組み込まれたプロウ
イルスのサイズを検出し、そしてゲノムDNA内でのみ切
断するBgl IIにより消化して、組み込み部位の数を推定
した。Xba I−及びBgl II消化DNAを順番にNeoRとLNGFR
遺伝子特異的プローブにハイブリダイズさせた。
NSV−Ｎベクターの組み込みは、全てのG418−選択セ
ルラインにおいて（図2A）、無傷のプロウイルスに対応
する、予想5.1kbサイズの単一Xba Iバンドを作り出し
た。Raji細胞においては、より小さなサイズの追加のバ
ンドが観察され、これは、再編成されたプロウイルスの
組み込みを示している（図2A、レーン３）。
ルラインにおいて（図2A）、無傷のプロウイルスに対応
する、予想5.1kbサイズの単一Xba Iバンドを作り出し
た。Raji細胞においては、より小さなサイズの追加のバ
ンドが観察され、これは、再編成されたプロウイルスの
組み込みを示している（図2A、レーン３）。
同様に、Xba I消化は、全NTK−Ｎ−感染セルラインか
らのDNA内に予想された5.4kbサイズの単一バンドを作り
出した（図2B）。たぶん再編成プロウイルスの存在によ
る追加のバンドがRIMサンプル内にのみ検出された（図2
B、レーン５）。4.5kbの単一バンドは、LNSNとSFCMベク
ターにより形質導入された全てのサンプル内で見られた
が、ウイルス再編成の証拠はない（図2C）。これに反
し、DCNにより感染された細胞からのDNA内でのウイルス
組み込みのパターンは頻度のある再編成を特徴とした
（図2D）。DCN−形質導入セルラインの全ては、無傷の
プロウイルスに対応する、5.4kbバンドの存在を示した
が、3.2kbの追加のバンドを１（KB1）を除くすべてのセ
ルライン内で検出された。２つのバンドの相対比は、分
析されたサンプル中で変化し、無傷のプロウイルス優性
（MOLT4、図2D、レーン６）から再編成されたものに広
がる（Raji、図2D、レーン３）までのレンジにあった。
同一レトロウイルス・ストックによる反復感染は、無傷
と再編成プロウイルスの間の比率が、ランダム、非−細
胞−特異的事件であることを示していた。
らのDNA内に予想された5.4kbサイズの単一バンドを作り
出した（図2B）。たぶん再編成プロウイルスの存在によ
る追加のバンドがRIMサンプル内にのみ検出された（図2
B、レーン５）。4.5kbの単一バンドは、LNSNとSFCMベク
ターにより形質導入された全てのサンプル内で見られた
が、ウイルス再編成の証拠はない（図2C）。これに反
し、DCNにより感染された細胞からのDNA内でのウイルス
組み込みのパターンは頻度のある再編成を特徴とした
（図2D）。DCN−形質導入セルラインの全ては、無傷の
プロウイルスに対応する、5.4kbバンドの存在を示した
が、3.2kbの追加のバンドを１（KB1）を除くすべてのセ
ルライン内で検出された。２つのバンドの相対比は、分
析されたサンプル中で変化し、無傷のプロウイルス優性
（MOLT4、図2D、レーン６）から再編成されたものに広
がる（Raji、図2D、レーン３）までのレンジにあった。
同一レトロウイルス・ストックによる反復感染は、無傷
と再編成プロウイルスの間の比率が、ランダム、非−細
胞−特異的事件であることを示していた。
他の全てのベクターにより形質導入されたセルライン
について観察したとき、Bgl IIパターンは、DCN感染が
全てのセルライン内でのポリクローナル組み込みを作り
出したことを示した。
について観察したとき、Bgl IIパターンは、DCN感染が
全てのセルライン内でのポリクローナル組み込みを作り
出したことを示した。
ランダム・プロウイルスの作出の責任を負う性質と機
構を調査するために、我々は、ADA−LNGFRミニ遺伝子内
で２回切断するHind IIIによるゲノムDNAの追加の消
化、その後の、LNGFRプローブによるハイブリダイゼー
ションを行った。両プローブによるXba IとXba I/Hind
III制限パターンの比較分析は、3.2kbバンドが、両LTR
からADA−LNGFRミニ遺伝子を欠く再編成プロウイルスに
対応したことを示した。欠陥プロウイルスも、DCN産生
体セルラインの選択の間高頻度で検出された。全ての我
々の実験において使用されたクローンは無傷のプロウイ
ルスだけを宿し、これは、欠陥プロウイルスの生成が標
的細胞内での組み込みの間に生じ、そしてその産生体セ
ルラインの欠陥によるものではないということを示して
いる。
構を調査するために、我々は、ADA−LNGFRミニ遺伝子内
で２回切断するHind IIIによるゲノムDNAの追加の消
化、その後の、LNGFRプローブによるハイブリダイゼー
ションを行った。両プローブによるXba IとXba I/Hind
III制限パターンの比較分析は、3.2kbバンドが、両LTR
からADA−LNGFRミニ遺伝子を欠く再編成プロウイルスに
対応したことを示した。欠陥プロウイルスも、DCN産生
体セルラインの選択の間高頻度で検出された。全ての我
々の実験において使用されたクローンは無傷のプロウイ
ルスだけを宿し、これは、欠陥プロウイルスの生成が標
的細胞内での組み込みの間に生じ、そしてその産生体セ
ルラインの欠陥によるものではないということを示して
いる。
要約すれば、NSV−N,NTK−N,LNSN及びSFCMによる全て
のセルラインの感染は、ほとんど再編成されていないプ
ロウイルスの低コピー数を担持するG418−耐性集団を発
生させ、一方、DCNベクターによる感染は、その組み込
み過程の間にレトロウイルス・ベクターの３′LTRから
のADA−LNGFRミニ遺伝子の損失により最も多くは誘導さ
れる、高頻度において一般的に再編成されたプロウイル
スを作り出した。この問題は、ウイルスLTR内の挿入遺
伝子のサイズと性質に因るものであることができ、他の
“ダブル−コピー”ベクター構築物による同様の限定が
観察されなかった12-14。
のセルラインの感染は、ほとんど再編成されていないプ
ロウイルスの低コピー数を担持するG418−耐性集団を発
生させ、一方、DCNベクターによる感染は、その組み込
み過程の間にレトロウイルス・ベクターの３′LTRから
のADA−LNGFRミニ遺伝子の損失により最も多くは誘導さ
れる、高頻度において一般的に再編成されたプロウイル
スを作り出した。この問題は、ウイルスLTR内の挿入遺
伝子のサイズと性質に因るものであることができ、他の
“ダブル−コピー”ベクター構築物による同様の限定が
観察されなかった12-14。
ヒト造血セルライン内でのベクター−仲介LNGFR発現 各種レトロウイルス・ベクターにより形質導入さたLN
GFRの発現を、タンパク質とmRNAの両方のレベルにおい
て評価した。G418−選択セルライン内でのLNGFRの細胞
表面発現を抗−LNGFR MoAbを用いたフロー・サイトメト
リーにより定量分析した。これらの結果を表１中に要約
した。NSV−Ｎ−とNTK−Ｎ−形質導入セルラインのほと
んどは、相対平均蛍光（＜100任意単位）として表され
る、低−中レベルの表面LNGFRを示した。高発現のLNGFR
（202a.u.）をNSV−Ｎにより形質導入されたEBV−感染R
IMセルライン内でのみ観察された。LNGFR発現を、NTK−
Ｎ−形質導入されたMOLT−４セルライン内では検出され
なかった。但し、プロウイルス・ゲノムの再編成はXba
I−消化ゲノムDNA内では全く検出されなかった（図2B、
レーン６）。同一セルライン内でのこのベクターによる
反復遺伝子移入は、一貫して陰性の結果を与えた。
GFRの発現を、タンパク質とmRNAの両方のレベルにおい
て評価した。G418−選択セルライン内でのLNGFRの細胞
表面発現を抗−LNGFR MoAbを用いたフロー・サイトメト
リーにより定量分析した。これらの結果を表１中に要約
した。NSV−Ｎ−とNTK−Ｎ−形質導入セルラインのほと
んどは、相対平均蛍光（＜100任意単位）として表され
る、低−中レベルの表面LNGFRを示した。高発現のLNGFR
（202a.u.）をNSV−Ｎにより形質導入されたEBV−感染R
IMセルライン内でのみ観察された。LNGFR発現を、NTK−
Ｎ−形質導入されたMOLT−４セルライン内では検出され
なかった。但し、プロウイルス・ゲノムの再編成はXba
I−消化ゲノムDNA内では全く検出されなかった（図2B、
レーン６）。同一セルライン内でのこのベクターによる
反復遺伝子移入は、一貫して陰性の結果を与えた。
LNSNとSFCMレトロウイルス・ベクターにより形質転換
された全てのセルラインが、中−高レベル（50−200a.
u.）においてLNGFRを発現した（表１）。
された全てのセルラインが、中−高レベル（50−200a.
u.）においてLNGFRを発現した（表１）。
DCN−形質導入セルラインのほとんどが中又は高レベ
ルのLNGFR（50−200a.u.）を発現した。DCN−形質転換
セルラインのFACSプロフィールは、サザン分析から得ら
れた結果と相関し、ここで、無傷のものに加えて再編成
されたプロウイルスを宿すセルラインは、それぞれ、無
傷と再編成プロウイルスに対応するバンドの相対強度に
比例する陰性と陽性ピークをもつ２相（biphasic）曲線
を示した。
ルのLNGFR（50−200a.u.）を発現した。DCN−形質転換
セルラインのFACSプロフィールは、サザン分析から得ら
れた結果と相関し、ここで、無傷のものに加えて再編成
されたプロウイルスを宿すセルラインは、それぞれ、無
傷と再編成プロウイルスに対応するバンドの相対強度に
比例する陰性と陽性ピークをもつ２相（biphasic）曲線
を示した。
形質導入された細胞（K562）内でのベクター特異的RN
Aの発現を、LNGFRとNeoプローブにハイブリダイズし
た。G418−選択セルラインから単離されたポリ（Ａ）+R
NAのノーザン・ブロッティングにより測定した。得られ
たパターンは、各々のレトロウイルス・ベクターの予想
された転写プロフィールと矛盾しなかった。NSV−Ｎ−
及びNTK−Ｎ−形質導入細胞においては、非スプライス
及びスプライスされたRNA種は、LNGFRとNeoプローブの
両方にハイブリダイズした。LNGFR−特異的mRNAを含むS
V−40−及びTK−誘導サブ−ゲノム転写は、LNGFRプロー
ブへのハイブリダイゼーション後にだけ観察された。LN
SN−又はSFCM−形質導入細胞は非スプライスRNA形態だ
けを発現し、これは、NeoRとLNGFRプローブの両方にハ
イブリダイズする。これは、LNSNとSFCMがそれから誘導
された５、LXSNベクター内でのスプライス・ドナー部位
の報告された失活と矛盾しない。SV40−誘導NeoR mRNA
に対するより短い転写物は、NeoRプローブにだけハイブ
リダイズした。
Aの発現を、LNGFRとNeoプローブにハイブリダイズし
た。G418−選択セルラインから単離されたポリ（Ａ）+R
NAのノーザン・ブロッティングにより測定した。得られ
たパターンは、各々のレトロウイルス・ベクターの予想
された転写プロフィールと矛盾しなかった。NSV−Ｎ−
及びNTK−Ｎ−形質導入細胞においては、非スプライス
及びスプライスされたRNA種は、LNGFRとNeoプローブの
両方にハイブリダイズした。LNGFR−特異的mRNAを含むS
V−40−及びTK−誘導サブ−ゲノム転写は、LNGFRプロー
ブへのハイブリダイゼーション後にだけ観察された。LN
SN−又はSFCM−形質導入細胞は非スプライスRNA形態だ
けを発現し、これは、NeoRとLNGFRプローブの両方にハ
イブリダイズする。これは、LNSNとSFCMがそれから誘導
された５、LXSNベクター内でのスプライス・ドナー部位
の報告された失活と矛盾しない。SV40−誘導NeoR mRNA
に対するより短い転写物は、NeoRプローブにだけハイブ
リダイズした。
DCNベクターは、２つのLTR−誘導ゲノム転写物、それ
ぞれ非スプライスとスプライスされた形態を作出した。
第３のRNA種は、ADAプロモーターから転写され、そして
最も多くは、LNGFR合成のための主要なmRNA鋳型として
使用された。LNGFR転写物に対する５′又は３′LTR内の
ADAプロモーターの相対的な貢献は、この技術によって
は評価されることができない。遅く転移するRNA形態
は、５′LTR内のADAプロモーターから開始され、そして
３′LTR内のポリ（Ａ）付加において終結する読み通し
転写物を提示することができた。NeoRプローブにだけハ
イブリダイズする２つの追加の、説明のできないRNA種
も検出された。全てのDCN−形失導入セルライン内に存
在するこれらの転写物は、Raji細胞内で検出された唯一
のRNA種であり、これは、LNGFRを発現せず、そしてサザ
ン・ブロット分析により立証されるように、再編成され
たプロウイルスだけを担持していた。それ故、たぶん、
これらの転写物は、ADAp−LNGFRミニ遺伝子を欠く再編
成プロウイルスに特異的なものであろう。
ぞれ非スプライスとスプライスされた形態を作出した。
第３のRNA種は、ADAプロモーターから転写され、そして
最も多くは、LNGFR合成のための主要なmRNA鋳型として
使用された。LNGFR転写物に対する５′又は３′LTR内の
ADAプロモーターの相対的な貢献は、この技術によって
は評価されることができない。遅く転移するRNA形態
は、５′LTR内のADAプロモーターから開始され、そして
３′LTR内のポリ（Ａ）付加において終結する読み通し
転写物を提示することができた。NeoRプローブにだけハ
イブリダイズする２つの追加の、説明のできないRNA種
も検出された。全てのDCN−形失導入セルライン内に存
在するこれらの転写物は、Raji細胞内で検出された唯一
のRNA種であり、これは、LNGFRを発現せず、そしてサザ
ン・ブロット分析により立証されるように、再編成され
たプロウイルスだけを担持していた。それ故、たぶん、
これらの転写物は、ADAp−LNGFRミニ遺伝子を欠く再編
成プロウイルスに特異的なものであろう。
他のセルラインにおいて観察されたRNA発現パターン
は、K562から得られたものに匹敵した。唯一の例外は、
NSV−N,LNSNとSFCMからの、高レベルのSV40−誘導転写
物を一貫して示すEBV−感染RIMセルラインであった。
は、K562から得られたものに匹敵した。唯一の例外は、
NSV−N,LNSNとSFCMからの、高レベルのSV40−誘導転写
物を一貫して示すEBV−感染RIMセルラインであった。
ヒトPBL内へのベクター−仲介遺伝子移入の効率 ヒトPBLをPHAとIL−２刺激の下レトロウイルス・ベク
ターにより感染させた。感染頻度を推定するために、感
染後48時間、Ｔ細胞を限界希釈条件（１〜103細胞／ウ
ェル）下で培養した。感染された及び非感染の対照細胞
を0.4mg/mlのG418の存在又は非存在中で培養した。細胞
増殖をプレーティングの後14日間評価した。このとき、
G418の存在中で培養された非感染細胞を含むウェル内で
は生存細胞は全く検出されることができなかった。全体
の感染頻度は、ベクター上清のウイルス・タイターに依
存して、１％未満〜5.1％のレンジにあった。しかしな
がら、有意な変化性は、各種ドナー内で観察されなかっ
た。遺伝子移入の効率は、多数の感染サイクル又は同時
培養により増加されることができる。48時間の、照射ウ
イルス−産生セルラインによるPBLの同時培養は、良好
な遺伝子移入効率（10〜15％）を一貫して提供した。LN
GFRとＴ細胞マーカーの２重蛍光分析は、LNGFR陽性集団
内でのベクター産生細胞による汚染の可能性を除外し
た。この実験においては、LNGFR発現の頻度は、全て、
感染されたPBLによる形質導入された遺伝子の発現によ
るものであった。なぜなら、FACS分析において陽性な全
ての細胞がヒトCD3を同時に発現していたからである。
遺伝子移入の開始効率から独立して、形質導入されたPB
Lは、G418との陰性選択又は、LNGFRに対して向けられた
モノクローナル抗体に結合された磁気ビーズによる陽性
免疫選択のいずれかにより同質まで選択されることがで
きる。代表的な実験においては、免疫選択の単一ラウン
ドは、非感染PBLからの形質導入された細胞の集団の分
離のために十分であった。一旦、これらの磁気ビーズが
除去されれば、形質導入されたリンパ球の均質集団を形
質導入された細胞の有意な損失を伴わずに得られた。
ターにより感染させた。感染頻度を推定するために、感
染後48時間、Ｔ細胞を限界希釈条件（１〜103細胞／ウ
ェル）下で培養した。感染された及び非感染の対照細胞
を0.4mg/mlのG418の存在又は非存在中で培養した。細胞
増殖をプレーティングの後14日間評価した。このとき、
G418の存在中で培養された非感染細胞を含むウェル内で
は生存細胞は全く検出されることができなかった。全体
の感染頻度は、ベクター上清のウイルス・タイターに依
存して、１％未満〜5.1％のレンジにあった。しかしな
がら、有意な変化性は、各種ドナー内で観察されなかっ
た。遺伝子移入の効率は、多数の感染サイクル又は同時
培養により増加されることができる。48時間の、照射ウ
イルス−産生セルラインによるPBLの同時培養は、良好
な遺伝子移入効率（10〜15％）を一貫して提供した。LN
GFRとＴ細胞マーカーの２重蛍光分析は、LNGFR陽性集団
内でのベクター産生細胞による汚染の可能性を除外し
た。この実験においては、LNGFR発現の頻度は、全て、
感染されたPBLによる形質導入された遺伝子の発現によ
るものであった。なぜなら、FACS分析において陽性な全
ての細胞がヒトCD3を同時に発現していたからである。
遺伝子移入の開始効率から独立して、形質導入されたPB
Lは、G418との陰性選択又は、LNGFRに対して向けられた
モノクローナル抗体に結合された磁気ビーズによる陽性
免疫選択のいずれかにより同質まで選択されることがで
きる。代表的な実験においては、免疫選択の単一ラウン
ドは、非感染PBLからの形質導入された細胞の集団の分
離のために十分であった。一旦、これらの磁気ビーズが
除去されれば、形質導入されたリンパ球の均質集団を形
質導入された細胞の有意な損失を伴わずに得られた。
ヒトPBLの感染におけるウイルス・ベクターの効率を
評価するために、多数のPBLバルク培養を、独立して、
異なるレトロウイルス・ベクターを含む上清に晒すこと
により形質導入し、そしてベクターの存在と発現につい
てG418により選択した。ベクター−形質導入カルチャー
の中の10（２×NSV−N,3×NTK−N,2×LNSN/SFCM及び３
×DCN）を、サザン・ブロッティングによりプロウイル
スの組み込みについて分析した。全てのベクターの５′
と３′LTRの両方の内で切断する代表的なXba IのNeoRプ
ローブへのハイブリダイゼーション（図１）は、組み込
まれたプロウイルスのサイズの検出を可能にし、そして
ゲノムDNA内だけで切断するBgl IIを用いて、組み込ま
れた部位の数の推定を可能ならしめた。NSV−N,NTK−
Ｎ、及びLNSN/SFCMにより形質導入された全てのリンパ
球カルチャーにおいて、無傷の組み込まれたプロウイル
スに対応するバンドだけが検出され、一方、再編成され
たプロウイルスに対応する追加のバンドが全てのDCN−
形質導入されたカルチャーにおいて観察された。
評価するために、多数のPBLバルク培養を、独立して、
異なるレトロウイルス・ベクターを含む上清に晒すこと
により形質導入し、そしてベクターの存在と発現につい
てG418により選択した。ベクター−形質導入カルチャー
の中の10（２×NSV−N,3×NTK−N,2×LNSN/SFCM及び３
×DCN）を、サザン・ブロッティングによりプロウイル
スの組み込みについて分析した。全てのベクターの５′
と３′LTRの両方の内で切断する代表的なXba IのNeoRプ
ローブへのハイブリダイゼーション（図１）は、組み込
まれたプロウイルスのサイズの検出を可能にし、そして
ゲノムDNA内だけで切断するBgl IIを用いて、組み込ま
れた部位の数の推定を可能ならしめた。NSV−N,NTK−
Ｎ、及びLNSN/SFCMにより形質導入された全てのリンパ
球カルチャーにおいて、無傷の組み込まれたプロウイル
スに対応するバンドだけが検出され、一方、再編成され
たプロウイルスに対応する追加のバンドが全てのDCN−
形質導入されたカルチャーにおいて観察された。
最終的に、プロウイルス組み込みの分析は、NSV−Ｎ
−,NTK−Ｎ−及びLNSN−/SFCM−形質導入Ｔ−細胞カル
チャーが広くポリクローナルであり、一方、DCN−形質
導入されたカルチャーは、優性バンド及びほんの少しの
小さなものの存在により示されるように、本質的にオリ
ゴフローナルであった。先に示唆されたように、これ
は、たぶん低いウイルス・タイターに因り、そしてベク
ター−産生セルラインによる標的細胞の同時培養を含む
異なる遺伝子移入プロトコールにより回避されることが
できたであろう。
−,NTK−Ｎ−及びLNSN−/SFCM−形質導入Ｔ−細胞カル
チャーが広くポリクローナルであり、一方、DCN−形質
導入されたカルチャーは、優性バンド及びほんの少しの
小さなものの存在により示されるように、本質的にオリ
ゴフローナルであった。先に示唆されたように、これ
は、たぶん低いウイルス・タイターに因り、そしてベク
ター−産生セルラインによる標的細胞の同時培養を含む
異なる遺伝子移入プロトコールにより回避されることが
できたであろう。
ヒトＴ−リンパ球に対するLNGFRのベクター−仲介発現 LNGFRの細胞表面発現を、全部で23のレトロウイルス
・ベクター−形質導入Ｔ−リンパ球カルチャー（5NSV−
Ｎ−,8NTK−Ｎ−,5LNSN−及び5DSN−形質導入細胞系）
においてFACS分析により検出した。LNGFR発現は、全て
のNSV−Ｎ−形質導入細胞において、そして８のNTK−Ｎ
−形質導入細胞培養の中の６において低かった。残りの
２つのNTK−Ｎ−形質導入されたＴ−セルラインは、中
程度のレベルのLNGFR発現を示した。異種発現レベルがL
NSN−SFCM細胞培養において観察され、２つの系がLNGFR
の、低レベルを、２つが中程度のレベルを、そして１つ
が高程度のレベルを発現した。５つの系の中の４つが、
LNGFRの、低いレベルを発現し、そして１つが中間レベ
ルを発現した。
・ベクター−形質導入Ｔ−リンパ球カルチャー（5NSV−
Ｎ−,8NTK−Ｎ−,5LNSN−及び5DSN−形質導入細胞系）
においてFACS分析により検出した。LNGFR発現は、全て
のNSV−Ｎ−形質導入細胞において、そして８のNTK−Ｎ
−形質導入細胞培養の中の６において低かった。残りの
２つのNTK−Ｎ−形質導入されたＴ−セルラインは、中
程度のレベルのLNGFR発現を示した。異種発現レベルがL
NSN−SFCM細胞培養において観察され、２つの系がLNGFR
の、低レベルを、２つが中程度のレベルを、そして１つ
が高程度のレベルを発現した。５つの系の中の４つが、
LNGFRの、低いレベルを発現し、そして１つが中間レベ
ルを発現した。
感染細胞を特徴付けするために、我々は、モノクロー
ナル抗体抗−CD4,CD8,CD5,B4,Leu7,CD25R及びCD34を使
用して、細胞表面リンパ球識別抗原の発現について13の
形質導入されたセルラインについてテストした。全ての
テストされたセルラインはCD5とCD25R発現について陽性
に等級付けされ、そしてLeu7,B4とCD34発現において陰
性に等級付けされた（データを示さず）。13の分析され
たカルチャーの中の８がLNGFR+/CD8+であり、１がLNGFR
+/CD4+であり、そして４がLNGFRについて陽性であり、
そしてCD8とCD4を同時発現する異なるパーセンテージの
細胞を含んでいた。PHAとIL−２刺激カルチャー中のCD8
+表現型の優勢も非感染対照セルラインにおいて観察さ
れ、そしてたぶんＴ細胞培養手順の一定のバイアスを提
示する。一般的には、我々は、４つのレトロウイルス・
ベクターの中のいずれかによる特定の細胞サブセットの
選択的形質導入を観察しなかった。
ナル抗体抗−CD4,CD8,CD5,B4,Leu7,CD25R及びCD34を使
用して、細胞表面リンパ球識別抗原の発現について13の
形質導入されたセルラインについてテストした。全ての
テストされたセルラインはCD5とCD25R発現について陽性
に等級付けされ、そしてLeu7,B4とCD34発現において陰
性に等級付けされた（データを示さず）。13の分析され
たカルチャーの中の８がLNGFR+/CD8+であり、１がLNGFR
+/CD4+であり、そして４がLNGFRについて陽性であり、
そしてCD8とCD4を同時発現する異なるパーセンテージの
細胞を含んでいた。PHAとIL−２刺激カルチャー中のCD8
+表現型の優勢も非感染対照セルラインにおいて観察さ
れ、そしてたぶんＴ細胞培養手順の一定のバイアスを提
示する。一般的には、我々は、４つのレトロウイルス・
ベクターの中のいずれかによる特定の細胞サブセットの
選択的形質導入を観察しなかった。
Ｔ細胞クローンを、約１％の平均感染頻度を考慮し
て、限界希釈（1000,100と10細胞／ウェル）において細
胞をプレーティングすることによりベクター形質導入Ｔ
細胞カルチャーから得た。全ての検査されたクローンの
72％がLNGFR+/CD4+であり、そして28％がLNGFR+/CD8+で
あった。CD4+表現型の優勢も対照、同一ドナーからのク
ローン化された非感染Ｔ細胞において観察され、そして
我々のクローニング条件下で標準的な発見として考えら
れている。さらに、レトロウイルス形質導入及びLNGFR
発現が２重陽性、CD4+/CD8+クローンにおいて達成され
た。これらの結果は、レトロウイルス感染が、成熟CD4+
とCD8+細胞において生じるだけでなく、未成熟CD4+/CD8
+2重陽性末梢血液リンパ球においても生じることができ
たということを立証する。
て、限界希釈（1000,100と10細胞／ウェル）において細
胞をプレーティングすることによりベクター形質導入Ｔ
細胞カルチャーから得た。全ての検査されたクローンの
72％がLNGFR+/CD4+であり、そして28％がLNGFR+/CD8+で
あった。CD4+表現型の優勢も対照、同一ドナーからのク
ローン化された非感染Ｔ細胞において観察され、そして
我々のクローニング条件下で標準的な発見として考えら
れている。さらに、レトロウイルス形質導入及びLNGFR
発現が２重陽性、CD4+/CD8+クローンにおいて達成され
た。これらの結果は、レトロウイルス感染が、成熟CD4+
とCD8+細胞において生じるだけでなく、未成熟CD4+/CD8
+2重陽性末梢血液リンパ球においても生じることができ
たということを立証する。
ベクター形質導入Ｔ−リンパ球におけるＴ細胞レパート
リーの分析 先に示したように、ウイルス組み込みのサザン・ブロ
ット分析は、ベクター感染Ｔ細胞カルチャーのポリクロ
ーナルの性質を立証した。これは、TCRβ鎖定常領域に
特異的なプローブにハイブリダイズしたXba I消化DNAサ
ンプルに対するＴ細胞レセプター（TCR）β鎖再編成の
分子分析によりさらに確認された。生殖系列に加えて優
勢バンドを全くもたないポリクローナル・パターンが、
NSV,NTK−ＮとLNSN/SFCMにより形質導入されたＴ細胞カ
ルチャーにおいて検出された。優勢再編成バンドの限定
された数の存在は、オリゴクローナル細胞集団に関し
て、DCN−感染カルチャーにおいて観察された。
リーの分析 先に示したように、ウイルス組み込みのサザン・ブロ
ット分析は、ベクター感染Ｔ細胞カルチャーのポリクロ
ーナルの性質を立証した。これは、TCRβ鎖定常領域に
特異的なプローブにハイブリダイズしたXba I消化DNAサ
ンプルに対するＴ細胞レセプター（TCR）β鎖再編成の
分子分析によりさらに確認された。生殖系列に加えて優
勢バンドを全くもたないポリクローナル・パターンが、
NSV,NTK−ＮとLNSN/SFCMにより形質導入されたＴ細胞カ
ルチャーにおいて検出された。優勢再編成バンドの限定
された数の存在は、オリゴクローナル細胞集団に関し
て、DCN−感染カルチャーにおいて観察された。
これらの観察に対するさらなる確認を、形質導入され
たリンパ球におけるTCR Vβ−鎖用法の系統的分析によ
り得た。ベクター含有上清によるPBL感染の単一サイク
ル、その後の、G418による形質導入された細胞の選択の
後、選択されたリンパ球集団の全RNAを逆転写し、そし
て得られたDNAを、Ｖβ−Ｃβ特異的オリゴヌクレオチ
ドの使用によりPCRに供し、そして方法セクションにお
いて記載したようにＣβ特異的オリゴヌクレオチドを使
用してアンカーPCRに供した。Ｖβ−特異的オリゴヌク
レオチドによる増幅された生成物の分析は、非形質導入
／非選択リンパ球の元の対照集団に比較したとき同一の
レパートリーを示した。TCR−β鎖再編成のサザン・ブ
ロット分析の結果と同様に、ベクター上清中の低ウイル
ス・タイターは、限定されたＶβレパートリーを作り出
した（データを示さず）。低タイター−ベクターのこの
限界は、産生体セルラインとのPBLの同時培養又は多感
染サイクルにより回避されることができた。
たリンパ球におけるTCR Vβ−鎖用法の系統的分析によ
り得た。ベクター含有上清によるPBL感染の単一サイク
ル、その後の、G418による形質導入された細胞の選択の
後、選択されたリンパ球集団の全RNAを逆転写し、そし
て得られたDNAを、Ｖβ−Ｃβ特異的オリゴヌクレオチ
ドの使用によりPCRに供し、そして方法セクションにお
いて記載したようにＣβ特異的オリゴヌクレオチドを使
用してアンカーPCRに供した。Ｖβ−特異的オリゴヌク
レオチドによる増幅された生成物の分析は、非形質導入
／非選択リンパ球の元の対照集団に比較したとき同一の
レパートリーを示した。TCR−β鎖再編成のサザン・ブ
ロット分析の結果と同様に、ベクター上清中の低ウイル
ス・タイターは、限定されたＶβレパートリーを作り出
した（データを示さず）。低タイター−ベクターのこの
限界は、産生体セルラインとのPBLの同時培養又は多感
染サイクルにより回避されることができた。
参考文献 １） Miller A.D.:ヒト遺伝子治療が成熟する。Nature
357:455,1992 ２） Karlsson S.:遺伝子移入による造血細胞機能にお
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へのアデノシン・デアミナーゼ・ミニ遺伝子の移入の間
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Garofalo A.,Giavazzi R.,Mavilio F.,Bordignon C.:ヒ
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0）137−141 配列表 （１）一般情報： （ｉ）出願人： （Ａ）名称：ベーリンガー・マンハイムGMBH （Ｂ）街:Sandhofer Str.116 （Ｃ）市:Mannheim （Ｄ）州:BW （Ｅ）国：ドイツ国 （Ｆ）郵便番号:D−68305 （Ｇ）電話:08856/60−3446 （Ｈ）ファックス:08856/60−3451 （ii）発明の名称：真核細胞のマーキング方法 （iii）配列の数:2 （iv）コンピュータ読み込み形態： （Ａ）媒質タイプ：フロッピー・ディスク （Ｂ）コンピュータ:IBM PC互換性 （Ｃ）オペレーティング・システム:PC−DOS/MS−D
OS （Ｄ）ソフトウェア:PatentIn Release ＃1.0,Vers
ion ＃1.25（EPO） （vi）先の出願データ： （Ａ）出願番号:IT RM93/A000587 （Ｂ）出願日:01−SEP−1993 （２）配列番号:1の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:1600塩基対 （Ｂ）配列の種類：核酸 （Ｃ）鎖の数:2本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の形態:cDNA （ix）特徴： （Ａ）NAME/KEY:misc_feature （Ｂ）位置:one−of（943） （Ｄ）その他の情報:/機能＝“Pvu II解裂部位” （ix）特徴： （Ａ）NAME/KEY:misc_feature （Ｂ）位置:one−of（1512） （Ｄ）その他の情報:/機能＝“Sst I解裂部位” （xi）配列番号:1: （２）配列番号:2の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:31塩基対 （Ｂ）配列の種類：核酸 （Ｃ）鎖の数:1本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の形態:cDNA （xi）配列番号:2:
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した進行メラノーマをもつ患者のヒト免疫治療への遺伝
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D.,Nobili N.,Soldati M.,Ungers G.,Mavilio F.,Gilbo
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トADA欠陥Ｔリンパ球内へのADA遺伝子の移入は特異的な
免疫機能を再構築する。Blood80:120,1992 14） Sullenger B.A.,Gallardo H.F.,Ungers G.E.,Gil
boa E.:TAR配列の過剰発現はヒト免疫不全ウイルス複製
に対する耐性を細胞に付与する。Cell63:601,1990 15） Lee T.C.,Sullenger B.A.,Gallardo H.F.,Ungers
G.E.,Gilboa E.:RRE−誘導配列の過剰発現はCEM細胞内
でのHIV−１複製を阻害する。New Biol.4:66,1992 16） Johnson D.,Lanahan A.,Buck C.R.,Seghal A.,Mo
rgan C.,Mercer E.,Bothwell M.,Chao,M.:ヒトNGFレセ
プターの発現と構造。Cell47:545,1986 17） Keller G.,Paige C.,Gilboa E.,Wagner E.F.:多
能性造血前駆体から誘導された骨髄及びリンパ球細胞内
での外来遺伝子の発現。Nature318:149,1985 18） Wiginton D.A.,Kaplan D.J.,States J.C.,Akeson
A.L.,Perme C.M.,Bilyk I.J.,Vaughn A.J.,Lattier D.
L.,Hutton J.J.:ヒト・アデノシン・デアミナーゼのた
めの遺伝子の完全配列と構造。Biochem.25:8234,1988 19） Mann R.,Mulligan R.C.,Baltimore D.:レトロウ
イルス・パッケージング突然変異体の構築とヘルパー不
含欠陥レトロウイルスを作出するためのその使用。Cell
33:153,1983 20） Sambrook J.,Fritsch E.F.,Maniatis T.:Molecul
ar cloning:a laboratory manual 2nd ed.1989 21） Miller A.D.,Buttimore C.:ヘルパー・ウイルス
生産を導く組換えを回避するためのレトロウイルス・パ
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哺乳類細胞の形質転換。J.Mol.Appl.Genet.1:327,1982 23） Yanagi Y.,Yoshikai Y.,Leggett K.,Clark S.P.,
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性をもつタンパク質をコードするヒトＴ細胞特異的cDNA
クローン。Nature308:145,1984 24） Chirgwin J.M.,Przybyla A.E.,MacDonald R.J.,R
utter W.J.:リボヌクレアーゼにおいて濃縮された源か
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グ。A Manual of Current Techniques,F.A.Davies Co.,
Philadelphia（1992） 32） Reddy et al,Molecular Brain Research 8（199
0）137−141 配列表 （１）一般情報： （ｉ）出願人： （Ａ）名称：ベーリンガー・マンハイムGMBH （Ｂ）街:Sandhofer Str.116 （Ｃ）市:Mannheim （Ｄ）州:BW （Ｅ）国：ドイツ国 （Ｆ）郵便番号:D−68305 （Ｇ）電話:08856/60−3446 （Ｈ）ファックス:08856/60−3451 （ii）発明の名称：真核細胞のマーキング方法 （iii）配列の数:2 （iv）コンピュータ読み込み形態： （Ａ）媒質タイプ：フロッピー・ディスク （Ｂ）コンピュータ:IBM PC互換性 （Ｃ）オペレーティング・システム:PC−DOS/MS−D
OS （Ｄ）ソフトウェア:PatentIn Release ＃1.0,Vers
ion ＃1.25（EPO） （vi）先の出願データ： （Ａ）出願番号:IT RM93/A000587 （Ｂ）出願日:01−SEP−1993 （２）配列番号:1の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:1600塩基対 （Ｂ）配列の種類：核酸 （Ｃ）鎖の数:2本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の形態:cDNA （ix）特徴： （Ａ）NAME/KEY:misc_feature （Ｂ）位置:one−of（943） （Ｄ）その他の情報:/機能＝“Pvu II解裂部位” （ix）特徴： （Ａ）NAME/KEY:misc_feature （Ｂ）位置:one−of（1512） （Ｄ）その他の情報:/機能＝“Sst I解裂部位” （xi）配列番号:1: （２）配列番号:2の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:31塩基対 （Ｂ）配列の種類：核酸 （Ｃ）鎖の数:1本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の形態:cDNA （xi）配列番号:2:
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (56)参考文献 特開 昭62−280（ＪＰ，Ａ) Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． ８ （1990）Ｐ．137−141 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (6)
- 【請求項１】自己移植及び／又は同種移植される細胞に
おける使用のための、細胞表面レセプターをコードする
核酸をその細胞内で発現させ、そしてその後に、その細
胞表面においてそのレセプターを提示させることによる
真核（哺乳類）細胞のマーキング方法であって、その表
面に提示されたレセプターが、その結合性パートナーへ
の結合後に、いずれのシグナル伝達をももたらすことが
できないような方法でレセプターの細胞内ドメインをコ
ードする領域が全体的に又は部分的に欠失又は修飾され
ている核酸を使用することを特徴とする方法。 - 【請求項２】自己移植及び／又は同種移植される細胞に
おいて使用されるトランスフェクトされた真核細胞のた
めの選択マーカーとしてそのレセプターが使用されるこ
とができる方法で修飾された細胞表面レセプターを発現
させ、そしてその細胞表面においてそのレセプターを提
示させるための、細胞表面レセプターをコードし、そし
てその中でその細胞内ドメインをコードする領域が、そ
のドメインがもはやいずれのシグナル伝達をも本質的に
もたらすことができない方法で全体的に又は部分的に欠
失又は修飾されている核酸の使用方法。 - 【請求項３】自己移植及び／又は同種移植される細胞に
おいて使用されるトランスフェクトされた細胞の免疫選
択方法であって、そのレセプターの細胞内ドメインをコ
ードする領域が、その表面に提示されたレセプターがそ
の結合性パートナーへの結合後にいずれのシグナル伝達
をももたらすことができない方法で全体的に又は部分的
に欠失され又は修飾されている細胞表面レセプターをコ
ードする核酸をその細胞内に導入し、そのレセプターに
特異的に結合するマークされた抗体と共にそれらの細胞
をインキュベートすることによりトランスフェクトされ
た細胞を同定し、そしてその抗体／細胞複合体からの解
裂によりそれらの細胞を回収することによる方法。 - 【請求項４】自己移植及び／又は同種移植される細胞に
おいて使用されるトランスフェクトされた細胞の免疫分
離方法であって、そのレセプターの細胞内ドメインをコ
ードする領域が、その表面に提示されたレセプターがそ
の結合性パートナーの結合後にいずれのシグナル伝達を
ももたらすことができない方法で全体的に又は部分的に
欠失され又は修飾されている細胞表面レセプターをコー
ドするDNAをその細胞内に導入し、インキュベーション
の前又は後に固定化されたレセプターに対する抗体と共
にそれらの細胞をインキュベートし、非結合細胞からそ
の抗体により固定化された細胞を分離し、そしてその抗
体−レセプター結合を解裂させることによりそれらの細
胞を単離することによる方法。 - 【請求項５】それにより、その細胞調製物が実質的にク
ローン原性腫瘍細胞を含まない、自己移植及び／又は同
種移植において使用される造血細胞調製物の生産方法で
あって、細胞毒性剤又は照射を用いてパージングし、細
胞表面レセプターをコードし、そして好ましくはその中
でその細胞内ドメインをコードする領域が、そのドメイ
ンがもはやいずれのシグナル伝達をも本質的にもたらす
ことができない方法で全体的に又は部分的に欠失又は修
飾されていない核酸を用いてこれらの細胞を形質導入
し、そして非形質導入細胞からその細胞表面レセプター
によりマークされた形質導入細胞を分離することによる
方法。 - 【請求項６】前記核酸又はDNAが、LNGFR核酸、配列番
号:1である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方
法。
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