ES2210260T3 - Metodo de marcado de celulas eucarioticas empleando como marcador un receptor de superficie celular. - Google Patents
Metodo de marcado de celulas eucarioticas empleando como marcador un receptor de superficie celular.Info
- Publication number
- ES2210260T3 ES2210260T3 ES94926187T ES94926187T ES2210260T3 ES 2210260 T3 ES2210260 T3 ES 2210260T3 ES 94926187 T ES94926187 T ES 94926187T ES 94926187 T ES94926187 T ES 94926187T ES 2210260 T3 ES2210260 T3 ES 2210260T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- cells
- cell
- receptor
- nucleic acid
- lngfr
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 42
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 title claims description 227
- 239000003550 marker Substances 0.000 title claims description 18
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 26
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 26
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 26
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims abstract description 20
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 36
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 32
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 31
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 29
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 16
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 16
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 claims description 14
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 claims description 14
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 claims description 10
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 claims description 10
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims description 10
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 9
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 claims description 9
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 7
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 claims description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 7
- 238000010926 purge Methods 0.000 claims description 7
- 101000884271 Homo sapiens Signal transducer CD24 Proteins 0.000 claims description 6
- 102100038081 Signal transducer CD24 Human genes 0.000 claims description 6
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 5
- 238000010361 transduction Methods 0.000 claims description 5
- 230000026683 transduction Effects 0.000 claims description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 5
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 3
- 102000007339 Nerve Growth Factor Receptors Human genes 0.000 claims description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 3
- 230000003021 clonogenic effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims description 3
- 230000005855 radiation Effects 0.000 claims description 3
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims description 3
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 claims description 2
- 102000015336 Nerve Growth Factor Human genes 0.000 claims description 2
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 claims description 2
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 claims description 2
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 claims description 2
- 238000005304 joining Methods 0.000 claims description 2
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 claims description 2
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 claims description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims 1
- 102000000853 LDL receptors Human genes 0.000 claims 1
- 108010001831 LDL receptors Proteins 0.000 claims 1
- 108091008604 NGF receptors Proteins 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 53
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 abstract description 5
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 abstract description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 109
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 46
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 36
- 230000030414 genetic transfer Effects 0.000 description 32
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 28
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 23
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 22
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 21
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 18
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 17
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 17
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 16
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 16
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 15
- 238000013461 design Methods 0.000 description 14
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 14
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 14
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 11
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 11
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 10
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 9
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 9
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 9
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 9
- 102100036664 Adenosine deaminase Human genes 0.000 description 8
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 8
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 8
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 8
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 8
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 7
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 6
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 5
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 5
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 5
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 5
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 5
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 5
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 description 4
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 4
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 4
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 4
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 4
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 4
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 210000003171 tumor-infiltrating lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 3
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 3
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 101000929495 Homo sapiens Adenosine deaminase Proteins 0.000 description 3
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 3
- 201000001779 Leukocyte adhesion deficiency Diseases 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 210000000777 hematopoietic system Anatomy 0.000 description 3
- 102000043395 human ADA Human genes 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 238000007479 molecular analysis Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 3
- 208000011691 Burkitt lymphomas Diseases 0.000 description 2
- 206010010099 Combined immunodeficiency Diseases 0.000 description 2
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 2
- 101100127166 Escherichia coli (strain K12) kefB gene Proteins 0.000 description 2
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 2
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 description 2
- 241000237955 Nassarius Species 0.000 description 2
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 108010032605 Nerve Growth Factor Receptors Proteins 0.000 description 2
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 2
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 2
- 101710160107 Outer membrane protein A Proteins 0.000 description 2
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 2
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 2
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- 108091027981 Response element Proteins 0.000 description 2
- 206010038997 Retroviral infections Diseases 0.000 description 2
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 208000037919 acquired disease Diseases 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000000712 assembly Effects 0.000 description 2
- 238000000429 assembly Methods 0.000 description 2
- 208000036556 autosomal recessive T cell-negative B cell-negative NK cell-negative due to adenosine deaminase deficiency severe combined immunodeficiency Diseases 0.000 description 2
- 230000002051 biphasic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010322 bone marrow transplantation Methods 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000000066 myeloid cell Anatomy 0.000 description 2
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 2
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 2
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 2
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- 101710169336 5'-deoxyadenosine deaminase Proteins 0.000 description 1
- 208000031261 Acute myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 102000055025 Adenosine deaminases Human genes 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 208000032791 BCR-ABL1 positive chronic myelogenous leukemia Diseases 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 1
- 208000027205 Congenital disease Diseases 0.000 description 1
- 208000029767 Congenital, Hereditary, and Neonatal Diseases and Abnormalities Diseases 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 208000028782 Hereditary disease Diseases 0.000 description 1
- 101100005713 Homo sapiens CD4 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000935040 Homo sapiens Integrin beta-2 Proteins 0.000 description 1
- 101001002657 Homo sapiens Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000801254 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 16 Proteins 0.000 description 1
- 102000018251 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108010091358 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102100025390 Integrin beta-2 Human genes 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 102000007330 LDL Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010007622 LDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 208000033761 Myelogenous Chronic BCR-ABL Positive Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000033776 Myeloid Acute Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010047620 Phytohemagglutinins Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000014450 RNA Polymerase III Human genes 0.000 description 1
- 108010078067 RNA Polymerase III Proteins 0.000 description 1
- 208000007660 Residual Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 201000009628 adenosine deaminase deficiency Diseases 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000002449 bone cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000002458 cell surface marker Substances 0.000 description 1
- 108091092328 cellular RNA Proteins 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 1
- 230000001427 coherent effect Effects 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 239000000824 cytostatic agent Substances 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000012137 double-staining Methods 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012921 fluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- YQOKLYTXVFAUCW-UHFFFAOYSA-N guanidine;isothiocyanic acid Chemical compound N=C=S.NC(N)=N YQOKLYTXVFAUCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000055277 human IL2 Human genes 0.000 description 1
- 210000001822 immobilized cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 102000027411 intracellular receptors Human genes 0.000 description 1
- 108091008582 intracellular receptors Proteins 0.000 description 1
- PWPJGUXAGUPAHP-UHFFFAOYSA-N lufenuron Chemical compound C1=C(Cl)C(OC(F)(F)C(C(F)(F)F)F)=CC(Cl)=C1NC(=O)NC(=O)C1=C(F)C=CC=C1F PWPJGUXAGUPAHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 1
- 230000001885 phytohemagglutinin Effects 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000001566 pro-viral effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000006490 viral transcription Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6854—Immunoglobulins
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
UN METODO DE MARCAR UNA CELULA EUCARIOTICA (MAMIFERO) MEDIANTE LA EXPRESION EN ESTA CELULA DE UN ACIDO NUCLEICO, DICHO ACIDO NUCLEICO CODIFICANDO UN RECEPTOR DE SUPERFICIE CELULAR, Y POSTERIORMENTE, PRESENTANDO DICHO RECEPTOR A LA SUPERFICIE CELULAR, CARACTERIZADO POR LA UTILIZACION DE UN ACIDO NUCLEICO EN EL QUE LA REGION QUE CODIFICA EL DOMINIO INTRACELULAR DEL RECEPTOR HA SIDO COMPLETA O PARCIALMENTE SUPRIMIDO O MODIFICADO DE TAL FORMA QUE EL RECEPTOR PRESENTADO EN LA SUPERFICIE NO PUEDE, DESPUES DE ENLAZARSE A SU COMPAÑERO DE ENLACE, EFECTUAR NINGUNA TRANSDUCCION DE SEÑAL, ES EFECTIVA Y UTILIZABLE EN TERAPIA GENICA.
Description
Método de marcado de células eucarióticas
empleando como marcador un receptor de superficie celular.
La invención se refiere a un método de marcado de
células eucarióticas (de mamíferos) empleando como marcador
seleccionable un receptor de superficie celular con un dominio
intracelular modificado.
La identificación de las células en las que se ha
introducido con éxito una secuencia de DNA es una etapa esencial de
la tecnología del DNA recombinante. Dado que la secuencia de DNA a
introducir no necesariamente conducirá a un fenotipo que pueda
seleccionarse de modo sencillo, habitualmente se introduce una
secuencia adicional de DNA que codifica a un fenotipo seleccionable.
El número de estos genes marcadores seleccionables sigue siendo muy
reducido en el ámbito de la tecnología del DNA recombinante de las
células eucarióticas. La mayor parte de estos genes marcadores
disponibles, por ejemplo la timidina-cinasa del
herpes simplex virus del tipo I (Wigler y col., Cell 1, 223,
1977) o la
hipoxantina-fosforribosil-transferasa
(Jolly y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 80, 477, 1983)
corresponden a genes o son muy afines a genes que por su
constitución se expresan en la mayoría de células normales o son
idénticos a dichos genes.
Por lo tanto, estos genes marcadores solamente
pueden utilizarse en células mutantes especiales, que no se expresan
en los genes correspondientes. Por otro lado, un gen marcador
preferido no debería expresarse en la mayoría de células de
mamíferos o por lo menos no debería expresarse en ciertos tejidos y
tipos de células, de modo que puedan utilizarse como genes
marcadores seleccionables en la tecnología del DNA recombinante que
trabaja con estas células.
Pawlink y col. han descrito el uso del antígeno
de superficie celular CD24 como marcador seleccionable dominante en
la transferencia genética mediada por retrovirus (Journal of
Cellular Biochemistry, suplemento 17E, página 203, resumen S210).
Con este marcador se pueden marcar fibroblastos
NIH-3T3, células BAF-3
pre-B y células de médula ósea murina infectadas con
retrovirus y las células marcadas se detectan por análisis de
clasificación de células activadas por fluorescencia. Sin embargo,
el antígeno de superficie celular CD24 normalmente se expresa en
algunas células de mamíferos, por lo cual el uso de este marcado
está limitado por la dificultad de diferenciar entre células que
normalmente expresan el antígeno de superficie celular CD24 y
células marcadas con este marcador.
Además, se ha encontrado que el antígeno de
superficie celular CD24 después de la expresión heteróloga se
presenta en la superficie de las células solamente en pequeña
extensión.
En la solicitud de patente europea
EP-0 455 460 se describe la proteína
tirosina-cinasa negativa trkB, que es un receptor de
superficie celular al que le falta el dominio catalítico
tirosina-cinasa y por ello no dispara señal de trkB
en las células. En la EP-0 455 460 se describe el
aislamiento y la identificación de este receptor.
Es un objeto de la presente invención un proceso
de marcado de una célula eucariótica (de mamífero) por expresión de
un ácido nucleico en esta célula, dicho ácido nucleico codifica un
receptor de superficie celular y por presentación del receptor en la
superficie de la célula, el proceso está caracterizado por el uso de
un ácido nucleico en el que la región que codifica el dominio
intracelular del receptor ha sufrido una deleción total o parcial o
se ha modificado de manera que el receptor presentado en la
superficie no puede realizar ninguna transducción de señal después
de haberse unido a su complemento de unión.
El dominio intracelular ha sufrido con
preferencia una deleción completa o bien los nucleótidos
individuales están modificados.
Se utiliza con preferencia el ácido nucleico que
codifica al receptor NGF, CD24 o LDL.
La secuencia del receptor NGF humano, que en lo
sucesivo se mencionará como "receptor del factor de crecimiento
nervioso de baja afinidad, LNGFR", ha sido descrita por D.
Johnson, Cell 47, 545-554, 1986. Se utiliza
con preferencia un ácido nucleico del que se ha eliminado (deleción)
la región de DNA que codifica los aminoácidos 245 (empezando por el
nucleótido 930) del extremo C (ver SEQ ID NO: 1).
En la SEQ ID NO: 1, el dominio extracelular se
codifica por parte de los nucleótidos 114 (ATG) - 863, el dominio
transmembrana se codifica por los nucleótidos 864 - 929 y el dominio
intracelular se codifica por los nucleótidos
930 - 1394 (Reddy y col., Molecular Brain Research 8, 137-141, 1990).
930 - 1394 (Reddy y col., Molecular Brain Research 8, 137-141, 1990).
Para la deleción del dominio intracelular es
posible efectuar la deleción de un dominio completo o solamente una
parte funcional, de modo que el receptor presentado en la superficie
no puede efectuar ninguna transducción de señal después de haberse
unido a su complemento de unión. Por ejemplo, es posible realizar la
deleción de los nucleótidos 943 - 1512 por restricción con PvuIII y
SstI.
El ácido nucleico puede introducirse en la célula
diana, por ejemplo mediante un vector vírico (con preferencia un
retrovirus) por lipofección o electroporación.
Otro objeto de la invención es un DNA que
codifica un LNGFR modificado y que se ilustra en la SEQ ID NO: 1 así
como una célula eucariótica que contenga un ácido nucleico de este
tipo.
Un ácido nucleico de este tipo puede utilizarse
para expresar un receptor de superficie celular modificado de este
modo y para presentar el receptor en la superficie celular de tal
manera que el receptor pueda utilizarse como marcador seleccionable
para células eurocarióticas transfectadas.
El DNA que codifica al receptor o un derivado del
mismo se introduce en un vector eucariótico de expresión por métodos
ya conocidos de la técnica. El experto en la materia ya conoce los
vectores idóneos de expresión, empleándose con preferencia los
vectores retrovíricos. Para la transferencia del DNA receptor pueden
utilizarse también otros vectores víricos con arreglo al estado de
la técnica (p. ej. herpesvirus, adenovirus, virus vacunales). Se ha
observado en un cierto tipo de retrovirus, los llamados vectores de
doble copia (Yu y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 83,
3194-3198, 1986) una frecuencia elevada de provirus
reordenados y una concentración significativamente baja. Son
preferidos los virus de vector XSN (Bio-Techniques
7, 980-990, 1989).
Los vectores de expresión eucarióticos
recombinantes se introducen seguidamente en una célula hospedante
eucariótica, ya sea sola para un protocolo de marcado de genes, ya
sea combinada con otro DNA que se quiera transducir, pero que no
tiene fenotipo seleccionable. La introducción del DNA en la célula
hospedante se realiza por métodos de infección víricano víricos (p.
ej. electroporación, transferencia de liposomas, precipitación de
calcio). Las células que contienen DNA exógeno pueden reconocerse
por su capacidad de producir un receptor en niveles elevados. Las
células eucarióticas recombinantes que controlan un DNA según la
presente invención pueden detectarse incluso con mayor facilidad por
su capacidad de producir un derivado del receptor.
El marcador receptor de las células eucarióticas
obtenido del modo descrito anteriormente permite una selección y
separación fáciles de tales células empleando anticuerpos que se
fijan sobre el receptor empleado. Estos anticuerpos son conocidos en
la técnica y se han descrito por ejemplo en A. Ross y col. (Proc.
Natl. Acad. Sci. 81, 6681-6685, 1984;
EP-A-0 202 055). Además los
anticuerpos de los receptores pueden obtenerse por métodos conocidos
en la técnica por inmunización de un animal con un proteína
codificada por el DNA según la presente invención y por aislamiento
de los anticuerpos del suero de los animales inmunizados o por
fusión de células de bazo de los animales inmunizados con células
inmortales, por ejemplo una línea celular de mieloma murino, para
obtener anticuerpos monoclonales. Estos anticuerpos se marcan por
métodos ya conocidos de la técnica (descritos por ejemplo en J.H.
Peters, Monoklonale Antikörper, editorial Springer, 2ª edición,
1988, páginas de 285 a 315). Los marcados idóneos pueden ser
enzimas, colorantes fluorescentes o quimioluminiscentes.
Es posible aislar las células marcadas por
inmunoselección introduciendo un ácido nucleico de este tipo en una
célula eucariótica. A tal fin se identifican las células
transfectadas, se seleccionan con un anticuerpo marcado que se fije
específicamente al receptor empleado según la invención y se aíslan
después de escindirse del complejo
anticuerpo/célula.
anticuerpo/célula.
Si se emplea un anticuerpo inmovilizado en lugar
de un anticuerpo marcado, las células transfectadas pueden
seleccionarse. Además, la fase sólida con el anticuerpo
inmovilizado contra el receptor se utiliza como matriz (estructura)
en la cromatografía de afinidad. Una vez separadas las células no
transfectadas que no expresan al receptor, se cultivan las células
fijadas por ejemplo y se expanden en cápsulas petri durante una
noche.
Los procesos descritos anteriormente son
especialmente importantes como herramientas de diagnóstico para
identificar células introducidas en un organismo de mamífero
mediante protocolos de terapia genética. Para algunas aplicaciones,
por ejemplo el trasplante de médula ósea, tendrá valor diagnóstico
la diferenciación entre células originadas a partir del trasplante
de médula ósea y células derivadas de las células residuales del
hospedante. En este caso se trasplantan células de médula ósea que
contienen DNA que codifica al receptor para dotar a estas células de
un marcador de superficie celular. Se trasplantarán con preferencia
células progenitoras o germinales (stem cells), que se han
enriquecido con arreglo al estado de la técnica (p. ej. anticuerpos
anti-CD34 inmovilizados), que contienen los genes
según la invención. Después del trasplante se pueden diferenciar las
células, en especial las células tumorales eventualmente surgidas,
en su condición de derivadas de las células trasplantadas o en su
condición de células residuales del organismo hospedante.
Otra forma de ejecución de la presente invención
es por tanto el uso del proceso de inmunoselección de células
transfectadas según la presente invención para la identificación de
diagnóstico de células que se han marcado mediante la introducción
de un DNA que codifique al receptor, en especial de un DNA según la
presente invención.
La principal aplicación del marcado de células de
sangre/células de médula ósea con los receptores modificados
descritos será el seguimiento (monitoring) de las células de
trasplantes autólogos y también de trasplantes alogénicos. En el
caso de leucemias y linfomas a menudo es necesario tratar a los
pacientes con dosis subletales de medicamentos citostáticos o con
dosis equivalentes de radiación o con combinaciones de ambas. Para
restablecer el funcionamiento de la médula ósea se puede explantar
médula ósea autóloga antes del tratamiento para reimplantarla a los
pacientes o bien se puede implantar médula alogénica de un dador de
HLA similar.
En el caso de trasplante de médula ósea autóloga,
la contaminación de células tumorales en el material reimplantado
puede conducir a una recidiva tumoral. Se emplean métodos de purga
para purificar la médula de células tumorales (células tumorales
clonogénicas), pero estas técnicas no son fiables actualmente. En el
caso de una recaída no es posible obviamente distinguir entre
células tumorales potencialmente contaminantes y una recaída
provocada por células residuales después del tratamiento. En el caso
de trasplantes de médula ósea alogénica, el principal problema es el
rechazo de la médula alogénica. Se han descrito las técnicas de
purga en Areman E.M. y col.: Bone Marrow and Stem Cell Processing: A
Manual of Current Techniques, F.A. Davies Co., Philadelphia (1992),
que se incorpora como referencia a esta descripción.
La invención se refiere además a un método de
obtención de una preparación de células hematopoyéticas (es decir,
células progenitoras de médula ósea o de sangre periférica
movilizada y/o células germinales), en el que dichas células se
marcan con un receptor de superficie celular y en el que dicha
preparación celular está sustancialmente exenta de células tumorales
clonogénicas, mediante purga empleando agentes citotóxicos o
radiación, transduciendo dichas células con un ácido nucleico que
codifica a un receptor de superficie celular y, con preferencia, en
el que la región que codifica el dominio intracelular haya sufrido
una deleción completa o parcial o se haya modificado de tal manera
que el dominio fundamentalmente ya no pueda realizar ninguna
transducción de señal y separando dichas células transducidas de las
células no transducidas. Esta separación se realiza con preferencia
por incubación de dichas células con un anticuerpo contra el
receptor inmovilizado antes o después de la incubación, por
separación de las células inmovilizadas por el anticuerpo de las
células no fijadas y por aislamiento de la preparación de células
hematopoyéticas por rotura de la unión de anticuerpo con
receptor.
Si después de un trasplante autólogo se marcan
las células trasplantadas con un gen y por consiguiente el producto
genético derivado no es común a estas células, entonces será posible
hacer el seguimiento de estas células directamente después del
trasplante y, en el caso de una recaída, se podrá diferenciar entre
las células tumorales derivadas del material trasplantado y las
células tumorales residuales. Estos conocimientos conducirán a una
definición muy temprana del tratamiento ulterior basándose en la
causa de la recaída. Aparte de esta finalidad de diagnóstico, el
marcado con genes en trasplantes autológicos permitirá además el
seguimiento y la comparación de la eficacia de los distintos métodos
de purga en grupos de pacientes relativamente pequeños.
En el trasplante autólogo y, sobre todo, el
alogénico, el principal campo de aplicación será el seguimiento del
rechazo de las células trasplantadas.
El protocolo clínico tendrá las etapas
siguientes:
a) Explantación de células del paciente.
b) Purga de las células explantadas con arreglo a
la técnica conocida.
c) Transducción de células del paciente con un
vector que contiene el gen receptor modificado con arreglo a esta
invención.
d) Opcionalmente, expansión de las células del
paciente en condiciones selectivas, p. ej. con G418 empleando la
expresión del gen de resistencia a la neomicina codificado sobre el
vector que contiene el gen receptor modificado.
e) Inmunoselección de las células marcadas que
expresan el gen modificado y presentan al receptor en la superficie
de las células.
f) Reimplante en el paciente de las células
enriquecidas y marcadas.
g) Análisis de muestras de sangre/médula del
paciente para el seguimiento de los genes marcadores mediante
ensayos FACS o técnicas ELISA.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Diagrama pasa a página
siguiente)
La invención se refiere además a un método de
inmunoselección de células transfectadas que consiste en la
introducción en dichas células de un ácido nucleico que codifica un
receptor de superficie celular en el que la región que codifica el
dominio intracelular del receptor ha sufrido una deleción completa
o parcial o se ha modificado de manera que el receptor presentado
en la superficie, después de unirse a su complemento de unión, no
puede realizar ninguna transducción de señal, en identificar las
células transfectadas por incubación de dichas células con un
anticuerpo marcado que se fija específicamente a dicho receptor y
en recuperar las células por destrucción del complejo
anticuerpo/célula.
La invención se refiere además a un método de
inmunoseparación de células transfectadas que consiste en introducir
en dichas células un DNA que codifica a un receptor de superficie
celular, en el que la región que codifica el dominio intracelular
del receptor ha sufrido una deleción total o parcial o se ha
modificado de tal manera que el receptor presentado en la
superficie, una vez fijado sobre su complemento de unión, no puede
efectuar ninguna transducción de señal, en incubar las células con
un anticuerpo contra el receptor inmovilizado antes o después de la
incubación, en separar las células inmovilizadas por el anticuerpo
de las no fijadas y en aislar las células por destrucción de la
unión anticuerpo-receptor.
Un gran número de estudios han demostrado que los
vectores retrovíricos son una herramienta eficaz para transferir
DNA exógeno a células somáticas^{1}. En el sistema hematopoyético
del ratón se han logrado la transferencia y la expresión genéticas
eficaces tanto en células progenitoras como en células germinales
pluripotentes, tanto "in vitro" como "in
vivo". Se han obtenido niveles más bajos de transferencia
genética en progenitores hematopoyéticos caninos y humanos en
cultivos en los que se han constatado niveles significativos de
expresión de genes transducidos (recopilación en ^{2}). La
transferencia genética mediada por retrovirus se utiliza
habitualmente en protocolos de terapia genética para el tratamiento
de enfermedades hereditarias o adquiridas, por ejemplo la
deficiencia de adenosina-desaminasa (ADA^{-}), la
inmunodeficiencia combinada grave (SCID) y el cáncer avanzado
(recopilación en ^{3}). Aunque se ha dedicado un gran esfuerzo a
optimizar los procedimientos de purificación de células germinales
hematopoyéticas humanas y en hallar condiciones eficaces para la
transferencia y la expresión genéticas, los linfocitos de la sangre
periférica (PBL) se continúan considerando como el vehículo más
seguro de transporte celular para la terapia genética humana.
Se ha diseñado y utilizado un gran número de
vectores retrovíricos para la transferencia genética a células
hematopoyéticas humanas, todos ellos basados en la estructura del
virus de la leucemia murina de Moloney (MoMLV). El uso de diferentes
promotores que dirigen la expresión del gen de interés y la posición
de las secuencias con respecto a la unidad de transcripción vírica
son algunos de los parámetros que hay que tener en cuenta para
generar diseños vectoriales
alternativos^{4-5-6}. Algunos de
estos vectores se emplean para transducir células linfoides humanas
en diversas condiciones. Los linfocitos infiltrantes de tumores
humanos (TIL) se transducen con el vector retrovírico N2, que lleva
un gen de resistencia a la
neomicina-fosfotransferasa (Neo), y conservan las
características fenotípicas y funcionales normales "in
vitro"^{7-8}. Se recuperan las células
transducidas de los sitios tumorales hasta después de 64 días de la
administración celular "in vivo" a pacientes de
melanoma^{9}. La transferencia genética se logra en los dos
subconjuntos de células T humanas CD4^{+} y CD8^{+}, derivadas
de los TIL y PBL^{10}. Un vector retrovírico para la expresión de
un gen funcional CD18, dirigido por un promotor LTR vírico,
transduce con éxito linfocitos de pacientes afectados por la
deficiencia de adhesión de leucocitos (LAD) y ha permitido la
corrección de la LAD "in vitro". La expresión de un ADA
humano dirigida por un promotor de ADA en un vector de doble
copia^{6} en los PBL obtenidos de pacientes afectados por
ADA^{-} SCID conduce también a la corrección de la deficiencia
enzimática, permitiendo el restablecimiento de las funciones
inmunes^{12-13}. Finalmente, los montajes
retrovíricos de superexpresión de secuencias de RNA estructural de
VIH (elemento de respuesta transactiva, TAR, y elemento de respuesta
Rev, RRE), dirigidos por un promotor de
RNA-polimerasa III, se introducen con éxito en una
línea celular de linfoide T, induciendo una inmunización
intracelular parcial contra el VIH^{14-15}. Aunque
en todos estos casos los vectores retrovíricos se constata que
transducen células linfoides humanas y expresan los genes
transferidos, todavía no se ha hecho ningún intento de comparar
directamente los diferentes diseños vectoriales en cuanto a su
estabilidad, eficacia de transferencia genética y expresión de los
genes transducidos.
El receptor del factor de crecimiento nervioso de
baja afinidad (LNGFR) humano no se expresa en la mayoría de las
células hematopoyéticas humanas, por lo cual permite el análisis
cuantitativo de la expresión de los genes transducidos por cada
vector y por cada célula diana mediante análisis de
inmunofluorescencia, incluso a nivel de células individuales. Con
cuatro montajes ("constructos") vectoriales se transducen
diferentes líneas celulares hematopoyéticas humanas de origen
mieloides y linfoide, así como células mononucleares normales de la
sangre periférica (PBMC) y se analizan en cuanto a la estabilidad y
al número de integraciones víricas y expresión de LNGFR, tanto a
nivel de RNA como de proteína. Se llevan a cabo análisis FACS de
líneas de células T transducidas y de clones para la coexpresión del
LNGFR y marcadores de superficie celular para estudiar la expresión
genética en la subpoblación específica de células T. En condiciones
apropiadas de infección de gran eficacia, todos los vectores
retrovíricos pueden transducir una población de células T del
repertorio inmune normal. Por lo tanto, según la invención el LNGFR
(en su forma truncada sin el dominio intracelular o en su forma
(fundamentalmente) sin modificar) es un marcador preferido para el
marcado celular, mediante la transfección de las células con un
ácido nucleico que codifique al LNGFR. Para la transfección se
emplean por ejemplo vectores del tipo retrovírico o también DNA
desnudo, p. ej. con liposomas como agente de transfección. El
marcador LNGFR se emplea con preferencia para marcar células del
sistema hematopoyético, en especial células germinales
hematopoyéticas. Es preferido en especial su utilización para el
marcado en terapia genética y en métodos de purga.
La transferencia genética eficiente con vectores
retrovíricos a células germinales hematopoyéticas continúa siendo el
objetivo prioritario de la terapia genética de muchos trastornos
congénitos o adquiridos. En calidad de vehículos, los vectores
retrovíricos son habitualmente la herramienta más segura y eficaz
para transferir y expresar el DNA exógeno en células
hemato-linfopoyéticas humanas. Actualmente, todos
los protocolos clínicos aprobados para la transferencia genética a
células de médula o de sangre se basan en vectores
retrovíricos^{1,3}. Aunque la célula diana ideal esté representada
por una célula germinal pluripotente, no existe una evidencia
concluyente acerca de la capacidad de los vectores retrovíricos para
transducir tales células con una eficacia adecuada y mantener una
expresión genética estable en su progenie. Los resultados de los
protocolos clínicos en marcha, basados en la transferencia genética
de médula ósea, pueden ayudar a esclarecer estos
problemas^{1,3,30}.
Obviamente, la transferencia genética puede
realizarse con mayor facilidad en linfocitos de sangre periférica,
una alternativa potencial frente a las células de médula ósea, por
lo menos en cuanto a los trastornos congénitos y adquiridos del
sistema inmune. Sin embargo es necesario para tal fin definir la
proporción de PBL que tienen que transducirse en orden de
representar la totalidad del repertorio inmune y si este podrá ser
mantenido estable "in vivo", ya que los dos son
requisitos previos para que un procedimiento de transferencia
genética sea terapéuticamente relevante. A tal fin son factores
cruciales la eficacia de la transferencia genética y el diseño del
vector, que afecta tanto a la persistencia como a los niveles de
expresión genética.
La eficacia global de la transferencia genética a
los PBL humanos depende estrictamente del protocolo de infección. La
expansión celular limitada de los linfocitos por una activación a
corto plazo "in vitro" seguida por la transferencia
genética a los PBL por exposición a los líquidos sobrenadantes de
las células productoras dan lugar a proporción limitada de células
resistentes a G418 (aproximadamente el 1% de cada ciclo de
infección), con una variabilidad adicional inducida por la
concentración de los líquidos sobrenadantes que contienen los
vectores. La eficiencia de la transferencia genética puede
incrementarse por una mayor expansión de las células diana "in
vitro".
El análisis del repertorio del uso de V\beta en
la población de PBL, después de tres ciclos de infección con PBL por
líquidos sobrenadantes que contienen vectores, seguidos por la
selección de las células transducidas por G418, da lugar a un
repertorio intacto, si se compara con la población original de
control de linfocitos sin transducir/sin seleccionar. Estos datos
indican que la expansión limitada de células diana y la utilización
de líquidos sobrenadantes que contienen vectores dan lugar a una
transferencia genética adecuada, con independencia de la frecuencia
relativamente baja de dicha transferencia genética, por lo menos
cuando los líquidos sobrenadantes que contienen vectores tienen una
buena concentración vírica (>5x10^{5}). Sin embargo, las
concentraciones víricas bajas en los líquidos sobrenadantes que
contienen vectores dan lugar a repertorios V\beta limitados. Esto
se confirma con un análisis Southern Blot del reordenamiento de la
cadena de TCR-\beta que presenta modelos
oligoclonales de población transducida/seleccionada. Esta limitación
se circunscribe al co-cultivo de PBL con células
productoras de vectores irradiadas. Con independencia de la
concentración vírica, este procedimiento de transferencia genética
es mucho más eficaz, por lo menos en un orden de magnitud. Teniendo
en cuenta la gran eficacia de la transferencia genética en caso de
co-cultivo y la expresión de LNGFR sobre linfocitos
transducidos, se elabora un protocolo sencillo de
co-cultivo y de inmunoselección que permite la
producción de células homogéneamente transducidas.
Los protocolos de co-cultivo
todavía se consideran inseguros para el uso clínico, por ello se
diseñan condiciones de co-cultivo en las que las
células productoras de vectores y los PBL se mantienen separados por
una membrana porosa que permite el paso de los virus, al tiempo que
evita el contacto de célula con célula. Este enfoque tiene algunas
ventajas si se compara con la infección por líquido
sobrenadante.
El análisis de doble fluorescencia de las células
T seleccionadas con G418 para la co-expresión del
LNGFR y distintos marcadores de superficie de células T presentan
una susceptibilidad similar a todas las subpoblaciones ensayadas con
una eficacia aparentemente igual de la transferencia genética.
Además hemos obtenido un evidencia esporádica, aunque concluyente,
de la transferencia genética a células CD4^{+}/CD8^{+}
inmaduras. Hemos demostrado anteriormente la transferencia genética
mediada por vectores retrovíricos a progenitores de células T antes
del reordenamiento del TCR^{13}. Los datos de la invención
demuestran que la infección retrovírica de los PBMC permite la
transferencia genética a progenitores en circulación con una
frecuencia baja pero detectable. Puede haber una ventaja adicional
en los protocolos de transferencia genética que trabajan con cultivo
"in vitro" de corto duración y en la expansión limitada
de los linfocitos diana.
Se analiza además el impacto del diseño vectorial
sobre la eficacia de la transferencia genética y la expresión. En
los diseños vectoriales empleados, el gen informante (reporter gen)
se coloca alternativamente dentro de la unidad de transcripción
retrovírica bajo el control de promotores internos SV40 o
HSV-TK (vectores NSV-N y
NTK-N, respectivamente), debajo el LTR del virus
MoMLV (LNSN/SFCM) o fuera de la unidad de transcripción retrovírica
bajo el control del promotor ADA humano (el vector de "doble
copia" DCN). El uso de un receptor según la invención en calidad
de gen informante (reporter gen) ha permitido estudiar los niveles
de expresión genética en diferentes subpoblaciones de PBL, con
resolución de célula individual.
Las concentraciones víricas obtenidas de
distintos vectores en los clones productores seleccionados son
comparables, excepto las células productoras de DCN que de modo
coherente dan concentraciones cinco veces más bajas que las de uno
de las tres vectores restantes, lo cual sugiere que la secuencia
extra del LTR vírico puede reducir la eficacia de la transducción,
probablemente por interferir con el proceso de transcripción
inversa/integración. Esto se refleja también en la tendencia
relativamente alta del DCN a integrarse en forma de provirus
reordenado, lo cual reduce todavía más la eficacia global de la
transferencia genética que puede obtenerse con este tipo de vector.
Se observa un reordenamiento de provirus integrados en frecuencias
despreciables para los tres vectores restantes.
Los niveles de expresión genética indican que los
vectores basados en las unidades de transcripción interna son los
menos eficaces en términos tanto de acumulación de mRNA como de
expresión de proteína. La única excepción es el nivel muy alto de
transcritos generados por el promotor SV-40 dentro
de dos vectores distintos (NSV-N y LNSN/SFCM) en la
línea RIM de células B infectadas con EBV. Esto podría deberse a la
interacción de las proteínas que trans-activan el
EBV con el ampliador SV-40. Por el contrario, los
vectores basados en el LTR de MoMLV y el promotor ADA humano de la
expresión de los genes mencionados trabajan con gran eficacia en
todas las líneas hematopoyéticas. Los análisis de las líneas de
células T y de los clones dieron básicamente los mismos resultados.
Tanto los vectores LNSN como los DCN son muy efectivos en dirigir
altos niveles de expresión genética en todas las subpoblaciones de
células T, incluidos los progenitores inmaduros y mantienen estos
niveles invariables a lo largo de un elevado número de pasajes
(subcultivos).
En conclusión, el vector retrovírico basado en
LTR es probablemente el más fiable y eficaz para la transferencia y
expresión genéticas en PBL humanos, mientras que el diseño DC,
aunque sea muy bueno en cuanto a la expresión genética, da lugar en
general a una baja eficacia de transferencia genética, debido tanto
a la baja concentración como a la tendencia al reordenamiento
genómico. Sin embargo este tipo de montaje (constructo) puede ser la
mejor elección de vector cuando el requisito obligado es una
expresión genética específica de tejido, inducible e por lo demás
independiente del LTR, o en otros casas en tejidos en los que
pudiera ocurrir una inactivación por LTR. Aunque no hemos abordado
este tema en el presente estudio, las células germinales (stem
cells) hematopoyéticas humanas podrían contarse entre estos tejidos,
por analogía a lo observado en el sistema hematopoyético murino.
La utilización de un codificador genético para
las molécula de superficie celular LNGFR o de un codificador para
una molécula de superficie celular en el que el dominio intracelular
del receptor haya sufrido una deleción completa o parcial o se haya
modificado de modo que el receptor presentado en la superficie, una
vez fijado sobre su complemento de unión, no pueda efectuar ninguna
transducción de señal, para el marcado celular mediado por vectores
retrovíricos representa claramente una ventaja importante con
respecto a los vectores empleados en los anteriores ensayos de
marcado genético que utilizan un gen marcador, normalmente el gen
NeoR, no expresado en la membrana celular. Este tipo de vector
podría constituir una ventaja potencial para los estudios
preclínicos y clínicos "in vivo" de marcado celular.
La figura 1: vectores retrovíricos para la
expresión de LNGFR (A, C, E, G).
Se presentan mapas esquemáticos de genomas
províricos integrados NSV-N (A),
NTK-N (C), LNSN (E) y DCN (G), indicando los
promotores internos SV40 (SV), HSV-TK (TK) y ADA
humano (ADAp). Las casillas negras indican secuencias de LTR. Se
indican los sitios de restricción XBa I y Hind III (H). En los mapas
se representan las especies de RNA que se originan a partir de cada
vector mediante flechas numeradas.
La figura 2: análisis "Southern Blot" de la
integración de los cuatro vectores retrovíricos
(A-D) en el digesto (digest) Xba I del DNA de líneas
celulares K562 (1), KG 1 (2), Raji (3), Daudi (4), RIM (5),
MOLT-4 (6) y J.M. (7), hibridados con una sonda Neo.
Se indican las bandas correspondientes a provirus integrados
intactos, junto con sus pesos moleculares (en kb). Las bandas de
reordenamiento se indican mediante flechas.
Las figuras 3 y 4: diferentes diseños
vectoriales. (L: secuencia líder; EXTR: dominio extracelular; T:
dominio transmembrana; INTR: dominio intracelular; casillas negras:
LTR; \Psi = señal de empaquetamiento.)
Se generan diferentes vectores retrovíricos para
la expresión del LNGFR en calidad de gen informante (reporter gen),
empleando un fragmento Sst I de 1,5 Kb de codificación completa del
cDNA de LNGFR^{16} humano o un cDNA de LNGFR truncado sin el
dominio intracelular (p.ej. por restricción con PvuII y SstI). Los
vectores NSV-N y NTK-N se obtienen
por clonación del cDNA de LNGFR en los sitios únicos Hind III y Bgl
II de los vectores NSV y NTK, respectivamente. El vector NSV deriva
del vector N2^{17} original por inserción del fragmento Kpn I/Hind
III de 0,4 kb que contiene el primitivo promotor ampliador SV40 y se
origina la replicación en el único sitio de clonación Xho I. El
vector NTK deriva también del N2 por inserción del promotor de
timidina-cinasa (TK) del herpes simplex virus (HSV)
de 852 bp.
El vector LNSN se construye por inserción del
cDNA de LNGFR en el sitio Hpa I del vector LXSN^{5}.
En el vector DCN (LNGFR de doble copia) se clona
el cDNA de LNGFR bajo el control del fragmento Ssp I/Nco I de 0,8 kb
del promotor adenosina-desaminasa
(ADA)^{18} humana en los sitios Bgl II/Sna Bl del vector
retrovírico N2A/segmento multienlace (polylinker)^{6}.
De modo muy similar, en los vectores
NSV-N, NTK-N, LNSN y DCN en lugar
del cDNA de LNGFR es posible emplear un cDNA de LNGFR truncado
(\DeltaLNGFR).
En las figuras 3 y 4 se presentan diferentes
diseños (constructs) vectoriales con arreglo a la invención.
Los DNA vectoriales se convierten en los virus
correspondientes por un protocolo de transinfección. En resumen, el
DNA del vector de transfecta en la línea celular^{19} de
empaquetamiento ecotrópico \Psi2 por
co-precipitación^{20} estándar de fosfato cálcico
48 horas después de la transfección, se recogen los líquidos
sobrenadantes que contienen \Psi2 y se utilizan para infectar las
líneas celulares de empaquetamiento anfotrópico PA317^{21} durante
16 horas en presencia de 8 \mug/ml de polibreno. Se seleccionan
las células PA317 infectadas en DMEM (GIBCO, Grand Island, NY)
suplementado con un 10% de FCS (Hyclone, Logan, UT) y que contiene
0,8 mg/ml de G418 (GIBCO) y se utiliza para generar líquidos
sobrenadantes que contienen virus, exentos de auxiliares (helper),
cuyas concentraciones se sitúa entre 10^{4} y 5x10^{5} cfu/ml.
Todos los vectores contienen el gen NeoR que codifica la
neomicina-fosfotransferasa que confiere resistencia
"in vitro" al análogo G418 de la neomicina.
Todas las líneas celulares descritas en este
estudio, excepto la RIM y la J.M., se obtienen de la ATCC y se
cultivan en medio RPMI 1640 (GIBCO) suplementado con un 10% de FCS.
La K562 y la KG1 son líneas celulares mieloides derivadas de
leucemias mielógenas crónicas y agudas, respectivamente; la Raji y
la Daudi derivan de dos linfomas de Burkitt; la
MOLT-4 se considera una célula T estable de leucemia
(CD8^{+}); la RIM es una línea celular linfoblastoide transformada
con EBV; la J.M. es una línea celular linfoblastoide T
CD4^{+}/CD8^{+}; la A875 es una línea celular de melanoma humano
que expresa \sim 10^{6} LNGFR/célula.
Se infectan durante 16 horas 5x10^{5} células
diana con líquidos sobrenadantes víricos sin diluir que contienen 8
\mug/ml de polibreno, se cultivan durante 24 horas más en medio
completo y después se selecciona en presencia de la dosis
determinada previamente de G418 (de 0,5 a 1,5 mg/ml). Los análisis
posteriores se realizan en cultivos a granel de células
seleccionadas con G418.
Se obtienen células mononucleares de sangre
periférica (PBMC) de donantes sanos por separación de gradiente
Ficoll-Hypaque (Pharmacia, Uppsala, Suecia) y se
cultivan durante 72 horas con estimulación de fitohemaglutinina
(PHA) e interleucina-2 recombinante humana
(hu-rIL2) (2 \mug/ml de PHA purificada, Welcome
Labs., Dartford, GB; 100 U/ml de hu-rIL2, Roche,
Nutley, NJ). La infección vírica se lleva a cabo por exposición de
los PBL estimulados a un stock vírico exento de células durante 6
horas en presencia de polibreno (8 \mug/ml). Pasadas 48 horas de
la infección se seleccionan los PBL en medio RPMI 1640 suplementado
con L-glutamina 2 mM, 1% de aminoácidos no
esenciales, 1% de piruvato Na, 5% de suero humano (HS) y 100 U/ml de
hu-rIL2 (medio completo), que contiene 0,4 mg/ml de
G418. La densidad celular se mantiene constante (5x10^{5}
células/ml) durante 2 semanas de la selección con G418. Los
linfocitos T humanos, transducidos con retrovirus, se clonan también
en placas Terasaki en diferentes concentraciones celulares
(1-10^{3} células/hoyo) en medio completo que
contiene 0,4 mg/ml de G418, en presencia de PBL humanos irradiados
que actúan de células alimentadoras (feeder cells).
Con el fin de mejorar la eficacia de la infección
retrovírica se co-cultivan los PBL humanos con
células productoras de virus durante 48-72 horas en
medio completo. El co-cultivo se lleva también a
cabo en placas Transwell (Costar, Cambridge, MA) para impedir el
contacto de célula con célula. Se siembran 3x10^{5} células
productoras en los hoyos de la placa de acumulación de platos de 6
hoyos y se incuban a 37ºC durante una noche. Se añaden 5x10^{5}
PBL estimulados en las placas Transwell y se cultivan durante
48-72 horas en presencia de 8 \mug/ml de
polibreno.
Se analizan las células transducidas con
retrovirus por citometría de flujo para determinar la expresión de
receptor y se expanden para análisis posteriores.
De las células se obtiene DNA de alto peso
molecular por extracción estándar con fenol/cloroformo^{20}, se
digiere por completo en 5 \mug de partes alícuotas con enzimas de
restricción apropiadas (GIBCO-BRL), se somete a
electroforesis en geles de agarosa al 0,8% en campo de 1,5 V/cm en
tampón tris-acetato, se transfiere a una membrana de
poliamida (Nylon) (Hybond-N, Amersham,
Buckinghamshire, GB) por punción capilar Southern^{20} y se
hibrida con 10^{7} dpm de una sonda marcada con P^{32}.
1) fragmento de pSV2-neo y
2) fragmento que contiene la región constante
TCR-\beta
Las sondas de DNA son un fragmento Hind III/Sma
de 1,2 Kb del pSV2-neo^{22} y el fragmento Hinc
II-3' del clon de cDNA de YTJ-2 que
contiene la región constante TCR-\beta
humana^{23}. Se lavan los filtros en condiciones de gran
estringencia y se exponen a películas Kodak X-AR 5 a
-70ºC.
1) fragmento de pSV2-neo y
2) fragmento de cDNA de LNGFR
Se extrae el RNA celular total por la técnica del
isotiocianato de guanidina^{24} y se selecciona su
poly(A)^{+} por cromatografía a través de
oligo(dT)celulosa^{20}. Se fraccionan por tamaño 5
\mug de poly(A)^{+}RNA a través de un gel de
agarosa al 1% en formaldehído, se transfieren a una membrana de
poliamida (nylon) por punción capilar Northern^{25} y se hibridan,
se lavan y se exponen del modo descrito con ocasión del Southern
Blot. Las sondas de DNA son un fragmento Hind III/Sma I de 1,2 Kb de
pSV2-neo y el fragmento Sst I de 1,5 Kb del cDNA de
LNGFR^{16}.
Expresión del LNGFR con seguimiento mediante
citometría de flujo empleando
1) LNGFR antihumano con marcador de fluoresceína
y
2) Anticuerpos monoclonales (MAB) antihumanos
conjugados con PE
Se hace el seguimiento de la expresión de
superficie celular del LNGFR por citometría de flujo empleando un
anticuerpo monoclonal LNGFR murino antihumano 20.4 (ATCC) mediante
un método indirecto de marcado con fluorescencia. Se determina el
fenotipo de superficie celular de las líneas de linfocitos T y de
los clones mediante citometría de flujo empleando anticuerpos
monoclonales (MAB) antihumanos CD4 conjugados con PE (T4), CD8 (T8),
CD5, B4, CD25R, Leu7, CD34 (Coulter Immunology Hialeah, FL). En
resumen, se tiñen 5x10^{5} células con 100 \mul de anticuerpos
diluidos a 4ºC durante 30 min, se lavan dos veces con medio sin FCS
y se vuelven a suspender en 0,5 ml de PBS para el análisis FACS o en
100 \mul de anticuerpo secundario conjugado con FITC y diluido.
Los análisis de tinción doble se llevan a cabo mediante incubación
secuencial de los anticuerpos conjugados con FITC y con PE.
Se extrae RNA de PBL y líneas de células T
empleando GTC^{26}, transcrito inversamente en el cDNA empleando
oligo-dT y dG adicionado en cola^{27}, un
veinteavo del DNA obtenido se somete a PCR empleando
oligonucleótidos específicos^{28} de
V\beta-C\beta y para anclar la PCR empleando un
oligonucleótido específico de C\beta
(5'-TGCTGACCCCACTGTCGACCTCCTTCCCATT-3')
(SEQ ID NO: 2), del modo descrito en la ref. 27. Los ciclos de
amplificación de la PCR se realizan a 94ºC durante 45'', a 57ºC
durante 45'' y a 72ºC durante 1'. Se purifica el producto
amplificado a través de gel y se clona en vector de plásmido
"bluescript". Las colonias positivas de C\beta se replican
sobre diferentes placas, se transfieren a filtros de nitrocelulosa y
se hibridan con oligonucleótidos^{28,29} específicos de V\beta
en las condiciones siguientes: 6 x SSC, 1% "blotto", 0,1% de
SDS y EDTA 5 mM a 42ºC durante 3-6 horas, se lavan
durante 1 h a la misma temperatura en 6 x SSC y se exponen durante
6-12 h a una película de rayos X a temperatura
ambiente.
Se desarrollan diversos diseños (constructos) de
vectores retrovíricos para la expresión del LNGFR que se utilizan
para la generación de las líneas celulares productoras de virus. Los
diseños NSV-N (fig. 1A) y NTK-N
(fig. 1C) se basan en promotores internos, que dirigen el cDNA del
LNGFR, es decir, el antiguo promotor SV40 y el promotor
HSV-TK, respectivamente. En el vector LNSN (fig.
1E), el gen LNGFR se expresa desde el LTR vírico. En el diseño DCN
(fig. 1G), el cDNA del LNGFR está controlado por el promotor ADA
humano, dentro de la región U3 del 3'LTR. Los diseños SFCM contienen
un gen LNGFR truncado, en el que ha sufrido deleción el dominio
intracelular (\DeltaLNGFR). Después de la infección de las células
diana, el gen transducido se duplica y se transfiere al 5'LTR^{6},
de este modo se genera un provirus que contiene dos copias del
minigen ADA-LNGFR. Todos los vectores llevan el gen
NeoR, ya sea bajo el control del LTR vírico (NSV-N,
NTK-N y DCN), ya sea del antiguo promotor SV40 (LNSN
y SFCM).
Los vectores pueden utilizarse para transducir el
gen LNGFR (y el gen LNGFR truncado, respectivamente) a las líneas
celulares hematopoyéticas humanas de diferentes linajes y a los PBL
humanos y son capaces de:
1) transducir células diana humanas,
2) integrar y formar provirus intactos y
3) expresar el gen informante (reporter gen).
\newpage
La concentración vírica de las líneas celulares
productoras anfotrópicas se sitúa entre 1x10^{4} y 5x10^{5}
cfu/ml para el caso de NSV-N, NTK-N,
LNSN y SFCM y entre 5x10^{3} y 1x10^{4} cfu/ml para el DCN.
Para el rastreo (screening) inicial de diferentes
vectores se utiliza un gran número de líneas celulares tumorales de
origen hemato-linfopoyético en calidad de células
diana de la transferencia genética. Se transducen dos líneas
celulares mieloides (K562 y KG1), dos linfomas de Burkitt (Raji y
Daudi), una línea celular linfoblastoide transformada con EBV (RIM)
y dos líneas celulares linfoblastoides T (MOLT-4 y
J.M.) con los cuatro vectores retrovíricos y se seleccionan en
presencia de G418. Se lleva a cabo el análisis molecular de las
integraciones retrovíricas por "Southern Blotting" para
detectar el tamaño de los virus integrados y el número de copias (de
1 a 5 copias/célula). Se digieren los DNA genómicos con Xba I, que
corta en los 5' y en los 3'LTR de todos los vectores (fig. 1),
permitiendo la detección del tamaño de los provirus integrados y con
Bgl II, que corta solamente los DNA genómicos, permitiendo estimar
el número de sitios de integración. Los DNA digeridos con XBa I y
con Bgl II se hibridan secuencialmente con sondas específicas de los
genes NeoR y LNGFR.
La integración del vector NSV-N
genera una banda simple Xba I del tamaño 5,1 kb esperado,
correspondiente a un provirus intacto, en todas las líneas celulares
seleccionadas con G418 (fig. 2A). En las células Raji se observa una
banda adicional de menor tamaño, indicando la integración de un
provirus reordenado (fig. 2A, carril 3).
De modo similar, la digestión con Xba I genera
una banda única del tamaño de 5,4 kb esperado en los DNA de todas
las líneas celulares NTK-N infectadas (fig. 2B). Una
banda adicional, debida probablemente a la presencia de un provirus
reordenado, se detecta solamente en la muestra RIM (fig. 2B, carril
5). Se observa una banda simple de 4,3 kb en todas las muestras
transducidas con el vector LNSN y SFCM, sin evidencia de
reordenamiento vírico (fig. 2C). Por el contrario, los modelos de
integración vírica en DNA de células infectadas con DCN se
caracterizan por reordenamientos frecuentes (fig. 2D). Todas las
líneas celulares transducidas con DCN presentan una banda de 5,4 kb,
correspondiente al provirus intacto, pero se detecta además una
banda adicional de 3,2 kb en todas las líneas celulares menos una
(KG1). La proporción relativa entre las dos bandas es variable en
las muestras analizadas, situándose desde la predominancia del
provirus intacto (MOLT-4, fig. 2D, carril 6) hasta
la prevalencia del reordenado (Raji, fig. 2D, carril 3). Las
infecciones repetidas con el mismo stock de retrovirus indican que
la proporción entre provirus intactos y reordenados es un suceso
aleatorio, no específico de las células.
Tal como se observa en las líneas celulares
transducidas por todos los demás vectores, el modelo Bgl II pone de
manifiesto que la infección con DCN genera una integración
policlonal en todas las líneas celulares.
Con el fin de investigar la naturaleza y el
mecanismo causante de la generación de provirus reordenados hemos
realizado digestiones adicionales de DNA genómicos con Hind III, que
corta dos veces en el minigen ADA-LNGFR, seguidas
por la hibridación con la sonda de LNGFR. Los análisis comparativos
de los modelos de restricción Xba I y XbaI/Hind III con las dos
sondas indican que la banda de 3,2 kb corresponde a un provirus
reordenado al que le falta el minigen ADA-LNGFR de
ambos LTR. Los provirus defectuosos se detectan también en alta
frecuencia durante la selección de las líneas celulares productoras
de DCN. El clon empleado en todos nuestros ensayos alberga solamente
provirus intactos, indicando que la generación de los provirus
defectuosos tiene lugar durante la integración en las células diana
y no se debe a defectos de la línea celular productora.
En resumen, la infección de todas las líneas
celulares con NSV-N, NTK-N, LNSN y
SFCM da lugar a poblaciones resistentes a G418 que llevan un número
bajo de copias de la mayoría de provirus sin reordenar, mientras que
la infección con el vector DCN genera un virus normalmente
reordenado en alta frecuencia, derivado con gran probabilidad de la
pérdida del minigen ADA-LNGFR del 3'LTR del vector
retrovírico durante el proceso de integración. Este problema puede
deberse al tamaño y a la naturaleza del gen insertado en el LTR
vírico, no se observan limitaciones similares con otros diseños
vectoriales de "doble copia", ver 12-14.
Se evalúa la expresión de LNGFR transducida por
diferentes vectores retrovíricos tanto a nivel de proteína como a
nivel de mRNA. La expresión en superficie celular del LNGFR en
líneas celulares seleccionadas con G418 se analiza cuantitativamente
por citometría de flujo con anticuerpos monoclonales (MAB)
anti-LNGFR. Se recogen los resultados en la tabla I.
La mayoría de las líneas celulares transducidas con
NSV-N y NTK-N presentan un nivel
medio-bajo de LNGFR de superficie, expresado como
fluorescencia media relativa (<100 unidades arbitrarias). Se
observa una expresión elevada del LNGFR (202 u.a.) solamente en la
línea celular RIM infectada con EBV y transducida por
NSV-N. No se detecta expresión de LNGFR en la línea
celular MOLT-4 transducida con
NTK-N, a pesar de que no se detecta un
reordenamiento del genoma provírico en el DNA genómico digerido con
Xba I (fig. 2B, carril 6). La transferencia genética repetida con
este vector a la misma línea celular dio resultados negativos en
forma coherente.
Todas las líneas celulares transducidas con
vectores retrovíricos LNSN y SFCM expresan el LNGFR en niveles
medios-altos (50-200 u.a.) (tabla
I).
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
^{a} \+ \begin{minipage}[t]{152mm} La expresión cuantitativa
del LNGFR se puntúa del modo siguiente: - indica 0 unidades
arbitrarias (u.a.) de intensidad de fluorescencia media relativa; +
indica 0-50 u.a.; ++ indica 50-100
u.a.; +++ indica 100-200 u.a. El valor medio
relativo de la línea celular de melanoma A875, que expresa \sim
10 ^{6} receptores/célula, es de 190 u.a. \end{minipage} \cr
^{b} \+ \begin{minipage}[t]{152mm}Los perfiles FACS de la
línea celular K562, Daudi, RIM y J.M. son bifásicos; la puntuación
se refiere solamente al pico positivo (ver
resultados).\end{minipage} \cr ^{c} \+los datos de los
vectores SFCM son
similares\cr}
La mayor parte de las líneas celulares
transducidas con DCN expresan niveles medios o altos de LNGFR
(50-200 u.a.). Los perfiles FACS de las líneas
celulares transducidas con DCN guardan buena relación con los
resultados obtenidos en el análisis Southern, en el que las líneas
celulares que albergan un provirus reordenado además del intacto
presentan curvas bifásicas, con un pico negativo y un pico positivo
proporcional a la intensidad relativa de las bandas que corresponden
a los provirus intacto y reordenado, respectivamente.
La expresión de RNA específicos de vector en
células transducidas (K562) se determina por Northern Blotting de
poly(A)^{+}RNA aislado de líneas celulares
seleccionadas con G418, hibridadas con sondas LNGFR y Neo. Los
modelos resultantes son coherentes con los perfiles de transcripción
esperados para cada vector retrovírico. En las células transducidas
con NSV-N y NTK-N, una especie RNA
sin empalmar y una empalmada se hibridan con una sonda LNGFR y con
una sonda Neo. Los transcritos subgenómicos derivados de
SV-40 y de TK que contienen el mRNA específico del
LNGFR se observan únicamente después de la hibridación con la sonda
LNGFR. Las células transducidas con LNSN o SFCM expresan únicamente
el RNA sin empalmar, se hibridan tanto con la sonda NeoR como con la
LNGFR. Esto es coherente con la inactivación ya publicada del sitio
dador de empalme del vector LXSN, del que se derivan el LNSN y el
SFCM^{5}. Un transcrito más corto, correspondiente al mRNA de NeoR
derivado de SV40 se hibrida solamente con una sonda NeoR.
El vector DCN genera dos transcritos genómicos
derivados de LTR, una forma sin empalmar y otra forma empalmada,
respectivamente. Una tercera especie de RNA se transcribe desde el
promotor ADA y muy probablemente se emplea como molde principal de
mRNA para la síntesis del LNGFR. La contribución relativa del
promotor ADA del 5' o del 3'LTR al transcrito LNGFR no puede
evaluarse por esta técnica. Una forma de RNA de migración lenta
puede representar un transcrito de lectura completa
(read-through transcript) iniciado desde el promotor
ADA en el 5'LTR y terminado en el sitio de adición poly(A)
del 3'LTR. Se detectan también dos especies de RNA adicionales, no
contadas, que se hibridan solamente con la sonda NeoR. Estos
transcritos, presentes en todas las líneas celulares transducidas
por DCN, son las únicas especies de RNA detectadas en las células
Raji, que no expresan el LNGFR y llevan solamente provirus
reordenados, como demuestra el análisis Southern Blot. Es probable
por tanto que estos transcritos sean específicos del provirus
reordenado, al que le falta el minigen
ADAp-LNGFR.
El modelo de expresión de RNA observado en otras
líneas celulares es comparable al obtenido a partir de la K562, con
la única excepción de la línea celular RIM infectada con EBV, que de
forma coherente presenta niveles altos de transcritos derivados de
SV40, partiendo de NSV-N, LNSN y SFCM.
Los PBL humanos se infectan con vectores
retrovíricos con estimulación PHA e IL-2. Con el fin
de estimar las frecuencias de infección, 48 horas después de la
infección se cultivan células T humanas en condiciones limitantes de
dilución (de 1 a 10^{3} células/hoyo). Se cultivan células de
control infectadas y no infectadas en presencia o ausencia de 0,4
mg/ml de G418. Se evalúa el crecimiento celular 14 días después del
inicio del cultivo en placa, entonces no se detectan células
supervivientes en hoyos que contienen células sin infectar
cultivadas en presencia de G418. La frecuencia global de infección
se sitúa entre menos del 1% y el 5,1%, en función de la
concentración vírica de los líquidos sobrenadantes que contienen
vectores. Sin embargo, entre diferentes donantes se observa una
variación significativa. La eficacia de la transferencia genética
puede aumentarse mediante ciclos de infección múltiple o mediante
co-cultivo. El co-cultivo de PBL con
líneas celulares productoras de virus irradiadas durante 48 horas
proporciona lógicamente una buena eficacia de transferencia genética
(del 10 al 15%). Los análisis de doble fluorescencia de los
marcadores LNGFR y células T indican la posibilidad de contaminación
con células productoras de vectores en la población positiva de
LNGFR. En el ensayo, la frecuencia de la expresión de LNGFR se debe
en su totalidad a la expresión del gen transducido por los PBL
infectados, ya que todas las células positivas en el análisis FACS
co-expresan el CD3 humano con independencia de la
eficacia inicial de la transferencia genética, los PBL transducidos
pueden seleccionarse hasta homogeneidad ya sea por selección con
G418, ya sea por inmunoselección positiva con bolas magnéticas
unidas a un anticuerpo monoclonal dirigido contra el LNGFR. En el
ensayo representativo fue suficiente una sola ronda de
inmunoselección para separar la población de células transducidas de
los PBL sin infectar. Una vez separadas las bolas magnéticas se
obtiene una población homogénea de linfocitos transducidos sin
pérdida significativa de células transducidas.
Con el fin de evaluar la eficacia de los vectores
víricos en infectar los PBL humanos se transduce un gran número de
cultivos de PBL a granel con independencia entre sí por exposición a
líquidos sobrenadantes que contienen los distintos vectores
retrovíricos y se seleccionan con el G418 para determinar la
presencia del vector y la expresión. Se analizan diez de los
cultivos transducidos con vector (2 por el NSV-N, 3
por el NTK-N, 2 por el LNSN/SFCM y 3 por el DCN) con
el Southern Blotting para determinar las integraciones províricas.
La hibridación con la sonda NeoR del Xba I representativo, que corta
en ambos 5' y 3'LTR de todos los vectores (fig. 1), permite detectar
el tamaño de los provirus integrados y con el Bgl II, que corta
solamente los DNA genómicos, permite estimar el número de sitios de
integración. En todos los cultivos de linfocitos transducidos con
NSV-N, NTK-N y LNSN/SFCM se detectan
solamente bandas correspondientes a los provirus integrados
intactos, mientras que en todos los cultivos transducidos con DCN se
observa una banda adicional correspondiente a un provirus
reordenado.
Finalmente, el análisis de integraciones
províricas revela que los cultivos de células T transducidas con
NSV-N, NTK-N y LNSN/SFCM son
ampliamente policlonales, mientras que los cultivos transducidos con
DCN son fundamentalmente oligoclonales, como indica la presencia de
una banda predominante y de unas pocas bandas menores. Tal como se
ha sugerido anteriormente, esto se debe probablemente a una
concentración vírica menor y podría soslayarse mediante diversos
protocolos de transferencia genética, incluido el
co-cultivo de células diana con líneas celulares
productoras de vectores.
La expresión del LNGFR en la superficie de las
células se detecta por análisis FACS en un total de 23 cultivos de
linfocitos T transducidos con vector retrovírico (5 líneas celulares
transducidas por NSV-N, 8 por NTK-N,
5 por LNSN y 5 por DCN). La expresión de LNGFR es baja en todas las
células transducidas con NSV-N y en seis de los ocho
cultivos celulares transducidos con NTK-N. Las dos
líneas restantes de células T transducidas con NTK-N
presentan niveles intermedios de expresión del LNGFR. Se observan
niveles heterogéneos de expresión en los cultivos celulares
LNSN-SFCM, de los que dos líneas expresan niveles
bajo, dos niveles intermedios y uno expresa niveles altos de LNGFR.
En las células transducidas con DCN, cuatro de las cinco líneas
expresan niveles bajos y uno niveles intermedios de LNGFR.
Con el fin de caracterizar las células infectadas
hemos ensayado 13 líneas celulares transducidas para determinar la
expresión de antígenos de diferenciación de linfocitos de superficie
celular empleando anticuerpos monoclonales anti-CD4,
CD8, CD5, B4, Leu7, CD25R y CD34. Todas las líneas celulares
obtienen puntos positivos en cuanto a expresión de CD5 y CD25R y
negativos en cuanto a expresión de Leu7, B4 y CD34 (no se presentan
los datos). Ocho de los 13 cultivos analizados son
LNGFR^{+}/CD8^{+}, uno es LNGFR^{+}/CD4^{+} y cuatro son
positivos para LNGFR y contienen diferentes porcentajes de células
que co-expresan CD8 y CD4. La predominancia del
fenotipo CD8^{+} en los cultivos estimulados con PHA e
IL-2 se observa también en las líneas celulares de
control, no infectadas y probablemente representen una desviación
(bias) constante del procedimiento de cultivo de células T. En
general no hemos observado una transducción preferente de los
subconjuntos celulares concretos en ninguno de los cuatro vectores
retrovíricos.
Se obtienen clones de células T de cultivos de
células T transducidas con vectores por cultivo de células en placa
con dilución limitante (1000, 100 y 10 células/hoyo), teniendo en
cuenta una frecuencia media de infección de aprox. el 1%. El 72% de
todos los clones examinados son LNGFR^{+}/CD4^{+} y el 28% son
LNGFR^{+}/CD8^{+}. Se observa también la predominancia del
fenotipo CD4^{+} en células T de control, no infectadas, clonadas
a partir de los mismos donantes y se considera un hallazgo estándar
en nuestras condiciones de clonación. Además se realiza la
transducción retrovírica y la expresión de LNGFR en clones
doblemente positivos CD4^{+}/CD8^{+}. Estos resultados
demuestran que la infección retrovírica puede ocurrir no solo en
células CD4^{+} y CD8^{+} maduras, sino también en linfocitos
doblemente positivos CD4^{+}/CD8^{+} inmaduros de la sangre
periférica.
Tal como se ha descrito anteriormente, en
análisis Southern Blot de integraciones víricas pone de manifiesto
la naturaleza policlonal de los cultivos de células T infectadas con
vectores. Esto se confirma además por análisis molecular de
reordenamientos de la cadena (TCR)\beta del receptor de
células T en muestras de DNA digerido con Xba I, hibridadas con una
sonda específica de la región constante de la cadena TCR\beta. En
los cultivos de células T transducidas con NSV,
NTK-N y LNSN/SFCM se detecta un modelo policlonal,
sin bandas predominantes, además del modelo de línea germinal. Se
observa la presencia de un número limitado de bandas predominantes
de reordenamiento en cultivos infectados con DCN, al igual que en
poblaciones de células oligoclonales.
Se obtiene una confirmación adicional de estas
observaciones por análisis sistemático del uso de la cadena
TCR-V\beta en linfocitos transducidos. Después de
un solo ciclo de infección de los PBL con líquidos sobrenadantes que
contienen vectores, seguida por la selección de las células
transducidas con G418, se somete el RNA total de la población de
linfocitos seleccionados a una transcripción inversa y se somete el
DNA obtenido a una PCR empleando oligonucleótidos específicos de
V\beta-C\beta y para anclar la PCR empleando un
oligonucleótido específico de C\beta, del modo descrito en la
sección de métodos. El análisis de los productos amplificados
mediante oligonucleótidos específicos de V\beta pone de manifiesto
un repertorio idéntico, si se compara con la población original de
control de linfocitos no transducidos/no seleccionados. De modo
similar a los resultados del análisis Southern Blot de los
reordenamientos de la cadena TCR-\beta, las
concentraciones víricas bajas de los líquidos sobrenadantes que
contienen vectores producen un repertorio V\beta limitado (no se
presentan los datos). Esta limitación de los vectores de baja
concentración podría soslayarse mediante ciclos múltiples de
infección o mediante el co-cultivo de PBL con la
línea celular productora.
1) Miller A.D.: Human gene therapy comes
of age. Nature 357:455, 1992
2) Karlsson S.: Treatment of genetics
defects in hematopoietic cell function by gene transfer.
Blood 78:2481, 1991
3) Anderson, W.F.: Human gene therapy.
Science 256:808, 1992
4) Gilboa E., Eglitis M.A.,
Kantoff P.W., Anderson W.F.: Transfer and expression
of cloned genes using retroviral vectors., Bio Techniques
4:504, 1986
5) Miller A.D., Rosman G.J.:
Improved retroviral vectors for gene transfer and expression.
Bio Techniques 7:980, 1989
6) Hantzopoulos P.A., Sullenger
B.A., Ungers G., Gilboa E.: Improved gene expression
upon transfer of the
adenosine deaminase minigene outside the transcriptional unit of a retroviral vector. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3519, 1989
adenosine deaminase minigene outside the transcriptional unit of a retroviral vector. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3519, 1989
7) Kasid A., Morecki S.,
Aebersold P., Cornetta K., Culver K.,
Freeman S., Director E., Lotze M.T.,
Blaese R.M., Anderson W.F., Rosenberg SA.:
Human gene transfer: characterization of human
tumor-infiltrating
lymphocytes as vehicles for retroviral-mediated gene transfer in man. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:473, 1990
lymphocytes as vehicles for retroviral-mediated gene transfer in man. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:473, 1990
8) Culver K., Cornetta K.,
Morgan R., Marecki S., Aebersold P.,
Kasid A., Lotze M., Rosenberg S.A.,
Anderson W. F., Blaese PM.: Lymphocytes as cellular
vehicles for gene therapy in mouse and man. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 88:3155, 1991
9) Rosenberg S.A., Aebersold P.,
Cornetta K., Kasid A., Morgan R.A.,
Moen R., Karson E.M., Lotze M.T., Yang
J. C., Topalian S.L., Merino M.J., Culver K.,
Miller A.D., Blaese P.M., Anderson W.F.: Gene
transfer
into humans immunotherapy of patients with advanced melanoma, using tumor-infiltrating lymphocytes modified by retroviral gene transduction. New Eng. J. of Med. 323:570, 1990
into humans immunotherapy of patients with advanced melanoma, using tumor-infiltrating lymphocytes modified by retroviral gene transduction. New Eng. J. of Med. 323:570, 1990
10) Morecki S., Karson E.,
Cornetta K., Kasid A., Aebersold P.,
Blaese R.M., Anderson W.F., Rosenberg S.A.:
Ret-rovirus-mediated gene transfer
into CD4+ and CD8+ human T cell subsets derived from
tumor-infiltrating lym-pnocytes and
peripheral blood mononuclear cells. Cancer Immunol.
Immunother. 32:342, 1991.
\newpage
12) Ferrari G., Rossini S.,
Giavazzi R., Maggioni D., Nobili N.,
Soldati M., Ungers G., Mavilio F.,
Gilboa E., Bordignon C.: An in vivo model of
somatic cell gene therapy for human sever combined
immunodeficiency. Science 251:1363, 1991
13) Ferrari G., Rossini S.,
Nobili N., Maggioni D., Garofalo A.,
Giavazzi R., Mavilio F., Bordignon C.: Transfer
of the ADA gene finto human
ADA-deficientT-lymphocytes
reconstitutes specific immune function. Blood 80:120,
1992
14) Sullenger B.A., Gallardo H.F.,
Ungers G.E., Gilboa E.: Overexpression of TAR
sequences renders cells resistant to human immunodeficiency virus
replication. Cell 63:601, 1990
15) Lee T.C., Sullenger B.A.,
Gallardo H.F., Ungers G.E., Gilboa E.:
Overexpression of RRE-derived sequences inhibits
HIV-1 replication in CEM cells. New Biol.
4:66, 1992
16) Johnson D., Lanahan A.,
Buck C.R., Seghal A., Morgan C., Mercer
E., Bothwell M., Chao, M.: Expression and structure of
the human NGF receptor. Cell 47:545, 1986
17) Keller G., Paige C.,
Gilboa E., Wagner E.F.: Expression of a foreign gene
in myeloid and Iymphoid celis derived from multipotent
haematopoietic precursors. Nature 318: 149, 1985
18) Wiginton D.A., Kaplan D.J.,
States J.C., Akeson Al., Penne C.M.,
Bilyk I.J., Vaughn A.J., Lattier D.L.,
Hutton J.J.: Complete sequence and structure of the gene for
human adenosine deaminase. Biochem. 25:8234, 1988
19) Mann R., Mulligan R.C.,
Baltimore D.: Construction of a retrovirus packaging mutant
and its use to produce helper-free detective
retrovirus. Cell 33:153, 1983
20) Sambrook J., Fritsch E.F.,
Maniatis T.: Molecular cloning: a laboratory manual 2nd ed.
1989
21) Miller A.D., Buttimore C.:
Redesign of retrovirus packaging cell lines to avoid recombination
leading to helper virus production. Mol. Cell. Biol. 6:2895,
1986
22) Southern PJ., Berg P.:
Transformation of mammalian cells to antibiotic resistance with a
bacterial gene under control of the SV40 early region promoter.
J. Mol. Appl. Genet. 1:327, 1982
23) Yanagi Y., Yoshikai Y.,
Leggett K., Clark S.P., Aleksander I.,
Mak T.W.: A human T cell-specificcDNA
clone encodes a protein having extensiva homology to immunoglobulin
chains. Nature 308:145, 1984
24) Chirgwin J.M., Przybyla AE.,
MacDonald R.J., Rutter W.J.: Isolation of
biologically active ribonucleic acid from sources enriched in
ribonuclease. Biochem. 18:5294, 1979
25) Thomas P.S.: Hybrídization of
denaturated RNA and small DNA fragments transferred to
nitrocellulose. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:5201,
1980
26) Chomczynski P., Sacchi N.:
Single-Step Method of RNA Isolation by Acid
Guanidimum Thiocyanate-Phenol Chloroform Extraction.
Analytical Biochemistry 162:156, 1987
27) Loh E.Y., Elliot J.F.,
Cwirla S., Lanier L.L., Davis M.M.: Polymerase
single-sided specificity: analysis of T cell
receptora chain. Science 243:217, 1989
28) Choi Y., Kotzin B.,
Herron L, Callahan J., Marrack P.,
Kappler J.: Interaction of Staphylococcus aureus toxin
"superantigens" with human T cells. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, Vol. 86:8941, 1989
29) Rosenberg W.M.C., PAH. Moss,
Bell J.I.: Variation in human T cell receptor V\beta and
J\beta repertoire: analysis using anchor polymerase chain
reaction. Eur. J. Immunol. 22:541, 1992
30) Bordignon C.: A clinical protocol for
transfer of the ADA gene into bone marrow cells and peripheral
blood lymphocytes for the treatment of patients affected by ADA
deficient SCID. Human Gene Therapy (in press).
31) Areman E.M. et al: Bone Marrow
and Stem Cell Processing: A Manual of Current Techniques, F.A.
Davies Co., Philadelphia (1992)
32) Reddy et al., Molecular Brain
Research 8 (1990) 137 - 141
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: BOEHRINGER MANNHEIM GmbH
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Sandhofer Str. 116
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Mannheim
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: BW
\vskip0.333000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: ALEMANIA
\vskip0.333000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): D-68305
\vskip0.333000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: 08856/60-3446
\vskip0.333000\baselineskip
- (H)
- TELEFAX: 08856/60-3451
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Método de marcado de células eucarióticas
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 2
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEÍBLE CON ORDENADOR:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: floppy disk
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA: PatentIn edición #1.0, versión #1.25 (EPO)
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE SOLICITUD PREVIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- SOLICITUD NÚMERO: IT RM93/A000587
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 01-SEP-1993
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 1:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1600 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- PROPIEDADES:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: propiedades diversas
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: uno-de(943)
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- INFORMACIÓN DIVERSA: /function = "PvuII cleavage site"
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- PROPIEDADES:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: propiedades diversas
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: uno-de(1512)
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- INFORMACIÓN DIVERSA: /function = "SstI cleavage site"
\vskip0.666000\baselineskip
- (x)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGCTGACCCC ACTGTCGACC TCCTTCCCAT T
\hfill31
Claims (11)
1. Un método de marcado de una célula de sangre o
una célula de médula ósea de mamífero mediante la expresión de un
ácido nucleico en dicha célula, dicho ácido nucleico codifica un
receptor de superficie celular y mediante la posterior presentación
de dicho receptor en la superficie de la célula,
caracterizado porque se utiliza un ácido nucleico en el que
la región que codifica el dominio intracelular del receptor ha
sufrido una deleción total o parcial o se ha modificado de tal
manera que el receptor presentado en la superficie, después de
unirse a su complemento de unión, no puede efectuar ninguna
transducción de señal.
2. El método según la reivindicación 1,
caracterizado porque la región que codifica el dominio
intracelular está modificada mediante sustitución de
nucleótidos.
3. El método según la reivindicación 1 ó 2,
caracterizado porque se utiliza un ácido nucleico que
codifica al receptor NGF, CD24 o LDL.
4. El método según las reivindicaciones de 1 a 3,
caracterizado porque en calidad de ácido nucleico se utiliza
el ácido nucleico del receptor NGF en el que la región que codifica
los aminoácidos 245 del extremo C ha sufrido deleción.
5. El método según las reivindicaciones de 1 a 4,
caracterizado porque el ácido nucleico se introduce en la
célula mediante un vector vírico o mediante lipofección.
6. Uso de un ácido nucleico que codifica un
receptor de superficie celular y en el que la región que codifica
el dominio intracelular ha sufrido una deleción total o parcial o
se ha modificado de tal manera que el dominio fundamentalmente ya
no está en condiciones de efectuar ninguna transducción de señal,
para expresar un receptor de superficie celular modificado de esta
manera y presentar el receptor en la superficie celular de tal
manera que el receptor se utiliza en calidad de marcador
seleccionable para células de sangre o células de médula ósea
transfectadas de mamífero.
7. Un método para la inmunoselección de células
de sangre o células de médula ósea transfectadas de mamífero que
consiste en la introducción de un ácido nucleico en la célula,
dicho ácido nucleico codifica a un receptor de superficie celular
en el que la región que codifica el dominio intracelular del
receptor ha sufrido una deleción total o parcial o se ha modificado
de tal manera que el receptor presentado en la superficie, una vez
se ha unido a su complemento de unión, no puede efectuar ninguna
transducción de señal, en identificar las células transfectadas por
incubación de dichas células con un anticuerpo marcado que se une
específicamente a dicho receptor y en recuperar las células por
destrucción del complejo anticuerpo/célula.
8. Un método para la inmunoseparación de células
de sangre o células de médula ósea transfectadas de mamífero que
consiste en la introducción de un DNA en la célula, dicho DNA
codifica a un receptor de superficie celular en el que la región que
codifica el dominio intracelular del receptor ha sufrido una
deleción total o parcial o se ha modificado de tal manera que el
receptor presentado en la superficie, una vez se ha unido a su
complemento de unión, no puede efectuar ninguna transducción de
señal, en incubar las células con un anticuerpo dirigido contra el
receptor inmovilizado antes o después de la incubación, en separar
las células inmovilizadas por el anticuerpo de las células no
fijadas y en aislar las células mediante la rotura de la unión
entre anticuerpo y receptor.
9. Un método de obtención de un preparado de
células hematopoyéticas, en el que dichas células están marcadas
con un receptor de superficie celular y en el que dicho preparado
celular está fundamentalmente exento de células tumorales
clonogénicas, que consiste en purgar mediante agentes citotóxicos o
mediante radiación, en transducir dichas células con un ácido
nucleico, que codifica un receptor de superficie celular y en el
que la región que codifica el dominio intracelular ha sufrido una
deleción total o parcial o se ha modificado de tal manera que el
dominio ya no puede realizar ninguna transducción de señal y en
separar dichas células transducidas de las células no
transducidas.
10. Uso de un ácido nucleico de LNGFR modificado,
ilustrado en la SEQ. ID. NO: 1, para el marcado de células de
sangre o células de médula ósea transfectadas de mamífero mediante
la transfección de las células con dicho ácido nucleico.
11. Uso según la reivindicación 10 para el
marcado de células hematopoyéticas humanas.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ITRM930587A IT1261847B (it) | 1993-09-01 | 1993-09-01 | Metodo per marcare cellule eucariote. |
| ITRM930587 | 1993-09-01 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2210260T3 true ES2210260T3 (es) | 2004-07-01 |
Family
ID=11401929
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES94926187T Expired - Lifetime ES2210260T3 (es) | 1993-09-01 | 1994-08-11 | Metodo de marcado de celulas eucarioticas empleando como marcador un receptor de superficie celular. |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6074836A (es) |
| EP (1) | EP0724634B1 (es) |
| JP (1) | JP2781276B2 (es) |
| AT (1) | ATE254660T1 (es) |
| CA (1) | CA2170757C (es) |
| DE (1) | DE69433342T2 (es) |
| DK (1) | DK0724634T3 (es) |
| ES (1) | ES2210260T3 (es) |
| IL (2) | IL110815A0 (es) |
| IT (1) | IT1261847B (es) |
| PT (1) | PT724634E (es) |
| WO (1) | WO1995006723A1 (es) |
Families Citing this family (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19643682C1 (de) * | 1996-10-23 | 1998-01-15 | Manfred Prof Dr Gareis | Verfahren zum Herkunftsnachweis von Nutztieren sowie davon stammenden Produkten |
| US6500421B1 (en) * | 1996-11-04 | 2002-12-31 | St. Jude Children's Research Hospital | In vivo selection of primitive hematopoietic cells |
| US6576813B2 (en) | 1997-01-31 | 2003-06-10 | Dnavec Research Inc. | Knockout animals |
| EP0904786B1 (en) * | 1997-08-22 | 2004-12-15 | Science Park Raf S.p.A. | Tumor vaccination by use of autologous or HLA-related antigen presenting cell (APC) transduced with a tumour antigen and a foreign antigen capable of causing an immune reaction |
| ZA989497B (en) * | 1997-10-20 | 2000-04-19 | Roche Diagnostics Gmbh | Positive-negative selection in homologous recombination. |
| IT1297016B1 (it) * | 1997-12-23 | 1999-08-03 | San Raffaele Centro Fond | Processo di selezione di linfociti t cd4+ per la transduzione di geni anti-hiv |
| IT1312570B1 (it) * | 1999-05-28 | 2002-04-22 | Genera Spa | Metodo per il traferimento di antigeni a cellule dendritiche. |
| US6790614B1 (en) | 1999-11-19 | 2004-09-14 | Novartis Ag | Selectable cell surface marker genes |
| EP1278773A2 (en) * | 1999-11-19 | 2003-01-29 | Novartis AG | Selectable cell surface marker genes |
| IL151996A0 (en) * | 2000-03-30 | 2003-04-10 | Novartis Ag | Selectable marker genes |
| DE10019075B4 (de) * | 2000-04-18 | 2007-01-18 | Vision 7 Gmbh | Verwendung von CD34 oder einem davon abgeleiteten Polypeptid als Zell-Oberflächen- bzw. Gentransfer-Marker |
| JP4489424B2 (ja) * | 2001-05-30 | 2010-06-23 | グラクソ グループ リミテッド | 染色体に基くプラットホーム |
| JP4344858B2 (ja) | 2001-09-13 | 2009-10-14 | カリフォルニア インスティチュート オブ テクノロジー | 細胞内で抗ウイルス性小ｒｎａ分子を発現させる方法 |
| US7737124B2 (en) | 2001-09-13 | 2010-06-15 | California Institute Of Technology | Method for expression of small antiviral RNA molecules with reduced cytotoxicity within a cell |
| AU2003241409A1 (en) * | 2003-05-12 | 2005-01-21 | Potomac Pharmaceuticals, Inc. | Gene expression suppression agents |
| GB0413702D0 (en) | 2004-06-18 | 2004-07-21 | Molmed Spa | Thymidine kinase |
| EP1784506B1 (en) | 2004-07-21 | 2010-08-25 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Lentiviral vectors and uses thereof |
| CN103842501B (zh) | 2011-10-05 | 2017-12-08 | 莫尔梅德股份有限公司 | 病毒载体纯化系统 |
| US20140037599A1 (en) * | 2012-08-03 | 2014-02-06 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Compositions and Methods of Treating T Cell Deficiency |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5055459A (en) * | 1986-06-30 | 1991-10-08 | Board Of Regents, The University Of Texas | Selective elimination of malignant cells from bone marrow by bis (acyloxy) propylphosphoramidates |
| AU7583891A (en) * | 1990-04-17 | 1991-11-11 | United States of America, as represented by the Secretary, U.S. Department of Commerce, The | Selective cytotoxic reagents comprising toxic moieties derived from mammalian proteins |
| CA2040099A1 (en) * | 1990-05-01 | 1991-11-02 | Mariano Barbacid | Tyrosine kinase negative trkb |
| US5462856A (en) * | 1990-07-19 | 1995-10-31 | Bunsen Rush Laboratories, Inc. | Methods for identifying chemicals that act as agonists or antagonists for receptors and other proteins involved in signal transduction via pathways that utilize G-proteins |
| JPH06501161A (ja) * | 1990-09-14 | 1994-02-10 | ザ ジョーンズ ホプキンス ユニバーシティー | 抗腫瘍免疫性の強化と遺伝子治療のための組成物及び方法 |
| US5470730A (en) * | 1990-09-28 | 1995-11-28 | Immunex | Method for producing TH -independent cytotoxic T lymphocytes |
| ATE159548T1 (de) * | 1990-11-13 | 1997-11-15 | Immunex Corp | Bifunktionelle wählbare fusionsgene |
| JPH06503722A (ja) * | 1990-11-30 | 1994-04-28 | アボット・ラボラトリーズ | 末端欠失神経成長因子受容体の検出に有用なイムノアッセイおよびモノクローナル抗体 |
| WO1992019749A1 (en) * | 1991-05-03 | 1992-11-12 | The Board Of Regents Acting For And On Behalf Of The University Of Michigan | Targeted delivery of genes encoding cell surface receptors |
| US5529774A (en) * | 1991-08-13 | 1996-06-25 | The Regents Of The University Of California | In vivo transfer of the HSV-TK gene implanted retroviral producer cells |
| JP2006344159A (ja) * | 2005-06-10 | 2006-12-21 | Toshiba Information Systems (Japan) Corp | 共通バス接続デバイス用通信制御装置 |
-
1993
- 1993-09-01 IT ITRM930587A patent/IT1261847B/it active IP Right Grant
-
1994
- 1994-08-11 EP EP94926187A patent/EP0724634B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-08-11 ES ES94926187T patent/ES2210260T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-08-11 DE DE69433342T patent/DE69433342T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-08-11 JP JP7507213A patent/JP2781276B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1994-08-11 CA CA002170757A patent/CA2170757C/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-08-11 US US08/602,791 patent/US6074836A/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-08-11 AT AT94926187T patent/ATE254660T1/de active
- 1994-08-11 DK DK94926187T patent/DK0724634T3/da active
- 1994-08-11 PT PT94926187T patent/PT724634E/pt unknown
- 1994-08-11 WO PCT/EP1994/002687 patent/WO1995006723A1/en active IP Right Grant
- 1994-08-29 IL IL11081594A patent/IL110815A0/xx not_active IP Right Cessation
- 1994-08-29 IL IL147557A patent/IL147557A/en not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ATE254660T1 (de) | 2003-12-15 |
| PT724634E (pt) | 2004-03-31 |
| EP0724634A1 (en) | 1996-08-07 |
| DK0724634T3 (da) | 2004-03-29 |
| DE69433342T2 (de) | 2004-09-09 |
| IL147557A (en) | 2006-10-31 |
| ITRM930587A0 (it) | 1993-09-01 |
| EP0724634B1 (en) | 2003-11-19 |
| CA2170757C (en) | 2003-04-22 |
| ITRM930587A1 (it) | 1995-03-01 |
| DE69433342D1 (de) | 2003-12-24 |
| JP2781276B2 (ja) | 1998-07-30 |
| IL110815A0 (en) | 1994-11-11 |
| WO1995006723A1 (en) | 1995-03-09 |
| US6074836A (en) | 2000-06-13 |
| IT1261847B (it) | 1996-06-03 |
| JPH09501569A (ja) | 1997-02-18 |
| CA2170757A1 (en) | 1995-03-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2210260T3 (es) | Metodo de marcado de celulas eucarioticas empleando como marcador un receptor de superficie celular. | |
| Mavilio et al. | Peripheral blood lymphocytes as target cells of retroviral vector-mediated gene transfer | |
| Su et al. | The glycosyl phosphatidylinositol anchor is critical for Ly-6A/E-mediated T cell activation. | |
| ES2315016T3 (es) | Moleculas llamadas b7l-1. | |
| US20030165835A1 (en) | Cell stress regulated human MHC class I gene | |
| KR100262420B1 (ko) | 바이러스, 특히 레트로바이러스의 복제를 억제하기 위한 "면역결핍-바이러스 억제 림포카인(아이에스엘)"의 용도 | |
| JP2003512844A (ja) | 多発性硬化症関連スーパー抗原 | |
| Bradley et al. | Correction of defective expression in MHC class II deficiency (bare lymphocyte syndrome) cells by retroviral transduction of CIITA. | |
| JPWO2007142241A1 (ja) | 抗ｃｄ３８抗体を細胞表面に有する免疫担当細胞 | |
| JP2001511363A (ja) | レトロウイルスの超抗原を含むインスリン依存性真性糖尿病のごとき自己免疫疾患の診断および治療方法 | |
| US6696244B2 (en) | G-coupled receptors associated with retroviral entry into cells, and therapeutic uses thereof | |
| US20200297766A1 (en) | Cell | |
| Vasicek et al. | B-less: a strain of profoundly B cell-deficient mice expressing a human lambda transgene. | |
| WO2000011168A2 (en) | Genes that regulate hematopoietic blood forming stem cells and uses thereof | |
| EP0893691A1 (en) | Methods for diagnosis and therapy of autoimmunedisease, such as insulin dependent diabetes mellitus, involving retroviral superantigens | |
| Rose et al. | Abrogation of IL-2 dependence by recombinant murine retrovirus containing v-myb | |
| Su | Structural and functional analysis of the murine Ly-6A/E antigen | |
| CA2444654A1 (en) | Molecular sequence of pig endogenous retrovirus receptors and methods of use | |
| Nuckols | H-2 linked control of envelope gene selection in recombinant murine leukemia viruses | |
| Le Page | Studies of KIR2DL4 and HLA-G | |
| Mavilio et al. | R zyxwvutsrqponm | |
| Vance | Natural killer cell receptors for nonclassical major histocompatibility complex class I molecules of the mouse | |
| Park | The role of Stat2 in interferon biology | |
| Doan | The transcriptional repressor protein growth factor independence-1B in T lymphopoiesis | |
| Lund | The regulation and expression of mouse mammary tumor virus genes and gene products in B lymphocytes |