ES2210260T3 - Metodo de marcado de celulas eucarioticas empleando como marcador un receptor de superficie celular. - Google Patents

Metodo de marcado de celulas eucarioticas empleando como marcador un receptor de superficie celular.

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ES2210260T3 ES94926187T ES94926187T ES2210260T3 ES 2210260 T3 ES2210260 T3 ES 2210260T3 ES 94926187 T ES94926187 T ES 94926187T ES 94926187 T ES94926187 T ES 94926187T ES 2210260 T3 ES2210260 T3 ES 2210260T3
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Abstract

UN METODO DE MARCAR UNA CELULA EUCARIOTICA (MAMIFERO) MEDIANTE LA EXPRESION EN ESTA CELULA DE UN ACIDO NUCLEICO, DICHO ACIDO NUCLEICO CODIFICANDO UN RECEPTOR DE SUPERFICIE CELULAR, Y POSTERIORMENTE, PRESENTANDO DICHO RECEPTOR A LA SUPERFICIE CELULAR, CARACTERIZADO POR LA UTILIZACION DE UN ACIDO NUCLEICO EN EL QUE LA REGION QUE CODIFICA EL DOMINIO INTRACELULAR DEL RECEPTOR HA SIDO COMPLETA O PARCIALMENTE SUPRIMIDO O MODIFICADO DE TAL FORMA QUE EL RECEPTOR PRESENTADO EN LA SUPERFICIE NO PUEDE, DESPUES DE ENLAZARSE A SU COMPAÑERO DE ENLACE, EFECTUAR NINGUNA TRANSDUCCION DE SEÑAL, ES EFECTIVA Y UTILIZABLE EN TERAPIA GENICA.

Description

Método de marcado de células eucarióticas empleando como marcador un receptor de superficie celular.
La invención se refiere a un método de marcado de células eucarióticas (de mamíferos) empleando como marcador seleccionable un receptor de superficie celular con un dominio intracelular modificado.
La identificación de las células en las que se ha introducido con éxito una secuencia de DNA es una etapa esencial de la tecnología del DNA recombinante. Dado que la secuencia de DNA a introducir no necesariamente conducirá a un fenotipo que pueda seleccionarse de modo sencillo, habitualmente se introduce una secuencia adicional de DNA que codifica a un fenotipo seleccionable. El número de estos genes marcadores seleccionables sigue siendo muy reducido en el ámbito de la tecnología del DNA recombinante de las células eucarióticas. La mayor parte de estos genes marcadores disponibles, por ejemplo la timidina-cinasa del herpes simplex virus del tipo I (Wigler y col., Cell 1, 223, 1977) o la hipoxantina-fosforribosil-transferasa (Jolly y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 80, 477, 1983) corresponden a genes o son muy afines a genes que por su constitución se expresan en la mayoría de células normales o son idénticos a dichos genes.
Por lo tanto, estos genes marcadores solamente pueden utilizarse en células mutantes especiales, que no se expresan en los genes correspondientes. Por otro lado, un gen marcador preferido no debería expresarse en la mayoría de células de mamíferos o por lo menos no debería expresarse en ciertos tejidos y tipos de células, de modo que puedan utilizarse como genes marcadores seleccionables en la tecnología del DNA recombinante que trabaja con estas células.
Pawlink y col. han descrito el uso del antígeno de superficie celular CD24 como marcador seleccionable dominante en la transferencia genética mediada por retrovirus (Journal of Cellular Biochemistry, suplemento 17E, página 203, resumen S210). Con este marcador se pueden marcar fibroblastos NIH-3T3, células BAF-3 pre-B y células de médula ósea murina infectadas con retrovirus y las células marcadas se detectan por análisis de clasificación de células activadas por fluorescencia. Sin embargo, el antígeno de superficie celular CD24 normalmente se expresa en algunas células de mamíferos, por lo cual el uso de este marcado está limitado por la dificultad de diferenciar entre células que normalmente expresan el antígeno de superficie celular CD24 y células marcadas con este marcador.
Además, se ha encontrado que el antígeno de superficie celular CD24 después de la expresión heteróloga se presenta en la superficie de las células solamente en pequeña extensión.
En la solicitud de patente europea EP-0 455 460 se describe la proteína tirosina-cinasa negativa trkB, que es un receptor de superficie celular al que le falta el dominio catalítico tirosina-cinasa y por ello no dispara señal de trkB en las células. En la EP-0 455 460 se describe el aislamiento y la identificación de este receptor.
Es un objeto de la presente invención un proceso de marcado de una célula eucariótica (de mamífero) por expresión de un ácido nucleico en esta célula, dicho ácido nucleico codifica un receptor de superficie celular y por presentación del receptor en la superficie de la célula, el proceso está caracterizado por el uso de un ácido nucleico en el que la región que codifica el dominio intracelular del receptor ha sufrido una deleción total o parcial o se ha modificado de manera que el receptor presentado en la superficie no puede realizar ninguna transducción de señal después de haberse unido a su complemento de unión.
El dominio intracelular ha sufrido con preferencia una deleción completa o bien los nucleótidos individuales están modificados.
Se utiliza con preferencia el ácido nucleico que codifica al receptor NGF, CD24 o LDL.
La secuencia del receptor NGF humano, que en lo sucesivo se mencionará como "receptor del factor de crecimiento nervioso de baja afinidad, LNGFR", ha sido descrita por D. Johnson, Cell 47, 545-554, 1986. Se utiliza con preferencia un ácido nucleico del que se ha eliminado (deleción) la región de DNA que codifica los aminoácidos 245 (empezando por el nucleótido 930) del extremo C (ver SEQ ID NO: 1).
En la SEQ ID NO: 1, el dominio extracelular se codifica por parte de los nucleótidos 114 (ATG) - 863, el dominio transmembrana se codifica por los nucleótidos 864 - 929 y el dominio intracelular se codifica por los nucleótidos
930 - 1394 (Reddy y col., Molecular Brain Research 8, 137-141, 1990).
Para la deleción del dominio intracelular es posible efectuar la deleción de un dominio completo o solamente una parte funcional, de modo que el receptor presentado en la superficie no puede efectuar ninguna transducción de señal después de haberse unido a su complemento de unión. Por ejemplo, es posible realizar la deleción de los nucleótidos 943 - 1512 por restricción con PvuIII y SstI.
El ácido nucleico puede introducirse en la célula diana, por ejemplo mediante un vector vírico (con preferencia un retrovirus) por lipofección o electroporación.
Otro objeto de la invención es un DNA que codifica un LNGFR modificado y que se ilustra en la SEQ ID NO: 1 así como una célula eucariótica que contenga un ácido nucleico de este tipo.
Un ácido nucleico de este tipo puede utilizarse para expresar un receptor de superficie celular modificado de este modo y para presentar el receptor en la superficie celular de tal manera que el receptor pueda utilizarse como marcador seleccionable para células eurocarióticas transfectadas.
El DNA que codifica al receptor o un derivado del mismo se introduce en un vector eucariótico de expresión por métodos ya conocidos de la técnica. El experto en la materia ya conoce los vectores idóneos de expresión, empleándose con preferencia los vectores retrovíricos. Para la transferencia del DNA receptor pueden utilizarse también otros vectores víricos con arreglo al estado de la técnica (p. ej. herpesvirus, adenovirus, virus vacunales). Se ha observado en un cierto tipo de retrovirus, los llamados vectores de doble copia (Yu y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 83, 3194-3198, 1986) una frecuencia elevada de provirus reordenados y una concentración significativamente baja. Son preferidos los virus de vector XSN (Bio-Techniques 7, 980-990, 1989).
Los vectores de expresión eucarióticos recombinantes se introducen seguidamente en una célula hospedante eucariótica, ya sea sola para un protocolo de marcado de genes, ya sea combinada con otro DNA que se quiera transducir, pero que no tiene fenotipo seleccionable. La introducción del DNA en la célula hospedante se realiza por métodos de infección víricano víricos (p. ej. electroporación, transferencia de liposomas, precipitación de calcio). Las células que contienen DNA exógeno pueden reconocerse por su capacidad de producir un receptor en niveles elevados. Las células eucarióticas recombinantes que controlan un DNA según la presente invención pueden detectarse incluso con mayor facilidad por su capacidad de producir un derivado del receptor.
El marcador receptor de las células eucarióticas obtenido del modo descrito anteriormente permite una selección y separación fáciles de tales células empleando anticuerpos que se fijan sobre el receptor empleado. Estos anticuerpos son conocidos en la técnica y se han descrito por ejemplo en A. Ross y col. (Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 6681-6685, 1984; EP-A-0 202 055). Además los anticuerpos de los receptores pueden obtenerse por métodos conocidos en la técnica por inmunización de un animal con un proteína codificada por el DNA según la presente invención y por aislamiento de los anticuerpos del suero de los animales inmunizados o por fusión de células de bazo de los animales inmunizados con células inmortales, por ejemplo una línea celular de mieloma murino, para obtener anticuerpos monoclonales. Estos anticuerpos se marcan por métodos ya conocidos de la técnica (descritos por ejemplo en J.H. Peters, Monoklonale Antikörper, editorial Springer, 2ª edición, 1988, páginas de 285 a 315). Los marcados idóneos pueden ser enzimas, colorantes fluorescentes o quimioluminiscentes.
Es posible aislar las células marcadas por inmunoselección introduciendo un ácido nucleico de este tipo en una célula eucariótica. A tal fin se identifican las células transfectadas, se seleccionan con un anticuerpo marcado que se fije específicamente al receptor empleado según la invención y se aíslan después de escindirse del complejo
anticuerpo/célula.
Si se emplea un anticuerpo inmovilizado en lugar de un anticuerpo marcado, las células transfectadas pueden seleccionarse. Además, la fase sólida con el anticuerpo inmovilizado contra el receptor se utiliza como matriz (estructura) en la cromatografía de afinidad. Una vez separadas las células no transfectadas que no expresan al receptor, se cultivan las células fijadas por ejemplo y se expanden en cápsulas petri durante una noche.
Los procesos descritos anteriormente son especialmente importantes como herramientas de diagnóstico para identificar células introducidas en un organismo de mamífero mediante protocolos de terapia genética. Para algunas aplicaciones, por ejemplo el trasplante de médula ósea, tendrá valor diagnóstico la diferenciación entre células originadas a partir del trasplante de médula ósea y células derivadas de las células residuales del hospedante. En este caso se trasplantan células de médula ósea que contienen DNA que codifica al receptor para dotar a estas células de un marcador de superficie celular. Se trasplantarán con preferencia células progenitoras o germinales (stem cells), que se han enriquecido con arreglo al estado de la técnica (p. ej. anticuerpos anti-CD34 inmovilizados), que contienen los genes según la invención. Después del trasplante se pueden diferenciar las células, en especial las células tumorales eventualmente surgidas, en su condición de derivadas de las células trasplantadas o en su condición de células residuales del organismo hospedante.
Otra forma de ejecución de la presente invención es por tanto el uso del proceso de inmunoselección de células transfectadas según la presente invención para la identificación de diagnóstico de células que se han marcado mediante la introducción de un DNA que codifique al receptor, en especial de un DNA según la presente invención.
La principal aplicación del marcado de células de sangre/células de médula ósea con los receptores modificados descritos será el seguimiento (monitoring) de las células de trasplantes autólogos y también de trasplantes alogénicos. En el caso de leucemias y linfomas a menudo es necesario tratar a los pacientes con dosis subletales de medicamentos citostáticos o con dosis equivalentes de radiación o con combinaciones de ambas. Para restablecer el funcionamiento de la médula ósea se puede explantar médula ósea autóloga antes del tratamiento para reimplantarla a los pacientes o bien se puede implantar médula alogénica de un dador de HLA similar.
En el caso de trasplante de médula ósea autóloga, la contaminación de células tumorales en el material reimplantado puede conducir a una recidiva tumoral. Se emplean métodos de purga para purificar la médula de células tumorales (células tumorales clonogénicas), pero estas técnicas no son fiables actualmente. En el caso de una recaída no es posible obviamente distinguir entre células tumorales potencialmente contaminantes y una recaída provocada por células residuales después del tratamiento. En el caso de trasplantes de médula ósea alogénica, el principal problema es el rechazo de la médula alogénica. Se han descrito las técnicas de purga en Areman E.M. y col.: Bone Marrow and Stem Cell Processing: A Manual of Current Techniques, F.A. Davies Co., Philadelphia (1992), que se incorpora como referencia a esta descripción.
La invención se refiere además a un método de obtención de una preparación de células hematopoyéticas (es decir, células progenitoras de médula ósea o de sangre periférica movilizada y/o células germinales), en el que dichas células se marcan con un receptor de superficie celular y en el que dicha preparación celular está sustancialmente exenta de células tumorales clonogénicas, mediante purga empleando agentes citotóxicos o radiación, transduciendo dichas células con un ácido nucleico que codifica a un receptor de superficie celular y, con preferencia, en el que la región que codifica el dominio intracelular haya sufrido una deleción completa o parcial o se haya modificado de tal manera que el dominio fundamentalmente ya no pueda realizar ninguna transducción de señal y separando dichas células transducidas de las células no transducidas. Esta separación se realiza con preferencia por incubación de dichas células con un anticuerpo contra el receptor inmovilizado antes o después de la incubación, por separación de las células inmovilizadas por el anticuerpo de las células no fijadas y por aislamiento de la preparación de células hematopoyéticas por rotura de la unión de anticuerpo con receptor.
Si después de un trasplante autólogo se marcan las células trasplantadas con un gen y por consiguiente el producto genético derivado no es común a estas células, entonces será posible hacer el seguimiento de estas células directamente después del trasplante y, en el caso de una recaída, se podrá diferenciar entre las células tumorales derivadas del material trasplantado y las células tumorales residuales. Estos conocimientos conducirán a una definición muy temprana del tratamiento ulterior basándose en la causa de la recaída. Aparte de esta finalidad de diagnóstico, el marcado con genes en trasplantes autológicos permitirá además el seguimiento y la comparación de la eficacia de los distintos métodos de purga en grupos de pacientes relativamente pequeños.
En el trasplante autólogo y, sobre todo, el alogénico, el principal campo de aplicación será el seguimiento del rechazo de las células trasplantadas.
El protocolo clínico tendrá las etapas siguientes:
a) Explantación de células del paciente.
b) Purga de las células explantadas con arreglo a la técnica conocida.
c) Transducción de células del paciente con un vector que contiene el gen receptor modificado con arreglo a esta invención.
d) Opcionalmente, expansión de las células del paciente en condiciones selectivas, p. ej. con G418 empleando la expresión del gen de resistencia a la neomicina codificado sobre el vector que contiene el gen receptor modificado.
e) Inmunoselección de las células marcadas que expresan el gen modificado y presentan al receptor en la superficie de las células.
f) Reimplante en el paciente de las células enriquecidas y marcadas.
g) Análisis de muestras de sangre/médula del paciente para el seguimiento de los genes marcadores mediante ensayos FACS o técnicas ELISA.
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Diagrama de flujo esquemático del protocolo de marcado genético
1
La invención se refiere además a un método de inmunoselección de células transfectadas que consiste en la introducción en dichas células de un ácido nucleico que codifica un receptor de superficie celular en el que la región que codifica el dominio intracelular del receptor ha sufrido una deleción completa o parcial o se ha modificado de manera que el receptor presentado en la superficie, después de unirse a su complemento de unión, no puede realizar ninguna transducción de señal, en identificar las células transfectadas por incubación de dichas células con un anticuerpo marcado que se fija específicamente a dicho receptor y en recuperar las células por destrucción del complejo anticuerpo/célula.
La invención se refiere además a un método de inmunoseparación de células transfectadas que consiste en introducir en dichas células un DNA que codifica a un receptor de superficie celular, en el que la región que codifica el dominio intracelular del receptor ha sufrido una deleción total o parcial o se ha modificado de tal manera que el receptor presentado en la superficie, una vez fijado sobre su complemento de unión, no puede efectuar ninguna transducción de señal, en incubar las células con un anticuerpo contra el receptor inmovilizado antes o después de la incubación, en separar las células inmovilizadas por el anticuerpo de las no fijadas y en aislar las células por destrucción de la unión anticuerpo-receptor.
Un gran número de estudios han demostrado que los vectores retrovíricos son una herramienta eficaz para transferir DNA exógeno a células somáticas^{1}. En el sistema hematopoyético del ratón se han logrado la transferencia y la expresión genéticas eficaces tanto en células progenitoras como en células germinales pluripotentes, tanto "in vitro" como "in vivo". Se han obtenido niveles más bajos de transferencia genética en progenitores hematopoyéticos caninos y humanos en cultivos en los que se han constatado niveles significativos de expresión de genes transducidos (recopilación en ^{2}). La transferencia genética mediada por retrovirus se utiliza habitualmente en protocolos de terapia genética para el tratamiento de enfermedades hereditarias o adquiridas, por ejemplo la deficiencia de adenosina-desaminasa (ADA^{-}), la inmunodeficiencia combinada grave (SCID) y el cáncer avanzado (recopilación en ^{3}). Aunque se ha dedicado un gran esfuerzo a optimizar los procedimientos de purificación de células germinales hematopoyéticas humanas y en hallar condiciones eficaces para la transferencia y la expresión genéticas, los linfocitos de la sangre periférica (PBL) se continúan considerando como el vehículo más seguro de transporte celular para la terapia genética humana.
Se ha diseñado y utilizado un gran número de vectores retrovíricos para la transferencia genética a células hematopoyéticas humanas, todos ellos basados en la estructura del virus de la leucemia murina de Moloney (MoMLV). El uso de diferentes promotores que dirigen la expresión del gen de interés y la posición de las secuencias con respecto a la unidad de transcripción vírica son algunos de los parámetros que hay que tener en cuenta para generar diseños vectoriales alternativos^{4-5-6}. Algunos de estos vectores se emplean para transducir células linfoides humanas en diversas condiciones. Los linfocitos infiltrantes de tumores humanos (TIL) se transducen con el vector retrovírico N2, que lleva un gen de resistencia a la neomicina-fosfotransferasa (Neo), y conservan las características fenotípicas y funcionales normales "in vitro"^{7-8}. Se recuperan las células transducidas de los sitios tumorales hasta después de 64 días de la administración celular "in vivo" a pacientes de melanoma^{9}. La transferencia genética se logra en los dos subconjuntos de células T humanas CD4^{+} y CD8^{+}, derivadas de los TIL y PBL^{10}. Un vector retrovírico para la expresión de un gen funcional CD18, dirigido por un promotor LTR vírico, transduce con éxito linfocitos de pacientes afectados por la deficiencia de adhesión de leucocitos (LAD) y ha permitido la corrección de la LAD "in vitro". La expresión de un ADA humano dirigida por un promotor de ADA en un vector de doble copia^{6} en los PBL obtenidos de pacientes afectados por ADA^{-} SCID conduce también a la corrección de la deficiencia enzimática, permitiendo el restablecimiento de las funciones inmunes^{12-13}. Finalmente, los montajes retrovíricos de superexpresión de secuencias de RNA estructural de VIH (elemento de respuesta transactiva, TAR, y elemento de respuesta Rev, RRE), dirigidos por un promotor de RNA-polimerasa III, se introducen con éxito en una línea celular de linfoide T, induciendo una inmunización intracelular parcial contra el VIH^{14-15}. Aunque en todos estos casos los vectores retrovíricos se constata que transducen células linfoides humanas y expresan los genes transferidos, todavía no se ha hecho ningún intento de comparar directamente los diferentes diseños vectoriales en cuanto a su estabilidad, eficacia de transferencia genética y expresión de los genes transducidos.
El receptor del factor de crecimiento nervioso de baja afinidad (LNGFR) humano no se expresa en la mayoría de las células hematopoyéticas humanas, por lo cual permite el análisis cuantitativo de la expresión de los genes transducidos por cada vector y por cada célula diana mediante análisis de inmunofluorescencia, incluso a nivel de células individuales. Con cuatro montajes ("constructos") vectoriales se transducen diferentes líneas celulares hematopoyéticas humanas de origen mieloides y linfoide, así como células mononucleares normales de la sangre periférica (PBMC) y se analizan en cuanto a la estabilidad y al número de integraciones víricas y expresión de LNGFR, tanto a nivel de RNA como de proteína. Se llevan a cabo análisis FACS de líneas de células T transducidas y de clones para la coexpresión del LNGFR y marcadores de superficie celular para estudiar la expresión genética en la subpoblación específica de células T. En condiciones apropiadas de infección de gran eficacia, todos los vectores retrovíricos pueden transducir una población de células T del repertorio inmune normal. Por lo tanto, según la invención el LNGFR (en su forma truncada sin el dominio intracelular o en su forma (fundamentalmente) sin modificar) es un marcador preferido para el marcado celular, mediante la transfección de las células con un ácido nucleico que codifique al LNGFR. Para la transfección se emplean por ejemplo vectores del tipo retrovírico o también DNA desnudo, p. ej. con liposomas como agente de transfección. El marcador LNGFR se emplea con preferencia para marcar células del sistema hematopoyético, en especial células germinales hematopoyéticas. Es preferido en especial su utilización para el marcado en terapia genética y en métodos de purga.
La transferencia genética eficiente con vectores retrovíricos a células germinales hematopoyéticas continúa siendo el objetivo prioritario de la terapia genética de muchos trastornos congénitos o adquiridos. En calidad de vehículos, los vectores retrovíricos son habitualmente la herramienta más segura y eficaz para transferir y expresar el DNA exógeno en células hemato-linfopoyéticas humanas. Actualmente, todos los protocolos clínicos aprobados para la transferencia genética a células de médula o de sangre se basan en vectores retrovíricos^{1,3}. Aunque la célula diana ideal esté representada por una célula germinal pluripotente, no existe una evidencia concluyente acerca de la capacidad de los vectores retrovíricos para transducir tales células con una eficacia adecuada y mantener una expresión genética estable en su progenie. Los resultados de los protocolos clínicos en marcha, basados en la transferencia genética de médula ósea, pueden ayudar a esclarecer estos problemas^{1,3,30}.
Obviamente, la transferencia genética puede realizarse con mayor facilidad en linfocitos de sangre periférica, una alternativa potencial frente a las células de médula ósea, por lo menos en cuanto a los trastornos congénitos y adquiridos del sistema inmune. Sin embargo es necesario para tal fin definir la proporción de PBL que tienen que transducirse en orden de representar la totalidad del repertorio inmune y si este podrá ser mantenido estable "in vivo", ya que los dos son requisitos previos para que un procedimiento de transferencia genética sea terapéuticamente relevante. A tal fin son factores cruciales la eficacia de la transferencia genética y el diseño del vector, que afecta tanto a la persistencia como a los niveles de expresión genética.
La eficacia global de la transferencia genética a los PBL humanos depende estrictamente del protocolo de infección. La expansión celular limitada de los linfocitos por una activación a corto plazo "in vitro" seguida por la transferencia genética a los PBL por exposición a los líquidos sobrenadantes de las células productoras dan lugar a proporción limitada de células resistentes a G418 (aproximadamente el 1% de cada ciclo de infección), con una variabilidad adicional inducida por la concentración de los líquidos sobrenadantes que contienen los vectores. La eficiencia de la transferencia genética puede incrementarse por una mayor expansión de las células diana "in vitro".
El análisis del repertorio del uso de V\beta en la población de PBL, después de tres ciclos de infección con PBL por líquidos sobrenadantes que contienen vectores, seguidos por la selección de las células transducidas por G418, da lugar a un repertorio intacto, si se compara con la población original de control de linfocitos sin transducir/sin seleccionar. Estos datos indican que la expansión limitada de células diana y la utilización de líquidos sobrenadantes que contienen vectores dan lugar a una transferencia genética adecuada, con independencia de la frecuencia relativamente baja de dicha transferencia genética, por lo menos cuando los líquidos sobrenadantes que contienen vectores tienen una buena concentración vírica (>5x10^{5}). Sin embargo, las concentraciones víricas bajas en los líquidos sobrenadantes que contienen vectores dan lugar a repertorios V\beta limitados. Esto se confirma con un análisis Southern Blot del reordenamiento de la cadena de TCR-\beta que presenta modelos oligoclonales de población transducida/seleccionada. Esta limitación se circunscribe al co-cultivo de PBL con células productoras de vectores irradiadas. Con independencia de la concentración vírica, este procedimiento de transferencia genética es mucho más eficaz, por lo menos en un orden de magnitud. Teniendo en cuenta la gran eficacia de la transferencia genética en caso de co-cultivo y la expresión de LNGFR sobre linfocitos transducidos, se elabora un protocolo sencillo de co-cultivo y de inmunoselección que permite la producción de células homogéneamente transducidas.
Los protocolos de co-cultivo todavía se consideran inseguros para el uso clínico, por ello se diseñan condiciones de co-cultivo en las que las células productoras de vectores y los PBL se mantienen separados por una membrana porosa que permite el paso de los virus, al tiempo que evita el contacto de célula con célula. Este enfoque tiene algunas ventajas si se compara con la infección por líquido sobrenadante.
El análisis de doble fluorescencia de las células T seleccionadas con G418 para la co-expresión del LNGFR y distintos marcadores de superficie de células T presentan una susceptibilidad similar a todas las subpoblaciones ensayadas con una eficacia aparentemente igual de la transferencia genética. Además hemos obtenido un evidencia esporádica, aunque concluyente, de la transferencia genética a células CD4^{+}/CD8^{+} inmaduras. Hemos demostrado anteriormente la transferencia genética mediada por vectores retrovíricos a progenitores de células T antes del reordenamiento del TCR^{13}. Los datos de la invención demuestran que la infección retrovírica de los PBMC permite la transferencia genética a progenitores en circulación con una frecuencia baja pero detectable. Puede haber una ventaja adicional en los protocolos de transferencia genética que trabajan con cultivo "in vitro" de corto duración y en la expansión limitada de los linfocitos diana.
Se analiza además el impacto del diseño vectorial sobre la eficacia de la transferencia genética y la expresión. En los diseños vectoriales empleados, el gen informante (reporter gen) se coloca alternativamente dentro de la unidad de transcripción retrovírica bajo el control de promotores internos SV40 o HSV-TK (vectores NSV-N y NTK-N, respectivamente), debajo el LTR del virus MoMLV (LNSN/SFCM) o fuera de la unidad de transcripción retrovírica bajo el control del promotor ADA humano (el vector de "doble copia" DCN). El uso de un receptor según la invención en calidad de gen informante (reporter gen) ha permitido estudiar los niveles de expresión genética en diferentes subpoblaciones de PBL, con resolución de célula individual.
Las concentraciones víricas obtenidas de distintos vectores en los clones productores seleccionados son comparables, excepto las células productoras de DCN que de modo coherente dan concentraciones cinco veces más bajas que las de uno de las tres vectores restantes, lo cual sugiere que la secuencia extra del LTR vírico puede reducir la eficacia de la transducción, probablemente por interferir con el proceso de transcripción inversa/integración. Esto se refleja también en la tendencia relativamente alta del DCN a integrarse en forma de provirus reordenado, lo cual reduce todavía más la eficacia global de la transferencia genética que puede obtenerse con este tipo de vector. Se observa un reordenamiento de provirus integrados en frecuencias despreciables para los tres vectores restantes.
Los niveles de expresión genética indican que los vectores basados en las unidades de transcripción interna son los menos eficaces en términos tanto de acumulación de mRNA como de expresión de proteína. La única excepción es el nivel muy alto de transcritos generados por el promotor SV-40 dentro de dos vectores distintos (NSV-N y LNSN/SFCM) en la línea RIM de células B infectadas con EBV. Esto podría deberse a la interacción de las proteínas que trans-activan el EBV con el ampliador SV-40. Por el contrario, los vectores basados en el LTR de MoMLV y el promotor ADA humano de la expresión de los genes mencionados trabajan con gran eficacia en todas las líneas hematopoyéticas. Los análisis de las líneas de células T y de los clones dieron básicamente los mismos resultados. Tanto los vectores LNSN como los DCN son muy efectivos en dirigir altos niveles de expresión genética en todas las subpoblaciones de células T, incluidos los progenitores inmaduros y mantienen estos niveles invariables a lo largo de un elevado número de pasajes (subcultivos).
En conclusión, el vector retrovírico basado en LTR es probablemente el más fiable y eficaz para la transferencia y expresión genéticas en PBL humanos, mientras que el diseño DC, aunque sea muy bueno en cuanto a la expresión genética, da lugar en general a una baja eficacia de transferencia genética, debido tanto a la baja concentración como a la tendencia al reordenamiento genómico. Sin embargo este tipo de montaje (constructo) puede ser la mejor elección de vector cuando el requisito obligado es una expresión genética específica de tejido, inducible e por lo demás independiente del LTR, o en otros casas en tejidos en los que pudiera ocurrir una inactivación por LTR. Aunque no hemos abordado este tema en el presente estudio, las células germinales (stem cells) hematopoyéticas humanas podrían contarse entre estos tejidos, por analogía a lo observado en el sistema hematopoyético murino.
La utilización de un codificador genético para las molécula de superficie celular LNGFR o de un codificador para una molécula de superficie celular en el que el dominio intracelular del receptor haya sufrido una deleción completa o parcial o se haya modificado de modo que el receptor presentado en la superficie, una vez fijado sobre su complemento de unión, no pueda efectuar ninguna transducción de señal, para el marcado celular mediado por vectores retrovíricos representa claramente una ventaja importante con respecto a los vectores empleados en los anteriores ensayos de marcado genético que utilizan un gen marcador, normalmente el gen NeoR, no expresado en la membrana celular. Este tipo de vector podría constituir una ventaja potencial para los estudios preclínicos y clínicos "in vivo" de marcado celular.
Breve descripción de las figuras
La figura 1: vectores retrovíricos para la expresión de LNGFR (A, C, E, G).
Se presentan mapas esquemáticos de genomas províricos integrados NSV-N (A), NTK-N (C), LNSN (E) y DCN (G), indicando los promotores internos SV40 (SV), HSV-TK (TK) y ADA humano (ADAp). Las casillas negras indican secuencias de LTR. Se indican los sitios de restricción XBa I y Hind III (H). En los mapas se representan las especies de RNA que se originan a partir de cada vector mediante flechas numeradas.
La figura 2: análisis "Southern Blot" de la integración de los cuatro vectores retrovíricos (A-D) en el digesto (digest) Xba I del DNA de líneas celulares K562 (1), KG 1 (2), Raji (3), Daudi (4), RIM (5), MOLT-4 (6) y J.M. (7), hibridados con una sonda Neo. Se indican las bandas correspondientes a provirus integrados intactos, junto con sus pesos moleculares (en kb). Las bandas de reordenamiento se indican mediante flechas.
Las figuras 3 y 4: diferentes diseños vectoriales. (L: secuencia líder; EXTR: dominio extracelular; T: dominio transmembrana; INTR: dominio intracelular; casillas negras: LTR; \Psi = señal de empaquetamiento.)
Ejemplos Ejemplo 1 Vectores retrovíricos
Se generan diferentes vectores retrovíricos para la expresión del LNGFR en calidad de gen informante (reporter gen), empleando un fragmento Sst I de 1,5 Kb de codificación completa del cDNA de LNGFR^{16} humano o un cDNA de LNGFR truncado sin el dominio intracelular (p.ej. por restricción con PvuII y SstI). Los vectores NSV-N y NTK-N se obtienen por clonación del cDNA de LNGFR en los sitios únicos Hind III y Bgl II de los vectores NSV y NTK, respectivamente. El vector NSV deriva del vector N2^{17} original por inserción del fragmento Kpn I/Hind III de 0,4 kb que contiene el primitivo promotor ampliador SV40 y se origina la replicación en el único sitio de clonación Xho I. El vector NTK deriva también del N2 por inserción del promotor de timidina-cinasa (TK) del herpes simplex virus (HSV) de 852 bp.
El vector LNSN se construye por inserción del cDNA de LNGFR en el sitio Hpa I del vector LXSN^{5}.
En el vector DCN (LNGFR de doble copia) se clona el cDNA de LNGFR bajo el control del fragmento Ssp I/Nco I de 0,8 kb del promotor adenosina-desaminasa (ADA)^{18} humana en los sitios Bgl II/Sna Bl del vector retrovírico N2A/segmento multienlace (polylinker)^{6}.
De modo muy similar, en los vectores NSV-N, NTK-N, LNSN y DCN en lugar del cDNA de LNGFR es posible emplear un cDNA de LNGFR truncado (\DeltaLNGFR).
En las figuras 3 y 4 se presentan diferentes diseños (constructs) vectoriales con arreglo a la invención.
Los DNA vectoriales se convierten en los virus correspondientes por un protocolo de transinfección. En resumen, el DNA del vector de transfecta en la línea celular^{19} de empaquetamiento ecotrópico \Psi2 por co-precipitación^{20} estándar de fosfato cálcico 48 horas después de la transfección, se recogen los líquidos sobrenadantes que contienen \Psi2 y se utilizan para infectar las líneas celulares de empaquetamiento anfotrópico PA317^{21} durante 16 horas en presencia de 8 \mug/ml de polibreno. Se seleccionan las células PA317 infectadas en DMEM (GIBCO, Grand Island, NY) suplementado con un 10% de FCS (Hyclone, Logan, UT) y que contiene 0,8 mg/ml de G418 (GIBCO) y se utiliza para generar líquidos sobrenadantes que contienen virus, exentos de auxiliares (helper), cuyas concentraciones se sitúa entre 10^{4} y 5x10^{5} cfu/ml. Todos los vectores contienen el gen NeoR que codifica la neomicina-fosfotransferasa que confiere resistencia "in vitro" al análogo G418 de la neomicina.
Infección de líneas celulares hematopoyéticas
Todas las líneas celulares descritas en este estudio, excepto la RIM y la J.M., se obtienen de la ATCC y se cultivan en medio RPMI 1640 (GIBCO) suplementado con un 10% de FCS. La K562 y la KG1 son líneas celulares mieloides derivadas de leucemias mielógenas crónicas y agudas, respectivamente; la Raji y la Daudi derivan de dos linfomas de Burkitt; la MOLT-4 se considera una célula T estable de leucemia (CD8^{+}); la RIM es una línea celular linfoblastoide transformada con EBV; la J.M. es una línea celular linfoblastoide T CD4^{+}/CD8^{+}; la A875 es una línea celular de melanoma humano que expresa \sim 10^{6} LNGFR/célula.
Se infectan durante 16 horas 5x10^{5} células diana con líquidos sobrenadantes víricos sin diluir que contienen 8 \mug/ml de polibreno, se cultivan durante 24 horas más en medio completo y después se selecciona en presencia de la dosis determinada previamente de G418 (de 0,5 a 1,5 mg/ml). Los análisis posteriores se realizan en cultivos a granel de células seleccionadas con G418.
Infección de PBMC humanas
Se obtienen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de donantes sanos por separación de gradiente Ficoll-Hypaque (Pharmacia, Uppsala, Suecia) y se cultivan durante 72 horas con estimulación de fitohemaglutinina (PHA) e interleucina-2 recombinante humana (hu-rIL2) (2 \mug/ml de PHA purificada, Welcome Labs., Dartford, GB; 100 U/ml de hu-rIL2, Roche, Nutley, NJ). La infección vírica se lleva a cabo por exposición de los PBL estimulados a un stock vírico exento de células durante 6 horas en presencia de polibreno (8 \mug/ml). Pasadas 48 horas de la infección se seleccionan los PBL en medio RPMI 1640 suplementado con L-glutamina 2 mM, 1% de aminoácidos no esenciales, 1% de piruvato Na, 5% de suero humano (HS) y 100 U/ml de hu-rIL2 (medio completo), que contiene 0,4 mg/ml de G418. La densidad celular se mantiene constante (5x10^{5} células/ml) durante 2 semanas de la selección con G418. Los linfocitos T humanos, transducidos con retrovirus, se clonan también en placas Terasaki en diferentes concentraciones celulares (1-10^{3} células/hoyo) en medio completo que contiene 0,4 mg/ml de G418, en presencia de PBL humanos irradiados que actúan de células alimentadoras (feeder cells).
Con el fin de mejorar la eficacia de la infección retrovírica se co-cultivan los PBL humanos con células productoras de virus durante 48-72 horas en medio completo. El co-cultivo se lleva también a cabo en placas Transwell (Costar, Cambridge, MA) para impedir el contacto de célula con célula. Se siembran 3x10^{5} células productoras en los hoyos de la placa de acumulación de platos de 6 hoyos y se incuban a 37ºC durante una noche. Se añaden 5x10^{5} PBL estimulados en las placas Transwell y se cultivan durante 48-72 horas en presencia de 8 \mug/ml de polibreno.
Se analizan las células transducidas con retrovirus por citometría de flujo para determinar la expresión de receptor y se expanden para análisis posteriores.
Análisis de DNA
De las células se obtiene DNA de alto peso molecular por extracción estándar con fenol/cloroformo^{20}, se digiere por completo en 5 \mug de partes alícuotas con enzimas de restricción apropiadas (GIBCO-BRL), se somete a electroforesis en geles de agarosa al 0,8% en campo de 1,5 V/cm en tampón tris-acetato, se transfiere a una membrana de poliamida (Nylon) (Hybond-N, Amersham, Buckinghamshire, GB) por punción capilar Southern^{20} y se hibrida con 10^{7} dpm de una sonda marcada con P^{32}.
Análisis de DNA - "Southern Blot" Sondas
1) fragmento de pSV2-neo y
2) fragmento que contiene la región constante TCR-\beta
Las sondas de DNA son un fragmento Hind III/Sma de 1,2 Kb del pSV2-neo^{22} y el fragmento Hinc II-3' del clon de cDNA de YTJ-2 que contiene la región constante TCR-\beta humana^{23}. Se lavan los filtros en condiciones de gran estringencia y se exponen a películas Kodak X-AR 5 a -70ºC.
Análisis de RNA - "Northern Blot" Sondas
1) fragmento de pSV2-neo y
2) fragmento de cDNA de LNGFR
Se extrae el RNA celular total por la técnica del isotiocianato de guanidina^{24} y se selecciona su poly(A)^{+} por cromatografía a través de oligo(dT)celulosa^{20}. Se fraccionan por tamaño 5 \mug de poly(A)^{+}RNA a través de un gel de agarosa al 1% en formaldehído, se transfieren a una membrana de poliamida (nylon) por punción capilar Northern^{25} y se hibridan, se lavan y se exponen del modo descrito con ocasión del Southern Blot. Las sondas de DNA son un fragmento Hind III/Sma I de 1,2 Kb de pSV2-neo y el fragmento Sst I de 1,5 Kb del cDNA de LNGFR^{16}.
Fenotipo de superficie celular
Expresión del LNGFR con seguimiento mediante citometría de flujo empleando
1) LNGFR antihumano con marcador de fluoresceína y
2) Anticuerpos monoclonales (MAB) antihumanos conjugados con PE
Se hace el seguimiento de la expresión de superficie celular del LNGFR por citometría de flujo empleando un anticuerpo monoclonal LNGFR murino antihumano 20.4 (ATCC) mediante un método indirecto de marcado con fluorescencia. Se determina el fenotipo de superficie celular de las líneas de linfocitos T y de los clones mediante citometría de flujo empleando anticuerpos monoclonales (MAB) antihumanos CD4 conjugados con PE (T4), CD8 (T8), CD5, B4, CD25R, Leu7, CD34 (Coulter Immunology Hialeah, FL). En resumen, se tiñen 5x10^{5} células con 100 \mul de anticuerpos diluidos a 4ºC durante 30 min, se lavan dos veces con medio sin FCS y se vuelven a suspender en 0,5 ml de PBS para el análisis FACS o en 100 \mul de anticuerpo secundario conjugado con FITC y diluido. Los análisis de tinción doble se llevan a cabo mediante incubación secuencial de los anticuerpos conjugados con FITC y con PE.
Análisis del uso de la cadena TCR V\beta vía PCR
Se extrae RNA de PBL y líneas de células T empleando GTC^{26}, transcrito inversamente en el cDNA empleando oligo-dT y dG adicionado en cola^{27}, un veinteavo del DNA obtenido se somete a PCR empleando oligonucleótidos específicos^{28} de V\beta-C\beta y para anclar la PCR empleando un oligonucleótido específico de C\beta (5'-TGCTGACCCCACTGTCGACCTCCTTCCCATT-3') (SEQ ID NO: 2), del modo descrito en la ref. 27. Los ciclos de amplificación de la PCR se realizan a 94ºC durante 45'', a 57ºC durante 45'' y a 72ºC durante 1'. Se purifica el producto amplificado a través de gel y se clona en vector de plásmido "bluescript". Las colonias positivas de C\beta se replican sobre diferentes placas, se transfieren a filtros de nitrocelulosa y se hibridan con oligonucleótidos^{28,29} específicos de V\beta en las condiciones siguientes: 6 x SSC, 1% "blotto", 0,1% de SDS y EDTA 5 mM a 42ºC durante 3-6 horas, se lavan durante 1 h a la misma temperatura en 6 x SSC y se exponen durante 6-12 h a una película de rayos X a temperatura ambiente.
Resultados Generación de retrovirus recombinantes para la expresión del LNGFR
Se desarrollan diversos diseños (constructos) de vectores retrovíricos para la expresión del LNGFR que se utilizan para la generación de las líneas celulares productoras de virus. Los diseños NSV-N (fig. 1A) y NTK-N (fig. 1C) se basan en promotores internos, que dirigen el cDNA del LNGFR, es decir, el antiguo promotor SV40 y el promotor HSV-TK, respectivamente. En el vector LNSN (fig. 1E), el gen LNGFR se expresa desde el LTR vírico. En el diseño DCN (fig. 1G), el cDNA del LNGFR está controlado por el promotor ADA humano, dentro de la región U3 del 3'LTR. Los diseños SFCM contienen un gen LNGFR truncado, en el que ha sufrido deleción el dominio intracelular (\DeltaLNGFR). Después de la infección de las células diana, el gen transducido se duplica y se transfiere al 5'LTR^{6}, de este modo se genera un provirus que contiene dos copias del minigen ADA-LNGFR. Todos los vectores llevan el gen NeoR, ya sea bajo el control del LTR vírico (NSV-N, NTK-N y DCN), ya sea del antiguo promotor SV40 (LNSN y SFCM).
Los vectores pueden utilizarse para transducir el gen LNGFR (y el gen LNGFR truncado, respectivamente) a las líneas celulares hematopoyéticas humanas de diferentes linajes y a los PBL humanos y son capaces de:
1) transducir células diana humanas,
2) integrar y formar provirus intactos y
3) expresar el gen informante (reporter gen).
\newpage
La concentración vírica de las líneas celulares productoras anfotrópicas se sitúa entre 1x10^{4} y 5x10^{5} cfu/ml para el caso de NSV-N, NTK-N, LNSN y SFCM y entre 5x10^{3} y 1x10^{4} cfu/ml para el DCN.
Análisis molecular de la integración vírica en líneas celulares hematopoyéticas humanas
Para el rastreo (screening) inicial de diferentes vectores se utiliza un gran número de líneas celulares tumorales de origen hemato-linfopoyético en calidad de células diana de la transferencia genética. Se transducen dos líneas celulares mieloides (K562 y KG1), dos linfomas de Burkitt (Raji y Daudi), una línea celular linfoblastoide transformada con EBV (RIM) y dos líneas celulares linfoblastoides T (MOLT-4 y J.M.) con los cuatro vectores retrovíricos y se seleccionan en presencia de G418. Se lleva a cabo el análisis molecular de las integraciones retrovíricas por "Southern Blotting" para detectar el tamaño de los virus integrados y el número de copias (de 1 a 5 copias/célula). Se digieren los DNA genómicos con Xba I, que corta en los 5' y en los 3'LTR de todos los vectores (fig. 1), permitiendo la detección del tamaño de los provirus integrados y con Bgl II, que corta solamente los DNA genómicos, permitiendo estimar el número de sitios de integración. Los DNA digeridos con XBa I y con Bgl II se hibridan secuencialmente con sondas específicas de los genes NeoR y LNGFR.
La integración del vector NSV-N genera una banda simple Xba I del tamaño 5,1 kb esperado, correspondiente a un provirus intacto, en todas las líneas celulares seleccionadas con G418 (fig. 2A). En las células Raji se observa una banda adicional de menor tamaño, indicando la integración de un provirus reordenado (fig. 2A, carril 3).
De modo similar, la digestión con Xba I genera una banda única del tamaño de 5,4 kb esperado en los DNA de todas las líneas celulares NTK-N infectadas (fig. 2B). Una banda adicional, debida probablemente a la presencia de un provirus reordenado, se detecta solamente en la muestra RIM (fig. 2B, carril 5). Se observa una banda simple de 4,3 kb en todas las muestras transducidas con el vector LNSN y SFCM, sin evidencia de reordenamiento vírico (fig. 2C). Por el contrario, los modelos de integración vírica en DNA de células infectadas con DCN se caracterizan por reordenamientos frecuentes (fig. 2D). Todas las líneas celulares transducidas con DCN presentan una banda de 5,4 kb, correspondiente al provirus intacto, pero se detecta además una banda adicional de 3,2 kb en todas las líneas celulares menos una (KG1). La proporción relativa entre las dos bandas es variable en las muestras analizadas, situándose desde la predominancia del provirus intacto (MOLT-4, fig. 2D, carril 6) hasta la prevalencia del reordenado (Raji, fig. 2D, carril 3). Las infecciones repetidas con el mismo stock de retrovirus indican que la proporción entre provirus intactos y reordenados es un suceso aleatorio, no específico de las células.
Tal como se observa en las líneas celulares transducidas por todos los demás vectores, el modelo Bgl II pone de manifiesto que la infección con DCN genera una integración policlonal en todas las líneas celulares.
Con el fin de investigar la naturaleza y el mecanismo causante de la generación de provirus reordenados hemos realizado digestiones adicionales de DNA genómicos con Hind III, que corta dos veces en el minigen ADA-LNGFR, seguidas por la hibridación con la sonda de LNGFR. Los análisis comparativos de los modelos de restricción Xba I y XbaI/Hind III con las dos sondas indican que la banda de 3,2 kb corresponde a un provirus reordenado al que le falta el minigen ADA-LNGFR de ambos LTR. Los provirus defectuosos se detectan también en alta frecuencia durante la selección de las líneas celulares productoras de DCN. El clon empleado en todos nuestros ensayos alberga solamente provirus intactos, indicando que la generación de los provirus defectuosos tiene lugar durante la integración en las células diana y no se debe a defectos de la línea celular productora.
En resumen, la infección de todas las líneas celulares con NSV-N, NTK-N, LNSN y SFCM da lugar a poblaciones resistentes a G418 que llevan un número bajo de copias de la mayoría de provirus sin reordenar, mientras que la infección con el vector DCN genera un virus normalmente reordenado en alta frecuencia, derivado con gran probabilidad de la pérdida del minigen ADA-LNGFR del 3'LTR del vector retrovírico durante el proceso de integración. Este problema puede deberse al tamaño y a la naturaleza del gen insertado en el LTR vírico, no se observan limitaciones similares con otros diseños vectoriales de "doble copia", ver 12-14.
Expresión de LNGFR mediada por vector en líneas celulares hematopoyéticas humanas
Se evalúa la expresión de LNGFR transducida por diferentes vectores retrovíricos tanto a nivel de proteína como a nivel de mRNA. La expresión en superficie celular del LNGFR en líneas celulares seleccionadas con G418 se analiza cuantitativamente por citometría de flujo con anticuerpos monoclonales (MAB) anti-LNGFR. Se recogen los resultados en la tabla I. La mayoría de las líneas celulares transducidas con NSV-N y NTK-N presentan un nivel medio-bajo de LNGFR de superficie, expresado como fluorescencia media relativa (<100 unidades arbitrarias). Se observa una expresión elevada del LNGFR (202 u.a.) solamente en la línea celular RIM infectada con EBV y transducida por NSV-N. No se detecta expresión de LNGFR en la línea celular MOLT-4 transducida con NTK-N, a pesar de que no se detecta un reordenamiento del genoma provírico en el DNA genómico digerido con Xba I (fig. 2B, carril 6). La transferencia genética repetida con este vector a la misma línea celular dio resultados negativos en forma coherente.
Todas las líneas celulares transducidas con vectores retrovíricos LNSN y SFCM expresan el LNGFR en niveles medios-altos (50-200 u.a.) (tabla I).
TABLA I
2
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  ^{a}   \+ \begin{minipage}[t]{152mm} La expresión cuantitativa
del LNGFR se puntúa del modo siguiente: - indica 0 unidades
arbitrarias (u.a.) de intensidad de fluorescencia media relativa; +
indica 0-50 u.a.; ++ indica 50-100
u.a.; +++ indica 100-200 u.a. El valor medio
relativo de la línea celular de melanoma A875, que expresa  \sim 
10 ^{6}  receptores/célula, es de 190 u.a. \end{minipage} \cr
 ^{b}  \+ \begin{minipage}[t]{152mm}Los perfiles FACS de la
línea celular K562, Daudi, RIM y J.M. son bifásicos; la puntuación
se refiere solamente al pico positivo (ver
resultados).\end{minipage} \cr  ^{c}  \+los datos de los
vectores SFCM son
similares\cr}
La mayor parte de las líneas celulares transducidas con DCN expresan niveles medios o altos de LNGFR (50-200 u.a.). Los perfiles FACS de las líneas celulares transducidas con DCN guardan buena relación con los resultados obtenidos en el análisis Southern, en el que las líneas celulares que albergan un provirus reordenado además del intacto presentan curvas bifásicas, con un pico negativo y un pico positivo proporcional a la intensidad relativa de las bandas que corresponden a los provirus intacto y reordenado, respectivamente.
La expresión de RNA específicos de vector en células transducidas (K562) se determina por Northern Blotting de poly(A)^{+}RNA aislado de líneas celulares seleccionadas con G418, hibridadas con sondas LNGFR y Neo. Los modelos resultantes son coherentes con los perfiles de transcripción esperados para cada vector retrovírico. En las células transducidas con NSV-N y NTK-N, una especie RNA sin empalmar y una empalmada se hibridan con una sonda LNGFR y con una sonda Neo. Los transcritos subgenómicos derivados de SV-40 y de TK que contienen el mRNA específico del LNGFR se observan únicamente después de la hibridación con la sonda LNGFR. Las células transducidas con LNSN o SFCM expresan únicamente el RNA sin empalmar, se hibridan tanto con la sonda NeoR como con la LNGFR. Esto es coherente con la inactivación ya publicada del sitio dador de empalme del vector LXSN, del que se derivan el LNSN y el SFCM^{5}. Un transcrito más corto, correspondiente al mRNA de NeoR derivado de SV40 se hibrida solamente con una sonda NeoR.
El vector DCN genera dos transcritos genómicos derivados de LTR, una forma sin empalmar y otra forma empalmada, respectivamente. Una tercera especie de RNA se transcribe desde el promotor ADA y muy probablemente se emplea como molde principal de mRNA para la síntesis del LNGFR. La contribución relativa del promotor ADA del 5' o del 3'LTR al transcrito LNGFR no puede evaluarse por esta técnica. Una forma de RNA de migración lenta puede representar un transcrito de lectura completa (read-through transcript) iniciado desde el promotor ADA en el 5'LTR y terminado en el sitio de adición poly(A) del 3'LTR. Se detectan también dos especies de RNA adicionales, no contadas, que se hibridan solamente con la sonda NeoR. Estos transcritos, presentes en todas las líneas celulares transducidas por DCN, son las únicas especies de RNA detectadas en las células Raji, que no expresan el LNGFR y llevan solamente provirus reordenados, como demuestra el análisis Southern Blot. Es probable por tanto que estos transcritos sean específicos del provirus reordenado, al que le falta el minigen ADAp-LNGFR.
El modelo de expresión de RNA observado en otras líneas celulares es comparable al obtenido a partir de la K562, con la única excepción de la línea celular RIM infectada con EBV, que de forma coherente presenta niveles altos de transcritos derivados de SV40, partiendo de NSV-N, LNSN y SFCM.
Eficacia de la transferencia genética mediada por vectores a PBL humanos
Los PBL humanos se infectan con vectores retrovíricos con estimulación PHA e IL-2. Con el fin de estimar las frecuencias de infección, 48 horas después de la infección se cultivan células T humanas en condiciones limitantes de dilución (de 1 a 10^{3} células/hoyo). Se cultivan células de control infectadas y no infectadas en presencia o ausencia de 0,4 mg/ml de G418. Se evalúa el crecimiento celular 14 días después del inicio del cultivo en placa, entonces no se detectan células supervivientes en hoyos que contienen células sin infectar cultivadas en presencia de G418. La frecuencia global de infección se sitúa entre menos del 1% y el 5,1%, en función de la concentración vírica de los líquidos sobrenadantes que contienen vectores. Sin embargo, entre diferentes donantes se observa una variación significativa. La eficacia de la transferencia genética puede aumentarse mediante ciclos de infección múltiple o mediante co-cultivo. El co-cultivo de PBL con líneas celulares productoras de virus irradiadas durante 48 horas proporciona lógicamente una buena eficacia de transferencia genética (del 10 al 15%). Los análisis de doble fluorescencia de los marcadores LNGFR y células T indican la posibilidad de contaminación con células productoras de vectores en la población positiva de LNGFR. En el ensayo, la frecuencia de la expresión de LNGFR se debe en su totalidad a la expresión del gen transducido por los PBL infectados, ya que todas las células positivas en el análisis FACS co-expresan el CD3 humano con independencia de la eficacia inicial de la transferencia genética, los PBL transducidos pueden seleccionarse hasta homogeneidad ya sea por selección con G418, ya sea por inmunoselección positiva con bolas magnéticas unidas a un anticuerpo monoclonal dirigido contra el LNGFR. En el ensayo representativo fue suficiente una sola ronda de inmunoselección para separar la población de células transducidas de los PBL sin infectar. Una vez separadas las bolas magnéticas se obtiene una población homogénea de linfocitos transducidos sin pérdida significativa de células transducidas.
Con el fin de evaluar la eficacia de los vectores víricos en infectar los PBL humanos se transduce un gran número de cultivos de PBL a granel con independencia entre sí por exposición a líquidos sobrenadantes que contienen los distintos vectores retrovíricos y se seleccionan con el G418 para determinar la presencia del vector y la expresión. Se analizan diez de los cultivos transducidos con vector (2 por el NSV-N, 3 por el NTK-N, 2 por el LNSN/SFCM y 3 por el DCN) con el Southern Blotting para determinar las integraciones províricas. La hibridación con la sonda NeoR del Xba I representativo, que corta en ambos 5' y 3'LTR de todos los vectores (fig. 1), permite detectar el tamaño de los provirus integrados y con el Bgl II, que corta solamente los DNA genómicos, permite estimar el número de sitios de integración. En todos los cultivos de linfocitos transducidos con NSV-N, NTK-N y LNSN/SFCM se detectan solamente bandas correspondientes a los provirus integrados intactos, mientras que en todos los cultivos transducidos con DCN se observa una banda adicional correspondiente a un provirus reordenado.
Finalmente, el análisis de integraciones províricas revela que los cultivos de células T transducidas con NSV-N, NTK-N y LNSN/SFCM son ampliamente policlonales, mientras que los cultivos transducidos con DCN son fundamentalmente oligoclonales, como indica la presencia de una banda predominante y de unas pocas bandas menores. Tal como se ha sugerido anteriormente, esto se debe probablemente a una concentración vírica menor y podría soslayarse mediante diversos protocolos de transferencia genética, incluido el co-cultivo de células diana con líneas celulares productoras de vectores.
Expresión mediada por vector del LNGFR en linfocitos T humanos
La expresión del LNGFR en la superficie de las células se detecta por análisis FACS en un total de 23 cultivos de linfocitos T transducidos con vector retrovírico (5 líneas celulares transducidas por NSV-N, 8 por NTK-N, 5 por LNSN y 5 por DCN). La expresión de LNGFR es baja en todas las células transducidas con NSV-N y en seis de los ocho cultivos celulares transducidos con NTK-N. Las dos líneas restantes de células T transducidas con NTK-N presentan niveles intermedios de expresión del LNGFR. Se observan niveles heterogéneos de expresión en los cultivos celulares LNSN-SFCM, de los que dos líneas expresan niveles bajo, dos niveles intermedios y uno expresa niveles altos de LNGFR. En las células transducidas con DCN, cuatro de las cinco líneas expresan niveles bajos y uno niveles intermedios de LNGFR.
Con el fin de caracterizar las células infectadas hemos ensayado 13 líneas celulares transducidas para determinar la expresión de antígenos de diferenciación de linfocitos de superficie celular empleando anticuerpos monoclonales anti-CD4, CD8, CD5, B4, Leu7, CD25R y CD34. Todas las líneas celulares obtienen puntos positivos en cuanto a expresión de CD5 y CD25R y negativos en cuanto a expresión de Leu7, B4 y CD34 (no se presentan los datos). Ocho de los 13 cultivos analizados son LNGFR^{+}/CD8^{+}, uno es LNGFR^{+}/CD4^{+} y cuatro son positivos para LNGFR y contienen diferentes porcentajes de células que co-expresan CD8 y CD4. La predominancia del fenotipo CD8^{+} en los cultivos estimulados con PHA e IL-2 se observa también en las líneas celulares de control, no infectadas y probablemente representen una desviación (bias) constante del procedimiento de cultivo de células T. En general no hemos observado una transducción preferente de los subconjuntos celulares concretos en ninguno de los cuatro vectores retrovíricos.
Se obtienen clones de células T de cultivos de células T transducidas con vectores por cultivo de células en placa con dilución limitante (1000, 100 y 10 células/hoyo), teniendo en cuenta una frecuencia media de infección de aprox. el 1%. El 72% de todos los clones examinados son LNGFR^{+}/CD4^{+} y el 28% son LNGFR^{+}/CD8^{+}. Se observa también la predominancia del fenotipo CD4^{+} en células T de control, no infectadas, clonadas a partir de los mismos donantes y se considera un hallazgo estándar en nuestras condiciones de clonación. Además se realiza la transducción retrovírica y la expresión de LNGFR en clones doblemente positivos CD4^{+}/CD8^{+}. Estos resultados demuestran que la infección retrovírica puede ocurrir no solo en células CD4^{+} y CD8^{+} maduras, sino también en linfocitos doblemente positivos CD4^{+}/CD8^{+} inmaduros de la sangre periférica.
Análisis del repertorio de células T en linfocitos T transducidos con vectores
Tal como se ha descrito anteriormente, en análisis Southern Blot de integraciones víricas pone de manifiesto la naturaleza policlonal de los cultivos de células T infectadas con vectores. Esto se confirma además por análisis molecular de reordenamientos de la cadena (TCR)\beta del receptor de células T en muestras de DNA digerido con Xba I, hibridadas con una sonda específica de la región constante de la cadena TCR\beta. En los cultivos de células T transducidas con NSV, NTK-N y LNSN/SFCM se detecta un modelo policlonal, sin bandas predominantes, además del modelo de línea germinal. Se observa la presencia de un número limitado de bandas predominantes de reordenamiento en cultivos infectados con DCN, al igual que en poblaciones de células oligoclonales.
Se obtiene una confirmación adicional de estas observaciones por análisis sistemático del uso de la cadena TCR-V\beta en linfocitos transducidos. Después de un solo ciclo de infección de los PBL con líquidos sobrenadantes que contienen vectores, seguida por la selección de las células transducidas con G418, se somete el RNA total de la población de linfocitos seleccionados a una transcripción inversa y se somete el DNA obtenido a una PCR empleando oligonucleótidos específicos de V\beta-C\beta y para anclar la PCR empleando un oligonucleótido específico de C\beta, del modo descrito en la sección de métodos. El análisis de los productos amplificados mediante oligonucleótidos específicos de V\beta pone de manifiesto un repertorio idéntico, si se compara con la población original de control de linfocitos no transducidos/no seleccionados. De modo similar a los resultados del análisis Southern Blot de los reordenamientos de la cadena TCR-\beta, las concentraciones víricas bajas de los líquidos sobrenadantes que contienen vectores producen un repertorio V\beta limitado (no se presentan los datos). Esta limitación de los vectores de baja concentración podría soslayarse mediante ciclos múltiples de infección o mediante el co-cultivo de PBL con la línea celular productora.
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(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE: BOEHRINGER MANNHEIM GmbH
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CALLE: Sandhofer Str. 116
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Mannheim
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
ESTADO: BW
\vskip0.333000\baselineskip
(E)
PAÍS: ALEMANIA
\vskip0.333000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL (ZIP): D-68305
\vskip0.333000\baselineskip
(G)
TELÉFONO: 08856/60-3446
\vskip0.333000\baselineskip
(H)
TELEFAX: 08856/60-3451
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Método de marcado de células eucarióticas
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 2
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
FORMA LEÍBLE CON ORDENADOR:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: floppy disk
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
PROGRAMA: PatentIn edición #1.0, versión #1.25 (EPO)
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
DATOS DE SOLICITUD PREVIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
SOLICITUD NÚMERO: IT RM93/A000587
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 01-SEP-1993
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 1:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1600 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
PROPIEDADES:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: propiedades diversas
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
SITUACIÓN: uno-de(943)
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
INFORMACIÓN DIVERSA: /function = "PvuII cleavage site"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
PROPIEDADES:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: propiedades diversas
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
SITUACIÓN: uno-de(1512)
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
INFORMACIÓN DIVERSA: /function = "SstI cleavage site"
\vskip0.666000\baselineskip
(x)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
3
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TGCTGACCCC ACTGTCGACC TCCTTCCCAT T
\hfill
31

Claims (11)

1. Un método de marcado de una célula de sangre o una célula de médula ósea de mamífero mediante la expresión de un ácido nucleico en dicha célula, dicho ácido nucleico codifica un receptor de superficie celular y mediante la posterior presentación de dicho receptor en la superficie de la célula, caracterizado porque se utiliza un ácido nucleico en el que la región que codifica el dominio intracelular del receptor ha sufrido una deleción total o parcial o se ha modificado de tal manera que el receptor presentado en la superficie, después de unirse a su complemento de unión, no puede efectuar ninguna transducción de señal.
2. El método según la reivindicación 1, caracterizado porque la región que codifica el dominio intracelular está modificada mediante sustitución de nucleótidos.
3. El método según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque se utiliza un ácido nucleico que codifica al receptor NGF, CD24 o LDL.
4. El método según las reivindicaciones de 1 a 3, caracterizado porque en calidad de ácido nucleico se utiliza el ácido nucleico del receptor NGF en el que la región que codifica los aminoácidos 245 del extremo C ha sufrido deleción.
5. El método según las reivindicaciones de 1 a 4, caracterizado porque el ácido nucleico se introduce en la célula mediante un vector vírico o mediante lipofección.
6. Uso de un ácido nucleico que codifica un receptor de superficie celular y en el que la región que codifica el dominio intracelular ha sufrido una deleción total o parcial o se ha modificado de tal manera que el dominio fundamentalmente ya no está en condiciones de efectuar ninguna transducción de señal, para expresar un receptor de superficie celular modificado de esta manera y presentar el receptor en la superficie celular de tal manera que el receptor se utiliza en calidad de marcador seleccionable para células de sangre o células de médula ósea transfectadas de mamífero.
7. Un método para la inmunoselección de células de sangre o células de médula ósea transfectadas de mamífero que consiste en la introducción de un ácido nucleico en la célula, dicho ácido nucleico codifica a un receptor de superficie celular en el que la región que codifica el dominio intracelular del receptor ha sufrido una deleción total o parcial o se ha modificado de tal manera que el receptor presentado en la superficie, una vez se ha unido a su complemento de unión, no puede efectuar ninguna transducción de señal, en identificar las células transfectadas por incubación de dichas células con un anticuerpo marcado que se une específicamente a dicho receptor y en recuperar las células por destrucción del complejo anticuerpo/célula.
8. Un método para la inmunoseparación de células de sangre o células de médula ósea transfectadas de mamífero que consiste en la introducción de un DNA en la célula, dicho DNA codifica a un receptor de superficie celular en el que la región que codifica el dominio intracelular del receptor ha sufrido una deleción total o parcial o se ha modificado de tal manera que el receptor presentado en la superficie, una vez se ha unido a su complemento de unión, no puede efectuar ninguna transducción de señal, en incubar las células con un anticuerpo dirigido contra el receptor inmovilizado antes o después de la incubación, en separar las células inmovilizadas por el anticuerpo de las células no fijadas y en aislar las células mediante la rotura de la unión entre anticuerpo y receptor.
9. Un método de obtención de un preparado de células hematopoyéticas, en el que dichas células están marcadas con un receptor de superficie celular y en el que dicho preparado celular está fundamentalmente exento de células tumorales clonogénicas, que consiste en purgar mediante agentes citotóxicos o mediante radiación, en transducir dichas células con un ácido nucleico, que codifica un receptor de superficie celular y en el que la región que codifica el dominio intracelular ha sufrido una deleción total o parcial o se ha modificado de tal manera que el dominio ya no puede realizar ninguna transducción de señal y en separar dichas células transducidas de las células no transducidas.
10. Uso de un ácido nucleico de LNGFR modificado, ilustrado en la SEQ. ID. NO: 1, para el marcado de células de sangre o células de médula ósea transfectadas de mamífero mediante la transfección de las células con dicho ácido nucleico.
11. Uso según la reivindicación 10 para el marcado de células hematopoyéticas humanas.
ES94926187T 1993-09-01 1994-08-11 Metodo de marcado de celulas eucarioticas empleando como marcador un receptor de superficie celular. Expired - Lifetime ES2210260T3 (es)

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