KR20210005923A - 세포독성 t 세포 고갈의 방법 및 조성물 - Google Patents

세포독성 t 세포 고갈의 방법 및 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR20210005923A
KR20210005923A KR1020207034097A KR20207034097A KR20210005923A KR 20210005923 A KR20210005923 A KR 20210005923A KR 1020207034097 A KR1020207034097 A KR 1020207034097A KR 20207034097 A KR20207034097 A KR 20207034097A KR 20210005923 A KR20210005923 A KR 20210005923A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
seq
domain
homology
polynucleotide sequence
variant
Prior art date
Application number
KR1020207034097A
Other languages
English (en)
Inventor
바샤 스텐코비치
Original Assignee
크리스퍼 테라퓨틱스 아게
바이엘 헬쓰케어 엘엘씨
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 크리스퍼 테라퓨틱스 아게, 바이엘 헬쓰케어 엘엘씨 filed Critical 크리스퍼 테라퓨틱스 아게
Publication of KR20210005923A publication Critical patent/KR20210005923A/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/4353—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/436—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems the heterocyclic ring system containing a six-membered ring having oxygen as a ring hetero atom, e.g. rapamycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0008—Antigens related to auto-immune diseases; Preparations to induce self-tolerance
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/462—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells
    • A61K39/4621—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells immunosuppressive or immunotolerising
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4631—Chimeric Antigen Receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/46433—Antigens related to auto-immune diseases; Preparations to induce self-tolerance
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/46434—Antigens related to induction of tolerance to non-self
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/464411—Immunoglobulin superfamily
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/55—IL-2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70517—CD8
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70539—MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C07K14/7155—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1138—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C12N5/0638—Cytotoxic T lymphocytes [CTL] or lymphokine activated killer cells [LAK]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5156—Animal cells expressing foreign proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Virology (AREA)

Abstract

본 발명은 제어된 세포독성 T 세포 고갈을 위한, 예컨대 세포독성 T 세포와 연관된 다양한 질환 및 상태의 치료를 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 출원은 그 중에서도 세포독성 T 림프구 (CTL)에 대한 세포독성을 조작된 T 세포에 부여할 수 있는 항-CTL 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 조작된 T 세포를 제공한다. 항-CTL 단백질은 세포외 베타2-마이크로글로불린 도메인을 포함할 수 있다.

Description

세포독성 T 세포 고갈의 방법 및 조성물
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2018년 4월 27일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 62/663,966에 대해 우선권을 주장하며, 이의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출되었고, 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 서열 목록을 함유한다. 2019년 4월 26일에 생성된 ASCII 사본은 052984-516001WO_SL_ST25.txt로 명명되며, 크기가 274,520 바이트이다.
분야
본 개시내용은 개체에서의 제어된 세포독성 T 세포 고갈을 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 특히, 조성물은 T 세포의 생존 및/또는 증식을 제어하는 것을 허용하는 생리학적으로 기능적인 합성 화학적으로 유도된 신호전달 복합체 (CISC)를 생성하기 위한 일반적 구조를 포함한다. 또한, 예컨대 다양한 질환 및 상태의 치료를 위한 이러한 조성물을 사용하는 방법이 제공된다.
키메라 항원 수용체 (CAR)는 입양 세포성 면역요법에 사용하기 위해 T 세포를 유전적으로 조작하는데 사용되는 조작된 수용체이다 (문헌 [Pule et al., Cytother. 5:3, 2003]; [Restifo et al., Nat. Rev. Immunol. 12:269, 2012] 참조). 항원 결합은 CAR의 세포내 절편 상의 신호전달 도메인을 자극함으로써, 신호전달 경로를 활성화시킨다. CAR-기반 입양 세포성 면역요법은 통상적인 치료의 표준 치료에 난치성인 종양을 갖는 암 환자를 치료하는데 사용되었다 (문헌 [Grupp et al., N. Engl. J. Med. 368:1509, 2013]; [Kalos et al., Sci. Transl. Med. 3:95ra73, 2011] 참조).
CAR-기반 입양 세포성 면역요법은 또한 질환 또는 상태에 관여하는 숙주 세포를 표적화하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 세포독성 T 림프구 (CTL)에 대해 특이적인 CAR T 세포는 잠재적으로 유해 CTL-매개된 면역 반응을 특징으로 하는 질환 또는 상태, 예컨대 자가면역 (예를 들어, 제1형 당뇨병 (T1D), 전신 홍반성 루푸스 (SLE), 다발성 경화증 (MS), 또는 류마티스성 관절염 (RA)) 또는 이식편 대 숙주 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 이러한 질환 및 상태를 위한 현재 이용가능한 치료는 만성 전반적 면역억제를 포함하며, 이는 질병 및/또는 사망을 발생시킬 수 있는 병원체에 대한 증가된 감수성을 발생시킨다. T1D 치료는 현재 인슐린 대체로 이루어지며, 이는 저인슐린혈증의 증상을 치료하지만, 원인, 즉 인슐린 생산 췌장 베타-섬 세포의 파괴를 다루지 않는다. 각각의 이들 면역학적 질환의 경우에, 현재 요법은 평생동안인 반면, CTL-억제성 세포 요법은 1회 치유적 치료일 잠재성을 갖는다.
그러나, 개체에서 CTL을 표적화하는 통상적인 CAR T 세포의 투여는 개체에서 CTL의 비제어된 고갈을 발생시킬 것이며, 이는 중증 유해 효과, 예컨대 병원성 감염에 반응하는 불능을 발생시킬 수 있다. 유해 CTL-매개된 면역 반응을 특징으로 하는 질환 및 상태에 대한 실행가능한 치료에 도달하는 CTL의 고갈을 제어하는 것을 허용하는 새로운 조성물 및 방법에 대한 필요가 남아 있다.
조작된 T 세포의 제어된 생존 및/또는 증식을 허용하는 화학적으로 유도된 신호전달 복합체 (CISC)를 포함하는 조작된 T 세포, 예컨대 조작된 T 세포에 대해 반응성인 CTL에 대한 세포독성을 부여하는 키메라 수용체를 발현하는 조작된 T 세포, 조작된 T 세포를 제조하고 사용하는 방법, 및 상기 방법에 유용한 조성물이 본원에 기재된다.
본원에 기재된 몇몇 측면은 화학적으로 유도된 신호전달 복합체 (CISC)를 포함하는 조성물 및 방법에 관한 것이다. 일부 측면에서, 조성물 및 방법은 T 세포, 예컨대 조작된 T 세포에 대해 반응성인 CTL에 대한 세포독성을 부여하는 키메라 수용체를 발현하는 조작된 T 세포의 집단의 선택적 생존 및/또는 증식에 사용될 수 있다.
한 측면에서, a) 비-기능적 T 세포 수용체 알파 불변 (TRAC) 도메인을 코딩하도록 변형된 내인성 T 세포 수용체 알파 (TRA) 유전자; 및 b) 조작된 T 세포에 대해 반응성인 세포독성 T 림프구 (CTL)에 대한 세포독성을 조작된 T 세포에 부여할 수 있는 항-CTL 구축물을 코딩하는 핵산을 포함하는 조작된 T 세포가 본원에서 제공된다. 일부 실시양태에서, 조작된 T 세포의 생존 및/또는 증식은 조작된 T 세포와 접촉하는 리간드의 양을 조정함으로써 제어될 수 있다.
일부 실시양태에서, 항-CTL 단백질은 세포외 β2-마이크로글로불린 도메인, 막횡단 도메인, 공동-자극성 도메인, 및 세포질 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 세포외 β2-마이크로글로불린 도메인은 서열식별번호(SEQ ID NO): 49의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 49와 적어도 85% 상동성을 포함하는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-CTL 단백질 막횡단 도메인은 CD8 막횡단 도메인을 포함하고/거나, 항-CTL 단백질 공동-자극성 도메인은 4-1BB 공동-자극성 도메인을 포함하고/거나, 항-CTL 단백질 세포질 신호전달 도메인은 CD3-ζ 세포질 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, i) CD8 막횡단 도메인은 서열식별번호: 50의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 50과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고/거나; ii) 4-1BB 공동-자극성 도메인은 서열식별번호: 51의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 51과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고/거나; iii) CD3-ζ 세포질 신호전달 도메인은 서열식별번호: 52의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 52와 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-CTL 단백질은 서열식별번호: 53의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 53과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, b) 항-CTL 단백질을 코딩하는 핵산은 TRAC 도메인을 코딩하는 내인성 TRA 유전자의 영역 내로 삽입되거나, 또는 b) 항-CTL 단백질을 코딩하는 핵산은 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입된다.
일부 실시양태에서, 세포는 c) 이량체화 활성화가능한 화학적으로 유도된 신호전달 복합체 (CISC)의 폴리펩티드 구성성분을 코딩하는 1종 이상의 핵산을 추가로 포함하며, 여기서 CISC의 폴리펩티드 구성성분은 i) 제1 세포외 결합 도메인 또는 그의 부분, 힌지 도메인, 막횡단 도메인, 및 신호전달 도메인 또는 그의 부분을 포함하는 제1 CISC 구성성분; 및 ii) 제2 세포외 결합 도메인 또는 그의 부분, 힌지 도메인, 막횡단 도메인, 및 신호전달 도메인 또는 그의 부분을 포함하는 제2 CISC 구성성분을 포함하며; 여기서 제1 CISC 구성성분 및 제2 CISC 구성성분은, 발현되는 경우에, 이들이 리간드의 존재 하에서 이량체화하여 신호전달-적격 CISC를 생성하도록 구성된다.
일부 실시양태에서, 제1 CISC 구성성분의 신호전달 도메인은 IL-2 수용체 서브유닛 감마 (IL2Rγ) 세포질 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, IL2Rγ 세포질 신호전달 도메인은 서열식별번호: 44의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 44의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 세포외 결합 도메인 또는 그의 부분은 FK506 결합 단백질 (FKBP) 도메인 또는 그의 부분을 포함한다.
일부 실시양태에서, FKBP 도메인은 서열식별번호: 41의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 41의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 제2 CISC 구성성분의 신호전달 도메인은 IL-2 수용체 서브유닛 베타 (IL2Rβ) 세포질 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, IL2Rβ 세포질 신호전달 도메인은 서열식별번호: 45의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 45의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 제2 세포외 결합 도메인 또는 그의 부분은 FKBP 라파마이신 결합 (FRB) 도메인 또는 그의 부분을 포함한다.
일부 실시양태에서, FRB는 서열식별번호: 42의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 42의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 및 제2 CISC 구성성분의 막횡단 도메인은 독립적으로 IL-2 수용체 막횡단 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 1) 제1 CISC 구성성분을 코딩하는 1종 이상의 핵산은 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입되고, 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 1종 이상의 핵산은 TRAC 도메인을 코딩하는 내인성 TRA 유전자의 영역 내로 삽입되거나; 또는 2) 제1 CISC 구성성분을 코딩하는 1종 이상의 핵산은 TRAC 도메인을 코딩하는 내인성 TRA 유전자의 영역 내로 삽입되고, 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 1종 이상의 핵산은 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입된다.
일부 실시양태에서, 리간드는 라파마이신 또는 라파마이신 유사체 (라파로그)이다.
일부 실시양태에서, 라파로그는 에베롤리무스, CCI-779, C20-메탈릴라파마이신, C16-(S)-3-메틸인돌라파마이신, C16-iRap, AP21967, 나트륨 미코페놀산, 베니디핀 히드로클로라이드, AP1903, 또는 AP23573, 또는 이들의 대사물, 유도체, 및/또는 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 리간드는 0.05 nM 내지 500 nM의 양으로 존재하거나 또는 제공된다.
일부 실시양태에서, 세포는 g) 선택가능한 마커를 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 선택가능한 마커는 말단절단된 저-친화도 신경 성장 인자 수용체 (tLNGFR) 폴리펩티드이다.
일부 실시양태에서, tLNGFR 폴리펩티드는 서열식별번호: 54의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 선택가능한 마커를 코딩하는 핵산은 TRAC 도메인을 코딩하는 내인성 TRA 유전자의 영역 내로 삽입되거나, 또는 선택가능한 마커를 코딩하는 핵산은 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입된다.
일부 실시양태에서, 세포는 e) 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드는 타크롤리무스 (FK506) 및/또는 시클로스포린 A (CsA)에 대한 저항성을 부여한다.
일부 실시양태에서, 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드는 돌연변이체 칼시뉴린 (CN) 폴리펩티드이다.
일부 실시양태에서, 돌연변이체 CN 폴리펩티드는 타크롤리무스 (FK506) 및 시클로스포린 A (CsA)에 대한 저항성을 부여한다.
일부 실시양태에서, 돌연변이체 CN 폴리펩티드는 CNb30 (서열식별번호: 55)이다.
일부 실시양태에서, 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 TRAC 도메인을 코딩하는 내인성 TRA 유전자의 영역 내로 삽입되거나, 또는 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입된다.
일부 실시양태에서, 세포는 f) 포유동물 라파마이신의 표적 (mTOR) 키나제의 FKBP-라파마이신 결합 (FRB) 도메인 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, FRB 도메인 폴리펩티드는 세포내 발현된다.
일부 실시양태에서, FRB 도메인 폴리펩티드는 서열식별번호: 56 또는 57의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 56 또는 57의 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 상동성을 갖는 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, FRB 도메인 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 TRAC 도메인을 코딩하는 내인성 TRA 유전자의 영역 내로 삽입되거나, 또는 FRB 도메인 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입된다.
또 다른 측면에서, TRAC 도메인을 코딩하는 영역 내의 또는 그 부근의 내인성 TRA 유전자에서의 서열에 상보적인 서열을 포함하는 가이드 RNA (gRNA)가 본원에서 제공된다.
일부 실시양태에서, gRNA는 서열식별번호: 1-3 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 서열식별번호: 1-3 중 어느 하나와 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
또 다른 측면에서, 내인성 IL2RG 유전자 내의 또는 그 부근의 서열에 상보적인 서열을 포함하는 가이드 RNA (gRNA)가 본원에서 제공된다.
일부 실시양태에서, gRNA는 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나와 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
또 다른 측면에서, a) 제1 gRNA가 상기 기재된 실시양태 중 임의의 것에 따른 gRNA이고 제2 gRNA가 상기 기재된 실시양태 중 임의의 것에 따른 gRNA인 제1 gRNA 및/또는 제2 gRNA; 및 b) RNA-가이드된 엔도뉴클레아제 (RGEN) 또는 RGEN을 코딩하는 핵산을 포함하는 시스템이 본원에서 제공된다.
일부 실시양태에서, 시스템은 c) i) 항-CTL 단백질; ii) 제1 세포외 결합 도메인 또는 그의 부분, 힌지 도메인, 막횡단 도메인, 및 신호전달 도메인 또는 그의 부분 또는 그의 기능적 유도체를 포함하는 제1 CISC 구성성분; 및 iii) 제2 세포외 결합 도메인 또는 그의 부분, 힌지 도메인, 막횡단 도메인, 및 신호전달 도메인 또는 그의 부분을 포함하는 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산을 포함하는 1종 이상의 공여자 주형을 추가로 포함하며, 여기서 제1 CISC 구성성분 및 제2 CISC 구성성분은, T 세포에 의해 발현되는 경우에, 이들이 리간드의 존재 하에서 이량체화하여 T 세포의 생존 및/또는 증식을 촉진시킬 수 있는 신호전달 적격 CISC를 생성하도록 구성된다.
일부 실시양태에서, 항-CTL 단백질은 세포외 β2-마이크로글로불린 도메인, 막횡단 도메인, 공동-자극성 도메인, 및 세포질 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 세포외 β2-마이크로글로불린 도메인은 서열식별번호: 49의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 49와 적어도 85% 상동성을 포함하는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-CTL 단백질 막횡단 도메인은 CD8 막횡단 도메인을 포함하고/거나, 항-CTL 단백질 공동-자극성 도메인은 4-1BB 공동-자극성 도메인을 포함하고/거나, 항-CTL 단백질 세포질 신호전달 도메인은 CD3-ζ 세포질 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, i) CD8 막횡단 도메인은 서열식별번호: 50의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 50과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고/거나; ii) 4-1BB 공동-자극성 도메인은 서열식별번호: 51의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 51과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고/거나; iii) CD3-ζ 세포질 신호전달 도메인은 서열식별번호: 52의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 52와 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-CTL 단백질은 서열식별번호: 53의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 53과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 CISC 구성성분의 신호전달 도메인은 IL-2 수용체 서브유닛 감마 (IL2Rγ) 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, IL2Rγ 세포질 신호전달 도메인은 서열식별번호: 44의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 44의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 세포외 결합 도메인 또는 그의 부분은 FK506 결합 단백질 (FKBP) 도메인 또는 그의 부분을 포함한다.
일부 실시양태에서, FKBP 도메인은 서열식별번호: 41의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 41의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 제2 CISC 구성성분의 신호전달 도메인은 IL-2 수용체 서브유닛 베타 (IL2Rβ) 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, IL2Rβ 세포질 신호전달 도메인은 서열식별번호: 45의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 45의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 제2 세포외 결합 도메인 또는 그의 부분은 FKBP 라파마이신 결합 (FRB) 도메인 또는 그의 부분을 포함한다.
일부 실시양태에서, FRB는 서열식별번호: 42의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 42의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 및 제2 CISC 구성성분의 막횡단 도메인은 독립적으로 IL-2 수용체 막횡단 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 리간드는 라파마이신 또는 라파로그이다.
일부 실시양태에서, 라파로그는 에베롤리무스, CCI-779, C20-메탈릴라파마이신, C16-(S)-3-메틸인돌라파마이신, C16-iRap, AP21967, 나트륨 미코페놀산, 베니디핀 히드로클로라이드, AP1903, 또는 AP23573, 또는 이들의 대사물, 유도체, 및/또는 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, c) 1종 이상의 공여자 주형은 iv) 선택가능한 마커; v) 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드; 또는 vi) 포유동물 라파마이신의 표적 (mTOR) 키나제의 FKBP-라파마이신 결합 (FRB) 도메인 폴리펩티드 중 1종 이상을 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 선택가능한 마커는 말단절단된 저-친화도 신경 성장 인자 수용체 (tLNGFR) 폴리펩티드이다.
일부 실시양태에서, tLNGFR 폴리펩티드는 서열식별번호: 54의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드는 돌연변이체 칼시뉴린 (CN) 폴리펩티드이다.
일부 실시양태에서, 돌연변이체 CN 폴리펩티드는 CNb30 (서열식별번호: 55)이다.
일부 실시양태에서, FRB 도메인 폴리펩티드는 서열식별번호: 56 또는 57의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 56 또는 57의 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 상동성을 갖는 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, RGEN은 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (또한 Csn1 및 Csx12로 공지됨), Cas100, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, 및 Cpf1 엔도뉴클레아제, 또는 그의 기능적 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, RGEN은 Cas9이다.
일부 실시양태에서, RGEN을 코딩하는 핵산은 리보핵산 (RNA) 서열이다.
일부 실시양태에서, RGEN을 코딩하는 RNA 서열은 공유 결합을 통해 제1 gRNA 또는 제2 gRNA에 연결된다.
일부 실시양태에서, 시스템은 1종 이상의 공여자 주형 중 하나를 포함하는 아데노-연관된 바이러스 (AAV) 벡터를 포함한다.
일부 실시양태에서, AAV 벡터는 서열식별번호: 19-40 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 19-40 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 시스템은 제1 gRNA 및 제1 AAV 벡터 및 제2 gRNA 및 제2 AAV 벡터를 포함하며, 여기서 (A) 제1 gRNA는 서열식별번호: 1의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 1의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 AAV 벡터는 서열식별번호: 37의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 37의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 gRNA는 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 AAV 벡터는 서열식별번호: 40의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 40의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하거나; (B) 제1 gRNA는 서열식별번호: 2의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 2의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 AAV 벡터는 서열식별번호: 38의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 38의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 gRNA는 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 AAV 벡터는 서열식별번호: 40의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 40의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하거나; (C) 제1 gRNA는 서열식별번호: 3의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 3의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 AAV 벡터는 서열식별번호: 39의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 39의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 gRNA는 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 AAV 벡터는 서열식별번호: 40의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 40의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 시스템은 제1 gRNA 및 제1 AAV 벡터를 포함하며, 여기서 (A) 제1 gRNA는 서열식별번호: 1의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 1의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 AAV 벡터는 서열식별번호: 19 또는 22의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 19 또는 22의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하거나; (B) 제1 gRNA는 서열식별번호: 2의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 2의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 AAV 벡터는 서열식별번호: 20 또는 23의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 20 또는 23의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하거나; (C) 제1 gRNA는 서열식별번호: 3의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 3의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 AAV 벡터는 서열식별번호: 21 또는 24의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 21 또는 24의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 시스템은 제1 gRNA 및 제1 AAV 벡터를 포함하며, 여기서 제1 gRNA는 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 AAV 벡터는 서열식별번호: 25-36 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 25-36 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 시스템은 RGEN 및 제1 gRNA 및/또는 제2 gRNA를 포함하는 리보핵단백질 (RNP) 복합체를 포함한다.
일부 실시양태에서, RGEN은 각각 1:1 내지 20:1의 gRNA 대 RGEN의 몰비로 제1 gRNA 및/또는 제2 gRNA와 예비복합체화되어 RNP를 형성한다.
또 다른 측면에서, 서열식별번호: 19-40 중 어느 하나의 핵산 서열, 또는 서열식별번호: 19-40 중 어느 하나와 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하는 벡터가 본원에서 제공된다.
일부 실시양태에서, 벡터는 아데노 연관된 바이러스 (AAV) 벡터이다.
또 다른 측면에서, 세포의 게놈을 편집하는 방법으로서, a) 제1 gRNA가 상기 기재된 실시양태 중 임의의 것에 따른 gRNA이고 제2 gRNA가 상기 기재된 실시양태 중 임의의 것에 따른 gRNA인 제1 gRNA 및/또는 제2 gRNA; b) RGEN 또는 RGEN을 코딩하는 핵산; 및 c) i) 항-CTL 단백질; ii) 제1 세포외 결합 도메인 또는 그의 부분, 힌지 도메인, 막횡단 도메인, 및 신호전달 도메인 또는 그의 부분 또는 그의 기능적 유도체를 포함하는 제1 CISC 구성성분; 및 iii) 제2 세포외 결합 도메인 또는 그의 부분, 힌지 도메인, 막횡단 도메인, 및 신호전달 도메인 또는 그의 부분을 포함하는 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산을 포함하는 1종 이상의 공여자 주형을 세포에 제공하는 것을 포함하며, 여기서 제1 CISC 구성성분 및 제2 CISC 구성성분은, T 세포에 의해 발현되는 경우에, 이들이 리간드의 존재 하에서 이량체화하여 T 세포의 생존 및/또는 증식을 촉진시킬 수 있는 신호전달 적격 CISC를 생성하도록 구성된 것인 방법이 본원에서 제공된다.
일부 실시양태에서, 항-CTL 단백질은 세포외 β2-마이크로글로불린 도메인, 막횡단 도메인, 공동-자극성 도메인, 및 세포질 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 세포외 β2-마이크로글로불린 도메인은 서열식별번호: 49의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 49와 적어도 85% 상동성을 포함하는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-CTL 단백질 막횡단 도메인은 CD8 막횡단 도메인을 포함하고/거나, 항-CTL 단백질 공동-자극성 도메인은 4-1BB 공동-자극성 도메인을 포함하고/거나, 항-CTL 단백질 세포질 신호전달 도메인은 CD3-ζ 세포질 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, i) CD8 막횡단 도메인은 서열식별번호: 50의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 50과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고/거나; ii) 4-1BB 공동-자극성 도메인은 서열식별번호: 51의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 51과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고/거나; iii) CD3-ζ 세포질 신호전달 도메인은 서열식별번호: 52의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 52와 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-CTL 단백질은 서열식별번호: 53의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 53과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 CISC 구성성분의 신호전달 도메인은 IL-2 수용체 서브유닛 감마 (IL2Rγ) 세포질 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, IL2Rγ 세포질 신호전달 도메인은 서열식별번호: 44의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 44의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 세포외 결합 도메인 또는 그의 부분은 FK506 결합 단백질 (FKBP) 도메인 또는 그의 부분을 포함한다.
일부 실시양태에서, FKBP 도메인은 서열식별번호: 41의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 41의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 제2 CISC 구성성분의 신호전달 도메인은 IL-2 수용체 서브유닛 베타 (IL2Rβ) 세포질 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, IL2Rβ 세포질 신호전달 도메인은 서열식별번호: 45의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 45의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 제2 세포외 결합 도메인 또는 그의 부분은 FKBP 라파마이신 결합 (FRB) 도메인 또는 그의 부분을 포함한다.
일부 실시양태에서, FRB 도메인은 서열식별번호: 42의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 42의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 및 제2 CISC 구성성분의 막횡단 도메인은 독립적으로 IL-2 수용체 막횡단 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 라파로그는 에베롤리무스, CCI-779, C20-메탈릴라파마이신, C16-(S)-3-메틸인돌라파마이신, C16-iRap, AP21967, 나트륨 미코페놀산, 베니디핀 히드로클로라이드, AP1903, 또는 AP23573, 또는 이들의 대사물, 유도체, 및/또는 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, c) 1종 이상의 공여자 주형은 iv) 선택가능한 마커; v) 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드; 또는 vi) 포유동물 라파마이신의 표적 (mTOR) 키나제의 FKBP-라파마이신 결합 (FRB) 도메인 폴리펩티드 중 1종 이상을 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 선택가능한 마커는 말단절단된 저-친화도 신경 성장 인자 수용체 (tLNGFR) 폴리펩티드이다.
일부 실시양태에서, tLNGFR 폴리펩티드는 서열식별번호: 54의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드는 돌연변이체 칼시뉴린 (CN) 폴리펩티드이다.
일부 실시양태에서, 돌연변이체 CN 폴리펩티드는 CNb30 (서열식별번호: 55)이다.
일부 실시양태에서, FRB 도메인 폴리펩티드는 서열식별번호: 56 또는 57의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 56 또는 57의 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 상동성을 갖는 변이체를 포함한다.
또 다른 측면에서, 세포의 게놈을 편집하는 방법으로서, 제1 gRNA, 제2 gRNA, RGEN 또는 RGEN을 코딩하는 핵산, 제1 벡터, 및 제2 벡터를 세포에 제공하는 것을 포함하며, 여기서 (A) 제1 gRNA가 서열식별번호: 1의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 1의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 벡터가 서열식별번호: 37의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 37의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 gRNA가 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 벡터가 서열식별번호: 40의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 40의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하거나; (B) 제1 gRNA가 서열식별번호: 2의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 2의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 벡터가 서열식별번호: 38의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 38의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 gRNA가 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 벡터가 서열식별번호: 40의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 40의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하거나; (C) 제1 gRNA가 서열식별번호: 3의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 3의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 벡터가 서열식별번호: 39의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 39의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 gRNA가 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 벡터가 서열식별번호: 40의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 40의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하는 것인 방법이 본원에서 제공된다.
또 다른 측면에서, 세포의 게놈을 편집하는 방법으로서, 제1 gRNA, RGEN 또는 RGEN을 코딩하는 핵산, 및 제1 벡터를 세포에 제공하는 것을 포함하며, 여기서 (A) 제1 gRNA가 서열식별번호: 1의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 1의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 벡터가 서열식별번호: 19 또는 22의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 19 또는 22의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하거나; (B) 제1 gRNA가 서열식별번호: 2의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 2의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 벡터가 서열식별번호: 20 또는 23의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 20 또는 23의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하거나; (C) 제1 gRNA가 서열식별번호: 3의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 3의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 벡터가 서열식별번호: 21 또는 24의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 21 또는 24의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하는 것인 방법이 본원에서 제공된다.
또 다른 측면에서, 세포의 게놈을 편집하는 방법으로서, 제1 gRNA, RGEN 또는 RGEN을 코딩하는 핵산, 및 제1 벡터를 세포에 제공하는 것을 포함하며, 여기서 제1 gRNA가 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 벡터가 서열식별번호: 25-36 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 25-36 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하는 것인 방법이 본원에서 제공된다.
일부 실시양태에서, RGEN은 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (또한 Csn1 및 Csx12로 공지됨), Cas100, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, 및 Cpf1 엔도뉴클레아제, 또는 그의 기능적 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, RGEN은 Cas9이다.
일부 실시양태에서, RGEN을 코딩하는 핵산은 리보핵산 (RNA) 서열이다.
일부 실시양태에서, RGEN을 코딩하는 RNA 서열은 공유 결합을 통해 제1 gRNA 또는 제2 gRNA에 연결된다.
일부 실시양태에서, 공여자 주형은 AAV 벡터에 함유된다.
일부 실시양태에서, RGEN은, 세포에의 제공 전에, 제1 gRNA 및/또는 제2 gRNA와 예비복합체화되어 RNP 복합체를 형성한다.
일부 실시양태에서, RGEN은 각각 1:1 내지 20:1의 gRNA 대 RGEN의 몰비로 제1 gRNA 및/또는 제2 gRNA와 예비복합체화된다.
일부 실시양태에서, 1종 이상의 공여자 주형은 독립적으로 세포의 게놈 내로 삽입된다.
일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 TRA 유전자 또는 유전자 조절 요소에, 그 내에, 또는 그 부근에 삽입되고/거나, 제2 공여자 주형은 IL2RG 유전자 또는 유전자 조절 요소에, 그 내에, 또는 그 부근에 삽입된다.
일부 실시양태에서, i) 제1 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산은 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입되고/거나, ii) 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산은 TRAC 도메인을 코딩하는 내인성 TRA 유전자의 영역 내로 삽입되거나; 또는 i) 제1 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산은 TRAC 도메인을 코딩하는 내인성 TRA 유전자의 영역 내로 삽입되고/거나, ii) 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산은 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입된다.
일부 실시양태에서, 세포는 T 세포이다.
일부 실시양태에서, T 세포는 CD8+ 세포독성 T 림프구 또는 CD3+ pan T 세포이다.
일부 실시양태에서, T 세포는 다중 공여자로부터 유래된 T 세포의 풀의 구성원이다.
일부 실시양태에서, 다중 공여자는 인간 공여자이다.
일부 실시양태에서, 세포는 CTL에 대해 세포독성이다.
또 다른 측면에서, 상기 기재된 실시양태 중 임의의 것에 따른 방법에 의해 생산된 조작된 세포가 본원에서 제공된다.
일부 실시양태에서, 조작된 세포는 CTL에 대해 세포독성이다.
또 다른 측면에서, 이식편 대 숙주 질환 (GvHD) 또는 자가면역 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에서 상기 질환을 치료하는 방법으로서, 상기 기재된 실시양태 중 임의의 것에 따른 조작된 세포를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법이 본원에서 제공된다.
또 다른 측면에서, 유해 CTL-매개된 면역 반응을 특징으로 하는 질환 또는 상태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 상기 질환 또는 상태를 치료하는 방법으로서, a) T 세포의 게놈을 상기 기재된 실시양태 중 임의의 것에 따른 방법에 따라 편집함으로써 조작된 T 세포를 생산하고; b) 조작된 T 세포를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법이 본원에서 제공된다.
일부 실시양태에서, T 세포는 대상체에 대해 자가유래이다.
일부 실시양태에서, T 세포는 대상체에 대해 동종이형이다.
일부 실시양태에서, T 세포는 다중 공여자로부터 유래된 T 세포의 풀을 포함한다.
일부 실시양태에서, 다중 공여자는 인간 공여자이다.
또 다른 측면에서, 유해 CTL-매개된 면역 반응을 특징으로 하는 질환 또는 상태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 상기 질환 또는 상태를 치료하는 방법으로서, 대상체에서의 T 세포의 게놈을 상기 기재된 실시양태 중 임의의 것에 따른 방법에 따라 편집하는 것을 포함하는 방법이 본원에서 제공된다.
일부 실시양태에서, T 세포는 CD8+ 세포독성 T 세포 또는 CD3+ pan T 세포를 포함한다.
일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다.
일부 실시양태에서, 방법은 라파마이신 또는 라파로그를 대상체에게 투여하는 것을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 라파로그는 에베롤리무스, CCI-779, C20-메탈릴라파마이신, C16-(S)-3-메틸인돌라파마이신, C16-iRap, AP21967, 나트륨 미코페놀산, 베니디핀 히드로클로라이드, AP1903, 또는 AP23573, 또는 이들의 대사물, 유도체, 및/또는 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 라파마이신 또는 라파로그는 0.05 nM 내지 500 nM의 농도로 투여된다.
일부 실시양태에서, 질환 또는 상태는 GvHD 또는 자가면역 질환이다.
일부 실시양태에서, 질환 또는 상태는 GvHD이고, 대상체는 이전에 동종이형 이식을 받았다.
일부 실시양태에서, 질환은 제1형 당뇨병 (T1D), 전신 홍반성 루푸스 (SLE), 류마티스성 관절염 (RA), 및 다발성 경화증 (MS)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 자가면역 질환이다.
또 다른 측면에서, 사용에 대한 지침서 및 a) 상기 기재된 실시양태 중 임의의 것에 따른 조작된 세포 및/또는 상기 기재된 실시양태 중 임의의 것에 따른 시스템의 1종 이상의 구성성분; 및/또는 b) 라파마이신 또는 라파로그를 포함하는 키트가 본원에서 제공된다.
일부 실시양태에서, 라파로그는 에베롤리무스, CCI-779, C20-메탈릴라파마이신, C16-(S)-3-메틸인돌라파마이신, C16-iRap, AP21967, 나트륨 미코페놀산, 베니디핀 히드로클로라이드, AP1903, 또는 AP23573, 또는 이들의 대사물, 유도체, 및/또는 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 측면에서, 상기 기재된 실시양태 중 임의의 것에 따른 조작된 세포 또는 상기 기재된 실시양태 중 임의의 것에 따른 시스템의 1종 이상의 구성성분을 포함하는 조성물을 포함하는 시린지가 본원에서 제공된다.
또 다른 측면에서, 상기 기재된 실시양태 중 임의의 것에 따른 조작된 세포 또는 상기 기재된 실시양태 중 임의의 것에 따른 시스템의 1종 이상의 구성성분을 포함하는 조성물을 포함하는 카테터가 본원에서 제공된다.
본 발명의 한 측면은 이식편 대 숙주 질환 (GvHD) 또는 자가면역 질환 또는 유해 CTL-매개된 면역 반응을 특징으로 하는 질환 또는 상태의 치료를 위한 본 발명의 조작된 T 세포의 용도이다. 본 발명의 또 다른 측면은 이식편 대 숙주 질환 (GvHD) 또는 자가면역 질환 또는 유해 CTL-매개된 면역 반응을 특징으로 하는 질환 또는 상태의 치료용 의약의 제조를 위한 본 발명의 조작된 T 세포의 용도이다. 본 발명의 또 다른 측면은 이식편 대 숙주 질환 (GvHD) 또는 자가면역 질환 또는 유해 CTL-매개된 면역 반응을 특징으로 하는 질환 또는 상태의 치료를 위한, 본 발명의 시스템의 용도이다. 본 발명의 또 다른 측면은 이식편 대 숙주 질환 (GvHD) 또는 자가면역 질환 또는 유해 CTL-매개된 면역 반응을 특징으로 하는 질환 또는 상태의 치료용 의약의 제조를 위한 본 발명의 시스템의 용도이다.
본 발명의 또 다른 측면은 이식편 대 숙주 질환 (GvHD) 또는 자가면역 질환 또는 유해 CTL-매개된 면역 반응을 특징으로 하는 질환 또는 상태의 치료를 위한, 본 발명의 가이드 RNA, 또는 본 발명의 벡터, 또는 본 발명의 키트, 또는 본 발명의 시린지, 또는 본 발명의 카테터의 용도이다.
본 발명의 또 다른 측면은 이식편 대 숙주 질환 (GvHD) 또는 자가면역 질환 또는 유해 CTL-매개된 면역 반응을 특징으로 하는 질환 또는 상태의 치료용 의약의 제조를 위한, 본 발명의 가이드 RNA, 또는 본 발명의 벡터, 또는 본 발명의 키트, 또는 본 발명의 시린지, 또는 본 발명의 카테터의 용도이다.
도 1은 10:1, 5:1, 및 1:1의 이펙터-대-표적 비로 공동-배양된 CD3+ WT (TCR 충분한) 또는 TCR KO 이펙터 T 세포 및 REH 표적 세포 (인간 림프모구성 백혈병 세포주)로의 세포독성 검정에 대한 결과를 제시한다.
도 2a는 염료 희석에 의해 결정된 바와 같은 IL-2 단독 (비자극된) 또는 PBMC 공동-배양 (자극된) 조건에서의 β2-마이크로글로불린 키메라 수용체 T 세포 증식에 대한 결과를 제시한다.
도 2b는 CD25 발현에 의해 결정된 바와 같은 IL-2 단독 (비자극된) 또는 PBMC 공동-배양 (자극된) 조건에서의 β2-마이크로글로불린 키메라 수용체 T 세포 활성화에 대한 결과를 제시한다.
도 3은 ELISA에 의해 결정된 바와 같은 IL-2 단독 (비자극된) 또는 PBMC 공동-배양 (자극된) 조건 (5:1 및 1:1의 이펙터-대-표적 세포 비)에서의 β2-마이크로글로불린 키메라 수용체 T 세포 (B2M LNGFR+), TCR KO T 세포 (RNP 단독), 및 대조군 비편집된 T 세포 (EP 단독)에 대한 IFNg 분비에 대한 결과를 제시한다.
도 4는 본 발명의 구축물, pCB0031 (서열식별번호: 19, 20)을 도시한다.
도 5는 본 발명의 구축물, pCB0032 (서열식별번호: 35)를 도시한다.
도 6은 본 발명의 구축물, pCB0033 (서열식별번호: 36)을 도시한다.
도 7은 본 발명의 구축물, pCB0034 (서열식별번호: 25)를 도시한다.
도 8은 본 발명의 구축물, pCB0035 (서열식별번호: 29)를 도시한다.
도 9는 본 발명의 구축물, pCB0036 (서열식별번호: 33)을 도시한다.
도 10은 본 발명의 구축물, pCB0037 (서열식별번호: 31)을 도시한다.
도 11은 본 발명의 구축물, pCB0038 (서열식별번호: 30)을 도시한다.
도 12는 본 발명의 구축물, pCB0039 (서열식별번호: 26)를 도시한다.
도 13은 본 발명의 구축물, pCB0040 (서열식별번호: 32)을 도시한다.
도 14는 본 발명의 구축물, pCB0041 (서열식별번호: 34)을 도시한다.
도 15는 본 발명의 구축물, pCB0042 (서열식별번호: 28)를 도시한다.
도 16은 본 발명의 구축물, pCB0043 (서열식별번호: 27)을 도시한다.
도 17은 본 발명의 구축물, pCB0044 (서열식별번호: 22)를 도시한다.
도 18은 본 발명의 구축물, pCB0045 (서열식별번호: 39)를 도시한다.
도 19는 본 발명의 구축물, pCB0046 (서열식별번호: 40)을 도시한다.
도 20은 실시예 2에 제시된 바와 같은 본 발명의 구축물, pCB0104 (서열식별번호: 65)를 도시한다.
도 21은 실시예 2에 제시된 바와 같은 본 발명의 구축물, pCB0110 (서열식별번호: 66)을 도시한다.
도 22는 실시예 2에 제시된 바와 같은 본 발명의 구축물, pCB0111 (서열식별번호: 67)을 도시한다.
도 23은 실시예 2에 제시된 바와 같은 본 발명의 구축물, pCB0112 (서열식별번호: 68)를 도시한다.
도 24는 본 발명의 구축물, pCB0113 (서열식별번호: 69)을 도시한다.
도 25는 실시예 2에 제시된 바와 같은 본 발명의 구축물, pCB0114 (서열식별번호: 70)를 도시한다.
도 26은 본 발명의 구축물, pCB0115 (서열식별번호: 71)를 도시한다.
도 27은 실시예 2에 제시된 바와 같은 본 발명의 구축물, pCB0116 (서열식별번호: 72)을 도시한다.
도 28은 본 발명의 구축물, pCB0117 (서열식별번호: 73)을 도시한다.
도 29는 본 발명의 구축물, pCB0120 (서열식별번호: 74)을 도시한다.
도 30은 실시예 2에 제시된 바와 같은 본 발명의 구축물, pCB0121 (서열식별번호: 75)을 도시한다.
도 31은 본 발명의 구축물, pCB2042 (서열식별번호: 76)를 도시한다.
도 32는 본 발명의 구축물, pCB2043 (서열식별번호: 77)을 도시한다.
도 33은 본 발명의 구축물, pCB2044 (서열식별번호: 78)를 도시한다.
도 34는 본 발명의 구축물, pCB2045 (서열식별번호: 79)를 도시한다.
도 35는 본 발명의 구축물, pCB2046 (서열식별번호: 80)을 도시한다.
도 36은 실시예 2에 제시된 바와 같은 본 발명의 구축물, pCB2047 (서열식별번호: 81)을 도시한다.
도 37은 본 발명의 구축물, pCB2048 (서열식별번호: 82)을 도시한다.
도 38은 본 발명의 구축물, pCB2049 (서열식별번호: 83)를 도시한다.
도 39는 본 발명의 구축물, pCB2052 (서열식별번호: 84)를 도시한다.
조작된 T 세포의 제어된 생존 및/또는 증식을 허용하는 화학적으로 유도된 신호전달 복합체 (CISC)를 포함하는 조작된 T 세포, 예컨대 조작된 T 세포에 대해 반응성인 세포독성 T 림프구 (CTL)에 대한 세포독성을 부여하는 키메라 수용체를 발현하는 조작된 T 세포, 조작된 T 세포를 제조하고 사용하는 방법, 및 상기 방법에 유용한 조성물이 본원에 기재된다.
본 출원인은 세포 게놈에서의 TRA 유전자 및/또는 IL2RG 유전자 내로의 항-CTL 단백질 및/또는 CISC를 코딩하는 이종 핵산 서열의 표적화된 통합을 위한 일련의 신규한 CRISPR/Cas 시스템을 개발하였으며, 여기서 CISC는 라파마이신 또는 라파마이신 유사체의 결합 시 편집된 세포에서 내인성 TCR 및/또는 IL2RG 발현을 기능적으로 억제하는 이종 핵산 서열의 통합을 이용하여 IL2R-유사 신호전달이 가능하다. TRA 또는 IL2RG를 표적화하는 스페이서 서열을 갖는 가이드 RNA (gRNA)를 온-타겟 및 오프-타겟 절단에 대해 분석하였으며, 이들을 예컨대 세포-기반 요법에서 하류 사용을 위한 후보로 만드는 바람직한 프로파일을 가짐을 밝혀내었다. 1차 인간 T 세포는 항-CTL 단백질을 발현하도록 성공적으로 편집되었다. 이들 발견은 본원에 기재된 CRISPR/Cas 시스템이 질환, 예를 들어, CTL과 연관된 질환을 치료하는데 유용함을 지시한다.
정의
달리 정의되지 않는다면, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 개시내용이 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 언급된 모든 특허, 출원, 공개된 출원 및 다른 간행물은 달리 언급되지 않는다면 그 전문이 명백하게 참조로 포함된다. 본원의 용어에 대한 복수의 정의가 있는 경우에, 달리 언급되지 않는다면 이 섹션에서의 정의가 지배한다.
본원에 사용된 바와 같은 단수 형태는 하나 또는 하나 초과를 의미할 수 있다.
"약"은 본 명세서의 관점에서 읽힐 경우에 그의 분명하고 통상적인 의미를 가지며, 예를 들어, 측정가능한 값을 지칭하는 경우에 사용될 수 있고, 특정된 값으로부터 ±20% 또는 ±10%, ±5%, ±l%, 또는 ±0.1 %의 변이를 포함하는 것으로 의미될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "단백질 서열"은 단백질의 1차 구조인 아미노산의 폴리펩티드 서열을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 "상류"는 폴리뉴클레오티드 상의 위치의 위치 5', 및 폴리펩티드 상의 위치의 N-말단을 향한 위치를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 "하류"는 뉴클레오티드 상의 위치의 위치 3', 및 폴리펩티드 상의 위치의 C-말단을 향한 위치를 지칭한다. 따라서, 용어 "N-말단"은 폴리펩티드 상의 위치의 N-말단을 향한 폴리뉴클레오티드 상의 요소 또는 위치의 위치를 지칭한다.
"핵산" 또는 "핵산 분자"는 폴리뉴클레오티드, 예컨대 데옥시리보핵산 (DNA) 또는 리보핵산 (RNA), 올리고뉴클레오티드, 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 생성된 단편, 및 라이게이션, 절단, 엔도뉴클레아제 작용, 및 엑소뉴클레아제 작용 중 임의의 것에 의해 생성된 단편을 지칭한다. 핵산 분자는 천연-발생 뉴클레오티드 (예컨대 DNA 및 RNA)인 단량체, 또는 천연-발생 뉴클레오티드의 유사체 (예를 들어, 천연-발생 뉴클레오티드의 거울상이성질체 형태), 또는 둘 다의 조합으로 구성될 수 있다. 변형된 뉴클레오티드는 당 모이어티에 및/또는 피리미딘 또는 퓨린 염기 모이어티에 변경을 가질 수 있다. 당 변형은 예를 들어, 1개 이상의 히드록실 기의 할로겐, 알킬 기, 아민 및 아지도 기로의 대체를 포함하거나, 당은 에테르 또는 에스테르로서 관능화될 수 있다. 더욱이, 전체 당 모이어티는 입체적으로 및 전자적으로 유사한 구조, 예컨대 아자-당 및 카르보시클릭 당 유사체로 대체될 수 있다. 염기 모이어티에서의 변형의 예로는 알킬화된 퓨린 및 피리미딘, 아실화된 퓨린 또는 피리미딘, 또는 다른 널리 공지된 헤테로시클릭 치환기를 들 수 있다. 핵산 단량체는 포스포디에스테르 결합 또는 이러한 연결의 유사체에 의해 연결될 수 있다. 포스포디에스테르 연결의 유사체는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포르아닐리데이트, 포스포르아미데이트 등을 포함한다. 용어 "핵산 분자"는 또한 폴리아미드 백본에 부착된 천연-발생 또는 변형된 핵산 염기를 포함하는 소위 "펩티드 핵산"을 포함한다. 핵산은 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 제공된다. 일부 실시양태에서, 핵산은 RNA 또는 DNA이다.
"코딩하는" 또는 "코딩"은 본원에 사용되며, 다른 거대분자, 예컨대 아미노산의 한정된 서열의 합성을 위한 주형으로서 기능하는 폴리뉴클레오티드에서 뉴클레오티드의 특이적 서열, 예컨대 유전자, cDNA, 또는 mRNA의 특성을 지칭한다. 따라서, 유전자는, 그 유전자에 상응하는 mRNA의 전사 및 번역이 세포 또는 다른 생물학적 시스템에서 단백질을 생산하는 경우에, 단백질을 코딩한다.
"폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열"은 서로의 축중성 버전이며, 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 모든 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질을 코딩하는 핵산이 제공된다.
"벡터", "발현 벡터", 또는 "구축물"은 세포에서 이종 핵산의 발현을 제공하는 조절 요소를 갖는 세포 내로 이종 핵산을 도입하는데 사용되는 핵산이다. 벡터는 플라스미드, 미니서클, 효모, 및 바이러스 게놈을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 벡터는 플라스미드, 미니서클, 효모, 또는 바이러스 게놈이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 아데노-연관된 바이러스 (AAV) 벡터이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 박테리아 시스템, 예컨대 이. 콜라이 (E. coli)에서의 단백질 발현을 위한 것이다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "발현", 또는 "단백질 발현"은 전사된 RNA 분자의 단백질 분자로의 번역을 지칭한다. 단백질 발현은 시간적, 공간적, 발달적, 또는 형태학적 질 뿐만 아니라 정량적 또는 정성적 지시를 특징으로 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단백질 또는 단백질들은 단백질이 리간드의 존재 하에서 이량체화를 위해 위치되도록 발현된다.
본원에 사용된 바와 같은 "융합 단백질" 또는 "키메라 단백질"은 원래 별개의 단백질 또는 단백질의 부분을 코딩하는 2개 이상의 유전자의 연결을 통해 생성된 단백질이다. 융합 단백질은 또한 2개 이상의 별개의 단백질로부터의 특이적 단백질 도메인으로 구성될 수 있다. 이 융합 유전자의 번역은 각각의 원래 단백질로부터 유래된 기능적 특성을 갖는 단일 또는 다중 폴리펩티드를 발생시킬 수 있다. 재조합 융합 단백질은 생물학적 연구 또는 치료에 사용하기 위해 재조합 DNA 기술에 의해 인공적으로 생성될 수 있다. 융합 단백질을 생성하는 이러한 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 일부 융합 단백질은 전체 펩티드를 조합하며, 따라서 원래 단백질의 모든 도메인, 특히 기능적 도메인을 함유할 수 있다. 그러나, 다른 융합 단백질, 특히 비-천연 발생인 것들은 단지 코딩 서열의 부분을 조합하며, 따라서 그들을 형성한 모 유전자의 원래 기능을 유지하지 않는다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "조절 요소"는 유전자 조절 활성을 갖는 DNA 분자, 예를 들어, 작동적으로 연결된 전사가능한 DNA 분자의 전사 및/또는 번역에 영향을 미치는 능력을 갖는 것을 지칭한다. 조절 요소, 예컨대 프로모터, 리더, 인트론, 및 전사 종결 영역은 유전자 조절 활성을 가지며, 살아 있는 세포에서 유전자의 전체적인 발현에서 필수적인 역할을 하는 DNA 분자이다. 따라서, 식물에서 기능하는 단리된 조절 요소, 예컨대 프로모터는 유전 공학의 방법을 통해 식물 표현형을 변형시키는데 유용하다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "작동적으로 연결된"은 제2 분자에 연결된 제1 분자를 지칭하며, 여기서 분자는 제1 분자가 제2 분자의 기능에 영향을 미치도록 배열된다. 2개의 분자는 단일 인접한 분자의 일부일 수 있으며, 인접할 수 있다. 예를 들어, 프로모터는, 프로모터가 세포에서 관심의 전사가능한 DNA 분자의 전사를 조정하는 경우에, 전사가능한 DNA 분자에 작동적으로 연결된다.
본원에 사용된 바와 같은 단백질 또는 핵산 서열은 그의 특징 및/또는 성능이 특히 야생형 또는 기존의 서열에 비해 일부 방식으로 개선되는 경우에 "최적화된다". 예를 들어, 핵산 서열이 그것이 보다 높은 발현, 또는 보다 효율적인 통합, 또는 보다 적은 오프 타겟 상호작용을 나타내도록 변경되는 경우에, 이는 최적화된 것으로 이야기될 수 있다. 서열은 "최량의" 성능을 나타내지 않고 "최적화될" 수 있다: 이는 "최적"일 필요는 없다.
"프로모터"는 특이적 유전자의 전사를 개시하는 DNA의 영역이다. 프로모터는 유전자의 전사 시작 부위 부근에, 동일한 가닥 상에 및 DNA 상의 상류 (센스 가닥의 5' 영역)에 위치할 수 있다. 프로모터는 조건적, 유도성 또는 구성적 프로모터일 수 있다. 프로모터는 박테리아, 포유동물 또는 곤충 세포 단백질 발현에 대해 특이적일 수 있다. 융합 단백질을 코딩하는 핵산이 제공되는 일부 실시양태에서, 핵산은 프로모터 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 박테리아, 포유동물 또는 곤충 세포 단백질 발현에 대해 특이적이다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 조건적, 유도성 또는 구성적 프로모터이다.
본원에 사용된 바와 같은 "RNA-가이드된 엔도뉴클레아제", "RGEN", "Cas 엔도뉴클레아제", 또는 "Cas 뉴클레아제"는 예를 들어, CRISPR (군집화된 규칙적으로 간격화된 짧은 회문구조 반복부) 적응성 면역계와 연관된 RNA-가이드된 DNA 엔도뉴클레아제 효소를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본원에서, "RGEN" 또는 "Cas 엔도뉴클레아제"는 천연-발생 및 재조합 Cas 엔도뉴클레아제 둘 다를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 "이량체성 화학적으로 유도된 신호전달 복합체", "이량체성 CISC", 또는 "이량체"는 함께 연결되는 융합 단백질 복합체일 수 있거나 그렇지 않을 수 있는 CISC의 2개의 구성성분을 지칭한다. "이량체화"는 2개의 별개의 실체를 단일 실체로 함께 연결하는 프로세스를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 리간드 또는 작용제는 이량체화를 자극한다. 일부 실시양태에서, 이량체화는 동종이량체화, 또는 2개의 동일한 실체, 예컨대 2개의 동일한 CISC 구성성분의 연결을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 이량체화는 2개의 상이한 실체, 예컨대 2개의 상이하고 별개의 CISC 구성성분의 연결의 이종이량체화를 지칭한다. 일부 실시양태에서, CISC 구성성분의 이량체화는 세포성 신호전달 경로를 발생시킨다. 일부 실시양태에서, CISC 구성성분의 이량체화는 세포 또는 세포의 집단의 선택적 확장을 허용한다. 추가의 CISC 시스템은 CISC 지베렐린 CISC 이량체화 시스템, 또는 SLF-TMP CISC 이량체화 시스템을 포함할 수 있다. 다른 화학적 유도성 이량체화 (CID) 시스템 및 구성성분 부분은 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "화학적으로 유도된 신호전달 복합체" 또는 "CISC"는 리간드-유도된 이량체화의 직접적인 결과로서 세포의 내부 내로 신호를 개시하는 조작된 복합체를 지칭한다. CISC는 동종이량체 (2개의 동일한 구성성분의 이량체화) 또는 이종이량체 (2개의 별개의 구성성분의 이량체화)일 수 있다. 따라서, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "동종이량체"는 동일한 아미노산 서열을 갖는 본원에 기재된 2개의 단백질 구성성분의 이량체를 지칭한다. 용어 "이종이량체"는 비-동일한 아미노산 서열을 갖는 본원에 기재된 2개의 단백질 구성성분의 이량체를 지칭한다.
CISC는 본원에 보다 상세히 기재된 바와 같은 합성 복합체일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 "합성"은 천연이 아니거나, 자연에서 발견되지 않는 본원에 기재된 바와 같은 복합체, 단백질, 이량체, 또는 조성물을 지칭한다. 일부 실시양태에서, IL2R-CISC는 인터류킨-2 수용체 구성성분을 포함하는 신호전달 복합체를 지칭한다. 일부 실시양태에서, IL2/15-CISC는 인터류킨-2 및 인터류킨-15에 의해 공유된 수용체 신호전달 서브유닛을 포함하는 신호전달 복합체를 지칭한다. 일부 실시양태에서, IL7-CISC는 인터류킨-7 수용체 구성성분을 포함하는 신호전달 복합체를 지칭한다. 따라서, CISC는 주어진 CISC의 구성성분을 구성하는 구성성분 부분에 따라 용어화될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 화학적으로 유도된 신호전달 복합체의 구성성분 부분이 CISC 내로의 혼입에 유용한 천연 또는 합성 구성성분으로 구성될 수 있음을 인식할 것이다. 따라서, 본원에서 제공된 예는 제한적인 것으로 의도되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같은 "시토카인 수용체"는 시토카인을 인식하고 그에 결합하는 수용체 분자를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 시토카인 수용체는 시토카인 수용체 아미노산 및/또는 핵산 서열에 대한 치환, 결실, 및/또는 부가를 갖는 것들을 포함하는 변형된 시토카인 수용체 분자 (예를 들어, "변이체 시토카인 수용체")를 포괄한다. 따라서, 상기 용어는 야생형, 뿐만 아니라, 재조합, 합성적으로-생산된, 및 변이체 시토카인 수용체를 포괄하는 것으로 의도된다. 일부 실시양태에서, 시토카인 수용체는 세포외 결합 도메인, 힌지 도메인, 막횡단 도메인, 및 신호전달 도메인을 포함하는 융합 단백질이다. 일부 실시양태에서, 수용체의 구성성분 (즉, 수용체의 도메인)은 천연 또는 합성이다. 일부 실시양태에서, 도메인은 인간 유래된 도메인이다.
본원에 사용된 바와 같은 "FKBP"는 FK506 결합 단백질이다. FKBP는 프롤릴 이소머라제 활성을 갖는 단백질의 패밀리를 지칭하며, 아미노산 서열에서는 아니지만 기능에서 시클로필린과 관련된다. FKBP는 효모부터 인간까지 많은 진핵생물에서 확인되었으며, 프롤린 잔기를 함유하는 단백질에 대한 단백질 폴딩 샤페론으로서 기능한다. 시클로필린과 함께, FKBP는 이뮤노필린 패밀리에 속한다. 용어 FKBP는 예를 들어, FKBP12 뿐만 아니라, 그의 동족체 및 그의 기능적 단백질 단편을 포함하여, 유전자 AIP; AIPL1; FKBP1A; FKBP1B; FKBP2; FKBP3; FKBP5; FKBP6; FKBP7; FKBP8; FKBP9; FKBP9L; FKBP10; FKBP11; FKBP14; FKBP15; FKBP52; 및/또는 LOC541473에 의해 코딩되는 단백질을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 "FRB"는 FKBP 라파마이신 결합 도메인이다. FRB 도메인은 FKBP 단백질 및 라파마이신 또는 그의 라파로그와 3부분 복합체를 형성하도록 구성된 폴리펩티드 영역 (단백질 "도메인")이다. FRB 도메인은 인간 및 다른 종으로부터의 mTOR 단백질 (또한 문헌에서 FRAP, RAPT1, 또는 RAFT로 지칭됨); Tor1 및/또는 Tor2를 포함하는 효모 단백질; 및 칸디다 (Candida) FRAP 동족체를 포함하는 다수의 천연 발생 단백질에 존재한다. FKBP 및 FRB 둘 다는 포유동물 라파마이신의 표적 (mTOR) 신호전달에서의 주요한 구성요소이다.
용어 "네이키드 FKBP 라파마이신 결합 도메인 폴리펩티드", "네이키드 FRB 도메인 폴리펩티드", "FKBP 라파마이신 결합 도메인 폴리펩티드" 및 "FRB 도메인 폴리펩티드"는 모두 단백질의 아미노산의 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%가 FRB 도메인의 아미노산인 FRB 도메인 또는 단백질의 아미노산만을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. FRB 도메인은 12 kDa 가용성 단백질로서 발현될 수 있다 (Chen et al., 1995, Proc Nat'l Acad Sci USA, 92:4947). FRB 도메인은 구상 단백질에서의 통상적인 구조적 모티프인 4개의 나선 번들을 형성한다. 그의 전체적인 치수는 30 Å x 45 Å x 30 Å이며, 모든 4개의 나선은 시토크롬 b562 폴드와 유사한 짧은 언더핸드 연결을 갖는다 (Choi et al., 1996, Science, 273:239-42). 일부 실시양태에서, 네이키드 FRB 도메인은 서열식별번호: 56 또는 57의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 접근법에 사용되는 면역조정성 이미드 약물은 탈리도미드를 포함할 수 있다 (유사체, 유도체를 포함하고, 그의 제약상 허용되는 염을 포함함). 탈리도미드는 이뮤노프린 (Immunoprin), 탈로미드 (Thalomid), 탈리덱스 (Talidex), 탈리저 (Talizer), 뉴로세딘 (Neurosedyn), α-(N-프탈이미도)글루타르이미드, 2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-2,3-디히드로-1H-이소인돌-1,3-디온); 포말리도미드를 포함할 수 있다 (유사체, 유도체를 포함하고, 그의 제약상 허용되는 염을 포함함). 포말리도미드는 포말리스트 (Pomalyst), 임노비드 (Imnovid), (RS)-4-아미노-2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)이소인돌-1,3-디온); 레날리도미드를 포함할 수 있다 (유사체, 유도체를 포함하고, 그의 제약상 허용되는 염을 포함함). 레날리도미드는 레브리미드 (Revlimid), (RS)-3-(4-아미노-1-옥소-1,3-디히드로-2H-이소인돌-2-일)피페리딘-2,6-디온); 또는 아프레밀라스트를 포함할 수 있다 (유사체, 유도체를 포함하고, 그의 제약상 허용되는 염을 포함함). 아프레밀라스트는 오테즐라 (Otezla), CC-10004, N-{2-[(1S)-1-(3-에톡시-4-메톡시페닐)-2-(메틸술포닐)에틸]-1,3-디옥소-2,3-디히드로-1H-이소인돌-4-일}아세트아미드); 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "세포외 결합 도메인"은 세포의 외부이며, 특이적 원자 또는 분자에 결합하도록 구성된 복합체의 도메인을 지칭한다. 일부 실시양태에서, CISC의 세포외 결합 도메인은 FKBP 도메인 또는 그의 부분이다. 일부 실시양태에서, 세포외 결합 도메인은 FRB 도메인 또는 그의 부분이다. 일부 실시양태에서, 세포외 결합 도메인은 리간드 또는 작용제에 결합함으로써, 2개의 CISC 구성성분의 이량체화를 자극하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 세포외 결합 도메인은 시토카인 수용체 조정제에 결합하도록 구성된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "시토카인 수용체 조정제"는 시토카인 수용체의 하류 표적의 인산화, 시토카인 수용체와 연관된 신호 전달 경로의 활성화, 및/또는 특정 단백질, 예컨대 시토카인의 발현을 조정하는 작용제를 지칭한다. 이러한 작용제는 시토카인 수용체의 하류 표적의 인산화, 시토카인 수용체와 연관된 신호 전달 경로의 활성화, 및/또는 특정 단백질, 예컨대 시토카인의 발현을 직접적으로 또는 간접적으로 조정할 수 있다. 따라서, 시토카인 수용체 조정제의 예로는 시토카인 수용체 또는 그의 단편에 면역특이적으로 결합하는 시토카인, 시토카인의 단편, 융합 단백질 및/또는 항체 또는 그의 결합 부분을 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 시토카인 수용체 조정제의 예로는 시토카인 또는 그의 단편에 면역특이적으로 결합하는 펩티드, 폴리펩티드 (예를 들어, 가용성 시토카인 수용체), 융합 단백질 및/또는 항체 또는 그의 결합 부분을 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "활성화시키다"는 관심의 단백질의 적어도 1종의 생물학적 활성의 증가를 지칭한다. 유사하게, 용어 "활성화"는 증가된 활성의 상태인 관심의 단백질의 상태를 지칭한다. 용어 "활성화가능한"은 신호, 작용제, 리간드, 화합물, 또는 자극의 존재 하에서 활성화되는 관심의 단백질의 능력을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 이량체는 신호, 작용제, 리간드, 화합물, 또는 자극의 존재 하에서 활성화되며, 신호전달 적격 이량체가 된다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "신호전달 적격"은 하류 신호전달 경로를 개시하거나 지속할 수 있도록 하는 이량체의 능력 또는 구성을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "힌지 도메인"은 세포외 결합 도메인을 막횡단 도메인에 연결하며, 세포외 결합 도메인에 유연성을 부여할 수 있는 도메인을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 힌지 도메인은 세포외 도메인을 형질막에 가깝게 위치시켜 항체 또는 그의 결합 단편에 의한 인식을 위한 잠재성을 최소화한다. 일부 실시양태에서, 세포외 결합 도메인은 힌지 도메인에 대해 N-말단에 위치한다. 일부 실시양태에서, 힌지 도메인은 천연 또는 합성일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "막횡단 도메인" 또는 "TM 도메인"은 막에서, 예컨대 세포막에서 안정한 도메인을 지칭한다. 용어 "막횡단 스팬", "통합 단백질", 및 "통합 도메인"은 또한 본원에 사용된다. 일부 실시양태에서, 힌지 도메인 및 세포외 도메인은 막횡단 도메인에 대해 N-말단에 위치한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 천연 또는 합성 도메인이다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 IL-2 수용체 막횡단 도메인이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "신호전달 도메인"은 세포, 예컨대 포유동물 세포 내부의 신호전달 캐스케이드에 관여하는 융합 단백질 또는 CISC 구성성분의 도메인을 지칭한다. 신호전달 도메인은 예를 들어 TCR/CD3 복합체의 CD3 제타 쇄에 의해 제공되는 1차 신호 외에도, 활성화, 증식, 분화, 및/또는 시토카인 분비를 포함하나 이에 제한되지는 않는 세포성 반응, 예컨대 T-세포 반응을 매개하는 신호를 세포, 예컨대 T-세포에 제공하는 신호전달 모이어티를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 신호전달 도메인은 막횡단 도메인, 힌지 도메인, 및 세포외 도메인에 대해 N-말단이다. 일부 실시양태에서, 신호전달 도메인은 합성 또는 천연 도메인이다. 일부 실시양태에서, 신호전달 도메인은 연쇄된 세포질 신호전달 도메인이다. 일부 실시양태에서, 신호전달 도메인은 시토카인 신호전달 도메인이다. 일부 실시양태에서, 신호전달 도메인은 항원 신호전달 도메인이다. 일부 실시양태에서, 신호전달 도메인은 인터류킨-2 수용체 서브유닛 감마 (IL2Rγ 또는 IL2RG) 도메인이다. 일부 실시양태에서, 신호전달 도메인은 인터류킨-2 수용체 서브유닛 베타 (IL2Rβ 또는 IL2RB) 도메인이다. 일부 실시양태에서, 세포외 결합 도메인에의 작용제 또는 리간드의 결합은 CISC 구성성분의 이량체화의 결과로서 신호전달 경로의 활성화에 의해 신호전달 도메인을 통한 신호 전달을 유발한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "신호 전달"은 세포외 도메인에 결합하는 리간드 또는 작용제에 의한 신호전달 경로의 활성화를 지칭한다. 신호의 활성화는 CISC 이량체화를 발생시키는, 리간드 또는 작용제에의 세포외 도메인의 결합의 결과이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "IL2RB" 또는 "IL2Rβ"는 인터류킨-2 수용체 서브유닛 베타를 지칭한다. 유사하게, 용어 "IL2RG" 또는 IL2Rγ"는 인터류킨-2 수용체 서브유닛 감마를 지칭하고, 용어 "IL2RA" 또는 "IL2Rα"는 인터류킨-2 수용체 서브유닛 알파를 지칭한다. IL-2 수용체는 3가지 형태, 또는 쇄, 즉, 알파, 베타, 및 감마를 가지며, 이는 또한 다른 시토카인에 대한 수용체에 대한 서브유닛이다. IL2Rβ 및 IL2Rγ는 유형 I 시토카인 수용체 패밀리의 구성원이다. 본원에 사용된 바와 같은 "IL2R"은 T 세포-매개된 면역 반응에 관여하는 인터류킨-2 수용체를 지칭한다. IL2R은 수용체-매개된 세포내이입 및 인터류킨 2로부터의 분열촉진성 신호의 전달에 관여한다. 유사하게, 용어 "IL-2/15R"은 IL-2 및 IL-15에 의해 공유된 수용체 신호전달 서브유닛을 지칭하며, 서브유닛 알파 (IL2/15RA 또는 IL2/15Rα), 베타 (IL2/15RB 또는 IL2/15Rβ), 또는 감마 (IL2/15Rg 또는 IL2/15Rγ)를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 화학적으로 유도된 신호전달 복합체는 2개의 구성성분을 포함하는 이종이량체화 신호전달 복합체이다. 일부 실시양태에서, 제1 구성성분은 이종이량체화 쌍의 한 부분인 세포외 결합 도메인, 임의적 힌지 도메인, 막횡단 도메인, 및 1개 이상의 연쇄된 세포질 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 구성성분은 이종이량체화 쌍의 다른 부분인 세포외 결합 도메인, 임의적 힌지 도메인, 막횡단 도메인, 및 1개 이상의 연쇄된 세포질 신호전달 도메인을 포함한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 2가지 별개의 변형 사건이 있다. 일부 실시양태에서, 2개의 CISC 구성성분은 세포, 예컨대 포유동물 세포에서 발현된다. 일부 실시양태에서, 세포, 예컨대 포유동물 세포, 또는 세포의 집단, 예컨대 포유동물 세포의 집단은 이종이량체화를 유발하는 리간드 또는 작용제와 접촉됨으로써 신호를 개시한다. 일부 실시양태에서, 동종이량체화 쌍은 이량체화하며, 그에 의해 단일 CISC 구성성분은 세포, 예컨대 포유동물 세포에서 발현되고, CISC 구성성분은 동종이량체화하여 신호를 개시한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "리간드" 또는 "작용제"는 바람직한 생물학적 효과를 갖는 분자를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 리간드는 세포외 결합 도메인에 의해 인식되고, 그에 의해 결합되어, 리간드 및 2개의 결합 CISC 구성성분을 포함하는 3부분 복합체를 형성한다. 리간드는 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 번역후 변형된 단백질, 항체, 그의 결합 부분을 포함하나 이에 제한되지는 않는 단백질성 분자; 소분자 (1000 달톤 미만), 무기 또는 유기 화합물; 및 이중-가닥 또는 단일-가닥 DNA, 또는 이중-가닥 또는 단일-가닥 RNA (예를 들어, 안티센스, RNAi 등), 압타머, 뿐만 아니라, 3중 나선 핵산 분자를 포함하나 이에 제한되지는 않는 핵산 분자를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 리간드는 임의의 공지된 유기체 (동물 (예를 들어, 포유동물 (인간 및 비-인간 포유동물)), 식물, 박테리아, 진균, 및 원생생물, 또는 바이러스를 포함하나 이에 제한되지는 않음)로부터 또는 합성 분자의 라이브러리로부터 유래되거나 얻어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 리간드는 단백질, 항체 또는 그의 부분, 소분자, 또는 약물이다. 일부 실시양태에서, 리간드는 라파마이신 또는 라파마이신 유사체 (라파로그)이다. 일부 실시양태에서, 라파로그는 라파마이신에 비해 하기 변형 중 1종 이상을 갖는 라파마이신의 변이체를 포함한다: C7, C42 및/또는 C29에서의 탈메틸화, 메톡시의 제거 또는 대체; C13, C43 및/또는 C28에서의 히드록시의 제거, 유도체화 또는 대체; C14, C24 및/또는 C30에서의 케톤의 환원, 제거 또는 유도체화; 6-원 피페콜레이트 고리의 5-원 프롤릴 고리로의 대체; 및 시클로헥실 고리 상의 대안적 치환 또는 시클로헥실 고리의 치환된 시클로펜틸 고리로의 대체. 따라서, 일부 실시양태에서, 라파로그는 에베롤리무스, 메릴리무스, 노볼리무스, 피메크롤리무스, 리다포롤리무스, 타크롤리무스, 템시롤리무스, 우미롤리무스, 조타롤리무스, CCI-779, C20-메탈릴라파마이신, C16-(S)-3-메틸인돌라파마이신, C16-iRap, AP21967, 나트륨 미코페놀산, 베니디핀 히드로클로라이드, AP23573, 또는 AP1903, 또는 이들의 대사물, 유도체, 및/또는 조합이다. 일부 실시양태에서, 리간드는 IMID-부류 약물 (예를 들어 탈리도미드, 포말리도미드, 레날리도미드 또는 관련된 유사체)이다.
따라서, 일부 실시양태에서, 신호전달 복합체의 화학적 유도를 위해 본원에 기재된 접근법에 사용되는 리간드 또는 작용제는 라파마이신을 포함할 수 있다 (유사체, 유도체를 포함하고, 그의 제약상 허용되는 염을 포함함). 라파마이신은 시롤리무스 (Sirolimus), 라파뮨 (Rapamune), (3S,6R,7E,9R,10R,12R,14S,15E,17E,19E,21S,23S,26R,27R,34aS)-9,10,12,13,14,21,22,23,24,25,26,27,32,33,34,34a-헥사데카히드로-9,27-디히드록시-3-[(1R)-2-[(1S,3R,4R)-4-히드록시-3-메톡시시클로헥실]-1-메틸에틸]-10,21-디메톡시-6,8,12,14,20,26-헥사메틸-23,27-에폭시-3H-피리도[2,1-c][1,4] 옥사아자시클로헨트리아콘틴-1,5,11,28,29 (4H,6H,31H)-펜톤); 에베롤리무스를 포함할 수 있다 (유사체, 유도체를 포함하고, 그의 제약상 허용되는 염을 포함함). 에베롤리무스는 RAD001, 조르트레스 (Zortress), 세르티칸 (Certican), 아피니토르 (Afinitor), 보투비아 (Votubia), 42-O-(2-히드록시에틸)라파마이신, (1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28E,30S,32S,35R)-1,18-디히드록시-12-[(2R)-1-[(1S,3R,4R)-4-(2-히드록시에톡시)-3-메톡시시클로헥실]프로판-2-일]-19,30-디메톡시-15,17,21,23,29,35-헥사메틸-11,36-디옥사-4-아자트리시클로[30.3.1.0(4,9)]헥사트리아콘타-16,24,26,28-테트라엔-2,3,10,14,20-펜톤); 메릴리무스를 포함할 수 있다 (유사체, 유도체를 포함하고, 그의 제약상 허용되는 염을 포함함). 메릴리무스는 SAR943, 42-O-(테트라히드로푸란-3-일)라파마이신 (메릴리무스-1); 42-O-(옥세탄-3-일)라파마이신 (메릴리무스-2), 42-O-(테트라히드로피란-3-일)라파마이신 (메릴리무스-3), 42-O-(4-메틸, 테트라히드로푸란-3-일)라파마이신, 42-O-(2,5,5-트리메틸, 테트라히드로푸란-3-일) 라파마이신, 42-O-(2,5-디에틸-2-메틸, 테트라히드로푸란-3-일)라파마이신, 42-O-(2H-피란-3-일, 테트라히드로-6-메톡시-2-메틸)라파마이신, 또는 42-O-(2H-피란-3-일, 테트라히드로-2,2-디메틸-6-페닐)라파마이신); 노볼리무스를 포함할 수 있다 (유사체, 유도체를 포함하고, 그의 제약상 허용되는 염을 포함함). 노볼리무스는 16-O-데메틸 라파마이신); 피메크롤리무스를 포함할 수 있다 (유사체, 유도체를 포함하고, 그의 제약상 허용되는 염을 포함함). 피메크롤리무스는 엘리델 (Elidel), (3S,4R,5S,8R,9E,12S,14S,15R,16S,18R,19R,26aS)-3-((E)-2-((1R,3R,4S)-4-클로로-3 메톡시시클로헥실)-1-메틸비닐)-8-에틸 5,6,8,11,12,13,14,15,16,17,18,19,24,26,26a헥사데카히드로-5,19-에폭시-3H-피리도(2,1-c)(1,4)옥사아자시클로트리코신-1,17,20,21(4H,23H)-테트론 33-에피-클로로-33-데스옥시아스코미신); 리다포롤리무스를 포함할 수 있다 (유사체, 유도체를 포함하고, 그의 제약상 허용되는 염을 포함함). 리다포롤리무스는 AP23573, MK-8669, 데포롤리무스, (1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28E,30S,32S,35R)-12-((1R)-2-((1S,3R,4R)-4-((디메틸포스피노일)옥시)-3-메톡시시클로헥실)-1-메틸에틸)-1,18-디히드록시-19,30-디메톡시15,17,21,23,29,35-헥사메틸-11,36-디옥사-4-아자트리시클로(30.3.1.04,9)헥사트리아콘타-16,24,26,28-테트라엔-2,3,10,14,20-펜톤); 타크롤리무스를 포함할 수 있다 (유사체, 유도체를 포함하고, 그의 제약상 허용되는 염을 포함함). 타크롤리무스는 FK-506, 푸지마이신, 프로그라프 (Prograf), 아드바그라프 (Advagraf), 프로토픽, 3S-[3R*[E(1S*,3S*,4S*)],4S*,5R*,8S*,9E,12R*,14R*,15S*,16R*,18S*,19S*,26aR*5,6,8,11,12,13,14,15,16,17,18,19,24,25,26,26a-헥사데카히드로-5,19-디히드록시-3-[2-(4-히드록시-3-메톡시시클로헥실)-1-메틸에테닐]-14,16-디메톡시-4,10,12,18-테트라메틸-8-(2-프로페닐)-15,19-에폭시-3H-피리도[2,1-c] [1,4] 옥사아자시클로트리코신-1,7,20,21(4H,23H)-테트론, 모노히드레이트); 템시롤리무스를 포함할 수 있다 (유사체, 유도체를 포함하고, 그의 제약상 허용되는 염을 포함함). 템시롤리무스는 CCI-779, CCL-779, 토리셀 (Torisel), (1R,2R,4S)-4-{(2R)-2-[(3S,6R,7E,9R,10R,12R,14S,15E,17E,19E,21S,23S,26R,27R,34aS)-9,27-디히드록시-10,21-디메톡시-6,8,12,14,20,26-헥사메틸-1,5,11,28,29-펜타옥소-1,4,5,6,9,10,11,12,13,14,21,22,23,24,25,26,27,28,29,31,32,33,34,34a-테트라코사히드로-3H-23,27-에폭시피리도[2,1-c][1,4]옥사자시클로헨트리아콘틴-3-일]프로필}-2-메톡시시클로헥실 3-히드록시-2-(히드록시메틸)-2-메틸프로파노에이트); 우미롤리무스를 포함할 수 있다 (유사체, 유도체를 포함하고, 그의 제약상 허용되는 염을 포함함). 우미롤리무스는 비올리무스 (Biolimus), 비올리무스 A9, BA9, TRM-986, 42-O-(2-에톡시에틸)라파마이신); 조타롤리무스를 포함할 수 있다 (유사체, 유도체를 포함하고, 그의 제약상 허용되는 염을 포함함). 조타롤리무스는 ABT-578, (42S)-42-데옥시-42-(1H-테트라졸-1-일)-라파마이신); C20-메탈릴라파마이신을 포함할 수 있다 (유사체, 유도체를 포함하고, 그의 제약상 허용되는 염을 포함함). C20-메탈릴라파마이신은 C20-마라프); C16-(S)-3-메틸인돌라파마이신을 포함할 수 있다 (유사체, 유도체를 포함하고, 그의 제약상 허용되는 염을 포함함). C16-(S)-3-메틸인돌라파마이신은 C16-iRap); AP21967을 포함할 수 있다 (유사체, 유도체를 포함하고, 그의 제약상 허용되는 염을 포함함). AP21967은 C-16-(S)-7-메틸인돌라파마이신); 나트륨 미코페놀산을 포함할 수 있다 (유사체, 유도체를 포함하고, 그의 제약상 허용되는 염을 포함함). 나트륨 미코페놀산은 셀셉트 (CellCept), 미포르틱 (Myfortic), (4E)-6-(4-히드록시-6-메톡시-7-메틸-3-옥소-1,3-디히드로-2-벤조푸란-5-일)-4-메틸헥스-4-엔산); 베니디핀 히드로클로라이드를 포함할 수 있다 (유사체, 유도체를 포함하고, 그의 제약상 허용되는 염을 포함함). 베니디핀 히드로클로라이드는 베니디피눔 (Benidipinum), 코니엘 (Coniel)); 또는 AP1903을 포함할 수 있다 (유사체, 유도체, 및 그의 제약상 허용되는 염을 포함함. AP1903은 리미두시드 (Rimiducid), [(1R)-3-(3,4-디메톡시페닐)-1-[3-[2-[2-[[2-[3-[(1R)-3-(3,4-디메톡시페닐)-1-[(2S)-1-[(2S)-2-(3,4,5-트리메톡시페닐)부타노일]피페리딘-2-카르보닐]옥시프로필]페녹시]아세틸]아미노]에틸아미노]-2-옥소에톡시]페닐]프로필] (2S)-1-[(2S)-2-(3,4,5-트리메톡시페닐)부타노일]피페리딘-2-카르복실레이트); 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "지베렐린"은 플라스티드에서 테르페노이드 경로에 의해 합성된 후, 그들이 그들의 생물학적-활성 형태에 도달할 때까지 세포질 세망 및 시토졸에서 변형되는 디테르페노이드 산의 합성 또는 천연 발생 형태를 지칭한다. 지베렐린은 지베렐린 1 (GA1), GA2, GA3 . . . GA136, 및 그의 유사체 및 유도체를 비롯한, 예를 들어, 엔트-지베렐란 골격으로부터 유래되거나, 또는 엔트-카우렌을 통해 합성된 지베렐린을 비롯한 천연 지베렐린 또는 그의 유사체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 지베렐린 또는 그의 유사체 또는 유도체는 CISC 이량체화에 이용된다.
본원에 사용된 바와 같은 "SLF-TMP" 또는 "트리메토프림에 연결된 FKBP의 합성 리간드"는 CISC 이량체화를 위한 이량체화제를 지칭한다. 일부 실시양태에서, SLF 모이어티는 제1 CISC 구성성분에 결합하고, TMP 모이어티는 제2 CISC 구성성분에 결합하여 CISC 이량체화를 유발한다. 일부 실시양태에서, SLF는 예를 들어, FKBP에 결합할 수 있고, TMP는 이. 콜라이 디히드로폴레이트 리덕타제 (eDHFR)에 결합할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "동시 결합"은 CISC 구성성분 및 리간드 구성성분을 포함하는 다구성성분 복합체를 형성하고, 후속 신호 활성화를 발생시키는, 동시에 또는, 일부의 경우에, 실질적으로 동시에 2개 이상의 CISC 구성성분에 의한 리간드의 결합을 지칭한다. 동시 결합은 CISC 구성성분이 단일 리간드에 공간적으로 결합하도록 구성되고, 또한 둘 다의 CISC 구성성분이 동일한 리간드 상의 상이한 모이어티에를 비롯한 동일한 리간드에 결합하도록 구성되는 것을 요구한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "선택적 확장"은 확장되는 바람직한 세포, 예컨대 포유동물 세포, 또는 바람직한 세포의 집단, 예컨대 포유동물 세포의 집단의 능력을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 선택적 확장은 2가지 유전적 변형 사건을 겪은 세포, 예컨대 포유동물 세포의 순수한 집단의 생성 또는 확장을 지칭한다. 이량체화 CISC의 한 구성성분은 하나의 변형의 일부이고, 다른 구성성분은 다른 변형이다. 따라서, 이종이량체화 CISC의 한 구성성분은 각각의 유전적 변형과 연관된다. 리간드에의 세포의 노출은 단지 둘 다의 바람직한 변형을 갖는 세포, 예컨대 포유동물 세포의 선택적 확장을 허용한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 단지 리간드와 접촉하는 반응을 할 수 있을 세포, 예컨대 포유동물 세포는 이종이량체화 CISC의 둘 다의 구성성분을 발현하는 것들이다.
본원에 사용된 바와 같은 "숙주 세포"는 핵산 구축물 또는 벡터로의 형질전환, 형질감염, 또는 형질도입에 감수성인 임의의 세포 유형, 예컨대 포유동물 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포, 예컨대 포유동물 세포는 T 세포 또는 T 조절성 세포 (Treg)이다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포, 예컨대 포유동물 세포는 조혈 줄기 세포이다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 CD3+, CD8+, 또는 CD4+ 세포이다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 나이브 CD8+ T 세포, 중심 기억 CD8+ T 세포, 이펙터 기억 CD8+ T 세포, 및 벌크 CD8+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 CD8+ T 세포독성 림프구 세포이다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 나이브 CD4+ T 세포, 중심 기억 CD4+ T 세포, 이펙터 기억 CD4+ T 세포, 및 벌크 CD4+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 CD4+ T 헬퍼 림프구 세포이다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "세포의 집단"은 1개 초과의 세포를 포함하는 세포, 예컨대 포유동물 세포의 군을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 세포, 예컨대 포유동물 세포가 제조되며, 여기서 세포는 본원에 기재된 바와 같은 단백질 서열 또는 본원에 기재된 바와 같은 단백질 서열을 코딩하는 발현 벡터를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "형질전환된" 또는 "형질감염된"은 외래 폴리뉴클레오티드 분자, 예컨대 구축물이 도입된 세포, 예컨대 포유동물 세포, 조직, 기관, 또는 유기체를 지칭한다. 도입된 폴리뉴클레오티드 분자는 도입된 폴리뉴클레오티드 분자가 후속 자손에 의해 유전되도록 수용자 세포, 예컨대 포유동물 세포, 조직, 기관, 또는 유기체의 게놈 DNA 내로 통합될 수 있다. "트랜스제닉" 또는 "형질감염된" 세포, 예컨대 포유동물 세포, 또는 유기체는 또한 세포 또는 유기체의 자손 및 교배에서 이러한 트랜스제닉 유기체를 모체로서 채용하는 육종 프로그램으로부터 생산되고, 외래 폴리뉴클레오티드 분자의 존재로부터 발생되는 변경된 표현형을 나타내는 자손을 포함한다. 용어 "트랜스제닉"은 1개 이상의 이종 폴리핵산 분자를 함유하는 박테리아, 진균, 또는 식물을 지칭한다. "형질도입"은 세포, 예컨대 포유동물 세포 내로의 바이러스-매개된 유전자 전달을 지칭한다.
용어 "조작된 세포"는 세포가 "직접적으로" 조작되었는지 (예를 들어, 세포가 원래 또는 야생형 상태로부터 물리적으로 변경됨), 또는 그렇게 변형된 세포로부터 전해졌는지 여부와 무관하게, 본 발명의 구축물(들)을 포함하는 세포를 지칭한다. 따라서, "조작된 세포"는 직접적으로 변형된 세포 및 그들의 자손을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 "대상체"는 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 동물을 지칭한다. "동물"은 냉혈 및 온혈 척추동물 및 무척추동물, 예컨대 어류, 패류, 파충류, 및 특히, 포유동물을 포함한다. "포유동물"은 제한 없이, 마우스, 래트, 토끼, 기니아 피그, 개, 고양이, 양, 염소, 소, 말, 영장류, 예컨대 원숭이, 침팬지, 및 유인원, 및 특히, 인간을 포함한다. 일부 대안에서, 대상체는 인간이다.
일부 실시양태에서, 이량체화를 유도하는데 사용되는 리간드의 유효량은 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100 nM 또는 상기 언급된 값 중 임의의 2개에 의해 한정되는 범위 내의 농도의 양이다.
본원에 기재된 바와 같은 "마커 서열"은 단백질 또는 관심의 단백질을 갖는 세포, 예컨대 포유동물 세포를 선택하거나 추적하는데 사용되는 단백질을 코딩한다. 본원에 기재된 실시양태에서, 제공된 융합 단백질은 실험, 예컨대 유동 세포계측법에서 선택될 수 있는 마커 서열을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "키메라 수용체" 또는 "키메라 항원 수용체"는 질환 또는 장애와 연관된 분자에 결합하며, 스페이서 도메인을 통해 T-세포 또는 다른 수용체의 1개 이상의 세포내 신호전달 도메인, 예컨대 공동자극성 도메인에 연결된 항체의 리간드 결합 도메인 또는 다른 단백질 서열을 포함하는 합성적으로 디자인된 수용체를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 세포, 예컨대 포유동물 세포가 제조되며, 여기서 세포는 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하고, 세포는 키메라 항원 수용체를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 "세포독성 T 림프구" (CTL)는 그의 표면 상에 CD8을 발현하는 T 림프구 (예를 들어, CD8+ T-세포)를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 이러한 세포는 항원-경험된 "기억" T-세포 (TM 세포)이다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질 분비를 위한 세포가 제공된다. 일부 실시양태에서, 세포는 세포독성 T 림프구이다. 본원에 사용된 바와 같은 "중심 기억" T-세포 (또는 "TCM")는 그의 표면 상에 CD62L, CCR-7 및/또는 CD45RO를 발현하고, 나이브 세포에 비해 CD45RA를 발현하지 않거나 그의 감소된 발현을 갖는 항원 경험된 CTL을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질 분비를 위한 세포가 제공된다. 일부 실시양태에서, 세포는 중심 기억 T-세포 (TCM)이다. 일부 실시양태에서, 중심 기억 세포는 CD62L, CCR7, CD28, CD127, CD45RO, 및/또는 CD95의 발현에 대해 양성이며, 나이브 세포에 비해 CD54RA의 감소된 발현을 가질 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 "이펙터 기억" T-세포 (또는 "TEM")는 중심 기억 세포에 비해 그의 표면 상에 CD62L을 발현하지 않거나 그의 감소된 발현을 갖고, 나이브 세포에 비해 CD45RA를 발현하지 않거나 그의 감소된 발현을 갖는 항원 경험된 T-세포를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질 분비를 위한 세포가 제공된다. 일부 실시양태에서, 세포는 이펙터 기억 T-세포이다. 일부 실시양태에서, 이펙터 기억 세포는 나이브 세포 또는 중심 기억 세포에 비해 CD62L 및/또는 CCR7의 발현에 대해 음성이며, CD28 및/또는 CD45RA의 가변적 발현을 가질 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "나이브 T-세포"는 중심 또는 이펙터 기억 세포에 비해, CD62L 및/또는 CD45RA를 발현하고, CD45RO-를 발현하지 않는 비-항원 경험된 T 림프구를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질 분비를 위한 세포, 예컨대 포유동물 세포가 제공된다. 일부 실시양태에서, 세포, 예컨대 포유동물 세포는 나이브 T-세포이다. 일부 실시양태에서, 나이브 CD8+ T 림프구는 CD62L, CCR7, CD28, CD127, 및/또는 CD45RA를 포함하는 나이브 T-세포의 표현형적 마커의 발현을 특징으로 한다.
본원에 사용된 바와 같은 "이펙터" T-세포는 중심 기억 또는 나이브 T-세포에 비해, CD62L, CCR7, 및/또는 CD28을 발현하지 않거나 그의 감소된 발현을 갖고, 그란자임 B 및/또는 퍼포린에 대해 양성인 항원 경험된 세포독성 T 림프구 세포를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질 분비를 위한 세포, 예컨대 포유동물 세포가 제공된다. 일부 실시양태에서, 세포, 예컨대 포유동물 세포는 이펙터 T-세포이다. 일부 실시양태에서, 세포, 예컨대 포유동물 세포는 중심 기억 또는 나이브 T-세포에 비해, CD62L, CCR7, 및/또는 CD28을 발현하지 않거나 그의 감소된 발현을 갖고, 그란자임 B 및/또는 퍼포린에 대해 양성이다.
본원에 사용된 바와 같은 "에피토프"는 항체, T-세포, 및/또는 B-세포를 포함하는 면역계에 의해 인식되는 항원 또는 분자의 일부를 지칭한다. 에피토프는 통상적으로 적어도 7개의 아미노산을 가지며, 선형 또는 입체형태적 에피토프일 수 있다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질을 발현하는 세포, 예컨대 포유동물 세포가 제공되며, 여기서 세포는 키메라 항원 수용체를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 항원 수용체는 암 세포 상의 에피토프를 인식할 수 있는 scFv를 포함한다. 본원에 개시된 다양한 폴리펩티드 또는 핵산을 기재하는데 사용되는 경우에 "단리하는", 또는 "정제하는"은 그의 천연 환경의 구성성분으로부터 확인되고 분리되고/거나 회수된 폴리펩티드 또는 핵산을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 단리된 폴리펩티드 또는 핵산은 그것이 천연적으로 회합되는 모든 구성성분과의 회합이 없다. 그의 천연 환경의 오염물 구성성분은 전형적으로 폴리펩티드 또는 핵산을 위한 진단 또는 치료 용도를 방해할 물질이며, 효소, 호르몬, 및 다른 단백질성 또는 비-단백질성 용질을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 실시양태 중 어느 하나의 핵산 또는 본원에 기재된 실시양태 중 어느 하나의 발현 벡터를 박테리아 세포, 포유동물 세포 또는 곤충 세포에 전달하고, 세포를 배양물에서 성장시키고, 융합 단백질의 발현을 유도하고, 치료를 위한 융합 단백질을 정제하는 것을 포함하는 방법이 제공된다.
본원에서 확인된 CISC 서열에 관하여 "퍼센트 (%) 아미노산 서열 동일성"은 서열을 정렬하고, 필요에 따라 갭을 도입하여 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성한 후, 및 임의의 보존적 치환을 서열 동일성의 일부로서 간주하지 않고, 세포외 결합 도메인, 힌지 도메인, 막횡단 도메인, 및/또는 신호전달 도메인의 각각에 대한 참조 서열에서의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열에서의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 결정하는 목적을 위한 정렬은 관련 기술분야의 기술 내인 다양한 방식으로, 예를 들어, 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 또는 멕얼라인 (Megalign) (DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 달성될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 비교되고 있는 서열의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 일고리듬을 포함하는, 정렬을 측정하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 예를 들어, WU-BLAST-2 컴퓨터 프로그램 (Altschul et al., Methods in Enzymology, 266:460-480 (1996))을 사용하여 생성된 % 아미노산 서열 동일성 값은 몇몇 검색 파라미터를 사용하며, 이들의 대부분은 디폴트 값으로 설정된다. 디폴트 값으로 설정되지 않은 것들 (예를 들어, 조정가능한 파라미터)은 하기 값으로 설정된다: 중첩 간격=1, 중첩 분율=0.125, 워드 역치 (T) =11 및 점수화 행렬=BLOSUM62. CISC의 일부 실시양태에서, CISC는 세포외 결합 도메인, 힌지 도메인, 막횡단 도메인, 및 신호전달 도메인을 포함하며, 여기서 각각의 도메인은 천연, 합성, 또는 천연 도메인의 돌연변이되거나 말단절단된 형태를 포함한다. 일부 실시양태에서, 임의의 주어진 도메인의 돌연변이되거나 말단절단된 형태는 100%, 95%, 90%, 85% 서열 동일성, 또는 본원에서 제공된 서열에 제시된 서열에 대해 상기 언급된 백분율 중 임의의 2개에 의해 한정되는 범위 내인 퍼센트 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 "CISC 변이체 폴리펩티드 서열" 또는 "CISC 변이체 아미노산 서열"은 본원에서 제공된 단백질 서열, 또는 그의 특이적으로 유도된 단편, 예컨대 세포외 결합 도메인, 힌지 도메인, 막횡단 도메인 및/또는 신호전달 도메인에 대한 단백질 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 아미노산 서열 동일성 (또는 상기 언급된 백분율 중 임의의 2개에 의해 한정되는 범위 내의 백분율 아미노산 서열 동일성)을 갖는 하기 정의된 바와 같은 단백질 서열을 지칭한다. 통상적으로, CISC 변이체 폴리펩티드 또는 그의 단편은 아미노산 서열 또는 그의 유도된 단편과 적어도 80% 아미노산 서열 동일성, 적어도 81% 아미노산 서열 동일성, 적어도 82% 아미노산 서열 동일성, 적어도 83% 아미노산 서열 동일성, 적어도 84% 아미노산 서열 동일성, 적어도 85% 아미노산 서열 동일성, 적어도 86% 아미노산 서열 동일성, 적어도 87% 아미노산 서열 동일성, 적어도 88% 아미노산 서열 동일성, 적어도 89% 아미노산 서열 동일성, 적어도 90% 아미노산 서열 동일성, 적어도 91% 아미노산 서열 동일성, 적어도 92% 아미노산 서열 동일성, 적어도 93% 아미노산 서열 동일성, 적어도 94% 아미노산 서열 동일성, 적어도 95% 아미노산 서열 동일성, 적어도 96% 아미노산 서열 동일성, 적어도 97% 아미노산 서열 동일성, 적어도 98% 아미노산 서열 동일성, 또는 적어도 99% 아미노산 서열 동일성을 가질 것이다. 변이체는 천연 단백질 서열을 포함하지 않는다.
본원에 사용된 바와 같은 "T-세포" 또는 "T 림프구"는 제한 없이 원숭이, 개, 영장류, 및 인간을 비롯한 임의의 포유동물 종으로부터의 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, T-세포는 수용자 대상체와 동종이형 (동일한 종, 그러나 상이한 공여자로부터)이고; 일부 실시양태에서, T-세포는 자가유래 (공여자 및 수용자가 동일함)이고; 일부 실시양태에서, T-세포는 동계 (공여자 및 수용자가 상이하지만, 동일한 트윈임)이다.
이 명세서에 사용된 바와 같이, 전이적 어구에서 또는 청구범위의 본문에서, 용어 "포함하다" 및 "포함하는"은 개방-말단 의미를 갖는 것으로 해석되어야 한다. 즉, 상기 용어는 어구 "적어도 갖는" 또는 "적어도 포함하는"과 동의어적으로 해석되어야 한다. 프로세스의 맥락에서 사용되는 경우에, 용어 "포함하는"은 프로세스가 적어도 나열된 단계를 포함하지만, 추가의 단계를 포함할 수 있음을 의미한다. 화합물, 조성물 또는 장치의 맥락에서 사용되는 경우에, 용어 "포함하는"은 화합물, 조성물 또는 장치가 적어도 나열된 특색 또는 구성성분을 포함하지만, 또한 추가의 특색 또는 구성성분을 포함할 수 있음을 의미한다.
제어된 CTL 고갈을 위한 시스템
한 측면에서, 개체에서 CTL의 제어된 고갈을 위한 조작된 세포 (예를 들어, 조작된 T 세포)를 생성하기 위한 시스템이 본원에서 제공된다. 시스템은 a) i) CTL에 대한 세포독성을 세포에 부여할 수 있는 항-CTL 단백질, 및 ii) 이량체화 활성화가능한 화학적으로 유도된 신호전달 복합체 (CISC)의 폴리펩티드 구성성분 (여기서 신호전달-적격 CISC는 세포의 생존 및/또는 증식을 촉진시키는 신호전달 경로에서 자극성 신호를 생성할 수 있음)을 코딩하는 세포 (예를 들어, T 세포)의 게놈 내로의 통합을 위한 핵산, 및 b) 항-CTL 단백질 및 CISC를 발현하는 조작된 세포를 생산하기 위한 세포의 게놈 내로 핵산을 통합하기 위한 게놈 편집 요소를 포함한다. CISC는 조작된 세포와 접촉하는 CISC 이량체화에 요구되는 리간드의 양을 조정함으로써 조작된 세포의 생존 및/또는 증식의 제어를 허용한다. 일부 실시양태에서, CISC는 제1 CISC 구성성분 및 제2 CISC 구성성분을 포함하며, 여기서 제1 CISC 구성성분 및 제2 CISC 구성성분은, 조작된 세포에 의해 발현되는 경우에, 이들이 리간드의 존재 하에서 이량체화하여 신호전달-적격 CISC를 생성하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포는 리간드의 부재 하에서 생존하고/거나 증식할 수 없다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포는 세포의 생존 및/또는 증식에 관여하는 내인성 신호전달 경로에 있어서 결함성이며, 신호전달-적격 CISC는 조작된 세포가 생존하고/거나 증식할 수 있도록 결함성 내인성 신호전달 경로를 보충할 수 있다.
항-세포독성 T 림프구 (CTL) 구축물
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 시스템은 항-CTL 단백질을 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-CTL 단백질은 구축물을 발현하는 편집된 세포에 편집된 세포를 외래물로서 인식하는 CTL에 대한 세포독성을 부여할 수 있는 반면, 편집된 T 세포는 편집된 세포를 외래물로서 인식하지 않는 CTL에 대해 비-세포독성이다. 일부 실시양태에서, 항-CTL 단백질은 세포외 β2-마이크로글로불린 도메인, 막횡단 도메인, 공동-자극성 도메인, 및 세포질 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 수용체이다. 일부 실시양태에서, 세포외 β2-마이크로글로불린 도메인은 서열식별번호: 49의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 49의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체 막횡단 도메인은 CD8 막횡단 도메인 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체 CD8 막횡단 도메인은 서열식별번호: 50의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 50의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체 공동-자극성 도메인은 4-1BB 공동-자극성 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체 4-1BB 공동-자극성 도메인은 서열식별번호: 51의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 51의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체 세포질 신호전달 도메인은 CD3-ζ 세포질 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체 CD3-ζ 세포질 신호전달 도메인은 서열식별번호: 52의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 52의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체는 서열식별번호: 53의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 53의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
CISC
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 시스템은 제1 CISC 구성성분 및 제2 CISC 구성성분을 포함하는 이량체성 CISC를 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 CISC 구성성분은 제1 세포외 결합 도메인 또는 그의 부분, 제1 막횡단 도메인, 및 제1 신호전달 도메인 또는 그의 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 CISC 구성성분은 제1 힌지 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 CISC 구성성분은 제2 세포외 결합 도메인 또는 그의 부분, 제2 막횡단 도메인, 및 제2 신호전달 도메인 또는 그의 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 CISC 구성성분은 제2 힌지 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 CISC 구성성분은, 발현되는 경우에, 이들이 리간드의 존재 하에서 이량체화하도록 구성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 세포외 결합 도메인 또는 그의 부분은 FK506 결합 단백질 (FKBP) 도메인 또는 그의 부분을 포함하고, 제2 세포외 결합 도메인 또는 그의 부분은 FKBP 라파마이신 결합 (FRB) 도메인 또는 그의 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 세포외 결합 도메인 또는 그의 부분은 FK506 결합 단백질 (FKBP) 도메인 또는 그의 부분을 포함하고, 제1 세포외 결합 도메인 또는 그의 부분은 FKBP 라파마이신 결합 (FRB) 도메인 또는 그의 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 리간드는 라파마이신 또는 라파로그이다. 일부 실시양태에서, 제1 신호전달 도메인은 IL2Rγ로부터 유래된 신호전달 도메인이고/거나, 제1 막횡단 도메인은 IL2Rγ로부터 유래된 막횡단 도메인이고, 제2 신호전달 도메인은 IL2Rβ로부터 유래된 신호전달 도메인이고/거나, 제2 막횡단 도메인은 IL2Rβ로부터 유래된 막횡단 도메인이다. 일부 실시양태에서, 제2 신호전달 도메인은 IL2Rγ로부터 유래된 신호전달 도메인이고/거나, 제2 막횡단 도메인은 IL2Rγ로부터 유래된 막횡단 도메인이고, 제1 신호전달 도메인은 IL2Rβ로부터 유래된 신호전달 도메인이고/거나, 제1 막횡단 도메인은 IL2Rβ로부터 유래된 막횡단 도메인이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 시스템은 제1 CISC 구성성분 및 제2 CISC 구성성분을 포함하는 이량체성 CISC를 코딩하는 핵산을 포함하며, 여기서 CISC는 IL2Rγ 및 IL2Rβ 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 CISC 구성성분은 신호전달 도메인을 비롯한 IL2Rγ의 부분 ("CISCg")을 포함하고, 제2 CISC 구성성분은 신호전달 도메인을 비롯한 IL2Rβ의 부분 ("CISCb")을 포함하거나, 제2 CISC 구성성분은 신호전달 도메인을 비롯한 IL2Rγ의 부분을 포함하고, 제1 CISC 구성성분은 신호전달 도메인을 비롯한 IL2Rβ의 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 CISC 구성성분은 서열식별번호: 44의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 44의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하는 IL2Rγ의 부분을 포함하고, 제2 CISC 구성성분은 서열식별번호: 45의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 45의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하는 IL2Rβ의 부분을 포함하거나, 제2 CISC 구성성분은 서열식별번호: 44의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 44의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하는 IL2Rγ의 부분을 포함하고, 제1 CISC 구성성분은 서열식별번호: 45의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 45의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하는 IL2Rβ의 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 세포외 결합 도메인 또는 그의 부분은 FK506 결합 단백질 (FKBP) 도메인 또는 그의 부분을 포함하고, 제2 세포외 결합 도메인 또는 그의 부분은 FKBP 라파마이신 결합 (FRB) 도메인 또는 그의 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 세포외 결합 도메인 또는 그의 부분은 FK506 결합 단백질 (FKBP) 도메인 또는 그의 부분을 포함하고, 제1 세포외 결합 도메인 또는 그의 부분은 FKBP 라파마이신 결합 (FRB) 도메인 또는 그의 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, FKBP 도메인은 서열식별번호: 41의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 41의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, FRB는 서열식별번호: 42의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 42의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 CISC 구성성분은 서열식별번호: 48의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 48의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 CISC 구성성분은 서열식별번호: 47의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 47의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 CISC 구성성분은 라파마이신 또는 라파로그의 존재 하에서 이량체화하여 신호전달 적격 CISC를 형성한다. 일부 실시양태에서, 라파로그는 에베롤리무스, CCI-779, C20-메탈릴라파마이신, C16-(S)-3-메틸인돌라파마이신, C16-iRap, AP21967, 나트륨 미코페놀산, 베니디핀 히드로클로라이드, AP1903, 또는 AP23573, 또는 이들의 대사물, 유도체, 및/또는 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, IL2Rβ 신호전달 도메인을 포함하는 CISC 구성성분은 말단절단된 세포내 IL2Rβ 도메인을 포함한다. 말단절단된 IL2Rβ 도메인은 IL2Rγ 신호전달 도메인을 포함하는 CISC 구성성분과의 이종이량체화 시 하류 IL2 신호전달을 활성화시키는 능력을 보유한다. 일부 실시양태에서, 말단절단된 IL2Rβ는 서열식별번호: 63에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열식별번호: 63의 말단절단된 IL2Rβ 도메인은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 N-말단 아미노산 중 임의의 것을 결여한다. 일부 실시양태에서, 말단절단된 세포내 IL2Rβ 도메인을 포함하는 CISC 구성성분은 서열식별번호: 64의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 IL2Rβ 신호전달 도메인을 포함하는 CISC 구성성분 중 임의의 것에 따르면, CISC 구성성분은 말단절단된 세포내 IL2Rβ 도메인을 포함하는 CISC 구성성분으로 치환될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 IL2Rβ 신호전달 도메인을 포함하는 CISC 구성성분은 서열식별번호: 64의 아미노산 서열을 포함하는 CISC 구성성분으로 치환된다. 예시적인 실시양태는 도 4-18, 21, 24-27, 31-35, 및 37-38에 제시된 벡터 (서열식별번호: 19, 22, 25-36, 39, 66, 69, 70-72, 76-80, 및 82-83)를 포함한다.
선택가능한 마커
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 시스템은 선택가능한 마커를 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 선택가능한 마커는 선택가능한 마커를 발현하는 편집된 세포에 선택적 조건에서, 예컨대 독소의 존재 하에서 또는 영양소의 부재 하에서 생존하는 능력을 부여할 수 있다. 일부 실시양태에서, 선택가능한 마커는 선택가능한 마커를 발현하는 세포의 선택을 허용하는 표면 마커이다. 일부 실시양태에서, 선택가능한 마커는 예를 들어 도 7, 9, 12, 14-18, 20, 26, 28, 32, 34, 36, 38, 및 39의 벡터 (서열식별번호: 25, 33, 26, 34, 27, 22, 39, 65, 71, 73, 77, 79, 81, 83, 및 84)에서의 말단절단된 저-친화도 신경 성장 인자 수용체 (tLNGFR) 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, tLNGFR 폴리펩티드는 서열식별번호: 54의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 54의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 선택가능한 마커는 mCherry 폴리펩티드이다.
칼시뉴린 억제제 저항성
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 시스템은 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 폴리펩티드를 발현하는 편집된 세포에 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여할 수 있다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드는 타크롤리무스 (FK506) 및/또는 시클로스포린 A (CsA)에 대한 저항성을 부여한다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드는 돌연변이체 칼시뉴린 (CN) 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 CN 폴리펩티드는 타크롤리무스 (FK506) 및 시클로스포린 A (CsA)에 대한 저항성을 부여한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 CN 폴리펩티드는 CNb30 (서열식별번호: 55)이다. 예시적인 벡터 실시양태는 도 6, 11-13, 15, 18, 26, 28-29, 32, 35, 및 39 (서열식별번호: 26, 28, 30, 32, 36, 39, 71, 73, 34, 77, 80, 및 84)를 포함한다.
라파마이신 저항성
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 시스템은 라파마이신에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 폴리펩티드를 발현하는 편집된 세포에 라파마이신에 대한 저항성을 부여할 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 포유동물 라파마이신의 표적 (mTOR) 키나제의 FKBP-라파마이신 결합 (FRB) 도메인 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 라파마이신에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드는 서열식별번호: 56 또는 57의 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 56 또는 57의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
게놈 편집 요소
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 시스템은 본원에 기재된 항-CTL 단백질 및 CISC를 발현하는 조작된 세포를 생산하는 세포의 게놈 내로 핵산을 통합하기 위한 게놈 편집 요소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 게놈 편집 요소는 본원에 기재된 다양한 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 내인성 TRA 유전자 및/또는 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입할 수 있다. 일부 실시양태에서, 게놈 편집 요소는 a) 내인성 TRA 유전자를 표적화하는 제1 gRNA 및/또는 내인성 IL2RG 유전자를 표적화하는 제2 gRNA; 및 b) RNA-가이드된 엔도뉴클레아제 (RGEN) 또는 RGEN을 코딩하는 핵산을 포함하는 CRISPR 시스템을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 gRNA는 TRAC 도메인을 코딩하는 영역 내의 또는 그 부근의 내인성 TRA 유전자를 표적화한다. gRNA 표적 부위는 그 표적 부위에서의 통합이 전형적으로 플랭킹 또는 인접한 서열에서 TRAC 도메인 발현 및/또는 기능을 방해할 수 있는 경우에 TRAC 도메인을 코딩하는 영역 "부근에" 있다. 일부 실시양태에서, 제1 gRNA는 서열식별번호: 1-3 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 서열식별번호: 1-3 중 어느 하나와 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 gRNA는 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나와 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, RGEN은 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (또한 Csn1 및 Csx12로 공지됨), Cas100, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, 및 Cpf1 엔도뉴클레아제, 또는 그의 기능적 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 시스템은 a) 내인성 TRA 유전자를 표적화하는 제1 gRNA 및/또는 내인성 IL2RG 유전자를 표적화하는 제2 gRNA; 및 b) RNA-가이드된 엔도뉴클레아제 (RGEN) 또는 RGEN을 코딩하는 핵산을 포함하는 게놈 편집 요소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 gRNA는 TRAC 도메인을 코딩하는 영역 내의 또는 그 부근의 내인성 TRA 유전자를 표적화한다. 일부 실시양태에서, 제1 gRNA는 서열식별번호: 1-3 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 서열식별번호: 1-3 중 어느 하나와 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 gRNA는 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나와 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, RGEN은 Cas9이다. 일부 실시양태에서, RGEN을 코딩하는 핵산은 리보핵산 (RNA) 서열이다. 일부 실시양태에서, RGEN을 코딩하는 RNA 서열은 공유 결합을 통해 제1 gRNA 또는 제2 gRNA에 연결된다. 일부 실시양태에서, 시스템은 본원에 기재된 항-CTL 단백질 및 CISC를 코딩하는 핵산을 포함하는 1종 이상의 공여자 주형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-CTL 단백질은 본원에 기재된 실시양태 중 임의의 것에 따른 세포외 β2-마이크로글로불린 도메인을 포함하는 키메라 수용체이다. 일부 실시양태에서, 항-CTL 단백질은 세포외 β2-마이크로글로불린 도메인, 막횡단 도메인, 공동-자극성 도메인, 및 세포질 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 수용체이다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 공여자 주형은 본원에 기재된 실시양태 중 임의의 것에 따른 선택가능한 마커, 칼시뉴린 억제제 저항성을 부여하는 폴리펩티드, 및 라파마이신에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드 중 1종 이상을 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 시스템은 내인성 TRA 유전자 내로의 삽입을 위한 제1 공여자 주형 및 내인성 IL2RG 유전자 내로의 삽입을 위한 제2 공여자 주형을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 시스템은 하기 시스템 구성성분을 코딩하는 핵산을 포함하는 1종 이상의 공여자 주형을 포함한다: i) 항-CTL 단백질; ii) IL2Rβ 신호전달 도메인을 포함하는 제1 CISC 구성성분; iii) 라파마이신에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드; iv) 선택가능한 마커; v) 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드; 및 vi) IL2Rγ 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CISC 구성성분 또는 그의 단편. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 공여자 주형은 제1 공여자 주형 및 제2 공여자 주형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 내인성 유전자에 삽입되도록 구성되고, 제2 공여자 주형은 제2 내인성 유전자에 삽입되도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 코딩 카세트를 포함하고, 제2 공여자 주형은 제2 코딩 카세트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 코딩 카세트는 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 선택가능한 마커를 코딩하는 핵산, 및 제1 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 코딩 카세트는 라파마이신에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 항-CTL 단백질을 코딩하는 핵산, 및 제2 CISC 구성성분 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은, 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 발현이 제1 프로모터의 제어 하에 있도록, 제1 코딩 카세트에 작동적으로 연결된 제1 프로모터를 포함하는 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 상류에 합성 폴리A 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 프로모터는 MND 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 제1 내인성 유전자는 내인성 TRA 유전자이다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 TRAC 도메인을 코딩하는 내인성 TRA 유전자의 영역 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형의 삽입은 비-기능적 TRAC 도메인을 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 제2 공여자 주형은, 제2 폴리시스트론성 발현 카세트의 발현이 제2 프로모터의 제어 하에 있도록, 제2 코딩 카세트에 작동적으로 연결된 제2 프로모터를 포함하는 제2 폴리시스트론성 발현 카세트 또는 그의 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 프로모터는 MND 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 제2 내인성 유전자는 내인성 IL2RG 유전자이다. 일부 실시양태에서, 제2 내인성 유전자는 내인성 IL2RG 유전자이고, 제2 공여자 주형은 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편을 포함하는 핵산을 포함하는 제2 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분을 포함하고, 제2 공여자 주형은 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입되는 경우에, 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편이 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결되고, 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결된 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편이 함께 제2 CISC 구성성분을 코딩하고, 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결된 제2 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분이 함께 제2 폴리시스트론성 발현 카세트를 포함하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 서열식별번호: 37-39 중 어느 하나로부터의 인접한 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 공여자 주형은 서열식별번호: 40으로부터의 인접한 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 AAV 벡터이고/거나, 제2 공여자 주형은 제2 AAV 벡터이다. 일부 실시양태에서, 제1 AAV 벡터는 서열식별번호: 37-39 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 37-39 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 AAV 벡터는 서열식별번호: 40의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 40의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 공여자 주형 중 임의의 것에 따르면, 공여자 주형은 항-세포독성 T 세포 단백질을 코딩하는 핵산을 포함한다. 항-세포독성 T 세포 단백질은 단량체성 (즉, 단일 아미노산 쇄를 포함함), 또는 다량체성 (즉, 동일하거나 상이할 수 있는 2개 이상의 아미노산 쇄를 포함함)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-세포독성 T 세포 단백질은 구축물을 발현하는 편집된 T 세포에 편집된 T 세포를 외래물로서 인식하는 세포독성 T 세포에 대한 세포독성을 부여할 수 있는 반면, 편집된 T 세포는 편집된 T 세포를 외래물로서 인식하지 않는 세포독성 T 세포에 대해 비-세포독성이다. 일부 실시양태에서, 항-세포독성 T 세포 단백질은 세포외 β2-마이크로글로불린 도메인, 막횡단 도메인, 공동-자극성 도메인, 및 세포질 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 수용체이다. 일부 실시양태에서, 세포외 β2-마이크로글로불린 도메인은 서열식별번호: 49의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 49의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체 막횡단 도메인은 CD8 막횡단 도메인 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체 CD8 막횡단 도메인은 서열식별번호: 50의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 50의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체 공동-자극성 도메인은 4-1BB 공동-자극성 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체 4-1BB 공동-자극성 도메인은 서열식별번호: 51의 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 51의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체 세포질 신호전달 도메인은 CD3-ζ 세포질 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체 CD3-ζ 세포질 신호전달 도메인은 서열식별번호: 52의 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 52의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체는 서열식별번호: 53의 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 53의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 공여자 주형 중 임의의 것에 따르면, 공여자 주형은 IL2Rβ 신호전달 도메인을 포함하는 제1 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 CISC 구성성분의 제1 세포외 결합 도메인은 FRB 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 CISC 구성성분은 서열식별번호: 48의 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 48의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 공여자 주형 중 임의의 것에 따르면, 공여자 주형은 라파마이신에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 라파마이신에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드는 FRB 도메인 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, FRB 도메인 폴리펩티드는 서열식별번호: 56 또는 57의 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 56 또는 57의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 공여자 주형 중 임의의 것에 따르면, 공여자 주형은 선택가능한 마커를 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 선택가능한 마커는 tLNGFR 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, tLNGFR 폴리펩티드는 서열식별번호: 54의 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 54의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 선택가능한 마커는 mCherry 폴리펩티드이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 공여자 주형 중 임의의 것에 따르면, 공여자 주형은 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드는 돌연변이체 CN 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 CN 폴리펩티드는 CNb30 (서열식별번호: 55)이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 공여자 주형 중 임의의 것에 따르면, 공여자 주형은 IL2Rγ 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CISC 구성성분 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 CISC 구성성분의 제2 세포외 결합 도메인은 FKBP 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 CISC 구성성분은 서열식별번호: 47의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 47의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 공여자 주형은 서열식별번호: 46의 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 46의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하는 제2 CISC 구성성분의 단편을 코딩하는 핵산을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 공여자 주형 중 임의의 것에 따르면, 공여자 주형은 MND 프로모터를 포함한다. 일부 실시양태에서, MND 프로모터는 서열식별번호: 62의 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 서열식별번호: 62의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 공여자 주형 중 임의의 것에 따르면, 공여자 주형은 인접한 시스템 구성성분-코딩 핵산 사이에 2A 자기-절단 펩티드를 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 공여자 주형은 각각의 인접한 시스템 구성성분-코딩 핵산 사이에 2A 자기-절단 펩티드를 코딩하는 핵산을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 공여자 주형은 5'에서 3'로의 순서로, 라파마이신에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 2A 자기-절단 펩티드를 코딩하는 핵산, 항-CTL 단백질을 코딩하는 핵산, 2A 자기-절단 펩티드를 코딩하는 핵산, 및 제2 CISC 구성성분 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 2A 자기-절단 펩티드는 독립적으로 T2A 자기-절단 펩티드 또는 P2A 자기-절단 펩티드이다. 일부 실시양태에서, T2A 자기-절단 펩티드는 서열식별번호: 60의 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 60의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, P2A 자기-절단 펩티드는 서열식별번호: 61의 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 61의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 시스템은 하기 시스템 구성성분을 코딩하는 핵산을 포함하는 1종 이상의 공여자 주형을 포함한다: i) IL2Rβ 신호전달 도메인을 포함하는 제1 CISC 구성성분; ii) IL2Rγ 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CISC 구성성분 또는 그의 단편; 및 iii) 선택가능한 마커. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 공여자 주형은 제1 공여자 주형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 내인성 유전자에 삽입되도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 코딩 카세트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 코딩 카세트는 제1 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산, 제2 CISC 구성성분 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산, 및 선택가능한 마커를 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은, 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 발현이 제1 프로모터의 제어 하에 있도록, 제1 코딩 카세트에 작동적으로 연결된 제1 프로모터를 포함하는 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 상류에 합성 폴리A 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 프로모터는 MND 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 제1 내인성 유전자는 내인성 TRA 유전자이다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 TRAC 도메인을 코딩하는 내인성 TRA 유전자의 영역 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형의 삽입은 비-기능적 TRAC 도메인을 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은, 제1 공여자 주형이 제1 내인성 유전자에 삽입되는 경우에, 제1 폴리시스트론성 발현 카세트가 제1 내인성 유전자의 내인성 프로모터의 제어 하에 있도록, 제1 코딩 카세트의 상류에 2A 자기-절단 펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 내인성 유전자는 내인성 IL2RG 유전자이다. 일부 실시양태에서, 제1 내인성 유전자는 내인성 IL2RG 유전자이고, 제1 공여자 주형은 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편을 포함하는 핵산을 포함하는 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분을 포함하고, 제1 공여자 주형은 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입되는 경우에, 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편이 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결되고, 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결된 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편이 함께 제2 CISC 구성성분을 코딩하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 서열식별번호: 19-25, 27, 및 35 중 어느 하나로부터의 인접한 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 AAV 벡터이다. 일부 실시양태에서, 제1 AAV 벡터는 서열식별번호: 19-25, 27, 및 35 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 19-25, 27, 및 35 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 시스템은 하기 시스템 구성성분을 코딩하는 핵산을 포함하는 1종 이상의 공여자 주형을 포함한다: i) IL2Rβ 신호전달 도메인을 포함하는 제1 CISC 구성성분; ii) IL2Rγ 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CISC 구성성분 또는 그의 단편; iii) 선택가능한 마커; 및 iv) 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 공여자 주형은 제1 공여자 주형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 내인성 유전자에 삽입되도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 코딩 카세트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 코딩 카세트는 제1 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산, 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산, 선택가능한 마커를 코딩하는 핵산, 및 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은, 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 발현이 제1 프로모터의 제어 하에 있도록, 제1 코딩 카세트에 작동적으로 연결된 제1 프로모터를 포함하는 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 상류에 합성 폴리A 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 프로모터는 MND 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은, 제1 공여자 주형이 제1 내인성 유전자에 삽입되는 경우에, 제1 폴리시스트론성 발현 카세트가 제1 내인성 유전자의 내인성 프로모터의 제어 하에 있도록, 제1 코딩 카세트의 상류에 2A 자기-절단 펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 내인성 유전자는 내인성 IL2RG 유전자이다. 일부 실시양태에서, 제1 내인성 유전자는 내인성 IL2RG 유전자이고, 제1 공여자 주형은 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편을 포함하는 핵산을 포함하는 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분을 포함하고, 제1 공여자 주형은 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입되는 경우에, 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편이 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결되고, 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결된 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편이 함께 제2 CISC 구성성분을 코딩하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 서열식별번호: 26, 28, 및 36 중 어느 하나로부터의 인접한 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 AAV 벡터이다. 일부 실시양태에서, 제1 AAV 벡터는 서열식별번호: 26, 28, 및 36 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열, 및 서열식별번호: 26, 28, 및 36 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 시스템은 하기 시스템 구성성분을 코딩하는 핵산을 포함하는 1종 이상의 공여자 주형을 포함한다: i) IL2Rβ 신호전달 도메인을 포함하는 제1 CISC 구성성분; ii) IL2Rγ 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CISC 구성성분 또는 그의 단편; 및 iii) 항-CTL 단백질. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 공여자 주형은 제1 공여자 주형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 내인성 유전자에 삽입되도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 코딩 카세트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 코딩 카세트는 제1 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산, 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산, 및 항-CTL 단백질을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은, 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 발현이 제1 프로모터의 제어 하에 있도록, 제1 코딩 카세트에 작동적으로 연결된 제1 프로모터를 포함하는 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분의 상류에 합성 폴리A 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 프로모터는 MND 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 공여자 주형이 제1 내인성 유전자에 삽입되는 경우에, 제1 폴리시스트론성 발현 카세트가 제1 내인성 유전자의 내인성 프로모터의 제어 하에 있도록, 제1 코딩 카세트의 상류에 2A 자기-절단 펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 내인성 유전자는 내인성 IL2RG 유전자이다. 일부 실시양태에서, 제1 내인성 유전자는 내인성 IL2RG 유전자이고, 제1 공여자 주형은 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편을 포함하는 핵산을 포함하는 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분을 포함하고, 제1 공여자 주형은 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입되는 경우에, 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편이 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결되고, 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결된 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편이 함께 제2 CISC 구성성분을 코딩하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 서열식별번호: 29 또는 31로부터의 인접한 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 AAV 벡터이다. 일부 실시양태에서, 제1 AAV 벡터는 서열식별번호: 29 또는 31의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 29 또는 31의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 시스템은 하기 시스템 구성성분을 코딩하는 핵산을 포함하는 1종 이상의 공여자 주형을 포함한다: i) IL2Rβ 신호전달 도메인을 포함하는 제1 CISC 구성성분; ii) IL2Rγ 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CISC 구성성분 또는 그의 단편; iii) 항-CTL 단백질; 및 iv) 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 공여자 주형은 제1 공여자 주형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 내인성 유전자에 삽입되도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 코딩 카세트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 코딩 카세트는 제1 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산, 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산, 항-CTL 단백질을 코딩하는 핵산, 및 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은, 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 발현이 제1 프로모터의 제어 하에 있도록, 제1 코딩 카세트에 작동적으로 연결된 제1 프로모터를 포함하는 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분의 상류에 합성 폴리A 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 프로모터는 MND 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은, 제1 공여자 주형이 제1 내인성 유전자에 삽입되는 경우에, 제1 폴리시스트론성 발현 카세트가 제1 내인성 유전자의 내인성 프로모터의 제어 하에 있도록, 제1 코딩 카세트의 상류에 2A 자기-절단 펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 내인성 유전자는 내인성 IL2RG 유전자이다. 일부 실시양태에서, 제1 내인성 유전자는 내인성 IL2RG 유전자이고, 제1 공여자 주형은 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편을 포함하는 핵산을 포함하는 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분을 포함하고, 제1 공여자 주형은 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입되는 경우에, 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편이 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결되고, 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결된 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편이 함께 제2 CISC 구성성분을 코딩하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 서열식별번호: 30 또는 32로부터의 인접한 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 AAV 벡터이다. 일부 실시양태에서, 제1 AAV 벡터는 서열식별번호: 30 또는 32의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 30 또는 32의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 시스템은 하기 시스템 구성성분을 코딩하는 핵산을 포함하는 1종 이상의 공여자 주형을 포함한다: i) IL2Rβ 신호전달 도메인을 포함하는 제1 CISC 구성성분; ii) IL2Rγ 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CISC 구성성분 또는 그의 단편; iii) 항-CTL 단백질; 및 iv) 선택가능한 마커. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 공여자 주형은 제1 공여자 주형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 내인성 유전자에 삽입되도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 코딩 카세트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 코딩 카세트는 제1 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산, 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산, 항-CTL 단백질을 코딩하는 핵산, 및 선택가능한 마커를 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은, 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 발현이 제1 프로모터의 제어 하에 있도록, 제1 코딩 카세트에 작동적으로 연결된 제1 프로모터를 포함하는 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분의 상류에 합성 폴리A 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 프로모터는 MND 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은, 제1 공여자 주형이 제1 내인성 유전자에 삽입되는 경우에, 제1 폴리시스트론성 발현 카세트가 제1 내인성 유전자의 내인성 프로모터의 제어 하에 있도록, 제1 코딩 카세트의 상류에 2A 자기-절단 펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 내인성 유전자는 내인성 IL2RG 유전자이다. 일부 실시양태에서, 제1 내인성 유전자는 내인성 IL2RG 유전자이고, 제1 공여자 주형은 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편을 포함하는 핵산을 포함하는 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분을 포함하고, 제1 공여자 주형은 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입되는 경우에, 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편이 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결되고, 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결된 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편이 함께 제2 CISC 구성성분을 코딩하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 서열식별번호: 33 또는 34로부터의 인접한 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 AAV 벡터이다. 일부 실시양태에서, 제1 AAV 벡터는 서열식별번호: 33 또는 34의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 33 또는 34의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 시스템은 1종 이상의 공여자 주형 및 1종 이상의 gRNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 공여자 주형은 제1 공여자 주형 및 제2 공여자 주형을 포함하고, 1종 이상의 gRNA는 제1 gRNA 및 제2 gRNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 AAV 벡터이고/거나, 제2 공여자 주형은 제2 AAV 벡터이다. 일부 실시양태에서, 제1 AAV 벡터는 서열식별번호: 37의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 37의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 gRNA는 서열식별번호: 1의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 1의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 AAV 벡터는 서열식별번호: 40의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 40의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 gRNA는 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 AAV 벡터는 서열식별번호: 38의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 38의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 gRNA는 서열식별번호: 2의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 2의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 AAV 벡터는 서열식별번호: 40의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 40의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 gRNA는 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 AAV 벡터는 서열식별번호: 39의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 39의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 gRNA는 서열식별번호: 3의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 3의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 AAV 벡터는 서열식별번호: 40의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 40의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 gRNA는 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 시스템은 1종 이상의 공여자 주형 및 1종 이상의 gRNA를 포함하며, 여기서 1종 이상의 공여자 주형은 제1 공여자 주형을 포함하고, 1종 이상의 gRNA는 제1 gRNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 AAV 벡터이다. 일부 실시양태에서, 제1 AAV 벡터는 서열식별번호: 19 또는 22의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 19 또는 22의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 gRNA는 서열식별번호: 1의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 1의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 AAV 벡터는 서열식별번호: 20 또는 23의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 20 또는 23의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 gRNA는 서열식별번호: 2의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 2의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 AAV 벡터는 서열식별번호: 21 또는 24의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 21 또는 24의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 gRNA는 서열식별번호: 3의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 3의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 시스템은 1종 이상의 공여자 주형 및 1종 이상의 gRNA를 포함하며, 여기서 1종 이상의 공여자 주형은 제1 공여자 주형을 포함하고, 1종 이상의 gRNA는 제1 gRNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 AAV 벡터이다. 일부 실시양태에서, 제1 AAV 벡터는 서열식별번호: 25-36 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 25-36 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 gRNA는 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 시스템은 RGEN 및 제1 gRNA 및/또는 제2 gRNA를 포함하는 리보핵단백질 (RNP) 복합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, RGEN은 각각 1:1 내지 20:1의 gRNA 대 RGEN의 몰비로 제1 gRNA 및/또는 제2 gRNA와 예비복합체화되어 RNP를 형성한다.
일부 실시양태에서, 공여자 주형을 포함하는 본원에 기재된 시스템 중 임의의 것에 따르면, 공여자 주형은 코딩 카세트를 포함하고, 공여자 주형은 코딩 카세트가 상동성 지정된 복구 (HDR)에 의해 시스템에서의 gRNA에 의해 표적화된 게놈 로커스 내로 통합될 수 있도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 코딩 카세트는 표적화된 게놈 로커스에서의 서열에 상응하는 상동성 아암에 의해 둘 다의 측 상에 플랭킹된다. 일부 실시양태에서, 상동성 아암은 시스템에서의 gRNA에 대한 표적 부위를 포함하는 표적화된 게놈 로커스에서의 서열에 상응한다. 일부 실시양태에서, 상동성 아암 중 하나 또는 둘 다는 시스템에서의 gRNA에 대한 표적 부위에 상응하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상동성 아암은 게놈 로커스 내로의 코딩 카세트의 통합이 gRNA에 대한 게놈 표적 부위를 제거하거나, 다르게는 그것이 더 이상 gRNA에 대한 표적이 아니도록 게놈 표적 부위를 변형시키도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 표적 부위에 상응하는 상동성 아암에서의 서열은, 그것이 gRNA에 대한 표적이 아니도록, 표적 부위의 PAM 서열의 변화를 포함한다. 일부 실시양태에서, 게놈 로커스 내로의 코딩 서열의 통합이 게놈 로커스에서의 표적 부위를 중단시키도록, 상동성 아암 중 하나는 표적 부위의 부분에 상응하는 서열을 포함하고, 다른 상동성 아암은 표적 부위의 나머지에 상응하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상동성 아암은 길이로 적어도 또는 적어도 약 0.2 kb (예컨대 적어도 또는 적어도 약 0.3 kb, 0.4 kb, 0.5 kb, 0.6 kb, 0.7 kb, 0.8 kb, 0.9 kb, 1 kb 중 임의의 것 또는 그 이상)이다. 예시적인 상동성 아암으로는 서열식별번호: 19-46 중 어느 하나의 서열을 갖는 공여자 주형으로부터의 상동성 아암을 들 수 있다. 일부 실시양태에서, 공여자 주형은 아데노 연관된 바이러스 (AAV) 벡터에서 코딩된다. 일부 실시양태에서, AAV 벡터는 AAV6 벡터이다.
일부 실시양태에서, 공여자 주형을 포함하는 본원에 기재된 시스템 중 임의의 것에 따르면, 공여자 주형은 코딩 카세트를 포함하고, 공여자 주형은 코딩 카세트가 비-상동성 말단 연결 (NHEJ)에 의해 시스템에서의 gRNA에 의해 표적화된 게놈 로커스 내로 통합될 수 있도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 코딩 카세트는 gRNA 표적 부위에 의해 하나 또는 둘 다의 측 상에 플랭킹된다. 일부 실시양태에서, 코딩 카세트는 gRNA 표적 부위에 의해 둘 다의 측 상에 플랭킹된다. 일부 실시양태에서, gRNA 표적 부위는 시스템에서의 gRNA에 대한 표적 부위이다. 일부 실시양태에서, 공여자 주형의 gRNA 표적 부위는 시스템에서의 gRNA에 대한 세포 게놈 gRNA 표적 부위의 역 상보체이다. 일부 실시양태에서, 공여자 주형은 아데노 연관된 바이러스 (AAV) 벡터에서 코딩된다. 일부 실시양태에서, AAV 벡터는 AAV6 벡터이다.
조작된 세포
일부 측면에서, i) 조작된 세포에 본원에 제시되고 기재된 바와 같은 CTL에 대한 세포독성을 부여할 수 있는 항-CTL 단백질, 및 ii) 본원에 제시되고 기재된 바와 같은 이량체화 활성화가능한 화학적으로 유도된 신호전달 복합체 (CISC)의 폴리펩티드 구성성분을 코딩하는 핵산을 포함하며, 여기서 신호전달-적격 CISC가 조작된 세포의 생존 및/또는 증식을 촉진시키는 신호전달 경로에서 자극성 신호를 생성할 수 있는 것인 조작된 세포, 예컨대 조작된 포유동물 세포 (예를 들어, T 세포)가 본원에서 제공된다. CISC는 조작된 세포와 접촉하는 CISC 이량체화에 요구되는 리간드의 양을 조정함으로써 조작된 세포의 생존 및/또는 증식을 제어하는 것을 허용한다. 일부 실시양태에서, CISC는 제1 CISC 구성성분 및 제2 CISC 구성성분을 포함하며, 여기서 제1 CISC 구성성분 및 제2 CISC 구성성분은, 조작된 세포에 의해 발현되는 경우에, 이들이 리간드의 존재 하에서 이량체화하여 신호전달-적격 CISC를 생성하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포는 리간드의 부재 하에서 생존하고/거나 증식할 수 없다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포는 세포의 생존 및/또는 증식에 관여하는 내인성 신호전달 경로에 있어서 결함성이며, 신호전달-적격 CISC는 조작된 세포가 생존하고/거나 증식할 수 있도록 결함성 내인성 신호전달 경로를 보충할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포는 조작된 T 세포이다. 일부 실시양태에서, 조작된 T 세포는 인간이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조작된 세포는 항-세포독성 T 세포 단백질을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-세포독성 T 세포 단백질은 구축물을 발현하는 편집된 T 세포에 편집된 T 세포를 외래물로서 인식하는 세포독성 T 세포에 대한 세포독성을 부여할 수 있는 반면, 편집된 T 세포는 편집된 T 세포를 외래물로서 인식하지 않는 세포독성 T 세포에 대해 비-세포독성이다. 일부 실시양태에서, 항-세포독성 T 세포 단백질은 세포외 β2-마이크로글로불린 도메인, 막횡단 도메인, 공동-자극성 도메인, 및 세포질 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 수용체이다. 일부 실시양태에서, 세포외 β2-마이크로글로불린 도메인은 서열식별번호: 49의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 49의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체 막횡단 도메인은 CD8 막횡단 도메인 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체 CD8 막횡단 도메인은 서열식별번호: 50의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 50의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체 공동-자극성 도메인은 4-1BB 공동-자극성 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체 4-1BB 공동-자극성 도메인은 서열식별번호: 51의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 51의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체 세포질 신호전달 도메인은 CD3-ζ 세포질 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체 CD3-ζ 세포질 신호전달 도메인은 서열식별번호: 52의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 52의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체는 서열식별번호: 53의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 53의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-세포독성 T 세포 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 본원에 기재된 조작된 세포 중 임의의 것에 따르면, 항-세포독성 T 세포 단백질을 코딩하는 외인성 핵산은 조작된 세포의 게놈 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 외인성 핵산은 내인성 TRA 유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 외인성 핵산은 TRAC 도메인을 코딩하는 내인성 TRA 유전자의 영역 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 외인성 핵산의 삽입은 비-기능적 TRAC 도메인을 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 외인성 핵산은 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 외인성 핵산은, 항-세포독성 T 세포 단백질의 발현이 1종 이상의 내인성 IL2RG 조절 요소의 제어 하에 있도록, 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 외인성 핵산은, 조작된 세포에서의 항-세포독성 T 세포 단백질의 발현이 프로모터의 제어 하에 있도록, 항-세포독성 T 세포 단백질을 코딩하는 외인성 핵산의 부분에 작동적으로 연결된 프로모터를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 골수증식성 육종 바이러스 인핸서, 음성 제어 영역 결실된, dl587rev 프라이머-결합 부위 치환된 (MND) 프로모터이다. 일부 실시양태에서, MND 프로모터는 서열식별번호: 62의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 62의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조작된 세포 중 임의의 것에 따르면, 항-CTL 단백질을 코딩하는 외인성 핵산은 조작된 세포의 게놈 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 외인성 핵산은 내인성 TRA 유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 외인성 핵산은 TRAC 도메인을 코딩하는 내인성 TRA 유전자의 영역 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 외인성 핵산의 삽입은 비-기능적 TRAC 도메인을 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 외인성 핵산은 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 외인성 핵산은, 항-CTL 단백질의 발현이 1종 이상의 내인성 IL2RG 조절 요소의 제어 하에 있도록, 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 외인성 핵산은, 조작된 세포에서의 항-CTL 단백질의 발현이 프로모터의 제어 하에 있도록, 항-CTL 단백질을 코딩하는 외인성 핵산의 부분에 작동적으로 연결된 프로모터를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 골수증식성 육종 바이러스 인핸서, 음성 제어 영역 결실된, dl587rev 프라이머-결합 부위 치환된 (MND) 프로모터이다. 일부 실시양태에서, MND 프로모터는 서열식별번호: 62의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 62의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조작된 세포는 제1 CISC 구성성분 및 제2 CISC 구성성분을 포함하는 이량체성 CISC를 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 CISC 구성성분은 제1 세포외 결합 도메인 또는 그의 부분, 제1 막횡단 도메인, 및 제1 신호전달 도메인 또는 그의 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 CISC 구성성분은 제1 힌지 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 CISC 구성성분은 제2 세포외 결합 도메인 또는 그의 부분, 제2 막횡단 도메인, 및 제2 신호전달 도메인 또는 그의 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 CISC 구성성분은 제2 힌지 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 CISC 구성성분은, 발현되는 경우에, 이들이 리간드의 존재 하에서 이량체화하도록 구성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 세포외 결합 도메인 또는 그의 부분은 FK506 결합 단백질 (FKBP) 도메인 또는 그의 부분을 포함하고, 제2 세포외 결합 도메인 또는 그의 부분은 FKBP 라파마이신 결합 (FRB) 도메인 또는 그의 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 세포외 결합 도메인 또는 그의 부분은 FK506 결합 단백질 (FKBP) 도메인 또는 그의 부분을 포함하고, 제1 세포외 결합 도메인 또는 그의 부분은 FKBP 라파마이신 결합 (FRB) 도메인 또는 그의 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 리간드는 라파마이신 또는 라파로그이다. 일부 실시양태에서, 제1 신호전달 도메인은 IL2Rγ로부터 유래된 신호전달 도메인이고/거나, 제1 막횡단 도메인은 IL2Rγ로부터 유래된 막횡단 도메인이고, 제2 신호전달 도메인은 IL2Rβ로부터 유래된 신호전달 도메인이고/거나, 제2 막횡단 도메인은 IL2Rβ로부터 유래된 막횡단 도메인이다. 일부 실시양태에서, 제2 신호전달 도메인은 IL2Rγ로부터 유래된 신호전달 도메인이고/거나, 제2 막횡단 도메인은 IL2Rγ로부터 유래된 막횡단 도메인이고, 제1 신호전달 도메인은 IL2Rβ로부터 유래된 신호전달 도메인이고/거나, 제1 막횡단 도메인은 IL2Rβ로부터 유래된 막횡단 도메인이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조작된 세포는 제1 CISC 구성성분 및 제2 CISC 구성성분을 포함하는 이량체성 CISC를 코딩하는 핵산을 포함하며, 여기서 CISC는 IL2Rγ 및 IL2Rβ 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 CISC 구성성분은 신호전달 도메인을 비롯한 IL2Rγ의 부분을 포함하고, 제2 CISC 구성성분은 신호전달 도메인을 비롯한 IL2Rβ의 부분을 포함하거나, 제2 CISC 구성성분은 신호전달 도메인을 비롯한 IL2Rγ의 부분을 포함하고, 제1 CISC 구성성분은 신호전달 도메인을 비롯한 IL2Rβ의 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 CISC 구성성분은 서열식별번호: 44의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 44의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하는 IL2Rγ의 부분을 포함하고, 제2 CISC 구성성분은 서열식별번호: 45의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 45의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하는 IL2Rβ의 부분을 포함하거나, 제2 CISC 구성성분은 서열식별번호: 44의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 44의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하는 IL2Rγ의 부분을 포함하고, 제1 CISC 구성성분은 서열식별번호: 45의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 45의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하는 IL2Rβ의 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 세포외 결합 도메인 또는 그의 부분은 FK506 결합 단백질 (FKBP) 도메인 또는 그의 부분을 포함하고, 제2 세포외 결합 도메인 또는 그의 부분은 FKBP 라파마이신 결합 (FRB) 도메인 또는 그의 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 세포외 결합 도메인 또는 그의 부분은 FK506 결합 단백질 (FKBP) 도메인 또는 그의 부분을 포함하고, 제1 세포외 결합 도메인 또는 그의 부분은 FKBP 라파마이신 결합 (FRB) 도메인 또는 그의 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, FKBP 도메인은 서열식별번호: 41의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 41의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, FRB는 서열식별번호: 42의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 42의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 CISC 구성성분은 라파마이신 또는 라파로그의 존재 하에서 이량체화하여 신호전달 적격 CISC를 형성한다. 일부 실시양태에서, 라파로그는 에베롤리무스, CCI-779, C20-메탈릴라파마이신, C16-(S)-3-메틸인돌라파마이신, C16-iRap, AP21967, 나트륨 미코페놀산, 베니디핀 히드로클로라이드, AP1903, 또는 AP23573, 또는 이들의 대사물, 유도체, 및/또는 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조작된 세포 중 임의의 것에 따르면, 제1 CISC 구성성분 또는 그의 부분을 코딩하는 제1 외인성 핵산은 조작된 세포의 게놈 내로 삽입되고/거나, 제2 CISC 구성성분 또는 그의 부분을 코딩하는 제2 외인성 핵산은 조작된 세포의 게놈 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 제1 외인성 핵산은 내인성 TRA 유전자 내로 삽입되고/거나, 제2 외인성 핵산은 내인성 TRA 유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 제1 외인성 핵산은 TRAC 도메인을 코딩하는 내인성 TRA 유전자의 영역 내로 삽입되고/거나, 제2 외인성 핵산은 TRAC 도메인을 코딩하는 내인성 TRA 유전자의 영역 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 외인성 핵산의 삽입은 비-기능적 TRAC 도메인을 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 제1 외인성 핵산은 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입되고/거나, 제2 외인성 핵산은 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, IL2Rγ의 부분을 포함하는 CISC 구성성분을 코딩하는 외인성 핵산은 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, IL2Rγ의 부분을 포함하는 CISC 구성성분을 코딩하는 외인성 핵산은, CISC 구성성분의 발현이 1종 이상의 내인성 IL2RG 조절 요소의 제어 하에 있도록, 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, IL2Rγ의 부분을 포함하는 CISC 구성성분의 N-말단 단편을 코딩하는 외인성 핵산은, i) CISC 구성성분의 발현이 1종 이상의 내인성 IL2RG 조절 요소의 제어 하에 있고, ii) CISC 구성성분의 N-말단 단편을 코딩하는 외인성 핵산이 내인성 IL2RG 유전자와 인 프레임으로 삽입되고, CISC 구성성분의 나머지 C-말단 부분은 내인성 IL2RG 유전자의 코딩 서열의 C-말단 부분에 의해 코딩되도록 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 제1 외인성 핵산은, 조작된 세포에서의 제1 CISC 구성성분의 발현이 제1 프로모터의 제어 하에 있도록, 제1 CISC 구성성분 또는 그의 부분을 코딩하는 외인성 핵산의 부분에 작동적으로 연결된 제1 프로모터를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 외인성 핵산은, 조작된 세포에서의 제2 CISC 구성성분의 발현이 제2 프로모터의 제어 하에 있도록, 제2 CISC 구성성분 또는 그의 부분을 코딩하는 외인성 핵산의 부분에 작동적으로 연결된 제2 프로모터를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 CISC 구성성분 또는 그의 부분 및 제2 CISC 구성성분 또는 그의 부분을 코딩하는 단일 외인성 핵산은 조작된 세포의 게놈 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 단일 외인성 핵산은, 조작된 세포에서의 제1 및 제2 CISC 구성성분의 발현이 단일 프로모터의 제어 하에 있도록, 제1 및 제2 CISC 구성성분 또는 그의 부분을 코딩하는 외인성 핵산의 부분에 작동적으로 연결된 단일 프로모터를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1, 제2, 및/또는 단일 프로모터는 골수증식성 육종 바이러스 인핸서, 음성 제어 영역 결실된, dl587rev 프라이머-결합 부위 치환된 (MND) 프로모터이다. 일부 실시양태에서, MND 프로모터는 서열식별번호: 62의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 62의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 조작된 세포는 T 세포, 또는 T 세포로 분화할 수 있는 전구체 세포이다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포는 CD3+, CD8+, 및/또는 CD4+ T 림프구이다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포는 CD8+ T 세포독성 림프구 세포이며, 이는 나이브 CD8+ T 세포, 중심 기억 CD8+ T 세포, 이펙터 기억 CD8+ T 세포, 또는 벌크 CD8+ T 세포를 포함할 수 있다.
림프구 (T 림프구)는 공지된 기법에 따라 수집되고, 공지된 기법, 예컨대 항체에의 친화성 결합, 예컨대 유동 세포계측법 및/또는 면역자성 선택에 의해 풍부화되거나 고갈될 수 있다. 풍부화 및/또는 고갈 단계 후, 바람직한 T 림프구의 시험관내 확장이 공지된 기법 또는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것인 그의 변형에 따라 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, T 세포는 환자로부터 얻어진 자가유래 T 세포이다.
예를 들어, 바람직한 T 세포 집단 또는 하위집단은 초기 T 림프구 집단을 시험관내에서 배양 배지에 첨가한 후, 배양 배지에 공급자 세포, 예컨대 비-분열 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 (예를 들어, 세포의 생성된 집단이 확장되는 초기 집단에서의 각각의 T 림프구에 대해 적어도 5, 10, 20, 또는 40개 이상의 PBMC 공급자 세포를 함유하도록) 첨가하고; 배양물을 (예를 들어 T 세포의 수를 확장시키는데 충분한 시간 동안) 인큐베이션함으로써 확장될 수 있다. 비-분열 공급자 세포는 감마-조사된 PBMC 공급자 세포를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, PBMC는 세포 분열을 방지하기 위해 3000 내지 3600 rads의 범위의 감마 선으로 조사된다. 일부 실시양태에서, PBMC는 세포 분열을 방지하기 위해 3000, 3100, 3200, 3300, 3400, 3500 또는 3600 rads 또는 열거된 값 중 임의의 것의 임의의 2개의 종점 사이의 rads의 임의의 값의 감마 선으로 조사된다. 배양 배지에의 T 세포 및 공급자 세포의 첨가의 순서는 바람직할 경우에 반전될 수 있다. 배양물은 전형적으로 T 림프구의 성장에 적합한 온도 등의 조건 하에서 인큐베이션될 수 있다. 인간 T 림프구의 성장을 위해, 예를 들어, 온도는 일반적으로 적어도 25℃, 적어도 30℃, 또는 적어도 37℃이다. 일부 실시양태에서, 인간 T 림프구의 성장을 위한 온도는 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 37℃, 또는 열거된 값 중 임의의 것의 임의의 2개의 종점 사이의 임의의 다른 온도이다.
T 림프구의 단리 후, 세포독성 및 헬퍼 T 림프구 둘 다는 확장 전에 또는 후에 나이브, 기억, 및 이펙터 T 세포 하위집단으로 분류될 수 있다.
CD8+ 세포는 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용함으로써 얻어질 수 있다. 일부 실시양태에서, CD8+ 세포는 CD8+ 세포의 그들 유형의 각각과 연관된 세포 표면 항원을 확인함으로써 나이브, 중심 기억, 및 이펙터 기억 세포로 더 분류된다. 일부 실시양태에서, 기억 T 세포는 CD8+ 말초 혈액 림프구의 CD62L+ 및 CD62L- 하위세트 둘 다에 존재한다. PBMC는 항-CD8 및 항-CD62L 항체로 염색한 후에 CD62L-CD8+ 및 CD62L+CD8+ 분획으로 분류된다. 일부 실시양태에서, 중심 기억 TCM의 표현형적 마커의 발현은 CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3, 및/또는 CD127을 포함하며, 그란자임 B에 대해 음성이거나 낮다. 일부 실시양태에서, 중심 기억 T 세포는 CD45RO+, CD62L+, 및/또는 CD8+ T 세포이다. 일부 실시양태에서, 이펙터 TE는 CD62L, CCR7, CD28, 및/또는 CD127에 대해 음성이고, 그란자임 B 및/또는 퍼포린에 대해 양성이다. 일부 실시양태에서, 나이브 CD8+ T 림프구는 CD62L, CCR7, CD28, CD3, CD127, 및/또는 CD45RA를 포함하는 나이브 T 세포의 표현형적 마커의 발현을 특징으로 한다.
세포, 예컨대 포유동물 세포, 또는 세포 집단, 예컨대 포유동물 세포의 집단이 확장을 위해 선택되는지 여부는 세포 또는 세포의 집단이 2가지 별개의 유전적 변형 사건을 겪었는지 여부에 의존한다. 세포, 예컨대 포유동물 세포, 또는 세포의 집단, 예컨대 포유동물 세포의 집단이 하나 이하의 유전적 변형 사건을 겪은 경우에, 리간드의 첨가는 이량체화를 발생시키지 않을 것이다. 그러나, 세포, 예컨대 포유동물 세포, 또는 세포의 집단, 예컨대 포유동물 세포의 집단이 2가지 유전적 변형 사건을 겪은 경우에, 리간드의 첨가는 CISC 구성성분의 이량체화, 및 후속 신호전달 캐스케이드를 발생시킬 것이다. 따라서, 세포, 예컨대 포유동물 세포, 또는 세포의 집단, 예컨대 포유동물 세포의 집단은 리간드와의 접촉에 대한 그의 반응에 기초하여 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 리간드는 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100 nM 또는 상기 언급된 값 중 임의의 2개에 의해 한정되는 범위 내의 농도의 양으로 첨가될 수 있다.
일부 실시양태에서, 세포, 예컨대 포유동물 세포, 또는 세포의 집단, 예컨대 포유동물 세포의 집단은 신호전달 경로의 결과로서의 마커의 발현에 기초하여 이량체성 CISC에 대해 양성일 수 있다. 따라서, 이량체성 CISC에 대해 양성인 세포 집단은 표면 마커에 대한 특이적 항체 및 이소타입 매칭된 대조군 항체로의 염색을 사용한 유동 세포계측법에 의해 결정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조작된 세포는 선택가능한 마커를 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 선택가능한 마커는 조작된 세포에 선택적 조건에서, 예컨대 독소의 존재 하에서 또는 영양소의 부재 하에서 생존하는 능력을 부여할 수 있다. 일부 실시양태에서, 선택가능한 마커는 선택가능한 마커를 발현하는 세포의 선택을 허용하는 표면 마커이다. 일부 실시양태에서, 선택가능한 마커는 말단절단된 저-친화도 신경 성장 인자 수용체 (tLNGFR) 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, tLNGFR 폴리펩티드는 서열식별번호: 54의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 54의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 선택가능한 마커를 코딩하는 핵산을 포함하는 본원에 기재된 조작된 세포 중 임의의 것에 따르면, 선택가능한 마커를 코딩하는 외인성 핵산은 조작된 세포의 게놈 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 외인성 핵산은 내인성 TRA 유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 외인성 핵산은 TRAC 도메인을 코딩하는 내인성 TRA 유전자의 영역 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 외인성 핵산의 삽입은 비-기능적 TRAC 도메인을 발생시킨다. TRAC 도메인은 생성된 세포가 기능적 천연 (비변형된) T 세포 수용체를 발현할 수 없는 경우에 비-기능적이다. 일부 실시양태에서, 외인성 핵산은 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 외인성 핵산은, 선택가능한 마커의 발현이 1종 이상의 내인성 IL2RG 조절 요소의 제어 하에 있도록, 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 외인성 핵산은, 조작된 세포에서의 선택가능한 마커의 발현이 프로모터의 제어 하에 있도록, 선택가능한 마커를 코딩하는 외인성 핵산의 부분에 작동적으로 연결된 프로모터를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 골수증식성 육종 바이러스 인핸서, 음성 제어 영역 결실된, dl587rev 프라이머-결합 부위 치환된 (MND) 프로모터이다. 일부 실시양태에서, MND 프로모터는 서열식별번호: 62의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 62의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조작된 세포는 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드는 타크롤리무스 (FK506) 및/또는 시클로스포린 A (CsA)에 대한 저항성을 부여한다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드는 돌연변이체 칼시뉴린 (CN) 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 CN 폴리펩티드는 타크롤리무스 (FK506) 및 시클로스포린 A (CsA)에 대한 저항성을 부여한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 CN 폴리펩티드는 CNb30 (서열식별번호: 55)이다.
일부 실시양태에서, 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 본원에 기재된 조작된 세포 중 임의의 것에 따르면, 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산은 조작된 세포의 게놈 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 외인성 핵산은 내인성 TRA 유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 외인성 핵산은 TRAC 도메인을 코딩하는 내인성 TRA 유전자의 영역 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 외인성 핵산의 삽입은 비-기능적 TRAC 도메인을 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 외인성 핵산은 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 외인성 핵산은, 선택가능한 마커의 발현이 1종 이상의 내인성 IL2RG 조절 요소의 제어 하에 있도록, 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 외인성 핵산은, 조작된 세포에서의 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드의 발현이 프로모터의 제어 하에 있도록, 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산의 부분에 작동적으로 연결된 프로모터를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 골수증식성 육종 바이러스 인핸서, 음성 제어 영역 결실된, dl587rev 프라이머-결합 부위 치환된 (MND) 프로모터이다. 일부 실시양태에서, MND 프로모터는 서열식별번호: 62의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 62의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조작된 세포는 라파마이신에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 포유동물 라파마이신의 표적 (mTOR) 키나제의 FKBP-라파마이신 결합 (FRB) 도메인 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 라파마이신에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드는 서열식별번호: 56 또는 57의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 56 또는 57의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 라파마이신에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 본원에 기재된 조작된 세포 중 임의의 것에 따르면, 라파마이신에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산은 조작된 세포의 게놈 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 외인성 핵산은 내인성 TRA 유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 외인성 핵산은 TRAC 도메인을 코딩하는 내인성 TRA 유전자의 영역 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 외인성 핵산의 삽입은 비-기능적 TRAC 도메인을 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 외인성 핵산은 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 외인성 핵산은, 선택가능한 마커의 발현이 1종 이상의 내인성 IL2RG 조절 요소의 제어 하에 있도록, 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 외인성 핵산은, 조작된 세포에서의 라파마이신에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드의 발현이 프로모터의 제어 하에 있도록, 라파마이신에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산의 부분에 작동적으로 연결된 프로모터를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 골수증식성 육종 바이러스 인핸서, 음성 제어 영역 결실된, dl587rev 프라이머-결합 부위 치환된 (MND) 프로모터이다. 일부 실시양태에서, MND 프로모터는 서열식별번호: 62의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 62의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조작된 세포 중 임의의 것에 따르면, 조작된 세포는 하기 시스템 구성성분을 코딩하는 핵산을 포함한다: i) 항-CTL 단백질; ii) IL2Rβ 신호전달 도메인을 포함하는 제1 CISC 구성성분; iii) 라파마이신에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드; iv) 선택가능한 마커; v) 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드; 및 vi) IL2Rγ 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CISC 구성성분. 일부 실시양태에서, 조작된 세포는 제1 코딩 카세트를 포함하는 핵산 및 제2 코딩 카세트를 포함하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 코딩 카세트는 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 선택가능한 마커를 코딩하는 핵산, 및 제1 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 코딩 카세트는 라파마이신에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 항-CTL 단백질을 코딩하는 핵산, 및 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포는, 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 발현이 제1 프로모터의 제어 하에 있도록, 제1 코딩 카세트에 작동적으로 연결된 제1 프로모터를 포함하는 제1 폴리시스트론성 발현 카세트를 포함하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 프로모터는 외인성 프로모터이고, 제1 폴리시스트론성 발현 카세트는 내인성 유전자에 삽입된 제1 외인성 핵산을 포함하며, 여기서 제1 외인성 핵산은 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 상류에 합성 폴리A 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 프로모터는 MND 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 제1 프로모터는 제1 내인성 유전자의 내인성 프로모터이고, 제1 폴리시스트론성 발현 카세트는 제1 내인성 유전자에 삽입된 제1 외인성 핵산을 포함하며, 여기서 제1 외인성 핵산은 제1 코딩 카세트의 상류에 2A 자기-절단 펩티드를 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 내인성 유전자는 내인성 TRA 유전자이다. 일부 실시양태에서, 제1 외인성 핵산은 TRAC 도메인을 코딩하는 내인성 TRA 유전자의 영역 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 제1 외인성 핵산의 삽입은 비-기능적 TRAC 도메인을 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포는, 제2 폴리시스트론성 발현 카세트의 발현이 제2 프로모터의 제어 하에 있도록, 제2 코딩 서열에 작동적으로 연결된 제2 프로모터를 포함하는 제2 폴리시스트론성 발현 카세트를 포함하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 프로모터는 외인성 프로모터이고, 제2 폴리시스트론성 발현 카세트는 제2 내인성 유전자에 삽입된 제2 외인성 핵산을 포함하며, 여기서 제2 외인성 핵산은 제2 코딩 카세트에 작동적으로 연결된 제2 프로모터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 프로모터는 MND 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 제2 내인성 유전자는 내인성 IL2RG 유전자이다. 일부 실시양태에서, 제2 내인성 유전자는 내인성 IL2RG 유전자이고, 제2 외인성 핵산은 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편을 포함하고, 제2 외인성 핵산은, 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편이 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결되고, 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결된 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편이 함께 제2 CISC 구성성분을 코딩하도록, 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 제1 폴리시스트론성 발현 카세트는 서열식별번호: 37-39 중 어느 하나로부터의 인접한 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 폴리시스트론성 발현 카세트는 서열식별번호: 40으로부터의 인접한 뉴클레오티드의 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리시스트론성 발현 카세트를 포함하는 본원에 기재된 조작된 세포 중 임의의 것에 따르면, 폴리시스트론성 발현 카세트는 인접한 시스템 구성성분-코딩 핵산 사이에 2A 자기-절단 펩티드를 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리시스트론성 발현 카세트는 각각의 인접한 시스템 구성성분-코딩 핵산 사이에 2A 자기-절단 펩티드를 코딩하는 핵산을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 폴리시스트론성 발현 카세트는 5'에서 3'로의 순서로, 라파마이신에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 2A 자기-절단 펩티드를 코딩하는 핵산, 항-CTL 단백질을 코딩하는 핵산, 2A 자기-절단 펩티드를 코딩하는 핵산, 및 제2 CISC 구성성분 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 2A 자기-절단 펩티드는 독립적으로 T2A 자기-절단 펩티드 또는 P2A 자기-절단 펩티드이다. 일부 실시양태에서, T2A 자기-절단 펩티드는 서열식별번호: 60의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 60의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, P2A 자기-절단 펩티드는 서열식별번호: 61의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 61의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조작된 세포 중 임의의 것에 따르면, 조작된 세포는 하기 시스템 구성성분을 코딩하는 핵산을 포함한다: i) IL2Rβ 신호전달 도메인을 포함하는 제1 CISC 구성성분; ii) IL2Rγ 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CISC 구성성분; 및 iii) 선택가능한 마커. 일부 실시양태에서, 조작된 세포는 제1 코딩 카세트를 포함하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 코딩 카세트는 제1 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산, 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산, 및 선택가능한 마커를 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포는, 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 발현이 제1 프로모터의 제어 하에 있도록, 제1 코딩 카세트에 작동적으로 연결된 제1 프로모터를 포함하는 제1 폴리시스트론성 발현 카세트를 포함하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 프로모터는 외인성 프로모터이고, 조작된 세포는 내인성 유전자에 삽입된 제1 외인성 핵산을 포함하며, 여기서 제1 외인성 핵산은 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 상류에 합성 폴리A 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 프로모터는 MND 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 제1 프로모터는 제1 내인성 유전자의 내인성 프로모터이고, 제1 폴리시스트론성 발현 카세트는 제1 내인성 유전자에 삽입된 제1 외인성 핵산을 포함하며, 여기서 제1 외인성 핵산은 제1 코딩 카세트의 상류에 2A 자기-절단 펩티드를 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 내인성 유전자는 내인성 TRA 유전자이다. 일부 실시양태에서, 제1 외인성 핵산은 TRAC 도메인을 코딩하는 내인성 TRA 유전자의 영역 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 제1 외인성 핵산의 삽입은 비-기능적 TRAC 도메인을 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 제1 내인성 유전자는 내인성 IL2RG 유전자이다. 일부 실시양태에서, 제1 내인성 유전자는 내인성 IL2RG 유전자이고, 제1 외인성 핵산은 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편을 포함하고, 제1 외인성 핵산은 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편이 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결되도록 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입되고, 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결된 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편은 함께 제2 CISC 구성성분을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 제1 폴리시스트론성 발현 카세트는 서열식별번호: 19-25, 27, 및 35 중 어느 하나로부터의 인접한 뉴클레오티드의 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조작된 세포 중 임의의 것에 따르면, 조작된 세포는 하기 시스템 구성성분을 코딩하는 핵산을 포함한다: i) IL2Rβ 신호전달 도메인을 포함하는 제1 CISC 구성성분; ii) IL2Rγ 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CISC 구성성분; iii) 선택가능한 마커; 및 iv) 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드. 일부 실시양태에서, 조작된 세포는 제1 코딩 카세트를 포함하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 코딩 카세트는 제1 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산, 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산, 선택가능한 마커를 코딩하는 핵산, 및 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포는, 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 발현이 제1 프로모터의 제어 하에 있도록, 제1 코딩 카세트에 작동적으로 연결된 제1 프로모터를 포함하는 제1 폴리시스트론성 발현 카세트를 포함하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 프로모터는 외인성 프로모터이고, 조작된 세포는 내인성 유전자에 삽입된 제1 외인성 핵산을 포함하며, 여기서 제1 외인성 핵산은 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 상류에 합성 폴리A 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 프로모터는 MND 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 제1 프로모터는 제1 내인성 유전자의 내인성 프로모터이고, 제1 폴리시스트론성 발현 카세트는 제1 내인성 유전자에 삽입된 제1 외인성 핵산을 포함하며, 여기서 제1 외인성 핵산은 제1 코딩 카세트의 상류에 2A 자기-절단 펩티드를 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 내인성 유전자는 내인성 TRA 유전자이다. 일부 실시양태에서, 제1 외인성 핵산은 TRAC 도메인을 코딩하는 내인성 TRA 유전자의 영역 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 제1 외인성 핵산의 삽입은 비-기능적 TRAC 도메인을 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 제1 내인성 유전자는 내인성 IL2RG 유전자이다. 일부 실시양태에서, 제1 내인성 유전자는 내인성 IL2RG 유전자이고, 제1 외인성 핵산은 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편을 포함하고, 제1 외인성 핵산은 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편이 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결되도록 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입되고, 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결된 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편은 함께 제2 CISC 구성성분을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 제1 폴리시스트론성 발현 카세트는 서열식별번호: 26, 28, 및 36 중 어느 하나로부터의 인접한 뉴클레오티드의 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조작된 세포 중 임의의 것에 따르면, 조작된 세포는 하기 시스템 구성성분을 코딩하는 핵산을 포함한다: i) IL2Rβ 신호전달 도메인을 포함하는 제1 CISC 구성성분; ii) IL2Rγ 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CISC 구성성분; 및 iii) 항-CTL 단백질. 일부 실시양태에서, 조작된 세포는 제1 코딩 카세트를 포함하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 코딩 카세트는 제1 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산, 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산, 및 항-CTL 단백질을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포는, 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 발현이 제1 프로모터의 제어 하에 있도록, 제1 코딩 카세트에 작동적으로 연결된 제1 프로모터를 포함하는 제1 폴리시스트론성 발현 카세트를 포함하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 프로모터는 외인성 프로모터이고, 제1 폴리시스트론성 발현 카세트는 내인성 유전자에 삽입된 제1 외인성 핵산을 포함하며, 여기서 제1 외인성 핵산은 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 상류에 합성 폴리A 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 프로모터는 MND 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 제1 프로모터는 제1 내인성 유전자의 내인성 프로모터이고, 제1 폴리시스트론성 발현 카세트는 제1 내인성 유전자에 삽입된 제1 외인성 핵산을 포함하며, 여기서 제1 외인성 핵산은 제1 코딩 카세트의 상류에 2A 자기-절단 펩티드를 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 내인성 유전자는 내인성 TRA 유전자이다. 일부 실시양태에서, 제1 외인성 핵산은 TRAC 도메인을 코딩하는 내인성 TRA 유전자의 영역 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 제1 외인성 핵산의 삽입은 비-기능적 TRAC 도메인을 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 제1 내인성 유전자는 내인성 IL2RG 유전자이다. 일부 실시양태에서, 제1 내인성 유전자는 내인성 IL2RG 유전자이고, 제1 외인성 핵산은 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편을 포함하고, 제1 외인성 핵산은 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편이 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결되도록 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입되고, 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결된 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편은 함께 제2 CISC 구성성분을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 제1 폴리시스트론성 발현 카세트는 서열식별번호: 29 또는 31로부터의 인접한 뉴클레오티드의 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조작된 세포 중 임의의 것에 따르면, 조작된 세포는 하기 시스템 구성성분을 코딩하는 핵산을 포함한다: i) IL2Rβ 신호전달 도메인을 포함하는 제1 CISC 구성성분; ii) IL2Rγ 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CISC 구성성분; iii) 항-CTL 단백질; 및 iv) 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드. 일부 실시양태에서, 조작된 세포는 제1 코딩 카세트를 포함하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 코딩 카세트는 제1 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산, 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산, 항-CTL 단백질을 코딩하는 핵산, 및 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포는, 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 발현이 제1 프로모터의 제어 하에 있도록, 제1 코딩 카세트에 작동적으로 연결된 제1 프로모터를 포함하는 제1 폴리시스트론성 발현 카세트를 포함하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 프로모터는 외인성 프로모터이고, 제1 폴리시스트론성 발현 카세트는 내인성 유전자에 삽입된 제1 외인성 핵산을 포함하며, 여기서 제1 외인성 핵산은 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 상류에 합성 폴리A 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 프로모터는 MND 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 제1 프로모터는 제1 내인성 유전자의 내인성 프로모터이고, 제1 폴리시스트론성 발현 카세트는 제1 내인성 유전자에 삽입된 제1 외인성 핵산을 포함하며, 여기서 제1 외인성 핵산은 제1 코딩 카세트의 상류에 2A 자기-절단 펩티드를 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 내인성 유전자는 내인성 TRA 유전자이다. 일부 실시양태에서, 제1 외인성 핵산은 TRAC 도메인을 코딩하는 내인성 TRA 유전자의 영역 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 제1 외인성 핵산의 삽입은 비-기능적 TRAC 도메인을 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 제1 내인성 유전자는 내인성 IL2RG 유전자이다. 일부 실시양태에서, 제1 내인성 유전자는 내인성 IL2RG 유전자이고, 제1 외인성 핵산은 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편을 포함하고, 제1 외인성 핵산은 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편이 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결되도록 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입되고, 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결된 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편은 함께 제2 CISC 구성성분을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 제1 폴리시스트론성 발현 카세트는 서열식별번호: 30 또는 32로부터의 인접한 뉴클레오티드의 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조작된 세포 중 임의의 것에 따르면, 조작된 세포는 하기 시스템 구성성분을 코딩하는 핵산을 포함한다: i) IL2Rβ 신호전달 도메인을 포함하는 제1 CISC 구성성분; ii) IL2Rγ 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CISC 구성성분; iii) 항-CTL 단백질; 및 iv) 선택가능한 마커. 일부 실시양태에서, 조작된 세포는 제1 코딩 카세트를 포함하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 코딩 카세트는 제1 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산, 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산, 항-CTL 단백질을 코딩하는 핵산, 및 선택가능한 마커를 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포는, 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 발현이 제1 프로모터의 제어 하에 있도록, 제1 코딩 카세트에 작동적으로 연결된 제1 프로모터를 포함하는 제1 폴리시스트론성 발현 카세트를 포함하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 프로모터는 외인성 프로모터이고, 제1 폴리시스트론성 발현 카세트는 내인성 유전자에 삽입된 제1 외인성 핵산을 포함하며, 여기서 제1 외인성 핵산은 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 상류에 합성 폴리A 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 프로모터는 MND 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 제1 프로모터는 제1 내인성 유전자의 내인성 프로모터이고, 제1 폴리시스트론성 발현 카세트는 제1 내인성 유전자에 삽입된 제1 외인성 핵산을 포함하며, 여기서 제1 외인성 핵산은 제1 코딩 카세트의 상류에 2A 자기-절단 펩티드를 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 내인성 유전자는 내인성 TRA 유전자이다. 일부 실시양태에서, 제1 외인성 핵산은 TRAC 도메인을 코딩하는 내인성 TRA 유전자의 영역 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 제1 외인성 핵산의 삽입은 비-기능적 TRAC 도메인을 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 제1 내인성 유전자는 내인성 IL2RG 유전자이다. 일부 실시양태에서, 제1 내인성 유전자는 내인성 IL2RG 유전자이고, 제1 외인성 핵산은 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편을 포함하고, 제1 외인성 핵산은 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편이 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결되도록 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입되고, 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결된 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편은 함께 제2 CISC 구성성분을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 제1 폴리시스트론성 발현 카세트는 서열식별번호: 33 또는 34로부터의 인접한 뉴클레오티드의 서열을 포함한다.
게놈을 편집하는 방법
일부 실시양태에서, 세포 게놈을 편집하는 방법으로서, 특히, 세포 게놈을 i) CTL에 대한 세포독성을 세포에 부여할 수 있는 항-CTL 단백질, 및 ii) 이량체화 활성화가능한 화학적으로 유도된 신호전달 복합체 (CISC)의 폴리펩티드 구성성분의 발현을 허용하도록 편집하며, 여기서 신호전달-적격 CISC가 세포의 생존 및/또는 증식을 촉진시키는 신호전달 경로에서 자극성 신호를 생성할 수 있는 것인 방법이 본원에서 제공된다.
한 측면에서, 조작된 세포를 생산하기 위해 세포 게놈을 편집하는 방법으로서, a) 본원에 기재된 실시양태 중 임의의 것에 따른 제1 gRNA 및/또는 제2 gRNA, b) 본원에 기재된 실시양태 중 임의의 것에 따른 RGEN 또는 RGEN을 코딩하는 핵산, 및 c) i) CTL에 대한 세포독성을 조작된 세포에 부여할 수 있는 항-CTL 단백질; 및 ii) 이량체화 활성화가능한 화학적으로 유도된 신호전달 복합체 (CISC)의 폴리펩티드 구성성분을 코딩하는 핵산을 포함하는 본원에 기재된 실시양태 중 임의의 것에 따른 1종 이상의 공여자 주형을 세포에 제공하는 것을 포함하며, 여기서 신호전달-적격 CISC가 조작된 세포의 생존 및/또는 증식을 촉진시키는 신호전달 경로에서 자극성 신호를 생성할 수 있는 것인 방법이 본원에서 제공된다. 일부 실시양태에서, CISC는 제1 CISC 구성성분 및 제2 CISC 구성성분을 포함하며, 여기서 제1 CISC 구성성분 및 제2 CISC 구성성분은, 조작된 세포에 의해 발현되는 경우에, 이들이 리간드의 존재 하에서 이량체화하여 신호전달-적격 CISC를 생성하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포는 리간드의 부재 하에서 생존하고/거나 증식할 수 없다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포는 세포의 생존 및/또는 증식에 관여하는 내인성 신호전달 경로에 있어서 결함성이며, 신호전달-적격 CISC는 조작된 세포가 생존하고/거나 증식할 수 있도록 결함성 내인성 신호전달 경로를 보충할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-CTL 단백질은 세포외 β2-마이크로글로불린 도메인을 포함하는 키메라 수용체이다. 일부 실시양태에서, 항-CTL 단백질은 세포외 β2-마이크로글로불린 도메인, 막횡단 도메인, 공동-자극성 도메인, 및 세포질 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 수용체이다. 일부 실시양태에서, 세포외 β2-마이크로글로불린 도메인은 서열식별번호: 49의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 49의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체 막횡단 도메인은 CD8 막횡단 도메인 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체 CD8 막횡단 도메인은 서열식별번호: 50의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 50의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체 공동-자극성 도메인은 4-1BB 공동-자극성 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체 4-1BB 공동-자극성 도메인은 서열식별번호: 51의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 51의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체 세포질 신호전달 도메인은 CD3-ζ 세포질 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체 CD3-ζ 세포질 신호전달 도메인은 서열식별번호: 52의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 52의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체는 서열식별번호: 53의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 53의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 CISC 구성성분은 IL2Rβ 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 CISC 구성성분의 제1 세포외 결합 도메인은 FRB 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 CISC 구성성분은 서열식별번호: 48의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 48의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 CISC 구성성분은 IL2Rγ 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 CISC 구성성분의 제2 세포외 결합 도메인은 FKBP 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 CISC 구성성분은 서열식별번호: 47의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 47의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 공여자 주형은 iii) 선택가능한 마커; iv) 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드; 또는 v) 라파마이신에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드 중 1종 이상을 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 라파마이신에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드는 FRB 도메인 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, FRB 도메인 폴리펩티드는 서열식별번호: 56 또는 57의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 56 또는 57의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 선택가능한 마커는 tLNGFR 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, tLNGFR 폴리펩티드는 서열식별번호: 54의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 54의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드는 돌연변이체 CN 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 CN 폴리펩티드는 CNb30 (서열식별번호: 55)이다. 일부 실시양태에서, 세포는 T 세포, 예컨대 세포독성 T 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 T 세포 전구체, 예컨대 세포독성 T 세포로 분화할 수 있는 세포이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 세포의 게놈을 편집하는 방법 중 임의의 것에 따르면, 1종 이상의 공여자 주형은 하기 시스템 구성성분을 코딩하는 핵산을 포함한다: i) 항-CTL 단백질; ii) IL2Rβ 신호전달 도메인을 포함하는 제1 CISC 구성성분; iii) 라파마이신에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드; iv) 선택가능한 마커; v) 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드; 및 vi) IL2Rγ 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CISC 구성성분 또는 그의 단편. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 공여자 주형은 제1 공여자 주형 및 제2 공여자 주형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 내인성 유전자에 삽입되도록 구성되고, 제2 공여자 주형은 제2 내인성 유전자에 삽입되도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 코딩 카세트를 포함하고, 제2 공여자 주형은 제2 코딩 카세트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 코딩 카세트는 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 선택가능한 마커를 코딩하는 핵산, 및 제1 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 코딩 카세트는 라파마이신에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 항-CTL 단백질을 코딩하는 핵산, 및 제2 CISC 구성성분 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은, 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 발현이 제1 프로모터의 제어 하에 있도록, 제1 코딩 카세트에 작동적으로 연결된 제1 프로모터를 포함하는 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 상류에 합성 폴리A 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 프로모터는 MND 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 제1 내인성 유전자는 내인성 TRA 유전자이다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 TRAC 도메인을 코딩하는 내인성 TRA 유전자의 영역 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형의 삽입은 비-기능적 TRAC 도메인을 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 제2 공여자 주형은, 제2 폴리시스트론성 발현 카세트의 발현이 제2 프로모터의 제어 하에 있도록, 제2 코딩 카세트에 작동적으로 연결된 제2 프로모터를 포함하는 제2 폴리시스트론성 발현 카세트 또는 그의 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 프로모터는 MND 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 제2 내인성 유전자는 내인성 IL2RG 유전자이다. 일부 실시양태에서, 제2 내인성 유전자는 내인성 IL2RG 유전자이고, 제2 공여자 주형은 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편을 포함하는 핵산을 포함하는 제2 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분을 포함하고, 제2 공여자 주형은 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입되는 경우에, 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편이 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결되고, 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결된 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편이 함께 제2 CISC 구성성분을 코딩하고, 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결된 제2 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분이 함께 제2 폴리시스트론성 발현 카세트를 포함하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 서열식별번호: 37-39 중 어느 하나로부터의 인접한 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 공여자 주형은 서열식별번호: 40으로부터의 인접한 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 AAV 벡터이고/거나, 제2 공여자 주형은 제2 AAV 벡터이다. 일부 실시양태에서, 제1 AAV 벡터는 서열식별번호: 37-39 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 37-39 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 AAV 벡터는 서열식별번호: 40의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 40의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 세포의 게놈을 편집하는 방법 중 임의의 것에 따르면, 1종 이상의 공여자 주형은 하기 시스템 구성성분을 코딩하는 핵산을 포함한다: i) IL2Rβ 신호전달 도메인을 포함하는 제1 CISC 구성성분; ii) IL2Rγ 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CISC 구성성분 또는 그의 단편; 및 iii) 선택가능한 마커. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 공여자 주형은 제1 공여자 주형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 내인성 유전자에 삽입되도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 코딩 카세트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 코딩 카세트는 제1 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산, 제2 CISC 구성성분 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산, 및 선택가능한 마커를 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은, 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 발현이 제1 프로모터의 제어 하에 있도록, 제1 코딩 카세트에 작동적으로 연결된 제1 프로모터를 포함하는 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 상류에 합성 폴리A 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 프로모터는 MND 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 제1 내인성 유전자는 내인성 TRA 유전자이다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 TRAC 도메인을 코딩하는 내인성 TRA 유전자의 영역 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형의 삽입은 비-기능적 TRAC 도메인을 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은, 제1 공여자 주형이 제1 내인성 유전자에 삽입되는 경우에, 제1 폴리시스트론성 발현 카세트가 제1 내인성 유전자의 내인성 프로모터의 제어 하에 있도록, 제1 코딩 카세트의 상류에 2A 자기-절단 펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 내인성 유전자는 내인성 IL2RG 유전자이다. 일부 실시양태에서, 제1 내인성 유전자는 내인성 IL2RG 유전자이고, 제1 공여자 주형은 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편을 포함하는 핵산을 포함하는 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분을 포함하고, 제1 공여자 주형은 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입되는 경우에, 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편이 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결되고, 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결된 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편이 함께 제2 CISC 구성성분을 코딩하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 서열식별번호: 19-25, 27, 및 35 중 어느 하나로부터의 인접한 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 AAV 벡터이다. 일부 실시양태에서, 제1 AAV 벡터는 서열식별번호: 19-25, 27, 및 35 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 19-25, 27, 및 35 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 세포의 게놈을 편집하는 방법 중 임의의 것에 따르면, 1종 이상의 공여자 주형은 하기 시스템 구성성분을 코딩하는 핵산을 포함한다: i) IL2Rβ 신호전달 도메인을 포함하는 제1 CISC 구성성분; ii) IL2Rγ 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CISC 구성성분 또는 그의 단편; iii) 선택가능한 마커; 및 iv) 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 공여자 주형은 제1 공여자 주형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 내인성 유전자에 삽입되도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 코딩 카세트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 코딩 카세트는 제1 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산, 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산, 선택가능한 마커를 코딩하는 핵산, 및 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은, 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 발현이 제1 프로모터의 제어 하에 있도록, 제1 코딩 카세트에 작동적으로 연결된 제1 프로모터를 포함하는 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 상류에 합성 폴리A 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 프로모터는 MND 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은, 제1 공여자 주형이 제1 내인성 유전자에 삽입되는 경우에, 제1 폴리시스트론성 발현 카세트가 제1 내인성 유전자의 내인성 프로모터의 제어 하에 있도록, 제1 코딩 카세트의 상류에 2A 자기-절단 펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 내인성 유전자는 내인성 IL2RG 유전자이다. 일부 실시양태에서, 제1 내인성 유전자는 내인성 IL2RG 유전자이고, 제1 공여자 주형은 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편을 포함하는 핵산을 포함하는 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분을 포함하고, 제1 공여자 주형은 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입되는 경우에, 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편이 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결되고, 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결된 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편이 함께 제2 CISC 구성성분을 코딩하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 서열식별번호: 26, 28, 및 36 중 어느 하나로부터의 인접한 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 AAV 벡터이다. 일부 실시양태에서, 제1 AAV 벡터는 서열식별번호: 26, 28, 및 36 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 26, 28, 및 36 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 세포의 게놈을 편집하는 방법 중 임의의 것에 따르면, 1종 이상의 공여자 주형은 하기 시스템 구성성분을 코딩하는 핵산을 포함한다: i) IL2Rβ 신호전달 도메인을 포함하는 제1 CISC 구성성분; ii) IL2Rγ 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CISC 구성성분 또는 그의 단편; 및 iii) 항-CTL 단백질. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 공여자 주형은 제1 공여자 주형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 내인성 유전자에 삽입되도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 코딩 카세트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 코딩 카세트는 제1 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산, 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산, 및 항-CTL 단백질을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은, 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 발현이 제1 프로모터의 제어 하에 있도록, 제1 코딩 카세트에 작동적으로 연결된 제1 프로모터를 포함하는 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분의 상류에 합성 폴리A 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 프로모터는 MND 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은, 제1 공여자 주형이 제1 내인성 유전자에 삽입되는 경우에, 제1 폴리시스트론성 발현 카세트가 제1 내인성 유전자의 내인성 프로모터의 제어 하에 있도록, 제1 코딩 카세트의 상류에 2A 자기-절단 펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 내인성 유전자는 내인성 IL2RG 유전자이다. 일부 실시양태에서, 제1 내인성 유전자는 내인성 IL2RG 유전자이고, 제1 공여자 주형은 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편을 포함하는 핵산을 포함하는 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분을 포함하고, 제1 공여자 주형은 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입되는 경우에, 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편이 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결되고, 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결된 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편이 함께 제2 CISC 구성성분을 코딩하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 서열식별번호: 29 또는 31로부터의 인접한 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 AAV 벡터이다. 일부 실시양태에서, 제1 AAV 벡터는 서열식별번호: 29 또는 31의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 29 또는 31의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 세포의 게놈을 편집하는 방법 중 임의의 것에 따르면, 1종 이상의 공여자 주형은 하기 시스템 구성성분을 코딩하는 핵산을 포함한다: i) IL2Rβ 신호전달 도메인을 포함하는 제1 CISC 구성성분; ii) IL2Rγ 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CISC 구성성분 또는 그의 단편; iii) 항-CTL 단백질; 및 iv) 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 공여자 주형은 제1 공여자 주형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 내인성 유전자에 삽입되도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 코딩 카세트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 코딩 카세트는 제1 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산, 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산, 항-CTL 단백질을 코딩하는 핵산, 및 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은, 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 발현이 제1 프로모터의 제어 하에 있도록, 제1 코딩 카세트에 작동적으로 연결된 제1 프로모터를 포함하는 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분의 상류에 합성 폴리A 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 프로모터는 MND 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은, 제1 공여자 주형이 제1 내인성 유전자에 삽입되는 경우에, 제1 폴리시스트론성 발현 카세트가 제1 내인성 유전자의 내인성 프로모터의 제어 하에 있도록, 제1 코딩 카세트의 상류에 2A 자기-절단 펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 내인성 유전자는 내인성 IL2RG 유전자이다. 일부 실시양태에서, 제1 내인성 유전자는 내인성 IL2RG 유전자이고, 제1 공여자 주형은 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편을 포함하는 핵산을 포함하는 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분을 포함하고, 제1 공여자 주형은 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입되는 경우에, 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편이 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결되고, 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결된 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편이 함께 제2 CISC 구성성분을 코딩하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 서열식별번호: 30 또는 32로부터의 인접한 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 AAV 벡터이다. 일부 실시양태에서, 제1 AAV 벡터는 서열식별번호: 30 또는 32의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 30 또는 32의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 세포의 게놈을 편집하는 방법 중 임의의 것에 따르면, 1종 이상의 공여자 주형은 하기 시스템 구성성분을 코딩하는 핵산을 포함한다: i) IL2Rβ 신호전달 도메인을 포함하는 제1 CISC 구성성분; ii) IL2Rγ 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CISC 구성성분 또는 그의 단편; iii) 항-CTL 단백질; 및 iv) 선택가능한 마커. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 공여자 주형은 제1 공여자 주형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 내인성 유전자에 삽입되도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 코딩 카세트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 코딩 카세트는 제1 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산, 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산, 항-CTL 단백질을 코딩하는 핵산, 및 선택가능한 마커를 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은, 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 발현이 제1 프로모터의 제어 하에 있도록, 제1 코딩 카세트에 작동적으로 연결된 제1 프로모터를 포함하는 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분의 상류에 합성 폴리A 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 프로모터는 MND 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은, 제1 공여자 주형이 제1 내인성 유전자에 삽입되는 경우에, 제1 폴리시스트론성 발현 카세트가 제1 내인성 유전자의 내인성 프로모터의 제어 하에 있도록, 제1 코딩 카세트의 상류에 2A 자기-절단 펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 내인성 유전자는 내인성 IL2RG 유전자이다. 일부 실시양태에서, 제1 내인성 유전자는 내인성 IL2RG 유전자이고, 제1 공여자 주형은 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편을 포함하는 핵산을 포함하는 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분을 포함하고, 제1 공여자 주형은 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입되는 경우에, 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편이 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결되고, 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결된 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편이 함께 제2 CISC 구성성분을 코딩하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 서열식별번호: 33 또는 34로부터의 인접한 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 AAV 벡터이다. 일부 실시양태에서, 제1 AAV 벡터는 서열식별번호: 33 또는 34의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 33 또는 34의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 세포의 게놈을 편집하는 방법 중 임의의 것에 따르면, 방법은 제1 gRNA, 제2 gRNA, RGEN 또는 RGEN을 코딩하는 핵산, 제1 벡터, 및 제2 벡터를 세포에 제공하는 것을 포함하며, 여기서 (A) 제1 gRNA는 서열식별번호: 1의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 1의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 벡터는 서열식별번호: 37의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 37의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 gRNA는 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 벡터는 서열식별번호: 40의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 40의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하거나; (B) 제1 gRNA는 서열식별번호: 2의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 2의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 벡터는 서열식별번호: 38의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 38의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 gRNA는 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 벡터는 서열식별번호: 40의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 40의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하거나; (C) 제1 gRNA는 서열식별번호: 3의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 3의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 벡터는 서열식별번호: 39의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 39의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 gRNA는 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 벡터는 서열식별번호: 40의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 40의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 세포의 게놈을 편집하는 방법 중 임의의 것에 따르면, 방법은 제1 gRNA, RGEN 또는 RGEN을 코딩하는 핵산, 및 제1 벡터를 세포에 제공하는 것을 포함하며, 여기서 (A) 제1 gRNA는 서열식별번호: 1의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 1의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 벡터는 서열식별번호: 19 또는 22의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 19 또는 22의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하거나; (B) 제1 gRNA는 서열식별번호: 2의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 2의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 벡터는 서열식별번호: 20 또는 23의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 20 또는 23의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하거나; (C) 제1 gRNA는 서열식별번호: 3의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 3의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 벡터는 서열식별번호: 21 또는 24의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 21 또는 24의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 세포의 게놈을 편집하는 방법 중 임의의 것에 따르면, 방법은 제1 gRNA, RGEN 또는 RGEN을 코딩하는 핵산, 및 제1 벡터를 세포에 제공하는 것을 포함하며, 여기서 제1 gRNA는 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 벡터는 서열식별번호: 25-36 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 25-36 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 세포의 게놈을 편집하는 방법 중 임의의 것에 따르면, RGEN은 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (또한 Csn1 및 Csx12로 공지됨), Cas100, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, 및 Cpf1 엔도뉴클레아제, 또는 그의 기능적 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, RGEN은 Cas9이다. 일부 실시양태에서, RGEN을 코딩하는 핵산은 리보핵산 (RNA) 서열이다. 일부 실시양태에서, RGEN을 코딩하는 RNA 서열은 공유 결합을 통해 제1 gRNA 또는 제2 gRNA에 연결된다. 일부 실시양태에서, RGEN은, 세포에의 제공 전에, 제1 gRNA 및/또는 제2 gRNA와 예비복합체화되어 RNP 복합체를 형성한다. 일부 실시양태에서, RGEN은 각각 1:1 내지 20:1의 gRNA 내지 RGEN의 몰비로 제1 gRNA 및/또는 제2 gRNA와 예비복합체화된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 세포의 게놈을 편집하는 방법 중 임의의 것에 따르면, 세포는 T 세포이다. 일부 실시양태에서, T 세포는 CD8+ 세포독성 T 림프구 또는 CD3+ pan T 세포이다. 일부 실시양태에서, T 세포는 다중 공여자로부터 유래된 T 세포의 풀의 구성원이다. 일부 실시양태에서, 다중 공여자는 인간 공여자이다. 일부 실시양태에서, 세포는 CTL에 대해 세포독성이다.
치료의 방법
일부 실시양태에서, 유해 CTL-매개된 면역 반응을 특징으로 하는 질환 또는 상태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 상기 질환 또는 상태를 치료하는 방법으로서, 1) T 세포의 게놈을 본원에 기재된 방법 중 임의의 것에 따라 편집함으로써 조작된 T 세포를 생산하고, 조작된 T 세포를 대상체에게 투여하거나; 또는 2) 대상체에서의 T 세포의 게놈을 본원에 기재된 방법 중 임의의 것에 따라 편집함으로써 대상체에서 조작된 T 세포를 생산하는 것을 포함하는 방법이 본원에서 제공된다. 일부 실시양태에서, a)의 T 세포는 대상체에 대해 자가유래이다. 일부 실시양태에서, a)의 T 세포는 대상체에 대해 동종이형이다. 일부 실시양태에서, a)의 T 세포는 다중 공여자로부터 유래된 T 세포의 풀을 포함한다. 일부 실시양태에서, 다중 공여자는 인간 공여자이다. 일부 실시양태에서, T 세포는 CD8+ 세포독성 T 세포 또는 CD3+ pan T 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 상태는 이식편-대-숙주 질환 (GvHD) 또는 자가면역 질환이다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 상태는 GvHD이고, 대상체는 이전에 동종이형 이식을 받았다. 일부 실시양태에서, 동종이형 이식은 조혈 줄기 세포, 골수, 또는 고형 기관이다. 일부 실시양태에서, 자가면역 질환은 제1형 당뇨병 (T1D), 전신 홍반성 루푸스 (SLE), 다발성 경화증 (MS), 류마티스성 관절염 (RA)이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 질환 또는 상태를 치료하는 방법 중 임의의 것에 따르면, T 세포의 게놈을 편집하여 조작된 T 세포를 생산하는 것은 a) 본원에 기재된 실시양태 중 임의의 것에 따른 제1 gRNA 및/또는 제2 gRNA, b) 본원에 기재된 실시양태 중 임의의 것에 따른 RGEN 또는 RGEN을 코딩하는 핵산, 및 c) i) CTL에 대한 세포독성을 조작된 세포에 부여할 수 있는 항-CTL 단백질; 및 ii) 이량체화 활성화가능한 화학적으로 유도된 신호전달 복합체 (CISC)의 폴리펩티드 구성성분을 코딩하는 핵산을 포함하는 본원에 기재된 실시양태 중 임의의 것에 따른 1종 이상의 공여자 주형을 T 세포에 제공하는 것을 포함하며, 여기서 신호전달-적격 CISC는 조작된 세포의 생존 및/또는 증식을 촉진시키는 신호전달 경로에서 자극성 신호를 생성할 수 있다. 일부 실시양태에서, CISC는 제1 CISC 구성성분 및 제2 CISC 구성성분을 포함하며, 여기서 제1 CISC 구성성분 및 제2 CISC 구성성분은, 조작된 세포에 의해 발현되는 경우에, 이들이 리간드의 존재 하에서 이량체화하여 신호전달-적격 CISC를 생성하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포는 리간드의 부재 하에서 생존하고/거나 증식할 수 없다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포는 세포의 생존 및/또는 증식에 관여하는 내인성 신호전달 경로에 있어서 결함성이며, 신호전달-적격 CISC는 조작된 세포가 생존하고/거나 증식할 수 있도록 결함성 내인성 신호전달 경로를 보충할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 CISC 구성성분은 IL2Rβ 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 CISC 구성성분의 제1 세포외 결합 도메인은 FRB 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 CISC 구성성분은 서열식별번호: 48의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 48의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 CISC 구성성분은 IL2Rγ 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 CISC 구성성분의 제2 세포외 결합 도메인은 FKBP 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 CISC 구성성분은 서열식별번호: 47의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 47의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-CTL 단백질은 세포외 β2-마이크로글로불린 도메인을 포함하는 키메라 수용체이다. 일부 실시양태에서, 항-CTL 단백질은 세포외 β2-마이크로글로불린 도메인, 막횡단 도메인, 공동-자극성 도메인, 및 세포질 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 수용체이다. 일부 실시양태에서, 세포외 β2-마이크로글로불린 도메인은 서열식별번호: 49의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 49의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체 막횡단 도메인은 CD8 막횡단 도메인 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체 CD8 막횡단 도메인은 서열식별번호: 50의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 50의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체 공동-자극성 도메인은 4-1BB 공동-자극성 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체 4-1BB 공동-자극성 도메인은 서열식별번호: 51의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 51의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체 세포질 신호전달 도메인은 CD3-ζ 세포질 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체 CD3-ζ 세포질 신호전달 도메인은 서열식별번호: 52의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 52의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체는 서열식별번호: 53의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 53의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 공여자 주형은 iii) 선택가능한 마커; iv) 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드; 또는 v) 라파마이신에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드 중 1종 이상을 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 라파마이신에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드는 FRB 도메인 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, FRB 도메인 폴리펩티드는 서열식별번호: 56 또는 57의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 56 또는 57의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 선택가능한 마커는 tLNGFR 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, tLNGFR 폴리펩티드는 서열식별번호: 54의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 54의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드는 돌연변이체 CN 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 CN 폴리펩티드는 CNb30 (서열식별번호: 55)이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 질환 또는 상태를 치료하는 방법 중 임의의 것에 따르면, 1종 이상의 공여자 주형은 하기 시스템 구성성분을 코딩하는 핵산을 포함한다: i) 항-CTL 단백질; ii) IL2Rβ 신호전달 도메인을 포함하는 제1 CISC 구성성분; iii) 라파마이신에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드; iv) 선택가능한 마커; v) 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드; 및 vi) IL2Rγ 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CISC 구성성분 또는 그의 단편. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 공여자 주형은 제1 공여자 주형 및 제2 공여자 주형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 내인성 유전자에 삽입되도록 구성되고, 제2 공여자 주형은 제2 내인성 유전자에 삽입되도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 코딩 카세트를 포함하고, 제2 공여자 주형은 제2 코딩 카세트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 코딩 카세트는 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 선택가능한 마커를 코딩하는 핵산, 및 제1 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 코딩 카세트는 라파마이신에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 항-CTL 단백질을 코딩하는 핵산, 및 제2 CISC 구성성분 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은, 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 발현이 제1 프로모터의 제어 하에 있도록, 제1 코딩 카세트에 작동적으로 연결된 제1 프로모터를 포함하는 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 상류에 합성 폴리A 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 프로모터는 MND 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 제1 내인성 유전자는 내인성 TRA 유전자이다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 TRAC 도메인을 코딩하는 내인성 TRA 유전자의 영역 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형의 삽입은 비-기능적 TRAC 도메인을 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 제2 공여자 주형은, 제2 폴리시스트론성 발현 카세트의 발현이 제2 프로모터의 제어 하에 있도록, 제2 코딩 카세트에 작동적으로 연결된 제2 프로모터를 포함하는 제2 폴리시스트론성 발현 카세트 또는 그의 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 프로모터는 MND 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 제2 내인성 유전자는 내인성 IL2RG 유전자이다. 일부 실시양태에서, 제2 내인성 유전자는 내인성 IL2RG 유전자이고, 제2 공여자 주형은 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편을 포함하는 핵산을 포함하는 제2 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분을 포함하고, 제2 공여자 주형은 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입되는 경우에, 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편이 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결되고, 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결된 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편이 함께 제2 CISC 구성성분을 코딩하고, 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결된 제2 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분이 함께 제2 폴리시스트론성 발현 카세트를 포함하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 서열식별번호: 37-39 중 어느 하나로부터의 인접한 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 공여자 주형은 서열식별번호: 40으로부터의 인접한 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 AAV 벡터이고/거나, 제2 공여자 주형은 제2 AAV 벡터이다. 일부 실시양태에서, 제1 AAV 벡터는 서열식별번호: 37-39 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 37-39 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 AAV 벡터는 서열식별번호: 40의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 40의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 질환 또는 상태를 치료하는 방법 중 임의의 것에 따르면, 1종 이상의 공여자 주형은 하기 시스템 구성성분을 코딩하는 핵산을 포함한다: i) IL2Rβ 신호전달 도메인을 포함하는 제1 CISC 구성성분; ii) IL2Rγ 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CISC 구성성분 또는 그의 단편; 및 iii) 선택가능한 마커. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 공여자 주형은 제1 공여자 주형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 내인성 유전자에 삽입되도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 코딩 카세트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 코딩 카세트는 제1 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산, 제2 CISC 구성성분 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산, 및 선택가능한 마커를 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은, 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 발현이 제1 프로모터의 제어 하에 있도록, 제1 코딩 카세트에 작동적으로 연결된 제1 프로모터를 포함하는 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 상류에 합성 폴리A 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 프로모터는 MND 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 제1 내인성 유전자는 내인성 TRA 유전자이다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 TRAC 도메인을 코딩하는 내인성 TRA 유전자의 영역 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형의 삽입은 비-기능적 TRAC 도메인을 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은, 제1 공여자 주형이 제1 내인성 유전자에 삽입되는 경우에, 제1 폴리시스트론성 발현 카세트가 제1 내인성 유전자의 내인성 프로모터의 제어 하에 있도록, 제1 코딩 카세트의 상류에 2A 자기-절단 펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 내인성 유전자는 내인성 IL2RG 유전자이다. 일부 실시양태에서, 제1 내인성 유전자는 내인성 IL2RG 유전자이고, 제1 공여자 주형은 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편을 포함하는 핵산을 포함하는 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분을 포함하고, 제1 공여자 주형은 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입되는 경우에, 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편이 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결되고, 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결된 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편이 함께 제2 CISC 구성성분을 코딩하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 서열식별번호: 19-25, 27, 및 35 중 어느 하나로부터의 인접한 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 AAV 벡터이다. 일부 실시양태에서, 제1 AAV 벡터는 서열식별번호: 19-25, 27, 및 35 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 19-25, 27, 및 35 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 질환 또는 상태를 치료하는 방법 중 임의의 것에 따르면, 1종 이상의 공여자 주형은 하기 시스템 구성성분을 코딩하는 핵산을 포함한다: i) IL2Rβ 신호전달 도메인을 포함하는 제1 CISC 구성성분; ii) IL2Rγ 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CISC 구성성분 또는 그의 단편; iii) 선택가능한 마커; 및 iv) 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 공여자 주형은 제1 공여자 주형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 내인성 유전자에 삽입되도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 코딩 카세트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 코딩 카세트는 제1 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산, 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산, 선택가능한 마커를 코딩하는 핵산, 및 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은, 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 발현이 제1 프로모터의 제어 하에 있도록, 제1 코딩 카세트에 작동적으로 연결된 제1 프로모터를 포함하는 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 상류에 합성 폴리A 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 프로모터는 MND 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은, 제1 공여자 주형이 제1 내인성 유전자에 삽입되는 경우에, 제1 폴리시스트론성 발현 카세트가 제1 내인성 유전자의 내인성 프로모터의 제어 하에 있도록, 제1 코딩 카세트의 상류에 2A 자기-절단 펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 내인성 유전자는 내인성 IL2RG 유전자이다. 일부 실시양태에서, 제1 내인성 유전자는 내인성 IL2RG 유전자이고, 제1 공여자 주형은 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편을 포함하는 핵산을 포함하는 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분을 포함하고, 제1 공여자 주형은 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입되는 경우에, 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편이 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결되고, 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결된 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편이 함께 제2 CISC 구성성분을 코딩하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 서열식별번호: 26, 28, 및 36 중 어느 하나로부터의 인접한 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 AAV 벡터이다. 일부 실시양태에서, 제1 AAV 벡터는 서열식별번호: 26, 28, 및 36 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 26, 28, 및 36 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 질환 또는 상태를 치료하는 방법 중 임의의 것에 따르면, 1종 이상의 공여자 주형은 하기 시스템 구성성분을 코딩하는 핵산을 포함한다: i) IL2Rβ 신호전달 도메인을 포함하는 제1 CISC 구성성분; ii) IL2Rγ 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CISC 구성성분 또는 그의 단편; 및 iii) 항-CTL 단백질. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 공여자 주형은 제1 공여자 주형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 내인성 유전자에 삽입되도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 코딩 카세트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 코딩 카세트는 제1 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산, 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산, 및 항-CTL 단백질을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은, 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 발현이 제1 프로모터의 제어 하에 있도록, 제1 코딩 카세트에 작동적으로 연결된 제1 프로모터를 포함하는 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분의 상류에 합성 폴리A 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 프로모터는 MND 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 공여자 주형이 제1 내인성 유전자에 삽입되는 경우에, 제1 폴리시스트론성 발현 카세트가 제1 내인성 유전자의 내인성 프로모터의 제어 하에 있도록, 제1 코딩 카세트의 상류에 2A 자기-절단 펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 내인성 유전자는 내인성 IL2RG 유전자이다. 일부 실시양태에서, 제1 내인성 유전자는 내인성 IL2RG 유전자이고, 제1 공여자 주형은 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편을 포함하는 핵산을 포함하는 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분을 포함하고, 제1 공여자 주형은 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입되는 경우에, 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편이 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결되고, 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결된 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편이 함께 제2 CISC 구성성분을 코딩하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 서열식별번호: 29 또는 31로부터의 인접한 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 AAV 벡터이다. 일부 실시양태에서, 제1 AAV 벡터는 서열식별번호: 29 또는 31의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 29 또는 31의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 질환 또는 상태를 치료하는 방법 중 임의의 것에 따르면, 1종 이상의 공여자 주형은 하기 시스템 구성성분을 코딩하는 핵산을 포함한다: i) IL2Rβ 신호전달 도메인을 포함하는 제1 CISC 구성성분; ii) IL2Rγ 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CISC 구성성분 또는 그의 단편; iii) 항-CTL 단백질; 및 iv) 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 공여자 주형은 제1 공여자 주형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 내인성 유전자에 삽입되도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 코딩 카세트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 코딩 카세트는 제1 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산, 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산, 항-CTL 단백질을 코딩하는 핵산, 및 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은, 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 발현이 제1 프로모터의 제어 하에 있도록, 제1 코딩 카세트에 작동적으로 연결된 제1 프로모터를 포함하는 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분의 상류에 합성 폴리A 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 프로모터는 MND 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은, 제1 공여자 주형이 제1 내인성 유전자에 삽입되는 경우에, 제1 폴리시스트론성 발현 카세트가 제1 내인성 유전자의 내인성 프로모터의 제어 하에 있도록, 제1 코딩 카세트의 상류에 2A 자기-절단 펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 내인성 유전자는 내인성 IL2RG 유전자이다. 일부 실시양태에서, 제1 내인성 유전자는 내인성 IL2RG 유전자이고, 제1 공여자 주형은 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편을 포함하는 핵산을 포함하는 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분을 포함하고, 제1 공여자 주형은 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입되는 경우에, 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편이 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결되고, 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결된 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편이 함께 제2 CISC 구성성분을 코딩하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 서열식별번호: 30 또는 32로부터의 인접한 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 AAV 벡터이다. 일부 실시양태에서, 제1 AAV 벡터는 서열식별번호: 30 또는 32의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 30 또는 32의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 질환 또는 상태를 치료하는 방법 중 임의의 것에 따르면, 1종 이상의 공여자 주형은 하기 시스템 구성성분을 코딩하는 핵산을 포함한다: i) IL2Rβ 신호전달 도메인을 포함하는 제1 CISC 구성성분; ii) IL2Rγ 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CISC 구성성분 또는 그의 단편; iii) 항-CTL 단백질; 및 iv) 선택가능한 마커. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 공여자 주형은 제1 공여자 주형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 내인성 유전자에 삽입되도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 코딩 카세트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 코딩 카세트는 제1 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산, 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산, 항-CTL 단백질을 코딩하는 핵산, 및 선택가능한 마커를 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은, 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 발현이 제1 프로모터의 제어 하에 있도록, 제1 코딩 카세트에 작동적으로 연결된 제1 프로모터를 포함하는 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분의 상류에 합성 폴리A 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 프로모터는 MND 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은, 제1 공여자 주형이 제1 내인성 유전자에 삽입되는 경우에, 제1 폴리시스트론성 발현 카세트가 제1 내인성 유전자의 내인성 프로모터의 제어 하에 있도록, 제1 코딩 카세트의 상류에 2A 자기-절단 펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 내인성 유전자는 내인성 IL2RG 유전자이다. 일부 실시양태에서, 제1 내인성 유전자는 내인성 IL2RG 유전자이고, 제1 공여자 주형은 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편을 포함하는 핵산을 포함하는 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분을 포함하고, 제1 공여자 주형은 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입되는 경우에, 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편이 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결되고, 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결된 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편이 함께 제2 CISC 구성성분을 코딩하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 서열식별번호: 33 또는 34로부터의 인접한 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 AAV 벡터이다. 일부 실시양태에서, 제1 AAV 벡터는 서열식별번호: 33 또는 34의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 33 또는 34의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 질환 또는 상태를 치료하는 방법 중 임의의 것에 따르면, 방법은 제1 gRNA, 제2 gRNA, RGEN 또는 RGEN을 코딩하는 핵산, 제1 벡터, 및 제2 벡터를 세포에 제공하는 것을 포함하며, 여기서 (A) 제1 gRNA는 제1 gRNA는 서열식별번호: 1의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 1의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 벡터는 서열식별번호: 37의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 37의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 gRNA는 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 벡터는 서열식별번호: 40의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 40의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하거나; (B) 제1 gRNA는 서열식별번호: 2의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 2의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 벡터는 서열식별번호: 38의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 38의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 gRNA는 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 벡터는 서열식별번호: 40의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 40의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하거나; (C) 제1 gRNA는 서열식별번호: 3의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 3의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 벡터는 서열식별번호: 39의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 39의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 gRNA는 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 벡터는 서열식별번호: 40의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 40의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 질환 또는 상태를 치료하는 방법 중 임의의 것에 따르면, 방법은 제1 gRNA, RGEN 또는 RGEN을 코딩하는 핵산, 및 제1 벡터를 세포에 제공하는 것을 포함하며, 여기서 (A) 제1 gRNA는 서열식별번호: 1의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 1의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 벡터는 서열식별번호: 19, 22, 또는 65-84의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 19, 22, 또는 65-84의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하거나; (B) 제1 gRNA는 서열식별번호: 2의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 2의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 벡터는 서열식별번호: 20 또는 23의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 20 또는 23의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하거나; (C) 제1 gRNA는 서열식별번호: 3의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 3의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 벡터는 서열식별번호: 21 또는 24의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 21 또는 24의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 질환 또는 상태를 치료하는 방법 중 임의의 것에 따르면, 방법은 제1 gRNA, RGEN 또는 RGEN을 코딩하는 핵산, 및 제1 벡터를 세포에 제공하는 것을 포함하며, 여기서 제1 gRNA는 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 벡터는 서열식별번호: 25-36 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 25-36 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 질환 또는 상태를 치료하는 방법 중 임의의 것에 따르면, RGEN은 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (또한 Csn1 및 Csx12로 공지됨), Cas100, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, 및 Cpf1 엔도뉴클레아제, 또는 그의 기능적 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, RGEN은 Cas9이다. 일부 실시양태에서, RGEN을 코딩하는 핵산은 리보핵산 (RNA) 서열이다. 일부 실시양태에서, RGEN을 코딩하는 RNA 서열은 공유 결합을 통해 제1 gRNA 또는 제2 gRNA에 연결된다. 일부 실시양태에서, RGEN은, 세포에의 제공 전에, 제1 gRNA 및/또는 제2 gRNA와 예비복합체화되어 RNP 복합체를 형성한다. 일부 실시양태에서, RGEN은 각각 1:1 내지 20:1의 gRNA 대 RGEN의 몰비로 제1 gRNA 및/또는 제2 gRNA와 예비복합체화된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 질환 또는 상태를 치료하는 방법 중 임의의 것에 따르면, 세포는 T 세포이다. 일부 실시양태에서, T 세포는 CD8+ 세포독성 T 림프구 또는 CD3+ pan T 세포이다. 일부 실시양태에서, T 세포는 다중 공여자로부터 유래된 T 세포의 풀의 구성원이다. 일부 실시양태에서, 다중 공여자는 인간 공여자이다. 일부 실시양태에서, 세포는 CTL에 대해 세포독성이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 질환 또는 상태를 치료하는 방법은 라파마이신 또는 라파로그를 대상체에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 라파로그는 에베롤리무스, CCI-779, C20-메탈릴라파마이신, C16-(S)-3-메틸인돌라파마이신, C16-iRap, AP21967, 나트륨 미코페놀산, 베니디핀 히드로클로라이드, AP1903, 또는 AP23573, 또는 이들의 대사물, 유도체, 및/또는 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 라파마이신 또는 라파로그는 0.05 nM 내지 500 nM의 농도로 투여된다.
조성물
이 개시내용에 제시된 바와 같이 제조된 유전적으로 변형된 세포, 예컨대 포유동물 세포를 포함하는 조성물이 본원에서 제공된다. 일부 실시양태에서, 세포, 예컨대 포유동물 세포는 본원의 실시양태에 기재된 바와 같은 단백질 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 세포외 결합 도메인, 힌지 도메인, 막횡단 도메인, 및 신호전달 도메인을 포함하는 CISC를 갖는 T 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, CISC는 IL2R-CISC이다. 다른 실시양태에서, 조성물은 세포외 결합 도메인, 힌지 도메인, 막횡단 도메인, 및 신호전달 도메인을 포함하는 CISC를 갖는 CD8+ T 세포를 포함하는 세포, 예컨대 포유동물 세포 제제를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, CISC 구성성분은 리간드 (예를 들어, 라파마이신 또는 라파로그)의 존재 하에서 이량체화하며, 이는 동시에 또는 순차적으로 일어날 수 있다. 일부 실시양태에서, 이들 집단의 각각은 서로 또는 다른 세포 유형과 조합되어 조성물을 제공할 수 있다.
일부 실시양태에서, 조성물의 세포는 CD8+ 세포이다. CD8+ 세포는 T 세포독성 림프구 세포, 나이브 CD8+ T 세포, 중심 기억 CD8+ T 세포, 이펙터 기억 CD8+ T 세포 및/또는 벌크 CD8+ T 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, CD8+ 세포독성 T 림프구 세포는 중심 기억 T 세포이며, 여기서 중심 기억 T 세포는 CD45RO+, CD62L+, 및/또는 CD8+ T 세포를 포함한다. 추가의 다른 실시양태에서, CD8+ 세포독성 T 림프구 세포는 중심 기억 T 세포이고, CD4+ 헬퍼 T 림프구 세포는 나이브 또는 중심 기억 CD4+ T 세포이다.
일부 실시양태에서, 조성물은 T 세포 전구체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 조혈 줄기 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 숙주 세포 (여기서 숙주 세포는 나이브 CD8+ T 세포, 중심 기억 CD8+ T 세포, 이펙터 기억 CD8+ T 세포 및 벌크 CD8+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 CD8+ T 세포독성 림프구 세포임), 및 제2 숙주 세포 (여기서 제2 숙주 세포는 전구체 T 세포임)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 전구체 T 세포는 조혈 줄기 세포이다.
일부 조성물에서, 세포는 NK 세포이다.
일부 실시양태에서, 세포는 CD8+ 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 나이브 CD8+ T-세포, 중심 기억 CD8+ T-세포, 이펙터 기억 CD8+ T-세포 및 벌크 CD8+ T-세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 CD8+ T 세포독성 림프구 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 전구체 T-세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 줄기 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 조혈 줄기 세포 또는 NK 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 키메라 수용체를 추가로 포함한다.
또한, 본원에서 제공되고 기재된 세포, 발현 벡터, 및 단백질 서열을 포함하는 키트 및 시스템이 본원에서 제공된다. 따라서, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 단백질 서열; 본원에 기재된 바와 같은 발현 벡터; 및/또는 본원에 기재된 바와 같은 세포 중 1종 이상을 포함하는 키트가 본원에서 제공된다. 또한, 본원에 기재된 바와 같은 세포를 포함하며, 여기서 세포가 본원에 기재된 바와 같은 단백질 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 발현 벡터를 포함하는 것인 세포의 내부 내로 신호를 선택적으로 활성화시키기 위한 시스템이 제공된다.
이량체성 CISC 구성성분을 발현하는 세포를 제조하는 방법
본원에 기재된 일부 실시양태에서, 단백질 서열 또는 발현 벡터를 약물 조절된 시토카인 신호전달에 및/또는 이량체성 CISC 구성성분을 발현하는 세포의 선택적 확장에 사용되는 숙주 세포, 예컨대 포유동물 세포, 예를 들어, 림프구 내로 도입하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 이량체성 CISC는 리간드와의 접촉 시 세포, 예컨대 포유동물 세포의 내부에 신호를 전달하기 위한 도입된 CISC 구성성분을 갖는 세포에서 시토카인 신호전달을 허용할 수 있다. 또한, 세포, 예컨대 포유동물 세포의 선택적 확장은 단지 본원에 기재된 바와 같이 2가지 특이적 유전적 변형 사건을 겪은 그러한 세포에 대해 선택하도록 제어될 수 있다. 이들 세포의 제조는 본 개시내용에 기초하여 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것인 공지된 기법에 따라 수행될 수 있다.
일부 실시양태에서, CISC-함유 세포, 예컨대 포유동물 세포를 제조하는 방법이 제공되며, 여기서 세포는 이량체성 CISC를 발현한다. 방법은 본원에 기재된 실시양태 또는 실시양태 중 임의의 것에 따른 단백질 서열 또는 본원에 기재된 실시양태 또는 실시양태의 발현 벡터를 세포, 예컨대 포유동물 세포에 전달하고, 세포, 예컨대 포유동물 세포에 전달하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단백질 서열은 제1 및 제2 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 서열은 제1 세포외 결합 도메인, 힌지 도메인, 특정된 길이의 링커 (여기서 길이는 임의로 최적화됨), 막횡단 도메인, 및 신호전달 도메인을 포함하는 제1 CISC 구성성분을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 제2 서열은 제2 세포외 결합 도메인, 힌지 도메인, 특정된 길이의 링커 (여기서 길이는 임의로 최적화됨), 막횡단 도메인, 및 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CISC 구성성분을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 스페이서는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개 아미노산 길이 또는 상기 언급된 길이 중 임의의 2개에 의해 한정되는 범위 내의 길이이다. 일부 실시양태에서, 신호전달 도메인은 인터류킨-2 신호전달 도메인, 예컨대 IL2RB 또는 IL2RG 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포외 결합 도메인은 FKBP 또는 FRB 또는 그의 부분을 포함하는, 라파마이신 또는 라파로그에 결합하는 결합 도메인이다. 일부 실시양태에서, 세포는 CD8+ 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 나이브 CD8+ T-세포, 중심 기억 CD8+ T-세포, 이펙터 기억 CD8+ T-세포 및 벌크 CD8+ T-세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 CD8+ T 세포독성 림프구 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 전구체 T-세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 줄기 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 조혈 줄기 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 NK 세포이다.
세포의 내부에서 신호를 활성화시키는 방법
일부 실시양태에서, 세포, 예컨대 포유동물 세포의 내부에서 신호를 활성화시키는 방법이 제공된다. 방법은 본원에 기재된 바와 같은 세포, 예컨대 포유동물 세포를 제공하는 것을 포함할 수 있으며, 여기서 세포는 본원에 제시된 바와 같은 단백질 서열 또는 본원에 제시된 바와 같은 발현 벡터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 본원에 기재된 바와 같은 이량체성 CISC를 코딩하는 단백질 서열을 발현하는 것, 또는 본원에 기재된 바와 같은 벡터의 발현을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 세포, 예컨대 포유동물 세포를 제1 및 제2 CISC 구성성분이 이량체화하는 것을 유발하고, 세포의 내부 내로 신호를 전달하는 리간드와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 리간드는 라파마이신 또는 라파로그이다. 일부 실시양태에서, 이량체화를 유도하기 위한 리간드의 유효량은 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100 nM 또는 상기 언급된 값 중 임의의 2개에 의해 한정되는 범위 내의 농도의 양으로 제공된다.
일부 실시양태에서, 이들 접근법에 사용되는 리간드는 예를 들어, 에베롤리무스, CCI-779, C20-메탈릴라파마이신, C16-(S)-3-메틸인돌라파마이신, C16-iRap, AP21967, 나트륨 미코페놀산, 베니디핀 히드로클로라이드, AP23573, 또는 AP1903, 또는 이들의 대사물, 유도체, 및/또는 조합을 포함하는 라파마이신 또는 라파로그이다. 추가의 유용한 라파로그는 예를 들어, 라파마이신에 비해 하기 변형 중 1종 이상을 갖는 라파마이신의 변이체를 포함할 수 있다: C7, C42 및/또는 C29에서 탈메틸화, 메톡시의 제거 또는 대체; C13, C43 및/또는 C28에서 히드록시의 제거, 유도체화 또는 대체; C14, C24 및/또는 C30에서 케톤의 환원, 제거 또는 유도체화; 6-원 피페콜레이트 고리의 5-원 프롤릴 고리로의 대체; 및/또는 시클로헥실 고리 상의 대안적 치환 또는 시클로헥실 고리의 치환된 시클로펜틸 고리로의 대체. 추가의 유용한 라파로그는 노볼리무스, 피메크롤리무스, 리다포롤리무스, 타크롤리무스, 템시롤리무스, 우미롤리무스, 또는 조타롤리무스, 또는 이들의 대사물, 유도체, 및/또는 조합을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 세포, 예컨대 포유동물 세포의 내부에서 신호를 검출하는 것은 신호전달 경로의 결과인 마커를 검출하는 방법에 의해 달성될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 신호는 웨스턴 블롯, 유동 세포계측법, 또는 다른 단백질 검출 및 정량화 방법의 프로세스를 통해 세포, 예컨대 포유동물 세포에서 Akt 또는 다른 신호전달 마커의 수준을 결정함으로써 검출될 수 있다. 검출을 위한 마커는 예를 들어, JAK, Akt, STAT, NF-κ, MAPK, PI3K, JNK, ERK, 또는 Ras, 또는 세포성 신호전달 사건의 지표인 다른 세포성 신호전달 마커를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 신호의 전달은 시토카인 신호전달에 영향을 미친다. 일부 실시양태에서, 신호의 전달은 IL2R 신호전달에 영향을 미친다. 일부 실시양태에서, 신호의 전달은 시토카인 수용체의 하류 표적의 인산화에 영향을 미친다. 일부 실시양태에서, 신호를 활성화시키는 방법은 CISC-발현 세포, 예컨대 포유동물 세포에서의 증식, 및 비-CISC 발현 세포에서의 수반되는 항-증식을 유도한다.
세포성 신호전달이 일어나기 위해, 시토카인 수용체는 이량체화하거나 이종이량체화해야 할 뿐만 아니라, 이들은 입체형태적 변화가 일어나기 위해 적절한 구성이어야 한다 (Kim, et al., J Biol Chem, 282(19):14253-61, 2007). 따라서, 신호전달 도메인의 정확한 입체형태적 위치화와 함께 이량체화는 적절한 신호전달을 위한 바람직한 프로세스인데, 이는 수용체 이량체화 또는 이종이량체화 단독이 수용체 활성화를 유도하는데 불충분하기 때문이다. 본원에 기재된 화학적으로 유도된 신호전달 복합체는 전형적으로 하류 신호전달 사건이 일어나기 위한 정확한 배향에 있다.
세포 집단의 선택적 확장의 방법
일부 실시양태에서, 세포, 예컨대 포유동물 세포의 집단을 선택적으로 확장시키는 방법이 본원에서 제공된다. 일부 실시양태에서, 방법은 본원에 기재된 바와 같은 세포, 예컨대 포유동물 세포를 제공하는 것을 포함하며, 여기서 세포는 본원에 제시된 바와 같은 단백질 서열 또는 본원에 제시된 바와 같은 발현 벡터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 본원에 기재된 바와 같은 이량체성 CISC를 코딩하는 단백질 서열을 발현하는 것, 또는 본원에 기재된 바와 같은 벡터의 발현을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 세포, 예컨대 포유동물 세포를 제1 및 제2 CISC 구성성분이 이량체화하는 것을 유발하고, 세포의 내부 내로 신호를 전달하는 리간드와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 리간드는 라파마이신 또는 라파로그이다. 일부 실시양태에서 이량체화를 유도하기 위한 제공되는 리간드의 유효량은 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100 nM 또는 상기 언급된 값 중 임의의 2개에 의해 한정되는 범위 내의 농도의 양이다. 일부 실시양태에서, 리간드가 라파로그인 경우에, 이량체화를 유도하기 위해 제공되는 리간드의 유효량은 100 nM, 200 nM, 300 nM, 400 nM, 500 nM, 600 nM, 700 nM, 800 nM, 900 nM, 1000 nM 이상, 또는 상기 언급된 값 중 임의의 2개에 의해 한정되는 범위 내의 농도의 양이다.
일부 실시양태에서, 사용되는 리간드는 예를 들어, 에베롤리무스, CCI-779, C20-메탈릴라파마이신, C16-(S)-3-메틸인돌라파마이신, C16-iRap, AP21967, 나트륨 미코페놀산, 베니디핀 히드로클로라이드, 또는 AP23573, AP1903, 또는 이들의 대사물, 유도체, 및/또는 조합을 포함하는 라파마이신 또는 라파로그이다. 추가의 유용한 라파로그는 예를 들어, 라파마이신에 비해 하기 변형 중 1종 이상을 갖는 라파마이신의 변이체를 포함할 수 있다: C7, C42 및/또는 C29에서 탈메틸화, 메톡시의 제거 또는 대체; C13, C43 및/또는 C28에서 히드록시의 제거, 유도체화 또는 대체; C14, C24 및/또는 C30에서 케톤의 환원, 제거 또는 유도체화; 6-원 피페콜레이트 고리의 5-원 프롤릴 고리로의 대체; 및/또는 시클로헥실 고리 상의 대안적 치환 또는 시클로헥실 고리의 치환된 시클로펜틸 고리로의 대체. 추가의 유용한 라파로그는 노볼리무스, 피메크롤리무스, 리다포롤리무스, 타크롤리무스, 템시롤리무스, 우미롤리무스, 또는 조타롤리무스, 또는 이들의 대사물, 유도체, 및/또는 조합을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 세포, 예컨대 포유동물 세포의 집단의 선택적 확장은 단지 2가지 별개의 유전적 변형 사건이 일어난 경우에 일어난다. 하나의 유전적 변형 사건은 이량체성 화학적으로 유도된 신호전달 복합체의 하나의 구성성분이고, 다른 유전적 변형 사건은 이량체성 화학적으로 유도된 신호전달 복합체의 다른 구성성분이다. 둘 다의 사건이 세포의 집단, 예컨대 포유동물 세포의 집단 내에서 일어나는 경우에, 화학적으로 유도된 신호전달 복합체 구성성분은 리간드의 존재 하에서 이량체화하여 활성 화학적으로 유도된 신호전달 복합체 및 세포의 내부 내로의 신호의 생성을 발생시킨다.
핵산
게놈-표적화 핵산 또는 가이드 RNA
본 개시내용은 표적 핵산 내의 특이적 표적 서열에 연관된 폴리펩티드 (예를 들어, 부위-지정된 폴리펩티드 또는 DNA 엔도뉴클레아제)의 활성을 지정할 수 있는 게놈-표적화 핵산을 제공한다. 일부 실시양태에서, 게놈-표적화 핵산은 RNA이다. 게놈-표적화 RNA는 본원에서 "가이드 RNA" 또는 "gRNA"로 지칭된다. 가이드 RNA는 적어도 관심의 표적 핵산 서열 및 CRISPR 반복부 서열에 혼성화하는 스페이서 서열을 갖는다. 유형 II 시스템에서, gRNA는 또한 tracrRNA 서열로 지칭되는 제2 RNA를 갖는다. 유형 II 가이드 RNA (gRNA)에서, CRISPR 반복부 서열 및 tracrRNA 서열은 서로 혼성화하여 듀플렉스를 형성한다. 유형 V 가이드 RNA (gRNA)에서, crRNA는 듀플렉스를 형성한다. 둘 다의 시스템에서, 듀플렉스는 가이드 RNA 및 부위-지정 폴리펩티드가 복합체를 형성하도록 부위-지정된 폴리펩티드에 결합한다. 게놈-표적화 핵산은 부위-지정된 폴리펩티드와의 그의 회합에 의해 복합체에 대한 표적 특이성을 제공한다. 따라서, 게놈-표적화 핵산은 부위-지정된 폴리펩티드의 활성을 지정한다.
일부 실시양태에서, 게놈-표적화 핵산은 이중-분자 가이드 RNA이다. 일부 실시양태에서, 게놈-표적화 핵산은 단일-분자 가이드 RNA이다. 이중-분자 가이드 RNA는 RNA의 2개의 가닥을 갖는다. 제1 가닥은 5'에서 3' 방향으로, 임의적 스페이서 연장 서열, 스페이서 서열 및 최소 CRISPR 반복부 서열을 갖는다. 제2 가닥은 최소 tracrRNA 서열 (최소 CRISPR 반복부 서열에 상보적임), 3' tracrRNA 서열 및 임의적 tracrRNA 연장 서열을 갖는다. 유형 II 시스템에서 단일-분자 가이드 RNA (sgRNA)는 5'에서 3' 방향으로, 임의적 스페이서 연장 서열, 스페이서 서열, 최소 CRISPR 반복부 서열, 단일-분자 가이드 링커, 최소 tracrRNA 서열, 3' tracrRNA 서열 및 임의적 tracrRNA 연장 서열을 갖는다. 임의적 tracrRNA 연장은 가이드 RNA에 대한 추가의 기능성 (예를 들어, 안정성)에 기여하는 요소를 가질 수 있다. 단일-분자 가이드 링커는 최소 CRISPR 반복부 및 최소 tracrRNA 서열을 연결하여 헤어핀 구조를 형성한다. 임의적 tracrRNA 연장은 1개 이상의 헤어핀을 갖는다. 유형 V 시스템에서 단일-분자 가이드 RNA (sgRNA)는 5'에서 3' 방향으로 최소 CRISPR 반복부 서열 및 스페이서 서열을 갖는다.
예시적인 게놈-표적화 핵산은 WO 2018002719에 기재되어 있다.
공여자 DNA 또는 공여자 주형
부위-지정된 폴리펩티드, 예컨대 DNA 엔도뉴클레아제는 핵산, 예를 들어, 게놈 DNA에서 이중-가닥 파단 또는 단일-가닥 파단을 도입할 수 있다. 이중-가닥 파단은 세포의 내인성 DNA-복구 경로 (예를 들어, 상동성-의존성 복구 (HDR) 또는 비-상동성 말단 연결 또는 대안적 비-상동성 말단 연결 (A-NHEJ) 또는 미세상동성-매개된 말단 연결 (MMEJ)을 자극할 수 있다. NHEJ는 상동성 주형에 대한 필요 없이 절단된 표적 핵산을 복구할 수 있다. 이는 때때로 절단의 부위에서 표적 핵산에서 작은 결실 또는 삽입 (indel)을 발생시킬 수 있으며, 유전자 발현의 파괴 또는 변경을 발생시킬 수 있다. 상동성 재조합 (HR)으로도 공지된 HDR은 상동성 복구 주형, 또는 공여자가 이용가능한 경우에 일어날 수 있다.
상동성 공여자 주형은 표적 핵산 절단 부위에 플랭킹된 서열에 상동성인 서열을 갖는다. 자매 염색분체는 일반적으로 복구 주형으로서 세포에 의해 사용된다. 그러나, 게놈 편집의 목적을 위해, 복구 주형은 종종 외인성 핵산, 예컨대 플라스미드, 듀플렉스 올리고뉴클레오티드, 단일-가닥 올리고뉴클레오티드, 이중-가닥 올리고뉴클레오티드, 또는 바이러스 핵산으로서 공급된다. 외인성 공여자 주형으로, 추가의 또는 변경된 핵산 서열이 또한 표적 로커스 내로 혼입되게 되도록, 상동성의 플랭킹 영역 사이에 추가의 핵산 서열 (예컨대 트랜스진) 또는 변형 (예컨대 단일 또는 다중 염기 변화 또는 결실)을 도입하는 것이 통상적이다. MMEJ는 작은 결실 및 삽입이 절단 부위에서 일어날 수 있다는 점에서 NHEJ와 유사한 유전적 결과를 발생시킨다. MMEJ는 절단 부위에 플랭킹된 소수의 염기 쌍의 상동성 서열을 사용하여 선호하는 말단-연결 DNA 복구 결과를 유도한다. 일부 예에서, 뉴클레아제 표적 영역에서 잠재적 미세상동성의 분석에 기초하여 가능한 복구 결과를 예측하는 것이 가능할 수 있다.
따라서, 일부의 경우에, 상동성 재조합은 표적 핵산 절단 부위 내로 외인성 폴리뉴클레오티드 서열을 삽입하는데 사용된다. 외인성 폴리뉴클레오티드 서열은 본원에서 공여자 폴리뉴클레오티드 (또는 공여자 또는 공여자 서열 또는 폴리뉴클레오티드 공여자 주형)로 용어화된다. 일부 실시양태에서, 공여자 폴리뉴클레오티드, 공여자 폴리뉴클레오티드의 부분, 공여자 폴리뉴클레오티드의 카피, 또는 공여자 폴리뉴클레오티드의 카피의 부분은 표적 핵산 절단 부위 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 공여자 폴리뉴클레오티드는 외인성 폴리뉴클레오티드 서열, 즉, 표적 핵산 절단 부위에서 천연적으로 발생하지 않는 서열이다.
외인성 DNA 분자가 이중-가닥 파단이 일어나는 세포의 핵 내부에 충분한 농도로 공급되는 경우에, 외인성 DNA는 NHEJ 복구 프로세스 동안 이중-가닥 파단에서 삽입되고, 따라서 게놈에의 영구 첨가가 될 수 있다. 이들 외인성 DNA 분자는 일부 실시양태에서 공여자 주형으로 지칭된다. 공여자 주형이 임의로 관련 조절 서열, 예컨대 프로모터, 인핸서, 폴리A 서열 및/또는 스플라이스 억셉터 서열과 함께 본원에 기재된 1종 이상의 시스템 구성성분에 대한 코딩 서열을 함유하는 경우에, 1종 이상의 시스템 구성성분은 게놈에서의 통합된 핵산으로부터 발현되어 세포의 생명을 위한 영구적 발현을 발생시킬 수 있다. 더욱이, 공여자 DNA 주형의 통합된 핵산은 세포가 분열하는 경우에 딸 세포에 전달될 수 있다.
이중-가닥 파단의 양 측에서 DNA 서열에 상동성을 갖는 플랭킹 DNA 서열 (상동성 아암으로 지칭됨)을 함유하는 충분한 농도의 공여자 DNA 주형의 존재 하에서, 공여자 DNA 주형은 HDR 경로를 통해 통합될 수 있다. 상동성 아암은 공여자 주형 및 이중-가닥 파단의 양 측의 서열 사이에 상동성 재조합을 위한 기질로서 작용한다. 이는 이중-가닥 파단의 양 측의 서열이 비-변형된 게놈에서의 그것으로부터 변경되지 않는 공여자 주형의 오류 무함유 삽입을 발생시킬 수 있다.
HDR에 의한 편집을 위한 공급된 공여자는 현저하게 다양하지만, 일반적으로 게놈 DNA에 대한 어닐링을 허용하는 작은 또는 큰 플랭킹 상동성 아암을 갖는 의도된 서열을 함유한다. 도입된 유전적 변화에 플랭킹된 상동성 영역은 30 bp 이하, 또는 프로모터, cDNA 등을 함유할 수 있는 다중-킬로베이스 카세트만큼 클 수 있다. 단일-가닥 및 이중-가닥 올리고뉴클레오티드 공여자 둘 다가 사용될 수 있다. 이들 올리고뉴클레오티드는 크기에 있어서 100 nt 미만에서 많은 kb 초과로 다양하지만, 보다 긴 ssDNA는 또한 생성되고 사용될 수 있다. PCR 앰플리콘, 플라스미드, 및 미니-서클을 비롯한 이중-가닥 공여자는 종종 사용된다. 일반적으로, AAV 벡터는 공여자 주형의 전달의 매우 효과적인 수단이지만, 개별적 공여자에 대한 패키징 한계는 5kb 미만인 것으로 밝혀졌다. 공여자의 활성 전사는 HDR을 3배 증가시켰으며, 이는 프로모터의 포함이 전환을 증가시킬 수 있음을 지시한다. 반대로, 공여자의 CpG 메틸화는 유전자 발현 및 HDR을 감소시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 공여자 DNA는 뉴클레아제로, 또는 독립적으로 다양한 상이한 방법에 의해, 예를 들어 형질감염, 나노입자, 미세-주사, 또는 바이러스 형질도입에 의해 공급될 수 있다. 다양한 테더링 선택안은 일부 실시양태에서 HDR에 대한 공여자의 이용가능성을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 예로는 공여자를 뉴클레아제에 부착시키는 것, 인근에 결합하는 DNA 결합 단백질에 부착시키는 것, 또는 DNA 말단 결합 또는 복구에 관여하는 단백질에 부착시키는 것을 들 수 있다.
NHEJ 또는 HDR에 의한 게놈 편집 외에도, NHEJ 경로 및 HR 둘 다를 사용하는 부위-특이적 유전자 삽입이 수행될 수 있다. 조합 접근법은 가능하게는 인트론/엑손 경계를 비롯한 특정 상황에서 적용가능할 수 있다. NHEJ는 인트론에서 라이게이션에 효과적인 것으로 입증된 반면, 오류-무함유 HDR은 코딩 영역에 보다 적합할 수 있다.
실시양태에서, 게놈 내로 삽입되도록 의도되는 외인성 서열은 본원에 기재된 1종 이상의 시스템 구성성분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 외인성 서열은 i) 항-CTL 단백질; ii) IL2Rβ 신호전달 도메인을 포함하는 제1 CISC 구성성분; iii) 항-세포독성 T 세포 단백질; iv) 라파마이신에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드; v) 선택가능한 마커; vi) 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드; 및 vii) IL2Rγ 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CISC 구성성분 또는 그의 단편 중 1종 이상을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-CTL 단백질은 세포외 β2-마이크로글로불린 도메인을 포함하는 키메라 수용체이다. 일부 실시양태에서, 항-CTL 단백질은 세포외 β2-마이크로글로불린 도메인, 막횡단 도메인, 공동-자극성 도메인, 및 세포질 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 수용체이다. 일부 실시양태에서, 세포외 β2-마이크로글로불린 도메인은 서열식별번호: 49의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 49의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체 막횡단 도메인은 CD8 막횡단 도메인 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체 CD8 막횡단 도메인은 서열식별번호: 50의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 50의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체 공동-자극성 도메인은 4-1BB 공동-자극성 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체 4-1BB 공동-자극성 도메인은 서열식별번호: 51의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 51의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체 세포질 신호전달 도메인은 CD3-ζ 세포질 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체 CD3-ζ 세포질 신호전달 도메인은 서열식별번호: 52의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 52의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체는 서열식별번호: 53의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 53의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 CISC 구성성분의 제1 세포외 결합 도메인은 FRB 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 CISC 구성성분은 서열식별번호: 48의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 48의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 라파마이신에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드는 FRB 도메인 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, FRB 도메인 폴리펩티드는 서열식별번호: 56 또는 57의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 56 또는 57의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 선택가능한 마커는 tLNGFR 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, tLNGFR 폴리펩티드는 서열식별번호: 54의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 54의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드는 돌연변이체 CN 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 CN 폴리펩티드는 CNb30 (서열식별번호: 55)이다. 일부 실시양태에서, 제2 CISC 구성성분의 제2 세포외 결합 도메인은 FKBP 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 CISC 구성성분은 서열식별번호: 47의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 47의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
부위-지정된 폴리펩티드 또는 DNA 엔도뉴클레아제를 코딩하는 핵산
일부 실시양태에서, 게놈 편집의 방법 및 조성물은 따라서 부위-지정된 폴리펩티드 또는 DNA 엔도뉴클레아제를 코딩하는 핵산 서열을 사용할 수 있다. 부위-지정된 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열은 DNA 또는 RNA일 수 있다. 부위-지정된 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열이 RNA인 경우에, 이는 gRNA 서열에 공유 연결되거나, 별개의 서열로서 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 부위-지정된 폴리펩티드 또는 DNA 엔도뉴클레아제의 펩티드 서열은 그의 핵산 서열 대신 사용될 수 있다.
벡터
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 게놈-표적화 핵산, 본 개시내용의 부위-지정된 폴리펩티드, 및/또는 본 개시내용의 방법의 실시양태를 수행하는데 필요한 임의의 핵산 또는 단백질성 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산을 제공한다. 일부 실시양태에서, 이러한 핵산은 벡터 (예를 들어, 재조합 발현 벡터)이다.
고려되는 발현 벡터는 우두 바이러스, 폴리오바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관된 바이러스, SV40, 단순 포진 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, 레트로바이러스 (예를 들어, 뮤린 백혈병 바이러스, 비장 괴사 바이러스, 및 레트로바이러스, 예컨대 라우스 육종 바이러스, 하비 육종 바이러스, 조류 백혈증 바이러스, 렌티바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, 골수증식성 육종 바이러스, 및 유방 종양 바이러스로부터 유래된 벡터)에 기초한 바이러스 벡터 및 다른 재조합 벡터를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 진핵생물 표적 세포에 대해 고려되는 다른 벡터는 벡터 pXT1, pSG5, pSVK3, pBPV, pMSG, 및 pSVLSV40 (파마시아 (Pharmacia))을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 진핵생물 표적 세포에 대해 고려되는 추가의 벡터는 벡터 pCTx-1, pCTx-2, 및 pCTx-3을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 다른 벡터는 이들이 숙주 세포와 혼화성인 한 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 벡터는 1종 이상의 전사 및/또는 번역 제어 요소를 갖는다. 이용되는 숙주/벡터 시스템에 따라, 구성적 및 유도성 프로모터, 전사 인핸서 요소, 전사 종결자 등을 비롯한 다수의 적합한 전사 및 번역 제어 요소 중 임의의 것이 발현 벡터에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 벡터는 바이러스 서열 또는 CRISPR 기구의 구성성분 또는 다른 요소를 불활성화시키는 자기-불활성화 벡터이다.
적합한 진핵생물 프로모터 (즉, 진핵생물 세포에서 기능적인 프로모터)의 비-제한적 예로는 시토메갈로바이러스 (CMV) 극초기, 단순 포진 바이러스 (HSV) 티미딘 키나제, 초기 및 후기 SV40, 레트로바이러스로부터의 긴 말단 반복부 (LTR), 인간 신장 인자-1 프로모터 (EF1), 닭 베타-액틴 프로모터 (CAG)에 융합된 시토메갈로바이러스 (CMV) 인핸서를 갖는 하이브리드 구축물, 뮤린 줄기 세포 바이러스 프로모터 (MSCV), 포스포글리세레이트 키나제-1 로커스 프로모터 (PGK), 및 마우스 메탈로티오네인-I로부터의 것들을 들 수 있다.
Cas 엔도뉴클레아제와 관련되어 사용되는 가이드 RNA를 비롯한 작은 RNA를 발현하기 위해, 다양한 프로모터, 예컨대 예를 들어 U6 및 H1을 비롯한 RNA 폴리머라제 III 프로모터가 유리할 수 있다. 이러한 프로모터의 설명 및 그의 사용을 향상시키기 위한 파라미터는 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 추가의 정보 및 접근법은 규칙적으로 기재되고 있다; 예를 들어, 문헌 [Ma, H. et al., Molecular Therapy - Nucleic Acids 3, e161 (2014) doi:10.1038/mtna.2014.12]을 참조한다.
발현 벡터는 또한 번역 개시를 위한 리보솜 결합 부위 및 전사 종결자를 함유할 수 있다. 발현 벡터는 또한 발현을 증폭시키기 위한 적절한 서열을 포함할 수 있다. 발현 벡터는 또한 부위-지정된 폴리펩티드에 융합되어 융합 단백질을 발생시키는 비-천연 태그 (예를 들어, 히스티딘 태그, 헤마글루티닌 태그, 녹색 형광 단백질 등)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 프로모터는 유도성 프로모터 (예를 들어, 열 충격 프로모터, 테트라시클린-조절된 프로모터, 스테로이드-조절된 프로모터, 금속-조절된 프로모터, 에스트로겐 수용체-조절된 프로모터 등)이다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 구성적 프로모터 (예를 들어, CMV 프로모터, UBC 프로모터)이다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 공간적으로 제한된 및/또는 시간적으로 제한된 프로모터 (예를 들어, 조직 특이적 프로모터, 세포 유형 특이적 프로모터 등)이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 유전자가 그것이 게놈 내로 삽입된 후 게놈에 존재하는 내인성 프로모터 하에서 발현되려고 하는 경우에, 숙주 세포에서 발현되는 적어도 1종의 유전자에 대한 프로모터를 갖지 않는다.
부위-지정된 폴리펩티드 또는 DNA 엔도뉴클레아제
NHEJ 및/또는 HDR로 인한 표적 DNA의 변형은 예를 들어, 돌연변이, 결실, 변경, 통합, 유전자 교정, 유전자 대체, 유전자 태그부착, 트랜스진 삽입, 뉴클레오티드 결실, 유전자 파괴, 전위 및/또는 유전자 돌연변이를 발생시킬 수 있다. 비-천연 핵산을 게놈 DNA 내로 통합시키는 프로세스는 게놈 편집의 예이다.
부위-지정된 폴리펩티드는 DNA를 절단하기 위해 게놈 편집에 사용되는 뉴클레아제이다. 부위-지정된 폴리펩티드는 1종 이상의 폴리펩티드, 또는 폴리펩티드를 코딩하는 1종 이상의 mRNA 중 어느 하나로서 세포 또는 환자에게 투여될 수 있다.
CRISPR/Cas 또는 CRISPR/Cpf1 시스템의 맥락에서, 부위-지정된 폴리펩티드는 가이드 RNA에 결합할 수 있고, 이는 다시, 폴리펩티드가 지정되는 표적 DNA에서의 부위를 특정한다. 본원의 CRISPR/Cas 또는 CRISPR/Cpf1 시스템의 실시양태에서, 부위-지정된 폴리펩티드는 엔도뉴클레아제, 예컨대 DNA 엔도뉴클레아제이다. 이러한 RNA-가이드된 부위-지정된 폴리펩티드는 또한 본원에서 RNA-가이드된 엔도뉴클레아제, 또는 RGEN으로 지칭된다.
예시적인 부위-지정된 폴리펩티드는 WO2018002719에 기재되어 있다.
표적 서열 선택
일부 실시양태에서, 특정 참조 로커스에 비한 5' 경계 및/또는 3' 경계의 위치의 이동은 유전자 편집의 특정 적용을 용이하게 하거나 향상시키는데 사용되며, 이는 본원에 추가로 기재되고 예시되는 바와 같이, 부분적으로 편집을 위해 선택되는 엔도뉴클레아제 시스템에 의존한다.
이러한 표적 서열 선택의 제1, 비-제한적 측면에서, 많은 엔도뉴클레아제 시스템은 절단을 위한 잠재적 표적 부위의 초기 선택을 가이드하는 규칙 또는 기준, 예컨대 CRISPR 유형 II 또는 유형 V 엔도뉴클레아제의 경우에 DNA 절단 부위에 인접한 특정 위치에서 PAM 서열 모티프의 요구를 갖는다.
표적 서열 선택 또는 최적화의 또 다른, 비-제한적 측면에서, 표적 서열 및 유전자 편집 엔도뉴클레아제의 특정 조합에 대한 "오프-타겟" 활성의 빈도 (즉, 선택된 표적 서열 이외의 부위에서 일어나는 DSB의 빈도)는 온-타겟 활성의 빈도에 비해 평가된다. 일부의 경우에, 바람직한 로커스에서 정확하게 편집된 세포는 다른 세포에 비해 선택적 이점을 가질 수 있다. 선택적 이점의 예시적인, 그러나 비-제한적 예로는 복제의 향상된 속도, 지속성, 특정 조건에 대한 저항성, 환자 내로의 도입 후에 생체내에서 성공적인 이식 또는 지속성의 향상된 비율, 및 이러한 세포의 유지 또는 증가된 수 또는 생존율과 연관된 다른 속성과 같은 속성의 획득을 들 수 있다. 다른 경우에, 바람직한 로커스에서 정확하게 편집된 세포는 정확하게 편집된 세포를 확인하거나, 분류하거나, 다르게는 그에 대해 선택하는데 사용되는 1종 이상의 스크리닝 방법에 의해 양성적으로 선택될 수 있다. 선택적 이점 및 지정된 선택 방법 둘 다는 교정과 연관된 표현형을 이용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 세포의 의도된 집단을 선택하거나 정제하는데 사용되는 새로운 표현형을 생성하는 제2 변형을 생성하기 위해 2회 이상 편집될 수 있다. 이러한 제2 변형은 선택가능한 또는 스크리닝가능한 마커에 대한 제2 gRNA를 첨가함으로써 생성될 수 있다. 일부의 경우에, 세포는 cDNA를 함유하는 DNA 단편 및 또한 선택가능한 마커를 사용하여 바람직한 로커스에서 정확하게 편집될 수 있다.
실시양태에서, 임의의 선택적 이점이 적용가능하든지, 임의의 지정된 선택이 특정 경우에 적용되어야 하든지, 표적 서열 선택은 또한 적용의 유효성을 향상시키고/거나 바람직한 표적 이외의 부위에서 비바람직한 변경을 위한 잠재성을 감소시키기 위해 오프-타겟 빈도의 고려에 의해 가이드된다. 본원에 및 관련 기술분야에서 추가로 기재되고 예시된 바와 같이, 오프-타겟 활성의 발생은 표적 부위 및 다양한 오프-타겟 부위 사이의 유사성 및 차이점, 뿐만 아니라 사용되는 특정 엔도뉴클레아제를 비롯한 다수의 인자에 의해 영향을 받는다. 오프-타겟 활성의 예측을 보조하는 생물정보학 도구는 이용가능하며, 빈번히 이러한 도구는 또한 오프-타겟 활성의 가장 가능성 있는 부위를 확인하는데 사용될 수 있으며, 이는 그 후 오프-타겟 대 온-타겟 활성의 상대 빈도를 평가하는 실험적 환경에서 평가됨으로써, 보다 높은 상대 온-타겟 활성을 갖는 서열의 선택을 허용할 수 있다. 이러한 기법의 예시적인 예는 본원에서 제공되며, 다른 것들은 관련 기술분야에 공지되어 있다.
표적 서열 선택의 또 다른 측면은 상동성 재조합 사건에 관한 것이다. 상동성의 영역을 공유하는 서열은 개재 서열의 결실을 발생시키는 상동성 재조합 사건에 대한 초점으로서 기능할 수 있다. 이러한 재조합 사건은 염색체 및 다른 DNA 서열의 복제의 정상적인 과정 동안, 및 또한 DNA 서열이 합성되고 있는 다른 시간에, 예컨대 이중-가닥 파단 (DSB)의 복구의 경우에 일어나며, 이는 정상적인 세포 복제 주기 동안 규칙적 기초로 일어나지만, 또한 다양한 사건 (예컨대 UV 광 및 DNA 파단의 다른 유도제)의 발생 또는 특정 작용제 (예컨대 다양한 화학적 유도제)의 존재에 의해 향상될 수 있다. 많은 이러한 유도제는 DSB가 게놈에서 무분별하게 일어나는 것을 유발하며, DSB는 정상적인 세포에서 규칙적으로 유도되고 복구되고 있다. 복구 동안, 원래 서열은 완전한 충실도로 재구축될 수 있지만, 일부의 경우에, 작은 삽입 또는 결실 ("indel"로 지칭됨)은 DSB 부위에 도입된다.
DSB는 또한 본원에 기재된 엔도뉴클레아제 시스템의 경우에서와 같이, 특정 위치에서 특이적으로 유도될 수 있으며, 이는 선택된 염색체 위치에서 지정된 또는 우선적 유전자 변형 사건을 유발하는데 사용될 수 있다. 상동성 서열이 DNA 복구 (뿐만 아니라 복제)의 맥락에서 재조합되는 경향성은 다수의 환경에서 이용될 수 있으며, 유전자 편집 시스템, 예컨대 상동성 지정된 복구가 "공여자" 폴리뉴클레오티드의 사용을 통해 제공된 관심의 서열을 바람직한 염색체 위치 내로 삽입하는데 사용되는 CRISPR의 하나의 적용에 대한 기초이다.
10개만큼 적은 염기 쌍 이하를 가질 수 있는 "미세상동성"의 작은 영역일 수 있는 특정 서열 사이의 상동성의 영역은 또한 바람직한 결실을 유발하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 단일 DSB는 인근의 서열과 미세상동성을 나타내는 부위에 도입된다. 이러한 DSB의 복구의 정상적인 과정 동안, 높은 빈도로 일어나는 결과는 DSB 및 수반되는 세포성 복구 프로세스에 의해 용이화되는 재조합의 결과로서의 개재 서열의 결실이다.
그러나, 일부 상황에서, 상동성의 영역 내의 표적 서열을 선택하는 것은 또한 유전자 융합 (결실이 코딩 영역에 있는 경우)을 비롯한 훨씬 더 큰 결실을 발생시킬 수 있으며, 이는 특정 상황을 고려하면 바람직할 수 있거나 바람직할 수 없다.
본원에서 제공된 실시예는 본원에 기재된 1종 이상의 시스템 구성성분을 삽입하도록 디자인된 DSB의 생성을 위한 다양한 표적 영역의 선택, 뿐만 아니라 온-타겟 사건에 비해 오프-타겟 사건을 최소화하도록 디자인된 이러한 영역 내의 특이적 표적 서열의 선택을 추가로 예시한다.
표적화된 통합
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 방법은 본원에 기재된 1종 이상의 시스템 구성성분을 코딩하는 핵산을 표적 세포 (예를 들어, T 세포)의 게놈에서의 특이적 위치에서 통합하는 것이며, 이는 "표적화된 통합"으로 지칭된다. 일부 실시양태에서, 표적화된 통합은 게놈 DNA에서 이중-가닥 파단을 생성하는 서열 특이적 뉴클레아제를 사용함으로써 가능하게 된다.
일부 실시양태에서 사용되는 CRISPR-Cas 시스템은 다수의 게놈 표적이 급속하게 스크리닝되어 최적 CRISPR-Cas 디자인을 확인할 수 있다는 이점을 갖는다. CRISPR-Cas 시스템은 연관된 Cas 뉴클레아제 (예를 들어 Cas9 뉴클레아제)를 DNA에서의 특이적 서열에 표적화하는 단일 가이드 RNA (sgRNA)로 지칭되는 RNA 분자를 사용한다. 이 표적화는 sgRNA 및 sgRNA의 대략 20 bp 표적화 서열 내의 게놈의 서열 사이의 왓슨-크릭 기재 쌍형성에 의해 일어난다. 표적 부위에서 결합되면, Cas 뉴클레아제는 게놈 DNA의 둘 다의 가닥을 절단하여 이중-가닥 파단을 생성한다. 특이적 DNA 서열을 표적화하는 sgRNA를 디자인하기 위한 유일한 요건은 표적 서열이 게놈 서열에 상보적인 sgRNA 서열의 3' 말단에 프로토스페이서 인접한 모티프 (PAM) 서열을 함유해야 한다는 것이다. Cas9 뉴클레아제의 경우에, PAM 서열은 NRG (여기서 R은 A 또는 G이고, N은 임의의 염기임), 또는 보다 제한된 PAM 서열 NGG이다. 따라서, 게놈의 임의의 영역을 표적화하는 sgRNA 분자는 모든 PAM 모티프에 인접한 20 bp 서열을 위치시킴으로써 인 실리코 디자인될 수 있다. PAM 모티프는 진핵생물의 게놈에서 평균 바로 15 bp 상에서 일어난다. 그러나, 인 실리코 방법에 의해 디자인된 sgRNA는 상이한 효율로 세포에서 이중-가닥 파단을 생성할 것이며, 인 실리코 방법을 사용하여 일련의 sgRNA 분자의 커팅 효율을 예측하는 것은 가능하지 않다. sgRNA는 시험관내에서 급속하게 합성될 수 있기 때문에, 이는 가장 효율적인 커팅을 발생시키는 sgRNA를 확인하기 위해 주어진 게놈 영역에서 모든 잠재적 sgRNA 서열의 급속한 스크리닝을 가능하게 한다. 전형적으로 주어진 게놈 영역 내의 일련의 sgRNA가 세포에서 시험되는 경우에, 0 내지 90%의 절단 효율의 범위가 관찰된다. 인 실리코 알고리듬 뿐만 아니라 실험실 실험은 또한 임의의 주어진 sgRNA의 오프-타겟 잠재성을 결정하는데 사용될 수 있다. sgRNA의 20 bp 인식 서열에 대한 완벽한 매치는 주로 대부분의 진핵생물 게놈에서 단지 1회 일어날 것이지만, sgRNA에 대한 1개 이상의 염기 쌍 미스매치를 갖는 게놈에서의 다수의 추가의 부위가 있을 것이다. 이들 부위는 종종 미스매치의 수 또는 위치에 기초하여 예측가능하지 않는 가변적 빈도로 절단될 수 있다. 인 실리코 합성에 의해 확인되지 않은 추가의 오프-타겟 부위에서의 절단은 또한 일어날 수 있다. 따라서, 관련된 세포 유형에서 다수의 sgRNA를 스크리닝하여 가장 바람직한 오프-타겟 프로파일을 갖는 sgRNA를 확인하는 것은 치료 용도를 위한 최적 sgRNA를 선택하는 중요한 구성성분이다. 바람직한 오프 타겟 프로파일은 실제 오프-타겟 부위의 수 및 이들 부위에서의 커팅의 빈도, 뿐만 아니라 이들 부위의 게놈에서의 위치를 고려할 것이다. 예를 들어, 기능적으로 중요한 유전자, 특히 종양유전자 또는 항-종양유전자에 가까운 또는 그 내의 오프-타겟 부위는 공지된 기능을 갖지 않는 유전자간 영역에서의 부위보다 덜 바람직한 것으로 간주될 것이다. 따라서, 최적 sgRNA의 확인은 유기체의 게놈 서열의 인 실리코 분석에 의해 간단히 예측될 수 없지만, 실험적 시험을 요구한다. 인 실리코 분석은 시험하는 가이드의 수를 좁히는데 도움이 될 수 있지만, 이는 높은 온 타겟 커팅을 갖는 가이드를 예측하거나 낮은 바람직한 오프-타겟 커팅을 갖는 가이드를 예측할 수 없다. Cas 효소에 의한 절단을 촉진시키는 주어진 sgRNA의 능력은 그 영역에서 염색질 구조에 의해 결정될 수 있는 게놈 DNA에서의 그 특이적 부위의 접근성과 관련될 수 있다. 조용한 분화된 세포에서의 게놈 DNA의 대다수는 매우 응축된 이질염색질에 존재하지만, 활성적으로 전사된 영역은 큰 분자, 예컨대 Cas 단백질과 같은 단백질에 보다 접근가능한 것으로 공지된 보다 개방된 염색질 상태로 존재한다. 심지어 활성적으로 전사된 유전자 내에서, DNA의 일부 특이적 영역은 결합된 전사 인자 또는 다른 조절성 단백질의 존재 또는 부재로 인해 다른 것들보다 더 접근가능하다. 게놈에서의 또는 특이적 게놈 로커스 또는 게놈 로커스의 영역 내의 부위를 예측하는 것은 가능하지 않으며, 따라서 관련된 세포 유형에서 실험적으로 결정될 필요가 있을 것이다. 일부 부위가 삽입을 위한 잠재적 부위로서 선택되면, 예를 들어 실험적 시험과 함께 또는 없이 소수의 뉴클레오티드를 선택된 부위로부터 상류 또는 하류로 이동시킴으로써 이러한 부위에 일부 변이를 첨가하는 것이 가능할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에 사용될 수 있는 gRNA는 서열식별번호: 1-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 1-18 중 어느 하나와 적어도 약 85% 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는 그의 임의의 유도체를 포함하는 스페이서를 포함한다.
핵산 변형
일부 실시양태에서, 세포 내로 도입된 폴리뉴클레오티드는 본원에 추가로 기재되고 관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 예를 들어, 활성, 안정성 또는 특이성을 향상시키거나, 전달을 변경시키거나, 숙주 세포에서의 선천 면역 반응을 감소시키거나, 다른 향상을 위해 독립적으로 또는 조합으로 사용될 수 있는 1종 이상의 변형을 갖는다.
특정 실시양태에서, 변형된 폴리뉴클레오티드는 CRISPR/Cas9/Cpf1 시스템에 사용되며, 이 경우에 가이드 RNA (단일-분자 가이드 또는 이중-분자 가이드 중 어느 하나) 및/또는 세포 내로 도입된 Cas 또는 Cpf1 엔도뉴클레아제를 코딩하는 DNA 또는 RNA는 하기 기재되고 예시된 바와 같이 변형될 수 있다. 이러한 변형된 폴리뉴클레오티드는 임의의 1종 이상의 게놈 로커스를 편집하기 위한 CRISPR/Cas9/Cpf1 시스템에 사용될 수 있다.
이러한 용도의 비-제한적 예시의 목적을 위한 CRISPR/Cas9/Cpf1 시스템을 사용하여, 가이드 RNA의 변형은 단일-분자 가이드 또는 이중-분자일 수 있는 가이드 RNA, 및 Cas 또는 Cpf1 엔도뉴클레아제를 갖는 CRISPR/Cas9/Cpf1 게놈 편집 복합체의 형성 또는 안정성을 향상시키는데 사용될 수 있다. 가이드 RNA의 변형은 또한 또는 대안적으로 예를 들어, 온-타겟 활성을 향상시키는데 사용될 수 있는 게놈에서의 표적 서열을 갖는 게놈 편집 복합체 사이의 상호작용의 개시, 안정성 또는 동역학을 향상시키는데 사용될 수 있다. 가이드 RNA의 변형은 또한 또는 대안적으로 특이성, 예를 들어, 다른 (오프-타겟) 부위에서의 효과에 비해 온-타겟 부위에서의 게놈 편집의 상대 비율을 향상시키는데 사용될 수 있다.
변형은 또한 또는 대안적으로 예를 들어, 세포에 존재하는 리보뉴클레아제 (RNase)에 의한 분해에 대한 그의 저항성을 증가시킴으로써, 세포에서의 그의 반감기가 증가되는 것을 유발함으로써, 가이드 RNA의 안정성을 증가시키는데 사용될 수 있다. 가이드 RNA 반감기를 향상시키는 변형은 Cas 또는 Cpf1 엔도뉴클레아제가 엔도뉴클레아제를 생성하기 위해 변역될 필요가 있는 RNA를 통해 편집되는 세포 내로 도입되는 실시양태에서 특히 유용할 수 있는데, 이는 엔도뉴클레아제를 코딩하는 RNA와 동시에 도입되는 가이드 RNA의 반감기를 증가시키는 것이 가이드 RNA 및 코딩된 Cas 또는 Cpf1 엔도뉴클레아제가 세포에 공존하는 시간을 증가시키는데 사용될 수 있기 때문이다.
변형은 또한 또는 대안적으로 세포 내로 도입된 RNA가 선천 면역 반응을 유발할 가능성 또는 정도를 감소시키는데 사용될 수 있다. 하기 및 관련 기술분야에 기재된 바와 같이, 작은-간섭 RNA (siRNA)를 비롯한 RNA 간섭 (RNAi)의 맥락에서 널리 특징규명된 이러한 반응은 RNA의 감소된 반감기 및/또는 시토카인 또는 면역 반응와 연관된 다른 인자의 유발과 연관되는 경향이 있다.
제한 없이, RNA의 안정성을 향상시키는 변형 (예컨대 세포에 존재하는 RNAse에 의한 그의 분해를 증가시킴으로써), 생성된 산물 (즉, 엔도뉴클레아제)의 번역을 향상시키는 변형, 및/또는 세포 내로 도입된 RNA가 선천 면역 반응을 유발할 가능성 또는 정도를 감소시키는 변형을 비롯한 1종 이상의 유형의 변형은 또한 세포 내로 도입된 엔도뉴클레아제를 코딩하는 RNA에 이루어질 수 있다.
변형, 예컨대 상기 및 다른 것들의 조합은 마찬가지로 사용될 수 있다. CRISPR/Cas9/Cpf1 시스템의 경우에, 예를 들어, 1종 이상의 유형의 변형은 가이드 RNA (상기 예시된 것들을 포함함)에 이루어질 수 있고/거나, 1종 이상의 유형의 변형은 Cas 엔도뉴클레아제를 코딩하는 RNA (상기 예시된 것들을 포함함)에 이루어질 수 있다.
예시적인 변형된 핵산은 WO2018002719에 기재되어 있다.
전달
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 방법에 사용되는 임의의 핵산 분자, 예를 들어 본 개시내용의 게놈-표적화 핵산 및/또는 부위-지정된 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 세포에의 전달을 위해 전달 비히클의 표면 내로 또는 상에 패키징된다. 고려되는 전달 비히클은 나노구, 리포솜, 양자 점, 나노입자, 폴리에틸렌 글리콜 입자, 히드로겔, 및 미셀을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 관련 기술분야에 기재된 바와 같이, 다양한 표적화 모이어티는 이러한 비히클과 바람직한 세포 유형 또는 위치의 우선적 상호작용을 향상시키는데 사용될 수 있다.
세포 내로의 본 개시내용의 복합체, 폴리펩티드, 및 핵산의 도입은 바이러스 또는 박테리오파지 감염, 형질감염, 접합, 원형질체 융합, 리포펙션, 전기천공, 뉴클레오펙션, 인산칼슘 침전, 폴리에틸렌이민 (PEI)-매개된 형질감염, DEAE-덱스트란 매개된 형질감염, 리포솜-매개된 형질감염, 입자 총 기술, 인산칼슘 침전, 직접 미세-주사, 나노입자-매개된 핵산 전달 등에 의해 일어날 수 있다.
예시적인 전달 방법 및 시약은 WO2018002719에 기재되어 있다.
본 발명의 예시적인 벡터는 도 4-39, 서열식별번호: 19, 22, 25-36, 30-40, 및 65-84에 제시된다.
본 발명의 한 측면은 이식편 대 숙주 질환 (GvHD) 또는 자가면역 질환 또는 유해 CTL-매개된 면역 반응을 특징으로 하는 질환 또는 상태의 치료를 위한 본 발명의 조작된 T 세포의 용도이다. 본 발명의 또 다른 측면은 이식편 대 숙주 질환 (GvHD) 또는 자가면역 질환 또는 유해 CTL-매개된 면역 반응을 특징으로 하는 질환 또는 상태의 치료용 의약의 제조를 위한 본 발명의 조작된 T 세포의 용도이다. 본 발명의 또 다른 측면은 이식편 대 숙주 질환 (GvHD) 또는 자가면역 질환 또는 유해 CTL-매개된 면역 반응을 특징으로 하는 질환 또는 상태의 치료를 위한, 본 발명의 시스템의 용도이다. 본 발명의 또 다른 측면은 이식편 대 숙주 질환 (GvHD) 또는 자가면역 질환 또는 유해 CTL-매개된 면역 반응을 특징으로 하는 질환 또는 상태의 치료용 의약의 제조를 위한 본 발명의 시스템의 용도이다.
본 발명의 또 다른 측면은 이식편 대 숙주 질환 (GvHD) 또는 자가면역 질환 또는 유해 CTL-매개된 면역 반응을 특징으로 하는 질환 또는 상태의 치료를 위한, 본 발명의 가이드 RNA, 또는 본 발명의 벡터, 또는 본 발명의 키트, 또는 본 발명의 시린지, 또는 본 발명의 카테터의 용도이다.
본 발명의 또 다른 측면은 이식편 대 숙주 질환 (GvHD) 또는 자가면역 질환 또는 유해 CTL-매개된 면역 반응을 특징으로 하는 질환 또는 상태의 치료용 의약의 제조를 위한, 본 발명의 가이드 RNA, 또는 본 발명의 벡터, 또는 본 발명의 키트, 또는 본 발명의 시린지, 또는 본 발명의 카테터의 용도이다.
본 개시내용은 구체적인 대안을 참조로 상기 기재되었다. 그러나, 상기 기재된 것과는 다른 대안은 본 개시내용의 범주 내에서 동등하게 가능하다. 상기 기재된 것들과는 상이한 방법 단계는 본 개시내용의 범주 내에서 제공될 수 있다. 본원에 기재된 상이한 특색 및 단계는 기재된 것들과는 다른 조합으로 조합될 수 있다.
본원에서 복수 및/또는 단수 용어의 사용에 관하여, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 맥락 및/또는 적용에 적절한 바와 같이 복수로부터 단수로 및/또는 단수로부터 복수로 번역할 수 있다. 다양한 단수/복수 치환은 명확성을 위해 본원에 명백하게 제시될 수 있다.
일반적으로, 본원에, 및 특히 첨부된 청구범위 (예를 들어, 첨부된 청구범위의 본문)에 사용된 용어는 일반적으로 "개방된" 용어로서 의도됨 (예를 들어, 용어 "포함하는"은 "포함하나 이에 제한되지는 않는"으로 해석되어야 하고, 용어 "갖는"은 "적어도 갖는"으로 해석되어야 하고, 용어 "포함하다"는 "포함하나 이제 제한되지는 않는다"로 해석되어야 하는 등)은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해될 것이다.
또한, 본 개시내용의 특색 또는 측면이 마쿠쉬 군의 관점에서 기재되는 경우에, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 개시내용이 또한 그에 의해 마쿠쉬 군의 임의의 개별적 구성원 또는 구성원의 하위군의 관점에서 기재됨을 인식할 것이다.
제1 내지 제11 측면의 대안의 특색 중 임의의 것은 본원에서 확인된 모든 측면 및 대안에 적용가능하다. 더욱이, 제1 내지 제11 측면의 대안의 특색 중 임의의 것은 부분적으로 또는 전체적으로 본원에 기재된 다른 대안과 임의의 방식으로 독립적으로 조합가능하며, 예를 들어, 1개, 2개, 또는 3개 이상의 대안은 전체적으로 또는 부분적으로 조합가능할 수 있다. 또한, 제1 내지 제11 측면의 대안의 특색 중 임의의 것은 다른 측면 또는 대안에 대해 임의적이 될 수 있다. 다양한 예 대안 및 실행의 관점에서 상기 기재되었지만, 개별적 대안 중 하나 이상에서 기재된 다양한 특색, 측면 및 기능성은 이들이 기재된 특정 대안에 대한 그들의 적용가능성에 제한되지 않지만, 대신 이러한 대안이 기재되든지 그렇지 않든지 및 이러한 특색이 기재된 대안의 일부인 것으로 제시되든지 그렇지 않든지, 단독으로 또는 다양한 조합으로 본 출원의 다른 대안 중 하나 이상에 적용될 수 있음이 이해되어야 한다. 따라서, 본 출원의 폭 및 범주는 상기 기재된 예 대안 중 임의의 것에 의해 제한되지 않아야 한다.
본원에 인용된 모든 참고문헌은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 참조로 포함된 간행물 및 특허 또는 특허 출원이 본 명세서에 함유된 본 개시내용과 상충되는 정도까지, 본 명세서는 임의의 이러한 상충되는 물질을 대신하고/거나 이에 우선하는 것으로 의도된다. 본원에 참조로 포함된 간행물 및 특허 또는 특허 출원이 본 명세서에 함유된 본 개시내용과 상충되는 정도까지, 본 명세서는 임의의 이러한 상충되는 물질을 대신하고/거나 이에 우선하는 것으로 의도된다.
본 개시내용의 하나 이상의 실시양태의 상세사항은 하기 첨부된 설명에 제시된다. 본원에 기재된 것들과 유사하거나 등가의 물질 및 방법은 본 개시내용의 실시 또는 시험에 사용될 수 있다. 본 개시내용의 다른 특색, 목적 및 이점은 설명으로부터 명백할 것이다. 설명에서, 단수 형태는 또한 맥락이 명백하게 달리 지시하지 않는다면 복수를 포함한다. 달리 정의되지 않는다면, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 이 개시내용이 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 상충되는 경우에, 본 설명이 지배할 것이다.
본원에 기재된 실시예 및 실시양태는 단지 예시적 목적을 위한 것이며, 그의 관점에서 다양한 변형 또는 변화는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 시사될 것이고, 본 출원의 취지 및 이해범위 및 첨부된 청구범위의 범주 내에 포함되어야 함이 이해된다. 본원에 인용된 모든 간행물, 특허, 및 특허 출원은 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
본원에 제공된 본 개시내용의 일부 실시양태는 하기 비-제한적 실시예에 의해 추가로 예시된다.
실시예
물질 및 방법
시약
아데노-연관된 바이러스 (AAV)를 293 세포의 삼중 형질감염으로부터 생산하고, 정제하였다. 단일-가이드 RNA (sgRNA)를 상업적 공급원 (예를 들어, 신테고 (Synthego))으로부터 얻고, 제조업자의 권고사항에 따라 사용하였다. sgRNA 서열의 표적-결합 부분은 하기를 포함한다: TRAC TRAC 1: 5'-ACAAAACTGTGCTAGACATG-3' (서열식별번호: 3); TRAC TRAC 2: 5'-AGAGCAACAGTGCTGTGGCC-3' (서열식별번호: 1); TRAC TRAC 3: 5'-TCTCTCAGCTGGTACACGGC-3' (서열식별번호: 2); IL2RG IL2RG GC1: 5'-ACCAGTGCCTGGCATGTAGT-3' (서열식별번호: 4); IL2RG GC2: 5'- CCAGTGCCTGGCATGTAGTA-3' (서열식별번호: 5); IL2RG GC3: 5'- CAGTGCCTGGCATGTAGTAG-3' (서열식별번호: 6); IL2RG GC4: 5'- GTAGGGGCACAACAAATATA-3' (서열식별번호: 7); IL2RG GC5: 5'- GAATCCTTTCCTGTTTGCAT-3' (서열식별번호: 8); IL2RG GC6: 5'- CCTGTTTGCATTGGAAGCCG-3' (서열식별번호: 9); IL2RG GC7: 5'- GAAGCCGTGGTTATCTCTGT-3' (서열식별번호: 10); IL2RG GC8: 5'- GGTTATCTCTGTTGGCTCCA-3' (서열식별번호: 11); IL2RG GC9: 5'- GTTATCTCTGTTGGCTCCAT-3' (서열식별번호: 12); IL2RG GC10: 5'- AAGGCTGATAATCAATCCCA-3' (서열식별번호: 13); IL2RG GC11: 5'- GGAGCCAACAGAGATAACCA-3' (서열식별번호: 14);. IL2RG GC12: 5'- CCACGGCTTCCAATGCAAAC-3' (서열식별번호: 15); IL2RG GC13: 5'- GCTTCCAATGCAAACAGGAA-3' (서열식별번호: 16); IL2RG GC14: 5'- TAGAAAAAAGAAAAGCAAAG-3' (서열식별번호: 17); IL2RG GC15: 5'- TTGTGCCCCTACTACATGCC-3' (서열식별번호: 18). Cas9 효소 (예를 들어, 트루컷 (TrueCut) V2)는 상업적 공급원 (예를 들어, 써모피셔 (ThermoFisher))으로부터 얻는다. Cas9 및 sgRNA를 사용 전에 예를 들어, 실온에서 적어도 10분 동안 포스페이트-완충 염수에서 복합체화하였다.
1차 인간 T 세포 배양 및 활성화
CD3-발현 또는 CD8-발현 T 림프구를 시판되는 자성 비드 풍부화 키트 (예를 들어, 밀테니 바이오텍 (Miltenyi Biotec), 미국 매사추세츠주 캠브리지)를 제조업자의 권고된 프로토콜에 따라 사용하여 건강한 공여자로부터 수집된 백혈구분리반출술 산물로부터 단리하고 냉동보존하였다. 냉동보존 후, 세포를 해동시키고, 활성화시켰다. T 세포를 관련 기술분야에 공지된 프로토콜을 사용하여 활성화시켰다.
실시예 1: gRNA의 특징규명
TRAC 유전자를 표적화하는 gRNA
표적화된 절단을 실행하는 TRAC 유전자에 대해 특이적인 gRNA의 능력을 평가하기 위해, 스페이서 TRAC 1 (서열식별번호: 3), TRAC 2 (서열식별번호: 1), 및 TRAC 3 (서열식별번호: 2)을 포함하는 gRNA를 신테고로부터 주문하고, 항-CD3/CD8/CD28 비드로의 3일의 활성화 후 전기천공에 의해 각각의 gRNA를 포함하는 Cas9/gRNA RNP로 형질감염된 1차 인간 CD8+ 또는 CD3+ T 세포에서 평가하였다. 형질감염 후 48시간에, 예측되는 절단 부위에 플랭킹된 PCR 프라이머를 사용하여 처리된 세포로부터 게놈 DNA를 증폭시키고, 이어서 PCR 산물을 생어 시퀀싱하는 TIDES 프로토콜 (Brinkman, E. K. et al. (2014). Nucleic Acids Res., 42(22):e168)을 사용하여 각각의 gRNA에 대한 온-타겟 부위에서의 절단 효율에 대해 세포를 분석하였다. 이중-가닥 파단이 세포의 게놈에서 생성되는 경우에, 세포는 이중-가닥 파단을 복구하려고 시도한다. 이 복구 프로세스는 오류 유발성이며, 이는 이중-가닥 파단의 부위에서 뉴클레오티드의 결실 또는 삽입을 발생시킬 수 있다. 완벽하게 복구된 파단은 Cas9 뉴클레아제에 의해 재-절단되는 반면, 뉴클레오티드의 삽입 또는 결실은 Cas9 절단을 방지할 것이기 때문에, 커팅 효율을 나타내는 삽입 및 결실의 축적이 있을 것이다. 그 후, 시퀀싱 크로마토그램 데이터를 예측되는 절단 부위에서 삽입되거나 결실된 염기의 빈도를 계산하는 컴퓨터 프로그램을 사용하여 분석하였다. 삽입되거나 결실된 염기 (INDEL)의 빈도를 사용하여 전체 절단 빈도를 계산하였다. 세포를 편집 후 제2일에 INDEL 효율, 세포 생존율, 및 총 세포 카운트에 대해 분석하였으며, 이는 시험된 모든 3가지 gRNA에 대해 유사하였다 (표 1, 2회의 독립적 실험으로부터의 결과). gRNA는 CD8+ 및 CD3+ T 세포 둘 다에 대해 54% 내지 64%의 범위의 INDEL 효율을 발생시켰고, 세포 생존율은 77% 내지 89%의 범위였으며, 이는 이들 gRNA가 세포독성을 유도하지 않고 T 세포에서의 그들의 표적 부위에서 효율적으로 절단함을 지시한다.
표 1
Figure pct00001
세포를 편집 후 제7일에 유동 세포계측법에 의해 TCR 및 CD3 발현에 대해 추가로 분석하였다 (표 2). 각각의 gRNA는 CD8+ 및 CD3+ T 세포 둘 다에서 TCR 발현을 비처리된 대조군에 비해 약 90% 이상 감소시킬 수 있었다. TCR 발현에 의존하는 표면 CD3 발현은 또한 각각의 gRNA로 처리된 세포에서 감소되었다. 이들 결과는 INDEL 효율에 대한 결과를 뒷받침하며, gRNA로의 편집이 T 세포에서 TCR 발현을 억제하여, 편집된 세포에서 내인성 TCR을 통한 신호전달을 침묵시킬 수 있었음을 지시한다.
표 2
Figure pct00002
gRNA TRAC 1, TRAC 2 및 TRAC 3에 의해 매개된 TRAC 유전자에서의 공여자 주형의 표적화된 통합을 평가하기 위해, 1차 인간 CD3+ T 세포를 50,000의 감염의 다중도 (MOI)로의 통합을 위해 전기천공에 의해 각각의 gRNA를 포함하는 Cas9/gRNA RNP로 형질감염시키고, 바로 이어서 각각의 gRNA에 대해 특이적인 상동성 아암을 갖고, CISC 및 mCherry 마커를 코딩하는 공여자 주형을 운반하는 상응하는 AAV 벡터로 형질도입시켰다. 형질도입 후 48시간에, 세포를 mCherry 및 TCR 발현에 대해 유동 세포계측법을 사용하여 통합 효율에 대해 분석하였다. 표 3 (상이한 T 세포 로트로의 2회의 독립적 실험으로부터의 결과)에 제시된 바와 같이, 공여자 주형의 표적화된 통합은 시험된 3가지 gRNA의 각각에 대해 달성되었으며, TCR-/CISC+ 세포의 양은 약 12% 내지 약 18%의 범위였다.
표 3
Figure pct00003
IL2RG 로커스를 표적화하는 gRNA
표적화된 절단에 영향을 미치는 IL2RG 로커스에 대해 특이적인 gRNA의 능력을 평가하기 위해, IL2RG 유전자의 엑손 6을 표적화하는 스페이서 GC1 (서열식별번호: 4), GC2 (서열식별번호: 5), GC3 (서열식별번호: 6), GC4 (서열식별번호: 7), GC5 (서열식별번호: 8), GC6 (서열식별번호: 9), GC7 (서열식별번호: 10), GC8 (서열식별번호: 11), GC9 (서열식별번호: 12), GC10 (서열식별번호: 13), GC11 (서열식별번호: 14), GC12 (서열식별번호: 15), GC13 (서열식별번호: 16), GC14 (서열식별번호: 17), 및 GC15 (서열식별번호: 18)를 포함하는 15가지 gRNA를 신테고로부터 주문하고, 항-CD3/CD8/CD28 비드로의 3일의 활성화 후 전기천공에 의해 각각의 gRNA를 포함하는 Cas9/gRNA RNP로 형질감염된 1차 인간 CD3+ T 세포에서 평가하였다. 형질감염 후 48시간에, 세포를 상기 기재된 바와 같은 TIDES 프로토콜을 사용하여 각각의 gRNA에 대한 온-타겟 부위에서의 절단 효율에 대해 분석하였다. 세포를 편집 후 1일에 INDEL 효율에 대해 분석하였고, 이는 약 15% 내지 약 80%의 범위였으며, 이는 다수의 gRNA가 T 세포에서의 그들의 표적 부위에서 효율적으로 절단함을 지시한다 (표 4, 3회의 독립적 실험으로부터의 결과).
표 4
Figure pct00004
gRNA GC8, GC10, 및 GC12에 의해 매개된 ILR2G 로커스에서의 공여자 주형의 표적화된 통합을 평가하기 위해, 1차 인간 CD3+ T 세포를 50,000의 감염의 다중도 (MOI)로의 통합을 위해 전기천공 단독, 또는 바로 이어서 각각의 gRNA에 대해 특이적인 상동성 아암을 갖고, CISC 및 tLNGFR 마커를 코딩하는 공여자 주형을 운반하는 상응하는 AAV 벡터로의 형질도입에 의해 각각의 gRNA를 포함하는 Cas9/gRNA RNP로 형질감염시켰다. 형질도입 후 48시간에, 세포를 tLNGFR에 대해 및 INDEL 효율에 대해 유동 세포계측법을 사용하여 통합 효율에 대해 분석하였다. 표 5 (상이한 T 세포 로트로의 2회의 독립적 실험으로부터의 결과)에 제시된 바와 같이, 공여자 주형의 표적화된 통합은 시험된 3가지 gRNA의 각각에 대해 달성되었으며, CISC+ 세포의 양 (tLNGFR 발현에 의해 지시된 바와 같음)은 약 11% 내지 약 29%의 범위였다.
표 5
Figure pct00005
오프-타겟 분석
인간 IL2RG-표적화 gRNA GC8, GC10, 및 GC12에 대한 오프-타겟 부위를 1차 인간 CD3+ 세포에서 가이드-seq (GUIDE-seq) 방법 (Tsai, S. Q. et al. (2015). Nat. Biotechnol., 33(2):187-197)을 사용하여 평가하였다. 가이드-seq는 절단 부위를 확인하는데 사용되는 경험적 방법이다. 가이드-seq는 염색체 DNA에서의 이중-가닥 파단의 부위에서 올리고뉴클레오티드의 자발적 포획에 의존한다. 간략하게, 가이드 RNA/Cas9 RNP 복합체 및 이중-가닥 올리고뉴클레오티드로의 세포의 형질감염 후, 게놈 DNA를 세포로부터 정제하고, 초음파처리하고, 일련의 어댑터 라이게이션을 수행하여 라이브러리를 생성한다. 올리고뉴클레오티드-함유 라이브러리를 고-처리량 DNA 시퀀싱으로 처리하고, 산출물을 디폴트 가이드-seq 소프트웨어를 사용하여 프로세싱하여 올리고뉴클레오티드 포획의 부위를 확인한다.
SpCas9 및 sgRNA를 함유하는 RNP의 형질감염이 없는 샘플을 병행하여 프로세싱하였다. RNP-함유 및 RNP-나이브 샘플 둘 다에서 발견되는 부위 (+/-1 kb)를 추가의 분석을 위해 배제하였다.
Y-어댑터를 커먼 어댑터 (Common Adaptor)를 8-mer 분자 지수를 함유하는 샘플 바코드 어댑터 (A01 - A16)의 각각에 어닐링함으로써 제조하였다. RNP 및 가이드-seq ODN으로 뉴클레오펙션된 CD3+ T 세포로부터 추출된 게놈 DNA를 큐빗 (Qubit) 형광계 (써모피셔 사이언티픽)를 사용하여 정량화하고, 모든 샘플을 120 μl 부피의 TE 완충제에서 400 ng으로 정규화하였다. 게놈 DNA를 코바리스 (Covaris) S220 초음파처리기에 대한 표준 작동 절차에 따라 200 bp의 평균 길이로 전단하였다. 평균 단편 길이를 확인하기 위해, 1 μl의 샘플을 테이프스테이션 (TapeStation) (애질런트 (Agilent)) 상에서 제조업자의 프로토콜에 따라 분석하였다. 전단된 DNA의 샘플을 AM퓨어 (AMPure) XP SPRI 비드를 제조업자의 프로토콜에 따라 사용하여 세정하고, 17 μl의 TE 완충제에서 용리하였다. 말단 복구 반응을 게놈 DNA 상에서 1.2 μl의 dNTP 믹스 (각각 5 mM dNTP), 3 μl의 10 x T4 DNA 리가제 완충제, 2.4 μl의 말단-복구 믹스 (End-Repair Mix), 2.4 μl의 10x 플래티넘 택 완충제 (Platinum Taq Buffer) (Mg2+ 무함유), 및 0.6 μl의 택 폴리머라제 (Taq Polymerase) (비-핫스타트) 및 14 μl 전단된 DNA 샘플 (이전의 단계로부터)을 튜브당 22.5 μl의 총 부피를 위해 혼합함으로써 수행하고, 써모사이클러에서 인큐베이션하였다 (12 ℃, 15분; 37 ℃, 15분; 72 ℃, 15분; 4 ℃ 유지). 여기에 1 μl 어닐링된 Y 어댑터 (10 μM) 및 2 μl T4 DNA 리가제를 첨가하고, 혼합물을 써모사이클러에서 인큐베이션하였다 (16 ℃, 30분; 22 ℃, 30분; 4 ℃ 유지). 샘플을 AM퓨어 XP SPRI 비드를 제조업자의 프로토콜에 따라 사용하여 세정하고, 23 μl의 TE 완충제에서 용리하였다. 1 μl의 샘플을 테이프스테이션 상에서 제조업자의 프로토콜에 따라 실행하여 단편에의 어댑터의 라이게이션을 확인하였다. 가이드-seq 라이브러리를 제조하기 위해, 14 μl 뉴클레아제-무함유 H2O, 3.6 μl 10 x 플래티넘 택 완충제, 0.7 μl dNTP 믹스 (각각 10 mM), 1.4 μl MgCl2, 50 mM, 0.36 μl 플래티넘 택 폴리머라제, 1.2 μl 센스 또는 안티센스 유전자 특이적 프라이머 (10 μM), 1.8 μl TMAC (0.5 M), 0.6 μl P5_1 (10 μM) 및 이전의 단계로부터의 10 μl의 샘플을 함유하는 반응물을 제조하였다. 이 믹스를 써모사이클러에서 인큐베이션하였다 (95 ℃, 5분, 그 후 95 ℃, 30초의 15 사이클; 2분 동안 70 ℃ (사이클당 마이너스 1 ℃); 72 ℃, 30초; 이어서 95 ℃, 30초의 10 사이클; 55 ℃, 1분; 72 ℃, 30초; 이어서 72 ℃, 5분). PCR 반응물을 AM퓨어 XP SPRI 비드를 제조업자 프로토콜에 따라 사용하여 세정하고, 15 μl의 TE 완충제에서 용리하였다. 1 μl의 샘플을 테이프스테이션 상에서 제조업자의 프로토콜에 따라 점검하여 샘플 진행을 추적하였다. 제2 PCR을 6.5 μl 뉴클레아제-무함유 H2O, 3.6 μl 10x 플래티넘 택 완충제 (Mg2+ 무함유), 0.7 μl dNTP 믹스 (각각 10 mM), 1.4 μl MgCl2 (50 mM), 0.4 μl 플래티넘 택 폴리머라제, 1.2 μl의 유전자 특이적 프라이머 (Gene Specific Primer) (GSP) 2 (센스: +, 또는 안티센스: -), 1.8 μl TMAC (0.5 M), 0.6 μl P5_2 (10 μM) 및 이전의 단계로부터의 15 μl의 PCR 산물을 혼합함으로써 수행하였다.
가이드-seq를 각각의 gRNA에 대해 다중 독립적 세포 샘플 복제물 (독립적 형질감염으로부터)에 대해 완결하였으며, 결과를 표 6 및 7에 제시한다. 이들 결과는 gRNA 스페이서 GC8, GC10, 및 GC12에 대한 일반적으로 바람직한 온-타겟/오프-타겟 프로파일을 입증한다.
표 6: CD3+ T 세포에서의 스페이서 GC8, GC10, 및 GC12로의 gRNA에 대한 가이드-seq 결과의 요약
Figure pct00006
표 7: 세포 샘플 복제물 중 적어도 2개에서의 가이드-seq에 의해 검출된 오프-타겟 부위의 상세사항
Figure pct00007
1. 위치는 게놈 레퍼런스 컨소시엄 휴먼 빌드 (Genome Reference Consortium Human Build) 38 (hg38)에서의 게놈 위치를 지칭한다. NCBI 게놈 데이터 뷰어 (Genome Data Viewer)를 사용하여 각각의 위치를 주해하였다 (www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/gdv).
오프-타겟 대 온-타겟 리드의 백분율은 gRNA가 그의 의도되는 표적에 대해 특이적인지 여부의 전체적인 제시를 제공하지만, 다른 인자는 관여될 수 있다. 예를 들어, 유기체의 생존에 요구되는 필수적인 유전자의 엑손에서의 후보 gRNA에 대한 오프-타겟 부위는 gRNA가 임상에서 사용하기에 비적합하게 할 수 있다. 한편, 비-코딩 또는 인트론성 영역에서의 오프-타겟 부위는 덜 문제를 제기할 수 있다. 치료 용도를 위해 의도되는 gRNA를 평가하는데 유용한 고려사항은 1) 오프-타겟 부위의 수, 2) 오프-타겟 부위의 위치, 3) 온-타겟 편집에 비해 오프-타겟 편집의 빈도, 및 4) gRNA 스페이서 서열에 대한 오프-타겟 부위의 상동성의 정도를 포함한다.
잠재적 오프-타겟 부위를 세포 샘플 복제물에서 실험을 재현함으로써 확인하였다. 따라서, 출원인은 IL2RG 엑손 6을 표적화하는 gRNA를 사용하여 편집된 세포에서 잠재적 오프-타겟 부위를 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 다중 세포 샘플 복제물에서 검출된 오프-타겟 부위는 표 7에 보고된다. 가이드-seq에서 온-타겟 부위에 대한 각각의 오프-타겟 부위에 대한 리드 카운트의 비교는 각각의 sgRNA에 대한 오프-타겟 부위의 오프-타겟 빈도의 추정을 제공한다. 이들 데이터는 게놈 부위 및 오프-타겟 부위가 유전자의 코딩 영역 내에 놓여있는지 여부에 대한 정보와 함께 표 7에 요약된다. 프로토스페이서 인접한 모티프 (PAM)에 인접한 표적 서열에 상응하는 스페이서의 7개의 뉴클레오티드로 이루어진 스페이서 시드 서열은 쳉, 티. (Zheng, T.) 등에 의해 미스매치에 대해 민감성인 것으로 제시된 바 있다 (Zheng, T. et al. (2017). Sci. Rep., 7, 40638.). sgRNA 스페이서 시드 서열에 상응하는 미스매치를 갖는 예측되는 오프-타겟 부위는 효율적으로 편집되는 것으로 예상되지 않을 것이다. 이 시드 영역에서의 미스매치를 갖는 이러한 오프-타겟 부위는 거짓 양성일 가능성이 있다. 진정한 오프-타겟 빈도는 딥 시퀀싱 방법, 예컨대 앰플리콘 시퀀싱에 의해 확인될 수 있다 (문헌 [Medinger, R. et al. (2010). Mol. Ecol., 19(Suppl. 1):32-40] 참조).
인간 TRAC-표적화 gRNA 스페이서 TRAC 1 (서열식별번호: 3)에 대한 온-타겟 부위 및 잠재적 오프-타겟 부위를 1차 인간 CD3+ 세포에서 앰플리콘 시퀀싱을 사용하여 평가하였다. 한 쌍의 PCR 프라이머를 대략 중간에 위치한 잠재적 절단 부위를 갖는 관심의 영역의 약 200 bp를 증폭시키도록 디자인하였다. 바코드화된 앰플리콘을 RNP-처리된 및 모의-형질감염된 세포로부터 생성하고, 복합체화하고, 고-처리량 DNA 시퀀싱으로 처리하였다. 서열 리드를 탈복합체화하고, 쌍형성된-말단 리드를 정렬하고, 판다섹 (Pandaseq) 2.11 (Masella, A. P., et al. (2012). BMC bioinformatics, 13(1), 31)을 사용하여 병합하고, INDEL의 빈도를 바이오파이톤 (Biopython) 1.69 페어와이즈2 정렬기를 사용하는 주문 소프트웨어로 각각의 표적 부위에 대해 결정하였다. 각각의 표적 부위에 대해, 최소 10,000개의 서열 리드 및 평균 40,000개에 걸쳐 리드의 수집을 수행하였다. 표 8에 제시된 바와 같이, 온-타겟 부위에 대한 INDEL 빈도는 약 85%였다. 0.2% 초과의 INDEL 빈도를 갖는 3개의 잠재적 오프-타겟 부위를 확인하였지만, 이들은 시퀀싱 실행에서 잡음으로부터 발생된 것으로 보인다. 이들 결과는 gRNA 스페이서 TRAC 1에 대한 매우 바람직한 온-타겟/오프-타겟 프로파일을 지시한다.
표 8
Figure pct00008
Figure pct00009
전체적으로, CD3+ T 세포에서의 가이드-seq 및 앰플리콘 시퀀싱 분석으로부터의 결과는 스페이서 GC8, GC10, GC12, 및 TRAC 1을 갖는 gRNA가 추가의 용도를 위한, 예컨대 입양 세포 요법에서 양호한 후보임을 입증하였다.
본원에 기재된 가이드-seq 및/또는 앰플리콘 시퀀싱 방법론을 사용한 인간 세포에서의 그들의 온-타겟/오프-타겟 프로파일에 대한 인간 TRAC 및 IL2RG 유전자에서의 표적 부위를 갖는 추가의 gRNA의 스크리닝은 β2-마이크로글로불린 키메라 수용체 T 세포를 생성하는 목적을 위해 이들 유전자를 표적화하는데 사용될 수 있는 추가의 gRNA 분자를 확인하기 위한 접근법으로서 고려된다.
실시예 2: β2-마이크로글로불린 키메라 수용체 T 세포의 생성 및 특징규명
1차 인간 T 세포의 게놈 편집
1차 인간 CD3+ 또는 CD8+ T 세포를 Cas9와의 복합체로서 1종 이상의 가이드 RNA (gRNA)로 형질감염시켜 (예를 들어, 전기천공에 의해) 리보핵단백질 복합체 (RNP)를 형성하였다. gRNA 서열은 T 세포 수용체 알파 불변 (TRAC) 유전자 (예를 들어, 서열식별번호: 1-3 중 어느 하나의 스페이서 서열을 가짐) 및/또는 인터류킨-2 수용체 감마 (IL2RG) 유전자 (예를 들어, 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 스페이서 서열을 가짐)에 대해 특이적이다. RNP 형질감염 후, 세포를 RNP에서의 gRNA에 상응하는 TRAC 또는 IL2RG 유전자 내로 통합되는 β2-마이크로글로불린 키메라 수용체 (예를 들어, 서열식별번호: 53의 아미노산 서열을 갖는 β2-마이크로글로불린 키메라 수용체)를 코딩하는 공여자 서열을 함유하는 바이러스 벡터 (예를 들어, AAV, 렌티바이러스 등) (예를 들어, 서열식별번호: 29-34, 40, 65-68, 70, 72, 75, 또는 81 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 갖는 AAV 벡터)로 예를 들어, 20,000-100,000의 MOI로 형질도입시켰다. T 세포는 세포를 RNP에서의 1종 이상의 gRNA에 상응하는 TRAC 또는 IL2RG 유전자 내로 통합되는 CISC의 둘 다의 서브유닛 (예를 들어, 서열식별번호: 47의 아미노산 서열을 갖는 CISCg 서브유닛 및 서열식별번호: 48의 아미노산 서열을 갖는 CISCb 서브유닛) 및 임의로 단리된 FRB 도메인 폴리펩티드 (예를 들어, 서열식별번호: 56 또는 57의 아미노산 서열을 갖는 단리된 FRB 도메인 폴리펩티드)를 코딩하는 공여자 서열을 함유하는 1종 이상의 바이러스 벡터 (예를 들어, AAV, 렌티바이러스 등) (예를 들어, 서열식별번호: 19-84 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 갖는 AAV 벡터)로 예를 들어, 20,000-100,000의 MOI로 형질도입시킴으로써 CISC 또는 유인용 CISC (DISC)를 발현하도록 추가로 편집될 수 있다.
편집된 T 세포에서의 β2-마이크로글로불린 키메라 수용체 발현
편집된 T 세포에서의 β2-마이크로글로불린 키메라 수용체의 발현을 편집 후 (예를 들어, 편집 후 2 내지 7일) 유동 세포계측법에 의해 평가하였다. 세포를 관련 기술분야에 공지된 면역조직화학적 기법을 사용하여 염색하고, 세포 게놈 내로 통합되는 β2-마이크로글로불린 키메라 수용체를 코딩하는 공여자 주형에 의해 코딩되는 선택가능한 마커 (예를 들어 tLNGFR) 또는 형광 태그 (예를 들어, mCherry 또는 GFP)의 발현에 의해 특징규명하였다. 예시적인 벡터는 서열식별번호: 33 (도 9), 서열식별번호: 34 (도 14), 서열식별번호: 65 (도 20), 및 서열식별번호: 81 (도 36)을 포함한다.
편집된 T 세포에서의 CISC/DISC 발현
편집된 T 세포에서의 CISC/DISC의 발현을 편집 후 (예를 들어, 편집 후 2 내지 7일) 유동 세포계측법에 의해 평가하였다. 세포를 관련 기술분야에 공지된 면역조직화학적 기법을 사용하여 염색하고, 세포 게놈 내로 통합되는 CISC/DISC를 코딩하는 공여자 주형에 의해 코딩되는 선택가능한 마커 (예를 들어 tLNGFR) 및/또는 형광 태그 (예를 들어, mCherry 또는 GFP)의 발현에 의해 특징규명하였다.
편집된 T 세포에서의 TCR 및 IL2RG 발현
편집된 T 세포에서의 TCRα/β 발현 및/또는 IL2RG 발현은 관련 기술분야에 공지된 기법을 사용하여 평가되고, 상기 기재된 바와 같은 β2-마이크로글로불린 키메라 수용체 발현 및/또는 CISC/DISC 발현과 동시에 평가될 수 있다. 예를 들어, 편집된 T 세포를 TCRα/β 발현 및/또는 IL2RG 발현을 위해 염색하고, 공여자 주형-연관된 마커 tLNGFR의 경우에, 세포를 또한 tLNGFR 발현을 위해 염색하였다. 형광 공여자 주형-연관된 마커 (예를 들어, mCherry)의 항체 결합 및 발현을 유동 세포계측법에 의해 분석하였다.
β2-마이크로글로불린 키메라 수용체 지속성
β2-마이크로글로불린 키메라 수용체 T 세포를 관련 기술분야에 공지된 기법을 사용하여 tLNGFR 발현을 위해 염색하고, 편집 후 다양한 시점 (예를 들어, 편집 후 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12일 이상)에서 유동 세포계측법에 의해 분석하였다.
β2-마이크로글로불린 키메라 수용체 발현의 용량-의존성
β2-마이크로글로불린 키메라 수용체 T 세포를 다양한 AAV MOI (예를 들어, 25,000, 50,000, 또는 100,000)를 사용하여 제조하였다. 세포를 관련 기술분야에 공지된 기법을 사용하여 β2-마이크로글로불린 키메라 수용체 발현을 위해 염색하고, 유동 세포계측법에 의해 분석하였다 (예를 들어, 편집 후 2일).
CISC-매개된 선택적 증식
CISC 복합체의 둘 다의 서브유닛을 발현하는 편집된 세포에서 라파마이신-의존성 증식의 기능적 결정을 0.1-20 nM 라파마이신 또는 10-200 nM 라파마이신 유사체 (예를 들어, AP21967)를 갖는 완전 세포 배양 배지의 보충을 통해 시험관내에서 확인하였다.
칼시뉴린 억제제에 대한 저항성
칼시뉴린 억제제 (CNI)에 대한 저항성을 편집된 T 림프구의 증식 및 세포 생존율을 치료 수준의 CNI (예를 들어, 10 ng/ml 타크롤리무스 (FK506) 또는 200 ng/ml 시클로스포린 A (CsA))의 존재 하에서 정량화함으로써 분석하였다.
실시예 3A: β2-마이크로글로불린 키메라 수용체 T 세포 세포독성
β2-마이크로글로불린 키메라 수용체를 발현하는 편집된 이펙터 T 세포의 T 세포 세포독성을 평가하기 위해, 실시예 2에 기재된 바와 같이 생성된 β2-마이크로글로불린 키메라 수용체 T 세포를 시험관내 세포독성 검정에서 시험하였다. 표적 세포 (예를 들어, CTL)를 비표지된 이펙터 T 세포 (예를 들어, 편집된 (β2-마이크로글로불린 키메라 수용체-발현) 또는 비-편집된 (β2-마이크로글로불린 키메라 수용체-음성) 1차 인간 T 림프구)와의 공동-배양 직전에 형광 막 통합 염료 (예를 들어, CFSE)로 표지하였다. 비표지된 이펙터 T 림프구를 표지된 표적 세포와 다양한 비 (예를 들어, 20:1, 10:1, 5:1, 2:1, 또는 1:1 이펙터-대-표적 몰비)로 공동-배양하고, 완전 배지에서 24시간 동안 배양한 후, 유동 세포계측법에 의해 분석하였다. 유동 세포계측 평가는 세포를 아넥신 (Annexin)-V 및 생존성 염료 (예를 들어, 7-아미노악티노마이신 (7-AAD) 또는 아이오드화프로피듐 (PI))로 염색하는 것을 포함하며, 퍼센트 용해를 표적 세포 단독 (공동-배양 없음)에 비해 공동-배양 조건에서 생존성으로 잔류하는 (예를 들어, 아넥신-V 및 생존성 염료 형광 신호에 대해 음성) 표지된 (CFSE+) 세포의 수에 기초하여 계산하였다.
실시예 3B: TRAC 유전자-편집된 T 세포 세포독성
TRAC 유전자에서 편집된 이펙터 T 세포의 T 세포 세포독성을 평가하기 위해, TCR 발현을 넉-아웃하도록 (TCR KO 이펙터 T 세포) 서열식별번호: 3의 스페이서 서열을 갖는 TRAC 1 gRNA 및 pCB0104의 서열을 갖는 AAV 벡터 (서열식별번호: 65)를 사용하여 실시예 2에 기재된 바와 같이 편집된 CD3+ T 세포를 시험관내 세포독성 검정에서 시험하였다. 비-편집된 CD3+ T 세포 (WT 이펙터 T 세포)는 양성 대조군으로서 포함되었다. 인간 림프모구성 백혈병 세포주, REH (ATCC® CRL-8286™)를 세포독성 검정을 위한 표적 세포로서 사용하였다. REH 세포를 막 표지화 염료 카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르 (CFSE)로 표지하고, 10:1, 5:1, 및 1:1의 이펙터-대-표적 비로 플레이팅된 TCR KO 이펙터 T 세포 또는 WT 이펙터 T 세포 중 어느 하나와 37℃에서 24시간 동안 공동-배양하였다. 세포를 아넥신 V 및 생존성 마커 (7-아미노악티노마이신 D; 7-AAD)를 표적화하는 형광 접합된 항체로 염색하였다. 퍼센트 표적 용해를 공동-배양 후 잔류하는 생존성 (아넥신-V-음성 및 7-AAD-음성) CFSE+ 표적 세포의 수에 기초하여 계산하였다. TCR KO 이펙터 T 세포는 약 19% 내지 약 33%의 범위의 WT 이펙터 T 세포에 비해 표적 세포 용해의 감소를 나타내었으며, 이는 유전자를 표적화하는 스페이서를 갖는 gRNA를 사용하여 TRAC 유전자를 편집하는 것이 편집된 T 세포에서 내인성 TCR 신호전달을 유효하게 감소시킬 수 있음을 입증한다.
실시예 4A: β2-마이크로글로불린 키메라 수용체 T 세포 증식
β2-마이크로글로불린 키메라 수용체 T 세포 증식을 평가하기 위해, 이펙터 T 림프구 (예를 들어, 편집된 (β2-마이크로글로불린 키메라 수용체-발현) 또는 비-편집된 (β2-마이크로글로불린 키메라 수용체-음성) 1차 인간 T 림프구)를 제조업자의 권고된 프로토콜에 따라 비표지된 표적 세포와의 공동-배양 직전에 형광 막 통합 염료 (예를 들어, CFSE)로 표지하였다. 표지된 이펙터 T 림프구를 2-5일 동안 완전 배지에서 다양한 비 (예를 들어, 20:1, 10:1, 5:1, 2:1, 또는 1:1 이펙터-대-표적 몰비)로 비표지된 표적 세포와 공동-배양하였다. 유동 세포계측 분석을 비-생존성 세포를 배제하기 위해 생존성 염료를 사용하여 수행하였다. 증식을 형광 태그부착된 생존성 T 림프구의 세포 수 및 평균 형광 강도 (MFI)에 기초하여 계산하였으며, MFI는 각각의 세포 분열로 대략 2배 감소하였다.
실시예 4B: β2-마이크로글로불린 키메라 수용체 T 세포 증식
β2-마이크로글로불린 키메라 수용체 T 세포 증식을 평가하기 위해, 편집된 β2-마이크로글로불린 키메라 수용체 이펙터 T 세포 (서열식별번호: 3의 스페이서 서열을 갖는 TRAC 1 gRNA 및 서열식별번호: 65의 서열을 갖는 AAV 벡터 (pCB0104) 또는 모의 전기천공된 대조군 이펙터 T 세포 (EP 단독)를 사용하여 실시예 2에 기재된 바와 같이 생성됨)를 24-96시간 동안 완전 배지에서 1:1의 이펙터-대-표적 세포 비로 비자극된 HLA-미스매칭된 PBMC와 공동-배양하기 직전에 CFSE로 표지하였다. IL-2 단독과의 이펙터 T 세포의 인큐베이션은 비자극된 대조군 조건으로서 포함되었다. 증식을 분열하는 세포에서의 CFSE 표지의 형광 강도의 소실 (각각의 세포 분열로 대략 2배)에 의해 측정하였다. 각각의 조건에 대한 모 세포의 퍼센트로서의 CFSElow (증식하는) 세포의 양을 도 2a에 제시한다. β2-마이크로글로불린 키메라 수용체 T 세포의 50% 초과는 대조군 이펙터 T 세포의 단지 약 20%에 비해, PBMC 공동-배양 조건에서 증식하고 있는 것으로 밝혀졌으며, 이는 편집된 세포에서의 β2-마이크로글로불린 키메라 수용체가 TCR-유사 신호전달을 부여할 수 있음을 입증한다. β2-마이크로글로불린 키메라 수용체 이펙터 T 세포를 T 세포 활성화의 지표로서 CD25 발현을 위해 염색하였다. 도 2b에 제시된 바와 같이, PBMC 공동-배양 조건에서의 β2-마이크로글로불린 키메라 수용체 이펙터 T 세포는 IL-2 단독 조건에서의 단지 20% CD25+에 비해, 약 80% CD25+였으며, 이는 β2-마이크로글로불린 키메라 수용체 이펙터 T 세포와 HLA-미스매칭된 PBMC의 상호작용이 편집된 세포를 활성화시킬 수 있음을 지시한다.
실시예 5: β2-마이크로글로불린 키메라 수용체 T 세포 시토카인 분비
β2-마이크로글로불린 키메라 수용체 T 세포 시토카인 분비를 평가하기 위해, 편집된 β2-마이크로글로불린 키메라 수용체 이펙터 T 세포 (서열식별번호: 3의 스페이서 서열을 갖는 TRAC 1 gRNA 및 서열식별번호: 65의 서열을 갖는 AAV 벡터 (pCB0104)를 사용하여 실시예 2에 기재된 바와 같이 생성되고, 항-LNGFR 항체 자성 비드를 사용한 자성 단리에 의해 정제됨), 편집된 TCR KO 이펙터 T 세포 (서열식별번호: 3의 스페이서 서열을 갖는 TRAC 1 gRNA를 사용하여 실시예 2에 기재된 바와 같이 생성됨), 및 모의 전기천공된 대조군 이펙터 T 세포 (EP 단독)를 96시간 동안 완전 배지에서 5:1 및 1:1의 이펙터-대-표적 세포 비로 HLA-미스매칭된 PBMC와 공동-배양하였다. IL-2 단독과의 이펙터 T 세포의 인큐베이션은 비자극된 대조군 조건으로서 포함되었다. 세포 배양 상청액을 수확하고, ELISA에 의해 인터페론-감마에 대해 분석하였다 (도 3). TRAC 유전자에서 편집함으로써 T 세포에서의 TCR KO는 대조군 이펙터 T 세포에 비해 PBMC 공동-배양에 반응하여 IFNg 분비의 양을 감소시켰고, TCR KO T 세포에서의 β2-마이크로글로불린 키메라 수용체의 발현은 이 효과를 반전시켰을 뿐만 아니라, 대조군 이펙터 T 세포에 비해 PBMC 공동-배양 조건에서 β2-마이크로글로불린 키메라 수용체 T 세포에 의한 IFNg 분비의 약 2배 증가를 발생시켰다.
실시예 6: 이종 이식편 대 숙주 질환 (X-GVHD)의 뮤린 모델
이종 이식편 대 숙주 질환 (X-GVHD)의 뮤린 모델을 사용하여 β2-마이크로글로불린 키메라 수용체 T 세포의 기능성을 결정하였다. Nod/Scid/감마 (NSG) 마우스를 조사하고, 이식의 30일 내에 이식편 대 숙주 질환을 유도하는 CD3+ T 세포로 이식하였다. X-GVHD 진행을 억제하는 편집된 β2-마이크로글로불린 키메라 수용체 CTL의 연속적 또는 공동 이식을 사망률, 중량 변화, 및 인간 T 세포의 이식에 의해 측정하였다. 라파마이신 및/또는 칼시뉴린 억제제 처리의 존재 또는 부재 하에서의 편집된 T 세포 (hCD45+CD3-)의 지속성을 또한 평가하였다.
실시예 7: 뮤린 유도된 당뇨병 모델
NSG 마우스를 췌장 섬 인슐린 생산 베타 세포를 표적화하고 근절하는 스트렙토조신 (STZ)으로 처리하였다. 마우스는 제1형 당뇨병 (T1D)에서의 사건을 개괄하는 질환 모델에서 고혈당성이 된다. 당뇨병 마우스를 동물의 정상혈당성 수준으로의 복귀 및 인슐린 생산을 발생시키는 인간 췌장 섬 베타 세포로 이식하였다. 인간 비-MHC 매칭된 CD3+ T 세포의 이식은 파괴를 위한 인간 섬 세포를 표적화하여 고혈당성 수준으로의 복귀를 발생시켰다. 췌장 세포 파괴 및 이식 거부를 억제하는 (공동으로 또는 연속적으로) β2-마이크로글로불린 키메라 수용체 T 세포와의 비-MHC 매칭된 CD3+ T 세포의 공동-이식의 능력을 예를 들어, 혈청 글루코스 수준, c-펩티드 수준, 및 인슐린 생산을 측정함으로써 평가하였다.
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
Figure pct00031
Figure pct00032
Figure pct00033
Figure pct00034
Figure pct00035
Figure pct00036
Figure pct00037
Figure pct00038
Figure pct00039
Figure pct00040
Figure pct00041
Figure pct00042
Figure pct00043
Figure pct00044
Figure pct00045
Figure pct00046
Figure pct00047
Figure pct00048
Figure pct00049
Figure pct00050
Figure pct00051
Figure pct00052
SEQUENCE LISTING <110> Casebia Therapeutics Limited Liability Partnership Stankovich, Basha <120> METHODS AND COMPOSITIONS OF CYTOTOXIC T CELL DEPLETION <130> 052984-516001WO <150> 62/663,966 <151> 2018-04-27 <160> 84 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> TRAC gRNA spacer, TRAC 2 <400> 1 agagcaacag tgctgtggcc 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> TRAC gRNA spacer, TRAC 3 <400> 2 tctctcagct ggtacacggc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> TRAC gRNA spacer, TRAC 1 <400> 3 acaaaactgt gctagacatg 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> IL2RG gRNA spacer, GC1 <400> 4 accagtgcct ggcatgtagt 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> IL2RG gRNA spacer, GC2 <400> 5 ccagtgcctg gcatgtagta 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> IL2RG gRNA spacer, GC3 <400> 6 cagtgcctgg catgtagtag 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> IL2RG gRNA spacer, GC4 <400> 7 gtaggggcac aacaaatata 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> IL2RG gRNA spacer, GC5 <400> 8 gaatcctttc ctgtttgcat 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> IL2RG gRNA spacer, GC6 <400> 9 cctgtttgca ttggaagccg 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> IL2RG gRNA spacer, GC7 <400> 10 gaagccgtgg ttatctctgt 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> IL2RG gRNA spacer, GC8 <400> 11 ggttatctct gttggctcca 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> IL2RG gRNA spacer, GC9 <400> 12 gttatctctg ttggctccat 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> IL2RG gRNA spacer, GC10 <400> 13 aaggctgata atcaatccca 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> IL2RG gRNA spacer, GC11 <400> 14 ggagccaaca gagataacca 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> IL2RG gRNA spacer, GC12 <400> 15 ccacggcttc caatgcaaac 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> IL2RG gRNA spacer, GC13 <400> 16 gcttccaatg caaacaggaa 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> IL2RG gRNA spacer, GC14 <400> 17 tagaaaaaag aaaagcaaag 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> IL2RG gRNA spacer, GC15 <400> 18 ttgtgcccct actacatgcc 20 <210> 19 <211> 5203 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> TRAC HA TRAC 2-synpA-MND-Kozak-ER-FKBP-IL2RG-P2A-ER-FRB-IL2RB-P2A-mCherry-WPRE 3-BGHpA-HA TRAC 2 <400> 19 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60 gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120 actccatcac taggggttcc tgcggcccgc ggcggcttgt gcctgtccct gagtcccagt 180 ccatcacgag cagctggttt ctaagatgct atttcccgta taaagcatga gaccgtgact 240 tgccagcccc acagagcccc gcccttgtcc atcactggca tctggactcc agcctgggtt 300 ggggcaaaga gggaaatgag atcatgtcct aaccctgatc ctcttgtccc acagatatcc 360 agaaccctga ccctgccgtg taccagctga gagactctaa atccagtgac aagtctgtct 420 gcctattcac cgattttgat tctcaaacaa atgtgtcaca aagtaaggat tctgatgtgt 480 atatcacaga caaaactgtg ctagacatga ggtctatgga cttcaagagc aacagtgctg 540 tttaattaaa tgaaataaaa gatctttatt ttcattagat ctgtgtgttg gttttttgtg 600 tgaacagaga aacaggagaa tatgggccaa acaggatatc tgtggtaagc agttcctgcc 660 ccggctcagg gccaagaaca gttggaacag cagaatatgg gccaaacagg atatctgtgg 720 taagcagttc ctgccccggc tcagggccaa gaacagatgg tccccagatg cggtcccgcc 780 ctcagcagtt tctagagaac catcagatgt ttccagggtg ccccaaggac ctgaaatgac 840 cctgtgcctt atttgaacta accaatcagt tcgcttctcg cttctgttcg cgcgcttctg 900 ctccccgagc tctatataag cagagctcgt ttagtgaacc gtcagatcgc cgccaccatg 960 ccacttggcc tgctctggct gggcttggca ttgctcggcg cgctccacgc ccaggctggc 1020 gttcaagttg aaaccattag tcccggagac ggtcgaacat ttcccaaacg gggccagacg 1080 tgcgtggtac actacaccgg aatgctggag gatggaaaaa aatttgacag cagccgggac 1140 agaaacaaac cattcaagtt catgcttggt aaacaagagg taatacgggg ttgggaagag 1200 ggtgtggccc agatgtcagt agggcaacgc gcgaagttga ccataagccc cgactatgcc 1260 tatggggcga caggccatcc cggtataatt cctccgcacg ctacactggt gtttgatgtt 1320 gagttgctga agctggagca aaatcttgtt attccgtggg ctcccgagaa cctcacattg 1380 cacaaattgt ccgaatcaca attggagctt aattggaaca atagattcct gaatcactgc 1440 cttgagcacc tcgtacaata ccggacagac tgggatcact cttggacgga gcagtccgtg 1500 gactaccgac ataaattctc actcccctca gtggatggcc agaaacgcta tacctttaga 1560 gtccggtccc gcttcaaccc gttgtgcggc agcgcacagc actggagtga atggagtcat 1620 ccgatacact ggggaagcaa tacgtcaaaa gagaacccgt tcctttttgc gctggaagca 1680 gtcgtgatca gcgttggatc tatggggctg atcatctccc ttctctgcgt ctatttctgg 1740 ctcgaaagaa ctatgccacg catccctacg ctgaaaaatc tggaggatct tgtgacggaa 1800 tatcatggaa atttttccgc ctggagtgga gtttccaaag gtctcgctga atctctgcag 1860 ccagactata gtgagcggct ctgcttggtc tctgagattc cacctaaggg gggggcgctc 1920 ggggaaggcc cgggcgcaag tccgtgtaat caacacagtc cgtactgggc tccaccatgc 1980 tataccctca agccggaaac tggatccggc gctacaaatt tttcactgct gaaacaggcg 2040 ggtgatgtgg aggagaaccc tggacccatg ccacttggcc tgctctggct gggcttggca 2100 ttgctcggcg cgctccacgc ccaggctgaa ctgatccgcg tggccatatt gtggcatgag 2160 atgtggcatg agggattgga ggaggcgagt aggctgtact ttggggaaag gaatgttaaa 2220 gggatgtttg aggtccttga acccctccac gctatgatgg aaagaggacc tcaaacgctt 2280 aaagagacgt cattcaatca agcctatgga cgggatctta tggaagctca agaatggtgt 2340 cgaaaataca tgaaaagcgg gaatgttaag gacctcacgc aagcctggga tctgtattac 2400 catgttttcc gacgcatttc taaacaagga aaagatacta tcccatggtt ggggcacttg 2460 ctcgttgggc tcagtggggc gtttggattc atcatcctcg tatatctgtt gattaattgt 2520 cggaacacag gtccctggct taaaaaagtt ttgaagtgta acaccccgga tccttctaaa 2580 ttttttagtc aacttagttc agaacacggg ggcgatgttc aaaagtggct gagttccccg 2640 tttcccagtt caagtttctc ccctgggggt ctcgcccccg agatatcacc tcttgaagtg 2700 ctcgagcggg acaaagttac acagcttctt ttgcaacagg ataaggttcc ggagccggcg 2760 tctctcagct ctaaccattc actcacttct tgtttcacca accaagggta ttttttcttc 2820 catctgcctg atgccttgga gattgaggct tgtcaggtgt actttaccta tgacccctat 2880 agtgaggaag accctgacga aggcgtagct ggcgccccca ctggctccag tccacagcct 2940 cttcagcctc tgtcagggga ggacgacgca tattgtacgt tcccctcacg ggacgacctt 3000 ctgctgtttt caccctcact gctcggcgga ccctccccgc caagcacggc acctgggggg 3060 agtggggcag gagaagaaag gatgcctcct agtttgcagg agcgggttcc tcgcgactgg 3120 gatccgcaac ccctcggacc acccacccct ggcgtacctg atctggtcga cttccaacca 3180 cctccggagc ttgtcctcag agaggccgga gaggaagtcc cagacgcggg gccaagagag 3240 ggtgtgtcat ttccctggtc ccgccctccg ggacagggtg agtttcgggc gctgaatgcg 3300 aggctccccc ttaataccga tgcgtacctg tcattgcagg aacttcaggg ccaggatcct 3360 acccacctgg tgggaagcgg agctactaac ttcagcctgc tgaagcaggc tggagacgtg 3420 gaggagaacc ctggacctat ggtgagcaag ggcgaggagg ataacatggc catcatcaag 3480 gagttcatgc gcttcaaggt gcacatggag ggctccgtga acggccacga gttcgagatc 3540 gagggcgagg gcgagggccg cccctacgag ggcacccaga ccgccaagct gaaggtgacc 3600 aagggtggcc ccctgccctt cgcctgggac atcctgtccc ctcagttcat gtacggctcc 3660 aaggcctacg tgaagcaccc cgccgacatc cccgactact tgaagctgtc cttccccgag 3720 ggcttcaagt gggagcgcgt gatgaacttc gaggacggcg gcgtggtgac cgtgacccag 3780 gactcctccc tgcaggacgg cgagttcatc tacaaggtga agctgcgcgg caccaacttc 3840 ccctccgacg gccccgtaat gcagaagaag accatgggct gggaggcctc ctccgagcgg 3900 atgtaccccg aggacggcgc cctgaagggc gagatcaagc agaggctgaa gctgaaggac 3960 ggcggccact acgacgctga ggtcaagacc acctacaagg ccaagaagcc cgtgcagctg 4020 cccggcgcct acaacgtcaa catcaagttg gacatcacct cccacaacga ggactacacc 4080 atcgtggaac agtacgaacg cgccgagggc cgccactcca ccggcggcat ggacgagctg 4140 tacaagtagg taagataatc aacctctgga ttacaaaatt tgtgaaagat tgactggtat 4200 tcttaactat gttgctcctt ttacgctatg tggatacgct gctttaatgc ctttgtatca 4260 tgctattgct tcccgtatgg ctttcatttt ctcctccttg tataaatcct ggttagttct 4320 tgccacggcg gaactcatcg ccgcctgcct tgcccgctgc tggacagggg ctcggctgtt 4380 gggcactgac aattccgtgg tgtgccttct agttgccagc catctgttgt ttgcccctcc 4440 cccgtgcctt ccttgaccct ggaaggtgcc actcccactg tcctttccta ataaaatgag 4500 gaaattgcat cgcattgtct gagtaggtgt cattctattc tggggggtgg ggtggggcag 4560 gacagcaagg gggaggattg ggaagacaat agcaggcatg ctggggatgc ggtgggctct 4620 acgccggcga gcaacaaatc tgactttgca tgtgcaaacg ccttcaacaa cagcattatt 4680 ccagaagaca ccttcttccc cagcccaggt aagggcagct ttggtgcctt cgcaggctgt 4740 ttccttgctt caggaatggc caggttctgc ccagagctct ggtcaatgat gtctaaaact 4800 cctctgattg gtggtctcgg ccttatccat tgccaccaaa accctctttt tactaagaaa 4860 cagtgagcct tgttctggca gtccagagaa tgacacggga aaaaagcaga tgaagagaag 4920 gtggcaggag agggcacgtg gcccagcctc agtctctcca actgagttcc tgcctgcctg 4980 cctttgctca gactgtttgc cccttactgc tcttctaggc ctcattctaa gccccttctc 5040 caagttgcct cctagggaat tgccttaggc cgcaggaacc cctagtgatg gagttggcca 5100 ctccctctct gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc 5160 cgggcggcct cagtgagcga gcgagcgcgc agctgcctgc agg 5203 <210> 20 <211> 5203 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> TRAC HA TRAC 3-synpA-MND-Kozak-ER-FKBP-IL2RG-P2A-ER-FRB-IL2RB-P2A-mCherry-WPRE 3-BGHpA-HA TRAC 3 <400> 20 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60 gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120 actccatcac taggggttcc tgcggcccgc ggcggtgcct ttactctgcc agagttatat 180 tgctggggtt ttgaagaaga tcctattaaa taaaagaata agcagtatta ttaagtagcc 240 ctgcatttca ggtttccttg agtggcaggc caggcctggc cgtgaacgtt cactgaaatc 300 atggcctctt ggccaagatt gatagcttgt gcctgtccct gagtcccagt ccatcacgag 360 cagctggttt ctaagatgct atttcccgta taaagcatga gaccgtgact tgccagcccc 420 acagagcccc gcccttgtcc atcactggca tctggactcc agcctgggtt ggggcaaaga 480 gggaaatgag atcatgtcct aaccctgatc ctcttgtccc acagatatcc agaaccctga 540 cttaattaaa tgaaataaaa gatctttatt ttcattagat ctgtgtgttg gttttttgtg 600 tgaacagaga aacaggagaa tatgggccaa acaggatatc tgtggtaagc agttcctgcc 660 ccggctcagg gccaagaaca gttggaacag cagaatatgg gccaaacagg atatctgtgg 720 taagcagttc ctgccccggc tcagggccaa gaacagatgg tccccagatg cggtcccgcc 780 ctcagcagtt tctagagaac catcagatgt ttccagggtg ccccaaggac ctgaaatgac 840 cctgtgcctt atttgaacta accaatcagt tcgcttctcg cttctgttcg cgcgcttctg 900 ctccccgagc tctatataag cagagctcgt ttagtgaacc gtcagatcgc cgccaccatg 960 ccacttggcc tgctctggct gggcttggca ttgctcggcg cgctccacgc ccaggctggc 1020 gttcaagttg aaaccattag tcccggagac ggtcgaacat ttcccaaacg gggccagacg 1080 tgcgtggtac actacaccgg aatgctggag gatggaaaaa aatttgacag cagccgggac 1140 agaaacaaac cattcaagtt catgcttggt aaacaagagg taatacgggg ttgggaagag 1200 ggtgtggccc agatgtcagt agggcaacgc gcgaagttga ccataagccc cgactatgcc 1260 tatggggcga caggccatcc cggtataatt cctccgcacg ctacactggt gtttgatgtt 1320 gagttgctga agctggagca aaatcttgtt attccgtggg ctcccgagaa cctcacattg 1380 cacaaattgt ccgaatcaca attggagctt aattggaaca atagattcct gaatcactgc 1440 cttgagcacc tcgtacaata ccggacagac tgggatcact cttggacgga gcagtccgtg 1500 gactaccgac ataaattctc actcccctca gtggatggcc agaaacgcta tacctttaga 1560 gtccggtccc gcttcaaccc gttgtgcggc agcgcacagc actggagtga atggagtcat 1620 ccgatacact ggggaagcaa tacgtcaaaa gagaacccgt tcctttttgc gctggaagca 1680 gtcgtgatca gcgttggatc tatggggctg atcatctccc ttctctgcgt ctatttctgg 1740 ctcgaaagaa ctatgccacg catccctacg ctgaaaaatc tggaggatct tgtgacggaa 1800 tatcatggaa atttttccgc ctggagtgga gtttccaaag gtctcgctga atctctgcag 1860 ccagactata gtgagcggct ctgcttggtc tctgagattc cacctaaggg gggggcgctc 1920 ggggaaggcc cgggcgcaag tccgtgtaat caacacagtc cgtactgggc tccaccatgc 1980 tataccctca agccggaaac tggatccggc gctacaaatt tttcactgct gaaacaggcg 2040 ggtgatgtgg aggagaaccc tggacccatg ccacttggcc tgctctggct gggcttggca 2100 ttgctcggcg cgctccacgc ccaggctgaa ctgatccgcg tggccatatt gtggcatgag 2160 atgtggcatg agggattgga ggaggcgagt aggctgtact ttggggaaag gaatgttaaa 2220 gggatgtttg aggtccttga acccctccac gctatgatgg aaagaggacc tcaaacgctt 2280 aaagagacgt cattcaatca agcctatgga cgggatctta tggaagctca agaatggtgt 2340 cgaaaataca tgaaaagcgg gaatgttaag gacctcacgc aagcctggga tctgtattac 2400 catgttttcc gacgcatttc taaacaagga aaagatacta tcccatggtt ggggcacttg 2460 ctcgttgggc tcagtggggc gtttggattc atcatcctcg tatatctgtt gattaattgt 2520 cggaacacag gtccctggct taaaaaagtt ttgaagtgta acaccccgga tccttctaaa 2580 ttttttagtc aacttagttc agaacacggg ggcgatgttc aaaagtggct gagttccccg 2640 tttcccagtt caagtttctc ccctgggggt ctcgcccccg agatatcacc tcttgaagtg 2700 ctcgagcggg acaaagttac acagcttctt ttgcaacagg ataaggttcc ggagccggcg 2760 tctctcagct ctaaccattc actcacttct tgtttcacca accaagggta ttttttcttc 2820 catctgcctg atgccttgga gattgaggct tgtcaggtgt actttaccta tgacccctat 2880 agtgaggaag accctgacga aggcgtagct ggcgccccca ctggctccag tccacagcct 2940 cttcagcctc tgtcagggga ggacgacgca tattgtacgt tcccctcacg ggacgacctt 3000 ctgctgtttt caccctcact gctcggcgga ccctccccgc caagcacggc acctgggggg 3060 agtggggcag gagaagaaag gatgcctcct agtttgcagg agcgggttcc tcgcgactgg 3120 gatccgcaac ccctcggacc acccacccct ggcgtacctg atctggtcga cttccaacca 3180 cctccggagc ttgtcctcag agaggccgga gaggaagtcc cagacgcggg gccaagagag 3240 ggtgtgtcat ttccctggtc ccgccctccg ggacagggtg agtttcgggc gctgaatgcg 3300 aggctccccc ttaataccga tgcgtacctg tcattgcagg aacttcaggg ccaggatcct 3360 acccacctgg tgggaagcgg agctactaac ttcagcctgc tgaagcaggc tggagacgtg 3420 gaggagaacc ctggacctat ggtgagcaag ggcgaggagg ataacatggc catcatcaag 3480 gagttcatgc gcttcaaggt gcacatggag ggctccgtga acggccacga gttcgagatc 3540 gagggcgagg gcgagggccg cccctacgag ggcacccaga ccgccaagct gaaggtgacc 3600 aagggtggcc ccctgccctt cgcctgggac atcctgtccc ctcagttcat gtacggctcc 3660 aaggcctacg tgaagcaccc cgccgacatc cccgactact tgaagctgtc cttccccgag 3720 ggcttcaagt gggagcgcgt gatgaacttc gaggacggcg gcgtggtgac cgtgacccag 3780 gactcctccc tgcaggacgg cgagttcatc tacaaggtga agctgcgcgg caccaacttc 3840 ccctccgacg gccccgtaat gcagaagaag accatgggct gggaggcctc ctccgagcgg 3900 atgtaccccg aggacggcgc cctgaagggc gagatcaagc agaggctgaa gctgaaggac 3960 ggcggccact acgacgctga ggtcaagacc acctacaagg ccaagaagcc cgtgcagctg 4020 cccggcgcct acaacgtcaa catcaagttg gacatcacct cccacaacga ggactacacc 4080 atcgtggaac agtacgaacg cgccgagggc cgccactcca ccggcggcat ggacgagctg 4140 tacaagtagg taagataatc aacctctgga ttacaaaatt tgtgaaagat tgactggtat 4200 tcttaactat gttgctcctt ttacgctatg tggatacgct gctttaatgc ctttgtatca 4260 tgctattgct tcccgtatgg ctttcatttt ctcctccttg tataaatcct ggttagttct 4320 tgccacggcg gaactcatcg ccgcctgcct tgcccgctgc tggacagggg ctcggctgtt 4380 gggcactgac aattccgtgg tgtgccttct agttgccagc catctgttgt ttgcccctcc 4440 cccgtgcctt ccttgaccct ggaaggtgcc actcccactg tcctttccta ataaaatgag 4500 gaaattgcat cgcattgtct gagtaggtgt cattctattc tggggggtgg ggtggggcag 4560 gacagcaagg gggaggattg ggaagacaat agcaggcatg ctggggatgc ggtgggctct 4620 acgccggcgt accagctgag agactctaaa tccagtgaca agtctgtctg cctattcacc 4680 gattttgatt ctcaaacaaa tgtgtcacaa agtaaggatt ctgatgtgta tatcacagac 4740 aaaactgtgc tagacatgag gtctatggac ttcaagagca acagtgctgt ggcctggagc 4800 aacaaatctg actttgcatg tgcaaacgcc ttcaacaaca gcattattcc agaagacacc 4860 ttcttcccca gcccaggtaa gggcagcttt ggtgccttcg caggctgttt ccttgcttca 4920 ggaatggcca ggttctgccc agagctctgg tcaatgatgt ctaaaactcc tctgattggt 4980 ggtctcggcc ttatccattg ccaccaaaac cctcttttta ctaagaaaca gtgagccttg 5040 ttctggcagt cctagggaat tgccttaggc cgcaggaacc cctagtgatg gagttggcca 5100 ctccctctct gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc 5160 cgggcggcct cagtgagcga gcgagcgcgc agctgcctgc agg 5203 <210> 21 <211> 5217 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> TRAC HA TRAC 1-synpA-MND-Kozak-ER-FKBP-IL2RG-P2A-ER-FRB-IL2RB-P2A-mCherry-WPRE 3-BGHpA-HA TRAC 1 <400> 21 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60 gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120 actccatcac taggggttcc tgcggcccgc ggcggccgcg ccaggcctgg ccgtgaacgt 180 tcactgaaat catggcctct tggccaagat tgatagcttg tgcctgtccc tgagtcccag 240 tccatcacga gcagctggtt tctaagatgc tatttcccgt ataaagcatg agaccgtgac 300 ttgccagccc cacagagccc cgcccttgtc catcactggc atctggactc cagcctgggt 360 tggggcaaag agggaaatga gatcatgtcc taaccctgat cctcttgtcc cacagatatc 420 cagaaccctg accctgccgt gtaccagctg agagactcta aatccagtga caagtctgtc 480 tgcctattca ccgattttga ttctcaaaca aatgtgtcac aaagtaagga ttctgatgtg 540 tatatcacat gttaattaaa tgaaataaaa gatctttatt ttcattagat ctgtgtgttg 600 gttttttgtg tgaacagaga aacaggagaa tatgggccaa acaggatatc tgtggtaagc 660 agttcctgcc ccggctcagg gccaagaaca gttggaacag cagaatatgg gccaaacagg 720 atatctgtgg taagcagttc ctgccccggc tcagggccaa gaacagatgg tccccagatg 780 cggtcccgcc ctcagcagtt tctagagaac catcagatgt ttccagggtg ccccaaggac 840 ctgaaatgac cctgtgcctt atttgaacta accaatcagt tcgcttctcg cttctgttcg 900 cgcgcttctg ctccccgagc tctatataag cagagctcgt ttagtgaacc gtcagatcgc 960 cgccaccatg ccacttggcc tgctctggct gggcttggca ttgctcggcg cgctccacgc 1020 ccaggctggc gttcaagttg aaaccattag tcccggagac ggtcgaacat ttcccaaacg 1080 gggccagacg tgcgtggtac actacaccgg aatgctggag gatggaaaaa aatttgacag 1140 cagccgggac agaaacaaac cattcaagtt catgcttggt aaacaagagg taatacgggg 1200 ttgggaagag ggtgtggccc agatgtcagt agggcaacgc gcgaagttga ccataagccc 1260 cgactatgcc tatggggcga caggccatcc cggtataatt cctccgcacg ctacactggt 1320 gtttgatgtt gagttgctga agctggagca aaatcttgtt attccgtggg ctcccgagaa 1380 cctcacattg cacaaattgt ccgaatcaca attggagctt aattggaaca atagattcct 1440 gaatcactgc cttgagcacc tcgtacaata ccggacagac tgggatcact cttggacgga 1500 gcagtccgtg gactaccgac ataaattctc actcccctca gtggatggcc agaaacgcta 1560 tacctttaga gtccggtccc gcttcaaccc gttgtgcggc agcgcacagc actggagtga 1620 atggagtcat ccgatacact ggggaagcaa tacgtcaaaa gagaacccgt tcctttttgc 1680 gctggaagca gtcgtgatca gcgttggatc tatggggctg atcatctccc ttctctgcgt 1740 ctatttctgg ctcgaaagaa ctatgccacg catccctacg ctgaaaaatc tggaggatct 1800 tgtgacggaa tatcatggaa atttttccgc ctggagtgga gtttccaaag gtctcgctga 1860 atctctgcag ccagactata gtgagcggct ctgcttggtc tctgagattc cacctaaggg 1920 gggggcgctc ggggaaggcc cgggcgcaag tccgtgtaat caacacagtc cgtactgggc 1980 tccaccatgc tataccctca agccggaaac tggatccggc gctacaaatt tttcactgct 2040 gaaacaggcg ggtgatgtgg aggagaaccc tggacccatg ccacttggcc tgctctggct 2100 gggcttggca ttgctcggcg cgctccacgc ccaggctgaa ctgatccgcg tggccatatt 2160 gtggcatgag atgtggcatg agggattgga ggaggcgagt aggctgtact ttggggaaag 2220 gaatgttaaa gggatgtttg aggtccttga acccctccac gctatgatgg aaagaggacc 2280 tcaaacgctt aaagagacgt cattcaatca agcctatgga cgggatctta tggaagctca 2340 agaatggtgt cgaaaataca tgaaaagcgg gaatgttaag gacctcacgc aagcctggga 2400 tctgtattac catgttttcc gacgcatttc taaacaagga aaagatacta tcccatggtt 2460 ggggcacttg ctcgttgggc tcagtggggc gtttggattc atcatcctcg tatatctgtt 2520 gattaattgt cggaacacag gtccctggct taaaaaagtt ttgaagtgta acaccccgga 2580 tccttctaaa ttttttagtc aacttagttc agaacacggg ggcgatgttc aaaagtggct 2640 gagttccccg tttcccagtt caagtttctc ccctgggggt ctcgcccccg agatatcacc 2700 tcttgaagtg ctcgagcggg acaaagttac acagcttctt ttgcaacagg ataaggttcc 2760 ggagccggcg tctctcagct ctaaccattc actcacttct tgtttcacca accaagggta 2820 ttttttcttc catctgcctg atgccttgga gattgaggct tgtcaggtgt actttaccta 2880 tgacccctat agtgaggaag accctgacga aggcgtagct ggcgccccca ctggctccag 2940 tccacagcct cttcagcctc tgtcagggga ggacgacgca tattgtacgt tcccctcacg 3000 ggacgacctt ctgctgtttt caccctcact gctcggcgga ccctccccgc caagcacggc 3060 acctgggggg agtggggcag gagaagaaag gatgcctcct agtttgcagg agcgggttcc 3120 tcgcgactgg gatccgcaac ccctcggacc acccacccct ggcgtacctg atctggtcga 3180 cttccaacca cctccggagc ttgtcctcag agaggccgga gaggaagtcc cagacgcggg 3240 gccaagagag ggtgtgtcat ttccctggtc ccgccctccg ggacagggtg agtttcgggc 3300 gctgaatgcg aggctccccc ttaataccga tgcgtacctg tcattgcagg aacttcaggg 3360 ccaggatcct acccacctgg tgggaagcgg agctactaac ttcagcctgc tgaagcaggc 3420 tggagacgtg gaggagaacc ctggacctat ggtgagcaag ggcgaggagg ataacatggc 3480 catcatcaag gagttcatgc gcttcaaggt gcacatggag ggctccgtga acggccacga 3540 gttcgagatc gagggcgagg gcgagggccg cccctacgag ggcacccaga ccgccaagct 3600 gaaggtgacc aagggtggcc ccctgccctt cgcctgggac atcctgtccc ctcagttcat 3660 gtacggctcc aaggcctacg tgaagcaccc cgccgacatc cccgactact tgaagctgtc 3720 cttccccgag ggcttcaagt gggagcgcgt gatgaacttc gaggacggcg gcgtggtgac 3780 cgtgacccag gactcctccc tgcaggacgg cgagttcatc tacaaggtga agctgcgcgg 3840 caccaacttc ccctccgacg gccccgtaat gcagaagaag accatgggct gggaggcctc 3900 ctccgagcgg atgtaccccg aggacggcgc cctgaagggc gagatcaagc agaggctgaa 3960 gctgaaggac ggcggccact acgacgctga ggtcaagacc acctacaagg ccaagaagcc 4020 cgtgcagctg cccggcgcct acaacgtcaa catcaagttg gacatcacct cccacaacga 4080 ggactacacc atcgtggaac agtacgaacg cgccgagggc cgccactcca ccggcggcat 4140 ggacgagctg tacaagtagg taagataatc aacctctgga ttacaaaatt tgtgaaagat 4200 tgactggtat tcttaactat gttgctcctt ttacgctatg tggatacgct gctttaatgc 4260 ctttgtatca tgctattgct tcccgtatgg ctttcatttt ctcctccttg tataaatcct 4320 ggttagttct tgccacggcg gaactcatcg ccgcctgcct tgcccgctgc tggacagggg 4380 ctcggctgtt gggcactgac aattccgtgg tgtgccttct agttgccagc catctgttgt 4440 ttgcccctcc cccgtgcctt ccttgaccct ggaaggtgcc actcccactg tcctttccta 4500 ataaaatgag gaaattgcat cgcattgtct gagtaggtgt cattctattc tggggggtgg 4560 ggtggggcag gacagcaagg gggaggattg ggaagacaat agcaggcatg ctggggatgc 4620 ggtgggctct acgccggcgt ggcggtctat ggacttcaag agcaacagtg ctgtggcctg 4680 gagcaacaaa tctgactttg catgtgcaaa cgccttcaac aacagcatta ttccagaaga 4740 caccttcttc cccagcccag gtaagggcag ctttggtgcc ttcgcaggct gtttccttgc 4800 ttcaggaatg gccaggttct gcccagagct ctggtcaatg atgtctaaaa ctcctctgat 4860 tggtggtctc ggccttatcc attgccacca aaaccctctt tttactaaga aacagtgagc 4920 cttgttctgg cagtccagag aatgacacgg gaaaaaagca gatgaagaga aggtggcagg 4980 agagggcacg tggcccagcc tcagtctctc caactgagtt cctgcctgcc tgcctttgct 5040 cagactgttt gccccttact gctccctagg gaattgcctt aggccgcagg aacccctagt 5100 gatggagttg gccactccct ctctgcgcgc tcgctcgctc actgaggccg ggcgaccaaa 5160 ggtcgcccga cgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagctgc ctgcagg 5217 <210> 22 <211> 5328 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> TRAC HA TRAC 2-synpA-MND-Kozak-ER-FKBP-IL2RG-P2A-ER-FRB-IL2RB-P2A-tLNGFR-WPRE3 -BGHpA-HA TRAC 2 <400> 22 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60 gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120 actccatcac taggggttcc tgcggcccgc ggcggcttgt gcctgtccct gagtcccagt 180 ccatcacgag cagctggttt ctaagatgct atttcccgta taaagcatga gaccgtgact 240 tgccagcccc acagagcccc gcccttgtcc atcactggca tctggactcc agcctgggtt 300 ggggcaaaga gggaaatgag atcatgtcct aaccctgatc ctcttgtccc acagatatcc 360 agaaccctga ccctgccgtg taccagctga gagactctaa atccagtgac aagtctgtct 420 gcctattcac cgattttgat tctcaaacaa atgtgtcaca aagtaaggat tctgatgtgt 480 atatcacaga caaaactgtg ctagacatga ggtctatgga cttcaagagc aacagtgctg 540 tttaattaaa tgaaataaaa gatctttatt ttcattagat ctgtgtgttg gttttttgtg 600 tgaacagaga aacaggagaa tatgggccaa acaggatatc tgtggtaagc agttcctgcc 660 ccggctcagg gccaagaaca gttggaacag cagaatatgg gccaaacagg atatctgtgg 720 taagcagttc ctgccccggc tcagggccaa gaacagatgg tccccagatg cggtcccgcc 780 ctcagcagtt tctagagaac catcagatgt ttccagggtg ccccaaggac ctgaaatgac 840 cctgtgcctt atttgaacta accaatcagt tcgcttctcg cttctgttcg cgcgcttctg 900 ctccccgagc tctatataag cagagctcgt ttagtgaacc gtcagatcgc cgccaccatg 960 ccacttggcc tgctctggct gggcttggca ttgctcggcg cgctccacgc ccaggctggc 1020 gttcaagttg aaaccattag tcccggagac ggtcgaacat ttcccaaacg gggccagacg 1080 tgcgtggtac actacaccgg aatgctggag gatggaaaaa aatttgacag cagccgggac 1140 agaaacaaac cattcaagtt catgcttggt aaacaagagg taatacgggg ttgggaagag 1200 ggtgtggccc agatgtcagt agggcaacgc gcgaagttga ccataagccc cgactatgcc 1260 tatggggcga caggccatcc cggtataatt cctccgcacg ctacactggt gtttgatgtt 1320 gagttgctga agctggagca aaatcttgtt attccgtggg ctcccgagaa cctcacattg 1380 cacaaattgt ccgaatcaca attggagctt aattggaaca atagattcct gaatcactgc 1440 cttgagcacc tcgtacaata ccggacagac tgggatcact cttggacgga gcagtccgtg 1500 gactaccgac ataaattctc actcccctca gtggatggcc agaaacgcta tacctttaga 1560 gtccggtccc gcttcaaccc gttgtgcggc agcgcacagc actggagtga atggagtcat 1620 ccgatacact ggggaagcaa tacgtcaaaa gagaacccgt tcctttttgc gctggaagca 1680 gtcgtgatca gcgttggatc tatggggctg atcatctccc ttctctgcgt ctatttctgg 1740 ctcgaaagaa ctatgccacg catccctacg ctgaaaaatc tggaggatct tgtgacggaa 1800 tatcatggaa atttttccgc ctggagtgga gtttccaaag gtctcgctga atctctgcag 1860 ccagactata gtgagcggct ctgcttggtc tctgagattc cacctaaggg gggggcgctc 1920 ggggaaggcc cgggcgcaag tccgtgtaat caacacagtc cgtactgggc tccaccatgc 1980 tataccctca agccggaaac tggatccggc gctacaaatt tttcactgct gaaacaggcg 2040 ggtgatgtgg aggagaaccc tggacccatg ccacttggcc tgctctggct gggcttggca 2100 ttgctcggcg cgctccacgc ccaggctgaa ctgatccgcg tggccatatt gtggcatgag 2160 atgtggcatg agggattgga ggaggcgagt aggctgtact ttggggaaag gaatgttaaa 2220 gggatgtttg aggtccttga acccctccac gctatgatgg aaagaggacc tcaaacgctt 2280 aaagagacgt cattcaatca agcctatgga cgggatctta tggaagctca agaatggtgt 2340 cgaaaataca tgaaaagcgg gaatgttaag gacctcacgc aagcctggga tctgtattac 2400 catgttttcc gacgcatttc taaacaagga aaagatacta tcccatggtt ggggcacttg 2460 ctcgttgggc tcagtggggc gtttggattc atcatcctcg tatatctgtt gattaattgt 2520 cggaacacag gtccctggct taaaaaagtt ttgaagtgta acaccccgga tccttctaaa 2580 ttttttagtc aacttagttc agaacacggg ggcgatgttc aaaagtggct gagttccccg 2640 tttcccagtt caagtttctc ccctgggggt ctcgcccccg agatatcacc tcttgaagtg 2700 ctcgagcggg acaaagttac acagcttctt ttgcaacagg ataaggttcc ggagccggcg 2760 tctctcagct ctaaccattc actcacttct tgtttcacca accaagggta ttttttcttc 2820 catctgcctg atgccttgga gattgaggct tgtcaggtgt actttaccta tgacccctat 2880 agtgaggaag accctgacga aggcgtagct ggcgccccca ctggctccag tccacagcct 2940 cttcagcctc tgtcagggga ggacgacgca tattgtacgt tcccctcacg ggacgacctt 3000 ctgctgtttt caccctcact gctcggcgga ccctccccgc caagcacggc acctgggggg 3060 agtggggcag gagaagaaag gatgcctcct agtttgcagg agcgggttcc tcgcgactgg 3120 gatccgcaac ccctcggacc acccacccct ggcgtacctg atctggtcga cttccaacca 3180 cctccggagc ttgtcctcag agaggccgga gaggaagtcc cagacgcggg gccaagagag 3240 ggtgtgtcat ttccctggtc ccgccctccg ggacagggtg agtttcgggc gctgaatgcg 3300 aggctccccc ttaataccga tgcgtacctg tcattgcagg aacttcaggg ccaggatcct 3360 acccacctgg tgggaagcgg agctactaac ttcagcctgc tgaagcaggc tggagacgtg 3420 gaggagaacc ctggacctat gggtgctggc gcaactggac gcgctatgga tggacctcgc 3480 ttgctgcttc ttctgcttct cggggtctct ttgggtggtg ctaaggaagc atgcccaacg 3540 ggactttata cgcatagcgg agagtgttgc aaagcttgta acctgggcga aggcgtcgcg 3600 caaccttgtg gtgcaaatca aaccgtctgc gagccatgtt tggactctgt tacgtttagt 3660 gacgtagtat ctgcgacaga gccatgcaag ccttgtacgg aatgtgtagg attgcagagc 3720 atgtctgccc cttgtgtaga agccgacgat gcagtttgca ggtgcgcgta tggctattac 3780 caagacgaaa caaccggacg atgtgaagct tgccgagttt gtgaagcggg ttccgggctt 3840 gtattctcct gtcaggataa gcagaacacc gtctgcgaag agtgccccga tggtacctac 3900 agcgatgaag cgaaccatgt agacccatgc ctgccttgca ccgtttgtga agacacggaa 3960 cgacagttgc gggaatgtac ccggtgggca gacgccgagt gcgaagagat tccaggccgc 4020 tggatcacgc gaagtacccc gccagaaggt tccgacagta ctgcaccaag cacccaagaa 4080 ccagaggcgc cccccgagca ggacctgatt gcctccaccg tggcgggtgt tgttactacg 4140 gttatgggct catcccagcc cgttgttacc cgaggaacta cagacaacct gattccggta 4200 tattgttcta tcttggcggc tgtagtagtt ggcttggtcg cgtacatcgc tttcaaaaga 4260 tgagtaagat aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa 4320 ctatgttgct ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat 4380 tgcttcccgt atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttag ttcttgccac 4440 ggcggaactc atcgccgcct gccttgcccg ctgctggaca ggggctcggc tgttgggcac 4500 tgacaattcc gtggtgtgcc ttctagttgc cagccatctg ttgtttgccc ctcccccgtg 4560 ccttccttga ccctggaagg tgccactccc actgtccttt cctaataaaa tgaggaaatt 4620 gcatcgcatt gtctgagtag gtgtcattct attctggggg gtggggtggg gcaggacagc 4680 aagggggagg attgggaaga caatagcagg catgctgggg atgcggtggg ctctacgccg 4740 gcgagcaaca aatctgactt tgcatgtgca aacgccttca acaacagcat tattccagaa 4800 gacaccttct tccccagccc aggtaagggc agctttggtg ccttcgcagg ctgtttcctt 4860 gcttcaggaa tggccaggtt ctgcccagag ctctggtcaa tgatgtctaa aactcctctg 4920 attggtggtc tcggccttat ccattgccac caaaaccctc tttttactaa gaaacagtga 4980 gccttgttct ggcagtccag agaatgacac gggaaaaaag cagatgaaga gaaggtggca 5040 ggagagggca cgtggcccag cctcagtctc tccaactgag ttcctgcctg cctgcctttg 5100 ctcagactgt ttgcccctta ctgctcttct aggcctcatt ctaagcccct tctccaagtt 5160 gcctcctagg gaattgcctt aggccgcagg aacccctagt gatggagttg gccactccct 5220 ctctgcgcgc tcgctcgctc actgaggccg ggcgaccaaa ggtcgcccga cgcccgggct 5280 ttgcccgggc ggcctcagtg agcgagcgag cgcgcagctg cctgcagg 5328 <210> 23 <211> 5328 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> TRAC HA TRAC 3-synpA-MND-Kozak-ER-FKBP-IL2RG-P2A-ER-FRB-IL2RB-P2A-tLNGFR-WPRE3 -BGHpA-HA TRAC 3 <400> 23 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60 gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120 actccatcac taggggttcc tgcggcccgc ggcggtgcct ttactctgcc agagttatat 180 tgctggggtt ttgaagaaga tcctattaaa taaaagaata agcagtatta ttaagtagcc 240 ctgcatttca ggtttccttg agtggcaggc caggcctggc cgtgaacgtt cactgaaatc 300 atggcctctt ggccaagatt gatagcttgt gcctgtccct gagtcccagt ccatcacgag 360 cagctggttt ctaagatgct atttcccgta taaagcatga gaccgtgact tgccagcccc 420 acagagcccc gcccttgtcc atcactggca tctggactcc agcctgggtt ggggcaaaga 480 gggaaatgag atcatgtcct aaccctgatc ctcttgtccc acagatatcc agaaccctga 540 cttaattaaa tgaaataaaa gatctttatt ttcattagat ctgtgtgttg gttttttgtg 600 tgaacagaga aacaggagaa tatgggccaa acaggatatc tgtggtaagc agttcctgcc 660 ccggctcagg gccaagaaca gttggaacag cagaatatgg gccaaacagg atatctgtgg 720 taagcagttc ctgccccggc tcagggccaa gaacagatgg tccccagatg cggtcccgcc 780 ctcagcagtt tctagagaac catcagatgt ttccagggtg ccccaaggac ctgaaatgac 840 cctgtgcctt atttgaacta accaatcagt tcgcttctcg cttctgttcg cgcgcttctg 900 ctccccgagc tctatataag cagagctcgt ttagtgaacc gtcagatcgc cgccaccatg 960 ccacttggcc tgctctggct gggcttggca ttgctcggcg cgctccacgc ccaggctggc 1020 gttcaagttg aaaccattag tcccggagac ggtcgaacat ttcccaaacg gggccagacg 1080 tgcgtggtac actacaccgg aatgctggag gatggaaaaa aatttgacag cagccgggac 1140 agaaacaaac cattcaagtt catgcttggt aaacaagagg taatacgggg ttgggaagag 1200 ggtgtggccc agatgtcagt agggcaacgc gcgaagttga ccataagccc cgactatgcc 1260 tatggggcga caggccatcc cggtataatt cctccgcacg ctacactggt gtttgatgtt 1320 gagttgctga agctggagca aaatcttgtt attccgtggg ctcccgagaa cctcacattg 1380 cacaaattgt ccgaatcaca attggagctt aattggaaca atagattcct gaatcactgc 1440 cttgagcacc tcgtacaata ccggacagac tgggatcact cttggacgga gcagtccgtg 1500 gactaccgac ataaattctc actcccctca gtggatggcc agaaacgcta tacctttaga 1560 gtccggtccc gcttcaaccc gttgtgcggc agcgcacagc actggagtga atggagtcat 1620 ccgatacact ggggaagcaa tacgtcaaaa gagaacccgt tcctttttgc gctggaagca 1680 gtcgtgatca gcgttggatc tatggggctg atcatctccc ttctctgcgt ctatttctgg 1740 ctcgaaagaa ctatgccacg catccctacg ctgaaaaatc tggaggatct tgtgacggaa 1800 tatcatggaa atttttccgc ctggagtgga gtttccaaag gtctcgctga atctctgcag 1860 ccagactata gtgagcggct ctgcttggtc tctgagattc cacctaaggg gggggcgctc 1920 ggggaaggcc cgggcgcaag tccgtgtaat caacacagtc cgtactgggc tccaccatgc 1980 tataccctca agccggaaac tggatccggc gctacaaatt tttcactgct gaaacaggcg 2040 ggtgatgtgg aggagaaccc tggacccatg ccacttggcc tgctctggct gggcttggca 2100 ttgctcggcg cgctccacgc ccaggctgaa ctgatccgcg tggccatatt gtggcatgag 2160 atgtggcatg agggattgga ggaggcgagt aggctgtact ttggggaaag gaatgttaaa 2220 gggatgtttg aggtccttga acccctccac gctatgatgg aaagaggacc tcaaacgctt 2280 aaagagacgt cattcaatca agcctatgga cgggatctta tggaagctca agaatggtgt 2340 cgaaaataca tgaaaagcgg gaatgttaag gacctcacgc aagcctggga tctgtattac 2400 catgttttcc gacgcatttc taaacaagga aaagatacta tcccatggtt ggggcacttg 2460 ctcgttgggc tcagtggggc gtttggattc atcatcctcg tatatctgtt gattaattgt 2520 cggaacacag gtccctggct taaaaaagtt ttgaagtgta acaccccgga tccttctaaa 2580 ttttttagtc aacttagttc agaacacggg ggcgatgttc aaaagtggct gagttccccg 2640 tttcccagtt caagtttctc ccctgggggt ctcgcccccg agatatcacc tcttgaagtg 2700 ctcgagcggg acaaagttac acagcttctt ttgcaacagg ataaggttcc ggagccggcg 2760 tctctcagct ctaaccattc actcacttct tgtttcacca accaagggta ttttttcttc 2820 catctgcctg atgccttgga gattgaggct tgtcaggtgt actttaccta tgacccctat 2880 agtgaggaag accctgacga aggcgtagct ggcgccccca ctggctccag tccacagcct 2940 cttcagcctc tgtcagggga ggacgacgca tattgtacgt tcccctcacg ggacgacctt 3000 ctgctgtttt caccctcact gctcggcgga ccctccccgc caagcacggc acctgggggg 3060 agtggggcag gagaagaaag gatgcctcct agtttgcagg agcgggttcc tcgcgactgg 3120 gatccgcaac ccctcggacc acccacccct ggcgtacctg atctggtcga cttccaacca 3180 cctccggagc ttgtcctcag agaggccgga gaggaagtcc cagacgcggg gccaagagag 3240 ggtgtgtcat ttccctggtc ccgccctccg ggacagggtg agtttcgggc gctgaatgcg 3300 aggctccccc ttaataccga tgcgtacctg tcattgcagg aacttcaggg ccaggatcct 3360 acccacctgg tgggaagcgg agctactaac ttcagcctgc tgaagcaggc tggagacgtg 3420 gaggagaacc ctggacctat gggtgctggc gcaactggac gcgctatgga tggacctcgc 3480 ttgctgcttc ttctgcttct cggggtctct ttgggtggtg ctaaggaagc atgcccaacg 3540 ggactttata cgcatagcgg agagtgttgc aaagcttgta acctgggcga aggcgtcgcg 3600 caaccttgtg gtgcaaatca aaccgtctgc gagccatgtt tggactctgt tacgtttagt 3660 gacgtagtat ctgcgacaga gccatgcaag ccttgtacgg aatgtgtagg attgcagagc 3720 atgtctgccc cttgtgtaga agccgacgat gcagtttgca ggtgcgcgta tggctattac 3780 caagacgaaa caaccggacg atgtgaagct tgccgagttt gtgaagcggg ttccgggctt 3840 gtattctcct gtcaggataa gcagaacacc gtctgcgaag agtgccccga tggtacctac 3900 agcgatgaag cgaaccatgt agacccatgc ctgccttgca ccgtttgtga agacacggaa 3960 cgacagttgc gggaatgtac ccggtgggca gacgccgagt gcgaagagat tccaggccgc 4020 tggatcacgc gaagtacccc gccagaaggt tccgacagta ctgcaccaag cacccaagaa 4080 ccagaggcgc cccccgagca ggacctgatt gcctccaccg tggcgggtgt tgttactacg 4140 gttatgggct catcccagcc cgttgttacc cgaggaacta cagacaacct gattccggta 4200 tattgttcta tcttggcggc tgtagtagtt ggcttggtcg cgtacatcgc tttcaaaaga 4260 tgagtaagat aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa 4320 ctatgttgct ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat 4380 tgcttcccgt atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttag ttcttgccac 4440 ggcggaactc atcgccgcct gccttgcccg ctgctggaca ggggctcggc tgttgggcac 4500 tgacaattcc gtggtgtgcc ttctagttgc cagccatctg ttgtttgccc ctcccccgtg 4560 ccttccttga ccctggaagg tgccactccc actgtccttt cctaataaaa tgaggaaatt 4620 gcatcgcatt gtctgagtag gtgtcattct attctggggg gtggggtggg gcaggacagc 4680 aagggggagg attgggaaga caatagcagg catgctgggg atgcggtggg ctctacgccg 4740 gcgtaccagc tgagagactc taaatccagt gacaagtctg tctgcctatt caccgatttt 4800 gattctcaaa caaatgtgtc acaaagtaag gattctgatg tgtatatcac agacaaaact 4860 gtgctagaca tgaggtctat ggacttcaag agcaacagtg ctgtggcctg gagcaacaaa 4920 tctgactttg catgtgcaaa cgccttcaac aacagcatta ttccagaaga caccttcttc 4980 cccagcccag gtaagggcag ctttggtgcc ttcgcaggct gtttccttgc ttcaggaatg 5040 gccaggttct gcccagagct ctggtcaatg atgtctaaaa ctcctctgat tggtggtctc 5100 ggccttatcc attgccacca aaaccctctt tttactaaga aacagtgagc cttgttctgg 5160 cagtcctagg gaattgcctt aggccgcagg aacccctagt gatggagttg gccactccct 5220 ctctgcgcgc tcgctcgctc actgaggccg ggcgaccaaa ggtcgcccga cgcccgggct 5280 ttgcccgggc ggcctcagtg agcgagcgag cgcgcagctg cctgcagg 5328 <210> 24 <211> 5342 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> TRAC HA TRAC 1-synpA-MND-Kozak-ER-FKBP-IL2RG-P2A-ER-FRB-IL2RB-P2A-tLNGFR-WPRE3 -BGHpA-HA TRAC 1 <400> 24 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60 gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120 actccatcac taggggttcc tgcggcccgc ggcggccgcg ccaggcctgg ccgtgaacgt 180 tcactgaaat catggcctct tggccaagat tgatagcttg tgcctgtccc tgagtcccag 240 tccatcacga gcagctggtt tctaagatgc tatttcccgt ataaagcatg agaccgtgac 300 ttgccagccc cacagagccc cgcccttgtc catcactggc atctggactc cagcctgggt 360 tggggcaaag agggaaatga gatcatgtcc taaccctgat cctcttgtcc cacagatatc 420 cagaaccctg accctgccgt gtaccagctg agagactcta aatccagtga caagtctgtc 480 tgcctattca ccgattttga ttctcaaaca aatgtgtcac aaagtaagga ttctgatgtg 540 tatatcacat gttaattaaa tgaaataaaa gatctttatt ttcattagat ctgtgtgttg 600 gttttttgtg tgaacagaga aacaggagaa tatgggccaa acaggatatc tgtggtaagc 660 agttcctgcc ccggctcagg gccaagaaca gttggaacag cagaatatgg gccaaacagg 720 atatctgtgg taagcagttc ctgccccggc tcagggccaa gaacagatgg tccccagatg 780 cggtcccgcc ctcagcagtt tctagagaac catcagatgt ttccagggtg ccccaaggac 840 ctgaaatgac cctgtgcctt atttgaacta accaatcagt tcgcttctcg cttctgttcg 900 cgcgcttctg ctccccgagc tctatataag cagagctcgt ttagtgaacc gtcagatcgc 960 cgccaccatg ccacttggcc tgctctggct gggcttggca ttgctcggcg cgctccacgc 1020 ccaggctggc gttcaagttg aaaccattag tcccggagac ggtcgaacat ttcccaaacg 1080 gggccagacg tgcgtggtac actacaccgg aatgctggag gatggaaaaa aatttgacag 1140 cagccgggac agaaacaaac cattcaagtt catgcttggt aaacaagagg taatacgggg 1200 ttgggaagag ggtgtggccc agatgtcagt agggcaacgc gcgaagttga ccataagccc 1260 cgactatgcc tatggggcga caggccatcc cggtataatt cctccgcacg ctacactggt 1320 gtttgatgtt gagttgctga agctggagca aaatcttgtt attccgtggg ctcccgagaa 1380 cctcacattg cacaaattgt ccgaatcaca attggagctt aattggaaca atagattcct 1440 gaatcactgc cttgagcacc tcgtacaata ccggacagac tgggatcact cttggacgga 1500 gcagtccgtg gactaccgac ataaattctc actcccctca gtggatggcc agaaacgcta 1560 tacctttaga gtccggtccc gcttcaaccc gttgtgcggc agcgcacagc actggagtga 1620 atggagtcat ccgatacact ggggaagcaa tacgtcaaaa gagaacccgt tcctttttgc 1680 gctggaagca gtcgtgatca gcgttggatc tatggggctg atcatctccc ttctctgcgt 1740 ctatttctgg ctcgaaagaa ctatgccacg catccctacg ctgaaaaatc tggaggatct 1800 tgtgacggaa tatcatggaa atttttccgc ctggagtgga gtttccaaag gtctcgctga 1860 atctctgcag ccagactata gtgagcggct ctgcttggtc tctgagattc cacctaaggg 1920 gggggcgctc ggggaaggcc cgggcgcaag tccgtgtaat caacacagtc cgtactgggc 1980 tccaccatgc tataccctca agccggaaac tggatccggc gctacaaatt tttcactgct 2040 gaaacaggcg ggtgatgtgg aggagaaccc tggacccatg ccacttggcc tgctctggct 2100 gggcttggca ttgctcggcg cgctccacgc ccaggctgaa ctgatccgcg tggccatatt 2160 gtggcatgag atgtggcatg agggattgga ggaggcgagt aggctgtact ttggggaaag 2220 gaatgttaaa gggatgtttg aggtccttga acccctccac gctatgatgg aaagaggacc 2280 tcaaacgctt aaagagacgt cattcaatca agcctatgga cgggatctta tggaagctca 2340 agaatggtgt cgaaaataca tgaaaagcgg gaatgttaag gacctcacgc aagcctggga 2400 tctgtattac catgttttcc gacgcatttc taaacaagga aaagatacta tcccatggtt 2460 ggggcacttg ctcgttgggc tcagtggggc gtttggattc atcatcctcg tatatctgtt 2520 gattaattgt cggaacacag gtccctggct taaaaaagtt ttgaagtgta acaccccgga 2580 tccttctaaa ttttttagtc aacttagttc agaacacggg ggcgatgttc aaaagtggct 2640 gagttccccg tttcccagtt caagtttctc ccctgggggt ctcgcccccg agatatcacc 2700 tcttgaagtg ctcgagcggg acaaagttac acagcttctt ttgcaacagg ataaggttcc 2760 ggagccggcg tctctcagct ctaaccattc actcacttct tgtttcacca accaagggta 2820 ttttttcttc catctgcctg atgccttgga gattgaggct tgtcaggtgt actttaccta 2880 tgacccctat agtgaggaag accctgacga aggcgtagct ggcgccccca ctggctccag 2940 tccacagcct cttcagcctc tgtcagggga ggacgacgca tattgtacgt tcccctcacg 3000 ggacgacctt ctgctgtttt caccctcact gctcggcgga ccctccccgc caagcacggc 3060 acctgggggg agtggggcag gagaagaaag gatgcctcct agtttgcagg agcgggttcc 3120 tcgcgactgg gatccgcaac ccctcggacc acccacccct ggcgtacctg atctggtcga 3180 cttccaacca cctccggagc ttgtcctcag agaggccgga gaggaagtcc cagacgcggg 3240 gccaagagag ggtgtgtcat ttccctggtc ccgccctccg ggacagggtg agtttcgggc 3300 gctgaatgcg aggctccccc ttaataccga tgcgtacctg tcattgcagg aacttcaggg 3360 ccaggatcct acccacctgg tgggaagcgg agctactaac ttcagcctgc tgaagcaggc 3420 tggagacgtg gaggagaacc ctggacctat gggtgctggc gcaactggac gcgctatgga 3480 tggacctcgc ttgctgcttc ttctgcttct cggggtctct ttgggtggtg ctaaggaagc 3540 atgcccaacg ggactttata cgcatagcgg agagtgttgc aaagcttgta acctgggcga 3600 aggcgtcgcg caaccttgtg gtgcaaatca aaccgtctgc gagccatgtt tggactctgt 3660 tacgtttagt gacgtagtat ctgcgacaga gccatgcaag ccttgtacgg aatgtgtagg 3720 attgcagagc atgtctgccc cttgtgtaga agccgacgat gcagtttgca ggtgcgcgta 3780 tggctattac caagacgaaa caaccggacg atgtgaagct tgccgagttt gtgaagcggg 3840 ttccgggctt gtattctcct gtcaggataa gcagaacacc gtctgcgaag agtgccccga 3900 tggtacctac agcgatgaag cgaaccatgt agacccatgc ctgccttgca ccgtttgtga 3960 agacacggaa cgacagttgc gggaatgtac ccggtgggca gacgccgagt gcgaagagat 4020 tccaggccgc tggatcacgc gaagtacccc gccagaaggt tccgacagta ctgcaccaag 4080 cacccaagaa ccagaggcgc cccccgagca ggacctgatt gcctccaccg tggcgggtgt 4140 tgttactacg gttatgggct catcccagcc cgttgttacc cgaggaacta cagacaacct 4200 gattccggta tattgttcta tcttggcggc tgtagtagtt ggcttggtcg cgtacatcgc 4260 tttcaaaaga tgagtaagat aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg 4320 gtattcttaa ctatgttgct ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt 4380 atcatgctat tgcttcccgt atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttag 4440 ttcttgccac ggcggaactc atcgccgcct gccttgcccg ctgctggaca ggggctcggc 4500 tgttgggcac tgacaattcc gtggtgtgcc ttctagttgc cagccatctg ttgtttgccc 4560 ctcccccgtg ccttccttga ccctggaagg tgccactccc actgtccttt cctaataaaa 4620 tgaggaaatt gcatcgcatt gtctgagtag gtgtcattct attctggggg gtggggtggg 4680 gcaggacagc aagggggagg attgggaaga caatagcagg catgctgggg atgcggtggg 4740 ctctacgccg gcgtggcggt ctatggactt caagagcaac agtgctgtgg cctggagcaa 4800 caaatctgac tttgcatgtg caaacgcctt caacaacagc attattccag aagacacctt 4860 cttccccagc ccaggtaagg gcagctttgg tgccttcgca ggctgtttcc ttgcttcagg 4920 aatggccagg ttctgcccag agctctggtc aatgatgtct aaaactcctc tgattggtgg 4980 tctcggcctt atccattgcc accaaaaccc tctttttact aagaaacagt gagccttgtt 5040 ctggcagtcc agagaatgac acgggaaaaa agcagatgaa gagaaggtgg caggagaggg 5100 cacgtggccc agcctcagtc tctccaactg agttcctgcc tgcctgcctt tgctcagact 5160 gtttgcccct tactgctccc tagggaattg ccttaggccg caggaacccc tagtgatgga 5220 gttggccact ccctctctgc gcgctcgctc gctcactgag gccgggcgac caaaggtcgc 5280 ccgacgcccg ggctttgccc gggcggcctc agtgagcgag cgagcgcgca gctgcctgca 5340 gg 5342 <210> 25 <211> 3862 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> IL2RG HA-p2A-tLNGFR-P2A-ER-FRB-IL2RB-P2A-ER-FKBP-fusion-IL2RG HA <400> 25 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60 gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120 actccatcac taggggttcc tgcggcccgc ggcaacctct agaaatcaag gtttttctgt 180 gtagggttgg gttagcgtgt tgttagagta ggggagtgga ttgagaagga ggctgagggg 240 tactcaaggg ggctatagaa tgtataggat ttccctgaag cattcctaga gagcctgcaa 300 ggtgaagatg gctttggaac cagctggatc taggctgtgc cacatactac ctctttggcc 360 ttggccacat ccctaaactc ttggattctg tttcctaaga tgtaagatgg aggtaattgt 420 tcctgcctca caggagctgt tgtgaggatt aaacagagag tatgtcttta gcgcggtgcc 480 tggcaccagt gcctggcatg tagtaggggc acaacaaata taaggtccac tttgcttttc 540 ttttttctat agggaagcgg agctactaac ttcagcctgc tgaagcaggc tggagacgtg 600 gaggagaacc ctggacctat gggtgctggc gcaactggac gcgctatgga tggacctcgc 660 ttgctgcttc ttctgcttct cggggtctct ttgggtggtg ctaaggaagc atgcccaacg 720 ggactttata cgcatagcgg agagtgttgc aaagcttgta acctgggcga aggcgtcgcg 780 caaccttgtg gtgcaaatca aaccgtctgc gagccatgtt tggactctgt tacgtttagt 840 gacgtagtat ctgcgacaga gccatgcaag ccttgtacgg aatgtgtagg attgcagagc 900 atgtctgccc cttgtgtaga agccgacgat gcagtttgca ggtgcgcgta tggctattac 960 caagacgaaa caaccggacg atgtgaagct tgccgagttt gtgaagcggg ttccgggctt 1020 gtattctcct gtcaggataa gcagaacacc gtctgcgaag agtgccccga tggtacctac 1080 agcgatgaag cgaaccatgt agacccatgc ctgccttgca ccgtttgtga agacacggaa 1140 cgacagttgc gggaatgtac ccggtgggca gacgccgagt gcgaagagat tccaggccgc 1200 tggatcacgc gaagtacccc gccagaaggt tccgacagta ctgcaccaag cacccaagaa 1260 ccagaggcgc cccccgagca ggacctgatt gcctccaccg tggcgggtgt tgttactacg 1320 gttatgggct catcccagcc cgttgttacc cgaggaacta cagacaacct gattccggta 1380 tattgttcta tcttggcggc tgtagtagtt ggcttggtcg cgtacatcgc tttcaaaaga 1440 ggatccggcg ctacaaattt ttcactgctg aaacaggcgg gtgatgtgga ggagaaccct 1500 ggacccatgc cacttggcct gctctggctg ggcttggcat tgctcggcgc gctccacgcc 1560 caggctgaac tgatccgcgt ggccatattg tggcatgaga tgtggcatga gggattggag 1620 gaggcgagta ggctgtactt tggggaaagg aatgttaaag ggatgtttga ggtccttgaa 1680 cccctccacg ctatgatgga aagaggacct caaacgctta aagagacgtc attcaatcaa 1740 gcctatggac gggatcttat ggaagctcaa gaatggtgtc gaaaatacat gaaaagcggg 1800 aatgttaagg acctcacgca agcctgggat ctgtattacc atgttttccg acgcatttct 1860 aaacaaggaa aagatactat cccatggttg gggcacttgc tcgttgggct cagtggggcg 1920 tttggattca tcatcctcgt atatctgttg attaattgtc ggaacacagg tccctggctt 1980 aaaaaagttt tgaagtgtaa caccccggat ccttctaaat tttttagtca acttagttca 2040 gaacacgggg gcgatgttca aaagtggctg agttccccgt ttcccagttc aagtttctcc 2100 cctgggggtc tcgcccccga gatatcacct cttgaagtgc tcgagcggga caaagttaca 2160 cagcttcttt tgcaacagga taaggttccg gagccggcgt ctctcagctc taaccattca 2220 ctcacttctt gtttcaccaa ccaagggtat tttttcttcc atctgcctga tgccttggag 2280 attgaggctt gtcaggtgta ctttacctat gacccctata gtgaggaaga ccctgacgaa 2340 ggcgtagctg gcgcccccac tggctccagt ccacagcctc ttcagcctct gtcaggggag 2400 gacgacgcat attgtacgtt cccctcacgg gacgaccttc tgctgttttc accctcactg 2460 ctcggcggac cctccccgcc aagcacggca cctgggggga gtggggcagg agaagaaagg 2520 atgcctccta gtttgcagga gcgggttcct cgcgactggg atccgcaacc cctcggacca 2580 cccacccctg gcgtacctga tctggtcgac ttccaaccac ctccggagct tgtcctcaga 2640 gaggccggag aggaagtccc agacgcgggg ccaagagagg gtgtgtcatt tccctggtcc 2700 cgccctccgg gacagggtga gtttcgggcg ctgaatgcga ggctccccct taataccgat 2760 gcgtacctgt cattgcagga acttcagggc caggatccta cccacctggt gggatccggc 2820 gctacaaatt tttcactgct gaaacaggcg ggtgatgtgg aggagaaccc tggacccatg 2880 cctctgggcc tgctgtggct gggcctggcc ctgctgggcg ccctgcacgc ccaggccggc 2940 gtgcaggtgg agacaatctc cccaggcgac ggacgcacat tccctaagcg gggccagacc 3000 tgcgtggtgc actatacagg catgctggag gatggcaaga agtttgacag ctcccgggat 3060 agaaacaagc cattcaagtt tatgctgggc aagcaggaag tgatcagagg ctgggaggag 3120 ggcgtggccc agatgtctgt gggccagagg gccaagctga ccatcagccc agactacgcc 3180 tatggagcaa caggccaccc aggaatcatc ccacctcacg ccaccctggt gttcgatgtg 3240 gagctgctga agctgggcga gggcagcaac accagcaaag agaatccttt cctgtttgca 3300 ttggaagccg tggttatctc tgttggctcc atgggattga ttatcagcct tctctgtgtg 3360 tatttctggc tggaacggtg agatttggag aagcccagaa aaatgagggg aacggtagct 3420 gacaatagca gaggagggtt ttgcagggtc tttaggagta aaggatgaga cagtaagtaa 3480 tgagagatta cccaagaggg tttggtgatg gaaggaagcc acaggcacag agaacacaga 3540 atcactttat ttcatatggg acaactggga gaagggtgat aaaaaagctt taacctatgt 3600 gctcctgctc cctctttctc ccctgtcagg acgatgcccc gaattcccac cctgaagaac 3660 ctagaggatc ttgttactga ataccacggg aacttttcgg tgagaacgct gtcatcaatt 3720 gccttaggcc gcaggaaccc ctagtgatgg agttggccac tccctctctg cgcgctcgct 3780 cgctcactga ggccgggcga ccaaaggtcg cccgacgccc gggcggcctc agtgagcgag 3840 cgagcgcgca gctgcctgca gg 3862 <210> 26 <211> 4452 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> IL2RG HA-p2A-tLNGFR-T2A-CNb30-P2A-ER-FRB-IL2RB-P2A-ER-FKBP-fusion-IL2RG HA <400> 26 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60 gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120 actccatcac taggggttcc tgcggcccgc ggcaacctct agaaatcaag gtttttctgt 180 gtagggttgg gttagcgtgt tgttagagta ggggagtgga ttgagaagga ggctgagggg 240 tactcaaggg ggctatagaa tgtataggat ttccctgaag cattcctaga gagcctgcaa 300 ggtgaagatg gctttggaac cagctggatc taggctgtgc cacatactac ctctttggcc 360 ttggccacat ccctaaactc ttggattctg tttcctaaga tgtaagatgg aggtaattgt 420 tcctgcctca caggagctgt tgtgaggatt aaacagagag tatgtcttta gcgcggtgcc 480 tggcaccagt gcctggcatg tagtaggggc acaacaaata taaggtccac tttgcttttc 540 ttttttctat agggaagcgg agctactaac ttcagcctgc tgaagcaggc tggagacgtg 600 gaggagaacc ctggacctat gggtgctggc gcaactggac gcgctatgga tggacctcgc 660 ttgctgcttc ttctgcttct cggggtctct ttgggtggtg ctaaggaagc atgcccaacg 720 ggactttata cgcatagcgg agagtgttgc aaagcttgta acctgggcga aggcgtcgcg 780 caaccttgtg gtgcaaatca aaccgtctgc gagccatgtt tggactctgt tacgtttagt 840 gacgtagtat ctgcgacaga gccatgcaag ccttgtacgg aatgtgtagg attgcagagc 900 atgtctgccc cttgtgtaga agccgacgat gcagtttgca ggtgcgcgta tggctattac 960 caagacgaaa caaccggacg atgtgaagct tgccgagttt gtgaagcggg ttccgggctt 1020 gtattctcct gtcaggataa gcagaacacc gtctgcgaag agtgccccga tggtacctac 1080 agcgatgaag cgaaccatgt agacccatgc ctgccttgca ccgtttgtga agacacggaa 1140 cgacagttgc gggaatgtac ccggtgggca gacgccgagt gcgaagagat tccaggccgc 1200 tggatcacgc gaagtacccc gccagaaggt tccgacagta ctgcaccaag cacccaagaa 1260 ccagaggcgc cccccgagca ggacctgatt gcctccaccg tggcgggtgt tgttactacg 1320 gttatgggct catcccagcc cgttgttacc cgaggaacta cagacaacct gattccggta 1380 tattgttcta tcttggcggc tgtagtagtt ggcttggtcg cgtacatcgc tttcaaaaga 1440 ggttccgggg agggccgagg gtcattgctg acgtgtggag acgtggagga gaatcctggc 1500 cccatgggca acgaggccag ctaccctctg gagatgtgct cccacttcga cgccgacgag 1560 atcaagcggc tgggcaagcg cttcaagaag ctggacctgg acaacagcgg cagcctgagc 1620 gtggaggagt ttatgtctct gcccgagctg cagcagaacc ccctggtgca gcgcgtgatc 1680 gacatcttcg acaccgacgg caacggcgag gtggacttca aggagttcat cgagggcgtg 1740 agccagttca gcgtgaaggg cgacaaggag cagaagctgc ggttcgcctt ccggatctac 1800 gatatggata aagatggcta tatttctaat ggcgagctgt tccaggtgct gaagatgatg 1860 gtgggcaaca ataccaagct ggccgatacc cagctgcagc agatcgtgga caagaccatc 1920 atcaacgccg acaaggacgg cgacggcaga atcagcttcg aggagttctg tgccgtggtg 1980 ggaggcctgg atattcacaa aaaaatggtg gtggacgtgg gatccggcgc tacaaatttt 2040 tcactgctga aacaggcggg tgatgtggag gagaaccctg gacccatgcc acttggcctg 2100 ctctggctgg gcttggcatt gctcggcgcg ctccacgccc aggctgaact gatccgcgtg 2160 gccatattgt ggcatgagat gtggcatgag ggattggagg aggcgagtag gctgtacttt 2220 ggggaaagga atgttaaagg gatgtttgag gtccttgaac ccctccacgc tatgatggaa 2280 agaggacctc aaacgcttaa agagacgtca ttcaatcaag cctatggacg ggatcttatg 2340 gaagctcaag aatggtgtcg aaaatacatg aaaagcggga atgttaagga cctcacgcaa 2400 gcctgggatc tgtattacca tgttttccga cgcatttcta aacaaggaaa agatactatc 2460 ccatggttgg ggcacttgct cgttgggctc agtggggcgt ttggattcat catcctcgta 2520 tatctgttga ttaattgtcg gaacacaggt ccctggctta aaaaagtttt gaagtgtaac 2580 accccggatc cttctaaatt ttttagtcaa cttagttcag aacacggggg cgatgttcaa 2640 aagtggctga gttccccgtt tcccagttca agtttctccc ctgggggtct cgcccccgag 2700 atatcacctc ttgaagtgct cgagcgggac aaagttacac agcttctttt gcaacaggat 2760 aaggttccgg agccggcgtc tctcagctct aaccattcac tcacttcttg tttcaccaac 2820 caagggtatt ttttcttcca tctgcctgat gccttggaga ttgaggcttg tcaggtgtac 2880 tttacctatg acccctatag tgaggaagac cctgacgaag gcgtagctgg cgcccccact 2940 ggctccagtc cacagcctct tcagcctctg tcaggggagg acgacgcata ttgtacgttc 3000 ccctcacggg acgaccttct gctgttttca ccctcactgc tcggcggacc ctccccgcca 3060 agcacggcac ctggggggag tggggcagga gaagaaagga tgcctcctag tttgcaggag 3120 cgggttcctc gcgactggga tccgcaaccc ctcggaccac ccacccctgg cgtacctgat 3180 ctggtcgact tccaaccacc tccggagctt gtcctcagag aggccggaga ggaagtccca 3240 gacgcggggc caagagaggg tgtgtcattt ccctggtccc gccctccggg acagggtgag 3300 tttcgggcgc tgaatgcgag gctccccctt aataccgatg cgtacctgtc attgcaggaa 3360 cttcagggcc aggatcctac ccacctggtg ggatccggcg ctacaaattt ttcactgctg 3420 aaacaggcgg gtgatgtgga ggagaaccct ggacccatgc ctctgggcct gctgtggctg 3480 ggcctggccc tgctgggcgc cctgcacgcc caggccggcg tgcaggtgga gacaatctcc 3540 ccaggcgacg gacgcacatt ccctaagcgg ggccagacct gcgtggtgca ctatacaggc 3600 atgctggagg atggcaagaa gtttgacagc tcccgggata gaaacaagcc attcaagttt 3660 atgctgggca agcaggaagt gatcagaggc tgggaggagg gcgtggccca gatgtctgtg 3720 ggccagaggg ccaagctgac catcagccca gactacgcct atggagcaac aggccaccca 3780 ggaatcatcc cacctcacgc caccctggtg ttcgatgtgg agctgctgaa gctgggcgag 3840 ggcagcaaca ccagcaaaga gaatcctttc ctgtttgcat tggaagccgt ggttatctct 3900 gttggctcca tgggattgat tatcagcctt ctctgtgtgt atttctggct ggaacggtga 3960 gatttggaga agcccagaaa aatgagggga acggtagctg acaatagcag aggagggttt 4020 tgcagggtct ttaggagtaa aggatgagac agtaagtaat gagagattac ccaagagggt 4080 ttggtgatgg aaggaagcca caggcacaga gaacacagaa tcactttatt tcatatggga 4140 caactgggag aagggtgata aaaaagcttt aacctatgtg ctcctgctcc ctctttctcc 4200 cctgtcagga cgatgccccg aattcccacc ctgaagaacc tagaggatct tgttactgaa 4260 taccacggga acttttcggt gagaacgctg tcatcaattg ccttaggccg caggaacccc 4320 tagtgatgga gttggccact ccctctctgc gcgctcgctc gctcactgag gccgggcgac 4380 caaaggtcgc ccgacgcccg ggctttgccc gggcggcctc agtgagcgag cgagcgcgca 4440 gctgcctgca gg 4452 <210> 27 <211> 4215 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> IL2RG HA-synpA-MND-Kozak-tLNGFR-P2A-ER-FRB-IL2RB-P2A-ER-FKBP-fusion-IL2 RG HA <400> 27 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60 gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120 actccatcac taggggttcc tgcggcccgc ggcaacctct agaaatcaag gtttttctgt 180 gtagggttgg gttagcgtgt tgttagagta ggggagtgga ttgagaagga ggctgagggg 240 tactcaaggg ggctatagaa tgtataggat ttccctgaag cattcctaga gagcctgcaa 300 ggtgaagatg gctttggaac cagctggatc taggctgtgc cacatactac ctctttggcc 360 ttggccacat ccctaaactc ttggattctg tttcctaaga tgtaagatgg aggtaattgt 420 tcctgcctca caggagctgt tgtgaggatt aaacagagag tatgtcttta gcgcggtgcc 480 tggcaccagt gcctggcatg tagtaggggc acaacaaata taaggtccac tttgcttttc 540 ttttttctat agatgaaata aaagatcttt attttcatta gatctgtgtg ttggtttttt 600 gtgtgaacag agaaacagga gaatatgggc caaacaggat atctgtggta agcagttcct 660 gccccggctc agggccaaga acagttggaa cagcagaata tgggccaaac aggatatctg 720 tggtaagcag ttcctgcccc ggctcagggc caagaacaga tggtccccag atgcggtccc 780 gccctcagca gtttctagag aaccatcaga tgtttccagg gtgccccaag gacctgaaat 840 gaccctgtgc cttatttgaa ctaaccaatc agttcgcttc tcgcttctgt tcgcgcgctt 900 ctgctccccg agctctatat aagcagagct cgtttagtga accgtcagat cgccgccacc 960 atgggtgctg gcgcaactgg acgcgctatg gatggacctc gcttgctgct tcttctgctt 1020 ctcggggtct ctttgggtgg tgctaaggaa gcatgcccaa cgggacttta tacgcatagc 1080 ggagagtgtt gcaaagcttg taacctgggc gaaggcgtcg cgcaaccttg tggtgcaaat 1140 caaaccgtct gcgagccatg tttggactct gttacgttta gtgacgtagt atctgcgaca 1200 gagccatgca agccttgtac ggaatgtgta ggattgcaga gcatgtctgc cccttgtgta 1260 gaagccgacg atgcagtttg caggtgcgcg tatggctatt accaagacga aacaaccgga 1320 cgatgtgaag cttgccgagt ttgtgaagcg ggttccgggc ttgtattctc ctgtcaggat 1380 aagcagaaca ccgtctgcga agagtgcccc gatggtacct acagcgatga agcgaaccat 1440 gtagacccat gcctgccttg caccgtttgt gaagacacgg aacgacagtt gcgggaatgt 1500 acccggtggg cagacgccga gtgcgaagag attccaggcc gctggatcac gcgaagtacc 1560 ccgccagaag gttccgacag tactgcacca agcacccaag aaccagaggc gccccccgag 1620 caggacctga ttgcctccac cgtggcgggt gttgttacta cggttatggg ctcatcccag 1680 cccgttgtta cccgaggaac tacagacaac ctgattccgg tatattgttc tatcttggcg 1740 gctgtagtag ttggcttggt cgcgtacatc gctttcaaaa gaggatccgg cgctacaaat 1800 ttttcactgc tgaaacaggc gggtgatgtg gaggagaacc ctggacccat gccacttggc 1860 ctgctctggc tgggcttggc attgctcggc gcgctccacg cccaggctga actgatccgc 1920 gtggccatat tgtggcatga gatgtggcat gagggattgg aggaggcgag taggctgtac 1980 tttggggaaa ggaatgttaa agggatgttt gaggtccttg aacccctcca cgctatgatg 2040 gaaagaggac ctcaaacgct taaagagacg tcattcaatc aagcctatgg acgggatctt 2100 atggaagctc aagaatggtg tcgaaaatac atgaaaagcg ggaatgttaa ggacctcacg 2160 caagcctggg atctgtatta ccatgttttc cgacgcattt ctaaacaagg aaaagatact 2220 atcccatggt tggggcactt gctcgttggg ctcagtgggg cgtttggatt catcatcctc 2280 gtatatctgt tgattaattg tcggaacaca ggtccctggc ttaaaaaagt tttgaagtgt 2340 aacaccccgg atccttctaa attttttagt caacttagtt cagaacacgg gggcgatgtt 2400 caaaagtggc tgagttcccc gtttcccagt tcaagtttct cccctggggg tctcgccccc 2460 gagatatcac ctcttgaagt gctcgagcgg gacaaagtta cacagcttct tttgcaacag 2520 gataaggttc cggagccggc gtctctcagc tctaaccatt cactcacttc ttgtttcacc 2580 aaccaagggt attttttctt ccatctgcct gatgccttgg agattgaggc ttgtcaggtg 2640 tactttacct atgaccccta tagtgaggaa gaccctgacg aaggcgtagc tggcgccccc 2700 actggctcca gtccacagcc tcttcagcct ctgtcagggg aggacgacgc atattgtacg 2760 ttcccctcac gggacgacct tctgctgttt tcaccctcac tgctcggcgg accctccccg 2820 ccaagcacgg cacctggggg gagtggggca ggagaagaaa ggatgcctcc tagtttgcag 2880 gagcgggttc ctcgcgactg ggatccgcaa cccctcggac cacccacccc tggcgtacct 2940 gatctggtcg acttccaacc acctccggag cttgtcctca gagaggccgg agaggaagtc 3000 ccagacgcgg ggccaagaga gggtgtgtca tttccctggt cccgccctcc gggacagggt 3060 gagtttcggg cgctgaatgc gaggctcccc cttaataccg atgcgtacct gtcattgcag 3120 gaacttcagg gccaggatcc tacccacctg gtgggatccg gcgctacaaa tttttcactg 3180 ctgaaacagg cgggtgatgt ggaggagaac cctggaccca tgcctctggg cctgctgtgg 3240 ctgggcctgg ccctgctggg cgccctgcac gcccaggccg gcgtgcaggt ggagacaatc 3300 tccccaggcg acggacgcac attccctaag cggggccaga cctgcgtggt gcactataca 3360 ggcatgctgg aggatggcaa gaagtttgac agctcccggg atagaaacaa gccattcaag 3420 tttatgctgg gcaagcagga agtgatcaga ggctgggagg agggcgtggc ccagatgtct 3480 gtgggccaga gggccaagct gaccatcagc ccagactacg cctatggagc aacaggccac 3540 ccaggaatca tcccacctca cgccaccctg gtgttcgatg tggagctgct gaagctgggc 3600 gagggcagca acaccagcaa agagaatcct ttcctgtttg cattggaagc cgtggttatc 3660 tctgttggct ccatgggatt gattatcagc cttctctgtg tgtatttctg gctggaacgg 3720 tgagatttgg agaagcccag aaaaatgagg ggaacggtag ctgacaatag cagaggaggg 3780 ttttgcaggg tctttaggag taaaggatga gacagtaagt aatgagagat tacccaagag 3840 ggtttggtga tggaaggaag ccacaggcac agagaacaca gaatcacttt atttcatatg 3900 ggacaactgg gagaagggtg ataaaaaagc tttaacctat gtgctcctgc tccctctttc 3960 tcccctgtca ggacgatgcc ccgaattccc accctgaaga acctagagga tcttgttact 4020 gaataccacg ggaacttttc ggtgagaacg ctgtcatcaa ttgccttagg ccgcaggaac 4080 ccctagtgat ggagttggcc actccctctc tgcgcgctcg ctcgctcact gaggccgggc 4140 gaccaaaggt cgcccgacgc ccgggctttg cccgggcggc ctcagtgagc gagcgagcgc 4200 gcagctgcct gcagg 4215 <210> 28 <211> 4794 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> IL2RG HA-synpA-MND-Kozak-tLNGFR-T2A-CNb30-P2A-ER-FRB-IL2RB-P2A-ER-FKBP- fusion-IL2RG HA <400> 28 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60 gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120 actccatcac taggggttcc tgcggcccgc ggcaacctct agaaatcaag gtttttctgt 180 gtagggttgg gttagcgtgt tgttagagta ggggagtgga ttgagaagga ggctgagggg 240 tactcaaggg ggctatagaa tgtataggat ttccctgaag cattcctaga gagcctgcaa 300 ggtgaagatg gctttggaac cagctggatc taggctgtgc cacatactac ctctttggcc 360 ttggccacat ccctaaactc ttggattctg tttcctaaga tgtaagatgg aggtaattgt 420 tcctgcctca caggagctgt tgtgaggatt aaacagagag tatgtcttta gcgcggtgcc 480 tggcaccagt gcctggcatg tagtaggggc acaacaaata taaggtccac tttgcttttc 540 ttttttctat agatgaaata aaagatcttt attttcatta gatctgtgtg ttggtttttt 600 gtgtgaacag agaaacagga gaatatgggc caaacaggat atctgtggta agcagttcct 660 gccccggctc agggccaaga acagttggaa cagcagaata tgggccaaac aggatatctg 720 tggtaagcag ttcctgcccc ggctcagggc caagaacaga tggtccccag atgcggtccc 780 gccctcagca gtttctagag aaccatcaga tgtttccagg gtgccccaag gacctgaaat 840 gaccctgtgc cttatttgaa ctaaccaatc agttcgcttc tcgcttctgt tcgcgcgctt 900 ctgctccccg agctctatat aagcagagct cgtttagtga accgtcagat cgccgccacc 960 atgggtgctg gcgcaactgg acgcgctatg gatggacctc gcttgctgct tcttctgctt 1020 ctcggggtct ctttgggtgg tgctaaggaa gcatgcccaa cgggacttta tacgcatagc 1080 ggagagtgtt gcaaagcttg taacctgggc gaaggcgtcg cgcaaccttg tggtgcaaat 1140 caaaccgtct gcgagccatg tttggactct gttacgttta gtgacgtagt atctgcgaca 1200 gagccatgca agccttgtac ggaatgtgta ggattgcaga gcatgtctgc cccttgtgta 1260 gaagccgacg atgcagtttg caggtgcgcg tatggctatt accaagacga aacaaccgga 1320 cgatgtgaag cttgccgagt ttgtgaagcg ggttccgggc ttgtattctc ctgtcaggat 1380 aagcagaaca ccgtctgcga agagtgcccc gatggtacct acagcgatga agcgaaccat 1440 gtagacccat gcctgccttg caccgtttgt gaagacacgg aacgacagtt gcgggaatgt 1500 acccggtggg cagacgccga gtgcgaagag attccaggcc gctggatcac gcgaagtacc 1560 ccgccagaag gttccgacag tactgcacca agcacccaag aaccagaggc gccccccgag 1620 caggacctga ttgcctccac cgtggcgggt gttgttacta cggttatggg ctcatcccag 1680 cccgttgtta cccgaggaac tacagacaac ctgattccgg tatattgttc tatcttggcg 1740 gctgtagtag ttggcttggt cgcgtacatc gctttcaaaa gaggttccgg ggagggccga 1800 gggtcattgc tgacgtgtgg agacgtggag gagaatcctg gccccatggg caacgaggcc 1860 agctaccctc tggagatgtg ctcccacttc gacgccgacg agatcaagcg gctgggcaag 1920 cgcttcaaga agctggacct ggacaacagc ggcagcctga gcgtggagga gtttatgtct 1980 ctgcccgagc tgcagcagaa ccccctggtg cagcgcgtga tcgacatctt cgacaccgac 2040 ggcaacggcg aggtggactt caaggagttc atcgagggcg tgagccagtt cagcgtgaag 2100 ggcgacaagg agcagaagct gcggttcgcc ttccggatct acgatatgga taaagatggc 2160 tatatttcta atggcgagct gttccaggtg ctgaagatga tggtgggcaa caataccaag 2220 ctggccgata cccagctgca gcagatcgtg gacaagacca tcatcaacgc cgacaaggac 2280 ggcgacggca gaatcagctt cgaggagttc tgtgccgtgg tgggaggcct ggatattcac 2340 aaaaaaatgg tggtggacgt gggatccggc gctacaaatt tttcactgct gaaacaggcg 2400 ggtgatgtgg aggagaaccc tggacccatg ccacttggcc tgctctggct gggcttggca 2460 ttgctcggcg cgctccacgc ccaggctgaa ctgatccgcg tggccatatt gtggcatgag 2520 atgtggcatg agggattgga ggaggcgagt aggctgtact ttggggaaag gaatgttaaa 2580 gggatgtttg aggtccttga acccctccac gctatgatgg aaagaggacc tcaaacgctt 2640 aaagagacgt cattcaatca agcctatgga cgggatctta tggaagctca agaatggtgt 2700 cgaaaataca tgaaaagcgg gaatgttaag gacctcacgc aagcctggga tctgtattac 2760 catgttttcc gacgcatttc taaacaagga aaagatacta tcccatggtt ggggcacttg 2820 ctcgttgggc tcagtggggc gtttggattc atcatcctcg tatatctgtt gattaattgt 2880 cggaacacag gtccctggct taaaaaagtt ttgaagtgta acaccccgga tccttctaaa 2940 ttttttagtc aacttagttc agaacacggg ggcgatgttc aaaagtggct gagttccccg 3000 tttcccagtt caagtttctc ccctgggggt ctcgcccccg agatatcacc tcttgaagtg 3060 ctcgagcggg acaaagttac acagcttctt ttgcaacagg ataaggttcc ggagccggcg 3120 tctctcagct ctaaccattc actcacttct tgtttcacca accaagggta ttttttcttc 3180 catctgcctg atgccttgga gattgaggct tgtcaggtgt actttaccta tgacccctat 3240 agtgaggaag accctgacga aggcgtagct ggcgccccca ctggctccag tccacagcct 3300 cttcagcctc tgtcagggga ggacgacgca tattgtacgt tcccctcacg ggacgacctt 3360 ctgctgtttt caccctcact gctcggcgga ccctccccgc caagcacggc acctgggggg 3420 agtggggcag gagaagaaag gatgcctcct agtttgcagg agcgggttcc tcgcgactgg 3480 gatccgcaac ccctcggacc acccacccct ggcgtacctg atctggtcga cttccaacca 3540 cctccggagc ttgtcctcag agaggccgga gaggaagtcc cagacgcggg gccaagagag 3600 ggtgtgtcat ttccctggtc ccgccctccg ggacagggtg agtttcgggc gctgaatgcg 3660 aggctccccc ttaataccga tgcgtacctg tcattgcagg aacttcaggg ccaggatcct 3720 acccacctgg tgggatccgg cgctacaaat ttttcactgc tgaaacaggc gggtgatgtg 3780 gaggagaacc ctggacccat gcctctgggc ctgctgtggc tgggcctggc cctgctgggc 3840 gccctgcacg cccaggccgg cgtgcaggtg gagacaatct ccccaggcga cggacgcaca 3900 ttccctaagc ggggccagac ctgcgtggtg cactatacag gcatgctgga ggatggcaag 3960 aagtttgaca gctcccggga tagaaacaag ccattcaagt ttatgctggg caagcaggaa 4020 gtgatcagag gctgggagga gggcgtggcc cagatgtctg tgggccagag ggccaagctg 4080 accatcagcc cagactacgc ctatggagca acaggccacc caggaatcat cccacctcac 4140 gccaccctgg tgttcgatgt ggagctgctg aagctgggcg agggcagcaa caccagcaaa 4200 gagaatcctt tcctgtttgc attggaagcc gtggttatct ctgttggctc catgggattg 4260 attatcagcc ttctctgtgt gtatttctgg ctggaacggt gagatttgga gaagcccaga 4320 aaaatgaggg gaacggtagc tgacaatagc agaggagggt tttgcagggt ctttaggagt 4380 aaaggatgag acagtaagta atgagagatt acccaagagg gtttggtgat ggaaggaagc 4440 cacaggcaca gagaacacag aatcacttta tttcatatgg gacaactggg agaagggtga 4500 taaaaaagct ttaacctatg tgctcctgct ccctctttct cccctgtcag gacgatgccc 4560 cgaattccca ccctgaagaa cctagaggat cttgttactg aataccacgg gaacttttcg 4620 gtgagaacgc tgtcatcaat tgccttaggc cgcaggaacc cctagtgatg gagttggcca 4680 ctccctctct gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc 4740 cgggctttgc ccgggcggcc tcagtgagcg agcgagcgcg cagctgcctg cagg 4794 <210> 29 <211> 3937 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> IL2RG HA-p2A-B2M-CD8-41bbzeta-P2A-ER-FRB-IL2RB-P2A-ER-FKBP-fusion-IL2RG HA <400> 29 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60 gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120 actccatcac taggggttcc tgcggcccgc ggcaacctct agaaatcaag gtttttctgt 180 gtagggttgg gttagcgtgt tgttagagta ggggagtgga ttgagaagga ggctgagggg 240 tactcaaggg ggctatagaa tgtataggat ttccctgaag cattcctaga gagcctgcaa 300 ggtgaagatg gctttggaac cagctggatc taggctgtgc cacatactac ctctttggcc 360 ttggccacat ccctaaactc ttggattctg tttcctaaga tgtaagatgg aggtaattgt 420 tcctgcctca caggagctgt tgtgaggatt aaacagagag tatgtcttta gcgcggtgcc 480 tggcaccagt gcctggcatg tagtaggggc acaacaaata taaggtccac tttgcttttc 540 ttttttctat agggatccgg cgctacaaat ttttcactgc tgaaacaggc gggtgatgtg 600 gaggagaacc ctggacccat gagcaggtca gtggcgttgg cggttctggc gcttttgagt 660 ttgagcggac tggaagccat ccaacgaacg cctaagatcc aggtatattc acgccacccg 720 gcggaaaacg gcaaaagtaa cttccttaat tgttatgtgt ctggcttcca cccgtctgat 780 attgaggtgg acctccttaa aaacggtgaa cggatcgaga aagtggagca ttccgatctt 840 agtttcagta aggattggag cttttacctt ctctattaca ctgagttcac tccgactgaa 900 aaggatgagt acgcctgtcg ggtcaaccac gtcaccctgt ctcaaccaaa aatagtcaaa 960 tgggacagag atatgtcaga tatttacata tgggcaccac ttgcgggcac gtgtggcgtc 1020 ctgcttctga gtctcgtcat tacgctttat tgtaaacggg gtagaaaaaa actcctttat 1080 atatttaaac agccatttat gcggccagtt caaacgacgc aggaagaaga cggctgtagt 1140 tgcagatttc cagaggaaga ggaaggtgga tgcgagcttc gggtcaagtt tagtaggtct 1200 gcagacgctc ccgcctatca acagggtcag aatcagcttt ataacgaact caacctcggt 1260 cgccgagaag agtacgacgt actcgataaa agaaggggta gagacccgga aatggggggc 1320 aaaccgcgcc gcaaaaatcc acaagagggg ctttataatg agcttcaaaa agacaaaatg 1380 gccgaagcat acagtgagat tgggatgaaa ggtgaacgca gaagaggtaa gggtcacgac 1440 gggctgtacc agggtttgtc aactgccaca aaggatactt atgacgctct gcatatgcaa 1500 gctcttcccc cacgcggatc cggcgctaca aatttttcac tgctgaaaca ggcgggtgat 1560 gtggaggaga accctggacc catgccactt ggcctgctct ggctgggctt ggcattgctc 1620 ggcgcgctcc acgcccaggc tgaactgatc cgcgtggcca tattgtggca tgagatgtgg 1680 catgagggat tggaggaggc gagtaggctg tactttgggg aaaggaatgt taaagggatg 1740 tttgaggtcc ttgaacccct ccacgctatg atggaaagag gacctcaaac gcttaaagag 1800 acgtcattca atcaagccta tggacgggat cttatggaag ctcaagaatg gtgtcgaaaa 1860 tacatgaaaa gcgggaatgt taaggacctc acgcaagcct gggatctgta ttaccatgtt 1920 ttccgacgca tttctaaaca aggaaaagat actatcccat ggttggggca cttgctcgtt 1980 gggctcagtg gggcgtttgg attcatcatc ctcgtatatc tgttgattaa ttgtcggaac 2040 acaggtccct ggcttaaaaa agttttgaag tgtaacaccc cggatccttc taaatttttt 2100 agtcaactta gttcagaaca cgggggcgat gttcaaaagt ggctgagttc cccgtttccc 2160 agttcaagtt tctcccctgg gggtctcgcc cccgagatat cacctcttga agtgctcgag 2220 cgggacaaag ttacacagct tcttttgcaa caggataagg ttccggagcc ggcgtctctc 2280 agctctaacc attcactcac ttcttgtttc accaaccaag ggtatttttt cttccatctg 2340 cctgatgcct tggagattga ggcttgtcag gtgtacttta cctatgaccc ctatagtgag 2400 gaagaccctg acgaaggcgt agctggcgcc cccactggct ccagtccaca gcctcttcag 2460 cctctgtcag gggaggacga cgcatattgt acgttcccct cacgggacga ccttctgctg 2520 ttttcaccct cactgctcgg cggaccctcc ccgccaagca cggcacctgg ggggagtggg 2580 gcaggagaag aaaggatgcc tcctagtttg caggagcggg ttcctcgcga ctgggatccg 2640 caacccctcg gaccacccac ccctggcgta cctgatctgg tcgacttcca accacctccg 2700 gagcttgtcc tcagagaggc cggagaggaa gtcccagacg cggggccaag agagggtgtg 2760 tcatttccct ggtcccgccc tccgggacag ggtgagtttc gggcgctgaa tgcgaggctc 2820 ccccttaata ccgatgcgta cctgtcattg caggaacttc agggccagga tcctacccac 2880 ctggtgggat ccggcgctac aaatttttca ctgctgaaac aggcgggtga tgtggaggag 2940 aaccctggac ccatgcctct gggcctgctg tggctgggcc tggccctgct gggcgccctg 3000 cacgcccagg ccggcgtgca ggtggagaca atctccccag gcgacggacg cacattccct 3060 aagcggggcc agacctgcgt ggtgcactat acaggcatgc tggaggatgg caagaagttt 3120 gacagctccc gggatagaaa caagccattc aagtttatgc tgggcaagca ggaagtgatc 3180 agaggctggg aggagggcgt ggcccagatg tctgtgggcc agagggccaa gctgaccatc 3240 agcccagact acgcctatgg agcaacaggc cacccaggaa tcatcccacc tcacgccacc 3300 ctggtgttcg atgtggagct gctgaagctg ggcgagggca gcaacaccag caaagagaat 3360 cctttcctgt ttgcattgga agccgtggtt atctctgttg gctccatggg attgattatc 3420 agccttctct gtgtgtattt ctggctggaa cggtgagatt tggagaagcc cagaaaaatg 3480 aggggaacgg tagctgacaa tagcagagga gggttttgca gggtctttag gagtaaagga 3540 tgagacagta agtaatgaga gattacccaa gagggtttgg tgatggaagg aagccacagg 3600 cacagagaac acagaatcac tttatttcat atgggacaac tgggagaagg gtgataaaaa 3660 agctttaacc tatgtgctcc tgctccctct ttctcccctg tcaggacgat gccccgaatt 3720 cccaccctga agaacctaga ggatcttgtt actgaatacc acgggaactt ttcggtgaga 3780 acgctgtcat caattgcctt aggccgcagg aacccctagt gatggagttg gccactccct 3840 ctctgcgcgc tcgctcgctc actgaggccg ggcgaccaaa ggtcgcccga cgcccgggcg 3900 gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagctgc ctgcagg 3937 <210> 30 <211> 4527 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> IL2RG HA-p2A-B2M-CD8-41bbzeta-T2A-CNb30-P2A-ER-FRB-IL2RB-P2A-ER-FKBP-fu sion-IL2RG HA <400> 30 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60 gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120 actccatcac taggggttcc tgcggcccgc ggcaacctct agaaatcaag gtttttctgt 180 gtagggttgg gttagcgtgt tgttagagta ggggagtgga ttgagaagga ggctgagggg 240 tactcaaggg ggctatagaa tgtataggat ttccctgaag cattcctaga gagcctgcaa 300 ggtgaagatg gctttggaac cagctggatc taggctgtgc cacatactac ctctttggcc 360 ttggccacat ccctaaactc ttggattctg tttcctaaga tgtaagatgg aggtaattgt 420 tcctgcctca caggagctgt tgtgaggatt aaacagagag tatgtcttta gcgcggtgcc 480 tggcaccagt gcctggcatg tagtaggggc acaacaaata taaggtccac tttgcttttc 540 ttttttctat agggatccgg cgctacaaat ttttcactgc tgaaacaggc gggtgatgtg 600 gaggagaacc ctggacccat gagcaggtca gtggcgttgg cggttctggc gcttttgagt 660 ttgagcggac tggaagccat ccaacgaacg cctaagatcc aggtatattc acgccacccg 720 gcggaaaacg gcaaaagtaa cttccttaat tgttatgtgt ctggcttcca cccgtctgat 780 attgaggtgg acctccttaa aaacggtgaa cggatcgaga aagtggagca ttccgatctt 840 agtttcagta aggattggag cttttacctt ctctattaca ctgagttcac tccgactgaa 900 aaggatgagt acgcctgtcg ggtcaaccac gtcaccctgt ctcaaccaaa aatagtcaaa 960 tgggacagag atatgtcaga tatttacata tgggcaccac ttgcgggcac gtgtggcgtc 1020 ctgcttctga gtctcgtcat tacgctttat tgtaaacggg gtagaaaaaa actcctttat 1080 atatttaaac agccatttat gcggccagtt caaacgacgc aggaagaaga cggctgtagt 1140 tgcagatttc cagaggaaga ggaaggtgga tgcgagcttc gggtcaagtt tagtaggtct 1200 gcagacgctc ccgcctatca acagggtcag aatcagcttt ataacgaact caacctcggt 1260 cgccgagaag agtacgacgt actcgataaa agaaggggta gagacccgga aatggggggc 1320 aaaccgcgcc gcaaaaatcc acaagagggg ctttataatg agcttcaaaa agacaaaatg 1380 gccgaagcat acagtgagat tgggatgaaa ggtgaacgca gaagaggtaa gggtcacgac 1440 gggctgtacc agggtttgtc aactgccaca aaggatactt atgacgctct gcatatgcaa 1500 gctcttcccc cacgcggttc cggggagggc cgagggtcat tgctgacgtg tggagacgtg 1560 gaggagaatc ctggccccat gggcaacgag gccagctacc ctctggagat gtgctcccac 1620 ttcgacgccg acgagatcaa gcggctgggc aagcgcttca agaagctgga cctggacaac 1680 agcggcagcc tgagcgtgga ggagtttatg tctctgcccg agctgcagca gaaccccctg 1740 gtgcagcgcg tgatcgacat cttcgacacc gacggcaacg gcgaggtgga cttcaaggag 1800 ttcatcgagg gcgtgagcca gttcagcgtg aagggcgaca aggagcagaa gctgcggttc 1860 gccttccgga tctacgatat ggataaagat ggctatattt ctaatggcga gctgttccag 1920 gtgctgaaga tgatggtggg caacaatacc aagctggccg atacccagct gcagcagatc 1980 gtggacaaga ccatcatcaa cgccgacaag gacggcgacg gcagaatcag cttcgaggag 2040 ttctgtgccg tggtgggagg cctggatatt cacaaaaaaa tggtggtgga cgtgggatcc 2100 ggcgctacaa atttttcact gctgaaacag gcgggtgatg tggaggagaa ccctggaccc 2160 atgccacttg gcctgctctg gctgggcttg gcattgctcg gcgcgctcca cgcccaggct 2220 gaactgatcc gcgtggccat attgtggcat gagatgtggc atgagggatt ggaggaggcg 2280 agtaggctgt actttgggga aaggaatgtt aaagggatgt ttgaggtcct tgaacccctc 2340 cacgctatga tggaaagagg acctcaaacg cttaaagaga cgtcattcaa tcaagcctat 2400 ggacgggatc ttatggaagc tcaagaatgg tgtcgaaaat acatgaaaag cgggaatgtt 2460 aaggacctca cgcaagcctg ggatctgtat taccatgttt tccgacgcat ttctaaacaa 2520 ggaaaagata ctatcccatg gttggggcac ttgctcgttg ggctcagtgg ggcgtttgga 2580 ttcatcatcc tcgtatatct gttgattaat tgtcggaaca caggtccctg gcttaaaaaa 2640 gttttgaagt gtaacacccc ggatccttct aaatttttta gtcaacttag ttcagaacac 2700 gggggcgatg ttcaaaagtg gctgagttcc ccgtttccca gttcaagttt ctcccctggg 2760 ggtctcgccc ccgagatatc acctcttgaa gtgctcgagc gggacaaagt tacacagctt 2820 cttttgcaac aggataaggt tccggagccg gcgtctctca gctctaacca ttcactcact 2880 tcttgtttca ccaaccaagg gtattttttc ttccatctgc ctgatgcctt ggagattgag 2940 gcttgtcagg tgtactttac ctatgacccc tatagtgagg aagaccctga cgaaggcgta 3000 gctggcgccc ccactggctc cagtccacag cctcttcagc ctctgtcagg ggaggacgac 3060 gcatattgta cgttcccctc acgggacgac cttctgctgt tttcaccctc actgctcggc 3120 ggaccctccc cgccaagcac ggcacctggg gggagtgggg caggagaaga aaggatgcct 3180 cctagtttgc aggagcgggt tcctcgcgac tgggatccgc aacccctcgg accacccacc 3240 cctggcgtac ctgatctggt cgacttccaa ccacctccgg agcttgtcct cagagaggcc 3300 ggagaggaag tcccagacgc ggggccaaga gagggtgtgt catttccctg gtcccgccct 3360 ccgggacagg gtgagtttcg ggcgctgaat gcgaggctcc cccttaatac cgatgcgtac 3420 ctgtcattgc aggaacttca gggccaggat cctacccacc tggtgggatc cggcgctaca 3480 aatttttcac tgctgaaaca ggcgggtgat gtggaggaga accctggacc catgcctctg 3540 ggcctgctgt ggctgggcct ggccctgctg ggcgccctgc acgcccaggc cggcgtgcag 3600 gtggagacaa tctccccagg cgacggacgc acattcccta agcggggcca gacctgcgtg 3660 gtgcactata caggcatgct ggaggatggc aagaagtttg acagctcccg ggatagaaac 3720 aagccattca agtttatgct gggcaagcag gaagtgatca gaggctggga ggagggcgtg 3780 gcccagatgt ctgtgggcca gagggccaag ctgaccatca gcccagacta cgcctatgga 3840 gcaacaggcc acccaggaat catcccacct cacgccaccc tggtgttcga tgtggagctg 3900 ctgaagctgg gcgagggcag caacaccagc aaagagaatc ctttcctgtt tgcattggaa 3960 gccgtggtta tctctgttgg ctccatggga ttgattatca gccttctctg tgtgtatttc 4020 tggctggaac ggtgagattt ggagaagccc agaaaaatga ggggaacggt agctgacaat 4080 agcagaggag ggttttgcag ggtctttagg agtaaaggat gagacagtaa gtaatgagag 4140 attacccaag agggtttggt gatggaagga agccacaggc acagagaaca cagaatcact 4200 ttatttcata tgggacaact gggagaaggg tgataaaaaa gctttaacct atgtgctcct 4260 gctccctctt tctcccctgt caggacgatg ccccgaattc ccaccctgaa gaacctagag 4320 gatcttgtta ctgaatacca cgggaacttt tcggtgagaa cgctgtcatc aattgcctta 4380 ggccgcagga acccctagtg atggagttgg ccactccctc tctgcgcgct cgctcgctca 4440 ctgaggccgg gcgaccaaag gtcgcccgac gcccgggctt tgcccgggcg gcctcagtga 4500 gcgagcgagc gcgcagctgc ctgcagg 4527 <210> 31 <211> 4279 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> IL2RG HA-synpA-MND-Kozak-B2M-CD8-41bbzeta-P2A-ER-FRB-IL2RB-P2A-ER-FKBP- fusion-IL2RG HA <400> 31 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60 gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120 actccatcac taggggttcc tgcggcccgc ggcaacctct agaaatcaag gtttttctgt 180 gtagggttgg gttagcgtgt tgttagagta ggggagtgga ttgagaagga ggctgagggg 240 tactcaaggg ggctatagaa tgtataggat ttccctgaag cattcctaga gagcctgcaa 300 ggtgaagatg gctttggaac cagctggatc taggctgtgc cacatactac ctctttggcc 360 ttggccacat ccctaaactc ttggattctg tttcctaaga tgtaagatgg aggtaattgt 420 tcctgcctca caggagctgt tgtgaggatt aaacagagag tatgtcttta gcgcggtgcc 480 tggcaccagt gcctggcatg tagtaggggc acaacaaata taaggtccac tttgcttttc 540 ttttttctat agatgaaata aaagatcttt attttcatta gatctgtgtg ttggtttttt 600 gtgtgaacag agaaacagga gaatatgggc caaacaggat atctgtggta agcagttcct 660 gccccggctc agggccaaga acagttggaa cagcagaata tgggccaaac aggatatctg 720 tggtaagcag ttcctgcccc ggctcagggc caagaacaga tggtccccag atgcggtccc 780 gccctcagca gtttctagag aaccatcaga tgtttccagg gtgccccaag gacctgaaat 840 gaccctgtgc cttatttgaa ctaaccaatc agttcgcttc tcgcttctgt tcgcgcgctt 900 ctgctccccg agctctatat aagcagagct cgtttagtga accgtcagat cgccgccacc 960 atgagcaggt cagtggcgtt ggcggttctg gcgcttttga gtttgagcgg actggaagcc 1020 atccaacgaa cgcctaagat ccaggtatat tcacgccacc cggcggaaaa cggcaaaagt 1080 aacttcctta attgttatgt gtctggcttc cacccgtctg atattgaggt ggacctcctt 1140 aaaaacggtg aacggatcga gaaagtggag cattccgatc ttagtttcag taaggattgg 1200 agcttttacc ttctctatta cactgagttc actccgactg aaaaggatga gtacgcctgt 1260 cgggtcaacc acgtcaccct gtctcaacca aaaatagtca aatgggacag agatatgtca 1320 gatatttaca tatgggcacc acttgcgggc acgtgtggcg tcctgcttct gagtctcgtc 1380 attacgcttt attgtaaacg gggtagaaaa aaactccttt atatatttaa acagccattt 1440 atgcggccag ttcaaacgac gcaggaagaa gacggctgta gttgcagatt tccagaggaa 1500 gaggaaggtg gatgcgagct tcgggtcaag tttagtaggt ctgcagacgc tcccgcctat 1560 caacagggtc agaatcagct ttataacgaa ctcaacctcg gtcgccgaga agagtacgac 1620 gtactcgata aaagaagggg tagagacccg gaaatggggg gcaaaccgcg ccgcaaaaat 1680 ccacaagagg ggctttataa tgagcttcaa aaagacaaaa tggccgaagc atacagtgag 1740 attgggatga aaggtgaacg cagaagaggt aagggtcacg acgggctgta ccagggtttg 1800 tcaactgcca caaaggatac ttatgacgct ctgcatatgc aagctcttcc cccacgcgga 1860 tccggcgcta caaatttttc actgctgaaa caggcgggtg atgtggagga gaaccctgga 1920 cccatgccac ttggcctgct ctggctgggc ttggcattgc tcggcgcgct ccacgcccag 1980 gctgaactga tccgcgtggc catattgtgg catgagatgt ggcatgaggg attggaggag 2040 gcgagtaggc tgtactttgg ggaaaggaat gttaaaggga tgtttgaggt ccttgaaccc 2100 ctccacgcta tgatggaaag aggacctcaa acgcttaaag agacgtcatt caatcaagcc 2160 tatggacggg atcttatgga agctcaagaa tggtgtcgaa aatacatgaa aagcgggaat 2220 gttaaggacc tcacgcaagc ctgggatctg tattaccatg ttttccgacg catttctaaa 2280 caaggaaaag atactatccc atggttgggg cacttgctcg ttgggctcag tggggcgttt 2340 ggattcatca tcctcgtata tctgttgatt aattgtcgga acacaggtcc ctggcttaaa 2400 aaagttttga agtgtaacac cccggatcct tctaaatttt ttagtcaact tagttcagaa 2460 cacgggggcg atgttcaaaa gtggctgagt tccccgtttc ccagttcaag tttctcccct 2520 gggggtctcg cccccgagat atcacctctt gaagtgctcg agcgggacaa agttacacag 2580 cttcttttgc aacaggataa ggttccggag ccggcgtctc tcagctctaa ccattcactc 2640 acttcttgtt tcaccaacca agggtatttt ttcttccatc tgcctgatgc cttggagatt 2700 gaggcttgtc aggtgtactt tacctatgac ccctatagtg aggaagaccc tgacgaaggc 2760 gtagctggcg cccccactgg ctccagtcca cagcctcttc agcctctgtc aggggaggac 2820 gacgcatatt gtacgttccc ctcacgggac gaccttctgc tgttttcacc ctcactgctc 2880 ggcggaccct ccccgccaag cacggcacct ggggggagtg gggcaggaga agaaaggatg 2940 cctcctagtt tgcaggagcg ggttcctcgc gactgggatc cgcaacccct cggaccaccc 3000 acccctggcg tacctgatct ggtcgacttc caaccacctc cggagcttgt cctcagagag 3060 gccggagagg aagtcccaga cgcggggcca agagagggtg tgtcatttcc ctggtcccgc 3120 cctccgggac agggtgagtt tcgggcgctg aatgcgaggc tcccccttaa taccgatgcg 3180 tacctgtcat tgcaggaact tcagggccag gatcctaccc acctggtggg atccggcgct 3240 acaaattttt cactgctgaa acaggcgggt gatgtggagg agaaccctgg acccatgcct 3300 ctgggcctgc tgtggctggg cctggccctg ctgggcgccc tgcacgccca ggccggcgtg 3360 caggtggaga caatctcccc aggcgacgga cgcacattcc ctaagcgggg ccagacctgc 3420 gtggtgcact atacaggcat gctggaggat ggcaagaagt ttgacagctc ccgggataga 3480 aacaagccat tcaagtttat gctgggcaag caggaagtga tcagaggctg ggaggagggc 3540 gtggcccaga tgtctgtggg ccagagggcc aagctgacca tcagcccaga ctacgcctat 3600 ggagcaacag gccacccagg aatcatccca cctcacgcca ccctggtgtt cgatgtggag 3660 ctgctgaagc tgggcgaggg cagcaacacc agcaaagaga atcctttcct gtttgcattg 3720 gaagccgtgg ttatctctgt tggctccatg ggattgatta tcagccttct ctgtgtgtat 3780 ttctggctgg aacggtgaga tttggagaag cccagaaaaa tgaggggaac ggtagctgac 3840 aatagcagag gagggttttg cagggtcttt aggagtaaag gatgagacag taagtaatga 3900 gagattaccc aagagggttt ggtgatggaa ggaagccaca ggcacagaga acacagaatc 3960 actttatttc atatgggaca actgggagaa gggtgataaa aaagctttaa cctatgtgct 4020 cctgctccct ctttctcccc tgtcaggacg atgccccgaa ttcccaccct gaagaaccta 4080 gaggatcttg ttactgaata ccacgggaac ttttcggtga gaacgctgtc atcaattgcc 4140 ttaggccgca ggaaccccta gtgatggagt tggccactcc ctctctgcgc gctcgctcgc 4200 tcactgaggc cgggcgacca aaggtcgccc gacgcccggg cggcctcagt gagcgagcga 4260 gcgcgcagct gcctgcagg 4279 <210> 32 <211> 4869 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> IL2RG HA-synpA-MND-Kozak-B2M-CD8-41bbzeta-T2A-CNb30-P2A-ER-FRB-IL2RB-P2 A-ER-FKBP-fusion-IL2RG HA <400> 32 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60 gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120 actccatcac taggggttcc tgcggcccgc ggcaacctct agaaatcaag gtttttctgt 180 gtagggttgg gttagcgtgt tgttagagta ggggagtgga ttgagaagga ggctgagggg 240 tactcaaggg ggctatagaa tgtataggat ttccctgaag cattcctaga gagcctgcaa 300 ggtgaagatg gctttggaac cagctggatc taggctgtgc cacatactac ctctttggcc 360 ttggccacat ccctaaactc ttggattctg tttcctaaga tgtaagatgg aggtaattgt 420 tcctgcctca caggagctgt tgtgaggatt aaacagagag tatgtcttta gcgcggtgcc 480 tggcaccagt gcctggcatg tagtaggggc acaacaaata taaggtccac tttgcttttc 540 ttttttctat agatgaaata aaagatcttt attttcatta gatctgtgtg ttggtttttt 600 gtgtgaacag agaaacagga gaatatgggc caaacaggat atctgtggta agcagttcct 660 gccccggctc agggccaaga acagttggaa cagcagaata tgggccaaac aggatatctg 720 tggtaagcag ttcctgcccc ggctcagggc caagaacaga tggtccccag atgcggtccc 780 gccctcagca gtttctagag aaccatcaga tgtttccagg gtgccccaag gacctgaaat 840 gaccctgtgc cttatttgaa ctaaccaatc agttcgcttc tcgcttctgt tcgcgcgctt 900 ctgctccccg agctctatat aagcagagct cgtttagtga accgtcagat cgccgccacc 960 atgagcaggt cagtggcgtt ggcggttctg gcgcttttga gtttgagcgg actggaagcc 1020 atccaacgaa cgcctaagat ccaggtatat tcacgccacc cggcggaaaa cggcaaaagt 1080 aacttcctta attgttatgt gtctggcttc cacccgtctg atattgaggt ggacctcctt 1140 aaaaacggtg aacggatcga gaaagtggag cattccgatc ttagtttcag taaggattgg 1200 agcttttacc ttctctatta cactgagttc actccgactg aaaaggatga gtacgcctgt 1260 cgggtcaacc acgtcaccct gtctcaacca aaaatagtca aatgggacag agatatgtca 1320 gatatttaca tatgggcacc acttgcgggc acgtgtggcg tcctgcttct gagtctcgtc 1380 attacgcttt attgtaaacg gggtagaaaa aaactccttt atatatttaa acagccattt 1440 atgcggccag ttcaaacgac gcaggaagaa gacggctgta gttgcagatt tccagaggaa 1500 gaggaaggtg gatgcgagct tcgggtcaag tttagtaggt ctgcagacgc tcccgcctat 1560 caacagggtc agaatcagct ttataacgaa ctcaacctcg gtcgccgaga agagtacgac 1620 gtactcgata aaagaagggg tagagacccg gaaatggggg gcaaaccgcg ccgcaaaaat 1680 ccacaagagg ggctttataa tgagcttcaa aaagacaaaa tggccgaagc atacagtgag 1740 attgggatga aaggtgaacg cagaagaggt aagggtcacg acgggctgta ccagggtttg 1800 tcaactgcca caaaggatac ttatgacgct ctgcatatgc aagctcttcc cccacgcggt 1860 tccggggagg gccgagggtc attgctgacg tgtggagacg tggaggagaa tcctggcccc 1920 atgggcaacg aggccagcta ccctctggag atgtgctccc acttcgacgc cgacgagatc 1980 aagcggctgg gcaagcgctt caagaagctg gacctggaca acagcggcag cctgagcgtg 2040 gaggagttta tgtctctgcc cgagctgcag cagaaccccc tggtgcagcg cgtgatcgac 2100 atcttcgaca ccgacggcaa cggcgaggtg gacttcaagg agttcatcga gggcgtgagc 2160 cagttcagcg tgaagggcga caaggagcag aagctgcggt tcgccttccg gatctacgat 2220 atggataaag atggctatat ttctaatggc gagctgttcc aggtgctgaa gatgatggtg 2280 ggcaacaata ccaagctggc cgatacccag ctgcagcaga tcgtggacaa gaccatcatc 2340 aacgccgaca aggacggcga cggcagaatc agcttcgagg agttctgtgc cgtggtggga 2400 ggcctggata ttcacaaaaa aatggtggtg gacgtgggat ccggcgctac aaatttttca 2460 ctgctgaaac aggcgggtga tgtggaggag aaccctggac ccatgccact tggcctgctc 2520 tggctgggct tggcattgct cggcgcgctc cacgcccagg ctgaactgat ccgcgtggcc 2580 atattgtggc atgagatgtg gcatgaggga ttggaggagg cgagtaggct gtactttggg 2640 gaaaggaatg ttaaagggat gtttgaggtc cttgaacccc tccacgctat gatggaaaga 2700 ggacctcaaa cgcttaaaga gacgtcattc aatcaagcct atggacggga tcttatggaa 2760 gctcaagaat ggtgtcgaaa atacatgaaa agcgggaatg ttaaggacct cacgcaagcc 2820 tgggatctgt attaccatgt tttccgacgc atttctaaac aaggaaaaga tactatccca 2880 tggttggggc acttgctcgt tgggctcagt ggggcgtttg gattcatcat cctcgtatat 2940 ctgttgatta attgtcggaa cacaggtccc tggcttaaaa aagttttgaa gtgtaacacc 3000 ccggatcctt ctaaattttt tagtcaactt agttcagaac acgggggcga tgttcaaaag 3060 tggctgagtt ccccgtttcc cagttcaagt ttctcccctg ggggtctcgc ccccgagata 3120 tcacctcttg aagtgctcga gcgggacaaa gttacacagc ttcttttgca acaggataag 3180 gttccggagc cggcgtctct cagctctaac cattcactca cttcttgttt caccaaccaa 3240 gggtattttt tcttccatct gcctgatgcc ttggagattg aggcttgtca ggtgtacttt 3300 acctatgacc cctatagtga ggaagaccct gacgaaggcg tagctggcgc ccccactggc 3360 tccagtccac agcctcttca gcctctgtca ggggaggacg acgcatattg tacgttcccc 3420 tcacgggacg accttctgct gttttcaccc tcactgctcg gcggaccctc cccgccaagc 3480 acggcacctg gggggagtgg ggcaggagaa gaaaggatgc ctcctagttt gcaggagcgg 3540 gttcctcgcg actgggatcc gcaacccctc ggaccaccca cccctggcgt acctgatctg 3600 gtcgacttcc aaccacctcc ggagcttgtc ctcagagagg ccggagagga agtcccagac 3660 gcggggccaa gagagggtgt gtcatttccc tggtcccgcc ctccgggaca gggtgagttt 3720 cgggcgctga atgcgaggct cccccttaat accgatgcgt acctgtcatt gcaggaactt 3780 cagggccagg atcctaccca cctggtggga tccggcgcta caaatttttc actgctgaaa 3840 caggcgggtg atgtggagga gaaccctgga cccatgcctc tgggcctgct gtggctgggc 3900 ctggccctgc tgggcgccct gcacgcccag gccggcgtgc aggtggagac aatctcccca 3960 ggcgacggac gcacattccc taagcggggc cagacctgcg tggtgcacta tacaggcatg 4020 ctggaggatg gcaagaagtt tgacagctcc cgggatagaa acaagccatt caagtttatg 4080 ctgggcaagc aggaagtgat cagaggctgg gaggagggcg tggcccagat gtctgtgggc 4140 cagagggcca agctgaccat cagcccagac tacgcctatg gagcaacagg ccacccagga 4200 atcatcccac ctcacgccac cctggtgttc gatgtggagc tgctgaagct gggcgagggc 4260 agcaacacca gcaaagagaa tcctttcctg tttgcattgg aagccgtggt tatctctgtt 4320 ggctccatgg gattgattat cagccttctc tgtgtgtatt tctggctgga acggtgagat 4380 ttggagaagc ccagaaaaat gaggggaacg gtagctgaca atagcagagg agggttttgc 4440 agggtcttta ggagtaaagg atgagacagt aagtaatgag agattaccca agagggtttg 4500 gtgatggaag gaagccacag gcacagagaa cacagaatca ctttatttca tatgggacaa 4560 ctgggagaag ggtgataaaa aagctttaac ctatgtgctc ctgctccctc tttctcccct 4620 gtcaggacga tgccccgaat tcccaccctg aagaacctag aggatcttgt tactgaatac 4680 cacgggaact tttcggtgag aacgctgtca tcaattgcct taggccgcag gaacccctag 4740 tgatggagtt ggccactccc tctctgcgcg ctcgctcgct cactgaggcc gggcgaccaa 4800 aggtcgcccg acgcccgggc tttgcccggg cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagct 4860 gcctgcagg 4869 <210> 33 <211> 4825 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> IL2RG HA-p2A-B2M-CD8-41bbzeta-P2A-tLNGFR-P2A-ER-FRB-IL2RB-P2A-ER-FKBP-f usion-IL2RG HA <400> 33 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60 gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120 actccatcac taggggttcc tgcggcccgc ggcaacctct agaaatcaag gtttttctgt 180 gtagggttgg gttagcgtgt tgttagagta ggggagtgga ttgagaagga ggctgagggg 240 tactcaaggg ggctatagaa tgtataggat ttccctgaag cattcctaga gagcctgcaa 300 ggtgaagatg gctttggaac cagctggatc taggctgtgc cacatactac ctctttggcc 360 ttggccacat ccctaaactc ttggattctg tttcctaaga tgtaagatgg aggtaattgt 420 tcctgcctca caggagctgt tgtgaggatt aaacagagag tatgtcttta gcgcggtgcc 480 tggcaccagt gcctggcatg tagtaggggc acaacaaata taaggtccac tttgcttttc 540 ttttttctat agggatccgg cgctacaaat ttttcactgc tgaaacaggc gggtgatgtg 600 gaggagaacc ctggacccat gagcaggtca gtggcgttgg cggttctggc gcttttgagt 660 ttgagcggac tggaagccat ccaacgaacg cctaagatcc aggtatattc acgccacccg 720 gcggaaaacg gcaaaagtaa cttccttaat tgttatgtgt ctggcttcca cccgtctgat 780 attgaggtgg acctccttaa aaacggtgaa cggatcgaga aagtggagca ttccgatctt 840 agtttcagta aggattggag cttttacctt ctctattaca ctgagttcac tccgactgaa 900 aaggatgagt acgcctgtcg ggtcaaccac gtcaccctgt ctcaaccaaa aatagtcaaa 960 tgggacagag atatgtcaga tatttacata tgggcaccac ttgcgggcac gtgtggcgtc 1020 ctgcttctga gtctcgtcat tacgctttat tgtaaacggg gtagaaaaaa actcctttat 1080 atatttaaac agccatttat gcggccagtt caaacgacgc aggaagaaga cggctgtagt 1140 tgcagatttc cagaggaaga ggaaggtgga tgcgagcttc gggtcaagtt tagtaggtct 1200 gcagacgctc ccgcctatca acagggtcag aatcagcttt ataacgaact caacctcggt 1260 cgccgagaag agtacgacgt actcgataaa agaaggggta gagacccgga aatggggggc 1320 aaaccgcgcc gcaaaaatcc acaagagggg ctttataatg agcttcaaaa agacaaaatg 1380 gccgaagcat acagtgagat tgggatgaaa ggtgaacgca gaagaggtaa gggtcacgac 1440 gggctgtacc agggtttgtc aactgccaca aaggatactt atgacgctct gcatatgcaa 1500 gctcttcccc cacgcggaag cggagctact aacttcagcc tgctgaagca ggctggagac 1560 gtggaggaga accctggacc tatgggtgct ggcgcaactg gacgcgctat ggatggacct 1620 cgcttgctgc ttcttctgct tctcggggtc tctttgggtg gtgctaagga agcatgccca 1680 acgggacttt atacgcatag cggagagtgt tgcaaagctt gtaacctggg cgaaggcgtc 1740 gcgcaacctt gtggtgcaaa tcaaaccgtc tgcgagccat gtttggactc tgttacgttt 1800 agtgacgtag tatctgcgac agagccatgc aagccttgta cggaatgtgt aggattgcag 1860 agcatgtctg ccccttgtgt agaagccgac gatgcagttt gccggtgcgc gtatggctat 1920 taccaagacg aaacaaccgg acgatgtgaa gcttgccgag tttgtgaagc gggttccggg 1980 cttgtattct cctgtcagga taagcagaac accgtctgcg aagagtgccc cgatggtacc 2040 tacagcgatg aagcgaacca tgtagaccca tgcctgcctt gcaccgtttg tgaagacacg 2100 gaacgacagt tgcgggaatg tacccggtgg gcagacgccg agtgcgaaga gattccaggc 2160 cgctggatca cgcgaagtac cccgccagaa ggttccgaca gtactgcacc aagcacccaa 2220 gaaccagagg cgccccccga gcaggacctg attgcctcca ccgtggcggg tgttgttact 2280 acggttatgg gctcatccca gcccgttgtt acccgaggaa ctacagacaa cctgattccg 2340 gtatattgtt ctatcttggc ggctgtagta gttggcttgg tcgcgtacat cgctttcaaa 2400 agaggatccg gcgctacaaa tttttcactg ctgaaacagg cgggtgatgt ggaggagaac 2460 cctggaccca tgccacttgg cctgctctgg ctgggcttgg cattgctcgg cgcgctccac 2520 gcccaggctg aactgatccg cgtggccata ttgtggcatg agatgtggca tgagggattg 2580 gaggaggcga gtaggctgta ctttggggaa aggaatgtta aagggatgtt tgaggtcctt 2640 gaacccctcc acgctatgat ggaaagagga cctcaaacgc ttaaagagac gtcattcaat 2700 caagcctatg gacgggatct tatggaagct caagaatggt gtcgaaaata catgaaaagc 2760 gggaatgtta aggacctcac gcaagcctgg gatctgtatt accatgtttt ccgacgcatt 2820 tctaaacaag gaaaagatac tatcccatgg ttggggcact tgctcgttgg gctcagtggg 2880 gcgtttggat tcatcatcct cgtatatctg ttgattaatt gtcggaacac aggtccctgg 2940 cttaaaaaag ttttgaagtg taacaccccg gatccttcta aattttttag tcaacttagt 3000 tcagaacacg ggggcgatgt tcaaaagtgg ctgagttccc cgtttcccag ttcaagtttc 3060 tcccctgggg gtctcgcccc cgagatatca cctcttgaag tgctcgagcg ggacaaagtt 3120 acacagcttc ttttgcaaca ggataaggtt ccggagccgg cgtctctcag ctctaaccat 3180 tcactcactt cttgtttcac caaccaaggg tattttttct tccatctgcc tgatgccttg 3240 gagattgagg cttgtcaggt gtactttacc tatgacccct atagtgagga agaccctgac 3300 gaaggcgtag ctggcgcccc cactggctcc agtccacagc ctcttcagcc tctgtcaggg 3360 gaggacgacg catattgtac gttcccctca cgggacgacc ttctgctgtt ttcaccctca 3420 ctgctcggcg gaccctcccc gccaagcacg gcacctgggg ggagtggggc aggagaagaa 3480 aggatgcctc ctagtttgca ggagcgggtt cctcgcgact gggatccgca acccctcgga 3540 ccacccaccc ctggcgtacc tgatctggtc gacttccaac cacctccgga gcttgtcctc 3600 agagaggccg gagaggaagt cccagacgcg gggccaagag agggtgtgtc atttccctgg 3660 tcccgccctc cgggacaggg tgagtttcgg gcgctgaatg cgaggctccc ccttaatacc 3720 gatgcgtacc tgtcattgca ggaacttcag ggccaggatc ctacccacct ggtgggatcc 3780 ggcgctacaa atttttcact gctgaaacag gcgggtgatg tggaggagaa ccctggaccc 3840 atgcctctgg gcctgctgtg gctgggcctg gccctgctgg gcgccctgca cgcccaggcc 3900 ggcgtccagg tggagacaat ctccccaggc gacggacgca cattccctaa gcggggccag 3960 acctgcgtgg tgcactatac aggcatgctg gaggatggca agaagtttga cagctcccgg 4020 gatagaaaca agccattcaa gtttatgctg ggcaagcagg aagtgatcag aggctgggag 4080 gagggcgtgg cccagatgtc tgtgggccag agggccaagc tgaccatcag cccagactac 4140 gcctatggag caacaggcca cccaggaatc atcccacctc acgccaccct ggtgttcgat 4200 gtggagctgc tgaagctggg cgagggcagc aacaccagca aagagaatcc tttcctgttt 4260 gcattggaag ccgtggttat ctctgttggc tccatgggat tgattatcag ccttctctgt 4320 gtgtatttct ggctggaacg gtgagatttg gagaagccca gaaaaatgag gggaacggta 4380 gctgacaata gcagaggagg gttttgcagg gtctttagga gtaaaggatg agacagtaag 4440 taatgagaga ttacccaaga gggtttggtg atggaaggaa gccacaggca cagagaacac 4500 agaatcactt tatttcatat gggacaactg ggagaagggt gataaaaaag ctttaaccta 4560 tgtgctcctg ctccctcttt ctcccctgtc aggacgatgc cccgaattcc caccctgaag 4620 aacctagagg atcttgttac tgaataccac gggaactttt cggtgagaac gctgtcatca 4680 attgccttag gccgcaggaa cccctagtga tggagttggc cactccctct ctgcgcgctc 4740 gctcgctcac tgaggccggg cgaccaaagg tcgcccgacg cccgggcggc ctcagtgagc 4800 gagcgagcgc gcagctgcct gcagg 4825 <210> 34 <211> 5178 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> IL2RG HA-synpA-MND-Kozak-B2M-CD8-41bbzeta-P2A-tLNGFR-P2A-ER-FRB-IL2RB-P 2A-ER-FKBP-fusion-IL2RG HA <400> 34 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60 gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120 actccatcac taggggttcc tgcggcccgc ggcaacctct agaaatcaag gtttttctgt 180 gtagggttgg gttagcgtgt tgttagagta ggggagtgga ttgagaagga ggctgagggg 240 tactcaaggg ggctatagaa tgtataggat ttccctgaag cattcctaga gagcctgcaa 300 ggtgaagatg gctttggaac cagctggatc taggctgtgc cacatactac ctctttggcc 360 ttggccacat ccctaaactc ttggattctg tttcctaaga tgtaagatgg aggtaattgt 420 tcctgcctca caggagctgt tgtgaggatt aaacagagag tatgtcttta gcgcggtgcc 480 tggcaccagt gcctggcatg tagtaggggc acaacaaata taaggtccac tttgcttttc 540 ttttttctat agatgaaata aaagatcttt attttcatta gatctgtgtg ttggtttttt 600 gtgtgaacag agaaacagga gaatatgggc caaacaggat atctgtggta agcagttcct 660 gccccggctc agggccaaga acagttggaa cagcagaata tgggccaaac aggatatctg 720 tggtaagcag ttcctgcccc ggctcagggc caagaacaga tggtccccag atgcggtccc 780 gccctcagca gtttctagag aaccatcaga tgtttccagg gtgccccaag gacctgaaat 840 gaccctgtgc cttatttgaa ctaaccaatc agttcgcttc tcgcttctgt tcgcgcgctt 900 ctgctccccg agctctatat aagcagagct cgtttagtga accgtcagat cgccgccacc 960 atgagcaggt cagtggcgtt ggcggttctg gcgcttttga gtttgagcgg actggaagcc 1020 atccaacgaa cgcctaagat ccaggtatat tcacgccacc cggcggaaaa cggcaaaagt 1080 aacttcctta attgttatgt gtctggcttc cacccgtctg atattgaggt ggacctcctt 1140 aaaaacggtg aacggatcga gaaagtggag cattccgatc ttagtttcag taaggattgg 1200 agcttttacc ttctctatta cactgagttc actccgactg aaaaggatga gtacgcctgt 1260 cgggtcaacc acgtcaccct gtctcaacca aaaatagtca aatgggacag agatatgtca 1320 gatatttaca tatgggcacc acttgcgggc acgtgtggcg tcctgcttct gagtctcgtc 1380 attacgcttt attgtaaacg gggtagaaaa aaactccttt atatatttaa acagccattt 1440 atgcggccag ttcaaacgac gcaggaagaa gacggctgta gttgcagatt tccagaggaa 1500 gaggaaggtg gatgcgagct tcgggtcaag tttagtaggt ctgcagacgc tcccgcctat 1560 caacagggtc agaatcagct ttataacgaa ctcaacctcg gtcgccgaga agagtacgac 1620 gtactcgata aaagaagggg tagagacccg gaaatggggg gcaaaccgcg ccgcaaaaat 1680 ccacaagagg ggctttataa tgagcttcaa aaagacaaaa tggccgaagc atacagtgag 1740 attgggatga aaggtgaacg cagaagaggt aagggtcacg acgggctgta ccagggtttg 1800 tcaactgcca caaaggatac ttatgacgct ctgcatatgc aagctcttcc cccacgcgga 1860 agcggagcta ctaacttcag cctgctgaag caggctggag acgtggagga gaaccctgga 1920 cctatgggtg ctggcgcaac tggacgcgct atggatggac ctcgcttgct gcttcttctg 1980 cttctcgggg tctctttggg tggtgctaag gaagcatgcc caacgggact ttatacgcat 2040 agcggagagt gttgcaaagc ttgtaacctg ggcgaaggcg tcgcgcaacc ttgtggtgca 2100 aatcaaaccg tctgcgagcc atgtttggac tctgttacgt ttagtgacgt agtatctgcg 2160 acagagccat gcaagccttg tacggaatgt gtaggattgc agagcatgtc tgccccttgt 2220 gtagaagccg acgatgcagt ttgccggtgc gcgtatggct attaccaaga cgaaacaacc 2280 ggacgatgtg aagcttgccg agtttgtgaa gcgggttccg ggcttgtatt ctcctgtcag 2340 gataagcaga acaccgtctg cgaagagtgc cccgatggta cctacagcga tgaagcgaac 2400 catgtagacc catgcctgcc ttgcaccgtt tgtgaagaca cggaacgaca gttgcgggaa 2460 tgtacccggt gggcagacgc cgagtgcgaa gagattccag gccgctggat cacgcgaagt 2520 accccgccag aaggttccga cagtactgca ccaagcaccc aagaaccaga ggcgcccccc 2580 gagcaggacc tgattgcctc caccgtggcg ggtgttgtta ctacggttat gggctcatcc 2640 cagcccgttg ttacccgagg aactacagac aacctgattc cggtatattg ttctatcttg 2700 gcggctgtag tagttggctt ggtcgcgtac atcgctttca aaagaggatc cggcgctaca 2760 aatttttcac tgctgaaaca ggcgggtgat gtggaggaga accctggacc catgccactt 2820 ggcctgctct ggctgggctt ggcattgctc ggcgcgctcc acgcccaggc tgaactgatc 2880 cgcgtggcca tattgtggca tgagatgtgg catgagggat tggaggaggc gagtaggctg 2940 tactttgggg aaaggaatgt taaagggatg tttgaggtcc ttgaacccct ccacgctatg 3000 atggaaagag gacctcaaac gcttaaagag acgtcattca atcaagccta tggacgggat 3060 cttatggaag ctcaagaatg gtgtcgaaaa tacatgaaaa gcgggaatgt taaggacctc 3120 acgcaagcct gggatctgta ttaccatgtt ttccgacgca tttctaaaca aggaaaagat 3180 actatcccat ggttggggca cttgctcgtt gggctcagtg gggcgtttgg attcatcatc 3240 ctcgtatatc tgttgattaa ttgtcggaac acaggtccct ggcttaaaaa agttttgaag 3300 tgtaacaccc cggatccttc taaatttttt agtcaactta gttcagaaca cgggggcgat 3360 gttcaaaagt ggctgagttc cccgtttccc agttcaagtt tctcccctgg gggtctcgcc 3420 cccgagatat cacctcttga agtgctcgag cgggacaaag ttacacagct tcttttgcaa 3480 caggataagg ttccggagcc ggcgtctctc agctctaacc attcactcac ttcttgtttc 3540 accaaccaag ggtatttttt cttccatctg cctgatgcct tggagattga ggcttgtcag 3600 gtgtacttta cctatgaccc ctatagtgag gaagaccctg acgaaggcgt agctggcgcc 3660 cccactggct ccagtccaca gcctcttcag cctctgtcag gggaggacga cgcatattgt 3720 acgttcccct cacgggacga ccttctgctg ttttcaccct cactgctcgg cggaccctcc 3780 ccgccaagca cggcacctgg ggggagtggg gcaggagaag aaaggatgcc tcctagtttg 3840 caggagcggg ttcctcgcga ctgggatccg caacccctcg gaccacccac ccctggcgta 3900 cctgatctgg tcgacttcca accacctccg gagcttgtcc tcagagaggc cggagaggaa 3960 gtcccagacg cggggccaag agagggtgtg tcatttccct ggtcccgccc tccgggacag 4020 ggtgagtttc gggcgctgaa tgcgaggctc ccccttaata ccgatgcgta cctgtcattg 4080 caggaacttc agggccagga tcctacccac ctggtgggat ccggcgctac aaatttttca 4140 ctgctgaaac aggcgggtga tgtggaggag aaccctggac ccatgcctct gggcctgctg 4200 tggctgggcc tggccctgct gggcgccctg cacgcccagg ccggcgtcca ggtggagaca 4260 atctccccag gcgacggacg cacattccct aagcggggcc agacctgcgt ggtgcactat 4320 acaggcatgc tggaggatgg caagaagttt gacagctccc gggatagaaa caagccattc 4380 aagtttatgc tgggcaagca ggaagtgatc agaggctggg aggagggcgt ggcccagatg 4440 tctgtgggcc agagggccaa gctgaccatc agcccagact acgcctatgg agcaacaggc 4500 cacccaggaa tcatcccacc tcacgccacc ctggtgttcg atgtggagct gctgaagctg 4560 ggcgagggca gcaacaccag caaagagaat cctttcctgt ttgcattgga agccgtggtt 4620 atctctgttg gctccatggg attgattatc agccttctct gtgtgtattt ctggctggaa 4680 cggtgagatt tggagaagcc cagaaaaatg aggggaacgg tagctgacaa tagcagagga 4740 gggttttgca gggtctttag gagtaaagga tgagacagta agtaatgaga gattacccaa 4800 gagggtttgg tgatggaagg aagccacagg cacagagaac acagaatcac tttatttcat 4860 atgggacaac tgggagaagg gtgataaaaa agctttaacc tatgtgctcc tgctccctct 4920 ttctcccctg tcaggacgat gccccgaatt cccaccctga agaacctaga ggatcttgtt 4980 actgaatacc acgggaactt ttcggtgaga acgctgtcat caattgcctt aggccgcagg 5040 aacccctagt gatggagttg gccactccct ctctgcgcgc tcgctcgctc actgaggccg 5100 ggcgaccaaa ggtcgcccga cgcccgggct ttgcccgggc ggcctcagtg agcgagcgag 5160 cgcgcagctg cctgcagg 5178 <210> 35 <211> 3748 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> IL2RG HA-P2A-mCherry-P2A-ER-FRB-IL2RB-P2A-ER-FKBP-fusion-IL2RG HA <400> 35 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60 gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120 actccatcac taggggttcc tgcggcccgc ggcaacctct agaaatcaag gtttttctgt 180 gtagggttgg gttagcgtgt tgttagagta ggggagtgga ttgagaagga ggctgagggg 240 tactcaaggg ggctatagaa tgtataggat ttccctgaag cattcctaga gagcctgcaa 300 ggtgaagatg gctttggaac cagctggatc taggctgtgc cacatactac ctctttggcc 360 ttggccacat ccctaaactc ttggattctg tttcctaaga tgtaagatgg aggtaattgt 420 tcctgcctca caggagctgt tgtgaggatt aaacagagag tatgtcttta gcgcggtgcc 480 tggcaccagt gcctggcatg tagtaggggc acaacaaata taaggtccac tttgcttttc 540 ttttttctat agggaagcgg agctactaac ttcagcctgc tgaagcaggc tggagacgtg 600 gaggagaacc ctggacctat ggtgagcaag ggcgaggagg ataacatggc catcatcaag 660 gagttcatgc gcttcaaggt gcacatggag ggctccgtga acggccacga gttcgagatc 720 gagggcgagg gcgagggccg cccctacgag ggcacccaga ccgccaagct gaaggtgacc 780 aagggtggcc ccctgccctt cgcctgggac atcctgtccc ctcagttcat gtacggctcc 840 aaggcctacg tgaagcaccc cgccgacatc cccgactact tgaagctgtc cttccccgag 900 ggcttcaagt gggagcgcgt gatgaacttc gaggacggcg gcgtggtgac cgtgacccag 960 gactcctccc tgcaggacgg cgagttcatc tacaaggtga agctgcgcgg caccaacttc 1020 ccctccgacg gccccgtaat gcagaagaag accatgggct gggaggcctc ctccgagcgg 1080 atgtaccccg aggacggcgc cctgaagggc gagatcaagc agaggctgaa gctgaaggac 1140 ggcggccact acgacgctga ggtcaagacc acctacaagg ccaagaagcc cgtgcagctg 1200 cccggcgcct acaacgtcaa catcaagttg gacatcacct cccacaacga ggactacacc 1260 atcgtggaac agtacgaacg cgccgagggc cgccactcca ccggcggcat ggacgagctg 1320 tacaagggat ccggcgctac aaatttttca ctgctgaaac aggcgggtga tgtggaggag 1380 aaccctggac ccatgccact tggcctgctc tggctgggct tggcattgct cggcgcgctc 1440 cacgcccagg ctgaactgat ccgcgtggcc atattgtggc atgagatgtg gcatgaggga 1500 ttggaggagg cgagtaggct gtactttggg gaaaggaatg ttaaagggat gtttgaggtc 1560 cttgaacccc tccacgctat gatggaaaga ggacctcaaa cgcttaaaga gacgtcattc 1620 aatcaagcct atggacggga tcttatggaa gctcaagaat ggtgtcgaaa atacatgaaa 1680 agcgggaatg ttaaggacct cacgcaagcc tgggatctgt attaccatgt tttccgacgc 1740 atttctaaac aaggaaaaga tactatccca tggttggggc acttgctcgt tgggctcagt 1800 ggggcgtttg gattcatcat cctcgtatat ctgttgatta attgtcggaa cacaggtccc 1860 tggcttaaaa aagttttgaa gtgtaacacc ccggatcctt ctaaattttt tagtcaactt 1920 agttcagaac acgggggcga tgttcaaaag tggctgagtt ccccgtttcc cagttcaagt 1980 ttctcccctg ggggtctcgc ccccgagata tcacctcttg aagtgctcga gcgggacaaa 2040 gttacacagc ttcttttgca acaggataag gttccggagc cggcgtctct cagctctaac 2100 cattcactca cttcttgttt caccaaccaa gggtattttt tcttccatct gcctgatgcc 2160 ttggagattg aggcttgtca ggtgtacttt acctatgacc cctatagtga ggaagaccct 2220 gacgaaggcg tagctggcgc ccccactggc tccagtccac agcctcttca gcctctgtca 2280 ggggaggacg acgcatattg tacgttcccc tcacgggacg accttctgct gttttcaccc 2340 tcactgctcg gcggaccctc cccgccaagc acggcacctg gggggagtgg ggcaggagaa 2400 gaaaggatgc ctcctagttt gcaggagcgg gttcctcgcg actgggatcc gcaacccctc 2460 ggaccaccca cccctggcgt acctgatctg gtcgacttcc aaccacctcc ggagcttgtc 2520 ctcagagagg ccggagagga agtcccagac gcggggccaa gagagggtgt gtcatttccc 2580 tggtcccgcc ctccgggaca gggtgagttt cgggcgctga atgcgaggct cccccttaat 2640 accgatgcgt acctgtcatt gcaggaactt cagggccagg atcctaccca cctggtggga 2700 tccggcgcta caaatttttc actgctgaaa caggcgggtg atgtggagga gaaccctgga 2760 cccatgcctc tgggcctgct gtggctgggc ctggccctgc tgggcgccct gcacgcccag 2820 gccggcgtgc aggtggagac aatctcccca ggcgacggac gcacattccc taagcggggc 2880 cagacctgcg tggtgcacta tacaggcatg ctggaggatg gcaagaagtt tgacagctcc 2940 cgggatagaa acaagccatt caagtttatg ctgggcaagc aggaagtgat cagaggctgg 3000 gaggagggcg tggcccagat gtctgtgggc cagagggcca agctgaccat cagcccagac 3060 tacgcctatg gagcaacagg ccacccagga atcatcccac ctcacgccac cctggtgttc 3120 gatgtggagc tgctgaagct gggcgagggc agcaacacca gcaaagagaa tcctttcctg 3180 tttgcattgg aagccgtggt tatctctgtt ggctccatgg gattgattat cagccttctc 3240 tgtgtgtatt tctggctgga acggtgagat ttggagaagc ccagaaaaat gaggggaacg 3300 gtagctgaca atagcagagg agggttttgc agggtcttta ggagtaaagg atgagacagt 3360 aagtaatgag agattaccca agagggtttg gtgatggaag gaagccacag gcacagagaa 3420 cacagaatca ctttatttca tatgggacaa ctgggagaag ggtgataaaa aagctttaac 3480 ctatgtgctc ctgctccctc tttctcccct gtcaggacga tgccccgaat tcccaccctg 3540 aagaacctag aggatcttgt tactgaatac cacgggaact tttcggtgag aacgctgtca 3600 tcaattgcct taggccgcag gaacccctag tgatggagtt ggccactccc tctctgcgcg 3660 ctcgctcgct cactgaggcc gggcgaccaa aggtcgcccg acgcccgggc ggcctcagtg 3720 agcgagcgag cgcgcagctg cctgcagg 3748 <210> 36 <211> 4327 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> IL2RG HA-P2A-mCherry-T2A-CNb30-P2A-ER-FRB-IL2RB-P2A-ER-FKBP-fusion-IL2R G HA <400> 36 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60 gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120 actccatcac taggggttcc tgcggcccgc ggcaacctct agaaatcaag gtttttctgt 180 gtagggttgg gttagcgtgt tgttagagta ggggagtgga ttgagaagga ggctgagggg 240 tactcaaggg ggctatagaa tgtataggat ttccctgaag cattcctaga gagcctgcaa 300 ggtgaagatg gctttggaac cagctggatc taggctgtgc cacatactac ctctttggcc 360 ttggccacat ccctaaactc ttggattctg tttcctaaga tgtaagatgg aggtaattgt 420 tcctgcctca caggagctgt tgtgaggatt aaacagagag tatgtcttta gcgcggtgcc 480 tggcaccagt gcctggcatg tagtaggggc acaacaaata taaggtccac tttgcttttc 540 ttttttctat agggaagcgg agctactaac ttcagcctgc tgaagcaggc tggagacgtg 600 gaggagaacc ctggacctat ggtgagcaag ggcgaggagg ataacatggc catcatcaag 660 gagttcatgc gcttcaaggt gcacatggag ggctccgtga acggccacga gttcgagatc 720 gagggcgagg gcgagggccg cccctacgag ggcacccaga ccgccaagct gaaggtgacc 780 aagggtggcc ccctgccctt cgcctgggac atcctgtccc ctcagttcat gtacggctcc 840 aaggcctacg tgaagcaccc cgccgacatc cccgactact tgaagctgtc cttccccgag 900 ggcttcaagt gggagcgcgt gatgaacttc gaggacggcg gcgtggtgac cgtgacccag 960 gactcctccc tgcaggacgg cgagttcatc tacaaggtga agctgcgcgg caccaacttc 1020 ccctccgacg gccccgtaat gcagaagaag accatgggct gggaggcctc ctccgagcgg 1080 atgtaccccg aggacggcgc cctgaagggc gagatcaagc agaggctgaa gctgaaggac 1140 ggcggccact acgacgctga ggtcaagacc acctacaagg ccaagaagcc cgtgcagctg 1200 cccggcgcct acaacgtcaa catcaagttg gacatcacct cccacaacga ggactacacc 1260 atcgtggaac agtacgaacg cgccgagggc cgccactcca ccggcggcat ggacgagctg 1320 tacaagggtt ccggggaggg ccgagggtca ttgctgacgt gtggagacgt ggaggagaat 1380 cctggcccca tgggcaacga ggccagctac cctctggaga tgtgctccca cttcgacgcc 1440 gacgagatca agcggctggg caagcgcttc aagaagctgg acctggacaa cagcggcagc 1500 ctgagcgtgg aggagtttat gtctctgccc gagctgcagc agaaccccct ggtgcagcgc 1560 gtgatcgaca tcttcgacac cgacggcaac ggcgaggtgg acttcaagga gttcatcgag 1620 ggcgtgagcc agttcagcgt gaagggcgac aaggagcaga agctgcggtt cgccttccgg 1680 atctacgata tggataaaga tggctatatt tctaatggcg agctgttcca ggtgctgaag 1740 atgatggtgg gcaacaatac caagctggcc gatacccagc tgcagcagat cgtggacaag 1800 accatcatca acgccgacaa ggacggcgac ggcagaatca gcttcgagga gttctgtgcc 1860 gtggtgggag gcctggatat tcacaaaaaa atggtggtgg acgtgggatc cggcgctaca 1920 aatttttcac tgctgaaaca ggcgggtgat gtggaggaga accctggacc catgccactt 1980 ggcctgctct ggctgggctt ggcattgctc ggcgcgctcc acgcccaggc tgaactgatc 2040 cgcgtggcca tattgtggca tgagatgtgg catgagggat tggaggaggc gagtaggctg 2100 tactttgggg aaaggaatgt taaagggatg tttgaggtcc ttgaacccct ccacgctatg 2160 atggaaagag gacctcaaac gcttaaagag acgtcattca atcaagccta tggacgggat 2220 cttatggaag ctcaagaatg gtgtcgaaaa tacatgaaaa gcgggaatgt taaggacctc 2280 acgcaagcct gggatctgta ttaccatgtt ttccgacgca tttctaaaca aggaaaagat 2340 actatcccat ggttggggca cttgctcgtt gggctcagtg gggcgtttgg attcatcatc 2400 ctcgtatatc tgttgattaa ttgtcggaac acaggtccct ggcttaaaaa agttttgaag 2460 tgtaacaccc cggatccttc taaatttttt agtcaactta gttcagaaca cgggggcgat 2520 gttcaaaagt ggctgagttc cccgtttccc agttcaagtt tctcccctgg gggtctcgcc 2580 cccgagatat cacctcttga agtgctcgag cgggacaaag ttacacagct tcttttgcaa 2640 caggataagg ttccggagcc ggcgtctctc agctctaacc attcactcac ttcttgtttc 2700 accaaccaag ggtatttttt cttccatctg cctgatgcct tggagattga ggcttgtcag 2760 gtgtacttta cctatgaccc ctatagtgag gaagaccctg acgaaggcgt agctggcgcc 2820 cccactggct ccagtccaca gcctcttcag cctctgtcag gggaggacga cgcatattgt 2880 acgttcccct cacgggacga ccttctgctg ttttcaccct cactgctcgg cggaccctcc 2940 ccgccaagca cggcacctgg ggggagtggg gcaggagaag aaaggatgcc tcctagtttg 3000 caggagcggg ttcctcgcga ctgggatccg caacccctcg gaccacccac ccctggcgta 3060 cctgatctgg tcgacttcca accacctccg gagcttgtcc tcagagaggc cggagaggaa 3120 gtcccagacg cggggccaag agagggtgtg tcatttccct ggtcccgccc tccgggacag 3180 ggtgagtttc gggcgctgaa tgcgaggctc ccccttaata ccgatgcgta cctgtcattg 3240 caggaacttc agggccagga tcctacccac ctggtgggat ccggcgctac aaatttttca 3300 ctgctgaaac aggcgggtga tgtggaggag aaccctggac ccatgcctct gggcctgctg 3360 tggctgggcc tggccctgct gggcgccctg cacgcccagg ccggcgtgca ggtggagaca 3420 atctccccag gcgacggacg cacattccct aagcggggcc agacctgcgt ggtgcactat 3480 acaggcatgc tggaggatgg caagaagttt gacagctccc gggatagaaa caagccattc 3540 aagtttatgc tgggcaagca ggaagtgatc agaggctggg aggagggcgt ggcccagatg 3600 tctgtgggcc agagggccaa gctgaccatc agcccagact acgcctatgg agcaacaggc 3660 cacccaggaa tcatcccacc tcacgccacc ctggtgttcg atgtggagct gctgaagctg 3720 ggcgagggca gcaacaccag caaagagaat cctttcctgt ttgcattgga agccgtggtt 3780 atctctgttg gctccatggg attgattatc agccttctct gtgtgtattt ctggctggaa 3840 cggtgagatt tggagaagcc cagaaaaatg aggggaacgg tagctgacaa tagcagagga 3900 gggttttgca gggtctttag gagtaaagga tgagacagta agtaatgaga gattacccaa 3960 gagggtttgg tgatggaagg aagccacagg cacagagaac acagaatcac tttatttcat 4020 atgggacaac tgggagaagg gtgataaaaa agctttaacc tatgtgctcc tgctccctct 4080 ttctcccctg tcaggacgat gccccgaatt cccaccctga agaacctaga ggatcttgtt 4140 actgaatacc acgggaactt ttcggtgaga acgctgtcat caattgcctt aggccgcagg 4200 aacccctagt gatggagttg gccactccct ctctgcgcgc tcgctcgctc actgaggccg 4260 ggcgaccaaa ggtcgcccga cgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagctgc 4320 ctgcagg 4327 <210> 37 <211> 4800 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> TRAC HA TRAC 2-synpA-MND-Kozak-CNb30-P2A-tLNGFR-ER-FRB-IL2RB-WPRE3-BGHpA-HA TRAC 2 <400> 37 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60 gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120 actccatcac taggggttcc tgcggcccgc ggcggcttgt gcctgtccct gagtcccagt 180 ccatcacgag cagctggttt ctaagatgct atttcccgta taaagcatga gaccgtgact 240 tgccagcccc acagagcccc gcccttgtcc atcactggca tctggactcc agcctgggtt 300 ggggcaaaga gggaaatgag atcatgtcct aaccctgatc ctcttgtccc acagatatcc 360 agaaccctga ccctgccgtg taccagctga gagactctaa atccagtgac aagtctgtct 420 gcctattcac cgattttgat tctcaaacaa atgtgtcaca aagtaaggat tctgatgtgt 480 atatcacaga caaaactgtg ctagacatga ggtctatgga cttcaagagc aacagtgctg 540 tttaattaaa tgaaataaaa gatctttatt ttcattagat ctgtgtgttg gttttttgtg 600 tgaacagaga aacaggagaa tatgggccaa acaggatatc tgtggtaagc agttcctgcc 660 ccggctcagg gccaagaaca gttggaacag cagaatatgg gccaaacagg atatctgtgg 720 taagcagttc ctgccccggc tcagggccaa gaacagatgg tccccagatg cggtcccgcc 780 ctcagcagtt tctagagaac catcagatgt ttccagggtg ccccaaggac ctgaaatgac 840 cctgtgcctt atttgaacta accaatcagt tcgcttctcg cttctgttcg cgcgcttctg 900 ctccccgagc tctatataag cagagctcgt ttagtgaacc gtcagatcgc cgccaccatg 960 ggcaacgagg ccagctaccc tctggagatg tgctcccact tcgacgccga cgagatcaag 1020 cggctgggca agcgcttcaa gaagctggac ctggacaaca gcggcagcct gagcgtggag 1080 gagtttatgt ctctgcccga gctgcagcag aaccccctgg tgcagcgcgt gatcgacatc 1140 ttcgacaccg acggcaacgg cgaggtggac ttcaaggagt tcatcgaggg cgtgagccag 1200 ttcagcgtga agggcgacaa ggagcagaag ctgcggttcg ccttccggat ctacgatatg 1260 gataaagatg gctatatttc taatggcgag ctgttccagg tgctgaagat gatggtgggc 1320 aacaatacca agctggccga tacccagctg cagcagatcg tggacaagac catcatcaac 1380 gccgacaagg acggcgacgg cagaatcagc ttcgaggagt tctgtgccgt ggtgggaggc 1440 ctggatattc acaaaaaaat ggtggtggac gtgggaagcg gagctactaa cttcagcctg 1500 ctgaagcagg ctggagacgt ggaggagaac cctggaccta tgggtgctgg cgcaactgga 1560 cgcgctatgg atggacctcg cttgctgctt cttctgcttc tcggggtctc tttgggtggt 1620 gctaaggaag catgcccaac gggactttat acgcatagcg gagagtgttg caaagcttgt 1680 aacctgggcg aaggcgtcgc gcaaccttgt ggtgcaaatc aaaccgtctg cgagccatgt 1740 ttggactctg ttacgtttag tgacgtagta tctgcgacag agccatgcaa gccttgtacg 1800 gaatgtgtag gattgcagag catgtctgcc ccttgtgtag aagccgacga tgcagtttgc 1860 aggtgcgcgt atggctatta ccaagacgaa acaaccggac gatgtgaagc ttgccgagtt 1920 tgtgaagcgg gttccgggct tgtattctcc tgtcaggata agcagaacac cgtctgcgaa 1980 gagtgccccg atggtaccta cagcgatgaa gcgaaccatg tagacccatg cctgccttgc 2040 accgtttgtg aagacacgga acgacagttg cgggaatgta cccggtgggc agacgccgag 2100 tgcgaagaga ttccaggccg ctggatcacg cgaagtaccc cgccagaagg ttccgacagt 2160 actgcaccaa gcacccaaga accagaggcg ccccccgagc aggacctgat tgcctccacc 2220 gtggcgggtg ttgttactac ggttatgggc tcatcccagc ccgttgttac ccgaggaact 2280 acagacaacc tgattccggt atattgttct atcttggcgg ctgtagtagt tggcttggtc 2340 gcgtacatcg ctttcaaaag aggatccggc gctacaaatt tttcactgct gaaacaggcg 2400 ggtgatgtgg aggagaaccc tggacccatg ccacttggcc tgctctggct gggcttggca 2460 ttgctcggcg cgctccacgc ccaggctgaa ctgatccgcg tggccatatt gtggcatgag 2520 atgtggcatg agggattgga ggaggcgagt aggctgtact ttggggaaag gaatgttaaa 2580 gggatgtttg aggtccttga acccctccac gctatgatgg aaagaggacc tcaaacgctt 2640 aaagagacgt cattcaatca agcctatgga cgggatctta tggaagctca agaatggtgt 2700 cgaaaataca tgaaaagcgg gaatgttaag gacctcacgc aagcctggga tctgtattac 2760 catgttttcc gacgcatttc taaacaagga aaagatacta tcccatggtt ggggcacttg 2820 ctcgttgggc tcagtggggc gtttggattc atcatcctcg tatatctgtt gattaattgt 2880 cggaacacag gtccctggct taaaaaagtt ttgaagtgta acaccccgga tccttctaaa 2940 ttttttagtc aacttagttc agaacacggg ggcgatgttc aaaagtggct gagttccccg 3000 tttcccagtt caagtttctc ccctgggggt ctcgcccccg agatatcacc tcttgaagtg 3060 ctcgagcggg acaaagttac acagcttctt ttgcaacagg ataaggttcc ggagccggcg 3120 tctctcagct ctaaccattc actcacttct tgtttcacca accaagggta ttttttcttc 3180 catctgcctg atgccttgga gattgaggct tgtcaggtgt actttaccta tgacccctat 3240 agtgaggaag accctgacga aggcgtagct ggcgccccca ctggctccag tccacagcct 3300 cttcagcctc tgtcagggga ggacgacgca tattgtacgt tcccctcacg ggacgacctt 3360 ctgctgtttt caccctcact gctcggcgga ccctccccgc caagcacggc acctgggggg 3420 agtggggcag gagaagaaag gatgcctcct agtttgcagg agcgggttcc tcgcgactgg 3480 gatccgcaac ccctcggacc acccacccct ggcgtacctg atctggtcga cttccaacca 3540 cctccggagc ttgtcctcag agaggccgga gaggaagtcc cagacgcggg gccaagagag 3600 ggtgtgtcat ttccctggtc ccgccctccg ggacagggtg agtttcgggc gctgaatgcg 3660 aggctccccc ttaataccga tgcgtacctg tcattgcagg aacttcaggg ccaggatcct 3720 acccacctgg tgtgagtaag ataatcaacc tctggattac aaaatttgtg aaagattgac 3780 tggtattctt aactatgttg ctccttttac gctatgtgga tacgctgctt taatgccttt 3840 gtatcatgct attgcttccc gtatggcttt cattttctcc tccttgtata aatcctggtt 3900 agttcttgcc acggcggaac tcatcgccgc ctgccttgcc cgctgctgga caggggctcg 3960 gctgttgggc actgacaatt ccgtggtgtg ccttctagtt gccagccatc tgttgtttgc 4020 ccctcccccg tgccttcctt gaccctggaa ggtgccactc ccactgtcct ttcctaataa 4080 aatgaggaaa ttgcatcgca ttgtctgagt aggtgtcatt ctattctggg gggtggggtg 4140 gggcaggaca gcaaggggga ggattgggaa gacaatagca ggcatgctgg ggatgcggtg 4200 ggctctacgc cggcgagcaa caaatctgac tttgcatgtg caaacgcctt caacaacagc 4260 attattccag aagacacctt cttccccagc ccaggtaagg gcagctttgg tgccttcgca 4320 ggctgtttcc ttgcttcagg aatggccagg ttctgcccag agctctggtc aatgatgtct 4380 aaaactcctc tgattggtgg tctcggcctt atccattgcc accaaaaccc tctttttact 4440 aagaaacagt gagccttgtt ctggcagtcc agagaatgac acgggaaaaa agcagatgaa 4500 gagaaggtgg caggagaggg cacgtggccc agcctcagtc tctccaactg agttcctgcc 4560 tgcctgcctt tgctcagact gtttgcccct tactgctctt ctaggcctca ttctaagccc 4620 cttctccaag ttgcctccta gggaattgcc ttaggccgca ggaaccccta gtgatggagt 4680 tggccactcc ctctctgcgc gctcgctcgc tcactgaggc cgggcgacca aaggtcgccc 4740 gacgcccggg ctttgcccgg gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgcagc tgcctgcagg 4800 <210> 38 <211> 4800 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> TRAC HA TRAC 3-synpA-MND-Kozak-CNb30-P2A-tLNGFR-ER-FRB-IL2RB-WPRE3-BGHpA-HA TRAC 3 <400> 38 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60 gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120 actccatcac taggggttcc tgcggcccgc ggcggtgcct ttactctgcc agagttatat 180 tgctggggtt ttgaagaaga tcctattaaa taaaagaata agcagtatta ttaagtagcc 240 ctgcatttca ggtttccttg agtggcaggc caggcctggc cgtgaacgtt cactgaaatc 300 atggcctctt ggccaagatt gatagcttgt gcctgtccct gagtcccagt ccatcacgag 360 cagctggttt ctaagatgct atttcccgta taaagcatga gaccgtgact tgccagcccc 420 acagagcccc gcccttgtcc atcactggca tctggactcc agcctgggtt ggggcaaaga 480 gggaaatgag atcatgtcct aaccctgatc ctcttgtccc acagatatcc agaaccctga 540 cttaattaaa tgaaataaaa gatctttatt ttcattagat ctgtgtgttg gttttttgtg 600 tgaacagaga aacaggagaa tatgggccaa acaggatatc tgtggtaagc agttcctgcc 660 ccggctcagg gccaagaaca gttggaacag cagaatatgg gccaaacagg atatctgtgg 720 taagcagttc ctgccccggc tcagggccaa gaacagatgg tccccagatg cggtcccgcc 780 ctcagcagtt tctagagaac catcagatgt ttccagggtg ccccaaggac ctgaaatgac 840 cctgtgcctt atttgaacta accaatcagt tcgcttctcg cttctgttcg cgcgcttctg 900 ctccccgagc tctatataag cagagctcgt ttagtgaacc gtcagatcgc cgccaccatg 960 ggcaacgagg ccagctaccc tctggagatg tgctcccact tcgacgccga cgagatcaag 1020 cggctgggca agcgcttcaa gaagctggac ctggacaaca gcggcagcct gagcgtggag 1080 gagtttatgt ctctgcccga gctgcagcag aaccccctgg tgcagcgcgt gatcgacatc 1140 ttcgacaccg acggcaacgg cgaggtggac ttcaaggagt tcatcgaggg cgtgagccag 1200 ttcagcgtga agggcgacaa ggagcagaag ctgcggttcg ccttccggat ctacgatatg 1260 gataaagatg gctatatttc taatggcgag ctgttccagg tgctgaagat gatggtgggc 1320 aacaatacca agctggccga tacccagctg cagcagatcg tggacaagac catcatcaac 1380 gccgacaagg acggcgacgg cagaatcagc ttcgaggagt tctgtgccgt ggtgggaggc 1440 ctggatattc acaaaaaaat ggtggtggac gtgggaagcg gagctactaa cttcagcctg 1500 ctgaagcagg ctggagacgt ggaggagaac cctggaccta tgggtgctgg cgcaactgga 1560 cgcgctatgg atggacctcg cttgctgctt cttctgcttc tcggggtctc tttgggtggt 1620 gctaaggaag catgcccaac gggactttat acgcatagcg gagagtgttg caaagcttgt 1680 aacctgggcg aaggcgtcgc gcaaccttgt ggtgcaaatc aaaccgtctg cgagccatgt 1740 ttggactctg ttacgtttag tgacgtagta tctgcgacag agccatgcaa gccttgtacg 1800 gaatgtgtag gattgcagag catgtctgcc ccttgtgtag aagccgacga tgcagtttgc 1860 aggtgcgcgt atggctatta ccaagacgaa acaaccggac gatgtgaagc ttgccgagtt 1920 tgtgaagcgg gttccgggct tgtattctcc tgtcaggata agcagaacac cgtctgcgaa 1980 gagtgccccg atggtaccta cagcgatgaa gcgaaccatg tagacccatg cctgccttgc 2040 accgtttgtg aagacacgga acgacagttg cgggaatgta cccggtgggc agacgccgag 2100 tgcgaagaga ttccaggccg ctggatcacg cgaagtaccc cgccagaagg ttccgacagt 2160 actgcaccaa gcacccaaga accagaggcg ccccccgagc aggacctgat tgcctccacc 2220 gtggcgggtg ttgttactac ggttatgggc tcatcccagc ccgttgttac ccgaggaact 2280 acagacaacc tgattccggt atattgttct atcttggcgg ctgtagtagt tggcttggtc 2340 gcgtacatcg ctttcaaaag aggatccggc gctacaaatt tttcactgct gaaacaggcg 2400 ggtgatgtgg aggagaaccc tggacccatg ccacttggcc tgctctggct gggcttggca 2460 ttgctcggcg cgctccacgc ccaggctgaa ctgatccgcg tggccatatt gtggcatgag 2520 atgtggcatg agggattgga ggaggcgagt aggctgtact ttggggaaag gaatgttaaa 2580 gggatgtttg aggtccttga acccctccac gctatgatgg aaagaggacc tcaaacgctt 2640 aaagagacgt cattcaatca agcctatgga cgggatctta tggaagctca agaatggtgt 2700 cgaaaataca tgaaaagcgg gaatgttaag gacctcacgc aagcctggga tctgtattac 2760 catgttttcc gacgcatttc taaacaagga aaagatacta tcccatggtt ggggcacttg 2820 ctcgttgggc tcagtggggc gtttggattc atcatcctcg tatatctgtt gattaattgt 2880 cggaacacag gtccctggct taaaaaagtt ttgaagtgta acaccccgga tccttctaaa 2940 ttttttagtc aacttagttc agaacacggg ggcgatgttc aaaagtggct gagttccccg 3000 tttcccagtt caagtttctc ccctgggggt ctcgcccccg agatatcacc tcttgaagtg 3060 ctcgagcggg acaaagttac acagcttctt ttgcaacagg ataaggttcc ggagccggcg 3120 tctctcagct ctaaccattc actcacttct tgtttcacca accaagggta ttttttcttc 3180 catctgcctg atgccttgga gattgaggct tgtcaggtgt actttaccta tgacccctat 3240 agtgaggaag accctgacga aggcgtagct ggcgccccca ctggctccag tccacagcct 3300 cttcagcctc tgtcagggga ggacgacgca tattgtacgt tcccctcacg ggacgacctt 3360 ctgctgtttt caccctcact gctcggcgga ccctccccgc caagcacggc acctgggggg 3420 agtggggcag gagaagaaag gatgcctcct agtttgcagg agcgggttcc tcgcgactgg 3480 gatccgcaac ccctcggacc acccacccct ggcgtacctg atctggtcga cttccaacca 3540 cctccggagc ttgtcctcag agaggccgga gaggaagtcc cagacgcggg gccaagagag 3600 ggtgtgtcat ttccctggtc ccgccctccg ggacagggtg agtttcgggc gctgaatgcg 3660 aggctccccc ttaataccga tgcgtacctg tcattgcagg aacttcaggg ccaggatcct 3720 acccacctgg tgtgagtaag ataatcaacc tctggattac aaaatttgtg aaagattgac 3780 tggtattctt aactatgttg ctccttttac gctatgtgga tacgctgctt taatgccttt 3840 gtatcatgct attgcttccc gtatggcttt cattttctcc tccttgtata aatcctggtt 3900 agttcttgcc acggcggaac tcatcgccgc ctgccttgcc cgctgctgga caggggctcg 3960 gctgttgggc actgacaatt ccgtggtgtg ccttctagtt gccagccatc tgttgtttgc 4020 ccctcccccg tgccttcctt gaccctggaa ggtgccactc ccactgtcct ttcctaataa 4080 aatgaggaaa ttgcatcgca ttgtctgagt aggtgtcatt ctattctggg gggtggggtg 4140 gggcaggaca gcaaggggga ggattgggaa gacaatagca ggcatgctgg ggatgcggtg 4200 ggctctacgc cggcgtacca gctgagagac tctaaatcca gtgacaagtc tgtctgccta 4260 ttcaccgatt ttgattctca aacaaatgtg tcacaaagta aggattctga tgtgtatatc 4320 acagacaaaa ctgtgctaga catgaggtct atggacttca agagcaacag tgctgtggcc 4380 tggagcaaca aatctgactt tgcatgtgca aacgccttca acaacagcat tattccagaa 4440 gacaccttct tccccagccc aggtaagggc agctttggtg ccttcgcagg ctgtttcctt 4500 gcttcaggaa tggccaggtt ctgcccagag ctctggtcaa tgatgtctaa aactcctctg 4560 attggtggtc tcggccttat ccattgccac caaaaccctc tttttactaa gaaacagtga 4620 gccttgttct ggcagtccta gggaattgcc ttaggccgca ggaaccccta gtgatggagt 4680 tggccactcc ctctctgcgc gctcgctcgc tcactgaggc cgggcgacca aaggtcgccc 4740 gacgcccggg ctttgcccgg gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgcagc tgcctgcagg 4800 <210> 39 <211> 4814 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> TRAC HA TRAC 1-synpA-MND-Kozak-CNb30-P2A-tLNGFR-ER-FRB-IL2RB-WPRE3-BGHpA-HA TRAC 1 pCB0045 <400> 39 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60 gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120 actccatcac taggggttcc tgcggcccgc ggcggccgcg ccaggcctgg ccgtgaacgt 180 tcactgaaat catggcctct tggccaagat tgatagcttg tgcctgtccc tgagtcccag 240 tccatcacga gcagctggtt tctaagatgc tatttcccgt ataaagcatg agaccgtgac 300 ttgccagccc cacagagccc cgcccttgtc catcactggc atctggactc cagcctgggt 360 tggggcaaag agggaaatga gatcatgtcc taaccctgat cctcttgtcc cacagatatc 420 cagaaccctg accctgccgt gtaccagctg agagactcta aatccagtga caagtctgtc 480 tgcctattca ccgattttga ttctcaaaca aatgtgtcac aaagtaagga ttctgatgtg 540 tatatcacat gttaattaaa tgaaataaaa gatctttatt ttcattagat ctgtgtgttg 600 gttttttgtg tgaacagaga aacaggagaa tatgggccaa acaggatatc tgtggtaagc 660 agttcctgcc ccggctcagg gccaagaaca gttggaacag cagaatatgg gccaaacagg 720 atatctgtgg taagcagttc ctgccccggc tcagggccaa gaacagatgg tccccagatg 780 cggtcccgcc ctcagcagtt tctagagaac catcagatgt ttccagggtg ccccaaggac 840 ctgaaatgac cctgtgcctt atttgaacta accaatcagt tcgcttctcg cttctgttcg 900 cgcgcttctg ctccccgagc tctatataag cagagctcgt ttagtgaacc gtcagatcgc 960 cgccaccatg ggcaacgagg ccagctaccc tctggagatg tgctcccact tcgacgccga 1020 cgagatcaag cggctgggca agcgcttcaa gaagctggac ctggacaaca gcggcagcct 1080 gagcgtggag gagtttatgt ctctgcccga gctgcagcag aaccccctgg tgcagcgcgt 1140 gatcgacatc ttcgacaccg acggcaacgg cgaggtggac ttcaaggagt tcatcgaggg 1200 cgtgagccag ttcagcgtga agggcgacaa ggagcagaag ctgcggttcg ccttccggat 1260 ctacgatatg gataaagatg gctatatttc taatggcgag ctgttccagg tgctgaagat 1320 gatggtgggc aacaatacca agctggccga tacccagctg cagcagatcg tggacaagac 1380 catcatcaac gccgacaagg acggcgacgg cagaatcagc ttcgaggagt tctgtgccgt 1440 ggtgggaggc ctggatattc acaaaaaaat ggtggtggac gtgggaagcg gagctactaa 1500 cttcagcctg ctgaagcagg ctggagacgt ggaggagaac cctggaccta tgggtgctgg 1560 cgcaactgga cgcgctatgg atggacctcg cttgctgctt cttctgcttc tcggggtctc 1620 tttgggtggt gctaaggaag catgcccaac gggactttat acgcatagcg gagagtgttg 1680 caaagcttgt aacctgggcg aaggcgtcgc gcaaccttgt ggtgcaaatc aaaccgtctg 1740 cgagccatgt ttggactctg ttacgtttag tgacgtagta tctgcgacag agccatgcaa 1800 gccttgtacg gaatgtgtag gattgcagag catgtctgcc ccttgtgtag aagccgacga 1860 tgcagtttgc aggtgcgcgt atggctatta ccaagacgaa acaaccggac gatgtgaagc 1920 ttgccgagtt tgtgaagcgg gttccgggct tgtattctcc tgtcaggata agcagaacac 1980 cgtctgcgaa gagtgccccg atggtaccta cagcgatgaa gcgaaccatg tagacccatg 2040 cctgccttgc accgtttgtg aagacacgga acgacagttg cgggaatgta cccggtgggc 2100 agacgccgag tgcgaagaga ttccaggccg ctggatcacg cgaagtaccc cgccagaagg 2160 ttccgacagt actgcaccaa gcacccaaga accagaggcg ccccccgagc aggacctgat 2220 tgcctccacc gtggcgggtg ttgttactac ggttatgggc tcatcccagc ccgttgttac 2280 ccgaggaact acagacaacc tgattccggt atattgttct atcttggcgg ctgtagtagt 2340 tggcttggtc gcgtacatcg ctttcaaaag aggatccggc gctacaaatt tttcactgct 2400 gaaacaggcg ggtgatgtgg aggagaaccc tggacccatg ccacttggcc tgctctggct 2460 gggcttggca ttgctcggcg cgctccacgc ccaggctgaa ctgatccgcg tggccatatt 2520 gtggcatgag atgtggcatg agggattgga ggaggcgagt aggctgtact ttggggaaag 2580 gaatgttaaa gggatgtttg aggtccttga acccctccac gctatgatgg aaagaggacc 2640 tcaaacgctt aaagagacgt cattcaatca agcctatgga cgggatctta tggaagctca 2700 agaatggtgt cgaaaataca tgaaaagcgg gaatgttaag gacctcacgc aagcctggga 2760 tctgtattac catgttttcc gacgcatttc taaacaagga aaagatacta tcccatggtt 2820 ggggcacttg ctcgttgggc tcagtggggc gtttggattc atcatcctcg tatatctgtt 2880 gattaattgt cggaacacag gtccctggct taaaaaagtt ttgaagtgta acaccccgga 2940 tccttctaaa ttttttagtc aacttagttc agaacacggg ggcgatgttc aaaagtggct 3000 gagttccccg tttcccagtt caagtttctc ccctgggggt ctcgcccccg agatatcacc 3060 tcttgaagtg ctcgagcggg acaaagttac acagcttctt ttgcaacagg ataaggttcc 3120 ggagccggcg tctctcagct ctaaccattc actcacttct tgtttcacca accaagggta 3180 ttttttcttc catctgcctg atgccttgga gattgaggct tgtcaggtgt actttaccta 3240 tgacccctat agtgaggaag accctgacga aggcgtagct ggcgccccca ctggctccag 3300 tccacagcct cttcagcctc tgtcagggga ggacgacgca tattgtacgt tcccctcacg 3360 ggacgacctt ctgctgtttt caccctcact gctcggcgga ccctccccgc caagcacggc 3420 acctgggggg agtggggcag gagaagaaag gatgcctcct agtttgcagg agcgggttcc 3480 tcgcgactgg gatccgcaac ccctcggacc acccacccct ggcgtacctg atctggtcga 3540 cttccaacca cctccggagc ttgtcctcag agaggccgga gaggaagtcc cagacgcggg 3600 gccaagagag ggtgtgtcat ttccctggtc ccgccctccg ggacagggtg agtttcgggc 3660 gctgaatgcg aggctccccc ttaataccga tgcgtacctg tcattgcagg aacttcaggg 3720 ccaggatcct acccacctgg tgtgagtaag ataatcaacc tctggattac aaaatttgtg 3780 aaagattgac tggtattctt aactatgttg ctccttttac gctatgtgga tacgctgctt 3840 taatgccttt gtatcatgct attgcttccc gtatggcttt cattttctcc tccttgtata 3900 aatcctggtt agttcttgcc acggcggaac tcatcgccgc ctgccttgcc cgctgctgga 3960 caggggctcg gctgttgggc actgacaatt ccgtggtgtg ccttctagtt gccagccatc 4020 tgttgtttgc ccctcccccg tgccttcctt gaccctggaa ggtgccactc ccactgtcct 4080 ttcctaataa aatgaggaaa ttgcatcgca ttgtctgagt aggtgtcatt ctattctggg 4140 gggtggggtg gggcaggaca gcaaggggga ggattgggaa gacaatagca ggcatgctgg 4200 ggatgcggtg ggctctacgc cggcgtggcg gtctatggac ttcaagagca acagtgctgt 4260 ggcctggagc aacaaatctg actttgcatg tgcaaacgcc ttcaacaaca gcattattcc 4320 agaagacacc ttcttcccca gcccaggtaa gggcagcttt ggtgccttcg caggctgttt 4380 ccttgcttca ggaatggcca ggttctgccc agagctctgg tcaatgatgt ctaaaactcc 4440 tctgattggt ggtctcggcc ttatccattg ccaccaaaac cctcttttta ctaagaaaca 4500 gtgagccttg ttctggcagt ccagagaatg acacgggaaa aaagcagatg aagagaaggt 4560 ggcaggagag ggcacgtggc ccagcctcag tctctccaac tgagttcctg cctgcctgcc 4620 tttgctcaga ctgtttgccc cttactgctc cctagggaat tgccttaggc cgcaggaacc 4680 cctagtgatg gagttggcca ctccctctct gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg 4740 accaaaggtc gcccgacgcc cgggctttgc ccgggcggcc tcagtgagcg agcgagcgcg 4800 cagctgcctg cagg 4814 <210> 40 <211> 3210 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> IL2RG HA-MND-Kozak-Naked FRB-P2A-B2M-CD8-41bbzeta-P2A-ER-FKBP-fusion-IL2RG HA pCB0046 <400> 40 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60 gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120 actccatcac taggggttcc tgcggcccgc ggcaacctct agaaatcaag gtttttctgt 180 gtagggttgg gttagcgtgt tgttagagta ggggagtgga ttgagaagga ggctgagggg 240 tactcaaggg ggctatagaa tgtataggat ttccctgaag cattcctaga gagcctgcaa 300 ggtgaagatg gctttggaac cagctggatc taggctgtgc cacatactac ctctttggcc 360 ttggccacat ccctaaactc ttggattctg tttcctaaga tgtaagatgg aggtaattgt 420 tcctgcctca caggagctgt tgtgaggatt aaacagagag tatgtcttta gcgcggtgcc 480 tggcaccagt gcctggcatg tagtaggggc acaacaaata taaggtccac tttgcttttc 540 ttttttctat agttcgtgtg aacagagaaa caggagaata tgggccaaac aggatatctg 600 tggtaagcag ttcctgcccc ggctcagggc caagaacagt tggaacagca gaatatgggc 660 caaacaggat atctgtggta agcagttcct gccccggctc agggccaaga acagatggtc 720 cccagatgcg gtcccgccct cagcagtttc tagagaacca tcagatgttt ccagggtgcc 780 ccaaggacct gaaatgaccc tgtgccttat ttgaactaac caatcagttc gcttctcgct 840 tctgttcgcg cgcttctgct ccccgagctc tatataagca gagctcgttt agtgaaccgt 900 cagatcgccg ccaccatgga gatgtggcat gagggtctgg aagaagcgtc tcgactgtac 960 tttggtgagc gcaatgtgaa gggcatgttt gaagtcctcg aaccccttca tgccatgatg 1020 gaacgcggac cccagacctt gaaggagaca agttttaacc aagcttacgg aagagacctg 1080 atggaagccc aggaatggtg caggaaatac atgaaaagcg ggaatgtgaa ggacttgctc 1140 caagcgtggg acctgtacta tcatgtcttt aggcgcatta gtaagggatc cggcgctaca 1200 aatttttcac tgctgaaaca ggcgggtgat gtggaggaga accctggacc catgagcagg 1260 tcagtggcgt tggcggttct ggcgcttttg agtttgagcg gactggaagc catccaacga 1320 acgcctaaga tccaggtata ttcacgccac ccggcggaaa acggcaaaag taacttcctt 1380 aattgttatg tgtctggctt ccacccgtct gatattgagg tggacctcct taaaaacggt 1440 gaacggatcg agaaagtgga gcattccgat cttagtttca gtaaggattg gagcttttac 1500 cttctctatt acactgagtt cactccgact gaaaaggatg agtacgcctg tcgggtcaac 1560 cacgtcaccc tgtctcaacc aaaaatagtc aaatgggaca gagatatgtc agatatttac 1620 atatgggcac cacttgcggg cacgtgtggc gtcctgcttc tgagtctcgt cattacgctt 1680 tattgtaaac ggggtagaaa aaaactcctt tatatattta aacagccatt tatgcggcca 1740 gttcaaacga cgcaggaaga agacggctgt agttgcagat ttccagagga agaggaaggt 1800 ggatgcgagc ttcgggtcaa gtttagtagg tctgcagacg ctcccgccta tcaacagggt 1860 cagaatcagc tttataacga actcaacctc ggtcgccgag aagagtacga cgtactcgat 1920 aaaagaaggg gtagagaccc ggaaatgggg ggcaaaccgc gccgcaaaaa tccacaagag 1980 gggctttata atgagcttca aaaagacaaa atggccgaag catacagtga gattgggatg 2040 aaaggtgaac gcagaagagg taagggtcac gacgggctgt accagggttt gtcaactgcc 2100 acaaaggata cttatgacgc tctgcatatg caagctcttc ccccacgcgg atccggcgct 2160 acaaattttt cactgctgaa acaggcgggt gatgtggagg agaaccctgg acccatgcct 2220 ctgggcctgc tgtggctggg cctggccctg ctgggcgccc tgcacgccca ggccggcgtg 2280 caggtggaga caatctcccc aggcgacgga cgcacattcc ctaagcgggg ccagacctgc 2340 gtggtgcact atacaggcat gctggaggat ggcaagaagt ttgacagctc ccgggataga 2400 aacaagccat tcaagtttat gctgggcaag caggaagtga tcagaggctg ggaggagggc 2460 gtggcccaga tgtctgtggg ccagagggcc aagctgacca tcagcccaga ctacgcctat 2520 ggagcaacag gccacccagg aatcatccca cctcacgcca ccctggtgtt cgatgtggag 2580 ctgctgaagc tgggcgaggg cagcaacacc agcaaagaga atcctttcct gtttgcattg 2640 gaagccgtgg ttatctctgt tggctccatg ggattgatta tcagccttct ctgtgtgtat 2700 ttctggctgg aacggtgaga tttggagaag cccagaaaaa tgaggggaac ggtagctgac 2760 aatagcagag gagggttttg cagggtcttt aggagtaaag gatgagacag taagtaatga 2820 gagattaccc aagagggttt ggtgatggaa ggaagccaca ggcacagaga acacagaatc 2880 actttatttc atatgggaca actgggagaa gggtgataaa aaagctttaa cctatgtgct 2940 cctgctccct ctttctcccc tgtcaggacg atgccccgaa ttcccaccct gaagaaccta 3000 gaggatcttg ttactgaata ccacgggaac ttttcggtga gaacgctgtc atcaattgcc 3060 ttaggccgca ggaaccccta gtgatggagt tggccactcc ctctctgcgc gctcgctcgc 3120 tcactgaggc cgggcgacca aaggtcgccc gacgcccggg ctttgcccgg gcggcctcag 3180 tgagcgagcg agcgcgcagc tgcctgcagg 3210 <210> 41 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> misc_feature <223> FKBP CISC domain <400> 41 Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly Arg Thr Phe Pro 1 5 10 15 Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly Met Leu Glu Asp 20 25 30 Gly Lys Lys Phe Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys Pro Phe Lys Phe 35 40 45 Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu Glu Gly Val Ala 50 55 60 Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu Thr Ile Ser Pro Asp Tyr 65 70 75 80 Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile Ile Pro Pro His Ala Thr 85 90 95 Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Glu 100 105 <210> 42 <211> 100 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> misc_feature <223> FRB CISC domain <400> 42 Glu Leu Ile Arg Val Ala Ile Leu Trp His Glu Met Trp His Glu Gly 1 5 10 15 Leu Glu Glu Ala Ser Arg Leu Tyr Phe Gly Glu Arg Asn Val Lys Gly 20 25 30 Met Phe Glu Val Leu Glu Pro Leu His Ala Met Met Glu Arg Gly Pro 35 40 45 Gln Thr Leu Lys Glu Thr Ser Phe Asn Gln Ala Tyr Gly Arg Asp Leu 50 55 60 Met Glu Ala Gln Glu Trp Cys Arg Lys Tyr Met Lys Ser Gly Asn Val 65 70 75 80 Lys Asp Leu Thr Gln Ala Trp Asp Leu Tyr Tyr His Val Phe Arg Arg 85 90 95 Ile Ser Lys Gln 100 <210> 43 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> misc_feature <223> ILR2g CISC fragment <400> 43 Gly Ser Asn Thr Ser Lys Glu Asn Pro Phe Leu Phe Ala Leu Glu Ala 1 5 10 15 Val Val Ile Ser Val Gly Ser Met Gly Leu Ile Ile Ser Leu Leu Cys 20 25 30 Val Tyr Phe Trp Leu Glu Arg 35 <210> 44 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> misc_feature <223> ILR2g CISC domain <400> 44 Gly Ser Asn Thr Ser Lys Glu Asn Pro Phe Leu Phe Ala Leu Glu Ala 1 5 10 15 Val Val Ile Ser Val Gly Ser Met Gly Leu Ile Ile Ser Leu Leu Cys 20 25 30 Val Tyr Phe Trp Leu Glu Arg Thr Met Pro Arg Ile Pro Thr Leu Lys 35 40 45 Asn Leu Glu Asp Leu Val Thr Glu Tyr His Gly Asn Phe Ser Ala Trp 50 55 60 Ser Gly Val Ser Lys Gly Leu Ala Glu Ser Leu Gln Pro Asp Tyr Ser 65 70 75 80 Glu Arg Leu Cys Leu Val Ser Glu Ile Pro Pro Lys Gly Gly Ala Leu 85 90 95 Gly Glu Gly Pro Gly Ala Ser Pro Cys Asn Gln His Ser Pro Tyr Trp 100 105 110 Ala Pro Pro Cys Tyr Thr Leu Lys Pro Glu Thr 115 120 <210> 45 <211> 315 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> misc_feature <223> ILR2b CISC domain <400> 45 Gly Lys Asp Thr Ile Pro Trp Leu Gly His Leu Leu Val Gly Leu Ser 1 5 10 15 Gly Ala Phe Gly Phe Ile Ile Leu Val Tyr Leu Leu Ile Asn Cys Arg 20 25 30 Asn Thr Gly Pro Trp Leu Lys Lys Val Leu Lys Cys Asn Thr Pro Asp 35 40 45 Pro Ser Lys Phe Phe Ser Gln Leu Ser Ser Glu His Gly Gly Asp Val 50 55 60 Gln Lys Trp Leu Ser Ser Pro Phe Pro Ser Ser Ser Phe Ser Pro Gly 65 70 75 80 Gly Leu Ala Pro Glu Ile Ser Pro Leu Glu Val Leu Glu Arg Asp Lys 85 90 95 Val Thr Gln Leu Leu Leu Gln Gln Asp Lys Val Pro Glu Pro Ala Ser 100 105 110 Leu Ser Ser Asn His Ser Leu Thr Ser Cys Phe Thr Asn Gln Gly Tyr 115 120 125 Phe Phe Phe His Leu Pro Asp Ala Leu Glu Ile Glu Ala Cys Gln Val 130 135 140 Tyr Phe Thr Tyr Asp Pro Tyr Ser Glu Glu Asp Pro Asp Glu Gly Val 145 150 155 160 Ala Gly Ala Pro Thr Gly Ser Ser Pro Gln Pro Leu Gln Pro Leu Ser 165 170 175 Gly Glu Asp Asp Ala Tyr Cys Thr Phe Pro Ser Arg Asp Asp Leu Leu 180 185 190 Leu Phe Ser Pro Ser Leu Leu Gly Gly Pro Ser Pro Pro Ser Thr Ala 195 200 205 Pro Gly Gly Ser Gly Ala Gly Glu Glu Arg Met Pro Pro Ser Leu Gln 210 215 220 Glu Arg Val Pro Arg Asp Trp Asp Pro Gln Pro Leu Gly Pro Pro Thr 225 230 235 240 Pro Gly Val Pro Asp Leu Val Asp Phe Gln Pro Pro Pro Glu Leu Val 245 250 255 Leu Arg Glu Ala Gly Glu Glu Val Pro Asp Ala Gly Pro Arg Glu Gly 260 265 270 Val Ser Phe Pro Trp Ser Arg Pro Pro Gly Gln Gly Glu Phe Arg Ala 275 280 285 Leu Asn Ala Arg Leu Pro Leu Asn Thr Asp Ala Tyr Leu Ser Leu Gln 290 295 300 Glu Leu Gln Gly Gln Asp Pro Thr His Leu Val 305 310 315 <210> 46 <211> 147 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> misc_feature <223> CISCg fragment <400> 46 Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly Arg Thr Phe Pro 1 5 10 15 Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly Met Leu Glu Asp 20 25 30 Gly Lys Lys Phe Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys Pro Phe Lys Phe 35 40 45 Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu Glu Gly Val Ala 50 55 60 Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu Thr Ile Ser Pro Asp Tyr 65 70 75 80 Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile Ile Pro Pro His Ala Thr 85 90 95 Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Gly Glu Gly Ser Asn Thr 100 105 110 Ser Lys Glu Asn Pro Phe Leu Phe Ala Leu Glu Ala Val Val Ile Ser 115 120 125 Val Gly Ser Met Gly Leu Ile Ile Ser Leu Leu Cys Val Tyr Phe Trp 130 135 140 Leu Glu Arg 145 <210> 47 <211> 231 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> misc_feature <223> CISCg component <400> 47 Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly Arg Thr Phe Pro 1 5 10 15 Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly Met Leu Glu Asp 20 25 30 Gly Lys Lys Phe Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys Pro Phe Lys Phe 35 40 45 Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu Glu Gly Val Ala 50 55 60 Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu Thr Ile Ser Pro Asp Tyr 65 70 75 80 Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile Ile Pro Pro His Ala Thr 85 90 95 Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Gly Glu Gly Ser Asn Thr 100 105 110 Ser Lys Glu Asn Pro Phe Leu Phe Ala Leu Glu Ala Val Val Ile Ser 115 120 125 Val Gly Ser Met Gly Leu Ile Ile Ser Leu Leu Cys Val Tyr Phe Trp 130 135 140 Leu Glu Arg Thr Met Pro Arg Ile Pro Thr Leu Lys Asn Leu Glu Asp 145 150 155 160 Leu Val Thr Glu Tyr His Gly Asn Phe Ser Ala Trp Ser Gly Val Ser 165 170 175 Lys Gly Leu Ala Glu Ser Leu Gln Pro Asp Tyr Ser Glu Arg Leu Cys 180 185 190 Leu Val Ser Glu Ile Pro Pro Lys Gly Gly Ala Leu Gly Glu Gly Pro 195 200 205 Gly Ala Ser Pro Cys Asn Gln His Ser Pro Tyr Trp Ala Pro Pro Cys 210 215 220 Tyr Thr Leu Lys Pro Glu Thr 225 230 <210> 48 <211> 415 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> misc_feature <223> CISCb component <400> 48 Glu Leu Ile Arg Val Ala Ile Leu Trp His Glu Met Trp His Glu Gly 1 5 10 15 Leu Glu Glu Ala Ser Arg Leu Tyr Phe Gly Glu Arg Asn Val Lys Gly 20 25 30 Met Phe Glu Val Leu Glu Pro Leu His Ala Met Met Glu Arg Gly Pro 35 40 45 Gln Thr Leu Lys Glu Thr Ser Phe Asn Gln Ala Tyr Gly Arg Asp Leu 50 55 60 Met Glu Ala Gln Glu Trp Cys Arg Lys Tyr Met Lys Ser Gly Asn Val 65 70 75 80 Lys Asp Leu Thr Gln Ala Trp Asp Leu Tyr Tyr His Val Phe Arg Arg 85 90 95 Ile Ser Lys Gln Gly Lys Asp Thr Ile Pro Trp Leu Gly His Leu Leu 100 105 110 Val Gly Leu Ser Gly Ala Phe Gly Phe Ile Ile Leu Val Tyr Leu Leu 115 120 125 Ile Asn Cys Arg Asn Thr Gly Pro Trp Leu Lys Lys Val Leu Lys Cys 130 135 140 Asn Thr Pro Asp Pro Ser Lys Phe Phe Ser Gln Leu Ser Ser Glu His 145 150 155 160 Gly Gly Asp Val Gln Lys Trp Leu Ser Ser Pro Phe Pro Ser Ser Ser 165 170 175 Phe Ser Pro Gly Gly Leu Ala Pro Glu Ile Ser Pro Leu Glu Val Leu 180 185 190 Glu Arg Asp Lys Val Thr Gln Leu Leu Leu Gln Gln Asp Lys Val Pro 195 200 205 Glu Pro Ala Ser Leu Ser Ser Asn His Ser Leu Thr Ser Cys Phe Thr 210 215 220 Asn Gln Gly Tyr Phe Phe Phe His Leu Pro Asp Ala Leu Glu Ile Glu 225 230 235 240 Ala Cys Gln Val Tyr Phe Thr Tyr Asp Pro Tyr Ser Glu Glu Asp Pro 245 250 255 Asp Glu Gly Val Ala Gly Ala Pro Thr Gly Ser Ser Pro Gln Pro Leu 260 265 270 Gln Pro Leu Ser Gly Glu Asp Asp Ala Tyr Cys Thr Phe Pro Ser Arg 275 280 285 Asp Asp Leu Leu Leu Phe Ser Pro Ser Leu Leu Gly Gly Pro Ser Pro 290 295 300 Pro Ser Thr Ala Pro Gly Gly Ser Gly Ala Gly Glu Glu Arg Met Pro 305 310 315 320 Pro Ser Leu Gln Glu Arg Val Pro Arg Asp Trp Asp Pro Gln Pro Leu 325 330 335 Gly Pro Pro Thr Pro Gly Val Pro Asp Leu Val Asp Phe Gln Pro Pro 340 345 350 Pro Glu Leu Val Leu Arg Glu Ala Gly Glu Glu Val Pro Asp Ala Gly 355 360 365 Pro Arg Glu Gly Val Ser Phe Pro Trp Ser Arg Pro Pro Gly Gln Gly 370 375 380 Glu Phe Arg Ala Leu Asn Ala Arg Leu Pro Leu Asn Thr Asp Ala Tyr 385 390 395 400 Leu Ser Leu Gln Glu Leu Gln Gly Gln Asp Pro Thr His Leu Val 405 410 415 <210> 49 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> misc_feature <223> beta-2-microglobulin domain <400> 49 Met Ser Arg Ser Val Ala Leu Ala Val Leu Ala Leu Leu Ser Leu Ser 1 5 10 15 Gly Leu Glu Ala Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg 20 25 30 His Pro Ala Glu Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser 35 40 45 Gly Phe His Pro Ser Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu 50 55 60 Arg Ile Glu Lys Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp 65 70 75 80 Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp 85 90 95 Glu Tyr Ala Cys Arg Val Asn His Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile 100 105 110 Val Lys Trp Asp Arg Asp Met 115 <210> 50 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> misc_feature <223> CD8 transmembrane domain <400> 50 Ser Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu 1 5 10 15 Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys 20 25 <210> 51 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> misc_feature <223> 4-1BB co-stimulatory domain <400> 51 Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met 1 5 10 15 Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe 20 25 30 Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 35 40 <210> 52 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> misc_feature <223> CD3zeta activation domain <400> 52 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly 1 5 10 15 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 20 25 30 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 35 40 45 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 50 55 60 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 65 70 75 80 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 85 90 95 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 100 105 110 <210> 53 <211> 299 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> misc_feature <223> beta-2-microglobulin chimeric receptor <400> 53 Met Ser Arg Ser Val Ala Leu Ala Val Leu Ala Leu Leu Ser Leu Ser 1 5 10 15 Gly Leu Glu Ala Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg 20 25 30 His Pro Ala Glu Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser 35 40 45 Gly Phe His Pro Ser Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu 50 55 60 Arg Ile Glu Lys Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp 65 70 75 80 Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp 85 90 95 Glu Tyr Ala Cys Arg Val Asn His Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile 100 105 110 Val Lys Trp Asp Arg Asp Met Ser Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu 115 120 125 Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr 130 135 140 Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe 145 150 155 160 Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg 165 170 175 Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser 180 185 190 Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr 195 200 205 Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys 210 215 220 Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn 225 230 235 240 Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu 245 250 255 Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly 260 265 270 His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr 275 280 285 Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 290 295 <210> 54 <211> 274 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> misc_feature <223> tLNGFR polypeptide <400> 54 Met Gly Ala Gly Ala Thr Gly Arg Ala Met Asp Gly Pro Arg Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Leu Leu Gly Val Ser Leu Gly Gly Ala Lys Glu Ala Cys 20 25 30 Pro Thr Gly Leu Tyr Thr His Ser Gly Glu Cys Cys Lys Ala Cys Asn 35 40 45 Leu Gly Glu Gly Val Ala Gln Pro Cys Gly Ala Asn Gln Thr Val Cys 50 55 60 Glu Pro Cys Leu Asp Ser Val Thr Phe Ser Asp Val Val Ser Ala Thr 65 70 75 80 Glu Pro Cys Lys Pro Cys Thr Glu Cys Val Gly Leu Gln Ser Met Ser 85 90 95 Ala Pro Cys Val Glu Ala Asp Asp Ala Val Cys Arg Cys Ala Tyr Gly 100 105 110 Tyr Tyr Gln Asp Glu Thr Thr Gly Arg Cys Glu Ala Cys Arg Val Cys 115 120 125 Glu Ala Gly Ser Gly Leu Val Phe Ser Cys Gln Asp Lys Gln Asn Thr 130 135 140 Val Cys Glu Glu Cys Pro Asp Gly Thr Tyr Ser Asp Glu Ala Asn His 145 150 155 160 Val Asp Pro Cys Leu Pro Cys Thr Val Cys Glu Asp Thr Glu Arg Gln 165 170 175 Leu Arg Glu Cys Thr Arg Trp Ala Asp Ala Glu Cys Glu Glu Ile Pro 180 185 190 Gly Arg Trp Ile Thr Arg Ser Thr Pro Pro Glu Gly Ser Asp Ser Thr 195 200 205 Ala Pro Ser Thr Gln Glu Pro Glu Ala Pro Pro Glu Gln Asp Leu Ile 210 215 220 Ala Ser Thr Val Ala Gly Val Val Thr Thr Val Met Gly Ser Ser Gln 225 230 235 240 Pro Val Val Thr Arg Gly Thr Thr Asp Asn Leu Ile Pro Val Tyr Cys 245 250 255 Ser Ile Leu Ala Ala Val Val Val Gly Leu Val Ala Tyr Ile Ala Phe 260 265 270 Lys Arg <210> 55 <211> 172 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> misc_feature <223> CNb30 polypeptide <400> 55 Met Gly Asn Glu Ala Ser Tyr Pro Leu Glu Met Cys Ser His Phe Asp 1 5 10 15 Ala Asp Glu Ile Lys Arg Leu Gly Lys Arg Phe Lys Lys Leu Asp Leu 20 25 30 Asp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Val Glu Glu Phe Met Ser Leu Pro Glu 35 40 45 Leu Gln Gln Asn Pro Leu Val Gln Arg Val Ile Asp Ile Phe Asp Thr 50 55 60 Asp Gly Asn Gly Glu Val Asp Phe Lys Glu Phe Ile Glu Gly Val Ser 65 70 75 80 Gln Phe Ser Val Lys Gly Asp Lys Glu Gln Lys Leu Arg Phe Ala Phe 85 90 95 Arg Ile Tyr Asp Met Asp Lys Asp Gly Tyr Ile Ser Asn Gly Glu Leu 100 105 110 Phe Gln Val Leu Lys Met Met Val Gly Asn Asn Thr Lys Leu Ala Asp 115 120 125 Thr Gln Leu Gln Gln Ile Val Asp Lys Thr Ile Ile Asn Ala Asp Lys 130 135 140 Asp Gly Asp Gly Arg Ile Ser Phe Glu Glu Phe Cys Ala Val Val Gly 145 150 155 160 Gly Leu Asp Ile His Lys Lys Met Val Val Asp Val 165 170 <210> 56 <211> 90 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> misc_feature <223> naked FRB wild-type polypeptide <400> 56 Met Glu Met Trp His Glu Gly Leu Glu Glu Ala Ser Arg Leu Tyr Phe 1 5 10 15 Gly Glu Arg Asn Val Lys Gly Met Phe Glu Val Leu Glu Pro Leu His 20 25 30 Ala Met Met Glu Arg Gly Pro Gln Thr Leu Lys Glu Thr Ser Phe Asn 35 40 45 Gln Ala Tyr Gly Arg Asp Leu Met Glu Ala Gln Glu Trp Cys Arg Lys 50 55 60 Tyr Met Lys Ser Gly Asn Val Lys Asp Leu Thr Gln Ala Trp Asp Leu 65 70 75 80 Tyr Tyr His Val Phe Arg Arg Ile Ser Lys 85 90 <210> 57 <211> 90 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> misc_feature <223> naked FRB mutant polypeptide <400> 57 Met Glu Met Trp His Glu Gly Leu Glu Glu Ala Ser Arg Leu Tyr Phe 1 5 10 15 Gly Glu Arg Asn Val Lys Gly Met Phe Glu Val Leu Glu Pro Leu His 20 25 30 Ala Met Met Glu Arg Gly Pro Gln Thr Leu Lys Glu Thr Ser Phe Asn 35 40 45 Gln Ala Tyr Gly Arg Asp Leu Met Glu Ala Gln Glu Trp Cys Arg Lys 50 55 60 Tyr Met Lys Ser Gly Asn Val Lys Asp Leu Leu Gln Ala Trp Asp Leu 65 70 75 80 Tyr Tyr His Val Phe Arg Arg Ile Ser Lys 85 90 <210> 58 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> misc_feature <223> CD8 signal <400> 58 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro 20 <210> 59 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> misc_feature <223> ER signal <400> 59 Met Pro Leu Gly Leu Leu Trp Leu Gly Leu Ala Leu Leu Gly Ala Leu 1 5 10 15 His Ala Gln Ala 20 <210> 60 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> misc_feature <223> T2A <400> 60 Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu 1 5 10 15 Glu Asn Pro Gly Pro 20 <210> 61 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> misc_feature <223> P2A <400> 61 Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val 1 5 10 15 Glu Glu Asn Pro Gly Pro 20 <210> 62 <211> 367 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> MND promoter <400> 62 acgtaagctt gtgtgaacag agaaacagga gaatatgggc caaacaggat atctgtggta 60 agcagttcct gccccggctc agggccaaga acagttggaa cagcagaata tgggccaaac 120 aggatatctg tggtaagcag ttcctgcccc ggctcagggc caagaacaga tggtccccag 180 atgcggtccc gccctcagca gtttctagag aaccatcaga tgtttccagg gtgccccaag 240 gacctgaaat gaccctgtgc cttatttgaa ctaaccaatc agttcgcttc tcgcttctgt 300 tcgcgcgctt ctgctccccg agctctatat aagcagagct cgtttagtga accgtcaaag 360 cttacgt 367 <210> 63 <211> 131 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> misc_feature <223> uDISC polypeptide cytoplasmic tail only <400> 63 Pro Ala Ala Leu Gly Lys Asp Thr Ile Pro Trp Leu Gly His Leu Leu 1 5 10 15 Val Gly Leu Ser Gly Ala Phe Gly Phe Ile Ile Leu Val Tyr Leu Leu 20 25 30 Ile Asn Cys Arg Asn Thr Gly Pro Trp Leu Lys Lys Val Leu Lys Cys 35 40 45 Asn Thr Pro Asp Pro Ser Lys Phe Phe Ser Gln Leu Ser Ser Glu His 50 55 60 Gly Gly Asp Val Gln Lys Trp Leu Ser Ser Pro Phe Pro Ser Ser Ser 65 70 75 80 Phe Ser Pro Gly Gly Leu Ala Pro Glu Ile Ser Pro Leu Glu Val Leu 85 90 95 Glu Arg Asp Lys Val Thr Gln Leu Leu Leu Gln Gln Asp Lys Val Pro 100 105 110 Glu Pro Ala Ser Leu Ser Leu Asn Thr Asp Ala Tyr Leu Ser Leu Gln 115 120 125 Glu Leu Gln 130 <210> 64 <211> 245 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> misc_feature <223> Entire uDISC polypeptide <400> 64 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Ile Leu Trp His Glu Met Trp His Glu Gly Leu 20 25 30 Glu Glu Ala Ser Arg Leu Tyr Phe Gly Glu Arg Asn Val Lys Gly Met 35 40 45 Phe Glu Val Leu Glu Pro Leu His Ala Met Met Glu Arg Gly Pro Gln 50 55 60 Thr Leu Lys Glu Thr Ser Phe Asn Gln Ala Tyr Gly Arg Asp Leu Met 65 70 75 80 Glu Ala Gln Glu Trp Cys Arg Lys Tyr Met Lys Ser Gly Asn Val Lys 85 90 95 Asp Leu Leu Gln Ala Trp Asp Leu Tyr Tyr His Val Phe Arg Arg Ile 100 105 110 Ser Lys Pro Ala Ala Leu Gly Lys Asp Thr Ile Pro Trp Leu Gly His 115 120 125 Leu Leu Val Gly Leu Ser Gly Ala Phe Gly Phe Ile Ile Leu Val Tyr 130 135 140 Leu Leu Ile Asn Cys Arg Asn Thr Gly Pro Trp Leu Lys Lys Val Leu 145 150 155 160 Lys Cys Asn Thr Pro Asp Pro Ser Lys Phe Phe Ser Gln Leu Ser Ser 165 170 175 Glu His Gly Gly Asp Val Gln Lys Trp Leu Ser Ser Pro Phe Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Phe Ser Pro Gly Gly Leu Ala Pro Glu Ile Ser Pro Leu Glu 195 200 205 Val Leu Glu Arg Asp Lys Val Thr Gln Leu Leu Leu Gln Gln Asp Lys 210 215 220 Val Pro Glu Pro Ala Ser Leu Ser Leu Asn Thr Asp Ala Tyr Leu Ser 225 230 235 240 Leu Gln Glu Leu Gln 245 <210> 65 <211> 3505 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> pCB0104 <400> 65 ccgcgccagg cctggccgtg aacgttcact gaaatcatgg cctcttggcc aagattgata 60 gcttgtgcct gtccctgagt cccagtccat cacgagcagc tggtttctaa gatgctattt 120 cccgtataaa gcatgagacc gtgacttgcc agccccacag agccccgccc ttgtccatca 180 ctggcatctg gactccagcc tgggttgggg caaagaggga aatgagatca tgtcctaacc 240 ctgatcctct tgtcccacag atatccagaa ccctgaccct gccgtgtacc agctgagaga 300 ctctaaatcc agtgacaagt ctgtctgcct attcaccgat tttgattctc aaacaaatgt 360 gtcacaaagt aaggattctg atgtgtatat cacatgttaa ttaaatgaaa taaaagatct 420 ttattttcat tagatctgtg tgttggtttt ttgtgtgaac agagaaacag gagaatatgg 480 gccaaacagg atatctgtgg taagcagttc ctgccccggc tcagggccaa gaacagttgg 540 aacagcagaa tatgggccaa acaggatatc tgtggtaagc agttcctgcc ccggctcagg 600 gccaagaaca gatggtcccc agatgcggtc ccgccctcag cagtttctag agaaccatca 660 gatgtttcca gggtgcccca aggacctgaa atgaccctgt gccttatttg aactaaccaa 720 tcagttcgct tctcgcttct gttcgcgcgc ttctgctccc cgagctctat ataagcagag 780 ctcgtttagt gaaccgtcag atcgccgcca ccatgagcag gtcagtggcg ttggcggttc 840 tggcgctttt gagtttgagc ggactggaag ccatccaacg aacgcctaag atccaggtat 900 attcacgcca cccggcggaa aacggcaaaa gtaacttcct taattgttat gtgtctggct 960 tccacccgtc tgatattgag gtggacctcc ttaaaaacgg tgaacggatc gagaaagtgg 1020 agcattccga tcttagtttc agtaaggatt ggagctttta ccttctctat tacactgagt 1080 tcactccgac tgaaaaggat gagtacgcct gtcgggtcaa ccacgtcacc ctgtctcaac 1140 caaaaatagt caaatgggac agagatatgt cagatattta catatgggca ccacttgcgg 1200 gcacgtgtgg cgtcctgctt ctgagtctcg tcattacgct ttattgtaaa cggggtagaa 1260 aaaaactcct ttatatattt aaacagccat ttatgcggcc agttcaaacg acgcaggaag 1320 aagacggctg tagttgcaga tttccagagg aagaggaagg tggatgcgag cttcgggtca 1380 agtttagtag gtctgcagac gctcccgcct atcaacaggg tcagaatcag ctttataacg 1440 aactcaacct cggtcgccga gaagagtacg acgtactcga taaaagaagg ggtagagacc 1500 cggaaatggg gggcaaaccg cgccgcaaaa atccacaaga ggggctttat aatgagcttc 1560 aaaaagacaa aatggccgaa gcatacagtg agattgggat gaaaggtgaa cgcagaagag 1620 gtaagggtca cgacgggctg taccagggtt tgtcaactgc cacaaaggat acttatgacg 1680 ctctgcatat gcaagctctt cccccacgcg gaagcggagc tactaacttc agcctgctga 1740 agcaggctgg agacgtggag gagaaccctg gacctatggg tgctggcgca actggacgcg 1800 ctatggatgg acctcgcttg ctgcttcttc tgcttctcgg ggtctctttg ggtggtgcta 1860 aggaagcatg cccaacggga ctttatacgc atagcggaga gtgttgcaaa gcttgtaacc 1920 tgggcgaagg cgtcgcgcaa ccttgtggtg caaatcaaac cgtctgcgag ccatgtttgg 1980 actctgttac gtttagtgac gtagtatctg cgacagagcc atgcaagcct tgtacggaat 2040 gtgtaggatt gcagagcatg tctgcccctt gtgtagaagc cgacgatgca gtttgcaggt 2100 gcgcgtatgg ctattaccaa gacgaaacaa ccggacgatg tgaagcttgc cgagtttgtg 2160 aagcgggttc cgggcttgta ttctcctgtc aggataagca gaacaccgtc tgcgaagagt 2220 gccccgatgg tacctacagc gatgaagcga accatgtaga cccatgcctg ccttgcaccg 2280 tttgtgaaga cacggaacga cagttgcggg aatgtacccg gtgggcagac gccgagtgcg 2340 aagagattcc aggccgctgg atcacgcgaa gtaccccgcc agaaggttcc gacagtactg 2400 caccaagcac ccaagaacca gaggcgcccc ccgagcagga cctgattgcc tccaccgtgg 2460 cgggtgttgt tactacggtt atgggctcat cccagcccgt tgttacccga ggaactacag 2520 acaacctgat tccggtatat tgttctatct tggcggctgt agtagttggc ttggtcgcgt 2580 acatcgcttt caaaagatga gtaagataat caacctctgg attacaaaat ttgtgaaaga 2640 ttgactggta ttcttaacta tgttgctcct tttacgctat gtggatacgc tgctttaatg 2700 cctttgtatc atgctattgc ttcccgtatg gctttcattt tctcctcctt gtataaatcc 2760 tggttagttc ttgccacggc ggaactcatc gccgcctgcc ttgcccgctg ctggacaggg 2820 gctcggctgt tgggcactga caattccgtg gtgtgccttc tagttgccag ccatctgttg 2880 tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct 2940 aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg 3000 gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt gggaagacaa tagcaggcat gctggggatg 3060 cggtgggctc tacgccggcg tggcggtcta tggacttcaa gagcaacagt gctgtggcct 3120 ggagcaacaa atctgacttt gcatgtgcaa acgccttcaa caacagcatt attccagaag 3180 acaccttctt ccccagccca ggtaagggca gctttggtgc cttcgcaggc tgtttccttg 3240 cttcaggaat ggccaggttc tgcccagagc tctggtcaat gatgtctaaa actcctctga 3300 ttggtggtct cggccttatc cattgccacc aaaaccctct ttttactaag aaacagtgag 3360 ccttgttctg gcagtccaga gaatgacacg ggaaaaaagc agatgaagag aaggtggcag 3420 gagagggcac gtggcccagc ctcagtctct ccaactgagt tcctgcctgc ctgcctttgc 3480 tcagactgtt tgccccttac tgctc 3505 <210> 66 <211> 3643 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> pCB0110 <400> 66 ccgcgccagg cctggccgtg aacgttcact gaaatcatgg cctcttggcc aagattgata 60 gcttgtgcct gtccctgagt cccagtccat cacgagcagc tggtttctaa gatgctattt 120 cccgtataaa gcatgagacc gtgacttgcc agccccacag agccccgccc ttgtccatca 180 ctggcatctg gactccagcc tgggttgggg caaagaggga aatgagatca tgtcctaacc 240 ctgatcctct tgtcccacag atatccagaa ccctgaccct gccgtgtacc agctgagaga 300 ctctaaatcc agtgacaagt ctgtctgcct attcaccgat tttgattctc aaacaaatgt 360 gtcacaaagt aaggattctg atgtgtatat cacatgttaa ttaaggatcc ggcgctacaa 420 atttttcact gctgaaacag gcgggtgatg tggaggagaa ccctggaccc atgccacttg 480 gcctgctctg gctgggcttg gcattgctcg gcgcgctcca cgcccaggct gaactgatcc 540 gcgtggccat attgtggcat gagatgtggc atgagggatt ggaggaggcg agtaggctgt 600 actttgggga aaggaatgtt aaagggatgt ttgaggtcct tgaacccctc cacgctatga 660 tggaaagagg acctcaaacg cttaaagaga cgtcattcaa tcaagcctat ggacgggatc 720 ttatggaagc tcaagaatgg tgtcgaaaat acatgaaaag cgggaatgtt aaggacctca 780 cgcaagcctg ggatctgtat taccatgttt tccgacgcat ttctaaacaa ggaaaagata 840 ctatcccatg gttggggcac ttgctcgttg ggctcagtgg ggcgtttgga ttcatcatcc 900 tcgtatatct gttgattaat tgtcggaaca caggtccctg gcttaaaaaa gttttgaagt 960 gtaacacccc ggatccttct aaatttttta gtcaacttag ttcagaacac gggggcgatg 1020 ttcaaaagtg gctgagttcc ccgtttccca gttcaagttt ctcccctggg ggtctcgccc 1080 ccgagatatc acctcttgaa gtgctcgagc gggacaaagt tacacagctt cttttgcaac 1140 aggataaggt tccggagccg gcgtctctca gctctaacca ttcactcact tcttgtttca 1200 ccaaccaagg gtattttttc ttccatctgc ctgatgcctt ggagattgag gcttgtcagg 1260 tgtactttac ctatgacccc tatagtgagg aagaccctga cgaaggcgta gctggcgccc 1320 ccactggctc cagtccacag cctcttcagc ctctgtcagg ggaggacgac gcatattgta 1380 cgttcccctc acgggacgac cttctgctgt tttcaccctc actgctcggc ggaccctccc 1440 cgccaagcac ggcacctggg gggagtgggg caggagaaga aaggatgcct cctagtttgc 1500 aggagcgggt tcctcgcgac tgggatccgc aacccctcgg accacccacc cctggcgtac 1560 ctgatctggt cgacttccaa ccacctccgg agcttgtcct cagagaggcc ggagaggaag 1620 tcccagacgc ggggccaaga gagggtgtgt catttccctg gtcccgccct ccgggacagg 1680 gtgagtttcg ggcgctgaat gcgaggctcc cccttaatac cgatgcgtac ctgtcattgc 1740 aggaacttca gggccaggat cctacccacc tggtgggttc cggggagggc cgagggtcat 1800 tgctgacgtg tggagacgtg gaggagaatc ctggccccat gagcaggtca gtggcgttgg 1860 cggttctggc gcttttgagt ttgagcggac tggaagccat ccaacgaacg cctaagatcc 1920 aggtatattc acgccacccg gcggaaaacg gcaaaagtaa cttccttaat tgttatgtgt 1980 ctggcttcca cccgtctgat attgaggtgg acctccttaa aaacggtgaa cggatcgaga 2040 aagtggagca ttccgatctt agtttcagta aggattggag cttttacctt ctctattaca 2100 ctgagttcac tccgactgaa aaggatgagt acgcctgtcg ggtcaaccac gtcaccctgt 2160 ctcaaccaaa aatagtcaaa tgggacagag atatgtcaga tatttacata tgggcaccac 2220 ttgcgggcac gtgtggcgtc ctgcttctga gtctcgtcat tacgctttat tgtaaacggg 2280 gtagaaaaaa actcctttat atatttaaac agccatttat gcggccagtt caaacgacgc 2340 aggaagaaga cggctgtagt tgcagatttc cagaggaaga ggaaggtgga tgcgagcttc 2400 gggtcaagtt tagtaggtct gcagacgctc ccgcctatca acagggtcag aatcagcttt 2460 ataacgaact caacctcggt cgccgagaag agtacgacgt actcgataaa agaaggggta 2520 gagacccgga aatggggggc aaaccgcgcc gcaaaaatcc acaagagggg ctttataatg 2580 agcttcaaaa agacaaaatg gccgaagcat acagtgagat tgggatgaaa ggtgaacgca 2640 gaagaggtaa gggtcacgac gggctgtacc agggtttgtc aactgccaca aaggatactt 2700 atgacgctct gcatatgcaa gctcttcccc cacgctgagt aagataatca acctctggat 2760 tacaaaattt gtgaaagatt gactggtatt cttaactatg ttgctccttt tacgctatgt 2820 ggatacgctg ctttaatgcc tttgtatcat gctattgctt cccgtatggc tttcattttc 2880 tcctccttgt ataaatcctg gttagttctt gccacggcgg aactcatcgc cgcctgcctt 2940 gcccgctgct ggacaggggc tcggctgttg ggcactgaca attccgtggt gtgccttcta 3000 gttgccagcc atctgttgtt tgcccctccc ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca 3060 ctcccactgt cctttcctaa taaaatgagg aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc 3120 attctattct ggggggtggg gtggggcagg acagcaaggg ggaggattgg gaagacaata 3180 gcaggcatgc tggggatgcg gtgggctcta cgccggcgtg gcggtctatg gacttcaaga 3240 gcaacagtgc tgtggcctgg agcaacaaat ctgactttgc atgtgcaaac gccttcaaca 3300 acagcattat tccagaagac accttcttcc ccagcccagg taagggcagc tttggtgcct 3360 tcgcaggctg tttccttgct tcaggaatgg ccaggttctg cccagagctc tggtcaatga 3420 tgtctaaaac tcctctgatt ggtggtctcg gccttatcca ttgccaccaa aaccctcttt 3480 ttactaagaa acagtgagcc ttgttctggc agtccagaga atgacacggg aaaaaagcag 3540 atgaagagaa ggtggcagga gagggcacgt ggcccagcct cagtctctcc aactgagttc 3600 ctgcctgcct gcctttgctc agactgtttg ccccttactg ctc 3643 <210> 67 <211> 3940 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> pCB0111 <400> 67 ccgcgccagg cctggccgtg aacgttcact gaaatcatgg cctcttggcc aagattgata 60 gcttgtgcct gtccctgagt cccagtccat cacgagcagc tggtttctaa gatgctattt 120 cccgtataaa gcatgagacc gtgacttgcc agccccacag agccccgccc ttgtccatca 180 ctggcatctg gactccagcc tgggttgggg caaagaggga aatgagatca tgtcctaacc 240 ctgatcctct tgtcccacag atatccagaa ccctgaccct gccgtgtacc agctgagaga 300 ctctaaatcc agtgacaagt ctgtctgcct attcaccgat tttgattctc aaacaaatgt 360 gtcacaaagt aaggattctg atgtgtatat cacatgttaa ttaagtgtga acagagaaac 420 aggagaatat gggccaaaca ggatatctgt ggtaagcagt tcctgccccg gctcagggcc 480 aagaacagtt ggaacagcag aatatgggcc aaacaggata tctgtggtaa gcagttcctg 540 ccccggctca gggccaagaa cagatggtcc ccagatgcgg tcccgccctc agcagtttct 600 agagaaccat cagatgtttc cagggtgccc caaggacctg aaatgaccct gtgccttatt 660 tgaactaacc aatcagttcg cttctcgctt ctgttcgcgc gcttctgctc cccgagctct 720 atataagcag agctcgttta gtgaaccgtc agatcgccgc caccatgcca cttggcctgc 780 tctggctggg cttggcattg ctcggcgcgc tccacgccca ggctgaactg atccgcgtgg 840 ccatattgtg gcatgagatg tggcatgagg gattggagga ggcgagtagg ctgtactttg 900 gggaaaggaa tgttaaaggg atgtttgagg tccttgaacc cctccacgct atgatggaaa 960 gaggacctca aacgcttaaa gagacgtcat tcaatcaagc ctatggacgg gatcttatgg 1020 aagctcaaga atggtgtcga aaatacatga aaagcgggaa tgttaaggac ctcacgcaag 1080 cctgggatct gtattaccat gttttccgac gcatttctaa acaaggaaaa gatactatcc 1140 catggttggg gcacttgctc gttgggctca gtggggcgtt tggattcatc atcctcgtat 1200 atctgttgat taattgtcgg aacacaggtc cctggcttaa aaaagttttg aagtgtaaca 1260 ccccggatcc ttctaaattt tttagtcaac ttagttcaga acacgggggc gatgttcaaa 1320 agtggctgag ttccccgttt cccagttcaa gtttctcccc tgggggtctc gcccccgaga 1380 tatcacctct tgaagtgctc gagcgggaca aagttacaca gcttcttttg caacaggata 1440 aggttccgga gccggcgtct ctcagctcta accattcact cacttcttgt ttcaccaacc 1500 aagggtattt tttcttccat ctgcctgatg ccttggagat tgaggcttgt caggtgtact 1560 ttacctatga cccctatagt gaggaagacc ctgacgaagg cgtagctggc gcccccactg 1620 gctccagtcc acagcctctt cagcctctgt caggggagga cgacgcatat tgtacgttcc 1680 cctcacggga cgaccttctg ctgttttcac cctcactgct cggcggaccc tccccgccaa 1740 gcacggcacc tggggggagt ggggcaggag aagaaaggat gcctcctagt ttgcaggagc 1800 gggttcctcg cgactgggat ccgcaacccc tcggaccacc cacccctggc gtacctgatc 1860 tggtcgactt ccaaccacct ccggagcttg tcctcagaga ggccggagag gaagtcccag 1920 acgcggggcc aagagagggt gtgtcatttc cctggtcccg ccctccggga cagggtgagt 1980 ttcgggcgct gaatgcgagg ctccccctta ataccgatgc gtacctgtca ttgcaggaac 2040 ttcagggcca ggatcctacc cacctggtgg gatccggcgc tacaaatttt tcactgctga 2100 aacaggcggg tgatgtggag gagaaccctg gacccatgag caggtcagtg gcgttggcgg 2160 ttctggcgct tttgagtttg agcggactgg aagccatcca acgaacgcct aagatccagg 2220 tatattcacg ccacccggcg gaaaacggca aaagtaactt ccttaattgt tatgtgtctg 2280 gcttccaccc gtctgatatt gaggtggacc tccttaaaaa cggtgaacgg atcgagaaag 2340 tggagcattc cgatcttagt ttcagtaagg attggagctt ttaccttctc tattacactg 2400 agttcactcc gactgaaaag gatgagtacg cctgtcgggt caaccacgtc accctgtctc 2460 aaccaaaaat agtcaaatgg gacagagata tgtcagatat ttacatatgg gcaccacttg 2520 cgggcacgtg tggcgtcctg cttctgagtc tcgtcattac gctttattgt aaacggggta 2580 gaaaaaaact cctttatata tttaaacagc catttatgcg gccagttcaa acgacgcagg 2640 aagaagacgg ctgtagttgc agatttccag aggaagagga aggtggatgc gagcttcggg 2700 tcaagtttag taggtctgca gacgctcccg cctatcaaca gggtcagaat cagctttata 2760 acgaactcaa cctcggtcgc cgagaagagt acgacgtact cgataaaaga aggggtagag 2820 acccggaaat ggggggcaaa ccgcgccgca aaaatccaca agaggggctt tataatgagc 2880 ttcaaaaaga caaaatggcc gaagcataca gtgagattgg gatgaaaggt gaacgcagaa 2940 gaggtaaggg tcacgacggg ctgtaccagg gtttgtcaac tgccacaaag gatacttatg 3000 acgctctgca tatgcaagct cttcccccac gctgagtaag ataatcaacc tctggattac 3060 aaaatttgtg aaagattgac tggtattctt aactatgttg ctccttttac gctatgtgga 3120 tacgctgctt taatgccttt gtatcatgct attgcttccc gtatggcttt cattttctcc 3180 tccttgtata aatcctggtt agttcttgcc acggcggaac tcatcgccgc ctgccttgcc 3240 cgctgctgga caggggctcg gctgttgggc actgacaatt ccgtggtgtg ccttctagtt 3300 gccagccatc tgttgtttgc ccctcccccg tgccttcctt gaccctggaa ggtgccactc 3360 ccactgtcct ttcctaataa aatgaggaaa ttgcatcgca ttgtctgagt aggtgtcatt 3420 ctattctggg gggtggggtg gggcaggaca gcaaggggga ggattgggaa gacaatagca 3480 ggcatgctgg ggatgcggtg ggctctacgc cggcgtggcg gtctatggac ttcaagagca 3540 acagtgctgt ggcctggagc aacaaatctg actttgcatg tgcaaacgcc ttcaacaaca 3600 gcattattcc agaagacacc ttcttcccca gcccaggtaa gggcagcttt ggtgccttcg 3660 caggctgttt ccttgcttca ggaatggcca ggttctgccc agagctctgg tcaatgatgt 3720 ctaaaactcc tctgattggt ggtctcggcc ttatccattg ccaccaaaac cctcttttta 3780 ctaagaaaca gtgagccttg ttctggcagt ccagagaatg acacgggaaa aaagcagatg 3840 aagagaaggt ggcaggagag ggcacgtggc ccagcctcag tctctccaac tgagttcctg 3900 cctgcctgcc tttgctcaga ctgtttgccc cttactgctc 3940 <210> 68 <211> 2617 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> pCB0112 <400> 68 ccgcgccagg cctggccgtg aacgttcact gaaatcatgg cctcttggcc aagattgata 60 gcttgtgcct gtccctgagt cccagtccat cacgagcagc tggtttctaa gatgctattt 120 cccgtataaa gcatgagacc gtgacttgcc agccccacag agccccgccc ttgtccatca 180 ctggcatctg gactccagcc tgggttgggg caaagaggga aatgagatca tgtcctaacc 240 ctgatcctct tgtcccacag atatccagaa ccctgaccct gccgtgtacc agctgagaga 300 ctctaaatcc agtgacaagt ctgtctgcct attcaccgat tttgattctc aaacaaatgt 360 gtcacaaagt aaggattctg atgtgtatat cacatgttaa ttaaatgaaa taaaagatct 420 ttattttcat tagatctgtg tgttggtttt ttgtgtgaac agagaaacag gagaatatgg 480 gccaaacagg atatctgtgg taagcagttc ctgccccggc tcagggccaa gaacagttgg 540 aacagcagaa tatgggccaa acaggatatc tgtggtaagc agttcctgcc ccggctcagg 600 gccaagaaca gatggtcccc agatgcggtc ccgccctcag cagtttctag agaaccatca 660 gatgtttcca gggtgcccca aggacctgaa atgaccctgt gccttatttg aactaaccaa 720 tcagttcgct tctcgcttct gttcgcgcgc ttctgctccc cgagctctat ataagcagag 780 ctcgtttagt gaaccgtcag atcgccgcca ccatgagcag gtcagtggcg ttggcggttc 840 tggcgctttt gagtttgagc ggactggaag ccatccaacg aacgcctaag atccaggtat 900 attcacgcca cccggcggaa aacggcaaaa gtaacttcct taattgttat gtgtctggct 960 tccacccgtc tgatattgag gtggacctcc ttaaaaacgg tgaacggatc gagaaagtgg 1020 agcattccga tcttagtttc agtaaggatt ggagctttta ccttctctat tacactgagt 1080 tcactccgac tgaaaaggat gagtacgcct gtcgggtcaa ccacgtcacc ctgtctcaac 1140 caaaaatagt caaatgggac agagatatgt cagatattta catatgggca ccacttgcgg 1200 gcacgtgtgg cgtcctgctt ctgagtctcg tcattacgct ttattgtaaa cggggtagaa 1260 aaaaactcct ttatatattt aaacagccat ttatgcggcc agttcaaacg acgcaggaag 1320 aagacggctg tagttgcaga tttccagagg aagaggaagg tggatgcgag cttcgggtca 1380 agtttagtag gtctgcagac gctcccgcct atcaacaggg tcagaatcag ctttataacg 1440 aactcaacct cggtcgccga gaagagtacg acgtactcga taaaagaagg ggtagagacc 1500 cggaaatggg gggcaaaccg cgccgcaaaa atccacaaga ggggctttat aatgagcttc 1560 aaaaagacaa aatggccgaa gcatacagtg agattgggat gaaaggtgaa cgcagaagag 1620 gtaagggtca cgacgggctg taccagggtt tgtcaactgc cacaaaggat acttatgacg 1680 ctctgcatat gcaagctctt cccccacgct gagtaagata atcaacctct ggattacaaa 1740 atttgtgaaa gattgactgg tattcttaac tatgttgctc cttttacgct atgtggatac 1800 gctgctttaa tgcctttgta tcatgctatt gcttcccgta tggctttcat tttctcctcc 1860 ttgtataaat cctggttagt tcttgccacg gcggaactca tcgccgcctg ccttgcccgc 1920 tgctggacag gggctcggct gttgggcact gacaattccg tggtgtgcct tctagttgcc 1980 agccatctgt tgtttgcccc tcccccgtgc cttccttgac cctggaaggt gccactccca 2040 ctgtcctttc ctaataaaat gaggaaattg catcgcattg tctgagtagg tgtcattcta 2100 ttctgggggg tggggtgggg caggacagca agggggagga ttgggaagac aatagcaggc 2160 atgctgggga tgcggtgggc tctacgccgg cgtggcggtc tatggacttc aagagcaaca 2220 gtgctgtggc ctggagcaac aaatctgact ttgcatgtgc aaacgccttc aacaacagca 2280 ttattccaga agacaccttc ttccccagcc caggtaaggg cagctttggt gccttcgcag 2340 gctgtttcct tgcttcagga atggccaggt tctgcccaga gctctggtca atgatgtcta 2400 aaactcctct gattggtggt ctcggcctta tccattgcca ccaaaaccct ctttttacta 2460 agaaacagtg agccttgttc tggcagtcca gagaatgaca cgggaaaaaa gcagatgaag 2520 agaaggtggc aggagagggc acgtggccca gcctcagtct ctccaactga gttcctgcct 2580 gcctgccttt gctcagactg tttgcccctt actgctc 2617 <210> 69 <211> 4564 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> pCB0113 <400> 69 ccgcgccagg cctggccgtg aacgttcact gaaatcatgg cctcttggcc aagattgata 60 gcttgtgcct gtccctgagt cccagtccat cacgagcagc tggtttctaa gatgctattt 120 cccgtataaa gcatgagacc gtgacttgcc agccccacag agccccgccc ttgtccatca 180 ctggcatctg gactccagcc tgggttgggg caaagaggga aatgagatca tgtcctaacc 240 ctgatcctct tgtcccacag atatccagaa ccctgaccct gccgtgtacc agctgagaga 300 ctctaaatcc agtgacaagt ctgtctgcct attcaccgat tttgattctc aaacaaatgt 360 gtcacaaagt aaggattctg atgtgtatat cacatgttaa ttaaggttcc ggggagggcc 420 gagggtcatt gctgacgtgt ggagacgtgg aggagaatcc tggccccatg ccacttggcc 480 tgctctggct gggcttggca ttgctcggcg cgctccacgc ccaggctggc gttcaagttg 540 aaaccattag tcccggagac ggtcgaacat ttcccaaacg gggccagacg tgcgtggtac 600 actacaccgg aatgctggag gatggaaaaa aatttgacag cagccgggac agaaacaaac 660 cattcaagtt catgcttggt aaacaagagg taatacgggg ttgggaagag ggtgtggccc 720 agatgtcagt agggcaacgc gcgaagttga ccataagccc cgactatgcc tatggggcga 780 caggccatcc cggtataatt cctccgcacg ctacactggt gtttgatgtt gagttgctga 840 agctggagca aaatcttgtt attccgtggg ctcccgagaa cctcacattg cacaaattgt 900 ccgaatcaca attggagctt aattggaaca atagattcct gaatcactgc cttgagcacc 960 tcgtacaata ccggacagac tgggatcact cttggacgga gcagtccgtg gactaccgac 1020 ataaattctc actcccctca gtggatggcc agaaacgcta tacctttaga gtccggtccc 1080 gcttcaaccc gttgtgcggc agcgcacagc actggagtga atggagtcat ccgatacact 1140 ggggaagcaa tacgtcaaaa gagaacccgt tcctttttgc gctggaagca gtcgtgatca 1200 gcgttggatc tatggggctg atcatctccc ttctctgcgt ctatttctgg ctcgaaagaa 1260 ctatgccacg catccctacg ctgaaaaatc tggaggatct tgtgacggaa tatcatggaa 1320 atttttccgc ctggagtgga gtttccaaag gtctcgctga atctctgcag ccagactata 1380 gtgagcggct ctgcttggtc tctgagattc cacctaaggg gggggcgctc ggggaaggcc 1440 cgggcgcaag tccgtgtaat caacacagtc cgtactgggc tccaccatgc tataccctca 1500 agccggaaac tggatccggc gctacaaatt tttcactgct gaaacaggcg ggtgatgtgg 1560 aggagaaccc tggacccatg ccacttggcc tgctctggct gggcttggca ttgctcggcg 1620 cgctccacgc ccaggctgaa ctgatccgcg tggccatatt gtggcatgag atgtggcatg 1680 agggattgga ggaggcgagt aggctgtact ttggggaaag gaatgttaaa gggatgtttg 1740 aggtccttga acccctccac gctatgatgg aaagaggacc tcaaacgctt aaagagacgt 1800 cattcaatca agcctatgga cgggatctta tggaagctca agaatggtgt cgaaaataca 1860 tgaaaagcgg gaatgttaag gacctcacgc aagcctggga tctgtattac catgttttcc 1920 gacgcatttc taaacaagga aaagatacta tcccatggtt ggggcacttg ctcgttgggc 1980 tcagtggggc gtttggattc atcatcctcg tatatctgtt gattaattgt cggaacacag 2040 gtccctggct taaaaaagtt ttgaagtgta acaccccgga tccttctaaa ttttttagtc 2100 aacttagttc agaacacggg ggcgatgttc aaaagtggct gagttccccg tttcccagtt 2160 caagtttctc ccctgggggt ctcgcccccg agatatcacc tcttgaagtg ctcgagcggg 2220 acaaagttac acagcttctt ttgcaacagg ataaggttcc ggagccggcg tctctcagct 2280 ctaaccattc actcacttct tgtttcacca accaagggta ttttttcttc catctgcctg 2340 atgccttgga gattgaggct tgtcaggtgt actttaccta tgacccctat agtgaggaag 2400 accctgacga aggcgtagct ggcgccccca ctggctccag tccacagcct cttcagcctc 2460 tgtcagggga ggacgacgca tattgtacgt tcccctcacg ggacgacctt ctgctgtttt 2520 caccctcact gctcggcgga ccctccccgc caagcacggc acctgggggg agtggggcag 2580 gagaagaaag gatgcctcct agtttgcagg agcgggttcc tcgcgactgg gatccgcaac 2640 ccctcggacc acccacccct ggcgtacctg atctggtcga cttccaacca cctccggagc 2700 ttgtcctcag agaggccgga gaggaagtcc cagacgcggg gccaagagag ggtgtgtcat 2760 ttccctggtc ccgccctccg ggacagggtg agtttcgggc gctgaatgcg aggctccccc 2820 ttaataccga tgcgtacctg tcattgcagg aacttcaggg ccaggatcct acccacctgg 2880 tgggaagcgg agctactaac ttcagcctgc tgaagcaggc tggagacgtg gaggagaacc 2940 ctggacctat ggtgagcaag ggcgaggagg ataacatggc catcatcaag gagttcatgc 3000 gcttcaaggt gcacatggag ggctccgtga acggccacga gttcgagatc gagggcgagg 3060 gcgagggccg cccctacgag ggcacccaga ccgccaagct gaaggtgacc aagggtggcc 3120 ccctgccctt cgcctgggac atcctgtccc ctcagttcat gtacggctcc aaggcctacg 3180 tgaagcaccc cgccgacatc cccgactact tgaagctgtc cttccccgag ggcttcaagt 3240 gggagcgcgt gatgaacttc gaggacggcg gcgtggtgac cgtgacccag gactcctccc 3300 tgcaggacgg cgagttcatc tacaaggtga agctgcgcgg caccaacttc ccctccgacg 3360 gccccgtaat gcagaagaag accatgggct gggaggcctc ctccgagcgg atgtaccccg 3420 aggacggcgc cctgaagggc gagatcaagc agaggctgaa gctgaaggac ggcggccact 3480 acgacgctga ggtcaagacc acctacaagg ccaagaagcc cgtgcagctg cccggcgcct 3540 acaacgtcaa catcaagttg gacatcacct cccacaacga ggactacacc atcgtggaac 3600 agtacgaacg cgccgagggc cgccactcca ccggcggcat ggacgagctg tacaagtagg 3660 taagataatc aacctctgga ttacaaaatt tgtgaaagat tgactggtat tcttaactat 3720 gttgctcctt ttacgctatg tggatacgct gctttaatgc ctttgtatca tgctattgct 3780 tcccgtatgg ctttcatttt ctcctccttg tataaatcct ggttagttct tgccacggcg 3840 gaactcatcg ccgcctgcct tgcccgctgc tggacagggg ctcggctgtt gggcactgac 3900 aattccgtgg tgtgccttct agttgccagc catctgttgt ttgcccctcc cccgtgcctt 3960 ccttgaccct ggaaggtgcc actcccactg tcctttccta ataaaatgag gaaattgcat 4020 cgcattgtct gagtaggtgt cattctattc tggggggtgg ggtggggcag gacagcaagg 4080 gggaggattg ggaagacaat agcaggcatg ctggggatgc ggtgggctct acgccggcgt 4140 ggcggtctat ggacttcaag agcaacagtg ctgtggcctg gagcaacaaa tctgactttg 4200 catgtgcaaa cgccttcaac aacagcatta ttccagaaga caccttcttc cccagcccag 4260 gtaagggcag ctttggtgcc ttcgcaggct gtttccttgc ttcaggaatg gccaggttct 4320 gcccagagct ctggtcaatg atgtctaaaa ctcctctgat tggtggtctc ggccttatcc 4380 attgccacca aaaccctctt tttactaaga aacagtgagc cttgttctgg cagtccagag 4440 aatgacacgg gaaaaaagca gatgaagaga aggtggcagg agagggcacg tggcccagcc 4500 tcagtctctc caactgagtt cctgcctgcc tgcctttgct cagactgttt gccccttact 4560 gctc 4564 <210> 70 <211> 3643 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> pCB0114 <400> 70 ccgcgccagg cctggccgtg aacgttcact gaaatcatgg cctcttggcc aagattgata 60 gcttgtgcct gtccctgagt cccagtccat cacgagcagc tggtttctaa gatgctattt 120 cccgtataaa gcatgagacc gtgacttgcc agccccacag agccccgccc ttgtccatca 180 ctggcatctg gactccagcc tgggttgggg caaagaggga aatgagatca tgtcctaacc 240 ctgatcctct tgtcccacag atatccagaa ccctgaccct gccgtgtacc agctgagaga 300 ctctaaatcc agtgacaagt ctgtctgcct attcaccgat tttgattctc aaacaaatgt 360 gtcacaaagt aaggattctg atgtgtatat cacatgttaa ttaaggttcc ggggagggcc 420 gagggtcatt gctgacgtgt ggagacgtgg aggagaatcc tggccccatg agcaggtcag 480 tggcgttggc ggttctggcg cttttgagtt tgagcggact ggaagccatc caacgaacgc 540 ctaagatcca ggtatattca cgccacccgg cggaaaacgg caaaagtaac ttccttaatt 600 gttatgtgtc tggcttccac ccgtctgata ttgaggtgga cctccttaaa aacggtgaac 660 ggatcgagaa agtggagcat tccgatctta gtttcagtaa ggattggagc ttttaccttc 720 tctattacac tgagttcact ccgactgaaa aggatgagta cgcctgtcgg gtcaaccacg 780 tcaccctgtc tcaaccaaaa atagtcaaat gggacagaga tatgtcagat atttacatat 840 gggcaccact tgcgggcacg tgtggcgtcc tgcttctgag tctcgtcatt acgctttatt 900 gtaaacgggg tagaaaaaaa ctcctttata tatttaaaca gccatttatg cggccagttc 960 aaacgacgca ggaagaagac ggctgtagtt gcagatttcc agaggaagag gaaggtggat 1020 gcgagcttcg ggtcaagttt agtaggtctg cagacgctcc cgcctatcaa cagggtcaga 1080 atcagcttta taacgaactc aacctcggtc gccgagaaga gtacgacgta ctcgataaaa 1140 gaaggggtag agacccggaa atggggggca aaccgcgccg caaaaatcca caagaggggc 1200 tttataatga gcttcaaaaa gacaaaatgg ccgaagcata cagtgagatt gggatgaaag 1260 gtgaacgcag aagaggtaag ggtcacgacg ggctgtacca gggtttgtca actgccacaa 1320 aggatactta tgacgctctg catatgcaag ctcttccccc acgcggatcc ggcgctacaa 1380 atttttcact gctgaaacag gcgggtgatg tggaggagaa ccctggaccc atgccacttg 1440 gcctgctctg gctgggcttg gcattgctcg gcgcgctcca cgcccaggct gaactgatcc 1500 gcgtggccat attgtggcat gagatgtggc atgagggatt ggaggaggcg agtaggctgt 1560 actttgggga aaggaatgtt aaagggatgt ttgaggtcct tgaacccctc cacgctatga 1620 tggaaagagg acctcaaacg cttaaagaga cgtcattcaa tcaagcctat ggacgggatc 1680 ttatggaagc tcaagaatgg tgtcgaaaat acatgaaaag cgggaatgtt aaggacctca 1740 cgcaagcctg ggatctgtat taccatgttt tccgacgcat ttctaaacaa ggaaaagata 1800 ctatcccatg gttggggcac ttgctcgttg ggctcagtgg ggcgtttgga ttcatcatcc 1860 tcgtatatct gttgattaat tgtcggaaca caggtccctg gcttaaaaaa gttttgaagt 1920 gtaacacccc ggatccttct aaatttttta gtcaacttag ttcagaacac gggggcgatg 1980 ttcaaaagtg gctgagttcc ccgtttccca gttcaagttt ctcccctggg ggtctcgccc 2040 ccgagatatc acctcttgaa gtgctcgagc gggacaaagt tacacagctt cttttgcaac 2100 aggataaggt tccggagccg gcgtctctca gctctaacca ttcactcact tcttgtttca 2160 ccaaccaagg gtattttttc ttccatctgc ctgatgcctt ggagattgag gcttgtcagg 2220 tgtactttac ctatgacccc tatagtgagg aagaccctga cgaaggcgta gctggcgccc 2280 ccactggctc cagtccacag cctcttcagc ctctgtcagg ggaggacgac gcatattgta 2340 cgttcccctc acgggacgac cttctgctgt tttcaccctc actgctcggc ggaccctccc 2400 cgccaagcac ggcacctggg gggagtgggg caggagaaga aaggatgcct cctagtttgc 2460 aggagcgggt tcctcgcgac tgggatccgc aacccctcgg accacccacc cctggcgtac 2520 ctgatctggt cgacttccaa ccacctccgg agcttgtcct cagagaggcc ggagaggaag 2580 tcccagacgc ggggccaaga gagggtgtgt catttccctg gtcccgccct ccgggacagg 2640 gtgagtttcg ggcgctgaat gcgaggctcc cccttaatac cgatgcgtac ctgtcattgc 2700 aggaacttca gggccaggat cctacccacc tggtgtgagt aagataatca acctctggat 2760 tacaaaattt gtgaaagatt gactggtatt cttaactatg ttgctccttt tacgctatgt 2820 ggatacgctg ctttaatgcc tttgtatcat gctattgctt cccgtatggc tttcattttc 2880 tcctccttgt ataaatcctg gttagttctt gccacggcgg aactcatcgc cgcctgcctt 2940 gcccgctgct ggacaggggc tcggctgttg ggcactgaca attccgtggt gtgccttcta 3000 gttgccagcc atctgttgtt tgcccctccc ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca 3060 ctcccactgt cctttcctaa taaaatgagg aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc 3120 attctattct ggggggtggg gtggggcagg acagcaaggg ggaggattgg gaagacaata 3180 gcaggcatgc tggggatgcg gtgggctcta cgccggcgtg gcggtctatg gacttcaaga 3240 gcaacagtgc tgtggcctgg agcaacaaat ctgactttgc atgtgcaaac gccttcaaca 3300 acagcattat tccagaagac accttcttcc ccagcccagg taagggcagc tttggtgcct 3360 tcgcaggctg tttccttgct tcaggaatgg ccaggttctg cccagagctc tggtcaatga 3420 tgtctaaaac tcctctgatt ggtggtctcg gccttatcca ttgccaccaa aaccctcttt 3480 ttactaagaa acagtgagcc ttgttctggc agtccagaga atgacacggg aaaaaagcag 3540 atgaagagaa ggtggcagga gagggcacgt ggcccagcct cagtctctcc aactgagttc 3600 ctgcctgcct gcctttgctc agactgtttg ccccttactg ctc 3643 <210> 71 <211> 4150 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> pCB0115 <400> 71 ccgcgccagg cctggccgtg aacgttcact gaaatcatgg cctcttggcc aagattgata 60 gcttgtgcct gtccctgagt cccagtccat cacgagcagc tggtttctaa gatgctattt 120 cccgtataaa gcatgagacc gtgacttgcc agccccacag agccccgccc ttgtccatca 180 ctggcatctg gactccagcc tgggttgggg caaagaggga aatgagatca tgtcctaacc 240 ctgatcctct tgtcccacag atatccagaa ccctgaccct gccgtgtacc agctgagaga 300 ctctaaatcc agtgacaagt ctgtctgcct attcaccgat tttgattctc aaacaaatgt 360 gtcacaaagt aaggattctg atgtgtatat cacatgttaa ttaaggatcc ggcgctacaa 420 atttttcact gctgaaacag gcgggtgatg tggaggagaa ccctggaccc atgccacttg 480 gcctgctctg gctgggcttg gcattgctcg gcgcgctcca cgcccaggct gaactgatcc 540 gcgtggccat attgtggcat gagatgtggc atgagggatt ggaggaggcg agtaggctgt 600 actttgggga aaggaatgtt aaagggatgt ttgaggtcct tgaacccctc cacgctatga 660 tggaaagagg acctcaaacg cttaaagaga cgtcattcaa tcaagcctat ggacgggatc 720 ttatggaagc tcaagaatgg tgtcgaaaat acatgaaaag cgggaatgtt aaggacctca 780 cgcaagcctg ggatctgtat taccatgttt tccgacgcat ttctaaacaa ggaaaagata 840 ctatcccatg gttggggcac ttgctcgttg ggctcagtgg ggcgtttgga ttcatcatcc 900 tcgtatatct gttgattaat tgtcggaaca caggtccctg gcttaaaaaa gttttgaagt 960 gtaacacccc ggatccttct aaatttttta gtcaacttag ttcagaacac gggggcgatg 1020 ttcaaaagtg gctgagttcc ccgtttccca gttcaagttt ctcccctggg ggtctcgccc 1080 ccgagatatc acctcttgaa gtgctcgagc gggacaaagt tacacagctt cttttgcaac 1140 aggataaggt tccggagccg gcgtctctca gctctaacca ttcactcact tcttgtttca 1200 ccaaccaagg gtattttttc ttccatctgc ctgatgcctt ggagattgag gcttgtcagg 1260 tgtactttac ctatgacccc tatagtgagg aagaccctga cgaaggcgta gctggcgccc 1320 ccactggctc cagtccacag cctcttcagc ctctgtcagg ggaggacgac gcatattgta 1380 cgttcccctc acgggacgac cttctgctgt tttcaccctc actgctcggc ggaccctccc 1440 cgccaagcac ggcacctggg gggagtgggg caggagaaga aaggatgcct cctagtttgc 1500 aggagcgggt tcctcgcgac tgggatccgc aacccctcgg accacccacc cctggcgtac 1560 ctgatctggt cgacttccaa ccacctccgg agcttgtcct cagagaggcc ggagaggaag 1620 tcccagacgc ggggccaaga gagggtgtgt catttccctg gtcccgccct ccgggacagg 1680 gtgagtttcg ggcgctgaat gcgaggctcc cccttaatac cgatgcgtac ctgtcattgc 1740 aggaacttca gggccaggat cctacccacc tggtgggttc cggggagggc cgagggtcat 1800 tgctgacgtg tggagacgtg gaggagaatc ctggccccat gggcaacgag gccagctacc 1860 ctctggagat gtgctcccac ttcgacgccg acgagatcaa gcggctgggc aagcgcttca 1920 agaagctgga cctggacaac agcggcagcc tgagcgtgga ggagtttatg tctctgcccg 1980 agctgcagca gaaccccctg gtgcagcgcg tgatcgacat cttcgacacc gacggcaacg 2040 gcgaggtgga cttcaaggag ttcatcgagg gcgtgagcca gttcagcgtg aagggcgaca 2100 aggagcagaa gctgcggttc gccttccgga tctacgatat ggataaagat ggctatattt 2160 ctaatggcga gctgttccag gtgctgaaga tgatggtggg caacaatacc aagctggccg 2220 atacccagct gcagcagatc gtggacaaga ccatcatcaa cgccgacaag gacggcgacg 2280 gcagaatcag cttcgaggag ttctgtgccg tggtgggagg cctggatatt cacaaaaaaa 2340 tggtggtgga cgtgggaagc ggagctacta acttcagcct gctgaagcag gctggagacg 2400 tggaggagaa ccctggacct atgggtgctg gcgcaactgg acgcgctatg gatggacctc 2460 gcttgctgct tcttctgctt ctcggggtct ctttgggtgg tgctaaggaa gcatgcccaa 2520 cgggacttta tacgcatagc ggagagtgtt gcaaagcttg taacctgggc gaaggcgtcg 2580 cgcaaccttg tggtgcaaat caaaccgtct gcgagccatg tttggactct gttacgttta 2640 gtgacgtagt atctgcgaca gagccatgca agccttgtac ggaatgtgta ggattgcaga 2700 gcatgtctgc cccttgtgta gaagccgacg atgcagtttg caggtgcgcg tatggctatt 2760 accaagacga aacaaccgga cgatgtgaag cttgccgagt ttgtgaagcg ggttccgggc 2820 ttgtattctc ctgtcaggat aagcagaaca ccgtctgcga agagtgcccc gatggtacct 2880 acagcgatga agcgaaccat gtagacccat gcctgccttg caccgtttgt gaagacacgg 2940 aacgacagtt gcgggaatgt acccggtggg cagacgccga gtgcgaagag attccaggcc 3000 gctggatcac gcgaagtacc ccgccagaag gttccgacag tactgcacca agcacccaag 3060 aaccagaggc gccccccgag caggacctga ttgcctccac cgtggcgggt gttgttacta 3120 cggttatggg ctcatcccag cccgttgtta cccgaggaac tacagacaac ctgattccgg 3180 tatattgttc tatcttggcg gctgtagtag ttggcttggt cgcgtacatc gctttcaaaa 3240 gatgagtaag ataatcaacc tctggattac aaaatttgtg aaagattgac tggtattctt 3300 aactatgttg ctccttttac gctatgtgga tacgctgctt taatgccttt gtatcatgct 3360 attgcttccc gtatggcttt cattttctcc tccttgtata aatcctggtt agttcttgcc 3420 acggcggaac tcatcgccgc ctgccttgcc cgctgctgga caggggctcg gctgttgggc 3480 actgacaatt ccgtggtgtg ccttctagtt gccagccatc tgttgtttgc ccctcccccg 3540 tgccttcctt gaccctggaa ggtgccactc ccactgtcct ttcctaataa aatgaggaaa 3600 ttgcatcgca ttgtctgagt aggtgtcatt ctattctggg gggtggggtg gggcaggaca 3660 gcaaggggga ggattgggaa gacaatagca ggcatgctgg ggatgcggtg ggctctacgc 3720 cggcgtggcg gtctatggac ttcaagagca acagtgctgt ggcctggagc aacaaatctg 3780 actttgcatg tgcaaacgcc ttcaacaaca gcattattcc agaagacacc ttcttcccca 3840 gcccaggtaa gggcagcttt ggtgccttcg caggctgttt ccttgcttca ggaatggcca 3900 ggttctgccc agagctctgg tcaatgatgt ctaaaactcc tctgattggt ggtctcggcc 3960 ttatccattg ccaccaaaac cctcttttta ctaagaaaca gtgagccttg ttctggcagt 4020 ccagagaatg acacgggaaa aaagcagatg aagagaaggt ggcaggagag ggcacgtggc 4080 ccagcctcag tctctccaac tgagttcctg cctgcctgcc tttgctcaga ctgtttgccc 4140 cttactgctc 4150 <210> 72 <211> 3940 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> pCB0116 <400> 72 ccgcgccagg cctggccgtg aacgttcact gaaatcatgg cctcttggcc aagattgata 60 gcttgtgcct gtccctgagt cccagtccat cacgagcagc tggtttctaa gatgctattt 120 cccgtataaa gcatgagacc gtgacttgcc agccccacag agccccgccc ttgtccatca 180 ctggcatctg gactccagcc tgggttgggg caaagaggga aatgagatca tgtcctaacc 240 ctgatcctct tgtcccacag atatccagaa ccctgaccct gccgtgtacc agctgagaga 300 ctctaaatcc agtgacaagt ctgtctgcct attcaccgat tttgattctc aaacaaatgt 360 gtcacaaagt aaggattctg atgtgtatat cacatgttaa ttaagtgtga acagagaaac 420 aggagaatat gggccaaaca ggatatctgt ggtaagcagt tcctgccccg gctcagggcc 480 aagaacagtt ggaacagcag aatatgggcc aaacaggata tctgtggtaa gcagttcctg 540 ccccggctca gggccaagaa cagatggtcc ccagatgcgg tcccgccctc agcagtttct 600 agagaaccat cagatgtttc cagggtgccc caaggacctg aaatgaccct gtgccttatt 660 tgaactaacc aatcagttcg cttctcgctt ctgttcgcgc gcttctgctc cccgagctct 720 atataagcag agctcgttta gtgaaccgtc agatcgccgc caccatgagc aggtcagtgg 780 cgttggcggt tctggcgctt ttgagtttga gcggactgga agccatccaa cgaacgccta 840 agatccaggt atattcacgc cacccggcgg aaaacggcaa aagtaacttc cttaattgtt 900 atgtgtctgg cttccacccg tctgatattg aggtggacct ccttaaaaac ggtgaacgga 960 tcgagaaagt ggagcattcc gatcttagtt tcagtaagga ttggagcttt taccttctct 1020 attacactga gttcactccg actgaaaagg atgagtacgc ctgtcgggtc aaccacgtca 1080 ccctgtctca accaaaaata gtcaaatggg acagagatat gtcagatatt tacatatggg 1140 caccacttgc gggcacgtgt ggcgtcctgc ttctgagtct cgtcattacg ctttattgta 1200 aacggggtag aaaaaaactc ctttatatat ttaaacagcc atttatgcgg ccagttcaaa 1260 cgacgcagga agaagacggc tgtagttgca gatttccaga ggaagaggaa ggtggatgcg 1320 agcttcgggt caagtttagt aggtctgcag acgctcccgc ctatcaacag ggtcagaatc 1380 agctttataa cgaactcaac ctcggtcgcc gagaagagta cgacgtactc gataaaagaa 1440 ggggtagaga cccggaaatg gggggcaaac cgcgccgcaa aaatccacaa gaggggcttt 1500 ataatgagct tcaaaaagac aaaatggccg aagcatacag tgagattggg atgaaaggtg 1560 aacgcagaag aggtaagggt cacgacgggc tgtaccaggg tttgtcaact gccacaaagg 1620 atacttatga cgctctgcat atgcaagctc ttcccccacg cggatccggc gctacaaatt 1680 tttcactgct gaaacaggcg ggtgatgtgg aggagaaccc tggacccatg ccacttggcc 1740 tgctctggct gggcttggca ttgctcggcg cgctccacgc ccaggctgaa ctgatccgcg 1800 tggccatatt gtggcatgag atgtggcatg agggattgga ggaggcgagt aggctgtact 1860 ttggggaaag gaatgttaaa gggatgtttg aggtccttga acccctccac gctatgatgg 1920 aaagaggacc tcaaacgctt aaagagacgt cattcaatca agcctatgga cgggatctta 1980 tggaagctca agaatggtgt cgaaaataca tgaaaagcgg gaatgttaag gacctcacgc 2040 aagcctggga tctgtattac catgttttcc gacgcatttc taaacaagga aaagatacta 2100 tcccatggtt ggggcacttg ctcgttgggc tcagtggggc gtttggattc atcatcctcg 2160 tatatctgtt gattaattgt cggaacacag gtccctggct taaaaaagtt ttgaagtgta 2220 acaccccgga tccttctaaa ttttttagtc aacttagttc agaacacggg ggcgatgttc 2280 aaaagtggct gagttccccg tttcccagtt caagtttctc ccctgggggt ctcgcccccg 2340 agatatcacc tcttgaagtg ctcgagcggg acaaagttac acagcttctt ttgcaacagg 2400 ataaggttcc ggagccggcg tctctcagct ctaaccattc actcacttct tgtttcacca 2460 accaagggta ttttttcttc catctgcctg atgccttgga gattgaggct tgtcaggtgt 2520 actttaccta tgacccctat agtgaggaag accctgacga aggcgtagct ggcgccccca 2580 ctggctccag tccacagcct cttcagcctc tgtcagggga ggacgacgca tattgtacgt 2640 tcccctcacg ggacgacctt ctgctgtttt caccctcact gctcggcgga ccctccccgc 2700 caagcacggc acctgggggg agtggggcag gagaagaaag gatgcctcct agtttgcagg 2760 agcgggttcc tcgcgactgg gatccgcaac ccctcggacc acccacccct ggcgtacctg 2820 atctggtcga cttccaacca cctccggagc ttgtcctcag agaggccgga gaggaagtcc 2880 cagacgcggg gccaagagag ggtgtgtcat ttccctggtc ccgccctccg ggacagggtg 2940 agtttcgggc gctgaatgcg aggctccccc ttaataccga tgcgtacctg tcattgcagg 3000 aacttcaggg ccaggatcct acccacctgg tgtgagtaag ataatcaacc tctggattac 3060 aaaatttgtg aaagattgac tggtattctt aactatgttg ctccttttac gctatgtgga 3120 tacgctgctt taatgccttt gtatcatgct attgcttccc gtatggcttt cattttctcc 3180 tccttgtata aatcctggtt agttcttgcc acggcggaac tcatcgccgc ctgccttgcc 3240 cgctgctgga caggggctcg gctgttgggc actgacaatt ccgtggtgtg ccttctagtt 3300 gccagccatc tgttgtttgc ccctcccccg tgccttcctt gaccctggaa ggtgccactc 3360 ccactgtcct ttcctaataa aatgaggaaa ttgcatcgca ttgtctgagt aggtgtcatt 3420 ctattctggg gggtggggtg gggcaggaca gcaaggggga ggattgggaa gacaatagca 3480 ggcatgctgg ggatgcggtg ggctctacgc cggcgtggcg gtctatggac ttcaagagca 3540 acagtgctgt ggcctggagc aacaaatctg actttgcatg tgcaaacgcc ttcaacaaca 3600 gcattattcc agaagacacc ttcttcccca gcccaggtaa gggcagcttt ggtgccttcg 3660 caggctgttt ccttgcttca ggaatggcca ggttctgccc agagctctgg tcaatgatgt 3720 ctaaaactcc tctgattggt ggtctcggcc ttatccattg ccaccaaaac cctcttttta 3780 ctaagaaaca gtgagccttg ttctggcagt ccagagaatg acacgggaaa aaagcagatg 3840 aagagaaggt ggcaggagag ggcacgtggc ccagcctcag tctctccaac tgagttcctg 3900 cctgcctgcc tttgctcaga ctgtttgccc cttactgctc 3940 <210> 73 <211> 3110 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> pCB0117 <400> 73 caacctctag aaatcaaggt ttttctgtgt agggttgggt tagcgtgttg ttagagtagg 60 ggagtggatt gagaaggagg ctgaggggta ctcaaggggg ctatagaatg tataggattt 120 ccctgaagca ttcctagaga gcctgcaagg tgaagatggc tttggaacca gctggatcta 180 ggctgtgcca catactacct ctttggcctt ggccacatcc ctaaactctt ggattctgtt 240 tcctaagatg taagatggag gtaattgttc ctgcctcaca ggagctgttg tgaggattaa 300 acagagagta tgtctttagc gcggtgcctg gcaccagtgc ctggcatgta gtaggggcac 360 aacaaatata aggtccactt tgcttttctt ttttctatag ttcggatccg gcgctacaaa 420 tttttcactg ctgaaacagg cgggtgatgt ggaggagaac cctggaccca tgggcaacga 480 ggccagctac cctctggaga tgtgctccca cttcgacgcc gacgagatca agcggctggg 540 caagcgcttc aagaagctgg acctggacaa cagcggcagc ctgagcgtgg aggagtttat 600 gtctctgccc gagctgcagc agaaccccct ggtgcagcgc gtgatcgaca tcttcgacac 660 cgacggcaac ggcgaggtgg acttcaagga gttcatcgag ggcgtgagcc agttcagcgt 720 gaagggcgac aaggagcaga agctgcggtt cgccttccgg atctacgata tggataaaga 780 tggctatatt tctaatggcg agctgttcca ggtgctgaag atgatggtgg gcaacaatac 840 caagctggcc gatacccagc tgcagcagat cgtggacaag accatcatca acgccgacaa 900 ggacggcgac ggcagaatca gcttcgagga gttctgtgcc gtggtgggag gcctggatat 960 tcacaaaaaa atggtggtgg acgtgggaag cggagctact aacttcagcc tgctgaagca 1020 ggctggagac gtggaggaga accctggacc tatgggtgct ggcgcaactg gacgcgctat 1080 ggatggacct cgcttgctgc ttcttctgct tctcggggtc tctttgggtg gtgctaagga 1140 agcatgccca acgggacttt atacgcatag cggagagtgt tgcaaagctt gtaacctggg 1200 cgaaggcgtc gcgcaacctt gtggtgcaaa tcaaaccgtc tgcgagccat gtttggactc 1260 tgttacgttt agtgacgtag tatctgcgac agagccatgc aagccttgta cggaatgtgt 1320 aggattgcag agcatgtctg ccccttgtgt agaagccgac gatgcagttt gcaggtgcgc 1380 gtatggctat taccaagacg aaacaaccgg acgatgtgaa gcttgccgag tttgtgaagc 1440 gggttccggg cttgtattct cctgtcagga taagcagaac accgtctgcg aagagtgccc 1500 cgatggtacc tacagcgatg aagcgaacca tgtagaccca tgcctgcctt gcaccgtttg 1560 tgaagacacg gaacgacagt tgcgggaatg tacccggtgg gcagacgccg agtgcgaaga 1620 gattccaggc cgctggatca cgcgaagtac cccgccagaa ggttccgaca gtactgcacc 1680 aagcacccaa gaaccagagg cgccccccga gcaggacctg attgcctcca ccgtggcggg 1740 tgttgttact acggttatgg gctcatccca gcccgttgtt acccgaggaa ctacagacaa 1800 cctgattccg gtatattgtt ctatcttggc ggctgtagta gttggcttgg tcgcgtacat 1860 cgctttcaaa agaggttccg gggagggccg agggtcattg ctgacgtgtg gagacgtgga 1920 ggagaatcct ggccccatgg agatgtggca tgagggtctg gaagaagcgt ctcgactgta 1980 ctttggtgag cgcaatgtga agggcatgtt tgaagtcctc gaaccccttc atgccatgat 2040 ggaacgcgga ccccagacct tgaaggagac aagttttaac caagcttacg gaagagacct 2100 gatggaagcc caggaatggt gcaggaaata catgaaaagc gggaatgtga aggacttgct 2160 ccaagcgtgg gacctgtact atcatgtctt taggcgcatt agtaagggat ccggcgctac 2220 aaatttttca ctgctgaaac aggcgggtga tgtggaggag aaccctggac ccatgcctct 2280 gggcctgctg tggctgggcc tggccctgct gggcgccctg cacgcccagg ccggcgtgca 2340 ggtggagaca atctccccag gcgacggacg cacattccct aagcggggcc agacctgcgt 2400 ggtgcactat acaggcatgc tggaggatgg caagaagttt gacagctccc gggatagaaa 2460 caagccattc aagtttatgc tgggcaagca ggaagtgatc agaggctggg aggagggcgt 2520 ggcccagatg tctgtgggcc agagggccaa gctgaccatc agcccagact acgcctatgg 2580 agcaacaggc cacccaggaa tcatcccacc tcacgccacc ctggtgttcg atgtggagct 2640 gctgaagctg ggcgagggca gcaacaccag caaagagaat cctttcctgt ttgcattgga 2700 agccgtggtt atctctgttg gctccatggg attgattatc agccttctct gtgtgtattt 2760 ctggctggaa cggtgagatt tggagaagcc cagaaaaatg aggggaacgg tagctgacaa 2820 tagcagagga gggttttgca gggtctttag gagtaaagga tgagacagta agtaatgaga 2880 gattacccaa gagggtttgg tgatggaagg aagccacagg cacagagaac acagaatcac 2940 tttatttcat atgggacaac tgggagaagg gtgataaaaa agctttaacc tatgtgctcc 3000 tgctccctct ttctcccctg tcaggacgat gccccgaatt cccaccctga agaacctaga 3060 ggatcttgtt actgaatacc acgggaactt ttcggtgaga acgctgtcat 3110 <210> 74 <211> 2236 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> pCB0120 <400> 74 ccgcgccagg cctggccgtg aacgttcact gaaatcatgg cctcttggcc aagattgata 60 gcttgtgcct gtccctgagt cccagtccat cacgagcagc tggtttctaa gatgctattt 120 cccgtataaa gcatgagacc gtgacttgcc agccccacag agccccgccc ttgtccatca 180 ctggcatctg gactccagcc tgggttgggg caaagaggga aatgagatca tgtcctaacc 240 ctgatcctct tgtcccacag atatccagaa ccctgaccct gccgtgtacc agctgagaga 300 ctctaaatcc agtgacaagt ctgtctgcct attcaccgat tttgattctc aaacaaatgt 360 gtcacaaagt aaggattctg atgtgtatat cacatgttaa ttaaatgaaa taaaagatct 420 ttattttcat tagatctgtg tgttggtttt ttgtgtgaac agagaaacag gagaatatgg 480 gccaaacagg atatctgtgg taagcagttc ctgccccggc tcagggccaa gaacagttgg 540 aacagcagaa tatgggccaa acaggatatc tgtggtaagc agttcctgcc ccggctcagg 600 gccaagaaca gatggtcccc agatgcggtc ccgccctcag cagtttctag agaaccatca 660 gatgtttcca gggtgcccca aggacctgaa atgaccctgt gccttatttg aactaaccaa 720 tcagttcgct tctcgcttct gttcgcgcgc ttctgctccc cgagctctat ataagcagag 780 ctcgtttagt gaaccgtcag atcgccgcca ccatgggcaa cgaggccagc taccctctgg 840 agatgtgctc ccacttcgac gccgacgaga tcaagcggct gggcaagcgc ttcaagaagc 900 tggacctgga caacagcggc agcctgagcg tggaggagtt tatgtctctg cccgagctgc 960 agcagaaccc cctggtgcag cgcgtgatcg acatcttcga caccgacggc aacggcgagg 1020 tggacttcaa ggagttcatc gagggcgtga gccagttcag cgtgaagggc gacaaggagc 1080 agaagctgcg gttcgccttc cggatctacg atatggataa agatggctat atttctaatg 1140 gcgagctgtt ccaggtgctg aagatgatgg tgggcaacaa taccaagctg gccgataccc 1200 agctgcagca gatcgtggac aagaccatca tcaacgccga caaggacggc gacggcagaa 1260 tcagcttcga ggagttctgt gccgtggtgg gaggcctgga tattcacaaa aaaatggtgg 1320 tggacgtgtg agtaagataa tcaacctctg gattacaaaa tttgtgaaag attgactggt 1380 attcttaact atgttgctcc ttttacgcta tgtggatacg ctgctttaat gcctttgtat 1440 catgctattg cttcccgtat ggctttcatt ttctcctcct tgtataaatc ctggttagtt 1500 cttgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 1560 ttgggcactg acaattccgt ggtgtgcctt ctagttgcca gccatctgtt gtttgcccct 1620 cccccgtgcc ttccttgacc ctggaaggtg ccactcccac tgtcctttcc taataaaatg 1680 aggaaattgc atcgcattgt ctgagtaggt gtcattctat tctggggggt ggggtggggc 1740 aggacagcaa gggggaggat tgggaagaca atagcaggca tgctggggat gcggtgggct 1800 ctacgccggc gtggcggtct atggacttca agagcaacag tgctgtggcc tggagcaaca 1860 aatctgactt tgcatgtgca aacgccttca acaacagcat tattccagaa gacaccttct 1920 tccccagccc aggtaagggc agctttggtg ccttcgcagg ctgtttcctt gcttcaggaa 1980 tggccaggtt ctgcccagag ctctggtcaa tgatgtctaa aactcctctg attggtggtc 2040 tcggccttat ccattgccac caaaaccctc tttttactaa gaaacagtga gccttgttct 2100 ggcagtccag agaatgacac gggaaaaaag cagatgaaga gaaggtggca ggagagggca 2160 cgtggcccag cctcagtctc tccaactgag ttcctgcctg cctgcctttg ctcagactgt 2220 ttgcccctta ctgctc 2236 <210> 75 <211> 2603 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> pCB0121 <400> 75 caacctctag aaatcaaggt ttttctgtgt agggttgggt tagcgtgttg ttagagtagg 60 ggagtggatt gagaaggagg ctgaggggta ctcaaggggg ctatagaatg tataggattt 120 ccctgaagca ttcctagaga gcctgcaagg tgaagatggc tttggaacca gctggatcta 180 ggctgtgcca catactacct ctttggcctt ggccacatcc ctaaactctt ggattctgtt 240 tcctaagatg taagatggag gtaattgttc ctgcctcaca ggagctgttg tgaggattaa 300 acagagagta tgtctttagc gcggtgcctg gcaccagtgc ctggcatgta gtaggggcac 360 aacaaatata aggtccactt tgcttttctt ttttctatag ttcggatccg gcgctacaaa 420 tttttcactg ctgaaacagg cgggtgatgt ggaggagaac cctggaccca tgagcaggtc 480 agtggcgttg gcggttctgg cgcttttgag tttgagcgga ctggaagcca tccaacgaac 540 gcctaagatc caggtatatt cacgccaccc ggcggaaaac ggcaaaagta acttccttaa 600 ttgttatgtg tctggcttcc acccgtctga tattgaggtg gacctcctta aaaacggtga 660 acggatcgag aaagtggagc attccgatct tagtttcagt aaggattgga gcttttacct 720 tctctattac actgagttca ctccgactga aaaggatgag tacgcctgtc gggtcaacca 780 cgtcaccctg tctcaaccaa aaatagtcaa atgggacaga gatatgtcag atatttacat 840 atgggcacca cttgcgggca cgtgtggcgt cctgcttctg agtctcgtca ttacgcttta 900 ttgtaaacgg ggtagaaaaa aactccttta tatatttaaa cagccattta tgcggccagt 960 tcaaacgacg caggaagaag acggctgtag ttgcagattt ccagaggaag aggaaggtgg 1020 atgcgagctt cgggtcaagt ttagtaggtc tgcagacgct cccgcctatc aacagggtca 1080 gaatcagctt tataacgaac tcaacctcgg tcgccgagaa gagtacgacg tactcgataa 1140 aagaaggggt agagacccgg aaatgggggg caaaccgcgc cgcaaaaatc cacaagaggg 1200 gctttataat gagcttcaaa aagacaaaat ggccgaagca tacagtgaga ttgggatgaa 1260 aggtgaacgc agaagaggta agggtcacga cgggctgtac cagggtttgt caactgccac 1320 aaaggatact tatgacgctc tgcatatgca agctcttccc ccacgcggtt ccggggaggg 1380 ccgagggtca ttgctgacgt gtggagacgt ggaggagaat cctggcccca tggagatgtg 1440 gcatgagggt ctggaagaag cgtctcgact gtactttggt gagcgcaatg tgaagggcat 1500 gtttgaagtc ctcgaacccc ttcatgccat gatggaacgc ggaccccaga ccttgaagga 1560 gacaagtttt aaccaagctt acggaagaga cctgatggaa gcccaggaat ggtgcaggaa 1620 atacatgaaa agcgggaatg tgaaggactt gctccaagcg tgggacctgt actatcatgt 1680 ctttaggcgc attagtaagg gatccggcgc tacaaatttt tcactgctga aacaggcggg 1740 tgatgtggag gagaaccctg gacccatgcc tctgggcctg ctgtggctgg gcctggccct 1800 gctgggcgcc ctgcacgccc aggccggcgt gcaggtggag acaatctccc caggcgacgg 1860 acgcacattc cctaagcggg gccagacctg cgtggtgcac tatacaggca tgctggagga 1920 tggcaagaag tttgacagct cccgggatag aaacaagcca ttcaagttta tgctgggcaa 1980 gcaggaagtg atcagaggct gggaggaggg cgtggcccag atgtctgtgg gccagagggc 2040 caagctgacc atcagcccag actacgccta tggagcaaca ggccacccag gaatcatccc 2100 acctcacgcc accctggtgt tcgatgtgga gctgctgaag ctgggcgagg gcagcaacac 2160 cagcaaagag aatcctttcc tgtttgcatt ggaagccgtg gttatctctg ttggctccat 2220 gggattgatt atcagccttc tctgtgtgta tttctggctg gaacggtgag atttggagaa 2280 gcccagaaaa atgaggggaa cggtagctga caatagcaga ggagggtttt gcagggtctt 2340 taggagtaaa ggatgagaca gtaagtaatg agagattacc caagagggtt tggtgatgga 2400 aggaagccac aggcacagag aacacagaat cactttattt catatgggac aactgggaga 2460 agggtgataa aaaagcttta acctatgtgc tcctgctccc tctttctccc ctgtcaggac 2520 gatgccccga attcccaccc tgaagaacct agaggatctt gttactgaat accacgggaa 2580 cttttcggtg agaacgctgt cat 2603 <210> 76 <211> 4253 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> pCB2042 <400> 76 gtgacttgcc agccccacag agccccgccc ttgtccatca ctggcatctg gactccagcc 60 tgggttgggg caaagaggga aatgagatca tgtcctaacc ctgatcctct tgtcccacag 120 atatccagaa ccctgaccct gccgtgtacc agctgagaga ctctaaatcc agtgacaagt 180 ctgtctgcct attcaccgat tttgattctc aaacaaatgt gtcacaaagt aaggattctg 240 atgtgtatat cacatgttaa ttaacccacg gggttggacg cgtaggaaca gagaaacagg 300 agaatatggg ccaaacagga tatctgtggt aagcagttcc tgccccggct cagggccaag 360 aacagttgga acagcagaat atgggccaaa caggatatct gtggtaagca gttcctgccc 420 cggctcaggg ccaagaacag atggtcccca gatgcggtcc cgccctcagc agtttctaga 480 gaaccatcag atgtttccag ggtgccccaa ggacctgaaa tgaccctgtg ccttatttga 540 actaaccaat cagttcgctt ctcgcttctg ttcgcgcgct tctgctcccc gagctctata 600 taagcagagc tcgtttagtg aaccgtcaga tcgctagcac cggtgccgcc accatgcctc 660 tgggcctgct gtggctgggc ctggccctgc tgggcgccct gcacgcccag gccggcgtgc 720 aggtggagac aatctcccca ggcgacggac gcacattccc taagcggggc cagacctgcg 780 ttgtgcacta tacaggcatg ctggaggatg gcaagaagtt tgacagctcc cgggatagaa 840 acaagccatt caagtttatg ctgggcaagc aggaagtgat cagaggctgg gaggagggcg 900 tggcccagat gtctgtgggc cagagggcca agctgaccat cagcccagac tacgcctatg 960 gagcaacagg ccacccagga atcatcccac ctcacgccac cctggtgttc gatgtggagc 1020 tgctgaagct gggcgaggga tccaacacat caaaagagaa cccctttctg ttcgcattgg 1080 aggccgtagt catatctgtt ggatccatgg gacttattat ctccctgttg tgtgtgtact 1140 tctggctgga acggactatg cccaggatcc ccacgctcaa gaatctggaa gatctcgtca 1200 cagaatacca tggtaatttc agcgcctgga gcggagtctc taagggtctg gccgaatccc 1260 tccaacccga ttattctgaa cggttgtgcc tcgtatccga aataccacca aaaggcgggg 1320 ctctgggtga gggcccaggg gcgagtccgt gcaatcaaca cagcccgtat tgggcccctc 1380 cttgttatac gttgaagccc gaaactggaa gcggagctac taacttcagc ctgctgaagc 1440 aggctggaga cgtggaggag aaccctggac ctatggcact gcccgtgacc gccctgctgc 1500 tgcctctggc cctgctgctg cacgcagccc ggcctatcct gtggcacgag atgtggcacg 1560 agggcctgga ggaggccagc aggctgtatt ttggcgagcg caacgtgaag ggcatgttcg 1620 aggtgctgga gcctctgcac gccatgatgg agagaggccc acagaccctg aaggagacat 1680 cctttaacca ggcctatgga cgggacctga tggaggcaca ggagtggtgc agaaagtaca 1740 tgaagtctgg caatgtgaag gacctgctgc aggcctggga tctgtactat cacgtgtttc 1800 ggagaatctc caagggcaaa gacacgattc cgtggcttgg gcatctgctc gttgggctga 1860 gtggtgcgtt tggtttcatc atcttggtct atctcttgat caattgcaga aatacaggcc 1920 cttggctgaa aaaagtgctc aagtgtaata cccccgaccc aagcaagttc ttctcccagc 1980 tttcttcaga gcatggaggc gatgtgcaga aatggctctc ttcacctttt ccctcctcaa 2040 gcttctcccc gggagggctg gcgcccgaga tttcacctct tgaggtactt gaacgagaca 2100 aggttaccca acttctcctt caacaggata aggtacccga acctgcgagc cttagctcca 2160 accactctct tacgagctgc ttcaccaatc agggatactt ctttttccac cttcccgatg 2220 cgctggaaat cgaagcttgt caagtttact ttacctatga tccatatagc gaggaagatc 2280 ccgacgaagg agtcgccggt gcgcccacgg gttcctcacc ccaacctctc cagcctctct 2340 caggagaaga tgatgcttat tgcacttttc ccagtagaga cgatctcctc ctcttttctc 2400 catctctttt ggggggacct tccccccctt ctacggcacc tggcgggtct ggtgctggcg 2460 aggagcggat gccgccgtcc ctccaggagc gagtaccacg agattgggat ccccagccac 2520 ttggaccccc cacccccggc gtacctgacc ttgtcgattt tcaacctccc cctgaattgg 2580 tgctgcgaga ggctggggag gaagttccgg acgctgggcc gagggagggc gtgtcctttc 2640 catggagtag gcctccaggt caaggcgagt ttagggctct caacgcgcgg ctgccgttga 2700 atacagacgc ttatctctca ctgcaggaac tgcaaggtca ggacccaaca catcttgtag 2760 gatctggtgc tactaatttt tctcttttga agcaagctgg agatgttgaa gagaaccccg 2820 gtccggagat gtggcatgag ggtctggaag aagcgtctcg actgtacttt ggtgagcgca 2880 atgtgaaggg catgtttgaa gtcctcgaac cccttcatgc catgatggaa cgcggacccc 2940 agaccttgaa ggagacaagt tttaaccaag cttacggaag agacctgatg gaagcccagg 3000 aatggtgcag gaaatacatg aaaagcggga atgtgaagga cttgctccaa gcgtgggacc 3060 tgtactatca tgtctttagg cgcattagta agggcagcgg cgccaccaac ttcagcctgc 3120 tgaagcaggc cggcgacgtg gaggagaacc ccggccccgt gagcaagggc gaggaggata 3180 acatggccat catcaaggag ttcatgcgct tcaaggtgca catggagggc tccgtgaacg 3240 gccacgagtt cgagatcgag ggcgagggcg agggccgccc ctacgagggc acccagaccg 3300 ccaagctgaa ggtgaccaag ggtggccccc tgcccttcgc ctgggacatc ctgtcccctc 3360 agttcatgta cggctccaag gcctacgtga agcaccccgc cgacatcccc gactacttga 3420 agctgtcctt ccccgagggc ttcaagtggg agcgcgtgat gaacttcgag gacggcggcg 3480 tggtgaccgt gacccaggac tcctctctgc aggacggcga gttcatctac aaggtgaagc 3540 tgcgcggcac caacttcccc tccgacggcc ccgtaatgca gaagaagacc atgggctggg 3600 aggcctcctc cgagcggatg taccccgagg acggcgccct gaagggcgag atcaagcaga 3660 ggctgaagct gaaggacggc ggccactacg acgctgaggt caagaccacc tacaaggcca 3720 agaagcccgt gcagctgccc ggcgcctaca acgtcaacat caagttggac atcacctccc 3780 acaacgagga ctacaccatc gtggaacagt acgaacgcgc cgagggccgc cactccaccg 3840 gcggcatgga cgagctgtac aagtgaacta gtgaacttgt ttattgcagc ttataatggt 3900 tacaaataaa gcaatagcat cacaaatttc acaaataaag catttttttc actgcattct 3960 agttgtggtt tgtccaaact catcaatgta tcttacgccg gcgtggcggt ctatggactt 4020 caagagcaac agtgctgtgg cctggagcaa caaatctgac tttgcatgtg caaacgcctt 4080 caacaacagc attattccag aagacacctt cttccccagc ccaggtaagg gcagctttgg 4140 tgccttcgca ggctgtttcc ttgcttcagg aatggccagg ttctgcccag agctctggtc 4200 aatgatgtct aaaactcctc tgattggtgg tctcggcctt atccattgcc acc 4253 <210> 77 <211> 4474 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> pCB2043 <400> 77 ccgcgccagg cctggccgtg aacgttcact gaaatcatgg cctcttggcc aagattgata 60 gcttgtgcct gtccctgagt cccagtccat cacgagcagc tggtttctaa gatgctattt 120 cccgtataaa gcatgagacc gtgacttgcc agccccacag agccccgccc ttgtccatca 180 ctggcatctg gactccagcc tgggttgggg caaagaggga aatgagatca tgtcctaacc 240 ctgatcctct tgtcccacag atatccagaa ccctgaccct gccgtgtacc agctgagaga 300 ctctaaatcc agtgacaagt ctgtctgcct attcaccgat tttgattctc aaacaaatgt 360 gtcacaaagt aaggattctg atgtgtatat cacatgttaa ttaaatgaaa taaaagatct 420 ttattttcat tagatctgtg tgttggtttt ttgtgtgaac agagaaacag gagaatatgg 480 gccaaacagg atatctgtgg taagcagttc ctgccccggc tcagggccaa gaacagttgg 540 aacagcagaa tatgggccaa acaggatatc tgtggtaagc agttcctgcc ccggctcagg 600 gccaagaaca gatggtcccc agatgcggtc ccgccctcag cagtttctag agaaccatca 660 gatgtttcca gggtgcccca aggacctgaa atgaccctgt gccttatttg aactaaccaa 720 tcagttcgct tctcgcttct gttcgcgcgc ttctgctccc cgagctctat ataagcagag 780 ctcgtttagt gaaccgtcag atcgccgcca ccatgggcaa cgaggccagc taccctctgg 840 agatgtgctc ccacttcgac gccgacgaga tcaagcggct gggcaagcgc ttcaagaagc 900 tggacctgga caacagcggc agcctgagcg tggaggagtt tatgtctctg cccgagctgc 960 agcagaaccc cctggtgcag cgcgtgatcg acatcttcga caccgacggc aacggcgagg 1020 tggacttcaa ggagttcatc gagggcgtga gccagttcag cgtgaagggc gacaaggagc 1080 agaagctgcg gttcgccttc cggatctacg atatggataa agatggctat atttctaatg 1140 gcgagctgtt ccaggtgctg aagatgatgg tgggcaacaa taccaagctg gccgataccc 1200 agctgcagca gatcgtggac aagaccatca tcaacgccga caaggacggc gacggcagaa 1260 tcagcttcga ggagttctgt gccgtggtgg gaggcctgga tattcacaaa aaaatggtgg 1320 tggacgtggg aagcggagct actaacttca gcctgctgaa gcaggctgga gacgtggagg 1380 agaaccctgg acctatgggt gctggcgcaa ctggacgcgc tatggatgga cctcgcttgc 1440 tgcttcttct gcttctcggg gtctctttgg gtggtgctaa ggaagcatgc ccaacgggac 1500 tttatacgca tagcggagag tgttgcaaag cttgtaacct gggcgaaggc gtcgcgcaac 1560 cttgtggtgc aaatcaaacc gtctgcgagc catgtttgga ctctgttacg tttagtgacg 1620 tagtatctgc gacagagcca tgcaagcctt gtacggaatg tgtaggattg cagagcatgt 1680 ctgccccttg tgtagaagcc gacgatgcag tttgcaggtg cgcgtatggc tattaccaag 1740 acgaaacaac cggacgatgt gaagcttgcc gagtttgtga agcgggttcc gggcttgtat 1800 tctcctgtca ggataagcag aacaccgtct gcgaagagtg ccccgatggt acctacagcg 1860 atgaagcgaa ccatgtagac ccatgcctgc cttgcaccgt ttgtgaagac acggaacgac 1920 agttgcggga atgtacccgg tgggcagacg ccgagtgcga agagattcca ggccgctgga 1980 tcacgcgaag taccccgcca gaaggttccg acagtactgc accaagcacc caagaaccag 2040 aggcgccccc cgagcaggac ctgattgcct ccaccgtggc gggtgttgtt actacggtta 2100 tgggctcatc ccagcccgtt gttacccgag gaactacaga caacctgatt ccggtatatt 2160 gttctatctt ggcggctgta gtagttggct tggtcgcgta catcgctttc aaaagaggaa 2220 gcggagctac taacttcagc ctgctgaagc aggctggaga cgtggaggag aaccctggac 2280 ctatggcact gcccgtgacc gccctgctgc tgcctctggc cctgctgctg cacgcagccc 2340 ggcctatcct gtggcacgag atgtggcacg agggcctgga ggaggccagc aggctgtatt 2400 ttggcgagcg caacgtgaag ggcatgttcg aggtgctgga gcctctgcac gccatgatgg 2460 agagaggccc acagaccctg aaggagacat cctttaacca ggcctatgga cgggacctga 2520 tggaggcaca ggagtggtgc agaaagtaca tgaagtctgg caatgtgaag gacctgctgc 2580 aggcctggga tctgtactat cacgtgtttc ggagaatctc caagggcaaa gacacgattc 2640 cgtggcttgg gcatctgctc gttgggctga gtggtgcgtt tggtttcatc atcttggtct 2700 atctcttgat caattgcaga aatacaggcc cttggctgaa aaaagtgctc aagtgtaata 2760 cccccgaccc aagcaagttc ttctcccagc tttcttcaga gcatggaggc gatgtgcaga 2820 aatggctctc ttcacctttt ccctcctcaa gcttctcccc gggagggctg gcgcccgaga 2880 tttcacctct tgaggtactt gaacgagaca aggttaccca acttctcctt caacaggata 2940 aggttcccga acctgcgagc cttagctcca accactctct tacgagctgc ttcaccaatc 3000 agggatactt ctttttccac cttcccgatg cgctggaaat cgaagcttgt caagtttact 3060 ttacctatga tccatatagc gaggaagatc ccgacgaagg agtcgccggt gcgcccacgg 3120 gttcctcacc ccaacctctc cagcctctct caggagaaga tgatgcttat tgcacttttc 3180 ccagtagaga cgatctcctc ctcttttctc catctctttt ggggggacct tccccccctt 3240 ctacggcacc tggcgggtct ggtgctggcg aggagcggat gccgccgtcc ctccaggagc 3300 gagtaccacg agattgggat ccccagccac ttggaccccc cacccccggc gtacctgacc 3360 ttgtcgattt tcaacctccc cctgaattgg tgctgcgaga ggctggggag gaagttccgg 3420 acgctgggcc gagggagggc gtgtcctttc catggagtag gcctccaggt caaggcgagt 3480 ttagggctct caacgcgcgg ctgccgttga atacagacgc ttatctctca ctgcaggaac 3540 tgcaaggtca ggacccaaca catcttgtag taagataatc aacctctgga ttacaaaatt 3600 tgtgaaagat tgactggtat tcttaactat gttgctcctt ttacgctatg tggatacgct 3660 gctttaatgc ctttgtatca tgctattgct tcccgtatgg ctttcatttt ctcctccttg 3720 tataaatcct ggttagttct tgccacggcg gaactcatcg ccgcctgcct tgcccgctgc 3780 tggacagggg ctcggctgtt gggcactgac aattccgtgg tgtgccttct agttgccagc 3840 catctgttgt ttgcccctcc cccgtgcctt ccttgaccct ggaaggtgcc actcccactg 3900 tcctttccta ataaaatgag gaaattgcat cgcattgtct gagtaggtgt cattctattc 3960 tggggggtgg ggtggggcag gacagcaagg gggaggattg ggaagacaat agcaggcatg 4020 ctggggatgc ggtgggctct acgccggcgt ggcggtctat ggacttcaag agcaacagtg 4080 ctgtggcctg gagcaacaaa tctgactttg catgtgcaaa cgccttcaac aacagcatta 4140 ttccagaaga caccttcttc cccagcccag gtaagggcag ctttggtgcc ttcgcaggct 4200 gtttccttgc ttcaggaatg gccaggttct gcccagagct ctggtcaatg atgtctaaaa 4260 ctcctctgat tggtggtctc ggccttatcc attgccacca aaaccctctt tttactaaga 4320 aacagtgagc cttgttctgg cagtccagag aatgacacgg gaaaaaagca gatgaagaga 4380 aggtggcagg agagggcacg tggcccagcc tcagtctctc caactgagtt cctgcctgcc 4440 tgcctttgct cagactgttt gccccttact gctc 4474 <210> 78 <211> 3425 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> pCB2044 <400> 78 gtgacttgcc agccccacag agccccgccc ttgtccatca ctggcatctg gactccagcc 60 tgggttgggg caaagaggga aatgagatca tgtcctaacc ctgatcctct tgtcccacag 120 atatccagaa ccctgaccct gccgtgtacc agctgagaga ctctaaatcc agtgacaagt 180 ctgtctgcct attcaccgat tttgattctc aaacaaatgt gtcacaaagt aaggattctg 240 atgtgtatat cacatgttaa ttaacccacg gggttggacg cgtaggaaca gagaaacagg 300 agaatatggg ccaaacagga tatctgtggt aagcagttcc tgccccggct cagggccaag 360 aacagttgga acagcagaat atgggccaaa caggatatct gtggtaagca gttcctgccc 420 cggctcaggg ccaagaacag atggtcccca gatgcggtcc cgccctcagc agtttctaga 480 gaaccatcag atgtttccag ggtgccccaa ggacctgaaa tgaccctgtg ccttatttga 540 actaaccaat cagttcgctt ctcgcttctg ttcgcgcgct tctgctcccc gagctctata 600 taagcagagc tcgtttagtg aaccgtcaga tcgctagcac cggtatggca ctgcccgtga 660 ccgccctgct gctgcctctg gccctgctgc tgcacgcagc ccggcctatc ctgtggcacg 720 agatgtggca cgagggcctg gaggaggcca gcaggctgta ttttggcgag cgcaacgtga 780 agggcatgtt cgaggtgctg gagcctctgc acgccatgat ggagagaggc ccacagaccc 840 tgaaggagac atcctttaac caggcctatg gacgggacct gatggaggca caggagtggt 900 gcagaaagta catgaagtct ggcaatgtga aggacctgct gcaggcctgg gatctgtact 960 atcacgtgtt tcggagaatc tccaagggca aagacacgat tccgtggctt gggcatctgc 1020 tcgttgggct gagtggtgcg tttggtttca tcatcttggt ctatctcttg atcaattgca 1080 gaaatacagg cccttggctg aaaaaagtgc tcaagtgtaa tacccccgac ccaagcaagt 1140 tcttctccca gctttcttca gagcatggag gcgatgtgca gaaatggctc tcttcacctt 1200 ttccctcctc aagcttctcc ccgggagggc tggcgcccga gatttcacct cttgaggtac 1260 ttgaacgaga caaggttacc caacttctcc ttcaacagga taaggtaccc gaacctgcga 1320 gccttagctc caaccactct cttacgagct gcttcaccaa tcagggatac ttctttttcc 1380 accttcccga tgcgctggaa atcgaagctt gtcaagttta ctttacctat gatccatata 1440 gcgaggaaga tcccgacgaa ggagtcgccg gtgcgcccac gggttcctca ccccaacctc 1500 tccagcctct ctcaggagaa gatgatgctt attgcacttt tcccagtaga gacgatctcc 1560 tcctcttttc tccatctctt ttggggggac cttccccccc ttctacggca cctggcgggt 1620 ctggtgctgg cgaggagcgg atgccgccgt ccctccagga gcgagtacca cgagattggg 1680 atccccagcc acttggaccc cccacccccg gcgtacctga ccttgtcgat tttcaacctc 1740 cccctgaatt ggtgctgcga gaggctgggg aggaagttcc ggacgctggg ccgagggagg 1800 gcgtgtcctt tccatggagt aggcctccag gtcaaggcga gtttagggct ctcaacgcgc 1860 ggctgccgtt gaatacagac gcttatctct cactgcagga actgcaaggt caggacccaa 1920 cacatcttgt aggatctggt gctactaatt tttctctttt gaagcaagct ggagatgttg 1980 aagagaaccc cggtccggag atgtggcatg agggtctgga agaagcgtct cgactgtact 2040 ttggtgagcg caatgtgaag ggcatgtttg aagtcctcga accccttcat gccatgatgg 2100 aacgcggacc ccagaccttg aaggagacaa gttttaacca agcttacgga agagacctga 2160 tggaagccca ggaatggtgc aggaaataca tgaaaagcgg gaatgtgaag gacttgctcc 2220 aagcgtggga cctgtactat catgtcttta ggcgcattag taagggcagc ggcgccacca 2280 acttcagcct gctgaagcag gccggcgacg tggaggagaa ccccggcccc gtgagcaagg 2340 gcgaggagga taacatggcc atcatcaagg agttcatgcg cttcaaggtg cacatggagg 2400 gctccgtgaa cggccacgag ttcgagatcg agggcgaggg cgagggccgc ccctacgagg 2460 gcacccagac cgccaagctg aaggtgacca agggtggccc cctgcccttc gcctgggaca 2520 tcctgtcccc tcagttcatg tacggctcca aggcctacgt gaagcacccc gccgacatcc 2580 ccgactactt gaagctgtcc ttccccgagg gcttcaagtg ggagcgcgtg atgaacttcg 2640 aggacggcgg cgtggtgacc gtgacccagg actcctctct gcaggacggc gagttcatct 2700 acaaggtgaa gctgcgcggc accaacttcc cctccgacgg ccccgtaatg cagaagaaga 2760 ccatgggctg ggaggcctcc tccgagcgga tgtaccccga ggacggcgcc ctgaagggcg 2820 agatcaagca gaggctgaag ctgaaggacg gcggccacta cgacgctgag gtcaagacca 2880 cctacaaggc caagaagccc gtgcagctgc ccggcgccta caacgtcaac atcaagttgg 2940 acatcacctc ccacaacgag gactacacca tcgtggaaca gtacgaacgc gccgagggcc 3000 gccactccac cggcggcatg gacgagctgt acaagtgaac tagtgaactt gtttattgca 3060 gcttataatg gttacaaata aagcaatagc atcacaaatt tcacaaataa agcatttttt 3120 tcactgcatt ctagttgtgg tttgtccaaa ctcatcaatg tatcttacgc cggcgtggcg 3180 gtctatggac ttcaagagca acagtgctgt ggcctggagc aacaaatctg actttgcatg 3240 tgcaaacgcc ttcaacaaca gcattattcc agaagacacc ttcttcccca gcccaggtaa 3300 gggcagcttt ggtgccttcg caggctgttt ccttgcttca ggaatggcca ggttctgccc 3360 agagctctgg tcaatgatgt ctaaaactcc tctgattggt ggtctcggcc ttatccattg 3420 ccacc 3425 <210> 79 <211> 2893 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> pCB2045 <400> 79 agtaggggag tggattgaga aggaggctga ggggtactca agggggctat agaatgtata 60 ggatttccct gaagcattcc tagagagcct gcaaggtgaa gatggctttg gaaccagctg 120 gatctaggct gtgccacata ctacctcttt ggccttggcc acatccctaa actcttggat 180 tctgtttcct aagatgtaag atggaggtaa ttgttcctgc ctcacaggag ctgttgtgag 240 gattaaacag agagtatgtc tttagcgcgg tgcctggcac cagtgcctgg catgtagtag 300 gggcacaaca aatataaggt ccactttgct tttctttttt ctatagagaa tcctttcctg 360 tttgcattgg aagccgtggt tatctctgtt ggctccatgg agatctgtgt gttggttttt 420 tgtgtgaaca gagaaacagg agaatatggg ccaaacagga tatctgtggt aagcagttcc 480 tgccccggct cagggccaag aacagttgga acagcagaat atgggccaaa caggatatct 540 gtggtaagca gttcctgccc cggctcaggg ccaagaacag atggtcccca gatgcggtcc 600 cgccctcagc agtttctaga gaaccatcag atgtttccag ggtgccccaa ggacctgaaa 660 tgaccctgtg ccttatttga actaaccaat cagttcgctt ctcgcttctg ttcgcgcgct 720 tctgctcccc gagctctata taagcagagc tcgtttagtg aaccgtcaga tcgccgccac 780 catgggtgct ggcgcaactg gacgcgctat ggatggacct cgcttgctgc ttcttctgct 840 tctcggggtc tctttgggtg gtgctaagga agcatgccca acgggacttt atacgcatag 900 cggagagtgt tgcaaagctt gtaacctggg cgaaggcgtc gcgcaacctt gtggtgcaaa 960 tcaaaccgtc tgcgagccat gtttggactc tgttacgttt agtgacgtag tatctgcgac 1020 agagccatgc aagccttgta cggaatgtgt aggattgcag agcatgtctg ccccttgtgt 1080 agaagccgac gatgcagttt gcaggtgcgc gtatggctat taccaagacg aaacaaccgg 1140 acgatgtgaa gcttgccgag tttgtgaagc gggttccggg cttgtattct cctgtcagga 1200 taagcagaac accgtctgcg aagagtgccc cgatggtacc tacagcgatg aagcgaacca 1260 tgtagaccca tgcctgcctt gcaccgtttg tgaagacacg gaacgacagt tgcgggaatg 1320 tacccggtgg gcagacgccg agtgcgaaga gattccaggc cgctggatca cgcgaagtac 1380 cccgccagaa ggttccgaca gtactgcacc aagcacccaa gaaccagagg cgccccccga 1440 gcaggacctg attgcctcca ccgtggcggg tgttgttact acggttatgg gctcatccca 1500 gcccgttgtt acccgaggaa ctacagacaa cctgattccg gtatattgtt ctatcttggc 1560 ggctgtagta gttggcttgg tcgcgtacat cgctttcaaa agaggatccg gcgctacaaa 1620 tttttcactg ctgaaacagg cgggtgatgt ggaggagaac cctggaccca tgcctctggg 1680 cctgctgtgg ctgggcctgg ccctgctggg cgccctgcac gcccaggccg gcgtgcaggt 1740 ggagacaatc tccccaggcg acggacgcac attccctaag cggggccaga cctgcgttgt 1800 gcactataca ggcatgctgg aggatggcaa gaagtttgac agctcccggg atagaaacaa 1860 gccattcaag tttatgctgg gcaagcagga agtgatcaga ggctgggagg agggcgtggc 1920 ccagatgtct gtgggccaga gggccaagct gaccatcagc ccagactacg cctatggagc 1980 aacaggccac ccaggaatca tcccacctca cgccaccctg gtgttcgatg tggagctgct 2040 gaagctgggc gagggatcca acacatcaaa agagaacccc tttctgttcg cattggaggc 2100 cgtagtcata tctgttggat ccatgggact tattatctcc ctgttgtgtg tgtacttttg 2160 gctcgagcgc actatgccca ggatccccac gctcaagaat ctggaagatc tcgtcacaga 2220 ataccatggt aatttcagcg cctggagcgg agtctctaag ggtctggccg aatccctcca 2280 acccgattat tctgaacggt tgtgcctcgt atccgaaata ccaccaaaag gcggggctct 2340 gggtgagggc ccaggggcga gtccgtgcaa tcaacacagc ccgtattggg cccctccttg 2400 ttatacgttg aagcccgaaa cttgaaactt gtttattgca gcttataatg gttacaaata 2460 aagcaatagc atcacaaatt tcacaaataa agcatttttt tcactgcatt ctagttgtgg 2520 tttgtccaaa ctcatcaatg tatcttagat tgattatcag ccttctctgt gtgtatttct 2580 ggctggaacg gtgagatttg gagaagccca gaaaaatgag gggaacggta gctgacaata 2640 gcagaggagg gttttgcagg gtctttagga gtaaaggatg agacagtaag taatgagaga 2700 ttacccaaga gggtttggtg atggaaggaa gccacaggca cagagaacac agaatcactt 2760 tatttcatat gggacaactg ggagaagggt gataaaaaag ctttaaccta tgtgctcctg 2820 ctccctcttt ctcccctgtc aggacgatgc cccgaattcc caccctgaag aacctagagg 2880 atcttgttac tga 2893 <210> 80 <211> 3819 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> pCB2046 <400> 80 ccgcgccagg cctggccgtg aacgttcact gaaatcatgg cctcttggcc aagattgata 60 gcttgtgcct gtccctgagt cccagtccat cacgagcagc tggtttctaa gatgctattt 120 cccgtataaa gcatgagacc gtgacttgcc agccccacag agccccgccc ttgtccatca 180 ctggcatctg gactccagcc tgggttgggg caaagaggga aatgagatca tgtcctaacc 240 ctgatcctct tgtcccacag atatccagaa ccctgaccct gccgtgtacc agctgagaga 300 ctctaaatcc agtgacaagt ctgtctgcct attcaccgat tttgattctc aaacaaatgt 360 gtcacaaagt aaggattctg atgtgtatat cacatgttaa ttaaatgaaa taaaagatct 420 ttattttcat tagatctgtg tgttggtttt ttgtgtgaac agagaaacag gagaatatgg 480 gccaaacagg atatctgtgg taagcagttc ctgccccggc tcagggccaa gaacagttgg 540 aacagcagaa tatgggccaa acaggatatc tgtggtaagc agttcctgcc ccggctcagg 600 gccaagaaca gatggtcccc agatgcggtc ccgccctcag cagtttctag agaaccatca 660 gatgtttcca gggtgcccca aggacctgaa atgaccctgt gccttatttg aactaaccaa 720 tcagttcgct tctcgcttct gttcgcgcgc ttctgctccc cgagctctat ataagcagag 780 ctcgtttagt gaaccgtcag atcgccgcca ccgagatgtg gcatgagggt ctggaagaag 840 cgtctcgact gtactttggt gagcgcaatg tgaagggcat gtttgaagtc ctcgaacccc 900 ttcatgccat gatggaacgc ggaccccaga ccttgaagga gacaagtttt aaccaagctt 960 acggaagaga cctgatggaa gcccaggaat ggtgcaggaa atacatgaaa agcgggaatg 1020 tgaaggactt gctccaagcg tgggacctgt actatcatgt ctttaggcgc attagtaagg 1080 gcagcggcgc caccaacttc agcctgctga agcaggccgg cgacgtggag gagaaccccg 1140 gccccatggg caacgaggcc agctaccctc tggagatgtg ctcccacttc gacgccgacg 1200 agatcaagcg gctgggcaag cgcttcaaga agctggacct ggacaacagc ggcagcctga 1260 gcgtggagga gtttatgtct ctgcccgagc tgcagcagaa ccccctggtg cagcgcgtga 1320 tcgacatctt cgacaccgac ggcaacggcg aggtggactt caaggagttc atcgagggcg 1380 tgagccagtt cagcgtgaag ggcgacaagg agcagaagct gcggttcgcc ttccggatct 1440 acgatatgga taaagatggc tatatttcta atggcgagct gttccaggtg ctgaagatga 1500 tggtgggcaa caataccaag ctggccgata cccagctgca gcagatcgtg gacaagacca 1560 tcatcaacgc cgacaaggac ggcgacggca gaatcagctt cgaggagttc tgtgccgtgg 1620 tgggaggcct ggatattcac aaaaaaatgg tggtggacgt gggaagcgga gctactaact 1680 tcagcctgct gaagcaggct ggagacgtgg aggagaaccc tggacctatg gcactgcccg 1740 tgaccgccct gctgctgcct ctggccctgc tgctgcacgc agcccggcct atcctgtggc 1800 acgagatgtg gcacgagggc ctggaggagg ccagcaggct gtattttggc gagcgcaacg 1860 tgaagggcat gttcgaggtg ctggagcctc tgcacgccat gatggagaga ggcccacaga 1920 ccctgaagga gacatccttt aaccaggcct atggacggga cctgatggag gcacaggagt 1980 ggtgcagaaa gtacatgaag tctggcaatg tgaaggacct gctgcaggcc tgggatctgt 2040 actatcacgt gtttcggaga atctccaagg gcaaagacac gattccgtgg cttgggcatc 2100 tgctcgttgg gctgagtggt gcgtttggtt tcatcatctt ggtctatctc ttgatcaatt 2160 gcagaaatac aggcccttgg ctgaaaaaag tgctcaagtg taataccccc gacccaagca 2220 agttcttctc ccagctttct tcagagcatg gaggcgatgt gcagaaatgg ctctcttcac 2280 cttttccctc ctcaagcttc tccccgggag ggctggcgcc cgagatttca cctcttgagg 2340 tacttgaacg agacaaggtt acccaacttc tccttcaaca ggataaggtt cccgaacctg 2400 cgagccttag ctccaaccac tctcttacga gctgcttcac caatcaggga tacttctttt 2460 tccaccttcc cgatgcgctg gaaatcgaag cttgtcaagt ttactttacc tatgatccat 2520 atagcgagga agatcccgac gaaggagtcg ccggtgcgcc cacgggttcc tcaccccaac 2580 ctctccagcc tctctcagga gaagatgatg cttattgcac ttttcccagt agagacgatc 2640 tcctcctctt ttctccatct cttttggggg gaccttcccc cccttctacg gcacctggcg 2700 ggtctggtgc tggcgaggag cggatgccgc cgtccctcca ggagcgagta ccacgagatt 2760 gggatcccca gccacttgga ccccccaccc ccggcgtacc tgaccttgtc gattttcaac 2820 ctccccctga attggtgctg cgagaggctg gggaggaagt tccggacgct gggccgaggg 2880 agggcgtgtc ctttccatgg agtaggcctc caggtcaagg cgagtttagg gctctcaacg 2940 cgcggctgcc gttgaataca gacgcttatc tctcactgca ggaactgcaa ggtcaggacc 3000 caacacatct tgtataagta agataatcaa cctctggatt acaaaatttg tgaaagattg 3060 actggtattc ttaactatgt tgctcctttt acgctatgtg gatacgctgc tttaatgcct 3120 ttgtatcatg ctattgcttc ccgtatggct ttcattttct cctccttgta taaatcctgg 3180 ttagttcttg ccacggcgga actcatcgcc gcctgccttg cccgctgctg gacaggggct 3240 cggctgttgg gcactgacaa ttccaacttg tttattgcag cttataatgg ttacaaataa 3300 agcaatagca tcacaaattt cacaaataaa gcattttttt cactgcattc tagttgtggt 3360 ttgtccaaac tcatcaatgt atcttacgcc ggcgtggcgg tctatggact tcaagagcaa 3420 cagtgctgtg gcctggagca acaaatctga ctttgcatgt gcaaacgcct tcaacaacag 3480 cattattcca gaagacacct tcttccccag cccaggtaag ggcagctttg gtgccttcgc 3540 aggctgtttc cttgcttcag gaatggccag gttctgccca gagctctggt caatgatgtc 3600 taaaactcct ctgattggtg gtctcggcct tatccattgc caccaaaacc ctctttttac 3660 taagaaacag tgagccttgt tctggcagtc cagagaatga cacgggaaaa aagcagatga 3720 agagaaggtg gcaggagagg gcacgtggcc cagcctcagt ctctccaact gagttcctgc 3780 ctgcctgcct ttgctcagac tgtttgcccc ttactgctc 3819 <210> 81 <211> 3425 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> pCB2047 <400> 81 agtaggggag tggattgaga aggaggctga ggggtactca agggggctat agaatgtata 60 ggatttccct gaagcattcc tagagagcct gcaaggtgaa gatggctttg gaaccagctg 120 gatctaggct gtgccacata ctacctcttt ggccttggcc acatccctaa actcttggat 180 tctgtttcct aagatgtaag atggaggtaa ttgttcctgc ctcacaggag ctgttgtgag 240 gattaaacag agagtatgtc tttagcgcgg tgcctggcac cagtgcctgg catgtagtag 300 gggcacaaca aatataaggt ccactttgct tttctttttt ctatagagaa tcctttcctg 360 tttgcattgg aagccgtggt tatctctgtt ggctccatgg ttaattaatt cgtgtgaaca 420 gagaaacagg agaatatggg ccaaacagga tatctgtggt aagcagttcc tgccccggct 480 cagggccaag aacagttgga acagcagaat atgggccaaa caggatatct gtggtaagca 540 gttcctgccc cggctcaggg ccaagaacag atggtcccca gatgcggtcc cgccctcagc 600 agtttctaga gaaccatcag atgtttccag ggtgccccaa ggacctgaaa tgaccctgtg 660 ccttatttga actaaccaat cagttcgctt ctcgcttctg ttcgcgcgct tctgctcccc 720 gagctctata taagcagagc tcgtttagtg aaccgtcaga tcgccgccac catgggtgct 780 ggcgcaactg gacgcgctat ggatggacct cgcttgctgc ttcttctgct tctcggggtc 840 tctttgggtg gtgctaagga agcatgccca acgggacttt atacgcatag cggagagtgt 900 tgcaaagctt gtaacctggg cgaaggcgtc gcgcaacctt gtggtgcaaa tcaaaccgtc 960 tgcgagccat gtttggactc tgttacgttt agtgacgtag tatctgcgac agagccatgc 1020 aagccttgta cggaatgtgt aggattgcag agcatgtctg ccccttgtgt agaagccgac 1080 gatgcagttt gcaggtgcgc gtatggctat taccaagacg aaacaaccgg acgatgtgaa 1140 gcttgccgag tttgtgaagc gggttccggg cttgtattct cctgtcagga taagcagaac 1200 accgtctgcg aagagtgccc cgatggtacc tacagcgatg aagcgaacca tgtagaccca 1260 tgcctgcctt gcaccgtttg tgaagacacg gaacgacagt tgcgggaatg tacccggtgg 1320 gcagacgccg agtgcgaaga gattccaggc cgctggatca cgcgaagtac cccgccagaa 1380 ggttccgaca gtactgcacc aagcacccaa gaaccagagg cgccccccga gcaggacctg 1440 attgcctcca ccgtggcggg tgttgttact acggttatgg gctcatccca gcccgttgtt 1500 acccgaggaa ctacagacaa cctgattccg gtatattgtt ctatcttggc ggctgtagta 1560 gttggcttgg tcgcgtacat cgctttcaaa agaggatctg gtgctactaa tttttctctt 1620 ttgaagcaag ctggagatgt tgaagagaac cccggtccga tgagcaggtc agtggcgttg 1680 gcggttctgg cgcttttgag tttgagcgga ctggaagcca tccaacgaac gcctaagatc 1740 caggtatatt cacgccaccc ggcggaaaac ggcaaaagta acttccttaa ttgttatgtg 1800 tctggcttcc acccgtctga tattgaggtg gacctcctta aaaacggtga acggatcgag 1860 aaagtggagc attccgatct tagtttcagt aaggattgga gcttttacct tctctattac 1920 actgagttca ctccgactga aaaggatgag tacgcctgtc gggtcaacca cgtcaccctg 1980 tctcaaccaa aaatagtcaa atgggacaga gatatgtcag atatttacat atgggcacca 2040 cttgcgggca cgtgtggcgt cctgcttctg agtctcgtca ttacgcttta ttgtaaacgg 2100 ggtagaaaaa aactccttta tatatttaaa cagccattta tgcggccagt tcaaacgacg 2160 caggaagaag acggctgtag ttgcagattt ccagaggaag aggaaggtgg atgcgagctt 2220 cgggtcaagt ttagtaggtc tgcagacgct cccgcctatc aacagggtca gaatcagctt 2280 tataacgaac tcaacctcgg tcgccgagaa gagtacgacg tactcgataa aagaaggggt 2340 agagacccgg aaatgggggg caaaccgcgc cgcaaaaatc cacaagaggg gctttataat 2400 gagcttcaaa aagacaaaat ggccgaagca tacagtgaga ttgggatgaa aggtgaacgc 2460 agaagaggta agggtcacga cgggctgtac cagggtttgt caactgccac aaaggatact 2520 tatgacgctc tgcatatgca agctcttccc ccacgcggat ccggcgctac aaatttttca 2580 ctgctgaaac aggcgggtga tgtggaggag aaccctggac ccatgcctct gggcctgctg 2640 tggctgggcc tggccctgct gggcgccctg cacgcccagg ccggcgtgca ggtggagaca 2700 atctccccag gcgacggacg cacattccct aagcggggcc agacctgcgt tgtgcactat 2760 acaggcatgc tggaggatgg caagaagttt gacagctccc gggatagaaa caagccattc 2820 aagtttatgc tgggcaagca ggaagtgatc agaggctggg aggagggcgt ggcccagatg 2880 tctgtgggcc agagggccaa gctgaccatc agcccagact acgcctatgg agcaacaggc 2940 cacccaggaa tcatcccacc tcacgccacc ctggtgttcg atgtggagct gctgaagctg 3000 ggcgagggca gcaacaccag caaagaaaac ccctttttgt tcgccctcga agcggtcgta 3060 attagtgttg gttctatggg attgattatc agccttctct gtgtgtattt ctggctggaa 3120 cggtgagatt tggagaagcc cagaaaaatg aggggaacgg tagctgacaa tagcagagga 3180 gggttttgca gggtctttag gagtaaagga tgagacagta agtaatgaga gattacccaa 3240 gagggtttgg tgatggaagg aagccacagg cacagagaac acagaatcac tttatttcat 3300 atgggacaac tgggagaagg gtgataaaaa agctttaacc tatgtgctcc tgctccctct 3360 ttctcccctg tcaggacgat gccccgaatt cccaccctga agaacctaga ggatcttgtt 3420 actga 3425 <210> 82 <211> 4472 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> pCB2048 <400> 82 caacctctag aaatcaaggt ttttctgtgt agggttgggt tagcgtgttg ttagagtagg 60 ggagtggatt gagaaggagg ctgaggggta ctcaaggggg ctatagaatg tataggattt 120 ccctgaagca ttcctagaga gcctgcaagg tgaagatggc tttggaacca gctggatcta 180 ggctgtgcca catactacct ctttggcctt ggccacatcc ctaaactctt ggattctgtt 240 tcctaagatg taagatggag gtaattgttc ctgcctcaca ggagctgttg tgaggattaa 300 acagagagta tgtctttagc gcggtgcctg gcaccagtgc ctggcatgta gtaggggcac 360 aacaaatata aggtccactt tgcttttctt ttttctatag atgaaataaa agatctttat 420 tttcattaga tctgtgtgtt ggttttttgt gtgaacagag aaacaggaga atatgggcca 480 aacaggatat ctgtggtaag cagttcctgc cccggctcag ggccaagaac agttggaaca 540 gcagaatatg ggccaaacag gatatctgtg gtaagcagtt cctgccccgg ctcagggcca 600 agaacagatg gtccccagat gcggtcccgc cctcagcagt ttctagagaa ccatcagatg 660 tttccagggt gccccaagga cctgaaatga ccctgtgcct tatttgaact aaccaatcag 720 ttcgcttctc gcttctgttc gcgcgcttct gctccccgag ctctatataa gcagagctcg 780 tttagtgaac cgtcagatcg ccgccaccat ggagatgtgg catgagggtc tggaagaagc 840 gtctcgactg tactttggtg agcgcaatgt gaagggcatg tttgaagtcc tcgaacccct 900 tcatgccatg atggaacgcg gaccccagac cttgaaggag acaagtttta accaagctta 960 cggaagagac ctgatggaag cccaggaatg gtgcaggaaa tacatgaaaa gcgggaatgt 1020 gaaggacttg ctccaagcgt gggacctgta ctatcatgtc tttaggcgca ttagtaagga 1080 gggcagggga agtcttctaa catgcgggga cgtggaggaa aatcccggcc ccatgagcaa 1140 gggagaagaa ctctttactg gtgttgtccc aattctggtt gagctggatg gtgatgtgaa 1200 tggccacaaa ttctctgtgt ctggtgaagg tgaaggagat gcaacttatg gaaagctgac 1260 tctgaagttc atttgtacaa caggaaagct gccagtgcct tggccaactc tggtgaccac 1320 cctgacttat ggtgttcaat gtttcagcag gtaccctgac cacatgaagc agcatgactt 1380 ctttaaatct gcaatgccag aaggttatgt tcaggagagg acaatcttct ttaaggatga 1440 tggaaattat aagacaaggg cagaagtgaa gtttgaaggt gatacactgg ttaacagaat 1500 tgagctgaaa ggcattgatt ttaaggaaga tggaaacatt ctgggtcaca agctggagta 1560 caactataat tctcacaatg tttacattat ggcagataag cagaagaatg gaattaaggt 1620 taatttcaag attagacaca acattgagga tggatctgtc caactggcag accattacca 1680 gcagaacacc cctattggtg atggcccagt tctcctccca gataatcact atctccgcac 1740 tcaatctgct ctgtccaaag accctaatga gaaaagagac cacatggtcc tcctggagtt 1800 tgtgacagca gcaggaatta ctctgggaat ggatgagctg tacaagggat ccggcgctac 1860 aaatttttca ctgctgaaac aggcgggtga tgtggaggag aaccctggac ccatgccact 1920 tggcctgctc tggctgggct tggcattgct cggcgcgctc cacgcccagg ctgaactgat 1980 ccgcgtggcc atattgtggc atgagatgtg gcatgaggga ttggaggagg cgagtaggct 2040 gtactttggg gaaaggaatg ttaaagggat gtttgaggtc cttgaacccc tccacgctat 2100 gatggaaaga ggacctcaaa cgcttaaaga gacgtcattc aatcaagcct atggacggga 2160 tcttatggaa gctcaagaat ggtgtcgaaa atacatgaaa agcgggaatg ttaaggacct 2220 cacgcaagcc tgggatctgt attaccatgt tttccgacgc atttctaaac aaggaaaaga 2280 tactatccca tggttggggc acttgctcgt tgggctcagt ggggcgtttg gattcatcat 2340 cctcgtatat ctgttgatta attgtcggaa cacaggtccc tggcttaaaa aagttttgaa 2400 gtgtaacacc ccggatcctt ctaaattttt tagtcaactt agttcagaac acgggggcga 2460 tgttcaaaag tggctgagtt ccccgtttcc cagttcaagt ttctcccctg ggggtctcgc 2520 ccccgagata tcacctcttg aagtgctcga gcgggacaaa gttacacagc ttcttttgca 2580 acaggataag gttccggagc cggcgtctct cagctctaac cattcactca cttcttgttt 2640 caccaaccaa gggtattttt tcttccatct gcctgatgcc ttggagattg aggcttgtca 2700 ggtgtacttt acctatgacc cctatagtga ggaagaccct gacgaaggcg tagctggcgc 2760 ccccactggc tccagtccac agcctcttca gcctctgtca ggggaggacg acgcatattg 2820 tacgttcccc tcacgggacg accttctgct gttttcaccc tcactgctcg gcggaccctc 2880 cccgccaagc acggcacctg gggggagtgg ggcaggagaa gaaaggatgc ctcctagttt 2940 gcaggagcgg gttcctcgcg actgggatcc gcaacccctc ggaccaccca cccctggcgt 3000 acctgatctg gtcgacttcc aaccacctcc ggagcttgtc ctcagagagg ccggagagga 3060 agtcccagac gcggggccaa gagagggtgt gtcatttccc tggtcccgcc ctccgggaca 3120 gggtgagttt cgggcgctga atgcgaggct cccccttaat accgatgcgt acctgtcatt 3180 gcaggaactt cagggccagg atcctaccca cctggtggga tccggcgcta caaatttttc 3240 actgctgaaa caggcgggtg atgtggagga gaaccctgga cccatgccac ttggcctgct 3300 ctggctgggc ttggcattgc tcggcgcgct ccacgcccag gctggcgttc aagttgaaac 3360 cattagtccc ggagacggtc gaacatttcc caaacggggc cagacgtgcg tggtacacta 3420 caccggaatg ctggaggatg gaaaaaaatt tgacagcagc cgggacagaa acaaaccatt 3480 caagttcatg cttggtaaac aagaggtaat acggggttgg gaagagggtg tggcccagat 3540 gtcagtaggg caacgcgcga agttgaccat aagccccgac tatgcctatg gggcgacagg 3600 ccatcccggt ataattcctc cgcacgctac actggtgttt gatgttgagt tgctgaagct 3660 ggagggaagc aatacgtcaa aagagaaccc gttccttttt gcgctggaag cagtcgtgat 3720 cagcgttgga tctatggggc tgatcatctc ccttctctgc gtctatttct ggctcgaaag 3780 aactatgcca cgcatcccta cgctgaaaaa tctggaggat cttgtgacgg aatatcatgg 3840 aaatttttcc gcctggagtg gagtttccaa aggtctcgct gaatctctgc agccagacta 3900 tagtgagcgg ctctgcttgg tctctgagat tccacctaag gggggggcgc tcggggaagg 3960 cccgggcgca agtccgtgta atcaacacag tccgtactgg gctccaccat gctataccct 4020 caagccggaa acttaggaga atcctttcct gtttgcattg gaagccgtgg ttatctctgt 4080 tggctccatg ggattgatta tcagccttct ctgtgtgtat ttctggctgg aacggtgaga 4140 tttggagaag cccagaaaaa tgaggggaac ggtagctgac aatagcagag gagggttttg 4200 cagggtcttt aggagtaaag gatgagacag taagtaatga gagattaccc aagagggttt 4260 ggtgatggaa ggaagccaca ggcacagaga acacagaatc actttatttc atatgggaca 4320 actgggagaa gggtgataaa aaagctttaa cctatgtgct cctgctccct ctttctcccc 4380 tgtcaggacg atgccccgaa ttcccaccct gaagaaccta gaggatcttg ttactgaata 4440 ccacgggaac ttttcggtga gaacgctgtc at 4472 <210> 83 <211> 4241 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> pCB2049 <400> 83 caacctctag aaatcaaggt ttttctgtgt agggttgggt tagcgtgttg ttagagtagg 60 ggagtggatt gagaaggagg ctgaggggta ctcaaggggg ctatagaatg tataggattt 120 ccctgaagca ttcctagaga gcctgcaagg tgaagatggc tttggaacca gctggatcta 180 ggctgtgcca catactacct ctttggcctt ggccacatcc ctaaactctt ggattctgtt 240 tcctaagatg taagatggag gtaattgttc ctgcctcaca ggagctgttg tgaggattaa 300 acagagagta tgtctttagc gcggtgcctg gcaccagtgc ctggcatgta gtaggggcac 360 aacaaatata aggtccactt tgcttttctt ttttctatag atgaaataaa agatctttat 420 tttcattaga tctgtgtgtt ggttttttgt gtgaacagag aaacaggaga atatgggcca 480 aacaggatat ctgtggtaag cagttcctgc cccggctcag ggccaagaac agttggaaca 540 gcagaatatg ggccaaacag gatatctgtg gtaagcagtt cctgccccgg ctcagggcca 600 agaacagatg gtccccagat gcggtcccgc cctcagcagt ttctagagaa ccatcagatg 660 tttccagggt gccccaagga cctgaaatga ccctgtgcct tatttgaact aaccaatcag 720 ttcgcttctc gcttctgttc gcgcgcttct gctccccgag ctctatataa gcagagctcg 780 tttagtgaac cgtcagatcg ccgccaccat ggagatgtgg catgagggtc tggaagaagc 840 gtctcgactg tactttggtg agcgcaatgt gaagggcatg tttgaagtcc tcgaacccct 900 tcatgccatg atggaacgcg gaccccagac cttgaaggag acaagtttta accaagctta 960 cggaagagac ctgatggaag cccaggaatg gtgcaggaaa tacatgaaaa gcgggaatgt 1020 gaaggacttg ctccaagcgt gggacctgta ctatcatgtc tttaggcgca ttagtaaggg 1080 atccggcgct acaaattttt cactgctgaa acaggcgggt gatgtggagg agaaccctgg 1140 acccatgggt gctggcgcaa ctggacgcgc tatggatgga cctcgcttgc tgcttcttct 1200 gcttctcggg gtctctttgg gtggtgctaa ggaagcatgc ccaacgggac tttatacgca 1260 tagcggagag tgttgcaaag cttgtaacct gggcgaaggc gtcgcgcaac cttgtggtgc 1320 aaatcaaacc gtctgcgagc catgtttgga ctctgttacg tttagtgacg tagtatctgc 1380 gacagagcca tgcaagcctt gtacggaatg tgtaggattg cagagcatgt ctgccccttg 1440 tgtagaagcc gacgatgcag tttgcaggtg cgcgtatggc tattaccaag acgaaacaac 1500 cggacgatgt gaagcttgcc gagtttgtga agcgggttcc gggcttgtat tctcctgtca 1560 ggataagcag aacaccgtct gcgaagagtg ccccgatggt acctacagcg atgaagcgaa 1620 ccatgtagac ccatgcctgc cttgcaccgt ttgtgaagac acggaacgac agttgcggga 1680 atgtacccgg tgggcagacg ccgagtgcga agagattcca ggccgctgga tcacgcgaag 1740 taccccgcca gaaggttccg acagtactgc accaagcacc caagaaccag aggcgccccc 1800 cgagcaggac ctgattgcct ccaccgtggc gggtgttgtt actacggtta tgggctcatc 1860 ccagcccgtt gttacccgag gaactacaga caacctgatt ccggtatatt gttctatctt 1920 ggcggctgta gtagttggct tggtcgcgta catcgctttc aaaagaggat ccggcgctac 1980 aaatttttca ctgctgaaac aggcgggtga tgtggaggag aaccctggac ccatgccact 2040 tggcctgctc tggctgggct tggcattgct cggcgcgctc cacgcccagg ctgaactgat 2100 ccgcgtggcc atattgtggc atgagatgtg gcatgaggga ttggaggagg cgagtaggct 2160 gtactttggg gaaaggaatg ttaaagggat gtttgaggtc cttgaacccc tccacgctat 2220 gatggaaaga ggacctcaaa cgcttaaaga gacgtcattc aatcaagcct atggacggga 2280 tcttatggaa gctcaagaat ggtgtcgaaa atacatgaaa agcgggaatg ttaaggacct 2340 cacgcaagcc tgggatctgt attaccatgt tttccgacgc atttctaaac aaggaaaaga 2400 tactatccca tggttggggc acttgctcgt tgggctcagt ggggcgtttg gattcatcat 2460 cctcgtatat ctgttgatta attgtcggaa cacaggtccc tggcttaaaa aagttttgaa 2520 gtgtaacacc ccggatcctt ctaaattttt tagtcaactt agttcagaac acgggggcga 2580 tgttcaaaag tggctgagtt ccccgtttcc cagttcaagt ttctcccctg ggggtctcgc 2640 ccccgagata tcacctcttg aagtgctcga gcgggacaaa gttacacagc ttcttttgca 2700 acaggataag gttccggagc cggcgtctct cagctctaac cattcactca cttcttgttt 2760 caccaaccaa gggtattttt tcttccatct gcctgatgcc ttggagattg aggcttgtca 2820 ggtgtacttt acctatgacc cctatagtga ggaagaccct gacgaaggcg tagctggcgc 2880 ccccactggc tccagtccac agcctcttca gcctctgtca ggggaggacg acgcatattg 2940 tacgttcccc tcacgggacg accttctgct gttttcaccc tcactgctcg gcggaccctc 3000 cccgccaagc acggcacctg gggggagtgg ggcaggagaa gaaaggatgc ctcctagttt 3060 gcaggagcgg gttcctcgcg actgggatcc gcaacccctc ggaccaccca cccctggcgt 3120 acctgatctg gtcgacttcc aaccacctcc ggagcttgtc ctcagagagg ccggagagga 3180 agtcccagac gcggggccaa gagagggtgt gtcatttccc tggtcccgcc ctccgggaca 3240 gggtgagttt cgggcgctga atgcgaggct cccccttaat accgatgcgt acctgtcatt 3300 gcaggaactt cagggccagg atcctaccca cctggtggga tccggcgcta caaatttttc 3360 actgctgaaa caggcgggtg atgtggagga gaaccctgga cccatgcctc tgggcctgct 3420 gtggctgggc ctggccctgc tgggcgccct gcacgcccag gccggcgtgc aggtggagac 3480 aatctcccca ggcgacggac gcacattccc taagcggggc cagacctgcg tggtgcacta 3540 tacaggcatg ctggaggatg gcaagaagtt tgacagctcc cgggatagaa acaagccatt 3600 caagtttatg ctgggcaagc aggaagtgat cagaggctgg gaggagggcg tggcccagat 3660 gtctgtgggc cagagggcca agctgaccat cagcccagac tacgcctatg gagcaacagg 3720 ccacccagga atcatcccac ctcacgccac cctggtgttc gatgtggagc tgctgaagct 3780 gggcgagggc agcaacacca gcaaagagaa tcctttcctg tttgcattgg aagccgtggt 3840 tatctctgtt ggctccatgg gattgattat cagccttctc tgtgtgtatt tctggctgga 3900 acggtgagat ttggagaagc ccagaaaaat gaggggaacg gtagctgaca atagcagagg 3960 agggttttgc agggtcttta ggagtaaagg atgagacagt aagtaatgag agattaccca 4020 agagggtttg gtgatggaag gaagccacag gcacagagaa cacagaatca ctttatttca 4080 tatgggacaa ctgggagaag ggtgataaaa aagctttaac ctatgtgctc ctgctccctc 4140 tttctcccct gtcaggacga tgccccgaat tcccaccctg aagaacctag aggatcttgt 4200 tactgaatac cacgggaact tttcggtgag aacgctgtca t 4241 <210> 84 <211> 3404 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> pCB2052 <400> 84 caacctctag aaatcaaggt ttttctgtgt agggttgggt tagcgtgttg ttagagtagg 60 ggagtggatt gagaaggagg ctgaggggta ctcaaggggg ctatagaatg tataggattt 120 ccctgaagca ttcctagaga gcctgcaagg tgaagatggc tttggaacca gctggatcta 180 ggctgtgcca catactacct ctttggcctt ggccacatcc ctaaactctt ggattctgtt 240 tcctaagatg taagatggag gtaattgttc ctgcctcaca ggagctgttg tgaggattaa 300 acagagagta tgtctttagc gcggtgcctg gcaccagtgc ctggcatgta gtaggggcac 360 aacaaatata aggtccactt tgcttttctt ttttctatag ttcgtgtgaa cagagaaaca 420 ggagaatatg ggccaaacag gatatctgtg gtaagcagtt cctgccccgg ctcagggcca 480 agaacagttg gaacagcaga atatgggcca aacaggatat ctgtggtaag cagttcctgc 540 cccggctcag ggccaagaac agatggtccc cagatgcggt cccgccctca gcagtttcta 600 gagaaccatc agatgtttcc agggtgcccc aaggacctga aatgaccctg tgccttattt 660 gaactaacca atcagttcgc ttctcgcttc tgttcgcgcg cttctgctcc ccgagctcta 720 tataagcaga gctcgtttag tgaaccgtca gatcgccgcc accatgggca acgaggccag 780 ctaccctctg gagatgtgct cccacttcga cgccgacgag atcaagcggc tgggcaagcg 840 cttcaagaag ctggacctgg acaacagcgg cagcctgagc gtggaggagt ttatgtctct 900 gcccgagctg cagcagaacc ccctggtgca gcgcgtgatc gacatcttcg acaccgacgg 960 caacggcgag gtggacttca aggagttcat cgagggcgtg agccagttca gcgtgaaggg 1020 cgacaaggag cagaagctgc ggttcgcctt ccggatctac gatatggata aagatggcta 1080 tatttctaat ggcgagctgt tccaggtgct gaagatgatg gtgggcaaca ataccaagct 1140 ggccgatacc cagctgcagc agatcgtgga caagaccatc atcaacgccg acaaggacgg 1200 cgacggcaga atcagcttcg aggagttctg tgccgtggtg ggaggcctgg atattcacaa 1260 aaaaatggtg gtggacgtgg gaagcggagc tactaacttc agcctgctga agcaggctgg 1320 agacgtggag gagaaccctg gacctatggg tgctggcgca actggacgcg ctatggatgg 1380 acctcgcttg ctgcttcttc tgcttctcgg ggtctctttg ggtggtgcta aggaagcatg 1440 cccaacggga ctttatacgc atagcggaga gtgttgcaaa gcttgtaacc tgggcgaagg 1500 cgtcgcgcaa ccttgtggtg caaatcaaac cgtctgcgag ccatgtttgg actctgttac 1560 gtttagtgac gtagtatctg cgacagagcc atgcaagcct tgtacggaat gtgtaggatt 1620 gcagagcatg tctgcccctt gtgtagaagc cgacgatgca gtttgcaggt gcgcgtatgg 1680 ctattaccaa gacgaaacaa ccggacgatg tgaagcttgc cgagtttgtg aagcgggttc 1740 cgggcttgta ttctcctgtc aggataagca gaacaccgtc tgcgaagagt gccccgatgg 1800 tacctacagc gatgaagcga accatgtaga cccatgcctg ccttgcaccg tttgtgaaga 1860 cacggaacga cagttgcggg aatgtacccg gtgggcagac gccgagtgcg aagagattcc 1920 aggccgctgg atcacgcgaa gtaccccgcc agaaggttcc gacagtactg caccaagcac 1980 ccaagaacca gaggcgcccc ccgagcagga cctgattgcc tccaccgtgg cgggtgttgt 2040 tactacggtt atgggctcat cccagcccgt tgttacccga ggaactacag acaacctgat 2100 tccggtatat tgttctatct tggcggctgt agtagttggc ttggtcgcgt acatcgcttt 2160 caaaagaggt tccggggagg gccgagggtc attgctgacg tgtggagacg tggaggagaa 2220 tcctggcccc atggagatgt ggcatgaggg tctggaagaa gcgtctcgac tgtactttgg 2280 tgagcgcaat gtgaagggca tgtttgaagt cctcgaaccc cttcatgcca tgatggaacg 2340 cggaccccag accttgaagg agacaagttt taaccaagct tacggaagag acctgatgga 2400 agcccaggaa tggtgcagga aatacatgaa aagcgggaat gtgaaggact tgctccaagc 2460 gtgggacctg tactatcatg tctttaggcg cattagtaag ggatccggcg ctacaaattt 2520 ttcactgctg aaacaggcgg gtgatgtgga ggagaaccct ggacccatgc ctctgggcct 2580 gctgtggctg ggcctggccc tgctgggcgc cctgcacgcc caggccggcg tgcaggtgga 2640 gacaatctcc ccaggcgacg gacgcacatt ccctaagcgg ggccagacct gcgtggtgca 2700 ctatacaggc atgctggagg atggcaagaa gtttgacagc tcccgggata gaaacaagcc 2760 attcaagttt atgctgggca agcaggaagt gatcagaggc tgggaggagg gcgtggccca 2820 gatgtctgtg ggccagaggg ccaagctgac catcagccca gactacgcct atggagcaac 2880 aggccaccca ggaatcatcc cacctcacgc caccctggtg ttcgatgtgg agctgctgaa 2940 gctgggcgag ggcagcaaca ccagcaaaga gaatcctttc ctgtttgcat tggaagccgt 3000 ggttatctct gttggctcca tgggattgat tatcagcctt ctctgtgtgt atttctggct 3060 ggaacggtga gatttggaga agcccagaaa aatgagggga acggtagctg acaatagcag 3120 aggagggttt tgcagggtct ttaggagtaa aggatgagac agtaagtaat gagagattac 3180 ccaagagggt ttggtgatgg aaggaagcca caggcacaga gaacacagaa tcactttatt 3240 tcatatggga caactgggag aagggtgata aaaaagcttt aacctatgtg ctcctgctcc 3300 ctctttctcc cctgtcagga cgatgccccg aattcccacc ctgaagaacc tagaggatct 3360 tgttactgaa taccacggga acttttcggt gagaacgctg tcat 3404

Claims (152)

  1. a) 비-기능적 T 세포 수용체 알파 불변 (TRAC) 도메인을 코딩하도록 변형된 내인성 T 세포 수용체 알파 (TRA) 유전자; 및
    b) 조작된 T 세포에 대해 반응성인 세포독성 T 림프구 (CTL)에 대한 세포독성을 조작된 T 세포에 부여할 수 있는 항-CTL 단백질을 코딩하는 핵산
    을 포함하는 조작된 T 세포.
  2. 제1항에 있어서, 항-CTL 단백질이 세포외 β2-마이크로글로불린 도메인, 막횡단 도메인, 공동-자극성 도메인, 및 세포질 신호전달 도메인을 포함하는 것인 세포.
  3. 제2항에 있어서, 세포외 β2-마이크로글로불린 도메인이 서열식별번호: 49의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 49와 적어도 85% 상동성을 포함하는 그의 변이체를 포함하는 것인 세포.
  4. 제3항에 있어서, 항-CTL 단백질 막횡단 도메인이 CD8 막횡단 도메인을 포함하고/거나, 항-CTL 단백질 공동-자극성 도메인이 4-1BB 공동-자극성 도메인을 포함하고/거나, 항-CTL 단백질 세포질 신호전달 도메인이 CD3-ζ 세포질 신호전달 도메인을 포함하는 것인 세포.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, i) CD8 막횡단 도메인이 서열식별번호: 50의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 50과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고/거나; ii) 4-1BB 공동-자극성 도메인이 서열식별번호: 51의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 51과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고/거나; iii) CD3-ζ 세포질 신호전달 도메인이 서열식별번호: 52의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 52와 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하는 것인 세포.
  6. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 항-CTL 단백질이 서열식별번호: 53의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 53과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하는 것인 세포.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, b) 항-CTL 단백질을 코딩하는 핵산이 TRAC 도메인을 코딩하는 내인성 TRA 유전자의 영역 내로 삽입되거나, 또는 b) 항-CTL 단백질을 코딩하는 핵산이 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입되는 것인 세포.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, c) 이량체화 활성화가능한 화학적으로 유도된 신호전달 복합체 (CISC)의 폴리펩티드 구성성분을 코딩하는 1종 이상의 핵산을 추가로 포함하며, 여기서 CISC의 폴리펩티드 구성성분은 하기를 포함하고:
    i) 제1 세포외 결합 도메인 또는 그의 부분, 힌지 도메인, 막횡단 도메인, 및 신호전달 도메인 또는 그의 부분을 포함하는 제1 CISC 구성성분; 및
    ii) 제2 세포외 결합 도메인 또는 그의 부분, 힌지 도메인, 막횡단 도메인, 및 신호전달 도메인 또는 그의 부분을 포함하는 제2 CISC 구성성분;
    여기서 제1 CISC 구성성분 및 제2 CISC 구성성분은, 발현되는 경우에, 이들이 리간드의 존재 하에서 이량체화하여 신호전달-적격 CISC를 생성하도록 구성된 것인
    세포.
  9. 제8항에 있어서, 제1 CISC 구성성분의 신호전달 도메인이 IL-2 수용체 서브유닛 감마 (IL2Rγ) 세포질 신호전달 도메인을 포함하는 것인 세포.
  10. 제9항에 있어서, IL2Rγ 세포질 신호전달 도메인이 서열식별번호: 44의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 44의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하는 것인 세포.
  11. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 세포외 결합 도메인 또는 그의 부분이 FK506 결합 단백질 (FKBP) 도메인 또는 그의 부분을 포함하는 것인 세포.
  12. 제11항에 있어서, FKBP 도메인이 서열식별번호: 41의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 41의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하는 것인 세포.
  13. 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 CISC 구성성분의 신호전달 도메인이 IL-2 수용체 서브유닛 베타 (IL2Rβ) 세포질 신호전달 도메인을 포함하는 것인 세포.
  14. 제13항에 있어서, IL2Rβ 세포질 신호전달 도메인이 서열식별번호: 45의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 45의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하는 것인 세포.
  15. 제8항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 세포외 결합 도메인 또는 그의 부분이 FKBP 라파마이신 결합 (FRB) 도메인 또는 그의 부분을 포함하는 것인 세포.
  16. 제15항에 있어서, FRB가 서열식별번호: 42의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 42의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하는 것인 세포.
  17. 제8항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 CISC 구성성분의 막횡단 도메인이 독립적으로 IL-2 수용체 막횡단 도메인을 포함하는 것인 세포.
  18. 제8항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 1) 제1 CISC 구성성분을 코딩하는 1종 이상의 핵산이 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입되고, 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 1종 이상의 핵산이 TRAC 도메인을 코딩하는 내인성 TRA 유전자의 영역 내로 삽입되거나; 또는 2) 제1 CISC 구성성분을 코딩하는 1종 이상의 핵산이 TRAC 도메인을 코딩하는 내인성 TRA 유전자의 영역 내로 삽입되고, 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 1종 이상의 핵산이 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입되는 것인 세포.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 리간드가 라파마이신 또는 라파마이신 유사체 (라파로그)인 세포.
  20. 제19항에 있어서, 라파로그가 에베롤리무스, CCI-779, C20-메탈릴라파마이신, C16-(S)-3-메틸인돌라파마이신, C16-iRap, AP21967, 나트륨 미코페놀산, 베니디핀 히드로클로라이드, AP1903, 또는 AP23573, 또는 이들의 대사물, 유도체, 및/또는 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 세포.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 리간드가 0.05 nM 내지 500 nM의 양으로 존재하거나 또는 제공되는 것인 세포.
  22. (없음)
  23. (없음)
  24. (없음)
  25. (없음)
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, g) 선택가능한 마커를 코딩하는 핵산을 추가로 포함하는 세포.
  27. 제26항에 있어서, 선택가능한 마커가 말단절단된 저-친화도 신경 성장 인자 수용체 (tLNGFR) 폴리펩티드인 세포.
  28. 제27항에 있어서, tLNGFR 폴리펩티드가 서열식별번호: 54의 아미노산 서열을 포함하는 것인 세포.
  29. 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 선택가능한 마커를 코딩하는 핵산이 TRAC 도메인을 코딩하는 내인성 TRA 유전자의 영역 내로 삽입되거나, 또는 선택가능한 마커를 코딩하는 핵산이 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입되는 것인 세포.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, e) 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 추가로 포함하는 세포.
  31. 제30항에 있어서, 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드가 타크롤리무스 (FK506) 및/또는 시클로스포린 A (CsA)에 대한 저항성을 부여하는 것인 세포.
  32. 제30항 또는 제31항에 있어서, 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드가 돌연변이체 칼시뉴린 (CN) 폴리펩티드인 세포.
  33. 제32항에 있어서, 돌연변이체 CN 폴리펩티드가 타크롤리무스 (FK506) 및 시클로스포린 A (CsA)에 대한 저항성을 부여하는 것인 세포.
  34. 제32항 또는 제33항에 있어서, 돌연변이체 CN 폴리펩티드가 CNb30 (서열식별번호: 55)인 세포.
  35. 제30항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산이 TRAC 도메인을 코딩하는 내인성 TRA 유전자의 영역 내로 삽입되거나, 또는 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산이 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입되는 것인 세포.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, f) 포유동물 라파마이신의 표적 (mTOR) 키나제의 FKBP-라파마이신 결합 (FRB) 도메인 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 추가로 포함하는 세포.
  37. 제36항에 있어서, FRB 도메인 폴리펩티드가 세포내 발현되는 것인 세포.
  38. 제36항 또는 제37항에 있어서, FRB 도메인 폴리펩티드가 서열식별번호: 56 또는 57의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 56 또는 57의 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 상동성을 갖는 변이체를 포함하는 것인 세포.
  39. 제36항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, FRB 도메인 폴리펩티드를 코딩하는 핵산이 TRAC 도메인을 코딩하는 내인성 TRA 유전자의 영역 내로 삽입되거나, 또는 FRB 도메인 폴리펩티드를 코딩하는 핵산이 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입되는 것인 세포.
  40. TRAC 도메인을 코딩하는 영역 내의 또는 그 부근의 내인성 TRA 유전자에서의 서열에 상보적인 서열을 포함하는 가이드 RNA (gRNA).
  41. 제40항에 있어서, gRNA가 서열식별번호: 1-3 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 서열식별번호: 1-3 중 어느 하나와 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하는 것인 gRNA.
  42. 내인성 IL2RG 유전자 내의 또는 그 부근의 서열에 상보적인 서열을 포함하는 가이드 RNA (gRNA).
  43. 제42항에 있어서, gRNA가 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나와 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하는 것인 gRNA.
  44. a) 제1 gRNA가 제40항 또는 제41항의 gRNA이고 제2 gRNA가 제42항 또는 제43항의 gRNA인 제1 gRNA 및/또는 제2 gRNA; 및 b) RNA-가이드된 엔도뉴클레아제 (RGEN) 또는 RGEN을 코딩하는 핵산을 포함하는 시스템.
  45. 제44항에 있어서, c) 하기를 코딩하는 핵산을 포함하는 1종 이상의 공여자 주형을 추가로 포함하며:
    i) 항-CTL 단백질;
    ii) 제1 세포외 결합 도메인 또는 그의 부분, 힌지 도메인, 막횡단 도메인, 및 신호전달 도메인 또는 그의 부분 또는 그의 기능적 유도체를 포함하는 제1 CISC 구성성분; 및
    iii) 제2 세포외 결합 도메인 또는 그의 부분, 힌지 도메인, 막횡단 도메인, 및 신호전달 도메인 또는 그의 부분을 포함하는 제2 CISC 구성성분,
    여기서 제1 CISC 구성성분 및 제2 CISC 구성성분은, T 세포에 의해 발현되는 경우에, 이들이 리간드의 존재 하에서 이량체화하여 T 세포의 생존 및/또는 증식을 촉진시킬 수 있는 신호전달 적격 CISC를 생성하도록 구성된 것인
    시스템.
  46. 제45항에 있어서, 항-CTL 단백질이 세포외 β2-마이크로글로불린 도메인, 막횡단 도메인, 공동-자극성 도메인, 및 세포질 신호전달 도메인을 포함하는 것인 시스템.
  47. 제46항에 있어서, 세포외 β2-마이크로글로불린 도메인이 서열식별번호: 49의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 49와 적어도 85% 상동성을 포함하는 그의 변이체를 포함하는 것인 시스템.
  48. 제47항에 있어서, 항-CTL 단백질 막횡단 도메인이 CD8 막횡단 도메인을 포함하고/거나, 항-CTL 단백질 공동-자극성 도메인이 4-1BB 공동-자극성 도메인을 포함하고/거나, 항-CTL 단백질 세포질 신호전달 도메인이 CD3-ζ 세포질 신호전달 도메인을 포함하는 것인 시스템.
  49. 제47항 또는 제48항에 있어서, i) CD8 막횡단 도메인이 서열식별번호: 50의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 50과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고/거나; ii) 4-1BB 공동-자극성 도메인이 서열식별번호: 51의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 51과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고/거나; iii) CD3-ζ 세포질 신호전달 도메인이 서열식별번호: 52의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 52와 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하는 것인 시스템.
  50. 제46항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 항-CTL 단백질이 서열식별번호: 53의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 53과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하는 것인 시스템.
  51. 제45항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 CISC 구성성분의 신호전달 도메인이 IL-2 수용체 서브유닛 감마 (IL2Rγ) 도메인을 포함하는 것인 시스템.
  52. 제51항에 있어서, IL2Rγ 세포질 신호전달 도메인이 서열식별번호: 44의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 44의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하는 것인 시스템.
  53. 제45항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 세포외 결합 도메인 또는 그의 부분이 FK506 결합 단백질 (FKBP) 도메인 또는 그의 부분을 포함하는 것인 시스템.
  54. 제53항에 있어서, FKBP 도메인이 서열식별번호: 41의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 41의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하는 것인 시스템.
  55. 제45항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 CISC 구성성분의 신호전달 도메인이 IL-2 수용체 서브유닛 베타 (IL2Rβ) 도메인을 포함하는 것인 시스템.
  56. 제55항에 있어서, IL2Rβ 세포질 신호전달 도메인이 서열식별번호: 45의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 45의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하는 것인 시스템.
  57. 제45항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 세포외 결합 도메인 또는 그의 부분이 FKBP 라파마이신 결합 (FRB) 도메인 또는 그의 부분을 포함하는 것인 시스템.
  58. 제57항에 있어서, FRB가 서열식별번호: 42의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 42의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하는 것인 시스템.
  59. 제45항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 CISC 구성성분의 막횡단 도메인이 독립적으로 IL-2 수용체 막횡단 도메인을 포함하는 것인 시스템.
  60. 제45항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 리간드가 라파마이신 또는 라파로그인 시스템.
  61. 제60항에 있어서, 라파로그가 에베롤리무스, CCI-779, C20-메탈릴라파마이신, C16-(S)-3-메틸인돌라파마이신, C16-iRap, AP21967, 나트륨 미코페놀산, 베니디핀 히드로클로라이드, AP1903, 또는 AP23573, 또는 이들의 대사물, 유도체, 및/또는 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 시스템.
  62. 제45항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, c) 1종 이상의 공여자 주형이 하기 중 1종 이상을 코딩하는 핵산을 추가로 포함하는 것인 시스템:
    iv) 선택가능한 마커;
    v) 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드; 또는
    vi) 포유동물 라파마이신의 표적 (mTOR) 키나제의 FKBP-라파마이신 결합 (FRB) 도메인 폴리펩티드.
  63. (없음)
  64. (없음)
  65. 제62항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 선택가능한 마커가 말단절단된 저-친화도 신경 성장 인자 수용체 (tLNGFR) 폴리펩티드인 시스템.
  66. 제65항에 있어서, tLNGFR 폴리펩티드가 서열식별번호: 54의 아미노산 서열을 포함하는 것인 시스템.
  67. 제62항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드가 돌연변이체 칼시뉴린 (CN) 폴리펩티드인 시스템.
  68. 제67항에 있어서, 돌연변이체 CN 폴리펩티드가 CNb30 (서열식별번호: 55)인 시스템.
  69. 제62항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, FRB 도메인 폴리펩티드가 서열식별번호: 56 또는 57의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 56 또는 57의 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 상동성을 갖는 변이체를 포함하는 것인 시스템.
  70. 제44항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, RGEN이 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (또한 Csn1 및 Csx12로 공지됨), Cas100, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, 및 Cpf1 엔도뉴클레아제, 또는 그의 기능적 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 시스템.
  71. 제44항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, RGEN이 Cas9인 시스템.
  72. 제44항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, RGEN을 코딩하는 핵산이 리보핵산 (RNA) 서열인 시스템.
  73. 제72항에 있어서, RGEN을 코딩하는 RNA 서열이 공유 결합을 통해 제1 gRNA 또는 제2 gRNA에 연결되는 것인 시스템.
  74. 제45항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 공여자 주형 중 하나를 포함하는 아데노-연관된 바이러스 (AAV) 벡터를 포함하는 시스템.
  75. 제74항에 있어서, AAV 벡터가 서열식별번호: 19-40 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 19-40 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하는 것인 시스템.
  76. 제74항 또는 제75항에 있어서, 제1 gRNA 및 제1 AAV 벡터 및 제2 gRNA 및 제2 AAV 벡터를 포함하며, 여기서
    (A) 제1 gRNA가 서열식별번호: 1의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 1의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 AAV 벡터가 서열식별번호: 37의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 37의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 gRNA가 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 AAV 벡터가 서열식별번호: 40의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 40의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하거나;
    (B) 제1 gRNA가 서열식별번호: 2의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 2의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 AAV 벡터가 서열식별번호: 38의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 38의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 gRNA가 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 AAV 벡터가 서열식별번호: 40의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 40의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하거나;
    (C) 제1 gRNA가 서열식별번호: 3의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 3의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 AAV 벡터가 서열식별번호: 39의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 39의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 gRNA가 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 AAV 벡터가 서열식별번호: 40의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 40의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하는 것인
    시스템.
  77. 제74항 또는 제75항에 있어서, 제1 gRNA 및 제1 AAV 벡터를 포함하며, 여기서
    (A) 제1 gRNA가 서열식별번호: 1의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 1의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 AAV 벡터가 서열식별번호: 19 또는 22의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 19 또는 22의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하거나;
    (B) 제1 gRNA가 서열식별번호: 2의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 2의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 AAV 벡터가 서열식별번호: 20 또는 23의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 20 또는 23의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하거나;
    (C) 제1 gRNA가 서열식별번호: 3의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 3의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 AAV 벡터가 서열식별번호: 21 또는 24의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 21 또는 24의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하는 것인
    시스템.
  78. 제74항 또는 제75항에 있어서, 제1 gRNA 및 제1 AAV 벡터를 포함하며, 여기서 제1 gRNA가 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 AAV 벡터가 서열식별번호: 25-36 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 25-36 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하는 것인 시스템.
  79. 제44항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, RGEN 및 제1 gRNA 및/또는 제2 gRNA를 포함하는 리보핵단백질 (RNP) 복합체를 포함하는 시스템.
  80. 제79항에 있어서, RGEN이 각각 1:1 내지 20:1의 gRNA 대 RGEN의 몰비로 제1 gRNA 및/또는 제2 gRNA와 예비복합체화되어 RNP를 형성하는 것인 시스템.
  81. 서열식별번호: 19-40 중 어느 하나의 핵산 서열, 또는 서열식별번호: 19-40 중 어느 하나와 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하는 벡터.
  82. 제81항에 있어서, 벡터가 아데노 연관된 바이러스 (AAV) 벡터인 벡터.
  83. 세포의 게놈을 편집하는 방법으로서, 하기를 세포에 제공하는 것을 포함하며:
    a) 제1 gRNA가 제40항 또는 제41항의 gRNA이고 제2 gRNA가 제42항 또는 제43항의 gRNA인 제1 gRNA 및/또는 제2 gRNA;
    b) RGEN 또는 RGEN을 코딩하는 핵산; 및
    c) 하기를 코딩하는 핵산을 포함하는 1종 이상의 공여자 주형:
    i) 항-CTL 단백질;
    ii) 제1 세포외 결합 도메인 또는 그의 부분, 힌지 도메인, 막횡단 도메인, 및 신호전달 도메인 또는 그의 부분 또는 그의 기능적 유도체를 포함하는 제1 CISC 구성성분; 및
    iii) 제2 세포외 결합 도메인 또는 그의 부분, 힌지 도메인, 막횡단 도메인, 및 신호전달 도메인 또는 그의 부분을 포함하는 제2 CISC 구성성분,
    여기서 제1 CISC 구성성분 및 제2 CISC 구성성분은, T 세포에 의해 발현되는 경우에, 이들이 리간드의 존재 하에서 이량체화하여 T 세포의 생존 및/또는 증식을 촉진시킬 수 있는 신호전달 적격 CISC를 생성하도록 구성된 것인
    방법.
  84. 제83항에 있어서, 항-CTL 단백질이 세포외 β2-마이크로글로불린 도메인, 막횡단 도메인, 공동-자극성 도메인, 및 세포질 신호전달 도메인을 포함하는 것인 방법.
  85. 제84항에 있어서, 세포외 β2-마이크로글로불린 도메인이 서열식별번호: 49의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 49와 적어도 85% 상동성을 포함하는 그의 변이체를 포함하는 것인 방법.
  86. 제85항에 있어서, 항-CTL 단백질 막횡단 도메인이 CD8 막횡단 도메인을 포함하고/거나, 항-CTL 단백질 공동-자극성 도메인이 4-1BB 공동-자극성 도메인을 포함하고/거나, 항-CTL 단백질 세포질 신호전달 도메인이 CD3-ζ 세포질 신호전달 도메인을 포함하는 것인 방법.
  87. 제85항 또는 제86항에 있어서, i) CD8 막횡단 도메인이 서열식별번호: 50의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 50과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고/거나; ii) 4-1BB 공동-자극성 도메인이 서열식별번호: 51의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 51과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고/거나; iii) CD3-ζ 세포질 신호전달 도메인이 서열식별번호: 52의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 52와 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하는 것인 방법.
  88. 제84항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 항-CTL 단백질이 서열식별번호: 53의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 53과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하는 것인 방법.
  89. 제83항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 CISC 구성성분의 신호전달 도메인이 IL-2 수용체 서브유닛 감마 (IL2Rγ) 세포질 신호전달 도메인을 포함하는 것인 방법.
  90. 제89항에 있어서, IL2Rγ 세포질 신호전달 도메인이 서열식별번호: 44의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 44의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하는 것인 방법.
  91. 제83항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 세포외 결합 도메인 또는 그의 부분이 FK506 결합 단백질 (FKBP) 도메인 또는 그의 부분을 포함하는 것인 방법.
  92. 제91항에 있어서, FKBP 도메인이 서열식별번호: 41의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 41의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하는 것인 방법.
  93. 제83항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 CISC 구성성분의 신호전달 도메인이 IL-2 수용체 서브유닛 베타 (IL2Rβ) 세포질 신호전달 도메인을 포함하는 것인 방법.
  94. 제93항에 있어서, IL2Rβ 세포질 신호전달 도메인이 서열식별번호: 45의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 45의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하는 것인 방법.
  95. 제83항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 세포외 결합 도메인 또는 그의 부분이 FKBP 라파마이신 결합 (FRB) 도메인 또는 그의 부분을 포함하는 것인 방법.
  96. 제95항에 있어서, FRB 도메인이 서열식별번호: 42의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 42의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하는 것인 방법.
  97. 제83항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 CISC 구성성분의 막횡단 도메인이 독립적으로 IL-2 수용체 막횡단 도메인을 포함하는 것인 방법.
  98. 제83항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 리간드가 라파마이신 또는 라파로그인 방법.
  99. 제98항에 있어서, 라파로그가 에베롤리무스, CCI-779, C20-메탈릴라파마이신, C16-(S)-3-메틸인돌라파마이신, C16-iRap, AP21967, 나트륨 미코페놀산, 베니디핀 히드로클로라이드, AP1903, 또는 AP23573, 또는 이들의 대사물, 유도체, 및/또는 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  100. 제83항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, c) 1종 이상의 공여자 주형이 하기 중 1종 이상을 코딩하는 핵산을 추가로 포함하는 것인 방법:
    iv) 선택가능한 마커;
    v) 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드; 또는
    vi) 포유동물 라파마이신의 표적 (mTOR) 키나제의 FKBP-라파마이신 결합 (FRB) 도메인 폴리펩티드.
  101. (없음)
  102. (없음)
  103. 제100항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 선택가능한 마커가 말단절단된 저-친화도 신경 성장 인자 수용체 (tLNGFR) 폴리펩티드인 방법.
  104. 제103항에 있어서, tLNGFR 폴리펩티드가 서열식별번호: 54의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  105. 제100항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드가 돌연변이체 칼시뉴린 (CN) 폴리펩티드인 방법.
  106. 제105항에 있어서, 돌연변이체 CN 폴리펩티드가 CNb30 (서열식별번호: 55)인 방법.
  107. 제100항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, FRB 도메인 폴리펩티드가 서열식별번호: 56 또는 57의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 56 또는 57의 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 상동성을 갖는 변이체를 포함하는 것인 방법.
  108. 세포의 게놈을 편집하는 방법으로서, 제1 gRNA, 제2 gRNA, RGEN 또는 RGEN을 코딩하는 핵산, 제1 벡터, 및 제2 벡터를 세포에 제공하는 것을 포함하며, 여기서
    (A) 제1 gRNA가 서열식별번호: 1의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 1의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 벡터가 서열식별번호: 37의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 37의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 gRNA가 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 벡터가 서열식별번호: 40의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 40의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하거나;
    (B) 제1 gRNA가 서열식별번호: 2의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 2의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 벡터가 서열식별번호: 38의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 38의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 gRNA가 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 벡터가 서열식별번호: 40의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 40의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하거나;
    (C) 제1 gRNA가 서열식별번호: 3의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 3의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 벡터가 서열식별번호: 39의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 39의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 gRNA가 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 벡터가 서열식별번호: 40의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 40의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하는 것인
    방법.
  109. 세포의 게놈을 편집하는 방법으로서, 제1 gRNA, RGEN 또는 RGEN을 코딩하는 핵산, 및 제1 벡터를 세포에 제공하는 것을 포함하며, 여기서
    (A) 제1 gRNA가 서열식별번호: 1의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 1의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 벡터가 서열식별번호: 19 또는 22의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 19 또는 22의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하거나;
    (B) 제1 gRNA가 서열식별번호: 2의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 2의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 벡터가 서열식별번호: 20 또는 23의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 20 또는 23의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하거나;
    (C) 제1 gRNA가 서열식별번호: 3의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 3의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 벡터가 서열식별번호: 21 또는 24의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 21 또는 24의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하는 것인
    방법.
  110. 세포의 게놈을 편집하는 방법으로서, 제1 gRNA, RGEN 또는 RGEN을 코딩하는 핵산, 및 제1 벡터를 세포에 제공하는 것을 포함하며, 여기서 제1 gRNA가 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 벡터가 서열식별번호: 25-36 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 25-36 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하는 것인 방법.
  111. 제83항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, RGEN이 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (또한 Csn1 및 Csx12로 공지됨), Cas100, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, 및 Cpf1 엔도뉴클레아제, 또는 그의 기능적 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  112. 제83항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, RGEN이 Cas9인 방법.
  113. 제83항 내지 제112항 중 어느 한 항에 있어서, RGEN을 코딩하는 핵산이 리보핵산 (RNA) 서열인 방법.
  114. 제113항에 있어서, RGEN을 코딩하는 RNA 서열이 공유 결합을 통해 제1 gRNA 또는 제2 gRNA에 연결되는 것인 방법.
  115. 제83항 내지 제114항 중 어느 한 항에 있어서, 공여자 주형이 AAV 벡터에 함유되는 것인 방법.
  116. 제83항 내지 제115항 중 어느 한 항에 있어서, RGEN이, 세포에의 제공 전에, 제1 gRNA 및/또는 제2 gRNA와 예비복합체화되어 RNP 복합체를 형성하는 것인 방법.
  117. 제116항에 있어서, RGEN이 각각 1:1 내지 20:1의 gRNA 대 RGEN의 몰비로 제1 gRNA 및/또는 제2 gRNA와 예비복합체화되는 것인 방법.
  118. 제83항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 공여자 주형이 독립적으로 세포의 게놈 내로 삽입되는 것인 방법.
  119. 제118항에 있어서, 제1 공여자 주형이 TRA 유전자 또는 유전자 조절 요소에, 그 내에, 또는 그 부근에 삽입되고/거나, 제2 공여자 주형이 IL2RG 유전자 또는 유전자 조절 요소에, 그 내에, 또는 그 부근에 삽입되는 것인 방법.
  120. 제118항 또는 제119항에 있어서, i) 제1 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산이 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입되고/거나, ii) 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산이 TRAC 도메인을 코딩하는 내인성 TRA 유전자의 영역 내로 삽입되거나; 또는 i) 제1 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산이 TRAC 도메인을 코딩하는 내인성 TRA 유전자의 영역 내로 삽입되고/거나, ii) 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산이 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입되는 것인 방법.
  121. 제83항 내지 제120항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 T 세포인 방법.
  122. 제121항에 있어서, T 세포가 CD8+ 세포독성 T 림프구 또는 CD3+ pan T 세포인 방법.
  123. 제121항 또는 제122항에 있어서, T 세포가 다중 공여자로부터 유래된 T 세포의 풀의 구성원인 방법.
  124. 제123항에 있어서, 다중 공여자가 인간 공여자인 방법.
  125. 제83항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 CTL에 대해 세포독성인 방법.
  126. 제83항 내지 제125항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 조작된 세포.
  127. 제1항 내지 제39항 및 제126항 중 어느 한 항에 있어서, 조작된 세포가 CTL에 대해 세포독성인 조작된 세포.
  128. 이식편 대 숙주 질환 (GvHD) 또는 자가면역 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에서 상기 질환을 치료하는 방법으로서, 제1항 내지 제39항 및 제126항 중 어느 한 항의 조작된 세포를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
  129. 유해 CTL-매개된 면역 반응을 특징으로 하는 질환 또는 상태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 상기 질환 또는 상태를 치료하는 방법으로서,
    a) T 세포의 게놈을 제83항 내지 제120항 중 어느 한 항의 방법에 따라 편집함으로써 조작된 T 세포를 생산하고;
    b) 조작된 T 세포를 대상체에게 투여하는 것
    을 포함하는 방법.
  130. 제129항에 있어서, T 세포가 대상체에 대해 자가유래인 방법.
  131. 제120항에 있어서, T 세포가 대상체에 대해 동종이형인 방법.
  132. 제131항에 있어서, T 세포가 다중 공여자로부터 유래된 T 세포의 풀을 포함하는 것인 방법.
  133. 제132항에 있어서, 다중 공여자가 인간 공여자인 방법.
  134. 유해 CTL-매개된 면역 반응을 특징으로 하는 질환 또는 상태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 상기 질환 또는 상태를 치료하는 방법으로서, 대상체에서의 T 세포의 게놈을 제83항 내지 제120항 중 어느 한 항의 방법에 따라 편집하는 것을 포함하는 방법.
  135. 제129항 내지 제134항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포가 CD8+ 세포독성 T 세포 또는 CD3+ pan T 세포를 포함하는 것인 방법.
  136. 제128항 내지 제135항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
  137. 제128항 내지 제136항 중 어느 한 항에 있어서, 라파마이신 또는 라파로그를 대상체에게 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  138. 제137항에 있어서, 라파로그가 에베롤리무스, CCI-779, C20-메탈릴라파마이신, C16-(S)-3-메틸인돌라파마이신, C16-iRap, AP21967, 나트륨 미코페놀산, 베니디핀 히드로클로라이드, AP1903, 또는 AP23573, 또는 이들의 대사물, 유도체, 및/또는 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  139. 제137항 또는 제138항에 있어서, 라파마이신 또는 라파로그가 0.05 nM 내지 500 nM의 농도로 투여되는 것인 방법.
  140. 제129항 내지 제139항 중 어느 한 항에 있어서, 질환 또는 상태가 GvHD 또는 자가면역 질환인 방법.
  141. 제140항에 있어서, 질환 또는 상태가 GvHD이고, 대상체가 이전에 동종이형 이식을 받은 것인 방법.
  142. 제140항에 있어서, 질환이 제1형 당뇨병 (T1D), 전신 홍반성 루푸스 (SLE), 류마티스성 관절염 (RA), 및 다발성 경화증 (MS)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 자가면역 질환인 방법.
  143. 사용에 대한 지침서 및 a) 제1항 내지 제39항 및 제126항 중 어느 한 항의 조작된 세포 및/또는 제44항 내지 제80항 중 어느 한 항의 시스템의 1종 이상의 구성성분; 및/또는 b) 라파마이신 또는 라파로그를 포함하는 키트.
  144. 제143항에 있어서, 라파로그가 에베롤리무스, CCI-779, C20-메탈릴라파마이신, C16-(S)-3-메틸인돌라파마이신, C16-iRap, AP21967, 나트륨 미코페놀산, 베니디핀 히드로클로라이드, AP1903, 또는 AP23573, 또는 이들의 대사물, 유도체, 및/또는 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 키트.
  145. 제1항 내지 제39항 및 제126항 중 어느 한 항의 조작된 세포 또는 제44항 내지 제80항 중 어느 한 항의 시스템의 1종 이상의 구성성분을 포함하는 조성물을 포함하는 시린지.
  146. 제1항 내지 제39항 및 제126항 중 어느 한 항의 조작된 세포 또는 제44항 내지 제80항 중 어느 한 항의 시스템의 1종 이상의 구성성분을 포함하는 조성물을 포함하는 카테터.
  147. 이식편 대 숙주 질환 (GvHD) 또는 자가면역 질환 또는 유해 CTL-매개된 면역 반응을 특징으로 하는 질환 또는 상태의 치료를 위한, 제1항 내지 제39항, 제126항 및 제127항 중 어느 한 항의 조작된 T 세포의 용도.
  148. 이식편 대 숙주 질환 (GvHD) 또는 자가면역 질환 또는 유해 CTL-매개된 면역 반응을 특징으로 하는 질환 또는 상태의 치료용 의약의 제조를 위한, 제1항 내지 제39항, 제126항 및 제127항 중 어느 한 항의 조작된 T 세포의 용도.
  149. 이식편 대 숙주 질환 (GvHD) 또는 자가면역 질환 또는 유해 CTL-매개된 면역 반응을 특징으로 하는 질환 또는 상태의 치료를 위한, 제44항 내지 제80항 중 어느 한 항의 시스템의 용도.
  150. 이식편 대 숙주 질환 (GvHD) 또는 자가면역 질환 또는 유해 CTL-매개된 면역 반응을 특징으로 하는 질환 또는 상태의 치료용 의약의 제조를 위한, 제44항 내지 제80항 중 어느 한 항의 시스템의 용도.
  151. 이식편 대 숙주 질환 (GvHD) 또는 자가면역 질환 또는 유해 CTL-매개된 면역 반응을 특징으로 하는 질환 또는 상태의 치료를 위한, 제40항 내지 제43항 중 어느 한 항의 가이드 RNA, 또는 제81항 또는 제82항의 벡터, 또는 제143항 또는 제144항의 키트, 또는 제145항의 시린지, 또는 제146항의 카테터의 용도.
  152. 이식편 대 숙주 질환 (GvHD) 또는 자가면역 질환 또는 유해 CTL-매개된 면역 반응을 특징으로 하는 질환 또는 상태의 치료용 의약의 제조를 위한, 제40항 내지 제43항 중 어느 한 항의 가이드 RNA, 또는 제81항 또는 제82항의 벡터, 또는 제143항 또는 제144항의 키트, 또는 제145항의 시린지, 또는 제146항의 카테터의 용도.
KR1020207034097A 2018-04-27 2019-04-26 세포독성 t 세포 고갈의 방법 및 조성물 KR20210005923A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862663966P 2018-04-27 2018-04-27
US62/663,966 2018-04-27
PCT/US2019/029504 WO2019210281A1 (en) 2018-04-27 2019-04-26 Methods and compositions of cytotoxic t cell depletion

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20210005923A true KR20210005923A (ko) 2021-01-15

Family

ID=66655438

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020207034097A KR20210005923A (ko) 2018-04-27 2019-04-26 세포독성 t 세포 고갈의 방법 및 조성물

Country Status (12)

Country Link
US (1) US20210069249A1 (ko)
EP (1) EP3784694A1 (ko)
JP (1) JP2021521837A (ko)
KR (1) KR20210005923A (ko)
CN (1) CN112752767A (ko)
AU (1) AU2019260804A1 (ko)
BR (1) BR112020021856A2 (ko)
CA (1) CA3097885A1 (ko)
IL (1) IL278201A (ko)
MX (1) MX2020011263A (ko)
SG (1) SG11202010228RA (ko)
WO (1) WO2019210281A1 (ko)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11753460B2 (en) 2016-12-13 2023-09-12 Seattle Children's Hospital Methods of exogenous drug activation of chemical-induced signaling complexes expressed in engineered cells in vitro and in vivo
CA3091490A1 (en) 2018-04-27 2019-10-31 Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) Rapamycin resistant cells
WO2022005462A1 (en) * 2020-06-30 2022-01-06 Tr1X, Inc. Poly-donor cd4+ t cells expressing il-10 and uses thereof
CA3188357A1 (en) * 2020-10-27 2022-05-05 Michal MASS Compositions and methods for the treatment of cancer using next generation engineered t cell therapy

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL136511A0 (en) * 2000-06-01 2001-06-14 Gavish Galilee Bio Appl Ltd Genetically engineered mhc molecules
JP6681837B2 (ja) * 2014-03-11 2020-04-15 セレクティスＣｅｌｌｅｃｔｉｓ 同種移植に適合するｔ細胞を作製するための方法
US20170335281A1 (en) * 2014-03-15 2017-11-23 Novartis Ag Treatment of cancer using chimeric antigen receptor
CN105647871A (zh) * 2016-01-27 2016-06-08 苏州佰通生物科技有限公司 一种可异体移植的嵌合抗原受体t细胞及制备方法
WO2018002719A1 (en) 2016-06-29 2018-01-04 Crispr Therapeutics Ag Compositions and methods for gene editing
CN107236741A (zh) * 2017-07-19 2017-10-10 广州医科大学附属第五医院 一种敲除野生型T细胞TCR alpha链的gRNA及方法
CN107630006B (zh) * 2017-09-30 2020-09-11 山东兴瑞生物科技有限公司 一种制备tcr与hla双基因敲除的t细胞的方法
GB201716728D0 (en) * 2017-10-12 2017-11-29 Autolus Ltd Cell
CN107723275B (zh) * 2017-10-20 2020-09-04 重庆精准生物技术有限公司 通用型car-t细胞及其制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CA3097885A1 (en) 2019-10-31
MX2020011263A (es) 2021-04-12
JP2021521837A (ja) 2021-08-30
IL278201A (en) 2020-11-30
US20210069249A1 (en) 2021-03-11
EP3784694A1 (en) 2021-03-03
SG11202010228RA (en) 2020-11-27
AU2019260804A1 (en) 2020-11-12
CN112752767A (zh) 2021-05-04
BR112020021856A2 (pt) 2021-02-23
WO2019210281A1 (en) 2019-10-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7399866B2 (ja) ＣＡＲＴｙｒｉｎ組成物とその利用方法
CN107207621B (zh) 嵌合蛋白
AU2022201296A1 (en) Genetically modified cells, tissues, and organs for treating disease
KR20210116526A (ko) 증진된 항-신생물 활성 및 면역억제 내성을 갖는 변형된 면역 세포
JP2023036914A (ja) インビトロ及びインビボで操作された細胞において発現された化学誘導シグナル伝達複合体の外因性薬物活性化の方法
KR20210005922A (ko) 형질 세포 고갈을 위한 항-bcma car-t-세포
KR20240067973A (ko) 조작된 면역자극성 박테리아 균주 및 이의 용도
KR20210008502A (ko) 암을 치료하기 위한 방법 및 조성물
KR20210005923A (ko) 세포독성 t 세포 고갈의 방법 및 조성물
WO2019051424A9 (en) Compositions and methods for chimeric ligand receptor (clr)-mediated conditional gene expression
KR20200104284A (ko) Hpv-특이적 결합 분자
AU2017306557A1 (en) Gene editing of CAR-T cells for the treatment of T cell malignancies with chimeric antigen receptors
KR20220090512A (ko) 액체암의 치료를 위한 조성물 및 방법
KR20220038362A (ko) 재조합 ad35 벡터 및 관련 유전자 요법 개선
KR20210149734A (ko) Rna-가이드된 엔도뉴클레아제를 사용한 dna 작제물의 통합을 위한 개선된 방법
KR20230029603A (ko) 필수 유전자 녹-인에 의한 선택
CN116802203A (zh) 从经修饰的恒定cd3免疫球蛋白超家族链基因座表达嵌合受体的细胞、相关多核苷酸和方法
KR20220157396A (ko) 면역 세포에서 아르기닌 수준을 조정하기 위한 방법 및 조성물
RU2792187C2 (ru) Композиции cart-иринов и способы их применения
RU2804664C2 (ru) Hpv-специфические связывающие молекулы
KR20230137340A (ko) 폴리시스트로닉 발현 카세트를 포함하는 재조합 벡터및 이의 사용 방법
TW200904466A (en) Methods of treating inflammatory disorders using isoforms of receptor tyrosine kinases