CN105647871A - 一种可异体移植的嵌合抗原受体t细胞及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种可异体移植的嵌合抗原受体T细胞及制备方法，本发明利用基因定点敲除技术，尤其是CRISPR/Cas9技术，改造T细胞，针对T细胞的TCR的α及β链的恒定区域进行基因敲除，使T细胞的TCR失活，从而使T细胞能够进行异体移植而不会产生免疫排斥。再将这种失活TCR的T细胞结合CAR技术，能够达到采用异体来源的T细胞靶向治疗特定的肿瘤的目的。本发明解决了目前自身T细胞数量少、活性低、培养时间长的弊端。且能够事先就采用健康人的血液分离高质量、高活性的T细胞进行改造，准备好针对各种肿瘤的CART细胞，肿瘤患者一旦需要CART治疗就无需等待时间，最大限度地缩短治疗等待的宝贵时间。
Description
技术领域
本发明涉及肿瘤治疗领域，尤其涉及一种可异体移植的嵌合抗原受体T细胞及制备方法。
背景技术
肿瘤一直以来都是困扰全世界的重大疾病，严重危害人类健康。因此，寻找有效的肿瘤治疗方法，彻底攻克肿瘤是世界医学界的重要研究课题。目前，传统的三大主要治疗手段即手术治疗、化疗、放疗这三大主要治疗手段虽然是全球肿瘤治疗的基本手段方法，然而其治疗效果有限。
其中传统手术切除是肿瘤行业中最基本、最重要的肿瘤治疗手段。放疗是用放射线照射癌组织，以抑制和杀灭癌细胞的一种治疗方法，是大多数肿瘤的辅助疗法，然而由于放疗对癌细胞和正常细胞没有分辨能力，多次放疗后，患者会产生一系列毒副作用和反应，对中晚期肿瘤患者，放疗作用有限。化疗是利用化学药物杀死肿瘤细胞、抑制肿瘤细胞的生长繁殖的一种治疗方式，但对大多数肿瘤的治疗的有效性较低。并且，化疗与放疗一样，其在杀伤肿瘤细胞的同时，也将正常细胞和免疫细胞一同杀灭，导致病患者免疫能力和身体机能下降，生活质量降低。
目前，免疫肿瘤疗法正在全世界兴起，为肿瘤患者带来了曙光。而免疫疗法中最有效果的疗法是基于嵌合抗原受体T细胞(ChimericantigenreceptorTcells,CART)疗法。其基本原理是利用基因工程改造从肿瘤患者自身身体中分离培养的T细胞，即通过逆转录病毒和慢病毒载体给T细胞加入一个能特异识别肿瘤细胞，并且同时激活T细胞杀死肿瘤细胞的嵌合抗体。然后将这些基因工程改造的T细胞进行体外扩增后回输到患者体内，使免疫细胞具有特异性识别和杀伤肿瘤的能力，从而达到治疗肿瘤的效果。
嵌合抗原受体（chimericantigenreceptor,CAR）主要由三部分组成，位于细胞外的抗原结合区scFv，跨膜区以及胞内信号转导结构域组成。其中，根据胞内信号转导结构域的研究发展，CAR可以分为第一代CAR、第二代CAR以及第三代CAR。第一代CAR仅含有一个信号单元，大多来自于CD3ζ，对肿瘤的杀伤效果很不理想。第二代CAR是在第一代CAR的胞内信号转导结构域基础之上增加了一个共刺激结构域，比如CD28、OX40或者4-1BB，能够提高CART细胞杀伤肿瘤的疗效，但是效果还不能令人满意。目前，大多数CAR都是第三代CAR，其主要是在在第二代CAR的胞内结构域基础之上再增加一个共刺激结构域，因此具有三个个共刺激结构域，研究发现这样极大地提高了CART细胞的扩增倍数以及T细胞在体内存活的时间，达到治疗肿瘤的效果。
虽然CART技术在治疗肿瘤上面显示出了巨大的优势和效果，然而，由于CART治疗肿瘤非常的个体化，即必须要分离肿瘤患者自身的T细胞，这在实际应用之中具有相当大的困难，也存在许多的不足。首先是绝大多数肿瘤患者采用CART治疗肿瘤时都是在其他肿瘤治疗方法失去效果的情况下进行的，在经过手术治疗，尤其是在经过化疗和放疗之后，患者的免疫系统遭到毁灭性的破坏，其自身的T细胞数量极其有限，这会造成分离T细胞困难。第二，经过放化疗至后，患者自身的T细胞遭受化学药物及射线的破坏，T细胞的活性非常低，尤其是细胞增殖能力非常低，分泌肿瘤杀伤因子的能力也大幅下降，进而不能够有效杀伤肿瘤细胞。第三，CART治疗前分离肿瘤患者自身的T细胞，在分离细胞的同时，无法完全避免分离的T细胞里面有少量的肿瘤细胞也混杂在分离的细胞里面，即便经过大规模的体外扩增，由于放化疗之后的肿瘤细胞活性更高，因此获得的T细胞里面也具有大量的肿瘤细胞，在输入患者体内之后，这些肿瘤细胞也会再次输入患者体内，为患者造成了致命打击。第四，经过放化疗的肿瘤患者身体极其脆弱，肿瘤随时都可能复发，留给患者的时间非常不足，往往在经过极其短的时间，甚至一两周之内就会复发，然而，个体化分离患者的T细胞、然后在经过基因改造成CART细胞，其后再大规模体外培养、最后输入患者，这段时间会经历非常长的时间，往往会需要几个月的时间，而这段准备CART的时间之内，患者可能已经失去生命。
因此，现有技术还有待于改进和发展。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可异体移植的嵌合抗原受体T细胞及制备方法，旨在解决现有T细胞分离困难、不能够有效杀伤肿瘤细胞及混杂有肿瘤细胞的问题。
本发明的技术方案如下：
一种可异体移植的嵌合抗原受体T细胞，所述嵌合抗原受体T细胞包括T细胞和嵌合抗原受体，其中，所述T细胞为经过基因工程改造的能够进行异体移植的T细胞。
所述的可异体移植的嵌合抗原受体T细胞，其中，所述T细胞为经过基因定点敲除技术在特定基因改造的T细胞。
所述的可异体移植的嵌合抗原受体T细胞，其中，所述特定基因为TCR基因，所述TCR包括α链和β链，所述基因改造具体为：在TCR的α和β链中的一种或两种链的恒定区域的相应编码基因的外显子用基因定点敲除技术，使T细胞的TCR不具有活性，进而使T细胞能够进行异体移植。
所述的可异体移植的嵌合抗原受体T细胞，其中，所述基因定点敲除技术为CRISPR/Cas9。
所述的可异体移植的嵌合抗原受体T细胞，其中，所述嵌合抗原受体由scFv抗原结合序列、跨膜序列及胞内信号转导序列组成。
所述的可异体移植的嵌合抗原受体T细胞，其中，所述scFv抗原结合序列包括轻链可变区序列和重链可变区序列。
所述的可异体移植的嵌合抗原受体T细胞，其中，所述scFv抗原结合序列为CD19、CD30、CD33、CEA、cMet、EGFRvIII、FAP、Her2、GD2、PSMA、Mesothelin和NCAM中的一种。
所述的可异体移植的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述跨膜序列为CD8。
所述的可异体移植的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述胞内信号转导序列包括CD28胞内结构域序列、4-1BB胞内结构域序列和CD3ζ胞内结构域序列。
一种如上任一所述的可异体移植的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其中，包括步骤：
A、在TCR的α和β链中的一种或两种链的恒定区域的相应编码基因的外显子用基因定点敲除技术，使T细胞的TCR不具有活性，进而得到能够进行异体移植的T细胞；
B、将携带嵌合抗原受体的慢病毒感染上述得到的能够进行异体移植的T细胞，感染完成后得到可异体移植的嵌合抗原受体T细胞。
有益效果：本发明异体来源的T细胞经过基因工程改造，进而可以使这种T细胞异体移植而不会产生免疫排斥。然后将这种异体移植不会产生免疫排斥的T细胞结合第三代CAR技术制备成一种可以异体移植的通用型的嵌合抗原受体T细胞，以便于肿瘤治疗。
附图说明
图1为本发明实施例1中T细胞α链恒定区TRAC的外显子用CRISPR/Cas9敲除及结合CAR治疗肿瘤的流程示意图。
图2为本发明实施例2中T细胞β链恒定区域一TCRBC1的外显子用CRISPR/Cas9敲除及结合CAR治疗肿瘤的流程示意图。
图3为本发明实施例3中T细胞β链恒定区域二TCRBC2的外显子用CRISPR/Cas9敲除及结合CAR治疗肿瘤的流程示意图。
图4为本发明实施例4中T细胞α链恒定区TRAC以及β链恒定区域一TCRBC1的外显子用CRISPR/Cas9同时敲除及结合CAR治疗肿瘤的流程示意图。
图5为本发明实施例5中T细胞α链恒定区TRAC以及β链恒定区域二TCRBC2的外显子用CRISPR/Cas9同时敲除及结合CAR治疗肿瘤的流程示意图。
图6为本发明实施例6中T细胞α链恒定区TRAC以及β链恒定区域一TCRBC1和β链恒定区域二TCRBC2的外显子用CRISPR/Cas9同时敲除及结合CAR治疗肿瘤的流程示意图。
具体实施方式
本发明提供一种可异体移植的嵌合抗原受体T细胞及制备方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明提供一种可异体移植的嵌合抗原受体T细胞，所述嵌合抗原受体T细胞包括T细胞和嵌合抗原受体，其中，所述T细胞为经过基因工程改造的能够进行异体移植的T细胞。其中，本发明T细胞的来源包括健康成年人采血分离获取或者患者自身血液分离提取或者其他符合相应条件的人的血液提取分离。本发明异体来源的T细胞经过基因工程改造，进而可以使这种T细胞异体移植而不会产生免疫排斥。然后将这种异体移植不会产生免疫排斥的T细胞结合第三代CAR技术制备成一种可以异体移植的通用型的嵌合抗原受体T细胞，以便于肿瘤治疗。
具体地，本发明所述T细胞为经过基因定点敲除技术在特定基因改造的T细胞。其中，所述特定基因可以为但不限于TCR基因，所述TCR包括α链和β链，所述基因改造具体为：在TCR的α和β链中的一种或两种链的恒定区域的相应编码基因的外显子用基因定点敲除技术，使T细胞的TCR不具有活性，进而使T细胞能够进行异体移植。
具体地，本发明所述TCR的α链的恒定区域为TRAC，TCR的β链的恒定区域具有两个区域，分别为TCRBC1和TCRBC2。
具体地，所述基因定点敲除技术优选为CRISPR/Cas9（Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats(CRISPR)/CRISPR-associatedsystems(Cas)，CRISPR/Cas9）技术。CRISPR/Cas9技术是最近发展起来的基因定点敲除技术之一，之前基因定点敲除技术还有锌指核酸酶（ZincFingerNuclease,ZFN）技术以及TALEN（Transcriptionactivator-likeeffectornucleases,TALEN）技术。而CRISPR/Cas9技术相较于ZFN技术和TALEN技术而言，其操作更加简单，同时脱靶效应也小于另两种技术，因此，在最近获得了巨大的关注和发展。Cas9酶含有两个核酸酶结构域，可以分别切割DNA两条单链。Cas9首先与crRNA及tracrRNA这两种结合成复合物，然后再通过PAM序列结合并侵入DNA，形成RNA-DNA复合结构，进而对目的DNA双链进行切割，使DNA双链断裂，而最终利用细胞自身的修复机制造成剪切的DNA部位增加或者缺失DNA序列，进而达到敲除基因表达的目的。
而通过基因工程手段对crRNA和tracrRNA进行改造，将其连接在一起得到sgRNA（singleguideRNA,sgRNA）。最终再通过将表达sgRNA的序列与表达Cas9的序列相连接，得到可以同时表达两者的质粒，将其转染细胞，便能够对目的基因进行敲除。
作为本发明优选的实施例，本发明基因改造可以为：T细胞的TCR的α及β两条链的恒定区域的相应编码基因的外显子用基因定点敲除技术（如CRISPR/Cas9技术）同时敲除，使T细胞的TCR不能够具有活性。T细胞的TCR的α及β两条链的恒定区域的相应编码基因的外显子用基因定点敲除技术尤其是CRISPR/Cas9技术同时敲除，其中包括采用基因定点敲除技术尤其是CRISPR/Cas9技术单独敲除α的恒定区TRAC或者β的恒定区TCRBC1或者β的恒定区TCRBC2，或者组合敲除α的恒定区TRAC和β的恒定区TCRBC1，或者α的恒定区TRAC和β的恒定区TCRBC2，或者α的恒定区TRAC和β的恒定区TCRBC1以及TCRBC2。
本发明中，所述嵌合抗原受体（即第三代CAR）由scFv抗原结合序列、跨膜序列及胞内信号转导序列组成。其中，scFv抗原结合序列包括针对不同肿瘤的序列，包括CD19（序列见Seq-CD19-scFv）、CD30（序列见Seq-CD30-scFv）、CD33（序列见Seq-CD33-scFv）、CEA（序列见Seq-CEA-scFv）、cMet（序列见Seq-cMet-scFv）、EGFRvIII（序列见Seq-EGFRvIII-scFv）、FAP（序列见Seq-FAP-scFv）、Her2（序列见Seq-Her2-scFv）、GD2（序列见Seq-GD2-scFv）、PSMA（序列见Seq-PSMA-scFv）、Mesothelin（序列见Seq-Mesothelin-scFv）和NCAM（序列见Seq-NCAM-scFv）等中的一种。所述scFv抗原结合序列和跨膜序列之间包含一段铰链序列（Hinge序列）。所述Hinge序列为CD8的胞外铰链结构。优选地，所述跨膜序列为CD8。而经过实验验证简化了操作，采用CD8分子的胞外铰链结构将跨膜序列与scFv抗原结合序列直接相连接。换句话说，本发明跨膜序列包括CD8的铰链序列及跨膜序列（序列见Seq-CD8-hinge-trans）。所述胞内信号转导序列包括CD28胞内结构域序列、4-1BB胞内结构域序列和CD3ζ胞内结构域序列等。其中，CD28胞内结构域序列见Seq-CD28-endo，4-1BB胞内结构域序列见Seq-4-1BB-endo，CD3ζ胞内结构域序列见Seq-CD3ζ-endo。将这些不同的scFv抗原结合序列和CD8铰链序列及跨膜序列、D28胞内结构域序列、4-1BB胞内结构域序列和CD3ζ胞内结构域序列组合，就可以得到针对不同血液肿瘤比如急性淋巴癌以及实体肿瘤，比如胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、胰腺癌等的嵌合抗原受体。
进一步地，本发明所述scFv抗原结合序列包括轻链可变区序列和重链可变区序列。优选地，本发明所述scFv抗原结合序列包括轻链可变区序列、重链可变区序列、连接轻链可变区序列和重链可变区序列的优化联结区序列及位于轻链可变区序列之前的可溶信号肽序列。
本发明利用基因定点敲除技术，尤其是CRISPR/Cas9技术，改造T细胞，针对T细胞的TCR的α及β链的恒定区域进行基因敲除，使T细胞的TCR失活，从而使T细胞能够进行异体移植而不会产生免疫排斥。再将这种失活TCR的T细胞结合CAR技术，能够达到采用异体来源的T细胞靶向治疗特定的肿瘤的目的。本发明解决了目前CART细胞技术只能够通过分离自身的T细胞，然后结合CAR技术来治疗肿瘤的不足，比如自身T细胞数量少、活性低、培养时间长的弊端。本发明能够事先就采用健康人的血液分离高质量、高活性的T细胞进行改造，准备好针对各种肿瘤的CART细胞，肿瘤患者一旦需要CART治疗就无需等待时间，最大限度地缩短治疗等待的宝贵时间。
基于上述嵌合抗原受体T细胞，本发明还提供一种如上任一所述的可异体移植的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其包括步骤：
一种如权利要求1-9任一所述的可异体移植的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于，包括步骤：
A、在TCR的α和β链中的一种或两种链的恒定区域的相应编码基因的外显子用基因定点敲除技术，使T细胞的TCR不具有活性，进而得到能够进行异体移植的T细胞；
B、将携带嵌合抗原受体的慢病毒感染上述得到的能够进行异体移植的T细胞，感染完成后得到可异体移植的嵌合抗原受体T细胞。
本发明主要包括以下几个部分，一个是异体来源的T细胞，而这种T细胞经过基因定点敲除技术尤其是CRISPR/Cas9技术改造，将T细胞受体的两条链即α及β两条链分别或者同时敲除，从而使TCR失活，进而可以使这种T细胞异体移植而不会产生免疫排斥。二是将这种异体移植不会产生免疫排斥的T细胞结合第三代CAR技术制备成一种可以异体移植的通用型的CART，以便于肿瘤治疗。
下面通过实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
异体移植TRAC失活的T细胞结合第三代CAR治疗肿瘤
本实施例中，采用CRISPR/Cas9技术来敲除TCR的α链的恒定区编码基因TRAC。针对TRAC的外显子，包括外显子1、外显子2、外显子3以及外显子4，利用CRISPR/Cas9技术来敲除TRAC的外显子1。根据TRAC外显子序列，尤其是外显子1的序列，设计表达sgRNA（singleguideRNA,sgRNA）的序列包括有：Seq-TRAC-EX1-1、Seq-TRAC-EX1-2、Seq-TRAC-EX1-3、Seq-TRAC-EX1-4、Seq-TRAC-EX1-5。
进一步地，将上述序列，尤其是Seq-TRAC-EX1-1序列反向相互补，得到Seq-TRAC-EX1-1的反向互补序列（见序列Seq-TRAC-EX1-1-R）。
进一步地，还需要在Seq-TRAC-EX1-1和Seq-TRAC-EX1-1-R两端加上双酶切位点BamHI和EcoRI，方便序列合成之后构建进入载体，加了双酶切位点之后的序列分别见序列Seq-TRAC-EX1-1-BamHI和序列Seq-TRAC-EX1-1-R-EcoRI。
进一步地，将上述序列分别合成，序列合成之后，首先进行退火反应，其过程为：按照合成序列说明书将寡聚核苷酸单链用ddH2O溶解成50μM的溶液；然后将8μl的Seq-TRAC-EX1-1-BamHI、8μl的Seq-TRAC-EX1-1-R-EcoRI以及2μl的NEBBuffer2和2μl的ddH2O混合均匀，然后把EP管放在95℃水浴5分钟。此后关闭水浴锅，让EP管在水浴锅中自然降温到常温即完成退火，得到能够表达sgRNA的双链寡核苷酸。
然后将上述序列构建到CRISPR/Cas9载体上。构建过称为：采用BamHI和EcoRI对CRISPR/Cas9载体进行双酶切，然后用胶回收试剂盒进行胶回收。将胶回收的CRISPR/Cas9载体与合成并退火的能够表达sgRNA的双链寡核苷酸按照摩尔比例为1:10混合（20微升体系），再加入T4DNA连接酶buffer溶液，之后在45℃水浴热激5分钟，热激之后放置到4℃冰箱5分钟，最后加入2微升T4DNA连接酶，在16摄氏度连接过夜。
之后将连接的质粒做细菌转化，其过程为：将连接的质粒放置在冰上，并且将DH5α细菌（每管50微升）在冰上解冻；之后用微量移液器吸取3-5微升质粒，加入细菌中，混合均匀，然后将混合物继续放置冰上5-10分钟；然后将混合物在42℃水浴热激90秒钟；然后迅速将混合物再放置在冰上冷却2-3分钟；最后加入500微升无菌LB培养基，放置在37℃振荡培养1小时；培养完成之后涂平板，然后放置在37℃培养过夜；第二天挑取克隆测序。
将测序正确的质粒转染从健康人分离培养的T细胞进行TCR基因的敲除。转染过称为：将50微克构建好的质粒加入到100微升含有脂质体的混合溶液（50微升超纯水和50微升脂质体混合）中，在室温放置15分钟。之后加入到1个10厘米培养皿培养的T细胞中，6个小时之后换上新鲜培养液。
质粒转染完成之后，继续培养T细胞并进一步扩增。由于TCR敲除的T细胞已经不会表达TCR，因此，TCR未被敲除的T细胞会表达，所以，采用荧光标记的抗TCRαβ的抗体anti-TCRαβ-PE可以直接将质粒转染后扩增的T细胞分为两群细胞，一群是有荧光的T细胞，一群是没有荧光的T细胞，而没有荧光的T细胞即是目的细胞。因此，可以采用流式细胞术分离TCR敲除的细胞，其过程为：将质粒转染并扩增之后的T细胞收集，并用磷酸盐缓冲液清洗3遍，之后加入1mL冰预冷的磷酸盐缓冲液重悬细胞，再向其中加入20微升anti-TCRαβ-PE抗体，避光孵育30分钟；孵育完成之后，用磷酸盐缓冲液清洗3遍，然后加入1mL磷酸盐缓冲液过流式细胞仪，收集不带荧光的细胞。细胞收集完成之后，继续在体外扩增培养并冻存待用。
之后将针对不同类型肿瘤的携带CAR的慢病毒感染上述分离到的可以异体移植的T细胞，其过程为：在10厘米培养皿中培养TCR失活的T细胞（1×107数量），然后将包装好的装载CAR的慢病毒即PLVX-信号肽序列-scFv-CD8（铰链及跨膜-CD28-endo-4-1BB-endo-CD3ζ慢病毒1mL加入培养皿混合均匀，24小时之后换新鲜培养液即可。
病毒感染完成之后，就将表达CAR的TCR失活的T细胞大规模体外扩增。培养到足够数量之后，对细胞进行收集，最后用磷酸盐缓冲液清洗三遍之后，用于异体移植治疗肿瘤。
实施例2
异体移植TCRBC1失活的T细胞结合第三代CAR治疗肿瘤
在本实施例中，采用CRISPR/Cas9技术来敲除TCR的β链的恒定区编码基因TCRBC1。针对TCRBC1的外显子，包括外显子1、外显子2、外显子3以及外显子4，利用CRISPR/Cas9技术来敲除TCRBC1的外显子1。根据TCRBC1外显子序列，尤其是外显子1的序列，设计表达sgRNA（singleguideRNA,sgRNA）的序列包括有：Seq-TCRBC1-EX1-1、Seq-TCRBC1-EX1-2、Seq-TCRBC1-EX1-3、Seq-TCRBC1-EX1-4、Seq-TCRBC1-EX1-5。
进一步地，将上述序列，尤其是Seq-TCRBC1-EX1-1序列反向相互补，得到Seq-TCRBC1-EX1-1的反向互补序列（见序列Seq-TCRBC1-EX1-1-R）。
进一步地，还需要在Seq-TCRBC1-EX1-1和Seq-TCRBC1-EX1-1-R两端加上双酶切位点BamHI和EcoRI，方便序列合成之后构建进入载体，加了双酶切位点之后的序列分别见序列Seq-TCRBC1-EX1-1-BamHI和序列Seq-TCRBC1-EX1-1-R-EcoRI。
进一步地，将上述序列分别合成，序列合成之后，首先进行退火反应，其过程为：按照合成序列说明书将寡聚核苷酸单链用ddH2O溶解成50μM的溶液；然后将8μl的Seq-TCRBC1-EX1-1-BamHI、8μl的Seq-TCRBC1-EX1-1-R-EcoRI以及2μl的NEBBuffer2和2μl的ddH2O混合均匀，然后把EP管放在95℃水浴5分钟。此后关闭水浴锅，让EP管在水浴锅中自然降温到常温即完成退火，得到能够表达sgRNA的双链寡核苷酸。
然后将上述序列构建到CRISPR/Cas9载体上。构建过称为：采用BamHI和EcoRI对CRISPR/Cas9载体进行双酶切，然后用胶回收试剂盒进行胶回收。将胶回收的CRISPR/Cas9载体与合成并退火的能够表达sgRNA的双链寡核苷酸按照摩尔比例为1:10混合（20微升体系），再加入T4DNA连接酶缓冲溶液，之后在45℃水浴热激5分钟，热激之后放置到4℃冰箱5分钟，最后加入2微升T4DNA连接酶，在16摄氏度连接过夜。
之后将连接的质粒做细菌转化，其过程为：将连接的质粒放置在冰上，并且将DH5α细菌（每管50微升）在冰上解冻；之后用微量移液器吸取3-5微升质粒，加入细菌中，混合均匀，然后将混合物继续放置冰上5-10分钟；然后将混合物在42℃水浴热激90秒钟；然后迅速将混合物再放置在冰上冷却2-3分钟；最后加入500微升无菌LB培养基，放置在37℃振荡培养1小时；培养完成之后涂平板，然后放置在37℃培养过夜；第二天挑取克隆测序。
将测序正确的质粒转染从健康人分离培养的T细胞进行TCR基因的敲除。转染过称为：将50微克构建好的质粒加入到100微升含有脂质体的混合溶液（50微升超纯水和50微升脂质体混合）中，在室温放置15分钟。之后加入到1个10厘米培养皿培养的T细胞中，6个小时之后换上新鲜培养液。
质粒转染完成之后，继续培养T细胞并进一步扩增。由于TCR敲除的T细胞已经不会表达TCR，因此，TCR未被敲除的T细胞会表达，所以，采用荧光标记的抗TCRαβ的抗体anti-TCRαβ-PE可以直接将质粒转染后扩增的T细胞分为两群细胞，一群是有荧光的T细胞，一群是没有荧光的T细胞，而没有荧光的T细胞即是目的细胞。因此，可以采用流式细胞术分离TCR敲除的细胞，其过程为：将质粒转染并扩增之后的T细胞收集，并用磷酸盐缓冲液清洗3遍，之后加入1mL冰预冷的磷酸盐缓冲液重悬细胞，再向其中加入20微升anti-TCRαβ-PE抗体，避光孵育30分钟；孵育完成之后，用磷酸盐缓冲液清洗3遍，然后加入1mL磷酸盐缓冲液过流式细胞仪，收集不带荧光的细胞。细胞收集完成之后，继续在体外扩增培养并冻存待用。
之后将针对不同类型肿瘤的携带CAR的慢病毒感染上述分离到的可以异体移植的T细胞，其过程为：在10厘米培养皿中培养TCR失活的T细胞（1×107数量），然后将包装好的装载CAR的慢病毒即PLVX-信号肽序列-scFv-CD8（铰链及跨膜-CD28-endo-4-1BB-endo-CD3ζ慢病毒1mL加入培养皿混合均匀，24小时之后换新鲜培养液即可。
病毒感染完成之后，就将表达CAR的TCR失活的T细胞大规模体外扩增。培养到足够数量之后，对细胞进行收集，最后用磷酸盐缓冲液清洗三遍之后，用于异体移植治疗肿瘤。
实施例3
异体移植TCRBC2失活的T细胞结合第三代CAR治疗肿瘤
在本实施例中，采用CRISPR/Cas9技术来敲除TCR的β链的恒定区编码基因TCRBC2。针对TCRBC2的外显子，包括外显子1、外显子2、外显子3以及外显子4，利用CRISPR/Cas9技术来敲除TCRBC2的外显子1。根据TCRBC2外显子序列，尤其是外显子1的序列，设计表达sgRNA（singleguideRNA,sgRNA）的序列包括有：Seq-TCRBC2-EX1-1、Seq-TCRBC2-EX1-2、Seq-TCRBC2-EX1-3、Seq-TCRBC2-EX1-4、Seq-TCRBC2-EX1-5。
进一步地，将上述序列，尤其是Seq-TCRBC2-EX1-1序列反向相互补，得到Seq-TCRBC2-EX1-1的反向互补序列（见序列Seq-TCRBC2-EX1-1-R）。
进一步地，还需要在Seq-TCRBC2-EX1-1和Seq-TCRBC2-EX1-1-R两端加上双酶切位点BamHI和EcoRI，方便序列合成之后构建进入载体，加了双酶切位点之后的序列分别见序列Seq-TCRBC2-EX1-1-BamHI和序列Seq-TCRBC2-EX1-1-R-EcoRI。
进一步地，将上述序列分别合成，序列合成之后，首先进行退火反应，其过程为：按照合成序列说明书将寡聚核苷酸单链用ddH2O溶解成50μM的溶液；然后将8μl的Seq-TCRBC2-EX1-1-BamHI、8μl的Seq-TCRBC2-EX1-1-R-EcoRI以及2μl的NEBBuffer2和2μl的ddH2O混合均匀，然后把EP管放在95℃水浴5分钟。此后关闭水浴锅，让EP管在水浴锅中自然降温到常温即完成退火，得到能够表达sgRNA的双链寡核苷酸。
然后将上述序列构建到CRISPR/Cas9载体上。构建过称为：采用BamHI和EcoRI对CRISPR/Cas9载体进行双酶切，然后用胶回收试剂盒进行胶回收。将胶回收的CRISPR/Cas9载体与合成并退火的能够表达sgRNA的双链寡核苷酸按照摩尔比例为1:10混合（20微升体系），再加入T4DNA连接酶缓冲溶液，之后在45℃水浴热激5分钟，热激之后放置到4℃冰箱5分钟，最后加入2微升T4DNA连接酶，在16摄氏度连接过夜。
之后将连接得到的质粒做细菌转化，其过程为：将连接的质粒放置在冰上，并且将DH5α细菌（每管50微升）在冰上解冻；之后用微量移液器吸取3-5微升质粒，加入细菌中，混合均匀，然后将混合物继续放置冰上5-10分钟；然后将混合物在42℃水浴热激90秒钟；然后迅速将混合物再放置在冰上冷却2-3分钟；最后加入500微升无菌LB培养基，放置在37℃振荡培养1小时；培养完成之后涂平板，然后放置在37℃培养过夜；第二天挑取克隆测序。
将测序正确的质粒转染从健康人分离培养的T细胞进行TCR基因的敲除。转染过称为：将50微克构建好的质粒加入到100微升含有脂质体的混合溶液（50微升超纯水和50微升脂质体混合）中，在室温放置15分钟。之后加入到1个10厘米培养皿培养的T细胞中，6个小时之后换上新鲜培养液。
质粒转染完成之后，继续培养T细胞并进一步扩增。由于TCR敲除的T细胞已经不会表达TCR，因此，TCR未被敲除的T细胞会表达，所以，采用荧光标记的抗TCRαβ的抗体anti-TCRαβ-PE可以直接将质粒转染后扩增的T细胞分为两群细胞，一群是有荧光的T细胞，一群是没有荧光的T细胞，而没有荧光的T细胞即是目的细胞。因此，可以采用流式细胞术分离TCR敲除的细胞，其过程为：将质粒转染并扩增之后的T细胞收集，并用磷酸盐缓冲液清洗3遍，之后加入1mL冰预冷的磷酸盐缓冲液重悬细胞，再向其中加入20微升anti-TCRαβ-PE抗体，避光孵育30分钟；孵育完成之后，用磷酸盐缓冲液清洗3遍，然后加入1mL磷酸盐缓冲液过流式细胞仪，收集不带荧光的细胞。细胞收集完成之后，继续在体外扩增培养并冻存待用。
之后将针对不同类型肿瘤的携带CAR的慢病毒感染上述分离到的可以异体移植的T细胞，其过程为：在10厘米培养皿中培养TCR失活的T细胞（1×107数量），然后将包装好的装载CAR的慢病毒即PLVX-信号肽序列-scFv-CD8（铰链及跨膜-CD28-endo-4-1BB-endo-CD3ζ慢病毒1mL加入培养皿混合均匀，24小时之后换新鲜培养液即可。
病毒感染完成之后，就将表达CAR的TCR失活的T细胞大规模体外扩增。培养到足够数量之后，对细胞进行收集，最后用磷酸盐缓冲液清洗三遍之后，用于异体移植治疗肿瘤。
实施例4
异体移植TRAC及TCRBC1同时失活的T细胞结合第三代CAR治疗肿瘤
在本实施例中，采用CRISPR/Cas9技术来敲除TCR的α链的恒定区编码基因TRAC以及β链的TCRBC1基因。针对TRAC及TCRBC1的外显子，分别包括它们的外显子1、外显子2、外显子3以及外显子4，利用CRISPR/Cas9技术来敲除TRAC的外显子1及TCRBC1的外显子1。根据TRAC及TCRBC1的外显子序列，尤其是外显子1的序列，设计表达sgRNA（singleguideRNA,sgRNA）的序列包括有：Seq-TRAC-EX1-1、Seq-TRAC-EX1-2、Seq-TRAC-EX1-3、Seq-TRAC-EX1-4、Seq-TRAC-EX1-5，Seq-TCRBC1-EX1-1、Seq-TCRBC1-EX1-2、Seq-TCRBC1-EX1-3、Seq-TCRBC1-EX1-4、Seq-TCRBC1-EX1-5。
进一步地，将上述序列，尤其是Seq-TRAC-EX1-1序列反向相互补，得到Seq-TRAC-EX1-1的反向互补序列（见序列Seq-TRAC-EX1-1-R）。
进一步地，将上述序列，尤其是Seq-TCRBC1-EX1-1序列反向相互补，得到Seq-TCRBC1-EX1-1的反向互补序列（见序列Seq-TCRBC1-EX1-1-R）。
进一步地，还需要在Seq-TRAC-EX1-1和Seq-TRAC-EX1-1-R两端加上双酶切位点BamHI和EcoRI，方便序列合成之后构建进入载体，加了双酶切位点之后的序列分别见序列Seq-TRAC-EX1-1-BamHI和序列Seq-TRAC-EX1-1-R-EcoRI。
进一步地，还需要在Seq-TCRBC1-EX1-1和Seq-TCRBC1-EX1-1-R两端加上双酶切位点BamHI和EcoRI，方便序列合成之后构建进入载体，加了双酶切位点之后的序列分别见序列Seq-TCRBC1-EX1-1-BamHI和序列Seq-TCRBC1-EX1-1-R-EcoRI。
进一步地，将上述序列分别合成，序列合成之后，首先进行退火反应，其过程为：按照合成序列说明书将寡聚核苷酸单链用ddH2O溶解成50μM的溶液；然后将8μl的Seq-TRAC-EX1-1-BamHI或者Seq-TCRBC1-EX1-1-BamHI、8μl的Seq-TRAC-EX1-1-R-EcoRI或者Seq-TCRBC1-EX1-1-R-EcoRI以及2μl的NEBBuffer2和2μl的ddH2O混合均匀，然后把EP管放在95℃水浴5分钟。此后关闭水浴锅，让EP管在水浴锅中自然降温到常温即完成退火，得到能够表达sgRNA的双链寡核苷酸。
然后将上述序列构建到CRISPR/Cas9载体上。构建过称为：采用BamHI和EcoRI对CRISPR/Cas9载体进行双酶切，然后用胶回收试剂盒进行胶回收。将胶回收的CRISPR/Cas9载体与合成并退火的能够表达sgRNA的双链寡核苷酸按照摩尔比例为1:10混合（20微升体系），再加入T4DNA连接酶缓冲溶液，之后在45℃水浴热激5分钟，热激之后放置到4℃冰箱5分钟，最后加入2微升T4DNA连接酶，在16摄氏度连接过夜。
之后将连接得到的质粒做细菌转化，其过程为：将连接的质粒放置在冰上，并且将DH5α细菌（每管50微升）在冰上解冻；之后用微量移液器吸取3-5微升质粒，加入细菌中，混合均匀，然后将混合物继续放置冰上5-10分钟；然后将混合物在42℃水浴热激90秒钟；然后迅速将混合物再放置在冰上冷却2-3分钟；最后加入500微升无菌LB培养基，放置在37℃振荡培养1小时；培养完成之后涂平板，然后放置在37℃培养过夜；第二天挑取克隆测序。
将测序正确的质粒转染从健康人分离培养的T细胞进行TCR基因的敲除。转染过称为：将50微克构建好的质粒加入到100微升含有脂质体的混合溶液（50微升超纯水和50微升脂质体混合）中，在室温放置15分钟。之后加入到1个10厘米培养皿培养的T细胞中，6个小时之后换上新鲜培养液。
质粒转染完成之后，继续培养T细胞并进一步扩增。由于TCR敲除的T细胞已经不会表达TCR，因此，TCR未被敲除的T细胞会表达，所以，采用荧光标记的抗TCRαβ的抗体anti-TCRαβ-PE可以直接将质粒转染后扩增的T细胞分为两群细胞，一群是有荧光的T细胞，一群是没有荧光的T细胞，而没有荧光的T细胞即是目的细胞。因此，可以采用流式细胞术分离TCR敲除的细胞，其过程为：将质粒转染并扩增之后的T细胞收集，并用磷酸盐缓冲液清洗3遍，之后加入1mL冰预冷的磷酸盐缓冲液重悬细胞，再向其中加入20微升anti-TCRαβ-PE抗体，避光孵育30分钟；孵育完成之后，用磷酸盐缓冲液清洗3遍，然后加入1mL磷酸盐缓冲液过流式细胞仪，收集不带荧光的细胞。细胞收集完成之后，继续在体外扩增培养并冻存待用。
之后将针对不同类型肿瘤的携带CAR的慢病毒感染上述分离到的可以异体移植的T细胞，其过程为：在10厘米培养皿中培养TCR失活的T细胞（1×107数量），然后将包装好的装载CAR的慢病毒即PLVX-信号肽序列-scFv-CD8（铰链及跨膜-CD28-endo-4-1BB-endo-CD3ζ慢病毒1mL加入培养皿混合均匀，24小时之后换新鲜培养液即可。
病毒感染完成之后，就将表达CAR的TCR失活的T细胞大规模体外扩增。培养到足够数量之后，对细胞进行收集，最后用磷酸盐缓冲液清洗三遍之后，用于异体移植治疗肿瘤。
实施例5
异体移植TRAC及TCRBC2同时失活的T细胞结合第三代CAR治疗肿瘤
在本实施例中，采用CRISPR/Cas9技术来敲除TCR的α链的恒定区编码基因TRAC以及β链的TCRBC2基因。针对TRAC及TCRBC2的外显子，分别包括它们的外显子1、外显子2、外显子3以及外显子4，利用CRISPR/Cas9技术来敲除TRAC的外显子1及TCRBC2的外显子1。根据TRAC及TCRBC2的外显子序列，尤其是外显子1的序列，设计表达sgRNA（singleguideRNA,sgRNA）的序列包括有：Seq-TRAC-EX1-1、Seq-TRAC-EX1-2、Seq-TRAC-EX1-3、Seq-TRAC-EX1-4、Seq-TRAC-EX1-5，Seq-TCRBC2-EX1-1、Seq-TCRBC2-EX1-2、Seq-TCRBC2-EX1-3、Seq-TCRBC2-EX1-4、Seq-TCRBC2-EX1-5。
进一步地，将上述序列，尤其是Seq-TRAC-EX1-1序列反向相互补，得到Seq-TRAC-EX1-1的反向互补序列（见序列Seq-TRAC-EX1-1-R）。
进一步地，将上述序列，尤其是Seq-TCRBC2-EX1-1序列反向相互补，得到Seq-TCRBC2-EX1-1的反向互补序列（见序列Seq-TCRBC2-EX1-1-R）。
进一步地，还需要在Seq-TRAC-EX1-1和Seq-TRAC-EX1-1-R两端加上双酶切位点BamHI和EcoRI，方便序列合成之后构建进入载体，加了双酶切位点之后的序列分别见序列Seq-TRAC-EX1-1-BamHI和序列Seq-TRAC-EX1-1-R-EcoRI。
进一步地，还需要在Seq-TCRBC2-EX1-1和Seq-TCRBC2-EX1-1-R两端加上双酶切位点BamHI和EcoRI，方便序列合成之后构建进入载体，加了双酶切位点之后的序列分别见序列Seq-TCRBC2-EX1-1-BamHI和序列Seq-TCRBC2-EX1-1-R-EcoRI。
进一步地，将上述序列分别合成，序列合成之后，首先进行退火反应，其过程为：按照合成序列说明书将寡聚核苷酸单链用ddH2O溶解成50μM的溶液；然后将8μ的Seq-TRAC-EX1-1-BamHI或者Seq-TCRBC2-EX1-1-BamHI、8μl的Seq-TRAC-EX1-1-R-EcoRI或者Seq-TCRBC2-EX1-1-R-EcoRI以及2μl的NEBBuffer2和2μl的ddH2O混合均匀，然后把EP管放在95℃水浴5分钟。此后关闭水浴锅，让EP管在水浴锅中自然降温到常温即完成退火，得到能够表达sgRNA的双链寡核苷酸。
然后将上述序列构建到CRISPR/Cas9载体上。构建过称为：采用BamHI和EcoRI对CRISPR/Cas9载体进行双酶切，然后用胶回收试剂盒进行胶回收。将胶回收的CRISPR/Cas9载体与合成并退火的能够表达sgRNA的双链寡核苷酸按照摩尔比例为1:10混合（20微升体系），再加入T4DNA连接酶buffer溶液，之后在45℃水浴热激5分钟，热激之后放置到4℃冰箱5分钟，最后加入2微升T4DNA连接酶，在16摄氏度连接过夜。
之后将连接的质粒做细菌转化，其过程为：将连接的质粒放置在冰上，并且将DH5α细菌（每管50微升）在冰上解冻；之后用微量移液器吸取3-5微升质粒，加入细菌中，混合均匀，然后将混合物继续放置冰上5-10分钟；然后将混合物在42℃水浴热激90秒钟；然后迅速将混合物再放置在冰上冷却2-3分钟；最后加入500微升无菌LB培养基，放置在37℃振荡培养1小时；培养完成之后涂平板，然后放置在37℃培养过夜；第二天挑取克隆测序。
将测序正确的质粒转染从健康人分离培养的T细胞进行TCR基因的敲除。转染过称为：将50微克构建好的质粒加入到100微升含有脂质体的混合溶液（50微升超纯水和50微升脂质体混合）中，在室温放置15分钟。之后加入到1个10厘米培养皿培养的T细胞中，6个小时之后换上新鲜培养液。
质粒转染完成之后，继续培养T细胞并进一步扩增。由于TCR敲除的T细胞已经不会表达TCR，因此，TCR未被敲除的T细胞会表达，所以，采用荧光标记的抗TCRαβ的抗体anti-TCRαβ-PE可以直接将质粒转染后扩增的T细胞分为两群细胞，一群是有荧光的T细胞，一群是没有荧光的T细胞，而没有荧光的T细胞即是目的细胞。因此，可以采用流式细胞术分离TCR敲除的细胞，其过程为：将质粒转染并扩增之后的T细胞收集，并用磷酸盐缓冲液清洗3遍，之后加入1mL冰预冷的磷酸盐缓冲液重悬细胞，再向其中加入20微升anti-TCRαβ-PE抗体，避光孵育30分钟；孵育完成之后，用磷酸盐缓冲液清洗3遍，然后加入1mL磷酸盐缓冲液过流式细胞仪，收集不带荧光的细胞。细胞收集完成之后，继续在体外扩增培养并冻存待用。
之后将针对不同类型肿瘤的携带CAR的慢病毒感染上述分离到的可以异体移植的T细胞，其过程为：在10厘米培养皿中培养TCR失活的T细胞（1X107数量），然后将包装好的装载CAR的慢病毒即PLVX-信号肽序列-scFv-CD8（铰链及跨膜-CD28-endo-4-1BB-endo-CD3ζ慢病毒1ml加入培养皿混合均匀，24小时之后换新鲜培养液即可。
病毒感染完成之后，就将表达CAR的TCR失活的T细胞大规模体外扩增。培养到足够数量之后，对细胞进行收集，最后用磷酸盐缓冲液清洗三遍之后，用于异体移植治疗肿瘤。
实施例6
异体移植TRAC及TCRBC1和TCRBC2同时失活的T细胞结合第三代CAR治疗肿瘤
在本实施例中，采用CRISPR/Cas9技术来敲除TCR的α链的恒定区编码基因TRAC以及β链的TCRBC1和TCRBC2基因。针对TRAC及TCRBC1和TCRBC2的外显子，分别包括它们的外显子1、外显子2、外显子3以及外显子4，利用CRISPR/Cas9技术来敲除TRAC的外显子1及TCRBC1和TCRBC2的外显子1。根据TRAC及TCRBC1和TCRBC2的外显子序列，尤其是外显子1的序列，设计表达sgRNA（singleguideRNA,sgRNA）的序列包括有：Seq-TRAC-EX1-1、Seq-TRAC-EX1-2、Seq-TRAC-EX1-3、Seq-TRAC-EX1-4、Seq-TRAC-EX1-5，Seq-TCRBC1-EX1-1、Seq-TCRBC1-EX1-2、Seq-TCRBC1-EX1-3、Seq-TCRBC1-EX1-4、Seq-TCRBC1-EX1-5，Seq-TCRBC2-EX1-1、Seq-TCRBC2-EX1-2、Seq-TCRBC2-EX1-3、Seq-TCRBC2-EX1-4、Seq-TCRBC2-EX1-5。
进一步地，将上述序列，尤其是Seq-TRAC-EX1-1序列反向相互补，得到Seq-TRAC-EX1-1的反向互补序列（见序列Seq-TRAC-EX1-1-R）。
进一步地，将上述序列，尤其是Seq-TCRBC1-EX1-1序列反向相互补，得到Seq-TCRBC1-EX1-1的反向互补序列（见序列Seq-TCRBC1-EX1-1-R）。
进一步地，将上述序列，尤其是Seq-TCRBC2-EX1-1序列反向相互补，得到Seq-TCRBC2-EX1-1的反向互补序列（见序列Seq-TCRBC2-EX1-1-R）。
进一步地，还需要在Seq-TRAC-EX1-1和Seq-TRAC-EX1-1-R两端加上双酶切位点BamHI和EcoRI，方便序列合成之后构建进入载体，加了双酶切位点之后的序列分别见序列Seq-TRAC-EX1-1-BamHI和序列Seq-TRAC-EX1-1-R-EcoRI。
进一步地，还需要在Seq-TCRBC1-EX1-1和Seq-TCRBC1-EX1-1-R两端加上双酶切位点BamHI和EcoRI，方便序列合成之后构建进入载体，加了双酶切位点之后的序列分别见序列Seq-TCRBC1-EX1-1-BamHI和序列Seq-TCRBC1-EX1-1-R-EcoRI。
进一步地，还需要在Seq-TCRBC2-EX1-1和Seq-TCRBC2-EX1-1-R两端加上双酶切位点BamHI和EcoRI，方便序列合成之后构建进入载体，加了双酶切位点之后的序列分别见序列Seq-TCRBC2-EX1-1-BamHI和序列Seq-TCRBC2-EX1-1-R-EcoRI。
进一步地，将上述序列分别合成，序列合成之后，首先进行退火反应，其过程为：按照合成序列说明书将寡聚核苷酸单链用ddH2O溶解成50μM的溶液；然后将8μl的Seq-TRAC-EX1-1-BamHI或者Seq-TCRBC1-EX1-1-BamHI或者Seq-TCRBC2-EX1-1-BamHI、8μl的Seq-TRAC-EX1-1-R-EcoRI或者Seq-TCRBC1-EX1-1-R-EcoRI或者Seq-TCRBC2-EX1-1-R-EcoRI以及2μl的NEBBuffer2和2μl的ddH2O混合均匀，然后把EP管放在95℃水浴5分钟。此后关闭水浴锅，让EP管在水浴锅中自然降温到常温即完成退火，得到能够表达sgRNA的双链寡核苷酸。
然后将上述序列构建到CRISPR/Cas9载体上。构建过称为：采用BamHI和EcoRI对CRISPR/Cas9载体进行双酶切，然后用胶回收试剂盒进行胶回收。将胶回收的CRISPR/Cas9载体与合成并退火的能够表达sgRNA的双链寡核苷酸按照摩尔比例为1:10混合（20微升体系），再加入T4DNA连接酶缓冲溶液，之后在45℃水浴热激5分钟，热激之后放置到4℃冰箱5分钟，最后加入2微升T4DNA连接酶，在16摄氏度连接过夜。
之后将连接得到的质粒做细菌转化，其过程为：将连接得到的质粒放置在冰上，并且将DH5α细菌（每管50微升）在冰上解冻；之后用微量移液器吸取3-5微升质粒，加入细菌中，混合均匀，然后将混合物继续放置冰上5-10分钟；然后将混合物在42℃水浴热激90秒钟；然后迅速将混合物再放置在冰上冷却2-3分钟；最后加入500微升无菌LB培养基，放置在37℃振荡培养1小时；培养完成之后涂平板，然后放置在37℃培养过夜；第二天挑取克隆测序。
将测序正确的质粒转染从健康人分离培养的T细胞进行TCR基因的敲除。转染过称为：将50微克构建好的质粒加入到100微升含有脂质体的混合溶液（50微升超纯水和50微升脂质体混合）中，在室温放置15分钟。之后加入到1个10厘米培养皿培养的T细胞中，6个小时之后换上新鲜培养液。
质粒转染完成之后，继续培养T细胞并进一步扩增。由于TCR敲除的T细胞已经不会表达TCR，因此，TCR未被敲除的T细胞会表达，所以，采用荧光标记的抗TCRαβ的抗体anti-TCRαβ-PE可以直接将质粒转染后扩增的T细胞分为两群细胞，一群是有荧光的T细胞，一群是没有荧光的T细胞，而没有荧光的T细胞即是目的细胞。因此，可以采用流式细胞术分离TCR敲除的细胞，其过程为：将质粒转染并扩增之后的T细胞收集，并用磷酸盐缓冲液清洗3遍，之后加入1mL冰预冷的磷酸盐缓冲液重悬细胞，再向其中加入20微升anti-TCRαβ-PE抗体，避光孵育30分钟；孵育完成之后，用磷酸盐缓冲液清洗3遍，然后加入1mL磷酸盐缓冲液过流式细胞仪，收集不带荧光的细胞。细胞收集完成之后，继续在体外扩增培养并冻存待用。
之后将针对不同类型肿瘤的携带CAR的慢病毒感染上述分离到的可以异体移植的T细胞，其过程为：在10厘米培养皿中培养TCR失活的T细胞（1×107数量），然后将包装好的装载CAR的慢病毒即PLVX-信号肽序列-scFv-CD8（铰链及跨膜-CD28-endo-4-1BB-endo-CD3ζ慢病毒1mL加入培养皿混合均匀，24小时之后换新鲜培养液即可。
病毒感染完成之后，就将表达CAR的TCR失活的T细胞大规模体外扩增。培养到足够数量之后，对细胞进行收集，最后用磷酸盐缓冲液清洗三遍之后，用于异体移植治疗肿瘤。
综上所述，本发明提供的一种可异体移植的嵌合抗原受体T细胞及其制备方法，本发明利用基因定点敲除技术，尤其是CRISPR/Cas9技术，改造T细胞，针对T细胞的TCR的α及β链的恒定区域进行基因敲除，使T细胞的TCR失活，从而使T细胞能够进行异体移植而不会产生免疫排斥。再将这种失活TCR的T细胞结合CAR技术，能够达到采用异体来源的T细胞靶向治疗特定的肿瘤的目的。本发明解决了目前CART细胞技术只能够通过分离自身的T细胞，然后结合CAR技术来治疗肿瘤的不足，比如自身T细胞数量少、活性低、培养时间长的弊端。本发明能够事先就采用健康人的血液分离高质量、高活性的T细胞进行改造，准备好针对各种肿瘤的CART细胞，肿瘤患者一旦需要CART治疗就无需等待时间，最大限度地缩短治疗等待的宝贵时间。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Seq-CD19-scFv：
GACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACTAAGTTGGAAATAACAGGCTCCACCTCTGGATCCGGCAAGCCCGGATCT
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Seq-CD30-scFv：
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cagcctgaagattttgcaacttattactgcttgcagtatgatgagtttcctctcacattt
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gtctct
Seq-EGFRvIII-scFv：
GACATCCAGATGACCCAGAGCCCTAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGACAGA
GTGACCATCACCTGTCGGGCCAGCCAGGGCATCAGAAACAACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGAGACTGATCTACGCTGCCAGCAATCTGCAGAGCGGCGTGCCCAGCAGATTCACCGGAAGCGGCTCCGGCACCGAGTTCACCCTGATCGTGTCCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGCACCACAGCTACCCTCTGACCAGCGGCGGAGGCACCAAGGTGGAGATCAAGCGGACCGGCAGCACCAGCGGCAGCGGCAAGCCTGGCAGCGGCGAGGGAAGCGAGGTCCAGGTGCTGGAATCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCAGCCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGCCATGTCTTGGGTCCGGCAGGCTCCTGGAAAGGGCCTGGAATGGGTGTCCGCCATCAGCGGCTCTGGCGGCTCCACCAACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCGGCAGCAGCGGGTGGAGCGAGTACTGGGGCCAGGGCACACTGGTCACAGTGTCTAGC
Seq-FAP-scFv：
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCACTCTCTGCATCTACAGGAGACAGA
GTCACCATCACTTGTCGGGCGAGTCAAGATATTAGCAGTTATTTAGCCTGGTATCAACAGGCACCCGGGAAAGCCCCTCATCTCCTGATGTCTGGAGCAACCACTTTACAGACTGGAGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCACGTCCCTGCAGTCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAGTATTATATTTACCCTCCGACGTTCGGCCAAGGGACCAGGGTGGAAATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCGCGGCCGGCTCCACCTCTGGATCCGGCAAGCCCGGATCTGGCGAGGGATCCACCAAGGGCCAGGTACAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAACCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGATCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTGCTAGTGGTGGTTATATAGACTATGCCGATTCCGTGAAGGGCCGGGTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACATGGCATATCTACAAATGAGCAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCCTTTATTACTGTGCGAAAGGAGGCAACTACCAGATGCTATTGGACCACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCAAAGCTT
Seq-Her2-scFv：
GATATCCAGATGACCCAGTCCCCGAGCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATAGG
GTCACCATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGATGTGAATACTGCTGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAACTACTGATTTACTCGGCATCCTTCCTTTATTCTGGAGTCCCTTCTCGCTTCTCTGGATCTAGATCTGGGACGGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGTCAGCAACATTATACTACTCCTCCCACGTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAACGCACTGGCTCCACCTCTGGATCCGGCAAGCCCGGATCTGGCGAGGGATCCACCAAGGGCGAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTCCGTTTGTCCTGTGCAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACACCTATATACACTGGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCAAGGATTTATCCTACGAATGGTTATACTAGATATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTCACTATAAGCGCAGACACATCCAAAAACACAGCCTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGTGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTTCTAGATGGGGAGGGGACGGCTTCTATGCTATGGACGTGTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCG
Seq-GD2-scFv：
CAGGTGAAACTGCAGCAGTCAGGACCTGAACTGGTGNAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATATCCTGCAAGACTTCTGGANACAAATTCACTGAATACACCATGCACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGAGGTATTAATCCTAACAATGGTGGTACTAACTACAAGCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGTAGACAAGTCCTCCAGCACAGCCTACATGGAGCTCCGCAGCCTGACATCTGAGGATTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGAGATACTACGGTCCCGTTTGCTTACTGGGTCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGT
GGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGACATCGAGCTCACTCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGGCAGCTCAAGTATAAGTTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGCCTGTCACCTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACACATCCAAACTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTATTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGTAGATGCTGCCACTTATTACTGCCATCAGCGGAGTAGTTACCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACACAGTTGGAAATAAAACGG
Seq-PSMA-scFv：
gaaattgtgttgacacagtctccagccaccctgtctttgtctccaggggaaaga
gccaccctctcctgcagggccagtcagagtgttagcagctacttagcctggttccaacag
aaacctggccaggctcccaggctcctcatctatgatgcatccaacagggccactggcatc
ccagccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagccta
gagcctgaagattttgcagtttattactgtcagcagcgtagcaactggctcatgtacact
tttggccaggggaccaagctggagatcaaaGGCTCCACCTCTGGATCCGGCAAGCCCGGA
TCTGGCGAGGGATCCACCAAGGGCgaggtgcagttggtgcagtctggagcagaggtgaaa
aagcccggggagtctctgaagatctcctgtaagggttctggatacagttttaccagctac
tggatcggctgggcgcgccagatgcccgggaaaggcctggagtggatggggatcatctat
cctggtgactctgataccagatacagcccgtccttccaaggccaggtcaccatctcagcc
gacaagtccatcagcaccgcctacctgcagtggagcagcctgaaggcctcggacaccgcc
atgtattactgttcggccgctaattcttctcactggtacttcgatctctggggccgtggc
accctggtcactgtctcctca
Seq-Mesothelin-scFv：
caggtacagctgcagcagtcaggtccaggactcgtgacgccctcgcagaccctc
tcactcacctgtgccatctccggggacagtgtctctagcaacagtgctacttggaactgg
atcaggcagtccccatcgagaggccttgagtggctgggaaggacatactacaggtccaag
tggtataacgactatgcagtatctgtgaaaagtcgaatgagcatcaacccagacacatcc
aagaaccagttctccctgcagctgaactctgtgactcccgaggacacggctgtgtattac
tgtgcaagaggaatgatgacttactattacggtatggacgtctggggccaagggaccacg
gtcaccgtctcctcaggaattctaggatccggtggcggtggcagcggcggtggtggttcc
ggaggcggcggttctcagcctgtgctgactcagtcgtcttccctctctgcatctcctgga
gcatcagccagtctcacctgcaccttgcgcagtggcatcaatgttggtccctacaggata
tactggtaccagcagaagccagggagtcctccccagtatctcctgaactacaaatcagac
tcagataagcagcagggctctggagtccccagccgcttctctggatccaaagatgcttcg
gccaatgcaggggttttactcatctctgggctccggtctgaggatgaggctgactattac
tgtatgatttggcacagcagcgctgctgtgttcggaggaggcacccaactgaccgtcctc
tcc
Seq-NCAM-scFv：
cccagtctccagcaatcatgtctgcatctccaggggagaaggtctccAtgacc
tgcagtgccagctcaagtgtaagttacatgtactggttccaaCagaagccaggatcctcc
cccagactcctgatttatgacacatccaacCtggcttctggagtccctgttcgcttcagt
ggcagtgggtctgggaccTcttactctctcacaatcagccgaatggaggctgaagatgct
gccactTattactgccagcagtggagtagttacccgctcacgttcggtgatgggAccaag
ctggagctgaaacgaactgtgGGCTCCACCTCTGGATCCGGCAAGCCCGGATCTGGCGAGGGATCCACCAAGGGCCaggagtctggacctgagctggtaaagcctggggcttcagtgaag
atgTcctgcaaggcttctggatacacattcactagctatgttatggactggGtgaagcag
aagcctgggcagggccttgagtggattggatatattaatCcttacaatgatggtactaag
tacaatgagaagttcaaaggcaaggccAcactgacttcagacaaatcctccagcacagcc
tacatggagctcagcAgcctgacctctgaggactctgcggtctattactgtgcaagatcg
ggtAttacggactttgactactggggccaaggcaccactctcatagtctccTca
Seq-CD8-hinge-trans：
TTCGTGCCGGTCTTCCTGCCAGCGAAGCCCACCACGACGCCAG
CGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAACCACAGGAAC
Seq-CD28-endo：
AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACAT
GACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC
Seq-4-1BB-endo：
CGTTTCTCTGTTGTTAAACGGGGCAGAAAGAAGCTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG
Seq-CD3ζ-endo：
AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCC
CCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA
Seq-TRAC-EX1-1：5’aacaaatgtgtcacaaagta3’；
Seq-TRAC-EX1-2：5’acaaaactgtgctagacatg3’；
Seq-TRAC-EX1-3：5’tgtgctagacatgaggtcta3’；
Seq-TRAC-EX1-4：5’cttcaagagcaacagtgctg3’；
Seq-TRAC-EX1-5：5’agagcaacagtgctgtggcc3’；
Seq-TRAC-EX1-1-R：5’tactttgtgacacatttgtt3’；
Seq-TRAC-EX1-1-BamHI：5’gatccaacaaatgtgtcacaaagtag3’
Seq-TRAC-EX1-1-R-EcoRI：5’aattctactttgtgacacatttgttg3’
Seq-TCRBC1-EX1-1：5’accacgtggagctgagctgg3’；
Seq-TCRBC1-EX1-2：5’ccacacccaaaaggccacac3’；
Seq-TCRBC1-EX1-3：5’cgctgtcaagtccagttcta3’；
Seq-TCRBC1-EX1-4：5’gctgtcaagtccagttctac3’；
Seq-TCRBC1-EX1-5：5’atgacgagtggacccaggat3’
Seq-TCRBC1-EX1-1-R：5’ccagctcagctccacgtggt3’
Seq-TCRBC1-EX1-1-BamHI：5’gatccaccacgtggagctgagctggg3’
Seq-TCRBC1-EX1-1-R-EcoRI：5’aattcccagctcagctccacgtggtg3’
Seq-TCRBC2-EX1-1：5’agctgagctggtgggtgaat3’；
Seq-TCRBC2-EX1-2：5’accacgtggagctgagctgg3’；
Seq-TCRBC2-EX1-3：5’ccacacccaaaaggccacac3’；
Seq-TCRBC2-EX1-4：5’cgctgtcaagtccagttcta3’；
Seq-TCRBC2-EX1-5：5’gctgtcaagtccagttctac3’
Seq-TCRBC2-EX1-1-R：5’attcacccaccagctcagct3’
Seq-TCRBC2-EX1-1-BamHI：5’gatccagctgagctggtgggtgaatg3’
Seq-TCRBC2-EX1-1-R-EcoRI：5’aattcattcacccaccagctcagctg3’
Seq-TRAC-EX1-1：5’aacaaatgtgtcacaaagta3’；
Seq-TRAC-EX1-2：5’acaaaactgtgctagacatg3’；
Seq-TRAC-EX1-3：5’tgtgctagacatgaggtcta3’；
Seq-TRAC-EX1-4：5’cttcaagagcaacagtgctg3’；
Seq-TRAC-EX1-5：5’agagcaacagtgctgtggcc3’；
Seq-TCRBC1-EX1-1：5’accacgtggagctgagctgg3’；
Seq-TCRBC1-EX1-2：5’ccacacccaaaaggccacac3’；
Seq-TCRBC1-EX1-3：5’cgctgtcaagtccagttcta3’；
Seq-TCRBC1-EX1-4：5’gctgtcaagtccagttctac3’；
Seq-TCRBC1-EX1-5：5’atgacgagtggacccaggat3’
Seq-TRAC-EX1-1-R：5’tactttgtgacacatttgtt3’
Seq-TCRBC1-EX1-1-R：5’ccagctcagctccacgtggt3’
Seq-TRAC-EX1-1-BamHI：5’gatccaacaaatgtgtcacaaagtag3’
Seq-TRAC-EX1-1-R-EcoRI：5’aattctactttgtgacacatttgttg3’
Seq-TCRBC1-EX1-1-BamHI：5’gatccaccacgtggagctgagctggg3’
Seq-TCRBC1-EX1-1-R-EcoRI：5’aattcccagctcagctccacgtggtg3’
Seq-TRAC-EX1-1：5’aacaaatgtgtcacaaagta3’；
Seq-TRAC-EX1-2：5’acaaaactgtgctagacatg3’；
Seq-TRAC-EX1-3：5’tgtgctagacatgaggtcta3’；
Seq-TRAC-EX1-4：5’cttcaagagcaacagtgctg3’；
Seq-TRAC-EX1-5：5’agagcaacagtgctgtggcc3’；
Seq-TCRBC2-EX1-1：5’agctgagctggtgggtgaat3’；
Seq-TCRBC2-EX1-2：5’accacgtggagctgagctgg3’；
Seq-TCRBC2-EX1-3：5’ccacacccaaaaggccacac3’；
Seq-TCRBC2-EX1-4：5’cgctgtcaagtccagttcta3’；
Seq-TCRBC2-EX1-5：5’gctgtcaagtccagttctac3’
Seq-TRAC-EX1-1-R：5’tactttgtgacacatttgtt3’
Seq-TCRBC2-EX1-1-R：5’attcacccaccagctcagct3’
Seq-TRAC-EX1-1-BamHI：5’gatccaacaaatgtgtcacaaagtag3’
Seq-TRAC-EX1-1-R-EcoRI：5’aattctactttgtgacacatttgttg3’
Seq-TCRBC2-EX1-1-BamHI：5’gatccagctgagctggtgggtgaatg3’
Seq-TCRBC2-EX1-1-R-EcoRI：5’aattcattcacccaccagctcagctg3’
Seq-TRAC-EX1-1：5’aacaaatgtgtcacaaagta3’；
Seq-TRAC-EX1-2：5’acaaaactgtgctagacatg3’；
Seq-TRAC-EX1-3：5’tgtgctagacatgaggtcta3’；
Seq-TRAC-EX1-4：5’cttcaagagcaacagtgctg3’；
Seq-TRAC-EX1-5：5’agagcaacagtgctgtggcc3’；
Seq-TCRBC1-EX1-1：5’accacgtggagctgagctgg3’；
Seq-TCRBC1-EX1-2：5’ccacacccaaaaggccacac3’；
Seq-TCRBC1-EX1-3：5’cgctgtcaagtccagttcta3’；
Seq-TCRBC1-EX1-4：5’gctgtcaagtccagttctac3’；
Seq-TCRBC1-EX1-5：5’atgacgagtggacccaggat3’；
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Seq-TCRBC2-EX1-5：5’gctgtcaagtccagttctac3’
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Seq-TRAC-EX1-1-BamHI：5’gatccaacaaatgtgtcacaaagtag3’
Seq-TRAC-EX1-1-R-EcoRI：5’aattctactttgtgacacatttgttg3’
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Seq-TCRBC2-EX1-1-BamHI：5’gatccagctgagctggtgggtgaatg3’
Seq-TCRBC2-EX1-1-R-EcoRI：5’aattcattcacccaccagctcagctg3’
Claims (10)
1.一种可异体移植的嵌合抗原受体T细胞，所述嵌合抗原受体T细胞包括T细胞和嵌合抗原受体，其特征在于，所述T细胞为经过基因工程改造的能够进行异体移植的T细胞。
2.根据权利要求1所述的可异体移植的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述T细胞为经过基因定点敲除技术在特定基因改造的T细胞。
3.根据权利要求2所述的可异体移植的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述特定基因为TCR基因，所述TCR包括α链和β链，所述基因改造具体为：在TCR的α和β链中的一种或两种链的恒定区域的相应编码基因的外显子用基因定点敲除技术，使T细胞的TCR不具有活性，进而使T细胞能够进行异体移植。
4.根据权利要求2所述的可异体移植的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述基因定点敲除技术为CRISPR/Cas9。
5.根据权利要求1所述的可异体移植的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体由scFv抗原结合序列、跨膜序列及胞内信号转导序列组成。
6.根据权利要求5所述的可异体移植的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述scFv抗原结合序列包括轻链可变区序列和重链可变区序列。
7.根据权利要求5所述的可异体移植的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述scFv抗原结合序列为CD19、CD30、CD33、CEA、cMet、EGFRvIII、FAP、Her2、GD2、PSMA、Mesothelin和NCAM中的一种。
8.根据权利要求5所述的可异体移植的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述跨膜序列为CD8。
9.根据权利要求5所述的可异体移植的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述胞内信号转导序列包括CD28胞内结构域序列、4-1BB胞内结构域序列和CD3ζ胞内结构域序列。
10.一种如权利要求1-9任一所述的可异体移植的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于，包括步骤：
A、在TCR的α和β链中的一种或两种链的恒定区域的相应编码基因的外显子用基因定点敲除技术，使T细胞的TCR不具有活性，进而得到能够进行异体移植的T细胞；
B、将携带嵌合抗原受体的慢病毒感染上述得到的能够进行异体移植的T细胞，感染完成后得到可异体移植的嵌合抗原受体T细胞。
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |