CN106614260B - 一种C5aR基因敲除小鼠cGVHD模型的建立方法 - Google Patents
一种C5aR基因敲除小鼠cGVHD模型的建立方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106614260B CN106614260B CN201610806650.4A CN201610806650A CN106614260B CN 106614260 B CN106614260 B CN 106614260B CN 201610806650 A CN201610806650 A CN 201610806650A CN 106614260 B CN106614260 B CN 106614260B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- mouse
- cell
- suspension
- cgvhd
- c5ar
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 16
- 101710098483 C5a anaphylatoxin chemotactic receptor 1 Proteins 0.000 title claims abstract description 13
- 102100032957 C5a anaphylatoxin chemotactic receptor 1 Human genes 0.000 title claims abstract description 12
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 title claims abstract description 10
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 claims abstract description 77
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 24
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 claims abstract description 18
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims abstract description 14
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 12
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 33
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 25
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 claims description 20
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 claims description 17
- 230000034994 death Effects 0.000 claims description 16
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 claims description 11
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims description 10
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 10
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 9
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 claims description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 8
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 7
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 7
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 claims description 6
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 claims description 6
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 claims description 5
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 4
- 238000007654 immersion Methods 0.000 claims description 4
- 239000013589 supplement Substances 0.000 claims description 3
- 210000002303 tibia Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 claims description 2
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 2
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 claims 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 abstract description 10
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 9
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 abstract description 5
- 230000024203 complement activation Effects 0.000 abstract description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 abstract 1
- 208000024908 graft versus host disease Diseases 0.000 description 13
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 7
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 7
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 6
- 208000017760 chronic graft versus host disease Diseases 0.000 description 6
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 6
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 5
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 5
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 5
- IAKHMKGGTNLKSZ-INIZCTEOSA-N (S)-colchicine Chemical compound C1([C@@H](NC(C)=O)CC2)=CC(=O)C(OC)=CC=C1C1=C2C=C(OC)C(OC)=C1OC IAKHMKGGTNLKSZ-INIZCTEOSA-N 0.000 description 4
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 4
- 238000010322 bone marrow transplantation Methods 0.000 description 4
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 4
- 210000004969 inflammatory cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 4
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- 208000009329 Graft vs Host Disease Diseases 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 230000035617 depilation Effects 0.000 description 3
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 3
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 3
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- 206010003694 Atrophy Diseases 0.000 description 2
- 206010006448 Bronchiolitis Diseases 0.000 description 2
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 2
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 2
- ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N Erythromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 2
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 230000037444 atrophy Effects 0.000 description 2
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 2
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 2
- 210000003123 bronchiole Anatomy 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 229960001338 colchicine Drugs 0.000 description 2
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 238000011134 hematopoietic stem cell transplantation Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 238000000879 optical micrograph Methods 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 210000002460 smooth muscle Anatomy 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- DTGKSKDOIYIVQL-WEDXCCLWSA-N (+)-borneol Chemical compound C1C[C@@]2(C)[C@@H](O)C[C@@H]1C2(C)C DTGKSKDOIYIVQL-WEDXCCLWSA-N 0.000 description 1
- REPVLJRCJUVQFA-UHFFFAOYSA-N (-)-isopinocampheol Natural products C1C(O)C(C)C2C(C)(C)C1C2 REPVLJRCJUVQFA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000019838 Blood disease Diseases 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- 206010018364 Glomerulonephritis Diseases 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- -1 I II III Chemical compound 0.000 description 1
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 description 1
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 1
- 206010039509 Scab Diseases 0.000 description 1
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 1
- 206010040943 Skin Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 210000002593 Y chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 206010069351 acute lung injury Diseases 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 238000011316 allogeneic transplantation Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 1
- 238000010009 beating Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 229940116229 borneol Drugs 0.000 description 1
- CKDOCTFBFTVPSN-UHFFFAOYSA-N borneol Natural products C1CC2(C)C(C)CC1C2(C)C CKDOCTFBFTVPSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000621 bronchi Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000007596 consolidation process Methods 0.000 description 1
- 238000011217 control strategy Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- DTGKSKDOIYIVQL-UHFFFAOYSA-N dl-isoborneol Natural products C1CC2(C)C(O)CC1C2(C)C DTGKSKDOIYIVQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 229960003276 erythromycin Drugs 0.000 description 1
- 201000003373 familial cold autoinflammatory syndrome 3 Diseases 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 208000014951 hematologic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000007490 hematoxylin and eosin (H&E) staining Methods 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000006749 inflammatory damage Effects 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- XGZVUEUWXADBQD-UHFFFAOYSA-L lithium carbonate Chemical compound [Li+].[Li+].[O-]C([O-])=O XGZVUEUWXADBQD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910052808 lithium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000003032 molecular docking Methods 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 230000003950 pathogenic mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000004080 punching Methods 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- 231100000019 skin ulcer Toxicity 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 210000004003 subcutaneous fat Anatomy 0.000 description 1
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000001993 wax Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/02—Breeding vertebrates
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种C5aR基因敲除小鼠cGVHD模型的建立方法，通过以下步骤实现：(1)以高龄雄性小鼠作为供鼠；(2)以高龄雌性小鼠作为受鼠；(3)受鼠接受全身照射预处理后，将获自供鼠的骨髓细胞BMC悬液及脾细胞SpC悬液注射至受鼠。本发明所建立的C5aR基因敲除小鼠cGVHD模型累及的病量器官多、典型；该模型组织中缺乏C5aR基因，是验证C5a‑C5aR补体途径与cGVHD疾病的相关性的关键性工具；建模型效率高，重复性好，为进行防治人类cGVHD的研究提供新的实验平台。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种小鼠cGVHD模型的建立方法。
背景技术
异基因造血干细胞移植已成为各类血液肿瘤的重要治疗策略，但移植后的主要并发症——慢性移植物抗宿主病成为制约其疗效的主要原因，不仅严重影响患者的生存质量，也是死亡的主要原因，亟需探索慢性移植物抗宿主病的发病机制和防治策略。C5a是补体系统活化产物中的主要强效介质，介导机体重要炎症反应，在增强机体防御功能的同时也可导致严重的免疫炎症损伤。研究已经发现C5a在急性肺损伤、脓毒血症、脑膜炎、类风湿性关节炎和肾小球肾炎等疾病的发生过程中起着重要作用。最新的研究也发现C5a参与急性移植物抗宿主病的病理损伤：全身照射小鼠后，补体表达上调，促进T细胞活化扩增；体内过表达C3aR和C5aR也将促进T细胞活化扩增，加重aGVHD的病理损伤；并且补体衰变加速因子DAF缺失小鼠的aGVHD的病理损伤更为严重。而目前尚未有研究深入探索C5a-C5aR补体途径在cGVHD疾病过程中的致病机理。为明确C5a-C5aR补体途径介导cGVHD疾病的病理机制，并以该途径分子为靶点开展C5a-C5aR补体途径药物研究、细胞靶向治疗等研究，我们在国内外首次建立C5aR基因敲除小鼠cGVHD模型。该模型的建立，不仅是相关基础研究的重要基础，还为开展疾病防治药物研发等研究奠定基础，具有重要的实际意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种C5aR基因敲除小鼠异基因骨髓移植后cGVHD模型的建立方法。
为了实现以上目的，本发明采用了以下技术方案：
一种C5aR基因敲除小鼠异基因骨髓移植后cGVHD模型的建立方法，通过以下步骤实现：
(1)以高龄B10.D2(Hc1 H2d H2-T18c)雄性小鼠作为供鼠；
(2)以高龄C5aR-/-(C.129S4(B6)-C5ar1tm1Cge/J)雌性小鼠作为受鼠；
(3)受鼠接受直线加速器全身照射(TBI)预处理后，将获自供鼠的骨髓细胞(BMC)悬液及脾细胞(SpC)悬液注射至受鼠。
优选地，所述供鼠及受鼠均采用16周龄小鼠。
具体地来说，所述步骤(3)中，供鼠BMC悬液的制备如下：以颈椎脱臼法处死供鼠后，放入75％乙醇中浸泡3～5min，无菌剥离股骨和胫骨，用RPMI 1640培养液冲洗骨髓腔，收集含有骨髓的液制成单细胞悬液，过滤后用红细胞裂解液破除红细胞，RPMI 1640洗涤3-4次，计数并用RPMI 1640重悬细胞，调整至4×10^7/0.15mL细胞浓度备用。
具体地来说，所述步骤(3)中，供鼠SpC悬液的制备如下：以颈椎脱臼法处死供鼠后，放入75％乙醇中浸泡3～5min，无菌取出脾脏，去除脾脏周围系膜组织，移入平皿内用RPMI 1640培养液洗涤若干次，碾磨，收集细胞冲洗液制成单细胞悬液，过滤后用红细胞裂解液破除红细胞，用RPMI1640洗涤3-4次，计数并用RPMI 1640重悬细胞，调整至4×10^6/0.15mL细胞浓度备用。
具体地来说，所述步骤(3)中，移植当日受鼠接受直线加速器30x30照射野，680cGy，698跳，源皮距为100cm，单次全身照射预处理，照射后立即补充饮水，休息4～6小时后经尾静脉注射终体积为0.3mL的由0.15mL BMC悬液和0.15mLSpC悬液组成的注射液。
优选地，所述步骤(3)中，注射给受鼠的BMC悬液的用量为4×10^7BMC，SpC悬液的用量为4×10^6。
以往认为移植细胞包括骨髓细胞和脾细胞，仅给予骨髓细胞，小鼠不会发生cGVHD，当移植脾细胞大于10^7个时，方可造成典型cGVHD的症象。而且以往的建模的成功率，累及的器官范围较窄。本发明通过应用移植主要组织相容性抗原(MHC)相合、次要组织相容性抗原(miHA)不合的异基因高龄B10.D2雄性小鼠的骨髓细胞及脾脏细胞，移植给直线加速器精准辐照后的高龄C5aR-/-(C.129S4(B6)-C5ar1tm1Cge/J)雌性小鼠，并不同于以主的报道，减少脾细胞的移植数量、提高骨髓细胞的移植数量，建立一种C5aR基因敲除小鼠cGVHD模型。其具有如下特点：(1)该模型具有模拟临床上异基因造血干细胞移植后慢性移植物抗宿主病的特点；(2)该模型累及的病量器官多、典型；(3)该模型组织中缺乏C5aR基因，是验证C5a-C5aR补体途径与cGVHD疾病的相关性的关键性工具；(4)建模型效率高，重复性好；(5)移植后小鼠存活时间长，更接近人类cGVHD的病征表现，为在活体动物内进行防治人类cGVHD的研究提供新的实验平台。
附图说明
图1是D组cGVHD实验组小鼠的临床评分图(图例中每个时间点的评分以均数±标准差表示，n＝5)
图2是D组cGVHD实验组小鼠临床表现，A显示尾巴、脚趾结痂；B显示脱毛；C显示弓背及耳内结痂；
图3是D组cGVHD实验组小鼠移植后+60d染色体图；
图4是D组cGVHD实验组小鼠+60d处死后分离的肺、皮肤、肝脏和肠道的病理活检HE染色图。
具体实施方式
本发明结合附图和和实施例作进一步的说明。本实验所用小鼠均购自TheJackson Laboratory，在广州市中山大学实验动物中心进行饲养。
实施例一
本例为本发明的C5aR基因敲除小鼠异基因骨髓移植后慢性移植物抗宿主病模型的建立例，按以下步骤操作：
一、供鼠准备
选用无特定病原体(Specefic pathogen Free,SPF)级B10.D2(Hc1 H2d H2-T18c)雄性，饲养至16周龄，作为供鼠备用。
二、受鼠准备
SPF级C5aR-/-(C.129S4(B6)-C5ar1tm1Cge/J)，雌性，16周龄，作为受鼠。将受鼠随机分为4组，每组5只；其中，
A、正常对照组：同步饲养，无干预；
B、放射对照组：TBI+RPMI 1640，即对组内小鼠进行全身照射(TBI)处理，经尾静脉注射PRMI1640培养液；
C、移植对照组：TBI+4×10^7BMC，即对组内小鼠进行全身照射(TBI)处理，经尾静脉注射经PRMI1640培养液处理的骨髓细胞BMC悬液；
D、cGVHD组：TBI+4×10^7BMC+4×10^6SpC，即对组内小鼠进行全身照射(TBI)处理，经尾静脉注射经PRMI1640培养液处理的骨髓细胞BMC悬液及脾细胞SpC悬液。
三、根据以上分组，采用下述步骤进行移植实验操作
1、异基因骨髓移植前一周对各组受鼠在层流动物房内接受添加抗生素(红霉素250mg/L，庆大霉素32万U/L)的灭菌饮水进行肠道准备，并维持至移植后3周。
2、移植当日(0d)，对B、C、D组受鼠接受移植当日受鼠接受直线加速器30x30照射野，680cGy，698跳，源皮距为100cm，单次全身照射预处理，照射后立即补充饮水，休息4～6小时后经尾静脉注射终体积为0.3mL的移植细胞悬液。
对照组B组小鼠中每只从尾静脉输注RPMI 1640培养液0.3mL；
对照组C组小鼠中每只从尾静脉输注RPMI 1640细胞悬液0.3mL，包括4×10^7BMC；
D组小鼠中每只从尾静脉输注RPMI 1640细胞悬液0.3mL，包括4×10^7BMC和4×10^6SpC。
其中，骨髓细胞(BMC)悬液制备操作如下：采用颈椎脱臼法处死供鼠，立即放入75％乙醇中浸泡3～5min；超净工作台中无菌剥离股骨和胫骨，用RPMI 1640培养液冲洗骨髓腔，收集含有骨髓的冲洗液通过4号针头制成单细胞悬液，过滤，用红细胞裂解液破除红细胞，RPMI 1640洗涤3次，计数并用RPMI 1640重悬细胞，调整至4×10^7/0.15mL细胞浓度备用。
脾细胞(SpC)悬液制备操作如下：无菌取出脾脏，小心去除脾脏周围系膜组织，移入平皿内用RPMI 1640培养液洗涤3遍，然后置于200目不锈钢筛网中用2mL注射器内芯轻轻碾磨，收集细胞冲洗液通过4号针头制成单细胞悬液，过滤，用红细胞裂解液破除红细胞，用RPMI1640洗涤3次，计数并用RPMI 1640重悬细胞，调整至4×10^7/0.15mL细胞浓度备用。
移植后每天观察小鼠一般状态，包括体重、皮疹、脱毛、结痂、弓背、腹泻等，移植14天后每3天进行一次临床评分，标准参见表1；濒死小鼠处死取材，其存活时间记至处死次日；实验终点为移植后+60情况。计数方法：断尾取血10μL，加入190μL白细胞稀释液中混匀，然后滴加到细胞计数板上，水平静置1min后计数4个大方格中细胞数(N)，WBC＝(N÷20)×10^9/L。
移植观察记录表明：A组小鼠正常存活至实验终点；B组小鼠中位存活12.0天，15天内全部死亡；C组小鼠仅输注骨髓细胞，跟既往文献报导一致未出现移植物抗宿主病，并长期存活；D组小鼠出现典型的慢性移植物抗宿主病表现(肺、皮肤、胃肠道、肝脏)，并存活至实验终点。以上记录表明D组均移植成功，且存活时间达到60天以上，比现有的类似疾病动物模型建立的存活时间长。
实施例2
本例为小鼠异基因骨髓植入检测例。
取移植后+60天的受鼠进行检测，按以下步骤进行：
1、秋水仙素处理：在做实验前3～4小时，向小鼠腹腔注射0.1％的秋水仙素(2-4μg/g)。
2、取股骨：实验时，用颈椎脱臼法迅速将小鼠处死，立即用剪刀剪去后肢的皮肤和肌肉，连同关节一起取下两侧股骨，剔净其上肌肉。
3、取骨髓细胞：用注射器吸取6ml生理盐水，将注射器针头插入骨髓腔的一端，用生理盐水冲出骨髓细胞至离心管，反复冲洗直至骨腔变白。将收集到的骨髓细胞溶液平衡后放入离心机，以1000r/min离心10min，吸去上清液。
4、低渗：根据细胞量多少，加入0.075mol/L KCl低渗液5-6ml，用吸管轻轻吹打混匀，在37℃恒温水浴箱内低渗20-30分钟。
5、预固定：低渗完毕，立即加1-2ml新配制的Carnoy固定液，轻轻吹打之后，以2000r/min离心10min，小心吸管吸去上清液。
6、固定：沿离心管壁缓慢加入固定液7ml，用吸管吹打成细胞悬液。2000rpm的速度离心10分钟，倾去上清。
7、再固定：重复步骤6的操作至上清基本无色清晰。
8、制备细胞悬液：沉淀物中加入适量固定液，用吸管轻轻吹打成细胞悬液。
9、滴冰片：从冰箱里取出预冷的载玻片，手持吸管在载玻片上方约10cm处向下滴片，2-3滴，使悬液均匀扩散与玻片之上，多余的液体可小心倾去。
10、干燥、火焰固定：玻片于酒精灯外焰迅速来回几下。
11、玻片老化：置于37℃温箱1-2天后，于65℃烤箱中24h。
12、染色：低浓度胰酶消化，清水洗净，Giemsa染液室温下染色10分钟左右。清水冲洗，在室温下自然干燥。
13、镜检：先用低倍镜找到一好的分裂相区域，然后转用高倍镜观察。
如图3所示，D组(cGVHD组)小鼠的染色体图，箭头所示为Y染色体。图中染色体的改变也进一步表明D组小鼠移植成功。
实施例3
本例为cGVHD组小鼠的临床及病理检测例。
一、对D组小鼠进行慢性GVHD的临床评分，其评分标准如表1所示：
表1慢性GVHD的临床评分标准
注:(a)耳朵、尾巴、脚掌每处脱皮或结痂记0.3分，皮肤临床表现最低得0分，最高得3.9分。(b)皮肤得分超过0.6分视为发生GVHD；即使症状消退、小鼠自然死亡或人为因素造成死亡也视为发生GVHD；小鼠无症状死亡视为无GVHD。
生存情况观察至少+60d。濒死小鼠处死取材，其存活时间记至处死次日。
图1为D组小鼠的临床评分示意图。(图例中每个时间点的评分以均数±标准差表示，n＝5)
图2为D组小鼠的临床表现，A显示尾巴、脚趾结痂；B显示脱毛；C显示弓背及耳内结痂。
二、对+60d的D组小鼠进行慢性GVHD的病理检测，病理评分标准如下表2所示：
表2慢性GVHD的病理评分标准
注：得分超过2视为发生GVHD。
取移植后+60d的D组受鼠处死后进行检测，按以下步骤进行：
1、固定：取各脏器组织切成小块，10％中性福尔马林溶液内固定24小时；
2、以下程序在Shandon全自动密闭脱水机中完成：
2.1把固定好的组织标本分别在80％乙醇50min，90％乙醇50min，95％乙醇ⅠⅡ各40min，100％乙醇ⅠⅡ各40min；
2.2将脱水后标本分别在二甲苯Ⅰ、Ⅱ、III中放置30min；
2.3低熔点石蜡Ⅰ、Ⅱ、III中放置各25min(温度设置为62摄氏度)；
2.4高熔点石蜡Ⅰ缸25min(温度设置为64摄氏度)；
3、组织处理程序结束后，取出标本，置于包埋机的蜡槽中，进行包埋(温度设置为62摄氏度)；
4、切片：在切片机上切下4μm切片，漂在干净的水面上，在50-57摄氏度温水中展开，再将组织切片捞起；在70摄氏度烤箱中烘烤15-20min；
5、从烤箱中取出切片，室温稍冷却，将切片放到染色机上进行全自动HE染色，染色程序如下：二甲苯Ⅰ、Ⅱ、III中放置各7min，100％乙醇ⅠⅡ、95％乙醇ⅠⅡ、80％乙醇、蒸馏水各1min；。苏木精染液中15分钟，水洗，0.5％盐酸酒精10s；2％碳酸锂水溶液1min；流水冲洗10min，80％乙醇、95％乙醇ⅠⅡ，80％乙醇，100％乙醇ⅠⅡIII、二甲苯Ⅰ、Ⅱ各1min；
6、取出切片，将切片挂上Shandon封片机进行封片。
7、光学显微镜下观察HE染色组织切片，病理结果描述：光学显微镜下观察HE染色组织切片发现小鼠肺脏表现为阻塞性细支气管炎，细支气管内大量炎性细胞浸润，阻塞细支气管，管壁平滑肌破坏，肺泡结构破坏，肺组织实变；皮肤溃疡，真皮层胶原沉积，炎症细胞浸润，皮下脂肪严重萎缩；肝脏门管区炎性细胞浸润；胃肠道局部炎性细胞浸润；图4显示C5aR-/-cGVHD小鼠+60d处死后分离的肺、皮肤、肝脏和肠道的病理活检HE染色图。
结果显示：C5aR-/-cGVHD小鼠肺部阻塞性细支气管炎，细支气管内大量炎性细胞浸润，管壁平滑肌破坏，肺泡结构破坏(×100，×200)；皮肤真皮层胶原沉积，炎性细胞浸润，脂肪严重萎缩(×100，×200)；肝脏炎性细胞浸润(×100，×200)；胃肠道局部炎性细胞浸润(×100，×200)。
检测结果表明，C5aR-/-cGVHD实验组小鼠在皮肤、肝脏、肺部和肠道均表现出cGVHD症状，与人类异基因移植后所表现的cGVHD症状非常相似。
Claims (5)
1.一种C5aR基因敲除小鼠cGVHD模型的建立方法，通过以下步骤实现：
(1)以高龄B10.D2(Hc1 H2d H2-T18c)雄性小鼠作为供鼠；
(2)以高龄C5aR-/-(C.129S4(B6)-C5ar1tm1Cge/J)雌性小鼠作为受鼠；
(3)受鼠接受全身照射(TBI)预处理后，将获自供鼠的骨髓细胞BMC悬液及脾细胞SpC悬液注射至受鼠；
所述供鼠及受鼠均采用16周龄小鼠。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，供鼠BMC悬液的制备如下：以颈椎脱臼法处死供鼠后，放入75％乙醇中浸泡3～5min，无菌剥离股骨和胫骨，用RPMI1640培养液冲洗骨髓腔，收集含有骨髓的冲洗液制成单细胞悬液，过滤后用红细胞裂解液破除红细胞，RPMI 1640培养液洗涤3-4次，计数并用RPMI 1640培养液重悬细胞，调整至4×10^7/0.15mL细胞浓度备用。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，供鼠SpC悬液的制备如下：以颈椎脱臼法处死供鼠后，放入75％乙醇中浸泡3～5min，无菌取出脾脏，去除脾脏周围系膜组织，移入平皿内用RPMI 1640培养液洗涤若干次，碾磨，收集细胞冲洗液制成单细胞悬液，过滤后用红细胞裂解液破除红细胞，用RPMI1640培养液洗涤3-4次，计数并用RPMI 1640培养液重悬细胞，调整至4×10^6/0.15mL细胞浓度备用。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，移植当日受鼠接受直线加速器30x30照射野，680cGy，698跳，源皮距为100cm，单次全身照射预处理，照射后立即补充饮水，休息4～6小时后经尾静脉注射终体积为0.3mL的由0.15mL BMC悬液和0.15mLSpC悬液组成的注射液。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，注射给受鼠的BMC悬液的用量为4×10^7个细胞数，SpC悬液的用量为4×10^6个细胞数。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610806650.4A CN106614260B (zh) | 2016-09-06 | 2016-09-06 | 一种C5aR基因敲除小鼠cGVHD模型的建立方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610806650.4A CN106614260B (zh) | 2016-09-06 | 2016-09-06 | 一种C5aR基因敲除小鼠cGVHD模型的建立方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN106614260A CN106614260A (zh) | 2017-05-10 |
| CN106614260B true CN106614260B (zh) | 2019-11-08 |
Family
ID=58851570
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201610806650.4A Active CN106614260B (zh) | 2016-09-06 | 2016-09-06 | 一种C5aR基因敲除小鼠cGVHD模型的建立方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN106614260B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112514853B (zh) * | 2020-12-25 | 2022-03-08 | 广东省人民医院 | 一种多发性骨髓瘤合并慢性移植物抗宿主病小鼠模型的建立方法 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009050484A1 (en) * | 2007-10-19 | 2009-04-23 | Iti Scotland Limited | Knockout mice for a p450 gene cluster |
| CN103114074A (zh) * | 2013-02-21 | 2013-05-22 | 广东省人民医院 | 一种小鼠异基因骨髓移植后cGVHD模型的建立方法 |
| CN104059149A (zh) * | 2006-08-22 | 2014-09-24 | G2炎症私人有限公司 | 具有改进性能的抗-C5aR抗体 |
| EP2950095A1 (en) * | 2014-05-28 | 2015-12-02 | Technische Universität Dresden | Cell-based assay and screening methods for modulators of p75NTR signaling |
| CN105647871A (zh) * | 2016-01-27 | 2016-06-08 | 苏州佰通生物科技有限公司 | 一种可异体移植的嵌合抗原受体t细胞及制备方法 |
-
2016
- 2016-09-06 CN CN201610806650.4A patent/CN106614260B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104059149A (zh) * | 2006-08-22 | 2014-09-24 | G2炎症私人有限公司 | 具有改进性能的抗-C5aR抗体 |
| WO2009050484A1 (en) * | 2007-10-19 | 2009-04-23 | Iti Scotland Limited | Knockout mice for a p450 gene cluster |
| CN103114074A (zh) * | 2013-02-21 | 2013-05-22 | 广东省人民医院 | 一种小鼠异基因骨髓移植后cGVHD模型的建立方法 |
| EP2950095A1 (en) * | 2014-05-28 | 2015-12-02 | Technische Universität Dresden | Cell-based assay and screening methods for modulators of p75NTR signaling |
| CN105647871A (zh) * | 2016-01-27 | 2016-06-08 | 苏州佰通生物科技有限公司 | 一种可异体移植的嵌合抗原受体t细胞及制备方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN106614260A (zh) | 2017-05-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN111394299B (zh) | 一种肝脏类器官的体外构建方法及应用 | |
| JP6636956B2 (ja) | ヒト肝臓スキャフォールド | |
| CN105535022A (zh) | 外泌体在制备治疗急性肝衰竭的药物中的用途和药物组合物 | |
| CN102205147B (zh) | 一种脂肪颗粒组织复合svf和prf的移植材料及其制备方法 | |
| CN104324053B (zh) | 一种快速愈合犬创伤组织的犬干细胞分泌因子修复液 | |
| CN1325271A (zh) | 能快速生长并产生增殖抑制性物质的受限细胞的组合物及其用途 | |
| CN103114074B (zh) | 一种小鼠异基因骨髓移植后cGVHD模型的建立方法 | |
| CN104483178B (zh) | 赤点石斑鱼成鱼染色体的制备方法 | |
| Rubino et al. | A scanning electron microscope study and statistical analysis of adipocyte morphology in lipofilling: comparing the effects of harvesting and purification procedures with 2 different techniques | |
| CN106074604A (zh) | 用于修复机体机能老化和延缓脏器功能衰退的治疗剂 | |
| CN106511385A (zh) | 一种治疗化疗脱发的药物 | |
| CN106614260B (zh) | 一种C5aR基因敲除小鼠cGVHD模型的建立方法 | |
| CN116904394A (zh) | 一种抗炎性间充质干细胞来源外泌体的制备方法及其应用 | |
| CN103740639A (zh) | 构建人源化Ph染色体阳性急性淋巴细胞白血病小鼠模型的方法 | |
| CN108486057B (zh) | 利用多功能胎盘组织处理装置提取胎盘中造血干细胞的方法 | |
| WO2017195225A1 (en) | Method for extracting and separating stem cells derived from adipose tissue for aesthetic treatments | |
| Chow et al. | Decellularizing and recellularizing adult mouse kidneys | |
| CN103992984A (zh) | 基于全血培养法处理鱼类染色体技术所用全血的方法 | |
| Kamel et al. | A quantitative analysis of the effects of different harvesting, preparation, and injection methods on the integrity of fat cells | |
| Pellacchia et al. | Bone regeneration of the maxillofacial region through the use of mesenchymal cells obtained by a filtration process of the adipose tissue | |
| CN112514853B (zh) | 一种多发性骨髓瘤合并慢性移植物抗宿主病小鼠模型的建立方法 | |
| CN114287390B (zh) | 小鼠自身免疫性骨髓纤维化模型的建立方法 | |
| Merrifield et al. | Volume retention, metabolism, and cellular composition of human fat xenografts | |
| CN115046808B (zh) | 一种鳖科动物使用的微创血液抽取方法及染色体制片方法 | |
| CN104257879B (zh) | 五子衍宗方的新用途 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |