KR20200118904A - 키메라 항원 수용체-변형된 nk-92 세포(chimeric antigen receptor-modified nk-92 cells) - Google Patents

키메라 항원 수용체-변형된 nk-92 세포(chimeric antigen receptor-modified nk-92 cells) Download PDF

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Abstract

키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 NK-92 세포가 제공된다. CAR은 FcεRIγ의 세포내 도메인을 포함할 수 있다. 암 또는 바이러스 감염과 같은, NK-92 세포로 치료 가능한 질병을 갖거나 가진 것으로 의심되는 환자를 치료하는 방법이 또한 기재되며, 본 방법은 NK-92-CAR 세포를 환자에게 투여하는 것을 포함한다.

Description

키메라 항원 수용체-변형된 NK-92 세포(CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR-MODIFIED NK-92 CELLS)
본 출원은 둘 모두 2018 년 11 월 06 일에 출원된 출원 번호 62/756,395 및 62/756,402를 갖는, 본 발명자들의 동시 계류 중인 미국 가출원에 대한 우선권을 주장한다.
서열 목록
크기가 134 kb인, 104077.0003PCT5 Sequence Listing_ST25라는 이름의 서열 목록의 ASCII 텍스트 파일의 내용은 2019 년 5 월 20 일에 생성되어 본 출원과 함께 EFS-웹을 통해 전자적으로 제출되었으며 그 전체가 참조로서 포함된다.
발명의 분야
본 발명의 분야는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 유전적으로 변형된 면역 적격 세포, 구체적으로 Fc 엡실론 수용체 감마(FcεRIγ) 신호 전달 도메인을 갖는 CAR을 발현하는 변형된 NK-92 세포이다.
자연 살해(NK) 세포는 선천적 면역계의 중요한 요소를 구성하는 세포 독성 림프구이다. 대부분의 경우 NK 세포는 순환하는 림프구의 약 10% 내지 15%에 상당하며, 바이러스-감염된 세포 및 많은 악성 세포를 포함하는 표적화된 세포에 결합하고 이를 살해한다. NK 세포 살해는 특정 항원에 관해 비-특이적이고 사전 면역 감작없이 발생할 수 있다. 표적화된 세포의 살해는 전형적으로, 퍼포린, 그랜자임, 및 그래뉼리신을 포함하는, 세포 용해 단백질에 의해 매개된다.
자가 NK 세포는 치료적 실체로 사용되어 왔다. 이를 위해 NK 세포는 전혈의 말초 혈액 림프구 분획으로부터 단리되고, 충분한 수의 세포를 수득하기 위해 세포 배양에서 확장되고, 그 후 대상체에게 재-주입된다. 자가 NK 세포는 생체외 요법 및 생체내 치료 둘 모두에서 적어도 일부 경우에 중간 정도의 효과를 나타냈다. 그러나, 자가 NK 세포의 단리 및 성장은 시간 및 비용 집약적이다. 더욱이, 자가 NK 세포 요법은 모든 NK 세포가 세포 용해성이 아니라는 사실에 의해 더욱 제한된다.
이들 어려움 중 적어도 일부는 비-호지킨(Hodgkins) 림프종을 앓는 대상체의 혈액에서 발견된 후 시험관내에서 불멸화된 세포 용해성 암 세포주인 NK-92 세포의 사용으로 극복될 수 있다(Gong et al., Leukemia 8: 652-658(1994)). NK-92 세포는 NK 세포 유도체이지만, NK-92 세포는 반대로 정상 NK 세포에 의해서는 표시되는 저해 수용체의 대다수를 결여하고 있으며, 활성화 수용체의 대다수를 보유한다. 그러나, NK-92 세포는 정상 세포를 공격하지도 않고 인간에게 달갑지 않은 면역 거부 반응을 유도하지도 않는다. 이 바람직한 특성으로 인해, NK-92 세포는 상세하게 특성 확인되고, 예를 들어 WO 1998/049268 또는 US 2002/068044에 기재된 바와 같이 일정 암의 치료에서 치료제로서 탐구되었다.
종양 세포를 동일한 조직으로부터 유래된 정상 세포와 구별되게 하는 표현형 변화는 종종, 정상 세포 표면 성분의 손실 또는 다른 것(즉, 상응하는 정상적 비-암성 조직에서 검출 가능하지 않은 항원)의 획득을 포함하는, 특정 유전자 산물의 발현의 하나 이상의 변화와 관련이 있다. 신생물 또는 종양 세포에서 발현되지만 정상 세포에서는 발현되지 않거나, 실질적으로 정상 세포에서 발견되는 것보다 높은 수준으로 신생물 세포에서 발현되는 항원은 "종양-특이적 항원" 또는 "종양-관련 항원"으로 일컬어져 왔다. 이러한 종양-특이적 항원은 종양 표현형에 대한 마커로서 역할을 할 수 있다. 종양-특이적 항원에는 암/고환-특이적 항원(예를 들어, MAGE, BAGE, GAGE, PRAME 및 NY-ESO-1), 멜라닌 세포 분화 항원(예를 들어, 티로시나제, Melan-A/MART, gpl00, TRP-1 및 TRP-2), 돌연변이되거나 비정상적으로 발현된 항원(예를 들어, MUM-1, CDK4, 베타-카테닌, gp100-in4, p15 및 N-아세틸글루코스-미닐트랜스페라제 V), 및 종양에서 더 높은 수준으로 발현되는 항원(예를 들어, CD19 및 CD20)이 포함된다.
종양-특이적 항원은 암 면역 요법을 위한 표적으로서 사용되어 왔다. 하나의 이러한 요법은, T 세포 및 NK 세포를 포함하는, 면역 세포의 표면에 발현된 키메라 항원 수용체(CAR)를 활용하여 암세포에 대한 세포 독성을 개선한다. CAR은 적어도 하나의 세포내 신호 전달 도메인에 연결된 단일-사슬 가변 단편(scFv)을 포함한다. scFv는 표적 세포(예를 들어, 암세포) 상의 항원을 인식하고 그에 결합하며 이펙터 세포 활성화를 촉발한다. 신호 전달 도메인은 수용체에 의한 세포내 신호 전달에 중요한 면역 수용체 티로신-기반 활성화 도메인(ITAM)을 함유한다.
T-세포에 사용된 1 세대 CAR은 하나의 세포질 신호 전달 도메인을 함유하였다. 예를 들어, T-세포에서의 1-세대 CAR의 하나의 버전은 하나의 ITAM을 함유하는 Fc 엡실론 수용체 감마(FcεRIγ)로부터의 신호 전달 도메인을 포함하는 반면, 다른 버전은 3 개의 ITAM을 함유하는 CD3ζ로부터의 신호 전달 도메인을 함유하였다. 생체내 및 시험관내 연구는 CD3ζ CAR T-세포가 FcεRIγ CAR T-세포보다 종양 소거에 더 효율적임을 보여주었다(예를 들어, Haynes, et al. 2001, J. Immunology 166:182-187; Cartellieri, et al. 2010, J. Biomed and Biotech, Vol. 2010, Article ID 956304). 그 후 추가 연구는 이러한 재조합 T-세포의 완전한 활성화 및 증식을 위해 일정 공동 자극 신호가 필요하다는 것을 밝혀냈고, 2 세대 및 3 세대 CAR은 다수의 신호 전달 도메인을 단일 CAR로 조합하여 재조합 CAR T-세포의 효능을 향상시켰다. 테스트된 T-세포에서 그들의 덜 바람직한 언어학적 효과 때문에, 1 세대 CAR 및 FcεRIγ 신호 전달 도메인은 하나 이상의 추가 신호 전달 도메인과 조합된 CD3ζ를 사용하는 새롭고 더 효율적인 CAR을 위해 대체로 폐기되었다(예를 들어, Hermanson and Kaufman 2015, Frontiers in Immunol., Vol. 6, Article 195).
보다 최근에는, 선택된 CAR이 또한 NK 세포에서 발현되었다. 예를 들어, CAR-변형된 NK-92 세포는 CD3ζ 세포내 신호 전달 도메인만을 갖는 1 세대 CAR을 사용하였다. B 세포 림프종의 경우 CD19 및 CD20, 유방, 난소, 및 편평 세포 암종의 경우 ErbB2, 신경모세포종의 경우 GD2, 및 다발성 골수종의 경우 CD138을 포함하여, 여러 항원이 이들 1 세대 CAR-NK 세포에 의해 표적화되었다. NK-92 계통으로부터의 2 세대 CAR-NK 세포는, 다발성 암종의 경우 EpCAM, 엡스타인-바르(Epstein-Barr) 바이러스의 경우 HLA-A2 EBNA3 복합체, 다발성 골수종의 경우 CS1, 및 HER2 양성 상피암의 경우 ErbB2를 포함하는 여러 항원에 대해 또한 생성되었다. 2 세대 NK-92 CAR에서 CD3ζ와 함께 사용되는 가장 통상적인 세포내 공동 자극 도메인은 CD28이다. 그러나, NK 세포는 CD28을 자연적으로 발현하지 않기 때문에 CD28 도메인의 잠재적인 효과는 불분명하다. 추가의 2 세대 CAR은 NK 세포 지속성을 개선하기 위해 CD3ζ와 함께 4-1BB 세포내 신호 전달 도메인을 포함하였다. 다른 이들은 유방암 세포에 대해 테스트되는 CD3ζ 단독, CD28 및 CD3ζ, 또는 4-1BB 및 CD3ζ와 융합된 ErbB2 scFv를 사용하여 상이한 세포내 도메인의 기능성을 비교하였다. 그들은 2 세대 작제물 둘 모두가 1 세대 CAR에 비해 살해를 개선했으며 CD28 및 CD3ζ는 65% 표적 용해를 가졌고, 4-1BB 및 CD3ζ는 62% 용해했으며, CD3ζ 단독은 표적의 51%를 살해하였다는 것을 발견하였다. 4-1BB 및 CD28 세포내 도메인은 B 세포 악성 종양에 대해 NK-92 세포 상에서 발현된 항-CD19 CAR을 사용하여 최근 연구에서 또한 비교되었다. 또 다른 이들은 세포 살해 및 사이토카인 생산에서 CD3ζ/4-1BB 작제물이 CD3ζ/CD28보다 덜 효과적이라는 것을 발견하였고, 이는 CD28 및 4-1BB 공동 자극 도메인의 차등적 효과를 강조한다.
3 세대 NK-92 CAR은 CD3ζ, CD28, 및 4-1BB 세포내 신호 전달 도메인과 함께 항-CD5 scFv로 구성되었으며 다양한 T-세포 백혈병 및 림프종 세포주 및 원발성 종양 세포에 대해 특이적이고 강력한 항-종양 활성을 입증하였다. 이러한 세포는 또한 T 세포 급성 림프모구성 백혈병(ALL) 세포주뿐만 아니라 원발성 종양 세포의 이종 이식 마우스 모델에서 질병 진행을 저해할 수 있었다(Transl Res. 2017 September; 187: 32-43). 추가의 예에서, WO 2016/201304 및 WO 2018/076391은 NK 세포 및 NK-92 세포에서 발현된 3 세대 CD3ζ CAR의 사용을 교시한다.
그러나, NK-92 세포를 조작하여 Fc 수용체를 발현하는 데 빈번히 실패함으로써 입증되는 바와 같이, NK 세포(그리고 구체적으로 NK-92 세포)를 유전적으로 변형하는 것은 대개 어렵다. 이러한 어려움은 NK-92 세포가 이종 발현을 위해 다수의 재조합 유전자 또는 비교적 큰 재조합 핵산 페이로드로 형질 감염되는 경우 더욱 심각해진다. 추가로, NK-92 세포는 또한 외인성 단백질(예를 들어, CD16)의 재조합 발현과 관련하여 예측 가능성이 상당히 부족하다는 것을 보여준다. 기능적 수준에서, 대부분의 경우 표적화된 세포 독성을 나타내지만, 전부는 아닐지라도 대부분의 CAR NK-92 세포는 높은 이펙터 대 표적 세포 비율을 필요로 한다.
따라서, 많은 재조합 NK-92 세포가 당업계에 알려져 있음에도, 이들 모두 또는 거의 모두는 다양한 어려움을 겪고 있다. 결과적으로, 고-활성 CAR을 상당한 양으로 발현하고, 단순하고 효과적인 방식으로 용이하게 배양될 수 있는 CAR-발현 NK-92 세포에 대한 필요성이 남아 있다.
본 발명자들은 FcεRIγ-함유 CAR을 발현하는 NK-92 세포가, 전형적으로는 다른 작제물에 비해 상대적으로 낮은 이펙터 대 표적 세포 비율에서, 예상외로 우수한 세포 용해 활성 및 FcεRIγ-함유 CAR의 높은 발현 수준을 나타낸다는 것을 발견하였다. 더욱이, 이러한 재조합 세포는 또한 바람직한 수준으로 CD16을 발현하였고, 자극성 사이토카인을 발현하도록 추가로 변형된 경우, 재조합 NK-92 세포는 또한 외인성 IL-2에 대한 필요없이 용이하게 배양되었다.
따라서, 본 발명의 대상(subject matter)의 일 양태에서, 본 발명자들은 단일 폴리펩티드 사슬 내에 (i) 세포외 결합 도메인, (ii) 힌지 도메인, (iii) 막 관통 도메인, 및 (iv) FcεRIγ 신호 전달 도메인을 포함하는 막 결합된 재조합 키메라 항원 수용체(CAR)를 갖는 유전적으로 변형된 NK 세포를 고려한다. 반드시 그런 것은 아니지만, 가장 전형적으로, NK 세포는 NK-92 세포이다.
일부 구현예에서, 세포외 결합 도메인은 종양-특이적 항원(예를 들어, CD19, CD20, GD2, HER-2, CD30, EGFR, FAP, CD33, CD123, PD-L1, IGF1R, CSPG4, 또는 B7-H4), 종양 관련 항원(예를 들어, MUC-2, 브라큐리(brachyury), CEA), 또는 환자- 및 종양-특이적 항원(예를 들어, 환자의 MHC I 및/또는 MHC II에 대한 높은 친화성을 갖는 네오에피토프)에 특이적으로 결합할 수 있는 scFv를 포함한다. 대안적으로, 세포외 결합 도메인은 또한 바이러스-특이적 항원에 특이적으로 결합할 수 있고, 본원에서 고려되는 전형적인 바이러스에는 HIV 바이러스, HPV 바이러스, RSV 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 에볼라바이러스, 또는 HCV 바이러스가 포함된다. 예를 들어, 적합한 바이러스 항원은 HIV 바이러스의 gp120을 포함한다.
추가의 구현예에서, 힌지 도메인 및/또는 막 관통 도메인은 CD8 힌지 도메인 및/또는 CD28 막 관통 도메인을 포함하고/하거나, FcεRIγ 신호 전달 도메인은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 갖는다.
추가로, 유전적으로 변형된 NK 세포는 막 결합된 재조합 CD16(및 특히 CD16의 고-친화성 변이체)을 추가로 가질 수 있고/있거나, 유전적으로 변형된 NK 세포는 내형질 체류 서열을 갖는 재조합 사이토카인을 발현할 수 있는 것으로 고려된다.
따라서, 그리고 상이한 관점에서 볼 때, 본 발명자들은 또한 키메라 항원 수용체(CAR)를 인코딩하는 재조합 핵산을 포함하는 유전적으로 변형된 NK 세포를 고려하며, 여기서 CAR은 단일 폴리펩티드 사슬 내에 (i) 세포외 결합 도메인, (ii) 힌지 도메인, (iii) 막 관통 도메인, 및 (iv) FcεRIγ 신호 전달 도메인을 포함한다. 앞서 언급된 바와 같이, NK 세포가 NK-92 세포인 것이 일반적으로 바람직하다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 RNA이며, 이는 내형질 체류 서열을 갖는 CD16 및/또는 사이토카인을 추가로 인코딩하는 폴리시스트론 RNA일 수 있다. 다양한 도메인과 관련하여, 상기에서 언급된 바와 동일한 고려 사항이 적용된다.
본 발명의 대상의 또 다른 추가의 양태에서, 본 발명자들은 본원에 제시된 유전적으로 변형된 NK 세포의 치료적 유효량을 환자에게 투여함으로써 암을 치료하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 환자에서 암을 치료하는 방법을 또한 고려한다. 용이하게 인식될 바와 같이, 고려되는 방법은 바이러스 암 백신, 박테리아 암 백신, 효모 암 백신, N-803, 항체, 줄기 세포 이식물, 및/또는 종양 표적화된 사이토카인을 포함하는, 적어도 하나의 추가적인 치료적 실체를 투여하는 단계를 추가로 포함할 것이다.
예를 들어, 고려되는 방법에 의해 치료되는 암에는 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수구성 백혈병, 만성 백혈병, 만성 골수구성(과립구성) 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 진성 다혈구증, 림프종, 호지킨 병, 비-호지킨 병, 다발성 골수종, 발덴스트롬(Waldenstrom) 거대글로불린 혈증, 중쇄 질병, 고형 종양이 포함되며, 고형 종양은 육종 및 암종, 예컨대 섬유 육종, 점액 육종, 지방 육종, 연골 육종, 골육종, 척삭종, 혈관 육종, 내피 육종, 림프관 육종, 림프관 내피 육종(lymphangioendotheliosarcoma), 활막종, 중피종, 유윙(Ewing) 종양, 평활근 육종, 횡문근 육종, 결장 암종, 췌장암, 유방암, 난소암, 전립선암, 편평 세포 암종, 기저 세포 암종, 선암종, 한선 암종, 피지선 암종, 유두상 암종, 유두상 선암종, 낭선암종, 수질 암종, 기관지원성 암종, 신 세포 암종, 간종양, 담관 암종, 융모 암종, 고환종, 태생성 암종, 윌름(Wilm) 종양, 자궁경부암, 고환 종양, 폐 암종, 소세포 폐 암종, 방광 암종, 상피 암종, 신경교종, 성상세포종, 수모세포종, 두개인두종, 뇌실막종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경종, 희돌기교종, 수막종, 흑색종, 신경모세포종 및 망막모세포종을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
마찬가지로, 본 발명자들은 본원에 제시된 유전적으로 변형된 NK 세포의 치료적 유효량을 환자에게 투여함으로써(세포외 결합 도메인을 갖는 것은 또한 바이러스-특이적 항원에 특이적으로 결합할 수 있음) 바이러스 감염을 치료하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 환자에서 바이러스 감염을 치료하는 방법을 고려한다. 물론, 고려되는 방법은 항 바이러스 약물을 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
치료 유형에 관계없이, 환자의 신체 표면적 m2 당 약 1 x 108 개 내지 약 1 x 1011 개의 세포가 환자에게 투여되는 것으로 고려된다.
따라서, 본 발명자들은 또한 암 또는 바이러스 감염의 치료에서의 본원에 제시된 유전적으로 변형된 NK 세포의 용도를 고려한다.
본 발명의 대상의 다양한 목적, 특징, 양태 및 장점은 유사한 번호가 유사한 요소에 해당하는 첨부 도면과 함께 바람직한 구현예에 대한 다음의 상세한 설명으로부터 보다 명백해질 것이다.
도 1은 테스트된 예시적 CD19-CAR의 개략적 표현이다. 모든 CD19-CAR 변이체는 항-CD19 scFv 영역(αCD19-scFv)을 포함하는 세포외 도메인, CD8로부터의 힌지 영역(CD8 힌지), 및 CD28로부터의 막 관통 도메인(CD28 TM)을 함유하였다. CD19CAR의 세포내 도메인은 표시된 대로 가변시켰다.
도 2a는 eF660으로 표지된 항-scFv 항체를 사용한 유세포 분석에 의해 결정되는 CD19-CAR mRNA를 사용한 형질 감염 후, 도 1의 CD19-CAR을 발현하는 NK-92 세포의 백분율에 대한 예시적 결과이다.
도 2b는 eF660으로 표지된 항-scFv 항체로 표지된 CD19-CAR-발현 NK-92 세포에 대한 형광 강도 중간값(MFI)에서 배경을 뺀 예시적 결과이다.
도 3a는 5:1 내지 0.3:1의 이펙터:표적 비율에서 CD19CAR을 발현하는 NK-92 세포(이펙터)에 의해 살해된 NK-92 세포-민감성 표적 암 세포(K562)의 백분율에 대한 예시적 결과를 나타낸다.
도 3b는 5:1 내지 0.3:1의 이펙터:표적 비율에서 CD19CAR을 발현하는 NK-92 세포(이펙터)에 의해 살해된 NK-92 세포-저항성, CD19-양성 표적 암 세포(SUP-B15)의 백분율에 대한 예시적 결과를 나타낸다.
도 4는 2:1 내지 0.25:1의 이펙터:표적 비율에서 SUP-B15 표적 세포를 사용한 탈과립 분석에서 항-CD107a 항체로 표지된 CD19-CAR-발현 NK-92 세포(이펙터)의 MFI에 대한 예시적 결과를 나타낸다.
도 5는 실시예에 기재된 IV 라지(Raji) 종양 보유 동물의 예시적 생존 곡선을 나타낸다. 통계 분석은 로그-순위(만텔-콕스(Mantel-Cox)) 테스트였다. ****, P<0.0001.
도 6은 IV 라지 종양 모델에서의 동물 체중 변화에 대한 예시적 결과를 나타낸다. 데이터는 평균 ± SEM이다. SEM은 N의 제곱근으로 나눈 표준 편차로 계산하였다.
도 7은 SC 라지 모델에 대한 예시적 종양 성장 곡선을 나타낸다. 데이터는 평균 ± SEM이다. 이원 ANOVA를 사용하여 통계 분석을 수행한 후 투키(Tukey) 테스트에 의한 다중 비교를 수행하였다; ***, P<0.001; ****, P<0.0001.
도 8은 CD19 t-haNK가 SC 라지 종양-보유 마우스의 간에서 전이성 질병 부담(burden)을 감소시켰음을 나타내는 예시적 데이터를 나타낸다. 패널 a: 13 일차에 표시된 처리군 동물의 전체 간 이미지. 화살표는 전이성 병변을 나타낸다. 간은 촬영 전 적어도 24 시간 동안 10% 포르말린에서 고정시켰다. 패널 b: 표시된 날짜에 간 내 종양 세포 개입 백분율을 정량화(H&E 염색으로 평가). 13 일차: *, P = 0.0257(독립 표본 양측 t 테스트에 의함). 제한된 표본 크기로 인해 11 일차 및 15 일차에 대한 통계 분석을 수행할 수 없었다. 미가공 데이터에 대해서는 표 4 참고.
도 9는 SC 라지 종양 모델에서의 동물 체중 변화에 대한 예시적 결과를 나타낸다. 데이터는 평균 ± SEM이다.
도 10은 실시예에 기재된, mCD19-CAR NK-92 세포 대 비히클 대조군을 이용한 종양내 처리 후 L1210-Luc 종양 세포가 주사된 마우스의 예시적 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 생존 곡선을 나타낸다.
도 11은 실시예에 기재된, L1210-Luc 종양 세포로 재-공격된 완전 반응자 대 나이브 대조군의 종양 크기에 대한 예시적 결과를 나타낸다.
도 12는 실시예에 기재된, mCD19-CAR NK-92 세포 대 비히클 대조군을 이용한 종양내 처리 후 A20 종양 세포가 주사된 마우스의 예시적 카플란-마이어 생존 곡선을 나타낸다.
도 13은 실시예에 기재된, A20 종양 세포로 재-공격된 완전 반응자 대 나이브 대조군의 종양 크기에 대한 예시적 결과를 나타낸다.
도 14는 BT-474 세포에 대한 HER2.CAR-t-haNK 세포의 세포 독성에 대한 예시적 결과를 나타낸다.
도 15는 THP-1 세포에 대한 CD33.CAR-t-haNK 세포의 세포 독성에 대한 예시적 결과를 나타낸다.
도 16은 SUP-B15.PD-L1+ 세포에 대한 PD-L1.CAR-t-haNK 세포의 세포 독성에 대한 예시적 결과를 나타낸다.
도 17은 U251 세포에 대한 PD-L1.CAR-t-haNK 세포의 세포 독성에 대한 예시적 결과를 나타낸다.
도 18은 A-549 세포에 대한 EGFR.CAR-t-haNK 세포의 세포 독성에 대한 예시적 결과를 나타낸다.
도 19는 K562 세포에 대한 CD19.CAR-t-haNK 세포의 세포 독성에 대한 예시적 결과를 나타낸다.
도 20은 SUP-B15 세포에 대한 CD19.CAR-t-haNK 세포의 세포 독성에 대한 예시적 결과를 나타낸다.
도 21은 SKBr3 세포에 대한 CD19.CAR-t-haNK 세포의 ADCC에 대한 예시적 결과를 나타낸다.
도 22는 MDA-MB-231 세포에 대한 IGF1R.CAR-t-haNK 세포의 세포 독성에 대한 예시적 결과를 나타낸다.
도 23은 다양한 암세포에 대한 PD-L1.CAR-t-haNK 세포의 세포 독성에 대한 예시적 결과를 나타낸다.
도 24a 및 도 24b는 MDA-MB-231 세포에 대한 PD-L1.CAR-t-haNK 세포의 세포 독성에 대한 예시적 비교 결과를 나타낸다.
도 25는 CD16 및 CD19.CAR의 예시적 결과 발현을 나타낸다.
도 26은 CD19.CAR-t-haNK 세포의 자연적 세포 독성에 대한 예시적 결과를 나타낸다.
도 27은 CD19.CAR-t-haNK 세포의 CAR 매개 세포 독성에 대한 예시적 결과를 나타낸다.
도 28은 CD19.CAR-t-haNK 세포의 ADCC에 대한 예시적 결과를 나타낸다.
도 29는 CD16 및 CD20.CAR의 발현에 대한 예시적 비교 결과를 나타낸다.
도 30은 CD20.CAR-t-haNK 세포의 자연적 세포 독성에 대한 예시적 결과를 나타낸다.
도 31은 CD16 및 CD33.CAR의 발현에 대한 예시적 결과를 나타낸다.
도 32는 CD33.CAR-t-haNK 세포의 자연적 세포 독성에 대한 예시적 결과를 나타낸다.
도 33은 CD33.CAR-t-haNK 세포의 CAR 매개 세포 독성에 대한 예시적 결과를 나타낸다.
도 34는 CD33.CAR-t-haNK 세포의 ADCC에 대한 예시적 결과를 나타낸다.
도 35는 CD16 및 EGFR.CAR의 발현에 대한 예시적 결과를 나타낸다.
도 36은 EGFR.CAR-t-haNK 세포의 자연적 세포 독성에 대한 예시적 결과를 나타낸다.
도 37은 EGFR.CAR-t-haNK 세포의 CAR 매개 세포 독성에 대한 예시적 결과를 나타낸다.
도 38은 EGFR.CAR-t-haNK 세포의 CAR 매개 세포 독성에 대한 예시적 결과를 나타낸다.
도 39는 EGFR.CAR-t-haNK 세포의 ADCC에 대한 예시적 결과를 나타낸다.
도 40은 CD16 및 HER2.CAR의 발현에 대한 예시적 결과를 나타낸다.
도 41은 HER2.CAR-t-haNK 세포의 자연적 세포 독성에 대한 예시적 결과를 나타낸다.
도 42는 HER2.CAR-t-haNK 세포의 CAR 매개 세포 독성에 대한 예시적 결과를 나타낸다.
도 43은 HER2.CAR-t-haNK 세포의 ADCC에 대한 예시적 결과를 나타낸다.
도 44는 CD16 및 PD-L1.CAR의 예시적 결과 발현을 나타낸다.
도 45는 PD-L1.CAR-t-haNK 세포의 자연적 세포 독성에 대한 예시적 결과를 나타낸다.
도 46은 PD-L1.CAR-t-haNK 세포의 CAR 매개 세포 독성에 대한 예시적 결과를 나타낸다.
도 47은 PD-L1.CAR-t-haNK 세포의 ADCC에 대한 예시적 결과를 나타낸다.
도 48은 CD123.CAR-t-haNK 세포의 CAR 매개 세포 독성에 대한 예시적 결과를 나타낸다.
도 49는 CD123.CAR-t-haNK 세포의 ADCC에 대한 예시적 결과를 나타낸다.
도 50은 CD16 및 CD30.CAR의 발현에 대한 예시적 결과를 나타낸다.
도 51은 CD30.CAR-t-haNK 세포의 자연적 세포 독성에 대한 예시적 결과를 나타낸다.
도 52는 CD30.CAR-t-haNK 세포의 CAR 매개 세포 독성에 대한 예시적 결과를 나타낸다.
도 53은 CD30.CAR-t-haNK 세포의 ADCC에 대한 예시적 결과를 나타낸다.
도 54는 CD16 및 BCMA.CAR 발현에 대한 예시적 결과를 나타낸다.
도 55는 BCMA.CAR-t-haNK 세포의 CAR 매개 세포 독성에 대한 예시적 결과를 나타낸다.
도 56은 BCMA.CAR-t-haNK 세포의 ADCC에 대한 예시적 결과를 나타낸다.
도 57은 CD16 및 gp120.CAR의 발현에 대한 예시적 결과를 나타낸다.
도 58은 gp120.CAR-t-haNK 세포의 GP120 결합에 대한 예시적 결과를 나타낸다.
도 59는 gp120.CAR-t-haNK 세포의 자연적 세포 독성에 대한 예시적 결과를 나타낸다.
도 60은 gp120.CAR-t-haNK 세포의 ADCC에 대한 예시적 결과를 나타낸다.
도 61은 CD16 및 FAP.CAR 발현에 대한 예시적 결과를 나타낸다.
도 62는 FAP.CAR-t-haNK 세포의 CAR 매개 세포 독성에 대한 예시적 결과를 나타낸다.
도 63은 CSPG4.CAR-t-haNK 세포에서 CSPG4 발현에 대한 예시적 결과를 나타낸다.
도 64는 CSPG4.CAR-t-haNK 세포의 CAR 매개 세포 독성에 대한 예시적 결과를 나타낸다.
도 65는 IGF1R-CAR, CD16, 및 IL-2ER을 인코딩하는 예시적 트리시스트론 작제물을 도시한다.
현재까지, 신호 전달 도메인(예를 들어, CD3ζ)이 특히 추가의 신호 전달 도메인과 조합될 때(2 세대 및 3 세대 CAR에서) 더 효율적인 것으로 간주되었기 때문에 FcεRIγ-함유 CAR은 NK-92 세포, 다른 NK 세포주, 또는 내인성 NK 세포에서 사용되지 않았다. 본 발명자들은 이제, 단 하나의 ITAM 도메인을 갖는, FcεRIγ로부터의 세포내 도메인을 포함하는 1-세대 CAR을 발현하는 NK-92 세포가, 3 개의 ITAM 도메인을 갖는, CD3ζ 신호 전달 도메인을 갖는 CAR을 발현하는 NK-92 세포보다, 심지어 이들 ITAM 도메인이 다른 신호 전달 도메인과 조합된 경우에도(즉, 2 세대 또는 3 세대 CAR), CAR에 의해 인식되는 항원을 발현하는 암 세포에 대해 동일하거나 더 높은 세포 독성 활성을 갖는다는 예상외의 놀라운 발견을 하였다. 특히, IgE 수용체(FcεRI)는 그의 본래의 맥락에서 이황화 결합을 통해 서로에게 커플링된 2 개의 감마 사슬을 포함하며 호산구, 호염기구, 및 표피 랑게르한스 세포에서만 정상적으로 발현된다. 본 발명자들은 또한 FcεRIγ로부터의 세포내 도메인을 포함하는 CAR이 다른 CAR, 특히 CD3ζ 신호 전달 도메인을 포함하는 것들보다 NK-92 세포의 표면 상에서 더 높은 수준으로 발현된다는 예상외의 발견을 하였다.
따라서, 본 발명의 대상은 세포 표면 상에 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하도록 조작된 유전적으로 변형된 NK-92 세포 또는 NK 세포주에 관한 것이다. 가장 전형적으로, CAR은 Fc 엡실론 수용체 감마(FcεRIγ)로부터의 세포내 도메인을 포함하지만, 다른 구현예에서 CAR은 또한 T 세포 수용체(TCR) CD3 제타(CD3ζ) 세포내 도메인을 포함할 수도 있다. 용이하게 인식될 바와 같이, CAR은 재조합 DNA 또는 RNA 분자로부터 NK-92 세포에 의해 일시적으로 또는 안정적으로 발현될 수 있다.
결과적으로, 본 발명의 대상의 일 양태에서, NK 세포, NK-92 세포 또는 NK/NK-92 세포주는 FcεRIγ의 세포질 도메인(예를 들어, SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 가짐)을 포함하는 NK-92 세포의 표면 상에 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현한다. 대안적으로, 또는 추가적으로, CAR은 또한 CD3 제타의 세포질 도메인(예를 들어, SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열을 가지며, 이는 SEQ ID NO: 11(코돈 최적화됨) 또는 SEQ ID NO: 12(코돈-최적화되지 않음)의 핵산에 의해 인코딩될 수 있음; 전장 서열은 SEQ ID NO: 47에 나타남)을 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서, 키메라 항원 수용체(CAR)를 인코딩하는 핵산으로 형질 전환된 NK 또는 NK-92 세포주가 고려된다. 예를 들어, 바람직한 핵산은 FcεRIγ의 세포질 도메인(예를 들어, SEQ ID NO: 2를 포함하거나 이로 구성됨)을 인코딩한다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 핵산은 CD3 제타의 세포질 도메인(예를 들어, SEQ ID NO: 11(인간, 코돈 최적화됨) 또는 SEQ ID NO: 12(인간)를 포함하거나 이로 구성됨)을 인코딩한다. 용이하게 인식될 바와 같이, CAR은 하기에 보다 상세히 기재되는 바와 같이 그의 세포외 결합 도메인을 통해 암-관련 또는 바이러스-관련 항원을 표적화할 수 있다.
추가로 고려되는 구현예에서, NK 또는 NK-92 세포는 적어도 하나의 사이토카인 또는 이의 변이체를 발현하도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 사이토카인은 재조합 세포에 의해 일시적으로 또는 안정적으로 발현될 수 있고, 사이토카인은 내형질 체류 신호를 포함할 수 있다. 원하는 경우, NK 또는 NK-92 세포는 또한 자살 유전자(예를 들어, 자살 유전자는 티미딘 키나제임)를 발현하도록 변형될 수 있다. 임의의 이론에 얽매이지 않고, 자살 유전자의 발현은 적합한 자극의 도입시 세포를 선택적으로 살해하는 메커니즘을 제공함으로써 NK-92 세포의 제어되지 않은 증식을 방지할 수 있다고 여겨진다.
본 발명의 대상의 또 다른 양태에서, 본 발명자들은 또한 본원에 기재된 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하도록 조작된 변형된 NK/NK-92 세포 또는 NK/NK-92 세포주의 치료적 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 환자에서 암을 치료하는 방법을 고려한다. 상이한 관점에서 볼 때, 본 발명자들은 대상체에서 종양을 치료하는 데 사용하기 위해, 바람직하게는 FcεRIγ의 세포질 도메인을 포함하는, 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 변형된 NK/NK-92 세포 또는 NK/NK-92 세포주를 또한 고려한다. 일부 구현예에서, 사용은 종양을 치료하기 위해 본원에 기재된 변형된 세포 또는 세포주의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 또한 다른 구현예에서, 종양 세포를 살해하는 시험관내 방법이 고려되고, 본원에 기재된 변형된 NK-92 세포 또는 NK-92 세포주와 종양 세포를 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 변형된 NK-92 세포 또는 NK-92 세포주는 종양 세포 상의 항원에 결합하는 CAR을 발현한다. 일부 구현예에서, CAR은 바람직하게는 Fc 엡실론 수용체 감마(FcεRIγ)로부터의 세포내 도메인을 포함한다. 대안적으로, 또는 추가적으로, CAR은 T 세포 수용체(TCR) CD3 제타(CD3ζ) 세포내 도메인을 포함한다.
또한 다른 구현예에서, 바이러스 감염의 치료를 필요로 하는 환자에서 바이러스 감염을 치료하는 방법이 기재되며, 본 방법은 본원에 기재된 CAR-발현 NK-92 세포의 치료적 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함한다.
이 설명을 읽은 후, 다양한 대안적인 구현예 및 대안적인 적용에서 본 발명을 실시하는 방법이 당업자에게 명백해질 것이다. 그러나, 본 발명의 모든 구현예가 본원에 기재되어 있는 것은 아니다. 본원에 제시된 구현예는 제한이 아니고 단지 예로서 제시된 것임이 이해될 것이다. 이와 같이, 다양한 대안적인 구현예의 이 상세한 설명은 하기에 제시된 본 발명의 범위 또는 폭을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
본 발명이 개시되고 설명되기 전에, 하기에 기재된 양태는 특정 조성물, 이러한 조성물의 제조 방법, 또는 이의 용도에 제한되지 않으며, 이는 물론 달라질 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 본원에서 사용된 용어는 단지 특정 양태를 설명하기 위한 목적을 가질 뿐이며 제한하는 것으로 의도되지 않는다는 점 또한 이해되어야 한다.
독자의 편의를 위해 제목 또는 부제가 본 명세서에서 사용될 수 있으며, 이는 본 발명의 범위에 영향을 주는 것으로 의도되지 않는다. 추가로, 본 명세서에서 사용되는 일부 용어는 하기에 보다 구체적으로 정의된다.
적합한 NK 세포와 관련하여, 모든 NK 세포는 본원에서의 사용에 적합한 것으로 간주되며 따라서 하기에 보다 상세하게 기재된 일차 NK 세포(보존된, 확장된, 및/또는 새로 공급된 세포), 불멸화된 이차 NK 세포, 자가 또는 이종 NK 세포(은행에 저장된, 보존된, 새로 공급된 등), 및 변형된 NK 세포를 포함한다는 것에 주의해야 한다. 일부 구현예에서, NK 세포는 NK-92 세포인 것이 바람직하다. NK-92 세포주는 인터루킨 2(IL-2)의 존재 하에서 증식하는 것으로 밝혀진 독특한 세포주이다(예를 들어, Gong et al., Leukemia 8:652-658(1994) 참고). NK-92 세포는 광범위한 항-종양 세포 독성 및 적합한 배양 배지에서의 확장 후 예측 가능한 수율을 갖는 암성 NK 세포이다. 유리하게는, NK-92 세포는 다양한 암에 대해 높은 세포 용해 활성을 갖는다.
원래의 NK-92 세포주는 CD56선명한(bright), CD2, CD7, CD11a, CD28, CD45, 및 CD54 표면 마커를 발현하고 CD1, CD3, CD4, CD5, CD8, CD10, CD14, CD16, CD19, CD20, CD23, 및 CD34 마커를 표시하지 않았다. 배양에서의 이러한 NK-92 세포의 성장은, 증식을 유지하기에 충분한 1 IU/mL 정도로 낮은 용량의 인터루킨 2(예를 들어, rIL-2)의 존재에 의해 좌우된다. IL-7 및 IL-12는 장기 성장을 지원하지 않으며, IL-1α, IL-6, 종양 괴사 인자 α, 인터페론 α, 및 인터페론 γ를 포함하는 다양한 다른 사이토카인은 테스트하지 않았다. 일차 NK 세포와 비교하여, NK-92는 전형적으로 상대적으로 낮은 이펙터:표적(E:T) 비율, 예를 들어 1:1에서도 높은 세포 독성을 갖는다. 대표적인 NK-92 세포는 미국 표준 균주(American Type Culture Collection, ATCC)에 명칭 CRL-2407로 기탁되어 있다.
따라서, 적합한 NK 세포는 MHC 클래스 I 분자와의 상호 작용을 감소시키거나 폐지하도록 돌연변이된 하나 이상의 변형된 KIR을 가질 수 있다. 물론, 하나 이상의 KIR이 또한 결실되거나 발현이 억제될 수 있다는 것에 주의해야 한다(예를 들어, miRNA, siRNA 등을 통해). 가장 전형적으로, 하나보다 많은 KIR은 돌연변이되거나, 결실되거나, 침묵화될 것이고, 특히 고려되는 KIR은 짧거나 긴 세포질 꼬리를 갖는, 2 개 또는 3 개의 도메인을 갖는 것을 포함한다. 상이한 관점에서 볼 때, 변형되거나, 침묵화되거나, 결실된 KIR에는 KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS4, KIR2DS5, KIR3DL1, KIR3DL2, KIR3DL3, 및 KIR3DS1이 포함될 것이다. 이러한 변형된 세포는 당업계에 잘 알려진 프로토콜을 사용하여 제조될 수 있다. 대안적으로, 이러한 세포는 또한 난퀘스트(NantKwest, URL www.nantkwest.com 참고)로부터 aNK 세포('활성화된 자연 살해 세포)로서 상업적으로 수득할 수 있다. 그 다음 이러한 세포는 하기에서 보다 상세하게 추가로 기재되는 바와 같이 CAR로 추가적으로 유전적으로 변형될 수 있다.
본 발명의 대상의 또 다른 양태에서, 유전적으로 조작된 NK 세포는 또한 고-친화성 Fcγ 수용체(CD16)를 발현하도록 변형된 NK-92 유도체일 수 있다. Fcγ 수용체의 고-친화성 변이체에 대한 서열은 당업계에 잘 알려져 있으며(예를 들어 Blood 2009 113:3716-3725; SEQ ID NO: 43 및 44 참고), 생성 및 발현의 모든 방식이 본원에서의 사용에 적합한 것으로 간주된다. 이러한 수용체의 발현은 환자의 종양 세포(예를 들어, 네오에피토프), 특정 종양 유형(예를 들어, her2neu, PSA, PSMA 등), 또는 암에 관련된 것(예를 들어, CEA-CAM)에 특이적인 항체를 사용하여 종양 세포의 특이적 표적화를 가능하게 하는 것으로 여겨진다. 유리하게는, 이러한 항체는 상업적으로 이용 가능하고 세포와 함께 사용될 수 있다(예를 들어, Fcγ 수용체에 결합). 대안적으로, 이러한 세포는 또한 난퀘스트로부터 haNK 세포로서 상업적으로 수득할 수 있다. 그 다음 이러한 세포는 하기에서 보다 상세하게 추가로 기재되는 바와 같이 CAR로 추가적으로 유전적으로 변형될 수 있다.
따라서, 본원에서의 사용에 적합한 NK 세포에는 NK-92 세포(CAR, CD16 또는 이의 변이체, 및 사이토카인 또는 이의 변이체를 인코딩하는 트리시스트론 작제물로 형질 감염될 수 있음), CD16 또는 이의 변이체 또는 사이토카인 또는 이의 변이체를 발현하는 유전적으로 변형된 NK 세포 또는 NK-92 세포(CAR 및 CD16 또는 이의 변이체 또는 사이토카인 또는 이의 변이체를 인코딩하는 핵산으로 형질 감염될 수 있음), 및 CD16 또는 이의 변이체 및 사이토카인 또는 이의 변이체를 발현하는 유전적으로 변형된 NK 세포 또는 NK-92 세포(CAR을 인코딩하는 핵산으로 형질 감염될 수 있음)가 포함된다.
본원에서 고려되는 NK 세포의 유전적 변형은 많은 방식으로 수행될 수 있고, 모든 알려진 방식이 본원에서의 사용에 적합한 것으로 간주된다. 더욱이, NK 세포는 DNA 또는 RNA로 형질 감염될 수 있으며, 특정 형질 감염의 선택은 원하는 재조합 세포의 유형 및 형질 감염 효율에 의해 적어도 부분적으로 좌우될 것임이 인식되어야 한다. 예를 들어, NK 세포가 안정적으로 형질 감염되는 것을 원하는 경우, 선형화된 DNA가 게놈 내로의 통합을 위해 세포에 도입될 수 있다. 한편, 일시적 형질 감염을 원하는 경우, 원형 DNA 또는 선형 RNA(예를 들어, 폴리A+ 꼬리를 갖는 mRNA)가 사용될 수 있다.
유사하게, 형질 감염 방식은 사용되는 핵산의 유형에 의해 적어도 부분적으로 좌우될 것임이 인식되어야 한다. 따라서, 바이러스 형질 감염, 화학적 형질 감염, 기계적 형질 감염 방법은 모두 본원에서의 사용에 적합한 것으로 간주된다. 예를 들어, 일 구현예에서, 본원에 기재된 벡터는 일시적 발현 벡터이다. 이러한 벡터를 사용하여 도입된 외인성 전이 유전자는 세포의 핵 게놈 내에 통합되지 않으므로; 벡터 복제의 부재 하에서, 외래 전이 유전자는 시간이 지남에 따라 분해되거나 희석될 것이다.
또 다른 구현예에서, 본원에 기재된 벡터는 세포의 안정적인 형질 감염을 가능하게 한다. 일 구현예에서, 벡터는 전이 유전자(들)의 세포 게놈 내로의 편입을 가능하게 한다. 바람직하게는, 이러한 벡터는 양성 선택 마커를 갖고 적합한 양성 선택 마커는 유전자를 발현하지 않는 세포를 살해하는 조건 하에서 세포가 성장하도록 하는 임의의 유전자를 포함한다. 비-제한적인 예에는 항생제 저항성, 예를 들어 제네티신(Tn5로부터의 Neo 유전자)이 포함된다.
대안적으로, 또는 추가적으로, 벡터는 플라스미드 벡터이다. 일 구현예에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 당업자에 의해 이해될 바와 같이, 임의의 적합한 벡터가 사용될 수 있으며, 적합한 벡터는 당업계에 잘 알려져 있다.
또한 다른 구현예에서, 세포는 관심 단백질(예를 들어, CAR)을 인코딩하는 mRNA로 형질 감염된다. mRNA의 형질 감염은 단백질의 일시적인 발현을 초래한다. 일 구현예에서, mRNA의 NK-92 세포로의 형질 감염은 세포 투여 직전에 수행된다. 일 구현예에서, 세포 투여 "직전"은 투여 전 약 15 분 내지 약 48 시간을 지칭한다. 바람직하게는, mRNA 형질 감염은 투여 전 약 5 시간 내지 약 24 시간에 수행된다. 하기에 보다 상세하게 기재된 적어도 일부 구현예에서, mRNA를 이용한 NK 세포 형질 감염은 형질 감염된 세포의 많은 팩션(faction)에서 예상외로 일관되고 강한 CAR의 발현을 초래하였다. 더욱이, 이러한 형질 감염된 세포는 또한 비교적 낮은 이펙터 대 표적 세포 비율에서 높은 특이적 세포 독성을 나타냈다.
고려되는 CAR과 관련하여 NK/NK-92 세포는 세포내 공간에 신호 전달 도메인을 유지하면서 세포 표면 상에 CAR의 일부를 노출시키는 막 결합 단백질로서의 CAR을 발현하도록 유전적으로 변형될 것임에 주의한다. 가장 전형적으로, CAR은 적어도 다음의 요소를 (순서대로) 포함할 것이다: 세포외 결합 도메인, 힌지 도메인, 막 관통 도메인, 및 FcεRIγ 신호 전달 도메인.
바람직한 구현예에서, CAR의 세포질 도메인은 FcεRIγ의 신호 전달 도메인을 포함하거나 이로 구성된다. 예를 들어, FcεRIγ 신호 전달 도메인은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되거나 이로 본질적으로 구성된다. 일부 구현예에서, FcεRIγ 세포질 도메인은 유일한 신호 전달 도메인이다. 그러나, 다른 신호 전달 도메인(예를 들어, CD28 신호 전달 도메인, CD3ζ 신호 전달 도메인, 4-1BB 신호 전달 도메인 등)과 같은 추가 요소 또한 포함될 수 있음이 인식되어야 한다. 이들 추가 신호 전달 도메인은 FcεRIγ 세포질 도메인의 다운스트림 및/또는 FcεRIγ 세포질 도메인의 업스트림에 위치할 수 있다.
일부 구현예에서, FcεRIγ 신호 전달 도메인은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열에 적어도 약 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되거나 이로 본질적으로 구성된다.
상기에서 언급된 바와 같이, 일부 구현예에서, CAR의 세포질 도메인은 CD3 제타(CD3ζ)의 신호 전달 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, CAR의 세포질 도메인은 CD3 제타의 신호 전달 도메인으로 구성된다. 일 구현예에서, CD3 제타 신호 전달 도메인은 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되거나 이로 본질적으로 구성된다. 일부 구현예에서, CD3 제타 신호 전달 도메인은 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열에 적어도 약 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되거나 이로 본질적으로 구성된다.
CAR은 임의의 적합한 막 관통 도메인을 포함할 수 있다. 일 양태에서, CAR은 CD28의 막 관통 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, CD28 막 관통 도메인은 SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되거나 이로 본질적으로 구성된다. 일 구현예에서, CD28 막 관통 도메인은 SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열에 적어도 약 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되거나 이로 본질적으로 구성된다. 일 구현예에서, 막 관통 도메인은 CD28 막 관통 도메인, 4-1BB 막 관통 도메인, 또는 FcεRIγ 막 관통 도메인으로부터 선택된다.
CAR은 임의의 적합한 힌지 영역을 포함할 수 있다. 일 양태에서, CAR은 CD8의 힌지 영역을 포함한다. 일 구현예에서, CD8 힌지 영역은 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되거나 이로 본질적으로 구성된다. 일 구현예에서, CD8 힌지 영역은 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열에 적어도 약 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되거나 이로 본질적으로 구성된다.
반드시 그런 것은 아니지만, 가장 전형적으로, CAR의 세포외 결합 도메인은 관심 항원에 특이적으로 결합하는 scFv, 또는 다른 천연 또는 합성 결합 부분일 것이다. 특히 적합한 결합 부분에는 단일, 이중, 또는 다중 표적 특이성을 갖는 작은 항체 단편, 베타 배럴 도메인 결합제, 페이지(page) 디스플레이 융합 단백질 등이 포함된다. 다른 적합한 세포외 결합 도메인 중에서, 바람직한 도메인은 종양-특이적 항원, 종양 관련 항원, 또는 환자- 및 종양-특이적 항원에 특이적으로 결합할 것이다. 예를 들어, 고려되는 항원에는 CD19, CD20, GD2, HER-2, CD30, EGFR, FAP, CD33, CD123, PD-L1, IGF1R, CSPG4, 또는 B7-H4가 포함된다. 추가의 종양-특이적 항원은 비-제한적인 예로서, US2013/0189268; WO 1999024566 A1; US 7098008; 및 WO 2000020460에 기재되어 있으며, 이들 각각은 그 전체가 본원에 참조로서 포함된다. 마찬가지로, 다른 바람직한 도메인은 HIV 바이러스(예를 들어, gp120), HPV 바이러스, RSV 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 에볼라바이러스, 또는 HCV 바이러스의 항원과 같은 (병원성) 바이러스-특이적 항원에 특이적으로 결합할 것이다.
고려되는 CAR의 구성과 관련하여 CAR은, 예를 들어 WO 2014/039523; US 2014/0242701; US 2014/0274909; US 2013/0280285 및 WO 2014/099671에 기재된 많은 방식으로 조작될 수 있음이 인식되어야 하며, 이들 각각은 그 전체가 본원에 참조로서 포함된다.
따라서, 그리고 상이한 관점에서 볼 때, 고려되는 CAR은 특정 암 유형과 관련된 항원을 표적화한다. 일 구현예에서, 암은 백혈병(급성 백혈병(예를 들어, 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수구성 백혈병(골수모구성, 전골수구성, 골수단핵구성, 단핵구성, 및 적백혈병을 포함)) 및 만성 백혈병(예를 들어, 만성 골수구성(과립구성) 백혈병 및 만성 림프구성 백혈병) 포함), 진성 다혈구증, 림프종(예를 들어, 호지킨 병 및 비-호지킨 병), 다발성 골수종, 발덴스트롬 거대글로불린 혈증, 중쇄 질병, 고형 종양이며, 고형 종양은 육종 및 암종, 예컨대 섬유 육종, 점액 육종, 지방 육종, 연골 육종, 골육종, 척삭종, 혈관 육종, 내피 육종, 림프관 육종, 림프관 내피 육종, 활막종, 중피종, 유윙 종양, 평활근 육종, 횡문근 육종, 결장 암종, 췌장암, 유방암, 난소암, 전립선암, 편평 세포 암종, 기저 세포 암종, 선암종, 한선 암종, 피지선 암종, 유두상 암종, 유두상 선암종, 낭선암종, 수질 암종, 기관지원성 암종, 신 세포 암종, 간종양, 담관 암종, 융모 암종, 고환종, 태생성 암종, 윌름 종양, 자궁경부암, 고환 종양, 폐 암종, 소세포 폐 암종, 방광 암종, 상피 암종, 신경교종, 성상세포종, 수모세포종, 두개인두종, 뇌실막종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경종, 희돌기교종, 수막종, 흑색종, 신경모세포종, 또는 망막모세포종을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
따라서, 고려되는 CAR은 일반적으로 FcεRIγ 신호 전달 도메인에 (직접) 커플링된 막 관통 도메인에 (직접) 커플링된 힌지 도메인에 (직접) 커플링된 세포외 결합 도메인의 구조를 가질 것이다. 또한 추가로 고려되는 양태에서, 고려되는 CAR은 또한 FcεRIγ 신호 전달 도메인 외에, 또는 이를 대체하는 하나 이상의 신호 전달 도메인을 포함할 수 있고, 특히 고려되는 신호 전달 도메인은 CD3ζ 신호 전달 도메인, 4-1BB 신호 전달 도메인, 및 CD28 신호 전달 도메인을 포함한다. 예를 들어, 고려되는 CAR은 따라서 힌지 도메인(예를 들어, SEQ ID NO: 6에서와 같은 CD8 힌지)에 커플링되고 이는 차례로 신호 전달 도메인(예를 들어, SEQ ID NO: 1에서와 같은 FcεRIγ 신호 전달 도메인, SEQ ID NO: ID NO: 8에서와 같은 CD28 신호 전달 도메인, SEQ ID NO: 9에서와 같은 4-1BB 신호 전달 도메인, SEQ ID NO: 10에서와 같은 CD3ζ 신호 전달 도메인)에 커플링된 막 관통 도메인(예를 들어, SEQ ID NO: 7에서와 같은 CD28 TM)에 커플링되는, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 23 내지 SEQ ID NO: 42, 및 SEQ ID NO: 48 내지 SEQ ID NO: 59를 갖는 결합 도메인 중 임의의 하나를 포함할 수 있다.
또한 추가로 고려되는 양태에서, NK 세포는 하나 이상의 사이토카인을 발현하도록 추가로 유전적으로 변형되어 사이토카인 및 CAR이 동일한 재조합 핵산 상에서 인코딩되는 경우 선택 마커를 제공하고/하거나 재조합 세포가 외인성 IL-2로부터 독립하도록 만들 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, NK-92 세포는 적어도 하나의 사이토카인을 발현하도록 변형된다. 구체적으로, 적어도 하나의 사이토카인은 IL-2, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, 또는 이의 변이체이다. 바람직한 구현예에서, 사이토카인은 IL-2 또는 이의 변이체이고 특히 바람직한 변이체는 내형질 체류 신호(예를 들어, SEQ ID NO: 18에서와 같은 인간 IL-2, 또는 SEQ ID NO: 19에서와 같은 ER 체류 신호를 가짐)를 포함한다. 예를 들어, IL-2 유전자는 IL-2를 소포체로 안내하는 신호 서열과 함께 클로닝되고 발현된다. 이는 자가 분비 활성화에 충분한 수준으로, 그러나 IL-2를 세포외로 방출하지 않고, IL-2의 발현을 가능하게 한다(예를 들어, 문헌[Exp Hematol. 2005 Feb; 33(2):159-64]). 대안적으로, 사이토카인(및 특히 IL-15)의 발현은 또한 사이토카인이 재조합 세포에 자가 분비 성장 신호를 제공하기에 충분한 양으로 발현될 뿐만 아니라, 발현된 IL-15의 적어도 일부가 세포로부터 방출되는 것을 가능하게 할 수 있으며, 이는 면역 자극성 신호를 제공할 것이다. 예를 들어, 이러한 발현은 신호 펩티드 및 내형질 체류 서열 둘 모두를 포함하는 인간 IL-15 서열을 사용하여 달성될 수 있다. 내형질 체류된 IL-15에 대한 예시적 DNA 및 단백질 서열은 각각 SEQ ID NO: 72 및 SEQ ID NO: 73에 나타나 있다.
원하는 경우, 고려되는 세포는 또한 자살 유전자를 발현할 수 있다. 용어 "자살 유전자"는 자살 유전자를 발현하는 세포의 음성 선택을 가능하게 하는 전이 유전자를 지칭한다. 자살 유전자는 안전 시스템으로서 사용되어, 유전자를 발현하는 세포가 선택적 제제의 도입에 의해 살해되도록 한다. 이는 재조합 유전자가 제어되지 않는 세포 성장으로 이어지는 돌연변이를 유발하거나, 세포 자체가 이러한 성장을 할 수 있는 경우에 바람직하다. 단순 헤르페스 바이러스 티미딘 키나제(TK) 유전자, 시토신 데아미나제 유전자, 수두 대상 포진 바이러스 티미딘 키나제 유전자, 니트로리덕타제 유전자, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) gpt 유전자, 및 이.콜라이(E. coli) Deo 유전자를 포함하는, 많은 자살 유전자 시스템이 확인되었다. 전형적으로 자살 유전자는, 세포에 악영향을 미치지 않지만 특정 화합물의 존재 하에서 세포를 죽이는 단백질을 인코딩한다. 따라서, 자살 유전자는 전형적으로 시스템의 일부이다.
일 구현예에서, 자살 유전자는 NK-92 세포에서 활성이다. 일 구현예에서, 자살 유전자는 티미딘 키나제(TK) 유전자이다. TK 유전자는 야생형 또는 돌연변이체 TK 유전자(예를 들어, tk30, tk75, sr39tk)일 수 있다. TK 단백질을 발현하는 세포는 간시클로비르를 사용하여 살해될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 자살 유전자는, 5-플루오로시토신의 존재 하에서 세포에 독성인 시토신 데아미나제이다. 문헌[Garcia-Sanchez et al. "Cytosine deaminase adenoviral vector and 5-fluorocytosine selectively reduce breast cancer cells 1 million-fold when they contaminate hematopoietic cells: a potential purging method for autologous transplantation." Blood. 1998 Jul 15;92(2):672-82]. 추가의 구현예에서, 자살 유전자는, 이포스파미드 또는 사이클로포스파미드의 존재 하에서 독성인 시토크롬 P450이다. 예를 들어 문헌[Touati et al. "A suicide gene therapy combining the improvement of cyclophosphamide tumor cytotoxicity and the development of an anti-tumor immune response." Curr Gene Ther. 2014;14(3):236-46] 참고. 또한 또 다른 구현예에서, 자살 유전자는 iCasp9이다. 문헌[Di Stasi, (2011) "Inducible apoptosis as a safety switch for adoptive cell therapy." N Engl J Med 365: 1673-1683]. 또한 문헌[Morgan, "Live and Let Die: A New Suicide Gene Therapy Moves to the Clinic" Molecular Therapy (2012); 20: 11-13] 참고. iCasp9는 소분자, AP1903의 존재 하에서 아폽토시스를 유도한다. AP1903은 생물학적으로 불활성인 소분자로서, 임상 연구에서 매우 내약성이 있는 것으로 나타났으며, 입양 세포 요법의 맥락에서 사용되어 왔다.
물론, 모든 재조합 단백질은 개별의 재조합 서열로부터 발현될 수 있다는 것에 주의해야한다. 그러나, 다수의 재조합 서열이 발현되는 경우(예를 들어, CAR, CD16, 사이토카인), 코딩 영역은 재조합 단백질을 인코딩하는 적어도 2 개 또는 적어도 3 개의 코딩 영역을 갖는 폴리시스트론 단위로 배열될 수 있는 것이 일반적으로 바람직하다. 따라서, 전이 유전자는 당업자에게 알려진 임의의 메커니즘에 의해 발현 벡터 내로 조작될 수 있다. 다수의 전이 유전자가 세포 내로 삽입되어야 하는 경우, 전이 유전자는 동일한 발현 벡터 또는 상이한 발현 벡터 내로 조작될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 발현될 전이 유전자 단백질을 인코딩하는 mRNA로 형질 감염된다. 일부 구현예에서, 세포는 발현될 전이 유전자 단백질을 인코딩하는 DNA로 형질 감염된다. 전이 유전자, mRNA 및 DNA는, 비-제한적인 예로서, 감염, 바이러스 벡터, 전기 천공, 리포펙션, 뉴클레오펙션, 또는 "유전자-총"을 포함하는, 당업계에 알려진 임의의 형질 감염 방법을 사용하여 NK-92 세포 내로 도입될 수 있다.
따라서 바람직한 구현예에서, 유전적으로 변형된 NK 세포(특히 세포가 CAR 및 CD16 또는 이의 변이체를 발현하는 경우)는 세 가지의 별개의 세포 살해 방식을 나타낼 것임에 주의해야 한다: 활성화 수용체에 의해 매개되는 일반적인 세포 독성(예를 들어, NKG2D 수용체), 표적 세포에 결합된 항체에 의해 매개되는 ADCC, 및 CAR 매개 세포 독성. 용이하게 알 수 있을 바와 같이, 고려되는 유전적으로 변형된 세포는 다양한 질병, 특히 질병에 걸린 세포가 질병-특이적 또는 질병-관련 항원을 제시하는 다양한 암 및 바이러스 감염의 치료에 사용될 수 있다. 결과적으로, 본 발명자들은 본원에 기재된 변형된 NK 또는 NK-92 세포를 이용하여 환자를 치료하는 방법을 고려한다. 일 구현예에서, 환자는 암(예를 들어, 종양)을 앓고 있고 변형된 NK-92 세포 또는 세포주는 암 또는 종양 유래 세포의 표면 상에 발현된 항원에 특이적인 CAR을 발현한다. 일 구현예에서, 환자는 바이러스 감염을 앓고 있고, 변형된 NK-92 세포 또는 세포주는 바이러스에 감염된 세포 표면 상에 발현된 항원에 특이적인 CAR을 발현한다. 일 구현예에서, 환자는 박테리아 감염을 앓고 있고, 변형된 NK-92 세포 또는 세포주는 감염을 유발하는 박테리아 세포의 표면 상에 발현된 항원에 특이적인 CAR을 발현한다.
일부 구현예에서, 암은 백혈병(급성 백혈병(예를 들어, 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수구성 백혈병(골수모구성, 전골수구성, 골수단핵구성, 단핵구성, 및 적백혈병을 포함)) 및 만성 백혈병(예를 들어, 만성 골수구성(과립구성) 백혈병 및 만성 림프구성 백혈병) 포함), 진성 다혈구증, 림프종(예를 들어, 호지킨 병 및 비-호지킨 병), 다발성 골수종, 발덴스트롬 거대글로불린 혈증, 중쇄 질병, 고형 종양으로 구성된 군으로부터 선택되며, 고형 종양은 육종 및 암종, 예컨대 섬유 육종, 점액 육종, 지방 육종, 연골 육종, 골육종, 척삭종, 혈관 육종, 내피 육종, 림프관 육종, 림프관 내피 육종, 활막종, 중피종, 유윙 종양, 평활근 육종, 횡문근 육종, 결장 암종, 췌장암, 유방암, 난소암, 전립선암, 편평 세포 암종, 기저 세포 암종, 선암종, 한선 암종, 피지선 암종, 유두상 암종, 유두상 선암종, 낭선암종, 수질 암종, 기관지원성 암종, 신 세포 암종, 간종양, 담관 암종, 융모 암종, 고환종, 태생성 암종, 윌름 종양, 자궁경부암, 고환 종양, 폐 암종, 소세포 폐 암종, 방광 암종, 상피 암종, 신경교종, 성상세포종, 수모세포종, 두개인두종, 뇌실막종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경종, 희돌기교종, 수막종, 흑색종, 신경모세포종, 또는 망막모세포종을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
고려되는 변형된 NK 또는 NK-92 세포는 세포의 절대 수로 개체에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 개체는 약 1000 개의 세포/주사 내지 최대 약 100억 개의 세포/주사, 예를 들어 주사 당 약, 적어도 약, 또는 많아도 약 1 × 108, 1 × 107, 5 × 107, 1 × 106, 5 × 106, 1 × 105, 5 × 105, 1 × 104, 5 × 104, 1 × 103, 5 × 103(등등) 개의 변형된 NK-92 세포, 또는 종점을 포함하여, 숫자들 중 임의의 둘 사이의 임의의 범위로 투여될 수 있다. 다른 구현예에서, 변형된 NK-92 세포는 세포의 상대적 수로 개체에게 투여될 수 있으며, 예를 들어, 상기 개체는 개체의 킬로그램 당 약 1000 개 내지 최대 약 100억 개의 세포, 예를 들어 개체의 킬로그램 당 약, 적어도 약, 또는 많아도 약 1 × 108, 1 × 107, 5 × 107, 1 × 106, 5 × 106, 1 × 105, 5 × 105, 1 × 104, 5 × 104, 1 × 103, 5 × 103(등등) 개의 변형된 NK-92 세포, 또는 종점을 포함하여, 숫자들 중 임의의 둘 사이의 임의의 범위로 투여될 수 있다. 다른 구현예에서, 총 투여량은 m2 당, 약 1 × 1011, 1 × 1010, 1 × 109, 1 × 108, 1 × 107, 또는 종점을 포함하여 숫자들 중 임의의 둘 사이의 임의의 범위를 포함하는, 신체 표면적의 m2에 의해 계산될 수 있다. 평균적 사람은 약 1.6 m2 내지 약 1.8 m2이다. 바람직한 구현예에서, 약 10억 개 내지 약 30억 개 NK-92 세포가 환자에게 투여된다.
변형된 NK-92 세포, 및 선택적으로 다른 항암 또는 항-바이러스제는 암을 갖는 또는 바이러스 감염된 환자에게 1 회 투여될 수 있거나 다회, 예를 들어 요법 동안 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 또는 23 시간마다 1 회, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7 일마다 1 회, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 주 이상마다 1 회, 또는 종점을 포함하여, 숫자들 중 임의의 둘 사이의 임의의 범위로 투여될 수 있다.
일 구현예에서, 변형된 NK-92 세포가 자살 유전자를 발현하는 경우, 환자는 변형된 NK-92 세포 사멸을 촉발하는 제제를 투여받는다. 일 구현예에서, 제제는 NK-92 세포가 표적 세포를 살해하기에 충분한 변형된 NK-92 세포의 투여 후의 어떤 시점에 투여된다.
일 구현예에서, 변형된 NK-92 세포는 환자에게 투여되기 전에 방사선 조사된다. NK-92 세포의 방사선 조사는, 예를 들어 미국 특허 번호 8,034,332에 기재되어 있으며, 이는 그 전체가 본원에 참조로서 포함된다. 일 구현예에서, 자살 유전자를 발현하도록 조작되지 않은 변형된 NK-92 세포는 방사선 조사된다.
더욱이, 고려되는 치료는 또한 다른 면역 치료적 실체의 투여를 포함할 것임이 인식되어야 하고, 특히 바람직한 면역 치료적 실체에는 바이러스 암 백신(예를 들어, 암 특이적 항원을 인코딩하는 아데노바이러스 벡터), 박테리아 암 백신(예를 들어, 하나 이상의 암 특이적 항원을 발현하는 비-발열성 이.콜라이), 효모 암 백신, N-803(ALT-803으로도 알려짐, ALTOR Biosciences), 항체(예를 들어, 종양 관련 항원 또는 환자 특이적 종양 신생 항원에 결합함), 줄기 세포 이식물(예를 들어, 동종 이계 또는 자가), 및 종양 표적화된 사이토카인(예를 들어, 종양 표적화 항체 또는 이의 단편에 커플링된 NHS-IL12, IL-12)이 포함된다.
실시예
다음의 실시예는 단지 설명을 목적으로 하고 있으며 청구된 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 목적으로 하는 발명을 성공적으로 수행하는 것을 유사하게 가능하게 할 다양한 대안적 기술 및 절차가 당업자에게 이용 가능하다.
실시예 1: CAR mRNA 제조
도 1에 개략적으로 도시된 CD19CAR의 각 변이체를 인코딩하는 DNA 서열을 인실리코에서 설계하고, 처음부터(de novo) 합성하고, mRNA 발현 벡터인 pXT7(GeneArt, Life Technologies) 내에 서브클로닝 하였다. 10 마이크로그램(μg)의 플라스미드를 SalI 제한 효소(New England Biolabs)로 분해하여 선형화하고 제조사의 지시에 따라 키아젠(QIAgen) 겔 정제 키트(QIAgen)를 사용하여 정제하였다.
선형화된 DNA는 제조사의 지시에 따라 T7 엠메세지 엠머쉰 울트라(mMessage mMachine Ultra) 전사 키트(ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)를 사용하여 mRNA의 시험관내 합성을 위한 주형으로 사용하였다. 이 키트는 mRNA의 폴리A 꼬리의 길이를 증가시켜 생체내 안정성을 향상시키는 폴리아데닐화 연장 단계를 포함한다.
6 개의 CD19-CAR 변이체에 대한 mRNA를 제조하였고, 녹색 형광 단백질(GFP) mRNA를 음성 대조군으로 제조하였다. 모든 CD19-CAR 폴리펩티드 변이체는 항-CD19 scFv 영역(αCD19-scFv)(SEQ ID NO: 4)을 포함하는 세포외 도메인, CD8로부터의 힌지 영역(SEQ ID NO: 6), 및 CD28로부터의 막 관통 도메인(SEQ ID NO: 7)을 함유하였다. CD19CAR의 세포내 도메인은 다음과 같고 도 1에 개략적으로 나타나 있다: CAR 3z는 CD3ζ 신호 전달 도메인을 함유하고; CAR FcRe는 FcεRIγ 신호 전달 도메인(SEQ ID NO: 1)을 함유하고; CAR 28_3z는 CD3ζ 신호 전달 도메인에 융합된 CD28 신호 전달 도메인을 함유하고; CAR BB_3z는 CD3ζ 신호 전달 도메인에 융합된 4-1BB 신호 전달 도메인을 함유하고; CAR 28_BB_3z는 CD3ζ 신호 전달 도메인에 융합된 4-1BB 신호 전달 도메인에 융합된 CD28 신호 전달 도메인을 함유하고; CAR BB_3z_28은 CD28 신호 전달 도메인에 융합된 CD3ζ 신호 전달 도메인에 융합된 4-1BB 신호 전달 도메인을 함유하였다.
보다 구체적으로, 도 1의 CD3ζ 신호 전달 도메인을 갖는 1 세대 CAR은 SEQ ID NO: 13(인간) 및 SEQ ID NO: 21(뮤린)의 핵산 서열을 가졌고, 이는 SEQ ID NO: 22의 아미노산 서열로 번역되었다. FcεRIγ 신호 전달 도메인 핵을 갖는 1 세대 CAR은 SEQ ID NO: 5의 핵산 서열 및 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 가졌다. CD28/CD3ζ 신호 전달 도메인을 갖는 2 세대 CAR은 SEQ ID NO: 14의 핵산 서열을 갖고 4-1BB/CD3ζ 신호 전달 도메인을 갖는 2 세대 CAR은 SEQ ID NO: 15의 핵산 서열을 가졌다. CD28/4-1BB/CD3ζ 신호 전달 도메인을 갖는 3 세대 CAR은 SEQ ID NO: 16의 핵산 서열을 갖고 4-1BB/CD3ζ/CD28 신호 전달 도메인을 갖는 3 세대 CAR은 SEQ ID NO: 17의 핵산 서열을 가졌다.
FcεRIγ 신호 전달 도메인을 갖는 추가의 1 세대 CAR은 하기에 보다 상세히 기재된 바와 같이 제조하였으며, 여기서 힌지 영역은 CD8 힌지(SEQ ID NO: 6 또는 SEQ ID NO: 45(인간), SEQ ID NO: 46에 의해 인코딩됨)였고, 여기서 막 관통 도메인은 CD28 막 관통 도메인(SEQ ID NO: 7)이었고, 여기서 신호 전달 도메인은 FcεRIγ 신호 전달 도메인(SEQ ID NO: 1, 핵산 SEQ ID NO: 2에 의해 인코딩됨)이었다.
그 후 다음과 같이 선택된 scFv 부분을 사용하여 다양한 종양-관련 표적에 대해 표적 특이성을 부여하였다(모두 도 1, CAR FcRe에 나타난 순차적 배열로): CD19(SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 24의 항-CD19 scFv 사용, 코돈-최적화된 SEQ ID NO: 23에 의해 인코딩됨), CD20(SEQ ID NO: 26의 항-CD20 scFv 사용, 코돈-최적화된 SEQ ID NO: 25에 의해 인코딩됨), CD33(SEQ ID NO: 28의 항-CD33 scFv 사용, 코돈-최적화된 SEQ ID NO: 27에 의해 인코딩됨), CSPG4(SEQ ID NO: 30의 항-CSPG4 scFv 사용, 코돈-최적화된 SEQ ID NO: 29에 의해 인코딩됨), EGFR(SEQ ID NO: 32의 항-EGFR scFv 사용, 코돈-최적화된 SEQ ID NO: 31에 의해 인코딩됨), IGF1R(SEQ ID NO: 34의 항-IGF1R scFv 사용, 코돈-최적화된 SEQ ID NO: 33에 의해 인코딩됨), CD30(SEQ ID NO: 36의 항-CD30 scFv 사용, 코돈-최적화된 SEQ ID NO: 35에 의해 인코딩됨), HER2/neu(SEQ ID NO: 38의 항-HER2/neu scFv 사용, 코돈-최적화된 SEQ ID NO: 37에 의해 인코딩됨), GD2(항-GD2 scFv 또는 SEQ ID NO: 40 또는 SEQ ID NO: 42 사용, 코돈-최적화된 SEQ ID NO: 39 또는 SEQ ID NO: 41에 의해 인코딩됨), CD123(SEQ ID NO: 49의 항-CD123 scFv 사용, 코돈-최적화된 SEQ ID NO: 48에 의해 인코딩됨), PD-L1(SEQ ID NO: 51의 항-PD-L1 scFv 사용, 코돈-최적화된 SEQ ID NO: 50에 의해 인코딩됨), B7-H4(SEQ ID NO: 53의 항-B7-H4 scFv 사용, 코돈-최적화된 SEQ ID NO: 52 에 의해 인코딩됨), 및 FAP(SEQ ID NO: 58 또는 SEQ ID NO: 59의 항-FAP scFv 사용, 코돈-최적화된 SEQ ID NO: 56 또는 SEQ ID NO: 57에 의해 인코딩됨).
유사하게, 다음과 같이 선택된 scFv 부분을 사용하여 다양한 바이러스-관련 표적에 대해 표적 특이성을 부여하였다(모두 도 1, CAR FcRe에 나타난 순차적 배열로): HIV gp120(SEQ ID NO: 55의 항-gp120 scFv 사용, 코돈-최적화된 SEQ ID NO: 54에 의해 인코딩됨).
상기 제조된 모든 작제물은 NK-92 세포에서 잘 발현되며 이렇게 변형된 NK-92 세포의 생리적 활성에 대한 예시적 결과가 나타나 있다.
실시예 2: CD19CAR mRNA를 갖는 NK-92 세포의 전기 천공
NK-92 세포는 5% 인간 AB 혈청(Valley Biomedical, Winchester, VA) 및 500 IU/mL IL-2(Prospec, Rehovot, Israel)로 보충된 엑스-비보10(X-Vivo10) 배지(Lonza, Basel, Switzerland)에서 성장시켰다. 네온(Neon)TM 전기 천공 장치(Life Technologies, Carlsbad, CA)를 사용하여, NK-92 세포에 대한 제조사의 파라미터(1250 V, 10 ms, 3 펄스)를 따르고 100 μl 부피에서 106 개의 세포 당 5 μg의 mRNA를 사용하여, 세포를 mRNA로 전기 천공하였다. 전기 천공된 세포를 20 시간(h) 동안 배지에서(상기와 동일) 유지하였다.
NK-92 세포 표면 상의 CD19CAR 발현은 eF660(eBioscience, San Diego, CA)으로 표지된 항-scFv 항체를 사용하여 유세포 분석에 의해 결정하였다. 도 2a는 NK-92 세포 집단에서의 표시된 CD19CAR의 발현%를 나타낸다. 도 2b는 표시된 CD19CAR로 전기 천공된 세포의 형광 강도 중간값(MFI에서 배경을 뺌)을 나타낸다. 도 2a 및 도 2b로부터 이해될 수 있는 바와 같이, 세포 표면에 CD19CAR을 발현하는 세포의 백분율은 예상외로 CAR FcRe에서 가장 높았을 뿐만 아니라(75.2%), MFI(재조합 세포 상에 발현된 CAR의 양)가 가장 높았으며, 그 다음은 28_3z(61.7%)였다.
실시예 3: 암 세포주에 대한 CD19CAR 발현 NK-92 세포의 세포 독성
시험관내 암 세포를 표적화하는 CAR-발현 NK-92 세포의 효능을 유동-기반 시험관내 세포 독성 분석을 사용하여 전기 천공 20 시간 후에 테스트하였다. 이펙터 세포(CD19CAR 또는 GFP를 발현하는 NK-92)를 상이한 이펙터 대 표적 비율(5:1 내지 0.3:1)로 PKHGL67-표지된(Sigma Aldrich, St. Louis, MO) 표적 세포(K562; 또는 SUPB15, B-ALL, CD19+)와 96-웰 플레이트 내에서 혼합시키고 37℃에서 4 h 동안 인큐베이션하였다. 프로피듐 요오다이드(PI)(Sigma Aldrich, St. Louis, MO)를 세포에 첨가하고 아툰(Attune) 유세포 분석기(Life Technologies, Carlsbad, CA)를 사용하여 2 h 이내에 샘플을 분석하였다. 세포 독성은 PKH-양성 표적 집단 내 PI-양성 세포의 %에 의해 결정하였다.
예시적 결과가 도 3a 및 도 3b에 제공된다. NK-92 세포는 도 3a에서 볼 수 있는 바와 같이 CD19CAR 발현에 관계없이 K562 세포를 살해하는 데 효과적이다. 따라서, 재조합 세포는 세포 독성을 잃지 않을 것임에 주의해야 한다. 대조적으로, GFP-발현 NK-92 세포는 암 세포주 SUP-B15를 살해하는 데 비효율적이었다. SUP-B15는, CD19-양성이고 NK-92-매개 세포 독성에 저항성이 있는 급성 림프모구성 백혈병 세포주이다. 도 3b로부터 용이하게 이해될 수 있는 바와 같이, 테스트된 임의의 CD19CAR 발현은 대조군(GFP-발현 NK-92 세포)에 비해 SUP-B15 세포주에 대해 증가된 세포 독성 활성을 제공하였다. 놀랍게도, CAR FcRe는 2 세대 및 3 세대 CAR과 유사하거나 이보다 우수한 세포 독성을 나타냈다. FcεRIγ 신호 전달 도메인이 단일 단위로서만 존재하고 다른 신호 전달 도메인과 조합되지 않았기 때문에 이러한 발견은 특히 예상치 못한 것이다. 이러한 배열은, CAR T-세포에 사용될 때 바람직한 표적화된 세포 독성을 제공하지 못하였다. 유리하게는, 트리시스트론 mRNA 작제물은 우수한 기능적 활성을 갖는 상당한 양의 원하는 CAR을 생산할 수 있었다. 이러한 작제물은 CAR 발현이 일시적이어야 하는 경우 특히 유익하다.
탈과립은 NK-92 세포 중의 분비 과립으로부터의 용해 단백질(예를 들어, 퍼포린 및 그랜자임)의 방출을 위해 필요한 결정적인 단계이다. 탈과립은 NK-92에 의한 표적 세포의 인식에 의해 개시된다. 작제물에서 탈과립을 테스트하기 위해 이펙터 세포(NK-92)를 상이한 이펙터 대 표적 비율(5:1 내지 0.3:1)로 96-웰 플레이트에서 표지되지 않은 표적 세포(SUP-B15)와 혼합시키고, 항-CD107a(FITC-접합된, BD Pharmingen, San Jose, CA)를 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 CO2 인큐베이터 내 37℃에서 인큐베이션하고 1 h 후 모넨신(Golgi-stop)을 웰에 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 또 다른 3 h 동안 인큐베이션하고 샘플을 유세포 분석(Attune, Life technologies, Carlsbad, CA)에 의해 분석하였다. 탈과립 백분율은 이펙터 + 표적 샘플에서의 CD107a 양성 %에 대해 NK-92 세포 단독에서의 CD107a 양성 %를 제함으로써 결정하였으며, 예시적 결과는 도 4에 제공된다.
실시예 4: CD19 t-haNK 세포는 라지 종양 이종 이식 모델에서 동물 생존을 유의미하게 개선하였다.
Fc 엡실론 세포내 신호 전달 도메인을 포함하는 CD19 t-haNK 세포(클론 19.6). CD19 t-haNK 세포는 5% 열 불활성화된 인간 AB 혈청으로 보충된 엑스-비보TM 10 배지에서 배양하였다.
테스트 동물: 동물 종류/종: NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ(NSG) 마우스; 연령: 연구 개시 시 9 주 내지 10 주(검역 후); 성별: 암컷; 체중: 연구 개시 시 20 그램 내지 27 그램. 동물 수: IV 종양 모델의 경우 20 마리; SC 종양 모델의 경우 12 마리. 공급자: 더 잭슨 래보라토리(The Jackson Laboratory)(610 Main Street Bar Harbor, ME 04609 US).
라지 종양 모델: 라지 암 세포주: 라지 세포는 원래 ATCC(카탈로그# CCL-86TM; 로트# 61723871)로부터 구입한 후 확장시켜 투여용으로 제조하였다.
세포 배양 배지: 페니실린(100 U/mL), 스트렙토마이신(100 μg/mL)이 포함된 10% 소 태아 혈청으로 보충된 ATCC-배합 RPMI-1640 배지.
세포 수확: 지수 단계의 라지 세포(계대 12)를 원심 분리에 의해 수집하였다. 세포를 세척하고 IV 접종을 위해 5 × 105 개의 생존 세포/mL의 농도로 무 혈청 배지에, SC 이식을 위해 2.5 × 106 개의 생존 세포/mL의 농도로 배지/마트리겔(1:1 v/v)에 재-현탁하였다. 동물 주사 전에 세포를 얼음에 보관하였다. 생체내 연구에 사용된 세포는 96%의 생존능력을 가졌다.
라지 세포 접종: 라지 IV 모델. 20 마리의 동물에게 27 게이지 바늘을 사용하여 0.2 mL의 라지 세포 현탁액을 측면 꼬리 정맥을 통해 IV 주사하였다(1 × 105 세포 접종량). 라지 SC 모델. 12 마리의 동물에게 25-게이지 바늘을 사용하여 0.1 mL의 라지 세포 현탁액을 양측 옆구리 상에 SC 이식하였다(2.5 × 105 세포 접종량).
기타 시약: RPMI-1640 배지, 엑스-비보TM 10 배지; 열-불활성화된 인간 남성 AB 혈청(Access Cell Culture(Access Biologicals LLC); 소 태아 혈청(FBS); 펜 스트렙(Pen Strep) 글루타민(100X)(Life Technologies, 카탈로그# 10378, 로트# 1881463, 만료일: 2018 년 5 월); 마트리겔 기저 막 매트릭스; 플루로닉(Pluronic)(R) F-68, 10% 용액.
실험 절차
IV 라지 모델 - 무작위 배정: 1 일차로 정의된 암세포 접종 후 24 시간 내에, 20 마리의 동물을 체중에 따라 10 마리씩 2 개 그룹으로 의사(pseudo)-무작위 배정하여 그룹 간 유사한 평균 체중을 달성하였다.
테스트 물품 투여: 2 일차, 5 일차, 8 일차, 10 일차, 12 일차, 및 17 일차에, 지수 단계에서 성장한 CD19 t-haNK 세포를 원심 분리에 의해 수확하고 200 μL의 주사 부피로 마우스 당 1 × 107 개의 세포 투여량으로 IV 투여하기 위해 엑스-비보TM 10에 5 × 107 개의 세포/mL의 농도로 제형화하였다. 그룹 A의 동물은 비히클 대조군을 제공받은 반면, 그룹 C의 동물은 CD19 t-haNK 세포를 제공받았다.
체중: 종양 세포 주사 전 및 매주 2 회 동물을 칭량하였다.
임상 관찰: 사망/이환(G0 내지 G4) 및 독성의 임상 징후에 대해 동물을 매일 관찰하였다. 마비되거나 빈사 상태의 동물은 안락사시켰다.
안락사: CO2 흡입 후 자궁 경부 탈구에 의해 동물을 안락사시켰다. 사망 사건(안락사 또는 자연사)은 사망 기록(부록 6)에 기록하고 생존 곡선을 계산하기 위해 집계하였다.
SC 라지 모델 - 종양 부피 측정: SC 종양 이식 후, 종양 확립을 위해 동물을 적어도 주 2 회 검사하였다. 종양을 감지할 수 있게 되었을 때, 디지털 휴대용 캘리퍼로 주 1 회 내지 2 회 종양 부피(TV)를 측정하고 이 공식을 사용하여 계산하였다: TV = 길이 × 폭 2/2 [길이는 종양의 가장 큰 직경이고 폭은 가장 짧은 직경임].
무작위 배정: 평균 종양 부피가 주사 가능한 크기(이 경우 195 mm3; 이식-후 24 일)에 도달하면, 12 마리의 종양-보유 동물을 6 마리씩 2 개 그룹으로 의사-무작위 배정하여 그룹 간 유사한 종양 부피를 달성하였다. 이것을 0 일차로 정의하였다.
테스트 물품 투여: 1 일차, 4 일차, 7 일차, 9 일차, 11 일차, 및 13 일차에, 지수 단계에서 성장한 CD19 t-haNK 세포를 원심 분리에 의해 수확하고, 1000 cGy 감마 조사를 거치게 하고, 200 μL의 주사 부피로 마우스 당 1 × 107 개의 세포 투여량으로 IV 투여하기 위해 엑스-비보TM 10 배지에 5 × 107 개의 세포/mL의 농도로 제형화하였다. 표 1에 나타나 있는 바와 같이, 그룹 D의 동물은 비히클 용액을 제공받은 반면, 그룹 F의 동물은 CD19 t-haNK 세포를 제공받았다.
체중. 종양 세포 주사 전 및 그 후 매주 2 회 동물을 칭량하였다.
임상 관찰. 사망/이환(G0 내지 G4) 및 독성의 임상 징후(T1 내지 T12)에 대해 동물을 매일 관찰하였다. 마비되거나 빈사 상태의 동물은 안락사시켰다.
종점 및 안락사. 빈사 상태의 동물은 그들이 이환을 나타내자마자 안락사시켰지만, 생존한 동물은 조직 수집을 위해 예정된 안락사를 거쳤다. 구체적으로, 생존한 동물의 절반(최대 3 마리의 마우스/그룹)을 13 일차에 테스트 물품 투여의 마지막 투약 후 6 시간째에 안락사시켰다. 나머지 동물은 15 일차에 마지막 투약 후 48 시간째에 안락사시켰다.
검시 및 종양 및 조직 수집. 종결시, 검시를 수행하고 가시적인 비대한 병변을 갖는 기관을 수집하여, 10% 포르말린에 고정시키고, 종양/전이성 질병 부담의 조직학적 평가를 위해 수탁 병리학 실험실(contract pathology laboratory)(Seventh Wave Laboratories)에 제출하였다.
Figure pct00001
IR, 방사선 조사됨(1000 cGy); 비-IR, 방사선 조사되지 않음; IV, 정맥내; SC, 피하; Tx, 처리.
데이터 분석
종양 부피 계산: 종양 부피 = 길이 × 폭 2/2(길이 및 폭은 각각 종양의 가장 긴 직경 및 가장 짧은 직경임); 종양 성장 저해(TGI) 계산: TGI = (TC-Tt)/ΔTC × 100%, 여기서 TC 및 Tt는 각각 연구 종료시 대조군 및 처리군에 대한 평균 종양 부피이고, ΔTC는 대조군에서의 평균 종양 부피의 변화이다.
통계 분석 - 종양 성장 곡선: 종양 성장 곡선은 이원 ANOVA 후 투키 테스트에 의한 다중 비교에 의해 분석하였다. 생존 곡선: 생존 곡선은 로그-순위(만텔-콕스) 테스트에 의해 분석하였다.
간 전이 추정: 개별 날짜에 대한 간 전이성 질병 부담의 차이는 독립 표본 양측 t 테스트에 의해 분석하였다. 통계적 유의성: P<0.05는 통계적으로 유의한 것으로 고려된다. 모든 통계 분석은 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 버전 7을 사용하여 수행하였다.
결과
IV 라지 모델: IV 종양 모델에서 주요 판독 정보는 동물 생존이었다. 동물이 죽은 것으로 밝혀지거나 질병-관련 이환 및/또는 마비로 인해 안락사된 경우 사망 사건을 계수하였다. 도 5에 나타난 바와 같이, 비히클 대조군과 비교하여, CD19 t-haNK 세포 처리는 동물의 생존율을 유의미하게 개선시킬 수 있었고, 비히클 대조군에서의 21.5 일에 비해 27 일의 생존 중간값을 초래하였다(P<0.0001).
동물 체중 변화 또한 연구 내내 모니터링 하였다. 도 6에 나타난 바와 같이, CD19 t-haNK 처리된 동물은 처리가 처음 개시되었을 때 중등도(10% 미만) 및 단기의 체중 감소를 보였으며, 이는 IV NK 주입을 제공받은 동물에서 드문 현상이 아니고, CD19 t-haNK 세포에 특이적이지 않다(참조 연구: LABC-TX01701). 그들의 체중은 처리 첫 주 후에 회복될 수 있었고 그 후 질병 진행으로 인해 다시 감소하였다.
SC 라지 모델: SC 종양 모델에서 일차 판독 정보는 종양 성장이었다. 도 7에 나타난 바와 같이, CD19 t haNK 세포는 비히클 대조군과 비교하여 7 일차 및 그 후에 명백하고 통계적으로 유의미한 종양 성장 저해를 보였으며, 연구 종료시(13 일차) 49% TGI를 보였다.
또한, 라지는 공격적인 림프종 모델이기 때문에, SC 접종한 경우에도, 암세포는 결국에 동물의 이환 및/또는 사망으로 이어지는 다수의 전이 부위를 퍼뜨리고 발달시킬 수 있었다. 비히클 그룹에서 총 3 마리의 동물(50%)이 11 일차와 13 일차 사이에 빈사 상태였고, 그에 따라 안락사시켰다. 대조적으로, CD19 t-haNK 세포 그룹에서는 예정되지 않은 사망 사건이 없었다(표 3).
추가로, 검시 동안 CD19 t-haNK 처리된 동물에서 간 전이의 질적 감소를 관찰하였다(도 8a). 질병 부담의 반-정량적 추정은 대표적으로 샘플링된 H&E 염색된 간 절편에 대해 수탁 병리학 실험실(Seventh Wave Laboratories)에서 수행하였다. 도 8b 및 표 4에 요약된 바와 같이, 연구가 진전됨에 따라 질병 부담이 증가하는 분명한 추세가 있었다. CD19 t-haNK 처리된 동물의 간은 비히클 대조군과 비교하여 현저히 더 낮은 암 침윤 면적의 백분율을 나타냈다. 대조군의 작은 샘플 수 및 예정되지 않은 조기 사망으로 인해, 통계 분석은 13 일차 데이터에 대해서만 수행할 수 있었다. 이 분석은, CD19 t-haNK 처리된 동물에서의 평균 10% 침윤 대 대조군에서의 30%로, 질병 부담의 유의미한 차이를 나타냈다.
연구 내내 체중 변화를 모니터링했으며, IV 라지 모델과 유사하게, CD19 t-haNK 처리된 동물은 도 9로부터 이해할 수 있는 바와 같이 치료 요법의 시작에서 중등도(10% 미만) 및 일시적인 체중 감소를 보였다.
Figure pct00002
예정된: 조직 수집을 위한 예정된 안락사.
Figure pct00003
반복된 IV 투약 요법에서 CD19 t-haNK 세포의 항-종양 효능을 평가하기 위해, 각각 IV 및 SC 종양 접종을 사용한 라지 이종 이식 모델의 2 가지의 변형을 본 연구에서 사용하였다.
IV 종양 모델에서, CD19 t-haNK 세포는 동물 생존을 유의미하게 개선할 수 있었고, 비히클 대조군과 비교하여 생존 중간값을 5.5 일만큼 연장하였다(26% 증가). SC 종양 모델에서, CD19 t-haNK 세포는 종양 성장을 유의미하게 억제할 수 있었고, 연구 종료시 49% TGI를 초래하였다. 더욱이, CD19 t-haNK 처리는 동물 이환/사망 사건의 수를 감소시킬 수 있었고(CD19 t-haNK 처리된 동물에서 0/6 대 대조군에서 3/6), SC 라지-종양 보유 동물의 간에서 전이성 질병 부담을 현저하게 감소시킬 수 있었다.
상기 데이터로부터 볼 수 있는 바와 같이, CD19 t-haNK 세포는 라지 이종 이식 모델의 두 변형 모두에서 비히클 대조군과 비교하여 유의미한 치료 효능을 나타냈다.
실시예 5. L1210 종양을 갖는 마우스의 CD19-CAR-NK-92 세포를 이용한 처리는 생존을 증가시켰으며, 처리에 완전 반응한 마우스는 재-공격 시 L1210 종양 동종 이식을 물리쳤다.
실험 설계: 6 주 내지 8 주령의 수컷 DBA/2J 마우스(Jackson Laboratories) 30 마리를 0 일차에 무작위 배정 후 등록하였다. 모든 동물을 표준 환경 조건 하에 수용하고 랩다이어트(LabDiet) 5053 방사선 조사된 설치류 사료로 사육하였으며, 멸균 수는 무제한으로 제공하였다. 도착 시, 동물을 귀 펀치로 식별하고 열(10) 마리의 케이지에 수용하고 연구 시작 전 최소 3 일 동안 장소에 순응시켰다. 순응 후, 각 마우스의 주사 부위를 면도하고 멸균 EtOH 탈지면으로 세정하였다. PR0 일차(무작위 배정-전 0 일차)에, 종양 세포 주사를 위해 동물을 이소플루란으로 마취시켰다. PR0 일차에 모든 동물에 우측 옆구리 내로 0.1 mL 부피의 무 혈청 DMEM 중의 2 x 105 L1210-Luc 종양 세포를 피하(s.c.) 주사하였다. PR 7 일차부터 시작하여, 모든 동물의 종양을 디지털 캘리퍼에 의해 매일 측정하였다. 종양 부피가 대략 50 mm3 내지 150 mm3으로 측정되고 평균 종양 부피가 대략 100 mm3으로 측정된 대략 PR7 일차에, 대략 100 mm3에 가장 가까운 종양을 보유한 스무(20) 마리의 동물을 연구 등록을 위해 선택하였다; 이들 동물은 각각 열(10) 마리로 구성된 두(2) 개의 그룹으로 무작위 배정하였다. 무작위 배정 날짜를 연구의 0 일차로 고려하였고, 이 날 처리를 실시하기 시작하였다. 연구에 등록되지 않은 동물은 CO2 과잉 투여에 의해 즉시 안락사시켰다. 그룹 1의 동물에는 50 μl의 종양내(i.t.) 주사로 비히클(무 혈청 DMEM)을 투여하였다. 그룹 2의 동물에는 50 μl의 부피로 2 x 106 mCD19-CAR-aNK 세포를 i.t. 투여하였다. 연구의 0 일차, 2 일차 및 4 일차에 동일한 처리를 시행하였다.
동물을 칭량하고 매일 일반적인 건강에 대해 모니터링하였다. 무작위 배정 후, 디지털 캘리퍼에 의해 매주 3 회(3x/주) 종양을 측정하였다. 2500 mm3보다 큰 종양 또는 궤양화된 종양을 보유한; 초기 체중(0 일차에)보다 30% 넘게 감소한; 또는 빈사 상태이거나, 고통스러워하거나 마비된 것으로 밝혀진 임의의 동물은 사망/희생 원인을 기록하고 CO2 과잉 투여로 안락사시켰다. 30 일차에, 그룹 4를 포함하는 완전 반응하는 동물 및 대략 10 주령의 나이브 추가 수컷 DBA/2J 마우스(Jackson Laboratories; Barrier) 5 마리에게 좌측 옆구리 내에 피하(s.c.)로 0.1 mL 부피의 무-혈청 DMEM 중 2 x 105 개의 L1210-Luc 종양 세포의 재공격 종양 세포 접종을 시행하였다. 모든 동물을 계속 칭량하고 매일 모니터링하고 종양 측정을 60 일차까지 3x/주 계속하였다.
결과
복지 임계값까지의 동물 생존 - 초기 종양 공격: 동물의 생존에 대해 매일 모니터링하였다. 초기 체중의 30% 초과의 감소, 2500 mm3를 초과하는 종양, 음식/물 획득 불능, 또는 빈사 상태로 발견되는 것을 포함하는 동물 건강 및 복지 임계값에 따라 안락사가 필요한 동물을 생존 분석에 포함하였다. 궤양화된 종양으로 인해 안락사가 필요한 동물은 생존 분석에 포함시키지 않았다.
시간 경과에 따른 동물 복지 임계값까지의 누적 생존은 도 10에 나타나 있다. L1210은 극도로 빠르게-성장하는 공격적인 종양 세포주이고 비히클 처리된 대조군 동물의 0%가 종양 공격 후 이십삼(23) 일보다 더 생존하였다. 대조적으로, CD19-CAR-aNK 세포 처리는 비히클 처리에 비해 생존을 향상시켰다. 실제로, CD19-CAR-aNK 세포로 처리된 동물의 25%(2/8)는 종양 이식 공격을 통과하여 61 일차에 연구가 완료될 때까지 생존하였다.
테스트 처리에 의해 제공되는 관찰된 생존 향상의 통계적 유의성은 로그-순위(만텔-콕스) 및 게한-브레슬로우 윌콕손(Gehan-Breslow Wilcoxon) 테스트에 의해 평가하였다. mCD19-CAR-aNK 세포 처리는 통계적으로 유의미한 생존 향상을 발생시켰다,(p = 0.05(만텔-콕스); p = 0.04(게한-브레슬로우 윌콕손). 이들 결과는 CD19-CAR-aNK 처리가 비히클에 비해 이러한 뮤린 림프구성 백혈병의 전임상 피하 모델에서 복지 임계값까지의 생존의 통계적으로 유의미한 개선을 생성하였음을 나타낸다.
완전 반응자의 종양 재-공격: 33 일차에, 그룹 2의 두(2) 마리의 완전 반응 동물을 다섯(5) 마리의 연령-매칭된 나이브 동물과 함께, 2 x 105 개의 L1210-Luc 세포의 제2 접종물을 반대쪽(왼쪽) 옆구리에 주사하여(일차 종양은 오른쪽 옆구리에 시딩하였음) 공격/재공격하였다. 동물의 생존을 매일 모니터링하였다. 초기 체중의 30% 초과의 감소, 2500 mm3를 초과하는 종양, 음식/물 획득 불능, 또는 빈사 상태로 발견되는 것을 포함하는 동물 건강 및 복지 임계값에 따라 안락사가 필요한 동물을 생존 분석에 포함하였다. 궤양화된 종양으로 인해 안락사가 필요한 동물은 생존 분석에 포함시키지 않았다.
생존 분석 적격인 모든(5 마리 중 5 마리) 나이브 동물은 52 일차까지 종양 부피로 인해 안락사를 필요로 하였다; 대조적으로, 2M CD19-CAR-aNK(N = 2) 세포로 이전에 처리된 모든 완전 반응 동물은 연구가 완료될 때(62 일차)까지 생존하였다. 테스트 처리에 의해 제공되는 관찰된 생존 향상의 통계적 유의성은 로그-순위(만텔-콕스) 및 게한-브레슬로우 윌콕손 테스트에 의해 평가하였으나, 생존 향상은 통계적으로 판별 가능하지 않았으며, 아마도 작은 샘플 크기에 기인했을 것이다.
종양은 재공격 단계 동안 매주 3 회(3x/주) 계속해서 측정하였다. 공격/재공격 L1210-Luc 세포의 투여부터 0% 대조군 생존(52 일차)까지의 각 그룹에 대한 평균 종양 부피 + SEM이 도 11에 표시된다.
나이브 동물의 종양은 투여 약 7 일(연구 40 일차) 후에 처음 검출 가능했으며, 꾸준하고 빠르게 증가하였다. 대조적으로, 2M CD19-CAR-aNK 세포로 이전에 처리된 완전 반응 동물에게 재공격한 후에는 재공격 단계의 전체 과정(33 일차 내지 61 일차)에 걸쳐 어떤 지점에서도 종양이 검출되지 않았다.
이 실시예에서 제공된 데이터는 이전에 2M CD19-CAR-aNK 세포로 처리된 완전 반응 동물이 L1210 종양 세포에 대해 효과적인 면역 반응을 발달시켰을 수 있음을 시사한다.
실시예 6: A20 종양을 갖는 마우스의 mCD19-CAR-NK-92 세포를 이용한 처리는 생존을 증가시켰으며, 처리에 완전 반응한 마우스는 재-공격 시 A20 종양 동종 이식을 물리쳤다.
실험 설계
파트 A: 5 주 내지 7 주령 BALB/c 마우스 마흔(40) 마리(20 마리의 수컷 및 20 마리의 암컷)를 타코닉 바이오사이언스(Taconic Biosciences)에서 공급받아 파트 A를 제공하였다. 무작위 배정-이전(PR) 0 일차에, 동물에 100 μL 부피의 무 혈청 배지 중의 2.5 x 106 개의 A20 뮤린 림프종 세포를 왼쪽 옆구리에 피하(s.c.) 주사하였다. PR7 일차에 시작하여, 매일 종양을 측정하였다. 종양 세포 이식 십(10) 일 후(PR10 일차; 0 일차), 마우스를 처리군들로 무작위 배정하여, 각각의 그룹이 유사한 부피 및 범위의 종양을 보유한 동물을 포함하도록 하였다. 무작위 배정의 날은 연구의 0 일차로 고려하였다. 종양을 디지털 캘리퍼에 의해 매주 3 회(3x/주) 측정하여 26 일차에 파트 A 완료까지 종양 성장을 모니터링하였다.
0 일차, 3 일차, 및 5 일차에, 마우스에 50 μl 부피의 무 혈청 배지 중의 테스트 세포 또는 비히클을 사전-확립된 i.t. 절차(실험 절차 참고)에 따라 각 동물의 종양 덩어리 내에 종양내(i.t.) 주사하였다. 간단히, 동물에게 비히클만 투여하거나 5 x 106 mCD19-CAR-NK-92를 투여하였다. 26 일차에, 부피가 40 mm3보다 큰 종양을 발달시키지 않은 동물은 연구에서 등록 취소하고 CO2 질식으로 안락사시켰다; 처리에 완전 반응을 나타낸 등록된 동물(CR; 40 mm3보다 큰 종양이 26 일차 전에 재발 없이 여러 날에 걸쳐 검출 가능하지 않도록(0 mm3) 퇴행함)은 파트 B에 등록하였다.
파트 B: 파트 B는 26 일차에 시작하였다. 종양이 없는 파트 A로부터의 동물을, 열두(12) 마리의 나이브 동물(6 마리의 수컷 및 6 마리의 암컷)과 함께, 파트 B에 등록하였다. 모든 파트 B 동물에게 오른쪽 옆구리에 2.5 x 106 개의 A20 세포를 투여하였다. 종양을 주당 2 회 측정하였다. 동물을 57 일차에 안락사시켰다.
결과: 파트 A - 동물 생존: 동물을 일반적인 건강 및 생존에 대해 매일 모니터링하였다. 초기 체중의 30% 초과의 감소, 1500 mm3를 초과하는 종양, 음식/물 획득 불능 또는 빈사 상태로 발견되는 것을 포함하는 동물 건강 및 복지 임계값에 따라 안락사가 필요한 동물을 생존 분석에 포함하였다. 궤양화된 종양으로 인해 안락사가 필요한 동물은 생존 분석에 포함시키지 않았다. 이 연구에서, 생존 분석에서 고려되는 모든 동물은 1500 mm3를 초과하는 종양 부담으로 인해 안락사시켰다. 피하 종양 부담 임계값은 임의적인 컷-오프 지점에 해당하므로, 이 경우 "생존" 분석은 상대적 종양 성장의 지표로서만 고려되어야 한다. 고려되는 모든 동물에 대한 시간 경과에 따른 누적 생존이 도 12에 표시된다.
1 일차, 3 일차, 및 5 일차에 비히클을 종양내(i.t.) 투여한 대조군 동물 중: 15 마리의 동물 중 0 마리(0%)가 26 일차에 파트 A 완료까지 생존하였다. 26 일차를 지난 생존은 처리를 제공받은 모든 동물에 대해 동물에 대해 증가하였다: 5M mCD19-CAR-NK92 세포가 투여된 18 마리의 동물 중 9 마리(50%). 모든 그룹을 로그-순위(만텔-콕스) 테스트로 상호 비교하였다. 비히클을 투여한 동물과 비교하여, 5M mCD19-CAR-NK92 세포를 투여한 동물에서 통계적으로 유의미한 생존 향상을 관찰하였다(p = <0.0001). 이들 결과는 모든 처리가 비히클 처리에 비해 26 일차까지의 생존을 개선했음을 시사한다.
파트 B - 완전 반응자의 종양 재-공격: 처리에 완전 반응한 동물(40 mm3보다 큰 종양을 보유하고 0 일차 내지 26 일차(파트 A) 과정에 걸쳐 처리에 반응하여 재성장 또는 재발 없이 26 일차까지 종양 부피가 0.00 mm3로 측정됨)에게 27 일차에 0.1 mL 무 혈청 RPMI-1640 배지 중의 2.5 x 106 A20 종양 세포를 사용하여, 옆구리(제1 이식편의 반대편)에 제2 피하 접종으로 재-공격하였다; 연구의 재공격 부분은 파트 B로 지정하였다. 추가 12 마리의 동물을 나이브 대조군으로서 제공하기 위해 파트 B 연구에 등록하였다; 파트 A 마우스와 동일한 시간에 동일한 공급자에게 공급받은 수컷 여섯(6) 마리 및 암컷 여섯(6) 마리의 연령-매칭된 BALB/c 마우스에게 27 일차에 2.5 x 106 개의 A20 종양 세포를 투여하였다. 종양은 57 일차까지 모든 동물에 대해 3 회/주 측정하였다. 각각의 파트 A 처리군 및 나이브 대조군의 평균 종양 부피 + SEM이 도 13에 나타나 있다. 나이브 동물로의 세포 접종으로부터 유래된 종양은 예상대로 꾸준히 성장하였다; 반면 완전 반응자 동물로의 재-공격 종양 세포 접종은 생존 가능한 종양(>40 mm3)을 생산하지 않았다.
요약하면, 본 실시예에 제시된 데이터는, 나이브 마우스와 대조적으로, 처리에 완전 반응했던 이전에 처리된 마우스는 처리와 관계없이 재-공격으로서 적용된 A20 종양 동종 이식을 물리칠 수 있었음을 나타내며, 이들 동물은 종양 항원에 대한 기억 반응을 발달시켰음을 시사한다.
표적화된 CAR 작제물 및 관련 기능 데이터에 대한 다음의 실시예는 선형화된 DNA 벡터 작제물로부터 유래된 것이며, 이는 형질 감염된 세포가 선형화된 DNA를 게놈 내로 통합하여 특정 CAR의 비-일시적 발현을 위한 방안을 제공하는 것을 가능하게 하였다.
실시예 7: FcεRIγ 신호 전달 도메인을 갖는 HER2-CAR
본 실시예에서 본 발명자들은, CD8 힌지에 커플링되고 이는 차례로 FcεRIγ 신호 전달 도메인에 커플링된 CD28 막 관통 도메인에 커플링되는, 항-HER2 scFv를 포함하는 FcεRIγ 신호 전달 도메인을 갖는 1 세대 CAR을 구성하였다. 이렇게 구성된 HER2-CAR은 SEQ ID NO: 60의 핵산 서열을 가졌다.
표준 세포 독성 분석을 사용하여, 이렇게 구성된 HER2.CAR-t-haNK 세포의 기능을 BT-474 세포에 대해 테스트하였고 예시적 결과는 도 14에 나타나 있다. 데이터에서 용이하게 볼 수 있는 바와 같이, FcεRIγ 신호 전달 도메인을 갖는 CAR을 발현하는 HER2.CAR-t-haNK 세포는 BT-474 표적 세포에 대해 유의미한 세포 독성을 나타냈다.
추가의 실험에서, 본 발명자는 도 40에 예시된 바와 같이 HER2.CAR-t-haNK 세포에서 HER2.CAR의 발현을 입증하였다. HER2.CAR-t-haNK 세포의 자연적 세포 독성은 도 41의 결과에 나타나 있고, 한편 CAR 매개 세포 독성에 대한 결과는 도 42에 나타나 있다. HER2.CAR-t-haNK 세포의 ADCC에 대한 예시적 데이터는 도 43의 그래프에 나타나 있다.
실시예 8: FcεRIγ 신호 전달 도메인을 갖는 CD30-CAR
본 실시예에서 본 발명자들은, CD8 힌지에 커플링되고 이는 차례로 FcεRIγ 신호 전달 도메인에 커플링된 CD28 막 관통 도메인에 커플링되는, 항-CD30 scFv를 포함하는 FcεRIγ 신호 전달 도메인을 갖는 1 세대 CAR을 구성하였다. 이렇게 구성된 CD30-CAR은 SEQ ID NO: 61의 핵산 서열을 가졌다.
CD30-CAR의 발현은 도 50의 결과에서 입증되고, 한편 재조합 세포의 자연적 세포 독성에 대한 결과는 도 51에 나타나 있다. CAR 매개 세포 독성은 도 52의 결과에서 입증되고, 한편 ADCC에 대한 예시적 결과는 도 53의 데이터에 나타나 있다.
실시예 9: FcεRIγ 신호 전달 도메인을 갖는 EGFR-CAR
본 실시예에서 본 발명자들은, CD8 힌지에 커플링되고 이는 차례로 FcεRIγ 신호 전달 도메인에 커플링된 CD28 막 관통 도메인에 커플링되는, 항-EGFR scFv를 포함하는 FcεRIγ 신호 전달 도메인을 갖는 1 세대 CAR을 구성하였다. 이렇게 구성된 EGFR-CAR은 SEQ ID NO: 62의 핵산 서열을 가졌다.
표준 세포 독성 분석을 사용하여, 이렇게 구성된 EGFR.CAR-t-haNK 세포의 기능을 A-549 세포에 대해 테스트하였고 예시적 결과는 도 17에 나타나 있다. 데이터에서 용이하게 볼 수 있는 바와 같이, FcεRIγ 신호 전달 도메인을 갖는 CAR을 발현하는 EGFR.CAR-t-haNK 세포는 A-549 표적 세포에 대해 유의미한 세포 독성을 나타냈다. EGFR.CAR-t-haNK 세포에서 EGFR-CAR의 발현은 도 35에 나타나 있고, 한편 자연적 세포 독성 결과는 도 36에 나타나 있다. EGFR.CAR-t-haNK 세포의 CAR 매개 세포 독성에 대한 예시적 결과는 도 37 및 도 38에 나타나 있고, 한편 EGFR.CAR-t-haNK 세포의 ADCC에 대한 결과는 도 39에 나타나 있다.
실시예 10: FcεRIγ 신호 전달 도메인을 갖는 IGF1R-CAR
본 실시예에서 본 발명자들은, CD8 힌지에 커플링되고 이는 차례로 FcεRIγ 신호 전달 도메인에 커플링된 CD28 막 관통 도메인에 커플링되는, 항-IGF1R scFv를 포함하는 FcεRIγ 신호 전달 도메인을 갖는 1 세대 CAR을 구성하였다. 이렇게 구성된 IGF1R-CAR은 SEQ ID NO: 63의 핵산 서열을 가졌고, IGF1R-CAR, CD16, 및 IL-2ER을 인코딩하는 트리시스트론 작제물은 SEQ ID NO: 76의 핵산 서열을 가졌으며, 이는 또한 개략적으로 도 65에 예시되어 있다.
이렇게 구성된 IGF1R.CAR-t-haNK 세포의 기능을 2 세대 CAR(CD28/CD3z)과 비교하여 표준 세포 독성 분석을 사용하여 MDA-MB-231 세포에 대해 테스트하였고 예시적 결과는 도 22에 나타나 있다. 데이터에서 용이하게 볼 수 있는 바와 같이, FcεRIγ 신호 전달 도메인을 갖는 CAR을 발현하는 IGF1R.CAR-t-haNK 세포는 MDA-MB-231 표적 세포에 대해 유의미하고 표적 특이적인 세포 독성을 나타냈으며, 이는 2 세대 CAR의 세포 독성과 비교할 만하였다.
실시예 11: FcεRIγ 신호 전달 도메인을 갖는 CD123-CAR
본 실시예에서 본 발명자들은, CD8 힌지에 커플링되고 이는 차례로 FcεRIγ 신호 전달 도메인에 커플링된 CD28 막 관통 도메인에 커플링되는, 항-CD123 scFv를 포함하는 FcεRIγ 신호 전달 도메인을 갖는 1 세대 CAR을 구성하였다. 이렇게 구성된 CD123-CAR은 SEQ ID NO: 64의 핵산 서열을 가졌다. CD123-CAR 발현 재조합 NK 세포의 CAR 매개 세포 독성에 대한 데이터는 도 48에 나타나 있고, 도 49는 CD123-CAR 발현 재조합 NK 세포의 ADCC에 대한 예시적 데이터를 나타낸다.
실시예 12: FcεRIγ 신호 전달 도메인을 갖는 PD-L1-CAR
본 실시예에서 본 발명자들은, CD8 힌지에 커플링되고 이는 차례로 FcεRIγ 신호 전달 도메인에 커플링된 CD28 막 관통 도메인에 커플링되는, 항-PD-L1 scFv를 포함하는 FcεRIγ 신호 전달 도메인을 갖는 1 세대 CAR을 구성하였다. 이렇게 구성된 PD-L1-CAR은 SEQ ID NO: 65의 핵산 서열을 가졌다.
표준 세포 독성 분석을 사용하여, 이렇게 구성된 PD-L1.CAR-t-haNK 세포의 기능을 SUP-B15.PD-L1+ 세포에 대해 테스트하였고 예시적 결과는 도 16에 나타나 있다. 데이터에서 용이하게 볼 수 있는 바와 같이, FcεRIγ 신호 전달 도메인을 갖는 CAR을 발현하는 PD-L1.CAR-t-haNK 세포는 SUP-B15.PD-L1+ 표적 세포에 대해 유의미한 세포 독성을 나타냈다.
표준 세포 독성 분석을 사용하여, 이렇게 구성된 PD-L1.CAR-t-haNK 세포의 기능도 U251 세포에 대해 테스트하였고 예시적 결과는 비-형질 감염된 haNK 세포와 함께 도 17에 나타나 있다. 데이터에서 용이하게 볼 수 있는 바와 같이, FcεRIγ 신호 전달 도메인을 갖는 CAR을 발현하는 PD-L1.CAR-t-haNK 세포는 U251 표적 세포에 대해 표적 특이적이고 유의미한 세포 독성을 나타낸 반면, haNK 대조군 세포는 동일한 U251 세포에 대해 세포 독성이 실질적으로 없었다.
PD-L1에 대한 표적 세포 특이성에 관한 추가의 실험에서, 본 발명자들은 일반적인 세포 독성에 대한 대조군으로서의 haNK 세포와 함께 PD-L1.CAR-t-haNK 세포를 사용하여 여러 PD-L1 양성 종양 세포주를 테스트하였다. 도 24a 및 도 24b에서 용이하게 볼 수 있는 바와 같이, PD-L1.CAR-t-haNK 세포는 매우 다양한 종양 세포(폐, 유방, 제니츄리(genitury) 종양 세포, 추가적으로, 두경부 소세포암, 척삭종) 전체에 걸쳐 우수한 세포 독성을 가졌다. 특히, PD-L1.CAR-t-haNK 세포는 대다수(>85%)의 세포 살해에 대해 4 시간 미만을 필요로 했던 반면, 대조군 haNK 세포는 12 시간 초과를 필요로 하였다.
도 24a 및 도 24b는 다양한 다른 대조군 세포(표시된 바와 같은 haNK 세포)와 비교하여 MDA-MB-231 세포에 대한 PD-L1.CAR-t-haNK 세포의 세포 독성을 추가로 예시한다. 데이터로부터 이해할 수 있는 바와 같이, 5:1 E:T 비율에서, PD-L1.thaNK에 의한 MDA-MB-231 용해는 세툭시맙에 의해 개선되었으며, haNK 활성은 세툭시맙 및 a-PD-L1의 첨가에 의해 개선되었다. 보통의 PD-L1.thank는 haNK 및 haNK + 세툭시맙에 비해 개선된 세포 독성 활성을 가졌고, 보통의 PD-L1.thank 살해는 haNK + PD-L1 항체의 그것과 비슷했지만 PD-L1.thank + 세툭시맙은 haNK + 세툭시맙 및 haNK + PD-L1을 능가하였다. 1:1 E:T 비율에서, PD-L1.thaNK 활성은 세툭시맙이 있거나 없거나 동일했으며, PD-L1.thaNK는 hank에 의한 고유한 ADCC-매개 살해를 유의미하게 능가하였다. haNK 활성은 세툭시맙 및 a-PD-L1의 첨가에 의해 개선되었다.
추가 실험에서, 본 발명자들은 도 44에 예시된 바와 같이 PD-L1.CAR-t-haNK 세포에서 PD-L1.CAR의 발현을 입증하였다. PD-L1.CAR-t-haNK 세포의 자연적 세포 독성은 도 45의 결과에 나타나 있고, 한편 CAR 매개 세포 독성에 대한 결과는 도 46에 나타나 있다. PD-L1.CAR-t-haNK 세포의 ADCC에 대한 예시적 데이터는 도 47의 그래프에 나타나 있다.
실시예 13: FcεRIγ 신호 전달 도메인을 갖는 CD33-CAR
본 실시예에서 본 발명자들은, CD8 힌지에 커플링되고 이는 차례로 FcεRIγ 신호 전달 도메인에 커플링된 CD28 막 관통 도메인에 커플링되는, 항-HER2 scFv를 포함하는 FcεRIγ 신호 전달 도메인을 갖는 1 세대 CAR을 구성하였다. 이렇게 구성된 CD33-CAR은 SEQ ID NO: 66의 핵산 서열을 가졌다.
표준 세포 독성 분석을 사용하여, 이렇게 구성된 CD33.CAR-t-haNK 세포의 기능을 THP-1 세포에 대해 테스트하였고 예시적 결과는 도 15에 나타나 있다. 데이터에서 용이하게 볼 수 있는 바와 같이, FcεRIγ 신호 전달 도메인을 갖는 CAR을 발현하는 CD33.CAR-t-haNK 세포는 THP-1 표적 세포에 대해 유의미한 세포 독성을 나타냈다. NK-92 세포에서의 CD33CAR의 강력한 발현을 도시하는 추가 데이터는 도 31에 제시되어 있다. K562 세포에 대한 CD33.CAR-t-haNK 세포의 자연적 세포 독성은 도 32에 나타나 있으며, 도 33은 THP-1 세포에 대한 CAR 매개 세포 독성에 대한 결과를 보여준다. 도 34는 리툭시맙과 함께 SUP-B15 CD19KO/CD20+에 대한 CD33.CAR-t-haNK 세포의 ADCC에 대한 추가 결과를 나타낸다.
실시예 14: FcεRIγ 신호 전달 도메인을 갖는 gp120-CAR
본 실시예에서 본 발명자들은, CD8 힌지에 커플링되고 이는 차례로 FcεRIγ 신호 전달 도메인에 커플링된 CD28 막 관통 도메인에 커플링되는, 항-gp120 scFv를 포함하는 FcεRIγ 신호 전달 도메인을 갖는 1 세대 CAR을 구성하였다. 이렇게 구성된 gp120-CAR은 SEQ ID NO: 67의 핵산 서열을 가졌다.
본 발명자들은 이렇게 생성된 세포가 도 57에서 볼 수 있는 바와 같이 상당한 양의 CD16 및 gp120CAR을 발현한다는 것을 추가로 입증하였다. gp120CAR에 대한 GP120의 결합은 도 58에서 입증된 바와 같이 음성 대조군으로서의 비-재조합 aNK 세포에 비해 나타났다. 이렇게 생성된 세포의 자연적 세포 독성은 도 59에 나타나 있고, 한편 해당 ADCC 데이터는 도 60에 나타나 있다.
실시예 15: FcεRIγ 신호 전달 도메인을 갖는 B7-H4-CAR
본 실시예에서 본 발명자들은, CD8 힌지에 커플링되고 이는 차례로 FcεRIγ 신호 전달 도메인에 커플링된 CD28 막 관통 도메인에 커플링되는, 항-B7-H4 scFv를 포함하는 FcεRIγ 신호 전달 도메인을 갖는 1 세대 CAR을 구성하였다. 이렇게 구성된 B7-H4-CAR은 SEQ ID NO: 68의 핵산 서열을 가졌다.
실시예 16: FcεRIγ 신호 전달 도메인을 갖는 BCMA-CAR
본 실시예에서 본 발명자들은, CD8 힌지에 커플링되고 이는 차례로 FcεRIγ 신호 전달 도메인에 커플링된 CD28 막 관통 도메인에 커플링되는, 항-BCMA scFv를 포함하는 FcεRIγ 신호 전달 도메인을 갖는 1 세대 CAR을 구성하였다. 이렇게 구성된 BCMA-CAR은 SEQ ID NO: 69의 핵산 서열을 가졌다.
BCMA 발현은 도 54의 예시적 결과에 나타난 바와 같이 확인하였고, CAR 매개 세포 독성은 도 55에 나타난 바와 같이 표적 세포에 대해 입증하였다. 유사하게, 도 56의 결과에서 볼 수 있는 바와 같이, 재조합 세포는 표적 세포에 대한 항체로서 리툭시맙을 사용하여 유의미한 ADCC를 가졌다.
실시예 17: FcεRIγ 신호 전달 도메인을 갖는 GD2-CAR
본 실시예에서 본 발명자들은, CD8 힌지에 커플링되고 이는 차례로 FcεRIγ 신호 전달 도메인에 커플링된 CD28 막 관통 도메인에 커플링되는, 항-GD2 scFv를 포함하는 FcεRIγ 신호 전달 도메인을 갖는 1 세대 CAR을 구성하였다. 이렇게 구성된 GD2-CAR은 SEQ ID NO: 70의 핵산 서열을 가졌다.
실시예 18: FcεRIγ 신호 전달 도메인을 갖는 FAP-CAR
본 실시예에서 본 발명자들은, CD8 힌지에 커플링되고 이는 차례로 FcεRIγ 신호 전달 도메인에 커플링된 CD28 막 관통 도메인에 커플링되는, 항-FAP scFv를 포함하는 FcεRIγ 신호 전달 도메인을 갖는 1 세대 CAR을 구성하였다. 이렇게 구성된 FAP-CAR은 SEQ ID NO: 71의 핵산 서열을 가졌다. FAP-CAR의 발현은 도 61의 데이터에 나타나 있으며, FAP.CAR 세포 독성은 도 62의 결과에서 표적 세포에 대해 입증된다.
실시예 19: FcεRIγ 신호 전달 도메인을 갖는 CD20-CAR
본 실시예에서 본 발명자들은, CD8 힌지에 커플링되고 이는 차례로 FcεRIγ 신호 전달 도메인에 커플링된 CD28 막 관통 도메인에 커플링되는, 항-CD20 scFv를 포함하는 FcεRIγ 신호 전달 도메인을 갖는 1 세대 CAR을 구성하였다. 이렇게 구성된 CD20-CAR은 SEQ ID NO: 74의 핵산 서열을 가졌다.
NK-92 세포에서의 CD20 CAR의 발현은 도 29의 결과에 나타나 있다. 용이하게 볼 수 있는 바와 같이, CD20.CAR은 압도적 대다수의 재조합 세포에서 강하게 발현된다(상기에서 언급된 선형화된 DNA로부터의 CD16과 함께). 도 30은 CD20+ 표적 세포에 대한 CD20.CAR NK 세포의 세포 독성에 대한 예시적 결과를 도시한다.
실시예 20: FcεRIγ 신호 전달 도메인을 갖는 CSPG-4-CAR
본 실시예에서 본 발명자들은, CD8 힌지에 커플링되고 이는 차례로 FcεRIγ 신호 전달 도메인에 커플링된 CD28 막 관통 도메인에 커플링되는, 항-CSPG-4 scFv를 포함하는 FcεRIγ 신호 전달 도메인을 갖는 1 세대 CAR을 구성하였다. 이렇게 구성된 CSPG-4-CAR은 SEQ ID NO: 75의 핵산 서열을 가졌다. CSPG-4-CAR의 발현을 FACS 분석으로 확인하고 예시적 결과를 도 63에 나타냈다. 이와 같이 구성된 세포는 또한 도 64의 예시적 데이터에 나타난 바와 같이 유의미한 세포 독성을 나타냈다.
실시예 21: FcεRIγ 신호 전달 도메인을 갖는 CD19-CAR
본 실시예에서 본 발명자들은, CD8 힌지에 커플링되고 이는 차례로 FcεRIγ 신호 전달 도메인에 커플링된 CD28 막 관통 도메인에 커플링되는, 항-CD19 scFv를 포함하는 FcεRIγ 신호 전달 도메인을 갖는 상기에 기재된 1 세대 CAR을 사용하였으며, 기능 테스트를 위해 선형화된 DNA로 NK-92 세포를 형질 감염시켰다.
이렇게 구성된 CD19.CAR-t-haNK 세포의 기능은 표준 세포 독성 분석을 사용하여 일반적인 세포 독성의 결정을 위해 K562 세포에 대해 테스트하였고 예시적 결과는 도 19에 나타나 있다. 용이하게 볼 수 있는 바와 같이, FcεRIγ 신호 전달 도메인을 갖는 CAR을 발현하는 CD19.CAR-t-haNK 세포는 K562 표적 세포에 대해 유의미한 세포 독성을 나타냈다. 추가의 실험 세트에서, 대조군으로서의 aNK 세포와 비교하여 SUP-B15 세포를 사용하여 표적 특이적 세포 독성을 결정하였고, 예시적 결과는 도 20에 나타나 있다. 다시 한 번, FcεRIγ 신호 전달 도메인을 갖는 CAR을 발현하는 CD19.CAR-t-haNK 세포는 유의미한 표적 특이적 세포 독성을 나타냈다. 또한 또 다른 실험 세트에서, 항체로서 허셉틴(Herceptin) 및 리툭산(Rituxan)을 사용하고 SKBr3 세포를 사용하여 표적 특이적 ADCC를 결정하였으며, 예시적 결과는 도 21에 나타나 있다. 다시, FcεRIγ 신호 전달 도메인을 갖는 CAR을 발현하는 CD19.CAR-t-haNK 세포는 유의미한 항체 및 표적 특이적 ADCC를 나타냈다. 특히, 재조합 NK 세포의 배가 시간은 aNK 세포와 실질적으로 동일하였다.
도 25는 NK-92 세포에서 CD16 및 IL-2ER를 인코딩하는 절편을 포함하는 선형화된 DNA 대 대조군으로부터의 CD19.CAR 발현을 예시적으로 도시한다. 도 25에서 볼 수 있는 바와 같이, 압도적 대다수의 세포에 걸쳐 발현은 매우 강했다. K562 세포에 대한 CD19.CAR t-haNK 세포의 자연적 세포 독성 및 SUP-B15 세포에 대한 표적화된 세포 독성에 대한 추가 결과가 도 26 및 도 27에 도시된다. SUP-B15CD19KO/CD20+ 세포에 대한 CD19.CAR t-haNK 세포의 ADCC에 대한 예시적 추가 결과는 도 28에 나타나 있다.
실시예 22: NSG 마우스 내 인간 이종 이식 모델에서의 PD-L1-표적화 t-haNK 세포의 항-종양 활성
MDA-MB-231 및 HCC827을 PD-L1 양성인 인증된 이종 이식 모델로서 사용하고, 다양한 제형, 투약 수준, 및 투약 경로(IV 및 IT)에서의 PD-L1 t-haNK 세포의 효능을 평가하였다.
동물: 동물 유형: NSG 마우스(JAX), 암컷, 9 주 내지 10 주령; MDA-MB-231 모델의 경우 동물 수: 24 마리(새로 공급된 세포), HCC827 모델의 경우: 24 마리(새로 공급된 세포) + 6 마리(냉동 보존된 세포). 종양 모델은 다음 세포주를 사용하였다: MDA-MB-231(인간 유방 선암종) 및 HCC827(인간 폐 선암종), 접종 경로는 양측 옆구리 상 피하였으며, 처리 개시 시 평균 종양 부담은 MDA-MB-231의 경우 약 100 mm3였고 HCC827의 경우 약 75 mm3 내지 80 mm3였다.
처리 물품: 새로 제조되고 방사선 조사된 5E7 개의 세포/mL 또는 2E7 개의 세포/mL의 농도의 항-PD-L1 t-haNK; 비히클 대조군은 엑스-비보TM 10 배지였다; 투여 방법은 언급된 IV 및 IT였다. IV NK 투약을 위한 투여량은 200 μL 중의 1E7 개의 세포/투여량(새로 제조된 세포), 200 μL 중의 4E6 개의 세포/투여량(냉동 보존된 세포)이었고; IT NK 투약을 위한(새로 공급된 세포만) 투여량은 50 μL 중의 2.5E6 개의 세포/종양/투여량이었다. 투약 빈도는 연속 4 주 동안 주 2 회(M/Th 또는 T/F)였고, 투약 첫 날을 1 일차로 정의하였다.
MDA-MB-231에 대한 연구 설계는 하기 표 4에 있다(이 연구는 27 일차에 종료되었고, 이때 그룹 A, C 및 D의 일부 동물은 2000 mm3보다 큰 합쳐진 종양 부피에 도달하였다)
Figure pct00004
HCC827에 대한 연구 설계는 하기 표 5에 있다(이 연구는 29 일차에 종료되었고, 이때 생존한 동물은 다른 목적에 맞게 만들고 또 다른 연구로 옮겼다).
Figure pct00005
결과: 새로 제조된 PD-L1 t-haNK 세포(1E7 개의 세포/투여량)는 MDA-MB-231 및 HCC827 모델 둘 모두에서 현저하고 오래 지속되는 종양 성장 저해로 이어졌다.
MDA-MB-231: 종양 정체: 16 일차의 TGI: 84%(최고치); 26 일차의 TGI: 79%(마지막 측정).
HCC827: 종양 퇴행: 16 일차의 TGI: 120%(최고치); 29 일차의 TGI: 84%(연구 종료).
냉동 보존된 PD-L1 t-haNK 세포(4E6 개의 세포/투여량) 또한 엑스-비보TM 10 배지와 비교하여 종양 성장을 억제하는 데 통계적으로 유의미한 효능을 나타냈다: 26 일차의 TGI: 60%(최고치), 및 29 일차의 TGI: 40%(연구 종료).
새로 제조된 PD-L1 t-haNK 세포(1E7 개의 세포/투여량) 또한 하기 표 6에 나타난 바와 같이 MDA-MB-231 모델에서 전이성 질병 부담의 유의미한 감소로 이어졌다.
Figure pct00006
간에서 가시적인 결절의 수는 비히클에서: 29 ± 9, PD-L1 t-haNK 그룹에서: 0(독립 표본 양측 t 테스트에 의해 P = 0.0116).
수행된 실험에 기초하여, 1E7 개의 세포/투여량의 투약 수준으로, 4 주 동안 주 2 회, 새로 제조된 PD-L1 t-haNK 세포의 IV 투약은 테스트된 피하 이종 이식 모델 둘 모두에서 현저한 항-종양 효능을 나타냈다: 처리는 MDA-MB-231 종양-보유 마우스에서 종양 정체를 초래하였고, 16 일차에 84%의 최고치 TGI였고 79%의 연구-종료 TGI였으며(이원 ANOVA에 이어 투키 테스트에 의한 다중 비교에 의해 두 시점 모두에 대해 P<0.0001), HCC827 모델에서 종양 퇴행을 초래하였고, 16 일차에 120%의 최고치 TGI였고 84%의 연구-종료 TGI였다(P<0.0001). 4E6 개의 세포/투여량의 투약 수준으로, 4 주 동안 주 2 회, 냉동 보존된 PD-L1 t-haNK 세포의 IV 투약 또한 HCC827 종양 모델에서 유의미한 치료 효능을 나타내어, 60%의 최고치 TGI(P<0.0001), 및 40%의 연구-종료 TGI(P<0.01)에 도달하였다. 2.5E6 개의 세포/투여량/종양의 투약 수준으로, 4 주 동안 주 2 회, 새로 제조된 PD-L1 t-haNK 세포의 IT 투약은 HCC827 종양의 성장을 효과적으로 억제하여, 20 일차에 70%의 최고치 TGI 및 49%의 연구-종료 TGI(P<0.001)를 초래하였다.
새로 제조된 PD-L1 t-haNK 세포(1E7 개의 세포/투여량)의 IV 투여를 제공받은 동물에 대해 유의미한 유해 반응을 관찰하였다. 새로 준비된 PD-L1 t-haNK 세포와 대조적으로, 냉동 보존된 세포(4E6 개의 세포/투여량의 더 낮은 수준으로 투약됨)는 IV 투여 후 동물에게 안전한 것으로 입증되었다. PD-L1 t-haNK 세포는 두 가지의 피하 종양 모델에서 현저한 효능을 입증하였다. 더 낮은 4E6 개의 세포/투여량 수준으로 투약되는 냉동 보존된 세포, 또한 종양 성장을 억제하는 데 유의미한 효능을 나타냈으며, 동물에게 안전한 것으로 입증되었다.
물론, 본원에서 제공되는 모든 핵산 서열에 대해 상응하는 인코딩되는 단백질 또한 본원에서 명시적으로 고려된다는 것이 인식되어야 한다. 마찬가지로, 모든 아미노산 서열에 대해, 상응하는 핵산 서열도 본원에서 고려된다(임의의 코돈 사용 빈도로).
본 명세서에 인용된 모든 특허 출원, 간행물, 참고 문헌, 및 서열 수탁 번호는 그 전체가 본원에 참조로서 포함된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본 명세서 및 이어지는 청구범위에서, 다음 의미를 갖도록 정의되어야 하는 다수의 용어가 언급될 것이다:
본원에서 사용된 용어는 특정 구현예를 기술하기 위한 목적을 가질 뿐이며 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 본원에서 사용된 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥이 달리 분명하게 지시하지 않는 한, 복수 형태 또한 포함하는 것으로 의도된다.
본원에 기재된 모든 수치(예를 들어, pH, 온도, 시간, 농도, 양, 및 분자량, 범위 포함)는 당업자가 접하는 측정에서의 정상적인 변동을 포함하는 것으로 이해된다. 따라서, 본원에 기재된 수치는 +/- 0.1% 내지 10%, 예를 들어 +/- 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 또는 10%의 변동을 포함한다. 항상 명시적으로 언급된 것은 아니지만, 용어 "약(about)"이 모든 숫자 명시 앞에 올 수 있음이 이해되어야 한다. 따라서, 용어 약은 수치의 +/- 0.1% 내지 10%, 예를 들어 +/- 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 또는 10%의 변동을 포함한다. 또한, 항상 명시적으로 언급된 것은 아니지만, 본원에 기재된 시약은 단지 예시일 뿐이며 이의 등가물이 당업계에 알려져 있음이 이해되어야 한다.
당업자에 의해 이해될 바와 같이, 특히 서면에 의한 설명(written description)을 제공하는 면에서, 모든 목적을 위해, 본원에 개시된 모든 범위는 범위의 종점을 포함하고, 범위의 종점 사이의 모든 값을 포함한다. 본원에 개시된 모든 범위는 또한 모든 가능한 하위 범위 및 이의 하위 범위의 조합을 포괄한다. 임의의 나열된 범위는 그 범위가 적어도 동일한 절반, 3 분의 1, 4 분의 1, 5 분의 1, 10 분의 1 등으로 나누어지는 것을 충분히 기술하고 가능하게 하는 것으로서 용이하게 인식될 수 있다. 비-제한적인 예로서, 본원에서 논의된 각각의 범위는 용이하게 하위 3 분의 1, 중위 3 분의 1 및 상위 3 분의 1 등으로 나누어질 수 있다. 당업자에 의해 또한 이해될 바와 같이 "최대(up to)", "적어도(at least)," 등과 같은 모든 언어는 열거된 숫자를 포함하고, 상기에서 논의된 바와 같이 차후에 하위 범위로 나누어질 수 있는 범위를 지칭한다. 마지막으로, 당업자에 의해 이해될 바와 같이, 범위는 각각의 개별 구성원을 포함한다. 따라서, 예를 들어 1 개 내지 3 개의 세포를 갖는 그룹은 1 개, 2 개, 또는 3 개의 세포를 갖는 그룹을 지칭한다. 유사하게, 1 개 내지 5 개의 세포를 갖는 그룹은 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 또는 5 개의 세포 등을 갖는 그룹을 지칭한다.
또한, 항상 명시적으로 언급된 것은 아니지만, 본원에 기재된 시약은 단지 예시일 뿐이며 이의 등가물이 당업계에 알려져 있음이 이해되어야 한다.
"선택적" 또는 "선택적으로"는 차후에 기재되는 사건 또는 환경이 발생할 수 있거나 발생할 수 없음을 의미하며, 이러한 기재는 사건 또는 환경이 발생하는 경우 및 발생하지 않는 경우를 포함함을 의미한다.
용어 "포함하는"은 조성물 및 방법이 열거된 요소를 포함하지만, 다른 것을 배제하지 않음을 의미하는 것으로 의도된다. 조성물 및 방법을 정의하는 데 사용될 때, "본질적으로 구성되는"은 조합에 대해 임의의 본질적 의미의 다른 요소를 배제하는 것을 의미해야 한다. 예를 들어, 본원에 정의된 요소들로 본질적으로 구성된 조성물은 청구된 발명의 기본적이고 신규한 특성(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 다른 요소를 배제하지 않을 것이다. "구성되는"은 열거된 다른 성분 및 실질적인 방법 단계의 미량보다 많은 것을 배제하는 것을 의미해야 한다. 이들 전이 용어 각각에 의해 정의되는 구현예는 본 개시의 범위 내에 있다.
본원에 사용된 "면역 요법"은, 단독 또는 조합 여부에 관계없이, NK-92 세포, 변형된 또는 변형되지 않은, 자연 발생된 또는 변형된 NK 세포 또는 T-세포의 사용을 지칭하며, 이는 표적 세포 접촉시 세포 독성을 유도할 수 있다.
본원에 사용된 "자연 살해(NK) 세포"는 특정 항원 자극의 부재 하에, 주요 조직적합성 복합체(MHC) 클래스에 따른 제한 없이 표적 세포를 살해하는 면역계의 세포이다. 표적 세포는 종양 세포 또는 바이러스를 보유한 세포일 수 있다. NK 세포는 CD56의 존재 및 CD3 표면 마커의 부재를 특징으로 한다.
용어 "내인성 NK 세포"는 NK-92 세포주와 구별되는, 공여자(또는 환자)로부터 유래된 NK 세포를 지칭하기 위해 사용된다. 내인성 NK 세포는 일반적으로 NK 세포가 강화된 이질적인 세포 집단이다. 내인성 NK 세포는 환자의 자가 또는 동종 이계 치료를 위해 의도될 수 있다.
용어 "NK-92"는 문헌[Gong et al.(1994)]에 기재된 매우 강력하고 고유한 세포주로부터 유래된 자연 살해 세포를 지칭하며, 이에 대한 권리는 난퀘스트가 소유하고 있다(이하, "NK-92TM 세포"). 불멸의 NK 세포주는 원래 비-호지킨 림프종 환자로부터 수득한 것이다. 달리 표시되지 않는 한, 용어 "NK-92TM"는 원래의 NK-92 세포주 뿐만 아니라 변형된(예를 들어, 외인성 유전자의 도입에 의해) NK-92 세포주도 지칭하는 것으로 의도된다. NK-92TM 세포 및 이의 예시적이고 비-제한적인 변형은 미국 특허 번호 7,618,817; 8,034,332; 8,313,943; 9,181,322; 9,150,636; 및 공개된 미국 출원 번호 10/008,955에 기재되어 있으며, 이들 모두는 그 전체가 본원에 참조로서 포함되고, 야생형 NK-92TM, NK-92TM-CD16, NK-92TM-CD16-γ, NK-92TM-CD16-ζ, NK-92TM-CD16(F176V), NK-92TMMI, 및 NK-92TMCI를 포함한다. NK-92 세포는 당업자에게 알려져 있으며, 이들에게 이러한 세포는 난퀘스트, 인크(NantKwest, Inc.)로부터 용이하게 입수 가능하다.
용어 "aNK"는 문헌[Gong et al.(1994)]에 기재된 매우 강력하고 고유한 세포주로부터 유래된 변형되지 않은 자연 살해 세포를 지칭하며, 이에 대한 권리는 난퀘스트가 소유하고 있다(이하, "aNKTM 세포"). 용어 "haNK"는 문헌[Gong et al.(1994)]에 기재된 매우 강력하고 고유한 세포주로부터 유래된 자연 살해 세포를 지칭하며, 이에 대한 권리는 난퀘스트가 소유하고 있고, 세포 표면 상에 CD16을 발현하도록 변형되었다(이하 "CD16+ NK-92TM 세포" 또는 "haNK® 세포"). 일부 구현예에서, CD16+ NK-92TM 세포는 세포 표면 상에 고친화성 CD16 수용체를 포함한다. 용어 "taNK"는 문헌[Gong et al.(1994)]에 기재된 매우 강력하고 고유한 세포주로부터 유래된 자연 살해 세포를 지칭하며, 이에 대한 권리는 난퀘스트가 소유하고 있고, 키메라 항원 수용체를 발현하도록 변형되었다(이하 "CAR-변형된 NK-92TM 세포" 또는 "taNK® 세포"). 용어 "t-haNK"는 문헌[Gong et al.(1994)]에 기재된 매우 강력하고 고유한 세포주로부터 유래된 자연 살해 세포를 지칭하며, 이에 대한 권리는 난퀘스트가 소유하고 있고, 세포 표면 상에 CD16을 발현하고 키메라 항원 수용체를 발현하도록 변형되었다(이하 "CAR-변형된 CD16+ NK-92TM 세포" 또는 "t-haNKTM 세포"). 일부 구현예에서, t-haNKTM 세포는 세포 표면 상에 고친화성 CD16 수용체를 발현한다.
"변형된 NK-92 세포"는, Fc 수용체, CAR, 사이토카인(예컨대 IL-2 또는 IL-12와 같은), 및/또는 자살 유전자와 같은 외인성 유전자 또는 단백질을 발현하는 NK-92 세포를 지칭한다. 일부 구현예에서, 변형된 NK-92 세포는, Fc 수용체, CAR, 사이토카인(예컨대 IL-2 또는 IL-12), 및/또는 자살 유전자와 같은 전이 유전자를 인코딩하는 벡터를 포함한다. 일 구현예에서, 변형된 NK-92 세포는 적어도 하나의 전이 유전자 단백질을 발현한다.
본원에 사용된 "비-방사선 조사된 NK-92 세포"는 방사선 조사되지 않은 NK-92 세포이다. 방사선 조사는 세포로 하여금 성장 및 증식을 할 수 없게 만든다. NK-92 세포는, 최적의 활성을 보존하기 위해 방사선 조사와 주입 사이의 시간이 4 시간보다 길지 않아야 하기 때문에, 환자를 치료하기 전 치료 시설에서 또는 어떤 다른 지점에서 방사선 조사될 것으로 구상된다. 대안적으로, NK-92 세포가 또 다른 메커니즘에 의해 증식하는 것이 방지될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, NK-92 세포의 "불활성화"는 그들로 하여금 성장할 수 없게 만든다. 불활성화는 또한 NK-92 세포의 사멸과 관련될 수 있다. NK-92 세포는 그들이 치료적 적용에서 병리와 관련된 세포의 생체외 샘플을 효과적으로 퍼지한 후, 또는 그들이 체내에 머무른 많은 또는 모든 표적 세포를 효과적으로 살해하기에 충분한 시간의 기간 동안 포유 동물의 체내에 머무른 후에 불활성화될 수 있는 것으로 구상된다. 비-제한적인 예로서, NK-92 세포가 민감한 불활성화 제제를 투여함으로써, 불활성화가 유도될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "세포 독성" 및 "세포 용해성"은, NK-92 세포와 같은 이펙터 세포의 활성을 기술하기 위해 사용될 때, 동의어인 것으로 의도된다. 일반적으로, 세포 독성 활성은 다양한 생물학적, 생화학적, 또는 생물 물리학적 메커니즘 중 임의의 것에 의한 표적 세포의 살해에 관한 것이다. 세포 용해는 이펙터가 표적 세포의 원형질 막을 용해함으로써 그의 물리적 무결성을 파괴하는 활성을 더 구체적으로 지칭한다. 이는 표적 세포의 살해를 초래한다. 이론에 얽매이기 원하지 않지만, NK-92 세포의 세포 독성 효과는 세포 용해에 기인한다고 여겨진다.
세포/세포 집단에 관해 용어 "살해하다"는 그 세포/세포 집단의 사멸로 이어질 임의의 유형의 조작을 포함하는 것과 관련이 있다.
용어 "Fc 수용체"는 Fc 영역으로 알려진 항체의 일부에 결합함으로써 면역 세포의 방어 기능에 기여하는 일정 세포(예를 들어, 자연 살해 세포)의 표면 상에서 발견되는 단백질을 지칭한다. 항체의 Fc 영역과 세포의 Fc 수용체(FcR)의 결합은 항체-매개 식세포 작용 또는 항체-의존성 세포-매개 세포 독성(ADCC)을 통해 세포의 식세포 또는 세포 독성 활성을 자극한다. FcR은 그들이 인식하는 항체 유형에 기초하여 분류된다. 예를 들어, Fc-감마 수용체(FCγR)는 항체의 IgG 클래스에 결합한다. FCγRIII-A(CD16이라고도 함; SEQ ID NO: 20)는 IgG 항체에 결합하고 ADCC를 활성화하는 저친화성 Fc 수용체이다. FCγRIII-A는 전형적으로 NK 세포 상에서 발견된다. NK-92 세포는 FCγRIII-A를 발현하지 않는다. Fc-엡실론 수용체(FcεR)는 IgE 항체의 Fc 영역에 결합한다.
본원에 사용된 용어 "키메라 항원 수용체"(CAR)는 세포내 신호 전달 도메인에 융합된 세포외 항원-결합 도메인을 지칭한다. CAR은 T 세포 또는 NK 세포에서 발현되어 세포 독성을 증가시킬 수 있다. 일반적으로, 세포외 항원-결합 도메인은 관심 세포 상에서 발견되는 항원에 특이적인 scFv이다. CAR-발현 NK-92 세포는 scFv 도메인의 특이성에 기초하여, 세포 표면 상에 일정 항원을 발현하는 세포에 표적화된다. scFv 도메인은 종양-특이적 항원 및 바이러스-특이적 항원을 포함하는 임의의 항원을 인식하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, CD19CAR은 일부 암에 의해 발현되는 세포 표면 마커인 CD19를 인식한다.
본원에 사용된 용어 "종양-특이적 항원"은 암 또는 신생 세포 상에 존재하지만 암 세포와 동일한 조직 또는 계통으로부터 유래된 정상 세포 상에서는 검출 가능하지 않은 항원을 지칭한다. 본원에 사용된 종양-특이적 항원은 또한 종양-관련 항원, 즉, 암 세포와 동일한 조직 또는 계통으로부터 유래된 정상 세포와 비교하여 암 세포 상에서 더 높은 수준으로 발현되는 항원을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "바이러스-특이적 항원"은 바이러스-감염된 세포 상에 존재하지만 바이러스-감염된 세포와 동일한 조직 또는 계통으로부터 유래된 정상 세포 상에서는 검출 가능하지 않은 항원을 지칭한다. 일 구현예에서, 바이러스-특이적 항원은 감염된 세포의 표면 상에서 발현되는 바이러스 단백질이다.
용어 "폴리뉴클레오티드", "핵산" 및 "올리고뉴클레오티드"는 상호 교환적으로 사용되며 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 또는 이의 유사체인, 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 임의의 3 차원 구조를 가질 수 있고, 알려지거나 알려지지 않은 임의의 기능을 수행할 수 있다. 다음은 폴리뉴클레오티드의 비-제한적인 예이다: 유전자 또는 유전자 단편(예를 들어, 프로브, 프라이머, EST 또는 SAGE 태그), 엑손, 인트론, 메신저 RNA(mRNA), 운반 RNA, 리보솜 RNA, 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지형 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브 및 프라이머. 폴리뉴클레오티드는 메틸화된 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체와 같은 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 존재한다면, 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 폴리뉴클레오티드의 조립 전 또는 후에 부여될 수 있다. 뉴클레오티드의 서열은 비-뉴클레오티드 성분에 의해 가로막힐 수 있다. 폴리뉴클레오티드는, 표지 성분과의 접합 등에 의해 중합 후에 추가로 변형될 수 있다. 용어는 또한 이중- 및 단일-가닥 분자 둘 모두를 지칭한다. 달리 명시되거나 요구되지 않는 한, 폴리뉴클레오티드인 본 발명의 임의의 구현예는 이중-가닥 형태, 및 이중-가닥 형태를 구성하는 것으로 알려져 있거나 예측되는 2 개의 상보적인 단일-가닥 형태 각각 둘 모두를 포괄한다.
폴리뉴클레오티드는 4 개의 뉴클레오티드 염기의 특정 서열로 구성된다: 아데닌(A); 시토신(C); 구아닌(G); 티민(T); 및 폴리뉴클레오티드가 RNA인 경우 티민에 대한 우라실(U). 따라서, 용어 "폴리뉴클레오티드 서열"은 폴리뉴클레오티드 분자의 알파벳 표현이다.
"상동성" 또는 "동일성" 또는 "유사성"은 2 개의 펩티드 사이 또는 2 개의 핵산 분자 사이의 서열 유사성을 지칭한다. 상동성은 비교 목적으로 정렬될 수 있는 각 서열에서의 위치를 비교함으로써 결정될 수 있다. 비교되는 서열에서의 위치가 동일한 염기 또는 아미노산에 의해 점유되면, 분자는 그 위치에서 상동이다. 서열 사이의 상동성의 정도는 서열에 의해 공유되는 매칭되는 또는 상동인 위치의 수의 함수이다.
본원에 사용된 "동일성 퍼센트"는 2 개의 펩티드 사이 또는 2 개의 핵산 분자 사이의 서열 동일성을 지칭한다. 동일성 퍼센트는 비교 목적으로 정렬될 수 있는 각 서열에서의 위치를 비교함으로써 결정될 수 있다. 비교되는 서열에서의 위치가 동일한 염기 또는 아미노산에 의해 점유되면, 분자는 그 위치에서 동일하다. 상동 뉴클레오티드 서열은 본원에 제시된 뉴클레오티드 서열의 자연 발생된 대립 유전자 변이체 및 돌연변이를 코딩하는 서열을 포함한다. 상동 뉴클레오티드 서열은 인간 외의 포유류 종의 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 상동 아미노산 서열은, 보존적 아미노산 치환을 함유하고 폴리펩티드가 동일한 결합 및/또는 활성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상동 아미노산 서열은 15 개 이하, 10 개 이하, 5 개 이하 또는 3 개 이하의 보존적 아미노산 치환을 갖는다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열은 본원에 기재된 서열과 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 85% 이상의 동일성 퍼센트를 갖는다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열은 본원에 기재된 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는다. 동일성 퍼센트는, 예를 들어 스미스 및 워터만(Smith and Waterman) 알고리즘(Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482-489)을 사용하는, 갭(Gap) 프로그램(Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for UNIX, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.)에서, 디폴트 설정을 사용하여, 결정될 수 있다. 퍼센트 서열 동일성을 결정하는 데 적합한 알고리즘에는 문헌[Altschul et al.(Nuc. Acids Res. 25:3389-402, 1977), 및 Altschul et al.(J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990)]에 각각 기재된 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이 포함된다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립 생물공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information, 인터넷 ncbi.nlm.nih.gov 참고)를 통해 공개적으로 이용 가능하다. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T, 및 X는 정렬의 민감도와 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램(뉴클레오티드 서열의 경우)은 디폴트로 단어 길이(W) 11, 기대값(E) 또는 10, M = 5, N = -4 및 두 가닥 모두의 비교를 사용한다. 아미노산 서열의 경우, BLASTP 프로그램은 디폴트로 단어 길이 3, 및 기대값(E) 10, 및 BLOSUM62 평점 매트릭스(문헌[Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915, 1989] 참고) 정렬(B) 50, 기대값(E) 10, M = 5, N = -4를 사용한다.
일부 구현예에서, 핵산 서열은 특정 종에서의 발현을 위해 코돈 최적화되며, 예를 들어 마우스 서열은 인간에서의 발현(코돈-최적화된 핵산 서열에 의해 인코딩된 단백질의 발현)을 위해 코돈 최적화될 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 코돈-최적화된 핵산 서열은 본원에 기재된 핵산 서열과 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 85% 이상의 동일성 퍼센트를 갖는다. 일부 구현예에서, 코돈-최적화된 핵산 서열 산 서열은 본원에 기재된 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는다.
용어 "발현하다"는 유전자 산물(예를 들어, 단백질)의 생산을 지칭한다. 발현을 언급할 때 용어 "일시적"은 폴리뉴클레오티드가 세포의 게놈 내로 편입되지 않음을 의미한다. 발현을 언급할 경우, 용어 "안정한"은 폴리뉴클레오티드가 세포의 게놈 내로 편입되거나, 양성 선택 마커(즉, 일정 성장 조건 하에서 이점을 제공하는 세포에 의해 발현되는 외인성 유전자)가 전이 유전자의 발현을 유지하기 위해 사용됨을 의미한다.
용어 "사이토카인" 또는 "사이토카인들"은 면역계의 세포에 영향을 미치는 일반적인 클래스의 생물학적 분자를 지칭한다. 예시적인 사이토카인에는 인터페론 및 인터루킨(IL)(구체적으로 IL-2, IL-12, IL-15, IL-18 및 IL-21)이 포함되나 이에 한정되지 않는다. 바람직한 구현예에서, 사이토카인은 IL-2이다.
본원에 사용된 용어 "벡터"는 벡터가, 예를 들어 형질 전환 과정에 의해, 허용 세포 내에 배치될 때 복제될 수 있도록 온전한 레플리콘을 포함하는 비-염색체 핵산을 지칭한다. 벡터는 박테리아와 같은 일 세포 유형에서 복제될 수 있으나, 포유류 세포와 같은 또 다른 세포에서는 복제 능력이 제한적이거나 전혀 없다. 벡터는 바이러스 또는 비-바이러스일 수 있다. 핵산 전달을 위한 예시적인 비-바이러스 벡터에는 네이키드 DNA; 양이온성 지질과 복합체화된 DNA(단독이거나 양이온성 중합체와 조합됨); 음이온성 및 양이온성 리포좀; 일부 경우에 리포좀에 함유된, 이종 폴리리신, 한정된-길이 올리고펩티드, 및 폴리에틸렌 이민과 같은 양이온성 중합체와 축합된 DNA를 포함하는 DNA-단백질 복합체 및 입자; 및 바이러스 및 폴리리신-DNA를 포함하는 삼원 복합체의 사용이 포함된다. 일 구현예에서, 벡터는 바이러스 벡터, 예를 들어 아데노바이러스이다. 바이러스 벡터는 당업계에 잘 알려져 있다.
단백질 발현을 언급할 때, 본원에 사용된 용어 "표적화된"은 단백질 또는 폴리펩티드를 세포 내 또는 그의 외부의 적절한 목적지로 안내하는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는 것으로 의도된다. 표적화는 전형적으로, 폴리펩티드 사슬 내의 아미노산 잔기의 스트레치인 신호 펩티드 또는 표적화 펩티드를 통해 달성된다. 이들 신호 펩티드는 폴리펩티드 서열 내 어느 곳에나 위치될 수 있으나, 종종 N-말단에 위치한다. 폴리펩티드는 또한 C-말단에 신호 펩티드를 갖도록 조작될 수 있다. 신호 펩티드는 세포외 부분, 원형질막, 골지, 엔도좀, 소포체, 및 기타 세포 구획으로의 위치를 향해 폴리펩티드를 안내할 수 있다. 예를 들어, 그의 C-말단에 특정 아미노산 서열(예를 들어, KDEL)을 갖는 폴리펩티드는 ER 루멘 내에 보유되거나 ER 루멘으로 다시 운반된다.
종양의 표적화를 언급할 때, 본원에 사용된, 용어 "표적"은 종양 세포(즉, 표적 세포)를 인식하고 살해하는 NK-92 세포의 능력을 지칭한다. 이 문맥에서 용어 "표적화된"은, 예를 들어 NK-92 세포에 의해 발현된 CAR이 종양에 의해 발현된 세포 표면 항원을 인식하고 그에 결합하는 능력을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "형질 감염"은 세포 내로의 핵산의 삽입을 지칭한다. 형질 감염은 핵산이 세포로 들어갈 수 있도록 하는 임의의 수단을 사용하여 수행될 수 있다. DNA 및/또는 mRNA는 세포로 형질 감염될 수 있다. 바람직하게는, 형질 감염된 세포는 핵산에 의해 인코딩되는 유전자 산물(즉, 단백질)을 발현한다.
용어 "자살 유전자"는 그 전이 유전자를 발현하는 세포의 음성 선택을 가능하게 하는 전이 유전자를 지칭한다. 자살 유전자는 안전 시스템으로서 사용되어, 유전자를 발현하는 세포가 선택적 제제의 도입에 의해 살해되도록 한다. 단순 헤르페스 바이러스 티미딘 키나제(TK) 유전자, 시토신 데아미나제 유전자, 수두 대상 포진 바이러스 티미딘 키나제 유전자, 니트로리덕타제 유전자, 에스케리키아 콜라이 gpt 유전자, 및 이.콜라이 Deo 유전자를 포함하는, 많은 자살 유전자 시스템이 확인되었다(예를 들어 문헌[Yazawa K, Fisher W E, Brunicardi F C: Current progress in suicide gene therapy for cancer. World J. Surg. 2002 July; 26(7):783-9]을 또한 참고). 일 구현예에서, 자살 유전자는 티미딘 키나제(TK) 유전자이다. TK 유전자는 야생형 또는 돌연변이체 TK 유전자(예를 들어, tk30, tk75, sr39tk)일 수 있다. TK 단백질을 발현하는 세포는 간시클로비르를 사용하여 살해될 수 있다.

Claims (29)

  1. 형질 감염된 재조합 플라스미드 상에서 인코딩되고 단일 폴리펩티드 사슬 내에 세포외 결합 도메인, 힌지 도메인, 막 관통 도메인, 및 FcεRIγ 신호 전달 도메인을 포함하는 막 결합된 재조합 키메라 항원 수용체(CAR)를 갖는 유전적으로 변형된 NK 세포로서, NK 세포는 NK-92 세포인, 유전적으로 변형된 NK 세포.
  2. 제1항에 있어서, 세포외 결합 도메인은 scFv를 포함하는, 유전적으로 변형된 NK 세포.
  3. 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항에 있어서, 세포외 결합 도메인은 종양-특이적 항원, 종양 관련 항원, 또는 환자- 및 종양-특이적 항원에 특이적으로 결합하는, 유전적으로 변형된 NK 세포.
  4. 제3항에 있어서, 종양-특이적 항원은 CD19, CD20, GD2, HER-2, CD30, EGFR, FAP, CD33, CD123, PD-L1, IGF1R, CSPG4, 또는 B7-H4인, 유전적으로 변형된 NK 세포.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 세포외 결합 도메인은 바이러스-특이적 항원에 특이적으로 결합하는, 유전적으로 변형된 NK 세포.
  6. 제5항에 있어서, 바이러스-특이적 항원은 HIV 바이러스, HPV 바이러스, RSV 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 에볼라바이러스, 또는 HCV 바이러스의 항원인, 유전적으로 변형된 NK 세포.
  7. 제5항에 있어서, 바이러스-특이적 항원은 HIV 바이러스의 gp120인, 유전적으로 변형된 NK 세포.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 힌지 도메인 및/또는 막 관통 도메인은 CD8 힌지 도메인 및/또는 CD28 막 관통 도메인을 포함하는, 유전적으로 변형된 NK 세포.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, FcεRIγ 신호 전달 도메인은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 갖는, 유전적으로 변형된 NK 세포.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 막 결합된 재조합 CD16을 추가로 갖는 유전적으로 변형된 NK 세포.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 내형질 체류 서열을 갖는 재조합 사이토카인을 추가로 포함하는 유전적으로 변형된 NK 세포.
  12. 유전적으로 변형된 NK 세포로서,
    키메라 항원 수용체(CAR)를 인코딩하는 재조합 핵산을 포함하며, 재조합 핵산은 형질 감염된 플라스미드이고;
    NK 세포는 NK-92 세포이며;
    CAR은 단일 폴리펩티드 사슬 내에 세포외 결합 도메인, 힌지 도메인, 막 관통 도메인, 및 FcεRIγ 신호 전달 도메인을 포함하는, 유전적으로 변형된 NK 세포.
  13. 제12항에 있어서, 재조합 핵산은 RNA인, 유전적으로 변형된 NK 세포.
  14. 제13항에 있어서, RNA는 내형질 체류 서열을 갖는 CD16 및/또는 사이토카인을 추가로 인코딩하는 폴리시스트론 RNA인, 유전적으로 변형된 NK 세포.
  15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 세포외 결합 도메인은 scFv를 포함하는, 유전적으로 변형된 NK 세포.
  16. 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 세포외 결합 도메인은 종양-특이적 항원, 종양 관련 항원, 또는 환자- 및 종양-특이적 항원에 특이적으로 결합하는, 유전적으로 변형된 NK 세포.
  17. 제16항에 있어서, 종양-특이적 항원은 CD19, CD20, GD2, HER-2, CD30, EGFR, FAP, CD33, CD123, PD-L1, IGF1R, CSPG4, 또는 B7-H4인, 유전적으로 변형된 NK 세포.
  18. 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 세포외 결합 도메인은 바이러스-특이적 항원에 특이적으로 결합하는, 유전적으로 변형된 NK 세포.
  19. 제18항에 있어서, 바이러스-특이적 항원은 HIV 바이러스, HPV 바이러스, RSV 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 에볼라바이러스, 또는 HCV 바이러스의 항원인, 유전적으로 변형된 NK 세포.
  20. 제18항에 있어서, 바이러스-특이적 항원은 HIV 바이러스의 gp120인, 유전적으로 변형된 NK 세포.
  21. 제12항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 힌지 도메인 및/또는 막 관통 도메인은 CD8 힌지 도메인 및/또는 CD28 막 관통 도메인을 포함하는, 유전적으로 변형된 NK 세포.
  22. 제12항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, FcεRIγ 신호 전달 도메인은 SEQ ID NO: 2의 핵산 서열을 갖는, 유전적으로 변형된 NK 세포.
  23. 제1항 내지 제22항의 유전적으로 변형된 NK 세포 중 어느 하나의 치료적 유효량을 환자에게 투여함으로써 암을 치료하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 환자에서 암을 치료하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 바이러스 암 백신, 박테리아 암 백신, 효모 암 백신, N-803, 항체, 줄기 세포 이식물, 및 종양 표적화된 사이토카인으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가적인 치료적 실체를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서, 암은 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수구성 백혈병, 만성 백혈병, 만성 골수구성(과립구성) 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 진성 다혈구증, 림프종, 호지킨(Hodgkin) 병, 비-호지킨 병, 다발성 골수종, 발덴스트롬(Waldenstrom) 거대글로불린 혈증, 중쇄 질병, 고형 종양으로부터 선택되며, 고형 종양은 육종 및 암종, 예컨대 섬유 육종, 점액 육종, 지방 육종, 연골 육종, 골육종, 척삭종, 혈관 육종, 내피 육종, 림프관 육종, 림프관 내피 육종(lymphangioendotheliosarcoma), 활막종, 중피종, 유윙(Ewing) 종양, 평활근 육종, 횡문근 육종, 결장 암종, 췌장암, 유방암, 난소암, 전립선암, 편평 세포 암종, 기저 세포 암종, 선암종, 한선 암종, 피지선 암종, 유두상 암종, 유두상 선암종, 낭선암종, 수질 암종, 기관지원성 암종, 신 세포 암종, 간종양, 담관 암종, 융모 암종, 고환종, 태생성 암종, 윌름(Wilm) 종양, 자궁경부암, 고환 종양, 폐 암종, 소세포 폐 암종, 방광 암종, 상피 암종, 신경교종, 성상세포종, 수모세포종, 두개인두종, 뇌실막종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경종, 희돌기교종, 수막종, 흑색종, 신경모세포종 및 망막모세포종을 포함하나 이에 한정되지 않는, 방법.
  26. 제1항, 제5항, 제6항, 제7항, 제12항, 제18항, 제19항, 또는 제20항의 유전적으로 변형된 NK 세포 중 어느 하나의 치료적 유효량을 환자에게 투여함으로써 바이러스 감염을 치료하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 환자에서 바이러스 감염을 치료하는 방법.
  27. 제26항에 있어서, 항 바이러스 약물을 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  28. 제23항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 환자의 신체 표면적 m2 당 약 1 x 108 개 내지 약 1 x 1011 개의 세포가 환자에게 투여되는 방법.
  29. 암 또는 바이러스 감염의 치료에서의 제12항 내지 제22항 중 어느 한 항의 유전적으로 변형된 NK 세포의 용도.
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