JP2023537871A - キメラ抗原受容体及びその用途 - Google Patents
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Abstract
Y/F突然変異を有するCD3ε細胞内領域を含むキメラ抗原受容体の構造は、順に連結される細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含む。前記細胞内ドメインにおける膜貫通ドメインに連結される一端には、Y/F突然変異を有するCD3ε細胞内領域が連結されている。前記Y/F突然変異を有するCD3ε細胞内領域とは、CD3ε細胞内領域のITAMにおける2つのチロシンがいずれもフェニルアラニンに突然変異したY/F突然変異型CD3ε細胞内領域のことである。キメラ抗原受容体で改変したT細胞は、生存能力が向上し、アポトーシスレベルが低下し、増殖能力が向上し、サイトカインIFN-γ及びTNF-αの発現レベルが下方調節される。【選択図】図1a
Description
本発明は、キメラ抗原受容体の分野に関し、具体的には、Y/F突然変異を有するCD3ε細胞内領域を含むか、CD3ε細胞内塩基性アミノ酸リッチな領域のモチーフを含むキメラ抗原受容体及びその用途に関する。
キメラ抗原受容体は、CAR(chimeric antigen receptor)と略称され、特定の腫瘍抗原を標的とするCARが搭載されたT細胞をCAR-T細胞と称する。CAR-T療法は、腫瘍の治療(特に、固形腫瘍の免疫療法)に幅広く応用されている。本療法は、腫瘍治療における新型の精密標的療法となっており、ここ数年は、最適化や改良を通じて、臨床の腫瘍治療において良好な効果を得ている。つまり、CAR-T療法は、非常に将来性があり、正確、迅速、効率的で、且つ癌を治癒し得る新型の腫瘍免疫療法である。
しかし、CAR-T療法には依然として多くの限界がある。例えば、腫瘍の臨床治療で遭遇するサイトカインストームや、神経毒性の安全性、持続的増殖能力に劣るといった問題がある。2015年、「ランセット」に1つの第I相臨床試験(臨床試験番号:NCT01593696,2015.Lacet.T cells expressing CD19 chimeric antigen receptors for acute lymphoblastic leukaemia in children and young adults-a phase 1dose-escalation trial)が発表された。この発表によると、再発性又は難治性急性リンパ性白血病、或いは非ホジキンリンパ腫に罹患した患者(年齢1~30歳)にKTE-C19(anti-CD19 28Z)CAR-T療法を施してから、体内における血中CAR-T細胞の数を検出したところ、14日目にCAR-T細胞の数がピークに達したが、その後は、28日目、42日目に顕著な逓減が見られ、68日目には全ての患者の血液からCAR-T細胞を検出できなくなったという。更に、2018年にも、「ニューイングランド・ジャーナル・オブ・メディシン」に1つの第I相臨床試験(臨床試験番号:NCT01044069,2018.NEJ.Long-Term Follow-up of CD19 CAR Therapy in Acute Lymphoblastic Leukemia)の結果が発表された。この発表でも、再発性急性リンパ性白血病に罹患した53名の患者にanti-CD19 28Z CAR-T療法を施してから、体内における血中CAR-T細胞の数を検出したところ、中央値が14日目に現れることが示された。これら2つの研究は、いずれも、28Z CAR-T細胞は持続的増殖・生存能力に比較的劣り、治療効果の向上が望まれることを示している。
CAR構造自体の改変を設計するにあたっては、抗腫瘍効果を向上させ、疾病の寛解期を延ばし、再発率を低下させ、患者の生存期間を延ばすために、CAR-T細胞の持続的生存能力を向上させるとの観点から考慮すればよい。上述した従来技術の欠点に鑑みて、本発明の目的は、Y/F突然変異を有するCD3ε細胞内領域を含むか、CD3ε細胞内塩基性アミノ酸リッチな領域のモチーフを含むキメラ抗原受容体及びその用途を提供することである。
上記の目的及び関連するその他の目的を実現するために、本発明は、第1の態様におい
て、Y/F突然変異を有するCD3ε細胞内領域を含むキメラ抗原受容体を提供する。当該キメラ抗原受容体は、順に連結される細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含む。前記細胞外ドメインは抗原認識領域とヒンジ領域を含む。
て、Y/F突然変異を有するCD3ε細胞内領域を含むキメラ抗原受容体を提供する。当該キメラ抗原受容体は、順に連結される細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含む。前記細胞外ドメインは抗原認識領域とヒンジ領域を含む。
前記細胞内ドメインにおける膜貫通ドメインに連結される一端には、Y/F突然変異を有するCD3ε細胞内領域が連結されている。前記Y/F突然変異を有するCD3ε細胞内領域とは、CD3ε細胞内領域の免疫受容体活性化チロシンモチーフ(Immunoreceptor tyrosine-based activation motif,ITAM)における2つのチロシンがいずれもフェニルアラニンに突然変異したY/F突然変異型CD3ε細胞内領域のことである。
本発明は、第2の態様において、ポリヌクレオチド配列を提供する。当該ポリヌクレオチド配列は、(1)本発明の第1の態様で述べたY/F突然変異を有するCD3ε細胞内領域を含むキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド配列と、(2)(1)で述べたポリヌクレオチド配列の相補的配列、から選択される。
本発明は、第3の態様において、核酸構築物を提供する。前記核酸構築物は、本発明の第2の態様で述べたポリヌクレオチド配列を含む。
好ましくは、前記核酸構築物はベクターである。
より好ましくは、前記核酸構築物はレンチウイルスベクターであって、複製起点、3’LTR、5’LTR、及び本発明の第2の態様で述べたポリヌクレオチド配列を含む。
本発明は、第4の態様において、レンチウイルスベクターシステムを提供する。前記レンチウイルスベクターシステムは、本発明の第3の態様で述べた核酸構築物及びレンチウイルスベクターの補助成分を含む。
本発明は、第5の態様において、遺伝子組換えT細胞、又は当該遺伝子組換えT細胞を含む薬物組成物を提供する。特徴として、前記細胞は、本発明の第2の態様で述べたポリヌクレオチド配列を含むか、本発明の第3の態様で述べた核酸構築物を含むか、本発明の第4の態様で述べたレンチウイルスベクターシステムに感染している。
本発明は、第6の態様において、本発明の第1の態様で述べたY/F突然変異を有するCD3ε細胞内領域を含むキメラ抗原受容体、本発明の第2の態様で述べたポリヌクレオチド配列、本発明の第3の態様で述べた核酸構築物、又は本発明の第4の態様で述べたレンチウイルスベクターシステムの、(1)T細胞の作製、(2)T細胞の生存能力の向上、(3)T細胞アポトーシスの阻害、(4)T細胞の増殖及び/又は生存能力の強化、(5)T細胞の抗腫瘍能力の向上、(6)T細胞からのサイトカインIFN-γレベルの抑制及びTNF-αの分泌阻害、のうちのいずれか1つ又は複数の用途の製品の製造における応用を提供する。
本発明は、第7の態様において、本発明の第1の態様で述べたY/F突然変異を有するCD3ε細胞内領域を含むキメラ抗原受容体、本発明の第2の態様で述べたポリヌクレオチド配列、本発明の第3の態様で述べた核酸構築物、本発明の第4の態様で述べたレンチウイルスベクターシステム、又は本発明の第5の態様で述べた遺伝子組換えT細胞の、腫瘍治療製品の製造における応用を提供する。
上述したように、本発明におけるY/F突然変異を有するCD3ε細胞内領域を含むキメラ抗原受容体及びその用途は、以下の有益な効果を有する。
本発明におけるキメラ抗原受容体で改変したT細胞は、生存能力の向上、アポトーシスレベルの低下、増殖能力の向上により、T細胞の持続性を顕著に向上させて、T細胞の抗腫瘍能力を著しく向上させることが可能である。この優位性により、臨床応用において、更に腫瘍治療効果を向上させ、疾病の寛解期を延ばし、再発率を低下させ、患者の生存期間を延ばすことが可能となる。且つ、当該改変T細胞は、サイトカインIFN-γ及びTNF-αの発現レベルを下方調節して、マクロファージ及び単球の活性化によるIL-1β及びIL-6といった炎症性サイトカインの産生を低下させることが可能である。
上記の目的及び関連するその他の目的を実現するために、本発明は、第8の態様において、CD3ε細胞内塩基性アミノ酸リッチな領域のモチーフを含むキメラ抗原受容体を提供する。当該キメラ抗原受容体は、順に連結される細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含む。
前記細胞外ドメインは抗原認識領域とヒンジ領域を含む。
前記細胞内ドメインにおける膜貫通ドメインに連結される一端にはCD3ε細胞内塩基性アミノ酸リッチな領域のモチーフが連結されている。
本発明は、第9の態様において、ポリヌクレオチド配列を提供する。当該ポリヌクレオチド配列は、(1)本発明の第8の態様で述べたCD3ε細胞内塩基性アミノ酸リッチな領域のモチーフを含むキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド配列と、(2)(1)で述べたポリヌクレオチド配列の相補的配列、から選択される。
本発明は、第10の態様において、核酸構築物を提供する。前記核酸構築物は、本発明の第9の態様で述べたポリヌクレオチド配列を含む。
好ましくは、前記核酸構築物はベクターである。
より好ましくは、前記核酸構築物はレンチウイルスベクターであって、複製起点、3’LTR、5’LTR、及び本発明の第9の態様で述べたポリヌクレオチド配列を含む。
本発明は、第11の態様において、レンチウイルスベクターシステムを提供する。前記レンチウイルスベクターシステムは、本発明の第10の態様で述べた核酸構築物及びレンチウイルスベクターの補助成分を含む。
本発明は、第12の態様において、遺伝子組換えT細胞、又は当該遺伝子組換えT細胞を含む薬物組成物を提供する。特徴として、前記細胞は、本発明の第9の態様で述べたポリヌクレオチド配列を含むか、本発明の第10の態様で述べた核酸構築物を含むか、本発明の第11の態様で述べたレンチウイルスベクターシステムに感染している。
本発明は、第13の態様において、本発明の第8の態様で述べたCD3ε細胞内塩基性アミノ酸リッチな領域のモチーフを含むキメラ抗原受容体、本発明の第9の態様で述べたポリヌクレオチド配列、本発明の第10の態様で述べた核酸構築物、又は本発明の第11の態様で述べたレンチウイルスベクターシステムの、(1)T細胞の作製、(2)T細胞の生存能力の向上、(3)T細胞アポトーシスの阻害、(4)T細胞の増殖能力の強化、(5)T細胞の抗腫瘍能力の向上、(6)T細胞からのサイトカインIFN-γレベルの抑制、のうちのいずれか1つ又は複数の用途の製品の製造における応用を提供する。
本発明は、第14の態様において、本発明の第8の態様で述べたCD3ε細胞内塩基性
アミノ酸リッチな領域のモチーフを含むキメラ抗原受容体、本発明の第9の態様で述べたポリヌクレオチド配列、本発明の第10の態様で述べた核酸構築物、本発明の第11の態様で述べたレンチウイルスベクターシステム、又は本発明の第12の態様で述べた遺伝子組換えT細胞の、腫瘍治療製品の製造における応用を提供する。
アミノ酸リッチな領域のモチーフを含むキメラ抗原受容体、本発明の第9の態様で述べたポリヌクレオチド配列、本発明の第10の態様で述べた核酸構築物、本発明の第11の態様で述べたレンチウイルスベクターシステム、又は本発明の第12の態様で述べた遺伝子組換えT細胞の、腫瘍治療製品の製造における応用を提供する。
上述したように、本発明におけるCD3ε細胞内塩基性アミノ酸リッチな領域のモチーフを含むキメラ抗原受容体及びその用途は、以下の有益な効果を有する。
本発明におけるCD3ε細胞内塩基性アミノ酸リッチな領域のモチーフを含むキメラ抗原受容体で改変したT細胞は、生存能力の向上、アポトーシスレベルの低下、増殖能力の向上によって、T細胞の持続性を顕著に向上させて、T細胞の抗腫瘍能力を著しく向上させることが可能である。この優位性により、臨床応用において、更に腫瘍治療効果を向上させ、疾病の寛解期を延ばし、再発率を低下させ、患者の生存期間を延ばすことが可能となる。且つ、当該改変T細胞は、サイトカインIFNγの発現レベルを下方調節して、マクロファージ及び単球の活性化によるIL-1β及びIL-6といった炎症性サイトカインの産生を低下させることが可能である。
本発明で記載するY/F突然変異を有するCD3ε細胞内領域を含むキメラ抗原受容体は、順に連結される細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含む。
前記細胞外ドメインは抗原認識領域とヒンジ領域を含む。
前記細胞内ドメインにおける膜貫通ドメインに連結される一端には、Y/F突然変異を有するCD3ε細胞内領域が連結されている。前記Y/F突然変異を有するCD3ε細胞内領域とは、CD3ε細胞内領域の免疫受容体活性化チロシンモチーフ(Immunoreceptor tyrosine-based activation motif,ITAM)における2つのチロシンがいずれもフェニルアラニンに突然変異したY/F突然変異型CD3ε細胞内領域のことである。
更に、前記Y/F突然変異を有するCD3ε細胞内領域のアミノ酸配列は、SEQ ID NO:1に示す通りであり、具体的には、KNRKAKAKPVTRGAGAGGRQRGQNKERPPPVPNPDFEPIRKGQRDLFSGLNQRRIである。
前記細胞内ドメインは、順に連結されるY/F突然変異を有するCD3ε細胞内領域(当該細胞内領域のITAMモチーフにおける2つのチロシンがフェニルアラニンに突然変異している)、共刺激シグナル伝達領域の細胞内領域及びCD3ζ細胞内セグメントを含む。
一実施形態において、前記共刺激シグナル伝達領域は、CD27、CD28、CD134、4-1BB、OX40又はICOSのうちの1つ又は複数の細胞内セグメントから選択される。
更に好ましい実施形態において、前記共刺激シグナル伝達領域はCD28細胞内セグメントから選択される。この場合、殺傷能力がより強くなる。
CD28細胞内セグメントのアミノ酸配列は、SEQ ID NO:2に示す通りであり、具体的には以下とする。
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS。
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一実施形態において、前記CD3ζ細胞内セグメントのアミノ酸配列はSEQ ID N
O:3に示す通りである。具体的には、以下とする。
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR。
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一実施形態において、前記抗原認識領域は、腫瘍表面抗原を標的とする一本鎖抗体から選択される。また、前記腫瘍表面抗原は、CD19、メソテリン(mesothelin)、CD20、CD22、CD123、CD30、CD33、CD38、CD138、BCMA、線維芽細胞活性化タンパク質(Fibroblast activation protein(FAP))、グリピカン-3(Glypican-3)、CEA、EGFRvIII、PSMA、Her2、IL13Rα2、CD171及びGD2のうちの1つ又は複数から選択される。
好ましくは、標的特異性が良好なCD19又はメソテリンから選択される。
前記膜貫通ドメインは、CD28、CD4、CD8α、OX40又はH2-Kbのうちの1つ又は複数の膜貫通領域から選択される。
好ましくは、前記膜貫通ドメインはCD28の膜貫通領域から選択される。具体的に、前記CD28の膜貫通領域のアミノ酸配列はSEQ ID NO:4に示す通りである。具体的には、FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVとする。
前記ヒンジ領域は、CD28ヒンジ領域、CD8αヒンジ領域、CD4ヒンジ領域、免疫グロブリンIgGのヒンジ領域、又は免疫グロブリンIgGのヒンジ領域とCH2CH3領域が連結したヒンジ領域のうちの1つ又は複数から選択される。即ち、IgG1 hinge又はIgG1 hinge-CH2CH3とすることができる。
選択的に、前記ヒンジ領域の配列はCD28ヒンジ領域(CD28 hinge)である。また、アミノ酸構造はSEQ ID NO:7に示す通りである。具体的には、IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPとする。
一実施形態において、前記一本鎖抗体は、軽鎖可変領域と重鎖可変領域を含む。
一実施形態において、前記軽鎖可変領域と前記重鎖可変領域はリンカー配列で連結されている。
一実施形態において、前記一本鎖抗体はFMC63から選択される。
FMC63には、市販の製品を使用可能である。
一実施形態において、前記一本鎖抗体は、モノクローナル抗体FMC63の軽鎖可変領域と重鎖可変領域を含み、前記軽鎖可変領域と重鎖可変領域が選択的にリンカー配列で連結されている。
一実施形態において、前記Y/F突然変異を有するCD3ε細胞内領域を含むキメラ抗原受容体の抗原認識領域はFMC63から選択され、ヒンジ領域はCD28ヒンジ領域から選択される。また、前記膜貫通ドメインはCD28膜貫通領域から選択される。細胞内ドメインは、順に連結されるY/F突然変異を有するCD3ε細胞内領域、CD28の細胞内セグメント及びCD3ζ細胞内セグメントを含む。
一実施形態において、前記Y/F突然変異を有するCD3ε細胞内領域を含むキメラ抗原受容体(Anti-CD19 EYF28Z CAR)のアミノ酸配列はSEQ ID NO:5に示す通りであり、具体的には以下とする。
SEQ ID NO:5(Anti-CD19 EYF28Z CARのアミノ酸配列):(5’→3’)FMC63 scFvから開始して、順に、CD28ヒンジ領域、CD28膜貫通領域、Y/F突然変異を有するCD3ε細胞内領域及びCD3ζ細胞内領域となるよう連結されている。
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVKNRKAKAKPVTRGAGAGGRQRGQNKERPPPVPNPDFEPIRKGQRDLFSGLNQRRIRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR。
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SEQ ID NO:5(Anti-CD19 EYF28Z CARのアミノ酸配列)に対応するヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:6(Anti-CD19 EYF28Z CARのヌクレオチド配列)である。SEQ ID NO:6は次の通りとする(5’→3’)。
gacatccagatgacacagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcagttgcagggcaagtcaggacattagtaaatatttaaattggtatcagcagaaaccagatggaactgttaaactcctgatctaccatacatcaagattacactcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctggaacagattattctctcaccattagcaacctggagcaagaagatattgccacttacttttgccaacagggtaatacgcttccgtacacgttcggaggggggactaagttggaaataacaggctccacctctggatccggcaagcccggatctggcgagggatccaccaagggcgaggtgaaactgcaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccgtcacatgcactgtctcaggggtctcattacccgactatggtgtaagctggattcgccagcctccacgaaagggtctggagtggctgggagtaatatggggtagtgaaaccacatactataattcagctctcaaatccagactgaccatcatcaaggacaactccaagagccaagttttcttaaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagccatttactactgtgccaaacattattactacggtggtagctatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcagcggccgcaattgaagttatgtatcctcctccttacctagacaatgagaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacctttgtccaagtcccctatttcccggaccttctaagcccttttgggtgctggtggtggttgggggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagt
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本発明で記載するCD3ε細胞内塩基性アミノ酸リッチな領域のモチーフを含むキメラ抗原受容体は、順に連結される細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含む。
前記細胞外ドメインは抗原認識領域とヒンジ領域を含む。
前記細胞内ドメインにおける膜貫通ドメインに連結される一端には、BRSモチーフと略称されるCD3ε細胞内塩基性アミノ酸リッチな領域のモチーフ(Basic residue Rich Sequence)が連結されている。
更に、前記CD3ε細胞内塩基性アミノ酸リッチな領域のモチーフのアミノ酸配列はSEQ ID NO:10に示す通りであり、具体的にはKNRKAKAKとする。
前記細胞内ドメインは、順に連結されるCD3ε細胞内塩基性アミノ酸リッチな領域のモチーフ、共刺激シグナル伝達領域及びCD3ζ細胞内セグメントを含む。
一実施形態において、前記共刺激シグナル伝達領域は、CD27、CD28、CD134、4-1BB、OX40又はICOSのうちの1つ又は複数の細胞内セグメントから選択される。
更に好ましい実施形態において、前記共刺激シグナル伝達領域はCD28の細胞内セグメントから選択される。この場合、殺傷能力がより強くなる。
CD28の細胞内セグメントのアミノ酸配列はSEQ ID NO:2に示す通りであり、具体的には、RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSとする。
一実施形態において、前記CD3ζ細胞内セグメントのアミノ酸配列はSEQ ID NO:3に示す通りである。具体的には、以下とする。
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR。
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR。
一実施形態において、前記抗原認識領域は、腫瘍表面抗原を標的とする一本鎖抗体から選択される。また、前記腫瘍表面抗原は、CD19、メソテリン(mesothelin)、CD20、CD22、CD123、CD30、CD33、CD38、CD138、BCMA、線維芽細胞活性化タンパク質(Fibroblast activation protein(FAP))、グリピカン-3(Glypican-3)、CEA、EGFRvIII、PSMA、Her2、IL13Rα2、CD171及びGD2のうちの1つ又は複数から選択される。
好ましくは、前記腫瘍表面抗原は、標的特異性が良好なCD19又はメソテリンから選択される。
更に、前記膜貫通ドメインは、CD28、CD4、CD8α、OX40又はH2-Kbのうちの1つ又は複数の膜貫通領域から選択される。
好ましくは、前記膜貫通ドメインはCD28の膜貫通領域から選択される。具体的に、前記CD28の膜貫通領域のアミノ酸配列はSEQ ID NO:4に示す通りである。具体的には、FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVとする。
前記ヒンジ領域は、CD28ヒンジ領域、CD8αヒンジ領域、CD4ヒンジ領域、免疫グロブリンIgGのヒンジ領域、又は免疫グロブリンIgGのヒンジ領域とCH2CH3領域が連結したヒンジ領域のうちの1つ又は複数から選択される。即ち、IgG1 hinge又はIgG1 hinge-CH2CH3とすることができる。
選択的に、前記ヒンジ領域の配列はCD28ヒンジ領域(CD28 hinge)である。また、アミノ酸構造はSEQ ID NO:7に示す通りである。具体的には、IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPとする。
一実施形態において、前記一本鎖抗体は、軽鎖可変領域と重鎖可変領域を含む。
一実施形態において、前記軽鎖可変領域と前記重鎖可変領域はリンカー配列で連結されている。
一実施形態において、前記一本鎖抗体はFMC63から選択される。
FMC63には、市販の製品を使用可能である。
一実施形態において、前記一本鎖抗体は、モノクローナル抗体FMC63の軽鎖可変領域と重鎖可変領域を含み、前記軽鎖可変領域と重鎖可変領域が選択的にリンカー配列で連結されている。
前記CD3ε細胞内塩基性アミノ酸リッチな領域のモチーフを含むキメラ抗原受容体の抗原認識領域はFMC63から選択され、ヒンジ領域はCD28ヒンジ領域から選択される。また、前記膜貫通ドメインはCD28膜貫通領域から選択される。細胞内ドメインは、順に連結されるCD3ε細胞内塩基性アミノ酸リッチな領域のモチーフ、CD28の細胞内セグメント及びCD3ζ細胞内セグメントを含む。
一実施形態において、CD3ε細胞内塩基性アミノ酸リッチな領域のモチーフを含むキメラ抗原受容体(Anti-CD19 EBRS28Z CAR)は、FMC63 scFv、CD28ヒンジ領域、CD28の膜貫通領域、CD3εBRSモチーフ及びCD3ζ細
胞内領域を含む。
胞内領域を含む。
一実施形態において、CD3ε細胞内塩基性アミノ酸リッチな領域のモチーフを含むキメラ抗原受容体(Anti-CD19 EBRS28Z CAR)のアミノ酸配列はSEQ
ID NO:11に示す通りであり、具体的には、以下とする。
ID NO:11に示す通りであり、具体的には、以下とする。
SEQ ID NO:11(Anti-CD19 EBRS28Z CARのアミノ酸配列):(5’→3’)FMC63 scFvから開始して、順に、CD28ヒンジ領域、CD28の膜貫通領域、CD3εBRSモチーフ及びCD3ζ細胞内領域となるよう連結されている。
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVKNRKAKAKRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR。
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Anti-CD19 EBRS28Z CARのアミノ酸配列に対応するヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:12(Anti-CD19 EBRS28Z CARのヌクレオチド配列)である。SEQ ID NO:12は次の通りとする(5’→3’)。
gacatccagatgacacagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcagttgcagggcaagtcaggacattagtaaatatttaaattggtatcagcagaaaccagatggaactgttaaactcctgatctaccatacatcaagattacactcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctggaacagattattctctcaccattagcaacctggagcaagaagatattgccacttacttttgccaacagggtaatacgcttccgtacacgttcggaggggggactaagttggaaataacaggctccacctctggatccggcaagcccggatctggcgagggatccaccaagggcgaggtgaaactgcaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccgtcacatgcactgtctcaggggtctcattacccgactatggtgtaagctggattcgccagcctccacgaaagggtctggagtggctgggagtaatatggggtagtgaaaccacatactataattcagctctcaaatccagactgaccatcatcaaggacaactccaagagccaagttttcttaaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagccatttactactgtgccaaacattattactacggtggtagctatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcagcggccgcaattgaagttatgtatcctcctccttacctagacaatgagaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacctttgtccaagtcccctatttcccggaccttctaagcccttttgggtgctggtggtggttgggggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaagaatagaaaggccaag
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本発明のキメラ抗原受容体を形成する上記各部分は、互いを直接連結してもよいし、リンカー配列を介して連結してもよい。リンカー配列は、当該分野において周知の抗体に適用されるリンカー配列とすればよく、例えば、G及びSを含むリンカー配列とする。通常、リンカーは、前後で繰り返される1つ又は複数のモチーフを含む。例えば、当該モチーフは、GGGS、GGGGS、SSSSG、GSGSA及びGGSGGとすることができる。好ましくは、当該モチーフは、リンカー配列において隣接しており、繰り返し間にアミノ酸残基は挿入されない。リンカー配列は、1個、2個、3個、4個又は5個の繰り返しモチーフを含んで構成可能である。リンカーの長さは3~25個のアミノ酸残基とすることができ、例えば、3~15個、5~15個、10~20個のアミノ酸残基とする。いくつかの実施方案において、リンカー配列はポリグリシンリンカー配列である。リンカー配列中のグリシンの数に特に制限はなく、通常は2~20個とし、例えば、2~15個、2~10個、2~8個とする。グリシン及びセリン以外にも、リンカーは、その他の既知のアミノ酸残基(例えば、アラニン(A)、ロイシン(L)、トレオニン(T)、グルタミン酸(E)、フェニルアラニン(F)、アルギニン(R)、グルタミン(Q)等)を含み得る。
理解すべき点として、遺伝子クローン操作では、適切な酵素切断部位の設計を要することが多い。その場合、発現するアミノ酸配列の末端に必然的に1つ又は複数の無関係な残基が導入されるが、これが標的配列の活性に影響することはない。また、融合タンパク質の作製、組換えタンパク質の発現促進、宿主細胞外に自動的に分泌される組換えタンパク質の取得、或いは組換えタンパク質の有利な精製のためには、組換えタンパク質のN-末端、C-末端又は当該タンパク質中のその他の適切な領域内に何らかのアミノ酸を添加せねばならないことが多い(例えば、適切なリンカーペプチド、シグナルペプチド、リーダーペプチド、末端伸長等を含むが、これらに限らない)。シグナルペプチドについては、仮に次のように考えられる。即ち、分泌タンパク質をコードするmRNAの翻訳時にまず合成されるのは、N末端に疎水性アミノ酸残基を有するシグナルペプチドである。シグナルペプチドは、小胞体膜上の受容体に認識されて結合する。シグナルペプチドは、膜中タンパク質により形成されるトンネルを経由して小胞体の内腔に到達すると、内腔表面に位置するシグナルペプチダーゼにより加水分解される。シグナルペプチドの誘導により、新生ポリペプチドは小胞体膜を通過して内腔に進入可能となり、最終的に細胞外に分泌される。CARのシグナルペプチドについては異なる取得源があり、主に、CD8及びCD28、GM-CSF受容体のシグナルペプチドがある。本発明の融合タンパク質(即ち、上記のCAR)のN末端又はC末端は、タンパク質タグとして、1つ又は複数のポリペプチドフラグメントを更に含んでもよい。本文では、任意の適切なタグをいずれも使用可能である。例えば、前記タグは、FLAG、HA、HA1、c-Myc、Poly-His、Poly-Arg、Strep-TagII、AU1、EE、T7、4A6、ε、B、gE及びTy1とすることができる。これらのタグは、タンパク質の精製に使用可能である。
本発明で提供するポリヌクレオチド配列は、(1)上記キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド配列と、(2)(1)で述べたポリヌクレオチド配列の相補的配列、から選択される。
本発明のポリヌクレオチド配列は、DNA形式であってもよいし、RNA形式であってもよい。DNA形式は、cDNA、ゲノムDNA又は人工的に合成されたDNAを含む。DNAは、1本鎖であってもよいし、2本鎖であってもよい。DNAは、コード鎖であってもよいし、非コード鎖であってもよい。本発明は、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の縮重バリアント(即ち、同一のアミノ酸配列をコードするがヌクレオチド配列の一部が異なるヌクレオチド配列)も含む。
通常、本文中で記載するポリヌクレオチド配列はPCR増幅法で取得可能である。具体的には、本文中で開示するヌクレオチド配列(特に、オープンリーディングフレーム配列)に基づいてプライマーを設計し、市販のcDNAライブラリか、当業者にとって既知の一般的な方法で作製したcDNAライブラリを鋳型として用い、増幅することで関連の配列を取得する。配列が長い場合には、2回又は複数回のPCR増幅を行ったあと、各回で増幅した断片を正しい順序で連結せねばならないことが多い。
本発明で提供する核酸構築物は、上記のポリヌクレオチド配列を含む。
前記核酸構築物は、更に、上記のポリヌクレオチド配列に操作的に連結される1つ又は複数の調節配列を含む。本発明で記載するCARのコード配列は、前記タンパク質の発現を保証するために、様々な方式で操作可能である。核酸構築物をベクターに挿入する前に、発現ベクターの違いや要求に応じて、核酸構築物を操作してもよい。組換えDNA手法を利用してポリヌクレオチド配列を改変する技術は、当該分野において既知である。
調節配列は、適切なプロモーター配列とすることができる。通常、プロモーター配列は、発現されるタンパク質のコード配列に操作的に連結される。プロモーターは、選択された宿主細胞において転写活性を示すいずれのヌクレオチド配列としてもよく、突然変異したもの、切断されたもの、及び雑種プロモーターを含む。且つ、当該宿主細胞と同種又は異種の細胞外又は細胞内のポリペプチドをコードする遺伝子から取得可能である。
調節配列は、適切な転写ターミネーター配列、つまり、宿主細胞に認識されることで転写を終結させる配列としてもよい。ターミネーター配列は、当該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の3’末端に操作的に連結される。選択された宿主細胞において機能を有するあらゆるターミネーターを本発明に使用可能である。
調節配列は、宿主細胞の翻訳にとって重要なmRNAの非翻訳領域である適切なリーダー配列としてもよい。リーダー配列は、当該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の5’末端に操作可能に連結される。選択された宿主細胞において機能を有するあらゆるターミネーターを本発明に使用可能である。
好ましくは、前記核酸構築物はベクターである。
通常は、CARをコードするポリヌクレオチド配列を操作可能にプロモーターに連結し、構築物を発現ベクターに組み込むことで、CARをコードするポリヌクレオチド配列の発現を実現する。当該ベクターは、真核細胞の複製及び統合に適したものとすればよい。代表的なクローニングベクターは、所望の核酸配列の発現を調節可能な転写及び翻訳のターミネーター、開始配列及びプロモーターを含む。
本発明のCARをコードするポリヌクレオチド配列は、数多くのタイプのベクターにクローニング可能である。例えば、プラスミド、バクテリオファージ、ファージ誘導体、動物ウイルス及びコスミドにクローニング可能である。更に、ベクターは発現ベクターである。発現ベクターは、ウイルスベクター形式で細胞に提供可能である。ウイルスベクター技術は当該分野において公知である。ベクターとして用い得るウイルスには、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス及びレンチウイルスが含まれる(ただし、これらに限らない)。通常、適切なベクターには、少なくとも1つの有機体において役割を発揮する複製起点、プロモーター配列、都合のよい制限酵素部位、及び1つ又は複数の選択可能なマーカーが含まれる。
より好ましくは、前記核酸構築物はレンチウイルスベクターであって、複製起点、3’LTR、5’LTR及び前記ポリヌクレオチド配列を含む。
適切なプロモーターの一例としては、最初期サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター配列が挙げられる。当該プロモーター配列は、自身に操作可能に連結される任意のポリヌクレオチド配列を高水準で発現可能とする強い構成型プロモーター配列である。適切なプロモーターの別の例としては、伸長因子-1α(EF-1α)が挙げられる。ただし、シミアンウイルス40(SV40)の初期プロモーター、マウス乳癌ウイルス(MMTV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)の長い末端反復(LTR)プロモーター、MoMuLVプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、EBウイルスの最初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、及びヒト遺伝子プロモーター(例えば、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘムプロモーター及びクレアチンキナーゼプロモーター。ただし、これらに限らない)を含む(ただし、上記に限らない)その他の構成型プロモーター配列を使用してもよい。更に、誘導型プロモーターの使用を検討してもよい。誘導型プロモーターを使用することで分子スイッチが提供される。分子スイッチは、発現を期待する時に、誘導型プロモーターに操作可能に連結されているポリヌクレオチド配列の発現をオンとすることができ、発現を期待しない場合には発現をオフとする。誘導型プロモーターの例には、メタロチオネインプロモーター、糖質コルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター及びテトラサイクリンプロモーターが含まれる(ただし、これらに限らない)。
CARのポリペプチド又はその部分の発現を評価するために、細胞に導入される発現ベクターは、選択可能なマーカー遺伝子又はレポーター遺伝子うちのいずれか一方又は双方を含んでもよい。このことは、ウイルスベクターによってトランスフェクション又は感染を試みた細胞群から発現細胞を鑑定及び選択するのに都合がよい。他方で、選択可能なマーカーは、単独のDNA断片に保持されてコトランスフェクション手順に使用することが可能である。選択可能なマーカー及びレポーター遺伝子の双方のフランキングは、宿主細胞内で発現可能となるよう、いずれも適切な調節配列を有し得る。有効な選択可能なマーカーには、例えばneoなどの抗生物質耐性遺伝子が含まれる。
レポーター遺伝子は、潜在的にトランスフェクションされた細胞の鑑定に用いられるとともに、調節配列の機能性評価にも用いられる。DNAが受容細胞に導入されたあと、レポーター遺伝子の発現が適切なタイミングで測定される。適切なレポーター遺伝子には、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼ又は緑色蛍光タンパク質遺伝子をコードする遺伝子が含まれ得る。また、適切な発現システムは、公知且つ既知の技術で作製可能であるか、商業的に取得される。
遺伝子を細胞に導入する方法及び遺伝子を細胞に発現させる方法は、当該分野において既
知である。ベクターは、当該分野における任意の方法で容易に宿主細胞(例えば、哺乳動物、細菌、酵母又は昆虫の細胞)に導入可能である。例えば、発現ベクターは、物理、化学又は生物学的手段で宿主細胞に導入可能である。
知である。ベクターは、当該分野における任意の方法で容易に宿主細胞(例えば、哺乳動物、細菌、酵母又は昆虫の細胞)に導入可能である。例えば、発現ベクターは、物理、化学又は生物学的手段で宿主細胞に導入可能である。
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する物理的方法には、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、粒子衝撃、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション等が含まれる。また、興味のあるポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する生物学的方法には、DNA及びRNAベクターを使用する方法が含まれる。また、ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する化学的手段には、例えば、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズといったコロイド分散系や、水中油型乳剤、ミセル、混合ミセル及びリポソームを含む脂質ベースのシステムが含まれる。
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する生物学的方法には、ウイルスベクター(特に、レンチウイルスベクター)を使用する方法が含まれる。これは、遺伝子を哺乳動物(例えば、ヒト)の細胞に導入するための最も汎用的な方法となっている。その他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスI型、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス等から入手可能である。遺伝子を哺乳動物の細胞に導入するための数多くのウイルスベースのシステムがすでに開発されており、例えば、レンチウイルスによって、遺伝子導入システムに用いられる便利なプラットフォームが提供されている。当該分野において既知の技術を用いれば、選択した遺伝子をベクターに導入し、レンチウイルス粒子にパッケージングすることが可能である。当該組換えウイルスは、その後分離して体内又は体外の対象細胞に導入可能となる。当該分野では、数多くのレトロウイルスシステムが知られている。また、いくつかの実施方案では、アデノウイルスベクターを使用する。当該分野では、数多くのアデノウイルスベクターが知られている。また、一実施方案では、レンチウイルスベクターを使用する。
本発明は、レンチウイルスベクターシステムを提供する。前記レンチウイルスベクターシステムは、上述した核酸構築物及びレンチウイルスベクターの補助成分を含む。
前記レンチウイルスの補助成分は、レンチウイルスパッケージングプラスミドと細胞株を含む。
前記レンチウイルスベクターシステムは、レンチウイルスパッケージングプラスミド及び細胞株の補助のもと、前記核酸構築物がウイルスパッケージングされてなる。前記レンチウイルスベクターシステムの構築方法は、当該分野において常用される方法である。
本発明は、T細胞の体外活性化方法を提供する。前記方法は、前記レンチウイルスを使用して前記T細胞を感染させるステップを含む。
ほかの薬物療法と比較すると、CAR-T細胞が持つ自己増殖及び生存維持能力に基づき、CAR-T細胞は体内で長時間維持することが可能である。また、標的とする特異抗原の刺激を受けると急速に増幅し、標的を有する腫瘍細胞を殺傷し得るとともに、その後は、例えばエフェクター記憶細胞(effector memory T cell)やセントラル記憶細胞(central memory T cell)といった特異的記憶細胞を形成可能である。
本発明は、更に、細胞療法を含む。当該細胞療法において、T細胞は本文中で記載するCARを発現するよう遺伝子組換えがなされる。また、CAR-T細胞は、これを必要とする適用者に注入される。注入された細胞は、適用者の腫瘍細胞を殺傷可能である。抗体療法とは異なり、CAR-T細胞は体内で複製可能であって、持続的に腫瘍を制御可能な長
期持続性を発揮する。
期持続性を発揮する。
CAR-T細胞に起因する抗腫瘍免疫反応は、能動的又は受動的な免疫反応となり得る。このほか、CARにより誘導される免疫反応は、養子免疫細胞療法のステップの一部分となり得る。CAR-T細胞は、CARの抗原結合部分について特異的な免疫反応を誘導する。
治療可能な癌は、血液腫瘍(例えば、白血病やリンパ腫)のような非固形腫瘍とすることができる。特に、本発明のCAR、そのコード配列、核酸構築物、発現ベクター、ウイルス及びCAR-T細胞を用いて治療可能な疾病は、好ましくはCD19誘導性の疾病であり、特にCD19誘導性の血液腫瘍である。
具体的に、本文中の「CD19誘導性の疾病」には、例えば、B細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、ヘアリー細胞白血病及び急性骨髄性白血病といった白血病及びリンパ腫が含まれる(ただし、これらに限らない)。
本発明は、遺伝子組換えT細胞、又は当該遺伝子組換えT細胞を含む薬物組成物を提供する。前記細胞は、前記ポリヌクレオチド配列を含むか、前記核酸構築物を含むか、前記レンチウイルスベクターシステムに感染している。
本発明のCAR-修飾T細胞は、単独で投与してもよいし、薬物組成物として、希釈剤及び/又はその他の成分(例えば、関連のサイトカイン又は細胞群)と組み合わせて投与してもよい。簡単に言うと、本発明の薬物組成物には、本文中で記載したCAR-T細胞と、1又は複数種類の薬学的又は生理学的に許容可能なベクター、希釈剤又は賦形剤の組み合わせが含まれ得る。このような組成物には、緩衝液(例えば、中性緩衝生理食塩水、硫酸塩緩衝生理食塩水等)、炭水化物(例えば、グルコース、マンノース、ショ糖又はデキストラン、マンニトール)、タンパク質、ポリペプチド又はアミノ酸(例えばグリシン)、抗酸化剤、キレート剤(例えば、EDTA又はグルタチオン)、アジュバント(例えば、水酸化アルミニウム)、及び防腐剤が含まれ得る。
本発明の薬物組成物は、治療(又は予防)対象の疾病に適した方式で投与される。投与の数量及び頻度は、例えば、患者の病症、患者の疾病タイプ及び深刻度といった要素から決定する。
「免疫学的有効量」、「抗腫瘍有効量」、「腫瘍-抑制有効量」又は「治療量」を示す場合、投与される本発明の組成物の正確な量は医師により決定可能である。その際には、患者(対象)の年齢、体重、腫瘍の大きさ、感染又は転移の程度及び病症の個体差が考慮される。通常、本文中で記載するT細胞を含む薬物組成物の投与量は、104~109細胞/kg(体重)、好ましくは、105~106細胞/kg(体重)とすることができる。T細胞組成物は、これらの投与量で複数回投与してもよい。細胞は、免疫療法において公知の注入技術で投与可能である。具体的な患者に対する最適な投与量及び治療プランについては、患者の疾病の兆候を観察し、それにより治療を調節することで、医療分野の技術者により容易に決定可能である。
対象組成物の投与は、噴霧法、注射、内服、点滴、埋め込み又は移植を含む任意の都合の良い方式で実施可能である。本文中で記載する組成物は、皮下、皮内、腫瘍内、結節内、脊髄内、筋肉内、静脈内注射又は腹膜内注射によって患者に投与可能である。一実施方案において、本発明のT細胞組成物は、皮内又は皮下注射によって患者に投与する。別の実施方案において、本発明のT細胞組成物は、好ましくは静脈注射によって投与する。また、T細胞組成物は、腫瘍、リンパ節又は感染部位に直接注入可能である。
本発明のいくつかの実施方案において、本発明のCAR-T細胞又はその組成物は、当該分野において既知のその他の治療法と組み合わせ可能である。前記治療法には、化学療法、放射線治療及び免疫抑制剤が含まれる(ただし、これらに限らない)。例えば、各種の放射線治療製剤を組み合わせて治療することが可能である。これらの放射線治療製剤には、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸モフェチル、FK506、フルダラビン、ラパマイシン及びミコフェノール酸等が含まれる。更なる実施方案において、本発明の細胞組成物は、骨髄移植や、化学療法薬(例えば、フルダラビン)、放射線外部照射療法(XRT)、シクロホスファミド又は抗体(例えば、OKT3又はCAMPATH)を利用したT細胞アブレーション療法と組み合わせて(例えば、事前、同時又は事後)患者に投与する。
本文中の「抗腫瘍能力」とは生物学的な効果を意味し、腫瘍体積の減少、腫瘍細胞数の減少、転移数の減少、推定寿命の延長又は癌関連の各種生理的症状の改善によって示すことができる。
「患者」、「対象」「個体」等は、本文中で互換的に使用可能であり、免疫反応を発生させ得る生体有機体(例えば、哺乳動物)を意味する。これには、例えば、ヒト、犬、猫、マウス、ラット及びその遺伝子組換え種が含まれる(ただし、これらに限らない)。
前記キメラ抗原受容体、前記ポリヌクレオチド配列、前記核酸構築物、前記レンチウイルスベクターシステムは、(1)T細胞の作製、(2)T細胞の生存能力の向上、(3)T細胞アポトーシスの阻害、(4)T細胞の増殖及び/又は生存能力の強化、(5)T細胞の抗腫瘍能力の向上、(6)T細胞からのサイトカインIFN-γレベルの抑制及びTNF-αの分泌阻害、のうちのいずれか1つ又は複数の用途の製品の製造に応用される。
生存能力の向上、アポトーシスレベルの低下、増殖能力の向上により、T細胞の持続性を顕著に向上させて、T細胞の抗腫瘍能力を著しく向上させることが可能となる。
前記キメラ抗原受容体、前記ポリヌクレオチド配列、前記核酸構築物、前記レンチウイルスベクターシステムは、更に、T細胞の増殖・生存能力、成長・増殖能力又は持続的増殖能力の強化、或いはT細胞数の増加のうちのいずれか1つ又は複数の用途の製品の製造にも応用可能である。
前記キメラ抗原受容体、前記ポリヌクレオチド配列、前記核酸構築物、前記レンチウイルスベクターシステム又は前記遺伝子組換えT細胞は、腫瘍治療製品の製造に応用される。
選択的に、前記腫瘍は、白血病又は固形腫瘍のうちの1つ又は複数から選択される。
選択的に、前記腫瘍は、B細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、ヘアリー細胞白血病及び急性骨髄性白血病から選択される。
以下に、特定の具体的実施例を通じて、本発明の実施形態につき説明する。なお、当業者であれば、本明細書で開示する内容から本発明のその他の利点及び効果を容易に理解可能である。更に、本発明は、その他の異なる具体的実施形態によっても実施又は応用可能である。また、本明細書の各詳細は、異なる視点及び応用に基づき、本発明の精神を逸脱しないことを前提に各種の改変又は変更が可能である。
本発明の具体的実施形態について更に記載する前に、理解すべき点として、本発明の保護の範囲は後述する特定の具体的実施方案に限らない。更に、理解すべき点として、本発明
の実施例で使用する用語は特定の具体的実施方案を記載するためのものであって、本発明の保護の範囲を制限するためのものではない。また、本発明の明細書及び特許請求の範囲では、本文中で別途明示している場合を除き、「1つ」、「一の」及び「この」といった単数形には複数形が含まれる。
の実施例で使用する用語は特定の具体的実施方案を記載するためのものであって、本発明の保護の範囲を制限するためのものではない。また、本発明の明細書及び特許請求の範囲では、本文中で別途明示している場合を除き、「1つ」、「一の」及び「この」といった単数形には複数形が含まれる。
実施例で数値範囲を示している場合には、本発明において別途説明している場合を除き、各数値範囲の2つの端点及び2つの端点間の任意の数値をいずれも選択可能であると解釈すべきである。また、別途定義している場合を除き、本発明で使用するあらゆる技術及び科学用語は、当業者により一般的に理解される意味と同義である。また、実施例で使用している具体的方法、デバイス、材料のほかに、当業者による従来技術の理解及び本発明の記載に基づいて、本発明の実施例で述べる方法、デバイス、材料と類似又は同等の従来技術における任意の方法、デバイス及び材料を用いて本発明を実現してもよい。
別途説明している場合を除き、本発明で開示する実験方法、検出方法、作製方法には、いずれも当該分野において一般的な分子生物学、生化学、クロマチン構造及び分析、分析化学、細胞培養、組換えDNA技術及び関連分野における一般的技術を用いている。
anti-CD1928Z CARの配列は、FMC63 scFv、CD28ヒンジ領域、CD28膜貫通領域、CD28及びCD3ζ細胞内領域という構造(即ち、Rosenberg,S.A.実験室がNCBIで共有する配列(GenBank:HM852952.1)を含む。遺伝子合成によりanti-CD19 28Z CARを取得し、これをベースに、図1aに示すCAR構造の配列を設計した。そして、T2A自己切断ペプチドを介して、eGFP及びCAR配列を同一のオープンリーディングフレーム(ORF)に連結してコードした。よって、CARの発現レベルは、eGFPの発現量/蛍光強度で示すことができた。また、重複伸長PCR法(gene splicing by overlap extension PCR)に基づく部位特異的変異導入技術及び遺伝子組換え連結技術を用い、Y/F突然変異を有するCD3ε細胞内領域(当該細胞内領域のITAMモチーフにおける2つのチロシンがフェニルアラニンに突然変異している)をCD28膜貫通領域の後方に挿入して新型のCARを作製し、anti-CD19 EYF28Z CARと命名した。
anti-CD19 EYF28Z CARのヌクレオチド配列はSEQ ID NO:8に示す通りである。具体的には、以下とする。
ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCAC
TACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGGGAAGCGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTGCTAACATGCGGTGACGTCGAGGAGAATCCTGGACCTatgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccaTACCCCTACGACGTGCCCGACTACGCCgacatccagatgacacagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcagttgcagggcaagtcaggacattagtaaatatttaaattggtatcagcagaaaccagatggaactgttaaactcctgatctaccatacatcaagattacactcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctggaacagattattctctcaccattagcaacctggagcaagaagatattgccacttacttttgccaacagggtaatacgcttccgtacacgttcggaggggggactaagttggaaataacaggctccacctctggatccggcaagcccggatctggcgagggatccaccaagggcgaggtgaaactgcaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccgtcacatgcactgtctcaggggtctcattacccgactatggtgtaagctggattcgccagcctccacgaaagggtctggagtggctgggagtaatatggggtagtgaaaccacatactataattcagctctcaaatccagactgaccatcatcaaggacaactccaagagccaagttttcttaaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagccatttactactgtgccaaacattattactacggtggtagctatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcagcggccgcaattgaagttatgtatcctcctccttacctagacaatgagaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacctttgtccaagtcccctatttcccggaccttctaagcccttttgggtgctggtggtggttgggggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaagaatagaaaggccaaggccaagcctgtgacacgaggagcgggtgctggcggcaggcaaaggggacaaaacaaggagaggccaccacCTGTTCCCAACCCAGACTTTGAGCCCATCCGGAAAGGCCAGCGGGACCTGTTTTCTGgcctgaatcagagacgcatcaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaa 。
ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCAC
TACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGGGAAGCGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTGCTAACATGCGGTGACGTCGAGGAGAATCCTGGACCTatgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccaTACCCCTACGACGTGCCCGACTACGCCgacatccagatgacacagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcagttgcagggcaagtcaggacattagtaaatatttaaattggtatcagcagaaaccagatggaactgttaaactcctgatctaccatacatcaagattacactcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctggaacagattattctctcaccattagcaacctggagcaagaagatattgccacttacttttgccaacagggtaatacgcttccgtacacgttcggaggggggactaagttggaaataacaggctccacctctggatccggcaagcccggatctggcgagggatccaccaagggcgaggtgaaactgcaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccgtcacatgcactgtctcaggggtctcattacccgactatggtgtaagctggattcgccagcctccacgaaagggtctggagtggctgggagtaatatggggtagtgaaaccacatactataattcagctctcaaatccagactgaccatcatcaaggacaactccaagagccaagttttcttaaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagccatttactactgtgccaaacattattactacggtggtagctatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcagcggccgcaattgaagttatgtatcctcctccttacctagacaatgagaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacctttgtccaagtcccctatttcccggaccttctaagcccttttgggtgctggtggtggttgggggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaagaatagaaaggccaaggccaagcctgtgacacgaggagcgggtgctggcggcaggcaaaggggacaaaacaaggagaggccaccacCTGTTCCCAACCCAGACTTTGAGCCCATCCGGAAAGGCCAGCGGGACCTGTTTTCTGgcctgaatcagagacgcatcaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaa 。
EYF28Zと同じ作製方法で、Y/F突然変異を有するCD3ε細胞内領域を配列がCD3ε細胞内領域となるよう置換した点のみが異なるanti-CD19 E28Z C
ARを作製した。anti-CD19 E28Z CARのヌクレオチド配列はSEQ ID NO:9に示す通りであり、具体的には以下とする。
ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGGGAAGCGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTGCTAACATGCGGTGACGTCGAGGAGAATCCTGGACCTatgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccaTACCCCTACGACGTGCCCGACTACGCCgacatccagatgacacagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcagttgcagggcaagtcaggacattagtaaatatttaaattggtatcagcagaaaccagatggaactgttaaactcctgatctaccatacatcaagattacactcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctggaacagattattctctcaccattagcaacctggagcaagaagatattgccacttacttttgccaacagggtaatacgcttccgtacacgttcggaggggggactaagttggaaataacaggctccacctctggatccggcaagcccggatctggcgagggatccaccaagggcgaggtgaaactgcaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccgtcacatgcactgtctcaggggtctcattacccgactatggtgtaagctggattcgccagcctccacgaaagggtctggagtggctgggagtaatatggggtagtgaaaccacatactataattcagctctcaaatccagactgaccatcatcaaggacaactccaagagccaagttttcttaaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagccatttactactgtgccaaacattattactacggtggtagctatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcagcggccgcaattgaagttatgtatcctcctccttacctagacaatgagaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacctttgtccaagtcccctatttcccggaccttctaagcccttttgggtgctggtggtggttgggggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaagaatagaaaggccaaggccaagcctgtgacacgaggagcgggtgctggcggcaggcaaaggggacaaaacaaggagaggccaccacctgttcccaacccagac
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ARを作製した。anti-CD19 E28Z CARのヌクレオチド配列はSEQ ID NO:9に示す通りであり、具体的には以下とする。
ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGGGAAGCGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTGCTAACATGCGGTGACGTCGAGGAGAATCCTGGACCTatgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccaTACCCCTACGACGTGCCCGACTACGCCgacatccagatgacacagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcagttgcagggcaagtcaggacattagtaaatatttaaattggtatcagcagaaaccagatggaactgttaaactcctgatctaccatacatcaagattacactcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctggaacagattattctctcaccattagcaacctggagcaagaagatattgccacttacttttgccaacagggtaatacgcttccgtacacgttcggaggggggactaagttggaaataacaggctccacctctggatccggcaagcccggatctggcgagggatccaccaagggcgaggtgaaactgcaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccgtcacatgcactgtctcaggggtctcattacccgactatggtgtaagctggattcgccagcctccacgaaagggtctggagtggctgggagtaatatggggtagtgaaaccacatactataattcagctctcaaatccagactgaccatcatcaaggacaactccaagagccaagttttcttaaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagccatttactactgtgccaaacattattactacggtggtagctatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcagcggccgcaattgaagttatgtatcctcctccttacctagacaatgagaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacctttgtccaagtcccctatttcccggaccttctaagcccttttgggtgctggtggtggttgggggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaagaatagaaaggccaaggccaagcctgtgacacgaggagcgggtgctggcggcaggcaaaggggacaaaacaaggagaggccaccacctgttcccaacccagac
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CARをレンチウイルス発現プラスミドpHAGEベクターにサブクローニングし、CAR発現プラスミドとパッケージングプラスミドpSPAX2及びpMD2Gをそれぞれ10:7.5:3.5の割合で混合したあと、リン酸カルシウムトランスフェクション手法で293FT細胞に導入し、レンチウイルス粒子を生成した。次に、超高速遠心分離手法を用い、anti-CD19 28Z CAR、anti-CD19 E28Z CAR又はanti-CD19 EYF28Z CARをそれぞれ発現したレンチウイルスを濃縮して小体積・高力価ウイルス(~108IU/ml)としたあと、αCD3/αCD28 Ab-beadsで1日活性化した初代T細胞(MOI=10)にそれぞれトランスフェクションした。T細胞完全培地(XIVO-15+1%P.S.+10ng/ml human IL-7+10ng/ml human IL-15+5% Human AB serum,10mM neutralized NAC)を用いた初代T細胞の培養期間は、ウイルスを1日トランスフェクションしたあと除去し、抗体で4日間刺激したあとこれも除去した。そして、抗体での刺激から5日目に、CAR発現量(eGFP蛍光強度で表示)が同じCAR-T細胞を分別し、取得したT-細胞を、それぞれ、anti-CD19
28Z CAR-T細胞、anti-CD19 E28Z CAR-T細胞及びanti-CD19 EYF28Z CAR-T細胞とした。次に、一定時間増幅させたあと、CARの膜上レベル、CD4とCD8のサブセット割合、インビトロでのサイトカイン分泌、インビトロでの殺傷能力、インビトロでの増殖能力、インビトロでのアポトーシスレベル、インビトロでの持続的生存能力、及びインビボでの抗腫瘍能力等の一連の指標鑑定をCAR-Tについて行った。
28Z CAR-T細胞、anti-CD19 E28Z CAR-T細胞及びanti-CD19 EYF28Z CAR-T細胞とした。次に、一定時間増幅させたあと、CARの膜上レベル、CD4とCD8のサブセット割合、インビトロでのサイトカイン分泌、インビトロでの殺傷能力、インビトロでの増殖能力、インビトロでのアポトーシスレベル、インビトロでの持続的生存能力、及びインビボでの抗腫瘍能力等の一連の指標鑑定をCAR-Tについて行った。
指標検出方法及び結果について:
取得したanti-CD19 28Z CAR、anti-CD19 E28Z CAR及びanti-CD19 EYF28Z CARの構造と、CD3ε細胞内領域のアミノ酸配列及びY/F突然変異を有するCD3ε細胞内領域のアミノ酸配列を図1aに示す。図中のFMC63は、CD19抗原を標的とする一本鎖抗体であり、受容体のヒンジ領域(Hinge region)及び膜貫通領域(transmembraneregion)はヒトCD28由来である。anti-CD19 E28Z CARにおいて、CD3εはCD28膜貫通領域の後方且つCD28細胞内領域の前方に挿入した。また、anti-CD19 EYF28Z CARにおいて、Y/F突然変異を有するCD3ε細胞内領域のアミノ酸配列は、CD28膜貫通領域の後方且つCD28細胞内領域の前方に挿入した。
取得したanti-CD19 28Z CAR、anti-CD19 E28Z CAR及びanti-CD19 EYF28Z CARの構造と、CD3ε細胞内領域のアミノ酸配列及びY/F突然変異を有するCD3ε細胞内領域のアミノ酸配列を図1aに示す。図中のFMC63は、CD19抗原を標的とする一本鎖抗体であり、受容体のヒンジ領域(Hinge region)及び膜貫通領域(transmembraneregion)はヒトCD28由来である。anti-CD19 E28Z CARにおいて、CD3εはCD28膜貫通領域の後方且つCD28細胞内領域の前方に挿入した。また、anti-CD19 EYF28Z CARにおいて、Y/F突然変異を有するCD3ε細胞内領域のアミノ酸配列は、CD28膜貫通領域の後方且つCD28細胞内領域の前方に挿入した。
Alexa Fluor647結合anti-mouse FMC63 scFv抗体を用い、anti-CD19 28Z CAR-T細胞、anti-CD19 E28Z CAR-T細胞及びanti-CD19 EYF28Z CAR-T細胞におけるanti-CD
19 CAR受容体の膜上レベルをフローサイトメトリー測定した。フローサイトメトリーグラフの結果を図1bに示す。これより、三者のCAR陽性率及び発現量(MFI)に差がないことが示された。
19 CAR受容体の膜上レベルをフローサイトメトリー測定した。フローサイトメトリーグラフの結果を図1bに示す。これより、三者のCAR陽性率及び発現量(MFI)に差がないことが示された。
anti-humanCD4-APC及びanti-human CD8-PE-Cy7抗体を用い、anti-CD19 28Z CAR-T細胞、anti-CD19 E28Z CAR-T細胞及びanti-CD19 EYF28Z CAR-T細胞についてフローサイトメトリー測定を行った。フローサイトメトリーグラフの結果を図1cに示す。これより、三者のCD4+CAR-T細胞及びCD8+CAR-T細胞の割合は類似していることが示された。
10万個のanti-CD19 28Z CAR-T細胞、anti-CD19 E28Z CAR-T細胞及びanti-CD19 EYF28Z CAR-T細胞をそれぞれCD19+リンパ腫細胞株Rajiと1:1の割合で丸底の96ウェルマイクロプレートに移植し、均一に混合したあと、室温で遠心分離(400g、1min)にかけて細胞間の接触を促進させた。次に、完全培地を用い、37℃のインキュベーター内で1日培養してからサンプルを回収した。また、サンプル回収の6時間前に1×BFAを加えてサイトカインの放出を阻害し、サンプル回収後にPBSでサンプルを1回洗浄した。その後、4%PFAを用いて室温で5min固定し、0.1%トリトンX-100を用いて室温で5min穿孔した。そして、通常の操作に従って細胞内染色手順を行い、対応する直接標識抗体でIL-2、IFN-γ、TNF-αを検出した。その結果、図1d~図1fに示すように、anti-CD19 E28Z CAR-T細胞と比較して、anti-CD19 EYF28Z CAR-T細胞がCD19+細胞による特異的刺激後に産生したIL-2、IFN-γ及びTNF-αのサイトカインレベルは明らかに回復し、上昇していた。これは、CD3ε細胞内領域のITAMモチーフがサイトカインの産生に対し重要な阻害作用を有することを意味している。しかし、注意すべき点として、anti-CD19 EYF28Z CAR-T細胞が分泌したサイトカインIFN-γ、TNF-αは、依然としてanti-CD19 28Z CAR-T細胞よりも明らかにやや少なかった(図1e~図1f)。よって、マクロファージ及び単球の活性化によるIL-1β及びIL-6といった炎症性サイトカインの産生を低下させることが可能であった。
10万個のanti-CD19 28Z CAR-T細胞、anti-CD19 E28Z CAR-T細胞及びanti-CD19 EYF28Z CAR-T細胞をそれぞれCD19+リンパ腫細胞株Rajiと1:1の割合で丸底の96ウェルマイクロプレートに移植し、均一に混合したあと、室温で遠心分離(400g、1min)にかけて細胞間の接触を促進させた。次に、完全培地を用い、37℃のインキュベーター内で一定時間培養した。続いて、異なるタイミングでサンプルを回収したあとPBSでサンプルを1回洗浄し、Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set試薬キットの説明書に従い操作して、anti-human Ki67-APC抗体により染色してから、Ki67の発現量をフローサイトメトリー測定した。その結果、図1gに示すように、anti-CD19 EYF28Z CAR-Tは、CD19+Raji細胞による刺激後の増殖速度が、持続的に一定時間は終始anti-CD19 28Z CAR-T細胞よりも速く、ひいてはanti-CD19 E28Z CAR-T細胞よりも速かった。即ち、anti-CD19 EYF28Z CAR-T細胞の増殖能力が最も強かった。
10万個のanti-CD19 28Z CAR-T細胞、anti-CD19 E28Z CAR-T細胞及びanti-CD19 EYF28Z CAR-T細胞をそれぞれCD19+リンパ腫細胞株Rajiと1:1の割合で丸底の96ウェルマイクロプレートに移植し、均一に混合したあと、室温で遠心分離(400g、1min)にかけて細胞間の接触
を促進させた。次に、完全培地を用い、37℃のインキュベーター内で一定時間培養した。続いて、異なるタイミングでサンプルを回収したあとPBSでサンプルを1回洗浄し、Annexin V Apoptosis Detection Kit APC試薬キットの説明書に従って染色してから、CAR-T細胞におけるアネキシンV(Annexin
V)の発現レベルをフローサイトメトリー測定した。その結果、図1hに示すように、anti-CD19 EYF28Z CAR-T細胞及びanti-CD19 E28Z CAR-T細胞は、CD19+Raji細胞による刺激から持続的に一定時間は、アポトーシスレベルがanti-CD19 28Z CAR-T細胞よりも明らかに低かった。
を促進させた。次に、完全培地を用い、37℃のインキュベーター内で一定時間培養した。続いて、異なるタイミングでサンプルを回収したあとPBSでサンプルを1回洗浄し、Annexin V Apoptosis Detection Kit APC試薬キットの説明書に従って染色してから、CAR-T細胞におけるアネキシンV(Annexin
V)の発現レベルをフローサイトメトリー測定した。その結果、図1hに示すように、anti-CD19 EYF28Z CAR-T細胞及びanti-CD19 E28Z CAR-T細胞は、CD19+Raji細胞による刺激から持続的に一定時間は、アポトーシスレベルがanti-CD19 28Z CAR-T細胞よりも明らかに低かった。
10万個のanti-CD19 28Z CAR-T細胞、anti-CD19 E28Z CAR-T細胞及びanti-CD19 EYF28Z CAR-T細胞をそれぞれCD19+リンパ腫細胞株Rajiと1:1の割合で丸底の96ウェルマイクロプレートに移植し、均一に混合したあと、室温で遠心分離(400g、1min)にかけて細胞間の接触を促進させた。次に、完全培地を用い、37℃のインキュベーター内で一定時間培養した。続いて、異なるタイミングでサンプルを回収したあとPBSでサンプルを1回洗浄し、anti-human CD4-APC及びanti-human CD8-PE-Cy7抗体により染色して、CAR+T細胞の生存数を検出した。その結果、図1iに示すように、CD19+Raji細胞による刺激後は、anti-CD19 EYF28Z CAR-T細胞の生存数が最も多く、その次がanti-CD19 E28Z CAR-T細胞となり、anti-CD19 28Z CAR-T細胞の生存数が最も少なかった。これは、EYF28Z CAR-T細胞の持続的生存能力が最も強いことを意味している。
anti-CD1928Z CAR-T細胞、anti-CD19 E28Z CAR-T細胞及びanti-CD19 EYF28Z CAR-T細胞は、CD19+腫瘍細胞に対し毒性反応を示す。そこで、CD19-K562細胞を1640無血清培地に再懸濁したあと、1×CellTraker deep red dyeで予め染色した(37℃のウォーターバス、30min)。続いて、1640無血清培地を1回洗浄し、T細胞完全培地を用いて再懸濁したあと、CD19+K562_CD19(IRES mCherry)細胞と1:1で混合して標的細胞とした。そして、CAR-T細胞を当該混合型標的細胞と3:1、1:1、1:3の割合で混合し、丸底の96ウェルマイクロプレートにプレーティングして均一に混合したあと、室温で遠心分離(400g、1min)にかけて細胞間の接触を促進させた。次に、完全培地を用い、37℃のインキュベーター内で1日培養してからサンプルを回収し、氷上に載置した。そして、CD19-K562細胞(APC+、mCherry-)のパーセンテージとCD19+K562_CD19細胞(APC-、mCherry+)のパーセンテージの変化をフローサイトメトリー測定し、実験群の「CD19-K562細胞(APC+、mCherry-)のパーセンテージ/CD19+K562_CD19細胞(APC-、mCherry+)のパーセンテージ」をNとした。N値は、CAR-T細胞を添加していない混合型標的細胞サンプルウェルの「N0=CD19-K562細胞(APC+、mCherry-)のパーセンテージ/CD19+K562_CD19細胞(APC-、mCherry+)のパーセンテージ」を基準としたあと、生存割合N/N0を算出した。即ち、殺傷率の式は「Lysis(%)=1-N/N0」とした。その結果、図1jに示すように、anti-CD19 28Z CAR-T細胞、anti-CD19 E28Z CAR-T細胞及びanti-CD19 EYF28Z CAR-T細胞の三者は、CD19+腫瘍細胞に対する殺傷毒性が同等であった。
10万個のanti-CD19 28Z CAR-T細胞、anti-CD19 E28Z CAR-T細胞及びanti-CD19 EYF28Z CAR-T細胞をそれぞれCD19+リンパ腫細胞株Rajiと1:1の割合で1.5mlのEPチューブに移植し、均一に混合したあと、4℃で遠心分離(500g、2min)にかけて細胞間の接触を促
進させた。次に、完全培地を用い、37℃のウォーターバスで一連のタイミングで刺激した。続いて、異なるタイミングで等体積の8%PFAを加えて室温で5min固定したあと、0.1%トリトンX-100を用いて室温で5min穿孔した。そして、通常の操作に従って細胞内染色手順を行った。まず、ウサギ由来pErk(1/2)Thr202/Tyr204(図1k)、ウサギ由来pAKTS473(図1l)及びウサギ由来一次抗体pS6S235/236(図1m)をそれぞれ一次抗体染色し、1回洗浄したあと、Alexa647結合ヤギ抗ウサギIgGポリクローナル抗体を二次抗体染色し、1回洗浄してからフローサイトメトリー測定を行った。その結果、図1k~図1mに示すように、anti-CD19 EYF28Z CAR-T細胞は、抗原による特異的刺激後のpErk(1/2)Thr202/Tyr204及びpS6S235/236の全体レベルがanti-CD19 28Z CAR-T及びanti-CD19 E28Z CAR-T細胞よりも明らかに高かった。また、anti-CD19 EYF28Z CAR-T細胞及びanti-CD19 E28Z CAR-T細胞のAKTS473リン酸化レベルは、いずれもanti-CD19 28Z CAR-T細胞よりも明らかに高かった。なお、キメラ抗原受容体CARの抗原活性化後のシグナル伝達経路のうち、Raf/MAPKシグナル経路のシグナル分子セリン/トレオニンプロテインキナーゼErk(1/2)Thr202/Tyr204のリン酸化レベルと、PI3K/AKTシグナル経路のセリン/トレオニンキナーゼAKTS473のリン酸化レベルは、いずれも細胞の増殖・生存能力及び抗アポトーシス能力の促進を示し、2つの経路の下流のシグナル分子であるリボソームタンパク質S6S235/236のリン酸化レベルは細胞の成長・増殖レベルを示す。これら3つのシグナル分子の表現型を用い、シグナル経路の面から見ることで、anti-CD19 EYF28Z CAR-T細胞の増殖・生存能力が最も強いことが明らかとなった。
進させた。次に、完全培地を用い、37℃のウォーターバスで一連のタイミングで刺激した。続いて、異なるタイミングで等体積の8%PFAを加えて室温で5min固定したあと、0.1%トリトンX-100を用いて室温で5min穿孔した。そして、通常の操作に従って細胞内染色手順を行った。まず、ウサギ由来pErk(1/2)Thr202/Tyr204(図1k)、ウサギ由来pAKTS473(図1l)及びウサギ由来一次抗体pS6S235/236(図1m)をそれぞれ一次抗体染色し、1回洗浄したあと、Alexa647結合ヤギ抗ウサギIgGポリクローナル抗体を二次抗体染色し、1回洗浄してからフローサイトメトリー測定を行った。その結果、図1k~図1mに示すように、anti-CD19 EYF28Z CAR-T細胞は、抗原による特異的刺激後のpErk(1/2)Thr202/Tyr204及びpS6S235/236の全体レベルがanti-CD19 28Z CAR-T及びanti-CD19 E28Z CAR-T細胞よりも明らかに高かった。また、anti-CD19 EYF28Z CAR-T細胞及びanti-CD19 E28Z CAR-T細胞のAKTS473リン酸化レベルは、いずれもanti-CD19 28Z CAR-T細胞よりも明らかに高かった。なお、キメラ抗原受容体CARの抗原活性化後のシグナル伝達経路のうち、Raf/MAPKシグナル経路のシグナル分子セリン/トレオニンプロテインキナーゼErk(1/2)Thr202/Tyr204のリン酸化レベルと、PI3K/AKTシグナル経路のセリン/トレオニンキナーゼAKTS473のリン酸化レベルは、いずれも細胞の増殖・生存能力及び抗アポトーシス能力の促進を示し、2つの経路の下流のシグナル分子であるリボソームタンパク質S6S235/236のリン酸化レベルは細胞の成長・増殖レベルを示す。これら3つのシグナル分子の表現型を用い、シグナル経路の面から見ることで、anti-CD19 EYF28Z CAR-T細胞の増殖・生存能力が最も強いことが明らかとなった。
実験データの処理方法:
ソフトウェアGraphPad Prism 8.0.2を使用して、データの統計分析を行い、P<0.05(具体的には、*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001、****P<0.0001)のとき、差に統計的に有意性があるとした。また、各群のデータはMean±SDで示した。
ソフトウェアGraphPad Prism 8.0.2を使用して、データの統計分析を行い、P<0.05(具体的には、*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001、****P<0.0001)のとき、差に統計的に有意性があるとした。また、各群のデータはMean±SDで示した。
図1d~図1fでは、一元配置分散分析にSidakの多重比較検定を加えた。
図1g、図1h、図1j~図1mでは、二元配置分散分析にSidakの多重比較検定を加えた。
図1iでは、二元配置分散分析行った。
実験結果:
(1)anti-CD19 EYF28Z CAR-T細胞と、anti-CD19 E28Z CAR-T細胞、anti-CD19 28Z CAR-T細胞は、anti-CD19 CAR受容体の膜上レベル及びCD4/CD8比が同等であった。
(1)anti-CD19 EYF28Z CAR-T細胞と、anti-CD19 E28Z CAR-T細胞、anti-CD19 28Z CAR-T細胞は、anti-CD19 CAR受容体の膜上レベル及びCD4/CD8比が同等であった。
(2)anti-CD19 28Z CAR-T細胞、anti-CD19 E28Z CAR-T細胞及びanti-CD19 EYF28Z CAR-T細胞をRaji細胞によりインビトロで特異的に刺激したところ、anti-CD19 28Z CAR-T細胞と比較して、anti-CD19 EYF28Z CAR-T細胞が産生したIL-2、IFN-γ及びTNF-αのサイトカインレベルは明らかに回復し、上昇した。これは、CD3ε細胞内領域のITAMモチーフがサイトカインの産生に対し重要な阻害作用を有することを意味している。しかし、注意すべき点として、anti-CD19 EYF28Z CAR-T細胞が分泌したこれらのサイトカインは、依然として、anti-CD19 28Z CAR-T細胞よりも明らかにやや少なかった(図1e~図1f)。よって、マク
ロファージ及び単球の活性化によるIL-1β及びIL-6といった炎症性サイトカインの産生を低下させることが可能であった。
ロファージ及び単球の活性化によるIL-1β及びIL-6といった炎症性サイトカインの産生を低下させることが可能であった。
(3)anti-CD19 28Z CAR-T細胞、anti-CD19 E28Z CAR-T細胞及びanti-CD19 EYF28Z CAR-T細胞をRaji細胞によりインビトロで特異的に刺激し、一定時間増幅させたあと、異なるタイミングでサンプルを採取して増殖能力(即ち、Ki67の発現レベル)を測定したところ、anti-CD19 28Z CAR-T細胞及びanti-CD19 E28Z CAR-T細胞と比較して、anti-CD19 EYF28Z CAR-T細胞の増殖能力が最も良好であった。
(4)anti-CD19 28Z CAR-T細胞、anti-CD19 E28Z CAR-T細胞及びanti-CD19 EYF28Z CAR-T細胞をRaji細胞によりインビトロで特異的に刺激し、一定時間増幅させたあと、異なるタイミングでサンプルを採取してアポトーシスレベル(アネキシンVで示す)を測定したところ、anti-CD19 E28Z CAR-T細胞及びanti-CD19 EYF28Z CAR-T細胞のアポトーシスレベルは、いずれもanti-CD19 28Z CAR-T細胞よりも明らかに低かった。
(5)anti-CD19 28Z CAR-T細胞、anti-CD19 E28Z CAR-T細胞及びanti-CD19 EYF28Z CAR-T細胞をRaji細胞により特異的に刺激し、一定時間増幅させたあと、異なるタイミングでサンプルを採取し、増幅したCAR+T細胞の数を測定したところ、時間の経過に伴って、anti-CD19 EYF28Z CAR-T細胞の数は、持続的にanti-CD19 28Z CAR-T細胞及びanti-CD19 E28Z CAR-T細胞よりも明らかに高かった。
(6)anti-CD19 28Z CAR-T細胞、anti-CD19 E28Z CAR-T細胞及びanti-CD19 EYF28Z CAR-T細胞と、CD19+K562:CD19-K562を共培養するインビトロ殺傷実験において、anti-CD19
EYF28Z CAR-T細胞の殺傷能力は、anti-CD19 28ZCAR-T細胞及びanti-CD19 E28Z CAR-T細胞と同等であった。
EYF28Z CAR-T細胞の殺傷能力は、anti-CD19 28ZCAR-T細胞及びanti-CD19 E28Z CAR-T細胞と同等であった。
(7)anti-CD19 28Z CAR-T細胞、anti-CD19 E28Z CAR-T細胞及びanti-CD19 EYF28Z CAR-T細胞をRaji細胞により特異的に刺激し、一定時間増幅させたあと、異なるタイミングでサンプルを採取し、シグナル分子セリン/トレオニンプロテインキナーゼErk(1/2)Thr202/Tyr204、セリン/トレオニンキナーゼAKTS473及びリボソームタンパク質S6S235/236のリン酸化レベルを測定した。すると、anti-CD19 EYF28Z CAR-T細胞は、抗原による特異的刺激後のpErk(1/2)Thr202/Tyr204及びpS6S235/236の全体レベルがanti-CD19 28Z CAR-T細胞及びanti-CD19 E28Z CAR-T細胞よりも明らかに高かった。且つ、anti-CD19 EYF28Z CAR-T細胞及びanti-CD19 E28Z CAR-T細胞のAKTS473リン酸化レベルは、いずれもanti-CD19 28Z CAR-T細胞よりも明らかに高かった。キメラ抗原受容体CARの抗原活性化後のシグナル伝達経路全体のうち、Raf/MAPKシグナル経路のシグナル分子Erk(1/2)Thr202/Tyr204のリン酸化レベルと、PI3K/AKTシグナル経路のAKTS473のリン酸化レベルは、いずれも細胞の増殖・生存能力及び抗アポトーシス能力の促進を示し、2つの経路の下流の共有シグナル分子であるリボソームタンパク質S6S235/236のリン酸化レベルは細胞の成長・増殖レベルを示す。これら3つのシグナル分子の表現型を用い、シグナル経路の面から見ることで、anti-CD19 EYF28Z CAR-T細胞の増殖・生存能力が最も強いことが明らかとなった。
anti-CD19EYF28Z CAR-T細胞と、anti-CD19 E28Z細胞及びanti-CD19 28Z CAR-T細胞の体内における抗皮下腫瘍能力を比較する実験計画は次の通りであった。
無菌操作により、3×107/mlのRaji細胞-PBS再懸濁液を準備した。そして、6週齢の各B-NDG雌マウスの左側背部に100μl・3百万個のRaji細胞を皮下移植し、この時点をday0とした。そして、6日後に、Raji皮下腫瘍が直径6~7mmまで成長した時点で、マウスをランダムに3群(EYF28Z群、E28Z群、28Z群、vector群)に群分けし、各マウスの尾静脈に100ul・8百万個のT細胞を注射した。その後、定期的にノギスで腫瘍の大きさを測定し、腫瘍データ及びマウスの生存期間を記録した。また、腫瘍面積=長さ×幅とした。
実験の結論:anti-CD19 EYF28Z CAR-T細胞は抗腫瘍能力を有していた。
anti-CD1928Z CARの配列は、FMC63 scFv、CD28ヒンジ領域、CD28膜貫通領域及びCD3ζ細胞内領域という構造(即ち、Rosenberg,S.A.実験室がNCBIで共有する配列(GenBank:HM852952.1)を含む。遺伝子合成によりanti-CD19 28Z CARを取得し、これをベースに、図2aに示すCAR構造の配列を設計した。そして、T2A自己切断ペプチドを介して、eGFP及びCAR配列を同一のオープンリーディングフレーム(ORF)に連結してコードした。よって、CARの発現レベルは、eGFPの発現量/蛍光強度で示すことができた。また、重複伸長PCR技術に基づいて、CD3ε細胞内セグメントのBRSモチーフをCD28膜貫通領域の後方に挿入することで、anti-CD19 EBRS28Z CARと称する新型のCARを作製した。
合成により取得したanti-CD19 EBRS28Z CARのヌクレオチド配列はSEQ ID NO:13に示す通りである。具体的には、以下とする。
ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGGGAAGCGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTGCTAACATGCGGTGACG
TCGAGGAGAATCCTGGACCTatgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccaTACCCCTACGACGTGCCCGACTACGCCgacatccagatgacacagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcagttgcagggcaagtcaggacattagtaaatatttaaattggtatcagcagaaaccagatggaactgttaaactcctgatctaccatacatcaagattacactcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctggaacagattattctctcaccattagcaacctggagcaagaagatattgccacttacttttgccaacagggtaatacgcttccgtacacgttcggaggggggactaagttggaaataacaggctccacctctggatccggcaagcccggatctggcgagggatccaccaagggcgaggtgaaactgcaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccgtcacatgcactgtctcaggggtctcattacccgactatggtgtaagctggattcgccagcctccacgaaagggtctggagtggctgggagtaatatggggtagtgaaaccacatactataattcagctctcaaatccagactgaccatcatcaaggacaactccaagagccaagttttcttaaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagccatttactactgtgccaaacattattactacggtggtagctatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcagcggccgcaattgaagttatgtatcctcctccttacctagacaatgagaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacctttgtccaagtcccctatttcccggaccttctaagcccttttgggtgctggtggtggttgggggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaagaatagaaaggccaaggccaagaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaa
ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGGGAAGCGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTGCTAACATGCGGTGACG
TCGAGGAGAATCCTGGACCTatgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccaTACCCCTACGACGTGCCCGACTACGCCgacatccagatgacacagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcagttgcagggcaagtcaggacattagtaaatatttaaattggtatcagcagaaaccagatggaactgttaaactcctgatctaccatacatcaagattacactcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctggaacagattattctctcaccattagcaacctggagcaagaagatattgccacttacttttgccaacagggtaatacgcttccgtacacgttcggaggggggactaagttggaaataacaggctccacctctggatccggcaagcccggatctggcgagggatccaccaagggcgaggtgaaactgcaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccgtcacatgcactgtctcaggggtctcattacccgactatggtgtaagctggattcgccagcctccacgaaagggtctggagtggctgggagtaatatggggtagtgaaaccacatactataattcagctctcaaatccagactgaccatcatcaaggacaactccaagagccaagttttcttaaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagccatttactactgtgccaaacattattactacggtggtagctatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcagcggccgcaattgaagttatgtatcctcctccttacctagacaatgagaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacctttgtccaagtcccctatttcccggaccttctaagcccttttgggtgctggtggtggttgggggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaagaatagaaaggccaaggccaagaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaa
CARをレンチウイルス発現プラスミドpHAGEベクターにサブクローニングし、CAR発現プラスミドとパッケージングプラスミドpSPAX2及びpMD2Gをそれぞれ10:7.5:3.5の割合で混合したあと、リン酸カルシウムトランスフェクション手法で293FT細胞に導入し、レンチウイルス粒子を生成した。次に、超高速遠心分離手法を用い、anti-CD19 28Z CAR又はanti-CD19 EBRS28Z CARをそれぞれ発現したレンチウイルスを濃縮して小体積・高力価ウイルス(~108IU/ml)としたあと、αCD3/αCD28 Ab-beadsで1日活性化した初代T細胞(MOI=10)にそれぞれトランスフェクションした。T細胞完全培地(XIVO-15+1%P.S.+10ng/ml human IL-7+10ng/ml human IL-15+5% Human AB serum,10mM neutrali
zed NAC)を用いた初代T細胞の培養期間は、ウイルスを1日トランスフェクションしたあと除去し、抗体で4日間刺激したあとこれも除去した。そして、抗体での刺激から5日目に、CAR発現量(eGFP蛍光強度で表示)が同じCAR-T細胞を分別し、取得したT-細胞を、それぞれ、anti-CD19 28Z CAR-T細胞及びanti-CD19 EBRS28Z CAR-T細胞とした。次に、一定時間増幅させたあと、CARの膜上レベル、CD4とCD8のサブセット割合、インビトロでのサイトカイン分泌、インビトロでの殺傷能力、インビトロでの増殖能力、インビトロでのアポトーシスレベル、インビトロでの持続的生存能力、及びインビボでの抗腫瘍能力等の一連の指標鑑定をCAR-Tについて行った。
zed NAC)を用いた初代T細胞の培養期間は、ウイルスを1日トランスフェクションしたあと除去し、抗体で4日間刺激したあとこれも除去した。そして、抗体での刺激から5日目に、CAR発現量(eGFP蛍光強度で表示)が同じCAR-T細胞を分別し、取得したT-細胞を、それぞれ、anti-CD19 28Z CAR-T細胞及びanti-CD19 EBRS28Z CAR-T細胞とした。次に、一定時間増幅させたあと、CARの膜上レベル、CD4とCD8のサブセット割合、インビトロでのサイトカイン分泌、インビトロでの殺傷能力、インビトロでの増殖能力、インビトロでのアポトーシスレベル、インビトロでの持続的生存能力、及びインビボでの抗腫瘍能力等の一連の指標鑑定をCAR-Tについて行った。
指標検出方法及び結果について:
取得したanti-CD19 28Z CAR及びanti-CD19 EBRS28Z CARの構造は図2aに示す通りであった。図中のFMC63は、CD19抗原を標的とする一本鎖抗体であり、受容体のヒンジ領域(Hinge region)及び膜貫通領域(transmembraneregion)はヒトCD28由来である。ヒトCD3ε細胞内塩基性リッチな領域のモチーフはCD28膜貫通領域の後方且つCD28細胞内領域の前方に挿入した。
取得したanti-CD19 28Z CAR及びanti-CD19 EBRS28Z CARの構造は図2aに示す通りであった。図中のFMC63は、CD19抗原を標的とする一本鎖抗体であり、受容体のヒンジ領域(Hinge region)及び膜貫通領域(transmembraneregion)はヒトCD28由来である。ヒトCD3ε細胞内塩基性リッチな領域のモチーフはCD28膜貫通領域の後方且つCD28細胞内領域の前方に挿入した。
Alexa Fluor647結合anti-mouse FMC63 scFv抗体を用い、anti-CD19 28Z CAR-T及びanti-CD19 EBRS28Z CAR-T細胞の膜表面におけるCARレベルをフローサイトメトリー測定した。フローサイトメトリーグラフの結果を図2bに示す。これより、両者のCAR陽性率及び発現量(MFI)に差がないことが示された。
anti-humanCD4-APC及びanti-human CD8-PE-Cy7抗体を用い、anti-CD19 28Z CAR-T及びanti-CD19 EBRS28Z CAR-T細胞についてフローサイトメトリー測定を行った。フローサイトメトリーグラフの結果を図2cに示す。これより、両者のCD4+CAR-T細胞及びCD8+CAR-T細胞の割合は類似していることが示された。
10万個のanti-CD19 28Z CAR-T細胞及びanti-CD19 EBRS28Z CAR-T細胞をそれぞれCD19+リンパ腫細胞株Rajiと1:1の割合で丸底の96ウェルマイクロプレートに移植し、均一に混合したあと、室温で遠心分離(400g、1min)にかけて細胞間の接触を促進させた。次に、完全培地を用い、37℃のインキュベーター内で1日培養してからサンプルを回収した。また、サンプル回収の6時間前に1×BFAを加えてサイトカインの放出を阻害し、サンプル回収後にPBSでサンプルを1回洗浄した。その後、4%PFAを用いて室温で5min固定し、0.1%トリトンX-100を用いて室温で5min穿孔した。そして、通常の操作に従って細胞内染色手順を行い、対応する直接標識抗体でIL-2、IFN-γ、TNF-αを検出した。その結果、図2d、図2e及び図2fに示すように、anti-CD19 EBRS28Z CAR-T細胞をCD19+細胞で特異的に刺激したあと産生されたIL-2及びTNF-αのサイトカインレベルは、anti-CD19 28Z CAR-T細胞と類似していたが、IFN-γのサイトカインレベルはanti-CD19 28Z CAR-T細胞よりも低下していた。
10万個のanti-CD19 28Z CAR-T細胞及びanti-CD19 EBRS28Z CAR-T細胞をそれぞれCD19+リンパ腫細胞株Rajiと1:1の割合で丸底の96ウェルマイクロプレートに移植し、均一に混合したあと、室温で遠心分離(400g、1min)にかけて細胞間の接触を促進させた。次に、完全培地を用い、37℃のインキュベーター内で一定時間培養した。続いて、異なるタイミングでサンプルを回
収したあとPBSでサンプルを1回洗浄し、Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set試薬キットの説明書に従い操作して、anti-human Ki67-APC抗体により染色してから、Ki67の発現量をフローサイトメトリー測定した。その結果、図2gに示すように、anti-CD19 EBRS28Z CAR-T細胞は、CD19+Raji細胞で刺激したあと、持続的に一定時間は終始anti-CD19 28Z CAR-T細胞よりも増殖が速かった。
収したあとPBSでサンプルを1回洗浄し、Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set試薬キットの説明書に従い操作して、anti-human Ki67-APC抗体により染色してから、Ki67の発現量をフローサイトメトリー測定した。その結果、図2gに示すように、anti-CD19 EBRS28Z CAR-T細胞は、CD19+Raji細胞で刺激したあと、持続的に一定時間は終始anti-CD19 28Z CAR-T細胞よりも増殖が速かった。
10万個のanti-CD19 28Z CAR-T細胞及びanti-CD19 EBRS28Z CAR-T細胞をそれぞれCD19+リンパ腫細胞株Rajiと1:1の割合で丸底の96ウェルマイクロプレートに移植し、均一に混合したあと、室温で遠心分離(400g、1min)にかけて細胞間の接触を促進させた。次に、完全培地を用い、37℃のインキュベーター内で一定時間培養した。続いて、異なるタイミングでサンプルを回収したあとPBSでサンプルを1回洗浄し、Annexin V Apoptosis Detection Kit APC試薬キットの説明書に従って染色してから、CAR-T細胞におけるアネキシンVの発現レベルをフローサイトメトリー測定した。その結果、図2hに示すように、anti-CD19 EBRS28Z CAR-T細胞は、CD19+Raji細胞で刺激したあと、後期のアポトーシスレベルがanti-CD19 28Z CAR-T細胞よりも明らかに低くなった。
10万個のanti-CD19 28Z CAR-T細胞及びanti-CD19 EBRS28Z CAR-T細胞をそれぞれCD19+リンパ腫細胞株Rajiと1:1の割合で丸底の96ウェルマイクロプレートに移植し、均一に混合したあと、室温で遠心分離(400g、1min)にかけて細胞間の接触を促進させた。次に、完全培地を用い、37℃のインキュベーター内で一定時間培養した。続いて、異なるタイミングでサンプルを回収したあとPBSでサンプルを1回洗浄し、anti-human CD4-APC及びanti-human CD8-PE-Cy7抗体により染色して、CAR+T細胞の生存数を検出した。その結果、図2iに示すように、anti-CD19 EBRS28Z CAR-T細胞は、CD19+Raji細胞による刺激後の生存数がanti-CD19
28Z CAR-T細胞よりも明らかに多かった。
28Z CAR-T細胞よりも明らかに多かった。
10万個のanti-CD19 28Z CAR-T細胞及びanti-CD19 EBRS28Z CAR-T細胞をそれぞれCD19+リンパ腫細胞株Rajiと1:1の割合で1.5mlのEPチューブに移植し、均一に混合したあと、4℃で遠心分離(500g、2min)にかけて細胞間の接触を促進させた。次に、完全培地を用い、37℃のウォーターバスで一連のタイミングで刺激した。続いて、異なるタイミングで等体積の8%PFAを加えて室温で5min固定したあと、0.1%トリトンX-100を用いて室温で5min穿孔した。そして、通常の操作に従って細胞内染色手順を行った。まず、ウサギ由来pAKTS473(図2j)及びウサギ由来一次抗体pS6S235/236(図2k)を一次抗体染色し、1回洗浄したあと、Alexa647結合ヤギ抗ウサギIgGポリクローナル抗体を二次抗体染色し、1回洗浄してからフローサイトメトリー測定を行った。その結果、図2j及び図2kに示すように、anti-CD19 EBRS28Z CAR-T細胞は、抗原による特異的刺激後のpAKTS473及びpS6S235/236の全体レベルがanti-CD19 28Z CAR-T細胞よりも明らかに高かった。なお、シグナル分子AKTS473のリン酸化レベルは細胞の増殖・生存能力の促進を示し、シグナル分子リボソームタンパク質S6S235/236のリン酸化レベルは細胞の成長・増殖レベルを示す。これら2つの指標は、シグナル経路の面から、anti-CD19 EBRS28Z CAR-T細胞の増殖・生存能力が比較的良好なことを示していた。
anti-CD19 28Z CAR-T細胞及びEBRS28Z CAR-T細胞は、
CD19+腫瘍細胞に対し毒性反応を示す。そこで、CD19-K562細胞を1640無血清培地に再懸濁したあと、1×CellTraker deep red dyeで予め染色した(37℃のウォーターバス、30min)。続いて、1640無血清培地を1回洗浄し、T細胞完全培地を用いて再懸濁したあと、CD19+K562_CD19(IRES mCherry)細胞と1:1で混合して標的細胞とした。そして、anti-CD19 28Z CAR-T細胞及びanti-CD19 EBRS28Z CAR-T細胞を当該混合型標的細胞とそれぞれ3:1、1:1、1:3の割合で混合し、丸底の96ウェルマイクロプレートにプレーティングして均一に混合したあと、室温で遠心分離(400g、1min)にかけて細胞間の接触を促進させた。次に、完全培地を用い、37℃のインキュベーター内で1日培養してからサンプルを回収し、氷上に載置した。そして、CD19-K562細胞(APC+、mCherry-)のパーセンテージとCD19+K562_CD19細胞(APC-、mCherry+)のパーセンテージの変化をフローサイトメトリー測定し、実験群の「CD19-K562細胞(APC+、mCherry-)のパーセンテージ/CD19+K562_CD19細胞(APC-、mCherry+)のパーセンテージ」をNとした。N値は、anti-CD19 28Z CAR-T細胞又はanti-CD19 EBRS28Z CAR-T細胞を添加していない混合型標的細胞サンプルウェルの「N0=CD19-K562細胞(APC+、mCherry-)のパーセンテージ/CD19+K562_CD19細胞(APC-、mCherry+)のパーセンテージ」を基準としたあと、生存割合N/N0を算出した。即ち、殺傷率の式は「Lysis(%)=1-N/N0」とした。その結果、図2lに示すように、CD19+腫瘍細胞に対するanti-CD19 EBRS28Z CAR-T細胞の毒性は、anti-CD19 28Z CAR-T細胞と同等であることが示された。
CD19+腫瘍細胞に対し毒性反応を示す。そこで、CD19-K562細胞を1640無血清培地に再懸濁したあと、1×CellTraker deep red dyeで予め染色した(37℃のウォーターバス、30min)。続いて、1640無血清培地を1回洗浄し、T細胞完全培地を用いて再懸濁したあと、CD19+K562_CD19(IRES mCherry)細胞と1:1で混合して標的細胞とした。そして、anti-CD19 28Z CAR-T細胞及びanti-CD19 EBRS28Z CAR-T細胞を当該混合型標的細胞とそれぞれ3:1、1:1、1:3の割合で混合し、丸底の96ウェルマイクロプレートにプレーティングして均一に混合したあと、室温で遠心分離(400g、1min)にかけて細胞間の接触を促進させた。次に、完全培地を用い、37℃のインキュベーター内で1日培養してからサンプルを回収し、氷上に載置した。そして、CD19-K562細胞(APC+、mCherry-)のパーセンテージとCD19+K562_CD19細胞(APC-、mCherry+)のパーセンテージの変化をフローサイトメトリー測定し、実験群の「CD19-K562細胞(APC+、mCherry-)のパーセンテージ/CD19+K562_CD19細胞(APC-、mCherry+)のパーセンテージ」をNとした。N値は、anti-CD19 28Z CAR-T細胞又はanti-CD19 EBRS28Z CAR-T細胞を添加していない混合型標的細胞サンプルウェルの「N0=CD19-K562細胞(APC+、mCherry-)のパーセンテージ/CD19+K562_CD19細胞(APC-、mCherry+)のパーセンテージ」を基準としたあと、生存割合N/N0を算出した。即ち、殺傷率の式は「Lysis(%)=1-N/N0」とした。その結果、図2lに示すように、CD19+腫瘍細胞に対するanti-CD19 EBRS28Z CAR-T細胞の毒性は、anti-CD19 28Z CAR-T細胞と同等であることが示された。
実験データの処理方法:
ソフトウェアGraphPad Prism 8.0.2を使用して、データの統計分析を行い、P<0.05(具体的には、*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001、****P<0.0001)のとき、差に統計的に有意性があるとした。また、各群のデータはMean±SDで示した。
ソフトウェアGraphPad Prism 8.0.2を使用して、データの統計分析を行い、P<0.05(具体的には、*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001、****P<0.0001)のとき、差に統計的に有意性があるとした。また、各群のデータはMean±SDで示した。
図2d~図2fでは、一元配置分散分析にSidakの多重比較検定を加えた。
図2g、図2h、図2j~図2lでは、二元配置分散分析にSidakの多重比較検定を加えた。
図2iでは、二元配置分散分析行った。
実験結果:
(1)anti-CD19 EBRS28Z CAR-T細胞及びanti-CD19 28Z CAR-T細胞の膜上レベル及びCD4/CD8比は同等であった。
(1)anti-CD19 EBRS28Z CAR-T細胞及びanti-CD19 28Z CAR-T細胞の膜上レベル及びCD4/CD8比は同等であった。
(2)anti-CD19 28Z CAR-T細胞及びanti-CD19 EBRS28Z CAR-T細胞をRaji細胞によりインビトロで特異的に刺激したところ、anti-CD19 EBRS28Z CAR-T細胞が産生したIL-2及びTNF-αのサイトカインレベルは、anti-CD19 28Z CAR-T細胞と類似していたが、IFN-γのサイトカインレベルはanti-CD19 28Z CAR-T細胞よりも低下した。
(3)anti-CD19 28Z CAR-T細胞及びanti-CD19 EBRS28Z CAR-T細胞をRaji細胞によりインビトロで特異的に刺激し、一定時間増幅させたあと、異なるタイミングでサンプルを採取して増殖能力(即ち、Ki67の発現レ
ベル)を測定したところ、anti-CD19 EBRS28Z CAR-Tの増殖能力はanti-CD19 28Z CAR-T細胞よりも明らかに高かった。
ベル)を測定したところ、anti-CD19 EBRS28Z CAR-Tの増殖能力はanti-CD19 28Z CAR-T細胞よりも明らかに高かった。
(4)anti-CD19 28Z CAR-T細胞及びanti-CD19 EBRS28Z CAR-T細胞をRaji細胞によりインビトロで特異的に刺激し、一定時間増幅させたあと、異なるタイミングでサンプルを採取してアポトーシスレベルを測定した。そして、anti-CD19 EBRS28Z CAR-T細胞とanti-CD19 28Z CAR-T細胞を比較したところ、前期は両者が同等であったが、後期には、anti-CD19 EBRS28Z CAR-T細胞のアポトーシスレベルがanti-CD19 28Z CAR-T細胞よりも明らかに低くなった。
(5)anti-CD19 28Z CAR-T細胞及びanti-CD19 EBRS28Z CAR-T細胞をRaji細胞により特異的に刺激し、一定時間増幅させたあと、異なるタイミングでサンプルを採取し、増幅したCAR+T細胞の数を測定したところ、時間の経過に伴って、anti-CD19 EBRS28Z CAR-T細胞の数はanti-CD19 28Z CAR-T細胞よりも明らかに高くなった。
(6)anti-CD19 28Z CAR-T細胞及びanti-CD19 EBRS28Z CAR-T細胞をRaji細胞により特異的に刺激し、一定時間増幅させたあと、異なるタイミングでサンプルを採取してシグナル分子AKTS473のリン酸化レベルを測定した。なお、シグナル分子AKTS473のリン酸化レベルは、細胞の増殖・生存能力の促進を示す。すると、anti-CD19 EBRS28Z CAR-T細胞の全体的なpAKTS473レベルはanti-CD19 28Z CAR-T細胞よりも高く、anti-CD19 EBRS28Z CAR-T細胞の増殖・生存能力がanti-CD19 28Z CAR-T細胞よりも明らかに高いことが示された。
(7)anti-CD19 28Z CAR-T細胞及びanti-CD19 EBRS28Z CAR-T細胞をRaji細胞により特異的に刺激し、一定時間増幅させたあと、異なるタイミングでサンプルを採取してシグナル分子S6S235/236のリン酸化レベルを測定した。なお、シグナル分子S6S235/236のリン酸化レベルは細胞の成長・増殖能力を示す。すると、anti-CD19 EBRS28Z CAR-T細胞の全体的なpS6S235/236レベルはanti-CD19 28Z CAR-T細胞よりも明らかに高く、anti-CD19 EBRS28Z CAR-T細胞の成長・増殖能力がanti-CD19 28Z CAR-T細胞よりも明らかに高いことが示された。
(8)anti-CD19 28Z CAR-T細胞及びanti-CD19 EBRS28Z CAR-T細胞と、CD19+K562:CD19-K562を共培養するインビトロ殺傷実験において、anti-CD19 EBRS28Z CAR-T細胞の殺傷能力はanti-CD19 28Z CAR-T細胞と同等であった。
anti-CD19EBRS28Z CAR-T細胞とanti-CD19 28Z CAR-T細胞の体内における抗皮下腫瘍能力を比較する実験計画は次の通りであった。
無菌操作により、3×107/mlのRaji細胞-PBS再懸濁液を準備した。そして、6週齢の各B-NDG雌マウスの左側背部に100μl・3百万個のRaji細胞を皮下移植し、この時点をday0とした。そして、6日後に、Raji皮下腫瘍が直径6~7mmまで成長した時点で、マウスをランダムに3群(EBRS28Z群、28Z群、vector群)に群分けし、各マウスの尾静脈に100ul・8百万個のT細胞を注射した。その後、定期的にノギスで腫瘍の大きさを測定し、腫瘍データ及びマウスの生存期間を記録した。また、腫瘍面積=長さ×幅とした。
実験の結論:anti-CD19 EBRS28Z CAR-Tは抗腫瘍能力を有していた。
以上は本発明の好ましい実施例にすぎず、本発明を形式的及び実質的になんら制限するものではない。指摘すべき点として、当業者であれば、本発明の方法を逸脱しないことを前提に、若干の改良及び補足が可能であって、これらの改良及び補足もまた本発明の保護の範囲とみなすべきである。本専門分野を熟知した技術者が、本発明の精神及び範囲を逸脱することなく、上記で開示した技術内容を利用して実施可能な些細な修正、改変及び変形の等価の変更は、いずれも本発明における等価の実施例である。また、本発明の実質的技術に基づいて上記の実施例に対し実施される任意の等価の変更の修正、改変及び変形は、いずれも本発明の技術方案の範囲に属する。
Claims (28)
- Y/F突然変異を有するCD3ε細胞内領域を含むキメラ抗原受容体であって、
順に連結される細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含み、
前記細胞外ドメインは抗原認識領域とヒンジ領域を含み、
前記細胞内ドメインにおける膜貫通ドメインに連結される一端には、Y/F突然変異を有するCD3ε細胞内領域が連結されており、前記Y/F突然変異を有するCD3ε細胞内領域とは、CD3ε細胞内領域の免疫受容体活性化チロシンモチーフにおける2つのチロシンがいずれもフェニルアラニンに突然変異したY/F突然変異型CD3ε細胞内領域のことである、Y/F突然変異を有するCD3ε細胞内領域を含むキメラ抗原受容体。 - 更に、
(1)前記Y/F突然変異を有するCD3ε細胞内領域のアミノ酸配列はSEQ ID NO:1に示す通りであり、
(2)前記細胞内ドメインは、順に連結されるY/F突然変異を有するCD3ε細胞内領域、共刺激シグナル伝達領域及びCD3ζ細胞内セグメントを含む、
との特徴のうちの1つ又は複数を含むことを特徴とする請求項1に記載のY/F突然変異を有するCD3ε細胞内領域を含むキメラ抗原受容体。 - 前記共刺激シグナル伝達領域は、CD27、CD28、CD134、4-1BB、OX40及びICOSのうちの1つ又は複数の細胞内セグメントから選択されることを特徴とする請求項2に記載のY/F突然変異を有するCD3ε細胞内領域を含むキメラ抗原受容体。
- 更に、
(1)前記CD28の細胞内セグメントのアミノ酸配列はSEQ ID NO:2に示す通りであり、
(2)前記CD3ζ細胞内セグメントのアミノ酸配列はSEQ ID NO:3に示す通りである、
との特徴のうちの1つ又は複数を含むことを特徴とする請求項3に記載のY/F突然変異を有するCD3ε細胞内領域を含むキメラ抗原受容体。 - 更に、
a.前記抗原認識領域は、腫瘍表面抗原を標的とする一本鎖抗体から選択され、前記腫瘍表面抗原は、CD19、メソテリン、CD20、CD22、CD123、CD30、CD33、CD38、CD138、BCMA、線維芽細胞活性化タンパク質(Fibroblast activation protein)、グリピカン-3(Glypican-3)、CEA、EGFRvIII、PSMA、Her2、IL13Rα2、CD171及びGD2のうちの1つ又は複数から選択され、
b.前記膜貫通ドメインは、CD28、CD4、CD8α、OX40又はH2-Kbのうちの1つ又は複数の膜貫通領域から選択され、
c.前記ヒンジ領域は、CD28ヒンジ領域、CD8αヒンジ領域、CD4ヒンジ領域、免疫グロブリンIgGのヒンジ領域、又は免疫グロブリンIgGのヒンジ領域とCH2CH3領域が連結したヒンジ領域のうちの1つ又は複数から選択される、
との特徴のうちの1つ又は複数を含むことを特徴とする請求項1に記載のY/F突然変異を有するCD3ε細胞内領域を含むキメラ抗原受容体。 - 更に、
d.前記一本鎖抗体はFMC63から選択され、
e.前記CD28の膜貫通領域のアミノ酸配列はSEQ ID NO:4に示す通りであ
り、
f.前記CD28ヒンジ領域のアミノ酸構造はSEQ ID NO:7に示す通りである、
との特徴のうちの1つ又は複数を含むことを特徴とする請求項5に記載のY/F突然変異を有するCD3ε細胞内領域を含むキメラ抗原受容体。 - 更に、
1)前記Y/F突然変異を有するCD3ε細胞内領域を含むキメラ抗原受容体の抗原認識領域はFMC63から選択され、ヒンジ領域はCD28ヒンジ領域から選択され、前記膜貫通ドメインはCD28膜貫通領域から選択され、細胞内ドメインは、順に連結されるY/F突然変異を有するCD3ε細胞内領域、CD28の細胞内セグメント及びCD3ζ細胞内セグメントを含み、
2)前記Y/F突然変異を有するCD3ε細胞内領域を含むキメラ抗原受容体のアミノ酸配列はSEQ ID NO:5に示す通りである、
との特徴のうちの1つ又は複数を含むことを特徴とする請求項1~6のいずれか1項に記載のY/F突然変異を有するCD3ε細胞内領域を含むキメラ抗原受容体。 - (1)請求項1~7のいずれか1項に記載のY/F突然変異を有するCD3ε細胞内領域を含むキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド配列、及び
(2)(1)で述べたポリヌクレオチド配列の相補的配列、
から選択されるポリヌクレオチド配列。 - 前記ポリヌクレオチド配列はSEQ ID NO:6に示す通りであることを特徴とする請求項8に記載のポリヌクレオチド配列。
- 核酸構築物であって、
請求項8又は9に記載のポリヌクレオチド配列を含み、
好ましくは、前記核酸構築物はベクターであり、
より好ましくは、前記核酸構築物はレンチウイルスベクターであって、複製起点、3’LTR、5’LTR、及び請求項8又は9に記載のポリヌクレオチド配列を含む、核酸構築物。 - 請求項10に記載の核酸構築物及びレンチウイルスベクターの補助成分を含む、レンチウイルスベクターシステム。
- 請求項8又は9に記載のポリヌクレオチド配列を含むか、請求項10に記載の核酸構築物を含むか、請求項11に記載のレンチウイルスベクターシステムに感染していることを特徴とする遺伝子組換えT細胞。
- 請求項1~7のいずれか1項に記載のY/F突然変異を有するCD3ε細胞内領域を含むキメラ抗原受容体、請求項8又は9に記載のポリヌクレオチド配列、或いは、請求項10に記載の核酸構築物、或いは、請求項11に記載のレンチウイルスベクターシステムの、(1)T細胞の作製、(2)T細胞の生存能力の向上、(3)T細胞アポトーシスの阻害、(4)T細胞の増殖及び/又は生存能力の強化、(5)T細胞の抗腫瘍能力の向上、(6)T細胞からのサイトカインIFN-γレベルの抑制及びTNF-αの分泌阻害、のうちのいずれか1つ又は複数の用途の製品の製造における使用。
- 請求項1~7のいずれか1項に記載のY/F突然変異を有するCD3ε細胞内領域を含むキメラ抗原受容体、請求項8又は9に記載のポリヌクレオチド配列、或いは、請求項10に記載の核酸構築物、或いは、請求項11に記載のレンチウイルスベクターシステム、
或いは、請求項12に記載の遺伝子組換えT細胞の、腫瘍治療製品の製造における使用。 - CD3ε細胞内塩基性アミノ酸リッチな領域のモチーフを含むキメラ抗原受容体であって、
順に連結される細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含み、
前記細胞外ドメインは抗原認識領域とヒンジ領域を含み、
前記細胞内ドメインにおける膜貫通ドメインに連結される一端にはCD3ε細胞内塩基性アミノ酸リッチな領域のモチーフが連結されている、CD3ε細胞内塩基性アミノ酸リッチな領域のモチーフを含むキメラキメラ抗原受容体。 - 更に、
(1)前記CD3ε細胞内塩基性アミノ酸リッチな領域のモチーフのアミノ酸配列はSEQ ID NO:10に示す通りであり、
(2)前記細胞内ドメインは、順に連結されるCD3ε細胞内塩基性アミノ酸リッチな領域のモチーフ、共刺激シグナル伝達領域及びCD3ζ細胞内セグメントを含む、
との特徴のうちの1つ又は複数を含むことを特徴とする請求項15に記載のCD3ε細胞内塩基性アミノ酸リッチな領域のモチーフを含むキメラ抗原受容体。 - 前記共刺激シグナル伝達領域は、CD27、CD28、CD134、4-1BB、OX-40及びICOSのうちの1つ又は複数の細胞内セグメントから選択されることを特徴とする請求項16に記載のCD3ε細胞内塩基性アミノ酸リッチな領域のモチーフを含むキメラ抗原受容体。
- 更に、
(1)前記CD28の細胞内セグメントのアミノ酸配列はSEQ ID NO:2に示す通りであり、
(2)前記CD3ζ細胞内セグメントのアミノ酸配列はSEQ ID NO:3に示す通りである、
との特徴のうちの1つ又は複数を含むことを特徴とする請求項17に記載のCD3ε細胞内塩基性アミノ酸リッチな領域のモチーフを含むキメラ抗原受容体。 - 更に、
a.前記抗原認識領域は、腫瘍表面抗原を標的とする一本鎖抗体から選択され、前記腫瘍表面抗原は、CD19、メソテリン、CD20、CD22、CD123、CD30、CD33、CD38、CD138、BCMA、線維芽細胞活性化タンパク質(Fibroblast activation protein)、グリピカン-3(Glypican-3)、CEA、EGFRvIII、PSMA、Her2、IL13Rα2、CD171及びGD2のうちの1つ又は複数から選択され、
b.前記膜貫通ドメインは、CD28、CD4、CD8α、OX40又はH2-Kbのうちの1つ又は複数の膜貫通領域から選択され、
c.前記ヒンジ領域は、CD28ヒンジ領域、CD8αヒンジ領域、CD4ヒンジ領域、免疫グロブリンIgGのヒンジ領域、又は免疫グロブリンIgGのヒンジ領域とCH2CH3領域が連結したヒンジ領域のうちの1つ又は複数から選択される、
との特徴のうちの1つ又は複数を含むことを特徴とする請求項15に記載のCD3ε細胞内塩基性アミノ酸リッチな領域のモチーフを含むキメラ抗原受容体。 - 更に、
d.前記一本鎖抗体はFMC63から選択され、
e.前記CD28の膜貫通領域のアミノ酸配列はSEQ ID NO:4に示す通りであり、
f.前記CD28ヒンジ領域のアミノ酸構造はSEQ ID NO:7に示す通りである、
との特徴のうちの1つ又は複数を含むことを特徴とする請求項19に記載のCD3ε細胞内塩基性アミノ酸リッチな領域のモチーフを含むキメラ抗原受容体。 - 更に、
1)前記CD3ε細胞内塩基性アミノ酸リッチな領域のモチーフを含むキメラ抗原受容体の抗原認識領域はFMC63から選択され、ヒンジ領域はCD28ヒンジ領域から選択され、前記膜貫通ドメインはCD28の膜貫通領域から選択され、細胞内ドメインは、順に連結されるCD3ε細胞内塩基性アミノ酸リッチな領域のモチーフ、CD28の細胞内セグメント及びCD3ζ細胞内セグメントを含み、
2)前記キメラ抗原受容体のアミノ酸配列はSEQ ID NO:11に示す通りである、
との特徴のうちの1つ又は複数を含むことを特徴とする請求項15~20のいずれか1項に記載のCD3ε細胞内塩基性アミノ酸リッチな領域のモチーフを含むキメラ抗原受容体。 - (1)請求項15~21のいずれか1項に記載のCD3ε細胞内塩基性アミノ酸リッチな領域のモチーフを含むキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド配列、及び
(2)(1)で述べたポリヌクレオチド配列の相補的配列、
から選択されるポリヌクレオチド配列。 - 前記ポリヌクレオチド配列はSEQ ID NO:12に示す通りであることを特徴とする請求項22に記載のポリヌクレオチド配列。
- 核酸構築物であって、
請求項22又は23に記載のポリヌクレオチド配列を含み、
好ましくは、前記核酸構築物はベクターであり、
より好ましくは、前記核酸構築物はレンチウイルスベクターであって、複製起点、3’LTR、5’LTR、及び請求項22又は23に記載のポリヌクレオチド配列を含む核酸構築物。 - 請求項24に記載の核酸構築物及びレンチウイルスベクターの補助成分を含むレンチウイルスベクターシステム。
- 請求項22又は23に記載のポリヌクレオチド配列を含むか、請求項24に記載の核酸構築物を含むか、請求項25に記載のレンチウイルスベクターシステムに感染していることを特徴とする遺伝子組換えT細胞。
- 請求項15~21のいずれか1項に記載のCD3ε細胞内塩基性アミノ酸リッチな領域のモチーフを含むキメラ抗原受容体、請求項22又は23に記載のポリヌクレオチド配列、或いは、請求項24に記載の核酸構築物、或いは、請求項25に記載のレンチウイルスベクターシステムの、(1)T細胞の作製、(2)T細胞の生存能力の向上、(3)T細胞アポトーシスの阻害、(4)T細胞の増殖能力の強化、(5)T細胞の抗腫瘍能力の向上、(6)T細胞からのサイトカインIFN-γレベルの抑制、のうちのいずれか1つ又は複数の用途の製品の製造における使用。
- 請求項15~21のいずれか1項に記載のCD3ε細胞内塩基性アミノ酸リッチな領域のモチーフを含むキメラ抗原受容体、請求項22又は23に記載のポリヌクレオチド配列、或いは、請求項24に記載の核酸構築物、或いは、請求項25に記載のレンチウイルス
ベクターシステム、或いは、請求項26に記載の遺伝子組換えT細胞の、腫瘍治療製品の製造における使用。
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