CN105567640A - 一种嵌合抗原受体脂肪干细胞及其制备方法 - Google Patents

一种嵌合抗原受体脂肪干细胞及其制备方法 Download PDF

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史秀娟
刘小青
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Abstract

本发明公开一种嵌合抗原受体脂肪干细胞及其制备方法，所述嵌合抗原受体脂肪干细胞由嵌合抗原受体、脂肪干细胞和肿瘤杀伤因子组成。本发明结合了抗原受体特异性性地结合特异肿瘤类型的高靶向性特点，以及脂肪肝细胞免疫原性低、容易被病毒感染、能再短时间内大规模扩增以及肿瘤杀伤因子的抗肿瘤作用，能够解决当前CART治疗肿瘤的“免疫风暴”、嵌合抗原表达效率低及异体移植免疫排斥等问题，提高了治疗肿瘤的效果。经过改造的脂肪干细胞，既具有了特异的迁移至特定肿瘤部位的高效靶向性，同时又避免了过度激活免疫系统从而进一步产生免疫排斥的风险，并且其携带的肿瘤杀伤因子又能够在肿瘤部位高效杀伤肿瘤，进而达到治疗肿瘤的目的。

Description

一种嵌合抗原受体脂肪干细胞及其制备方法
技术领域
本发明涉及肿瘤治疗领域，尤其涉及一种嵌合抗原受体脂肪干细胞及其制备方法。
背景技术
肿瘤是严重危害人类健康的重大疾病之一。在我国，肿瘤极大地威胁着人民的生命健康，极大地降低了肿瘤患者的生活质量，同时肿瘤也给家庭和社会造成了巨大的负担。因此，寻找有效的肿瘤治疗方法，彻底攻克肿瘤是世界医学界的重要研究课题。
肿瘤免疫疗法是当前肿瘤治疗领域最具前景研究方向之一，是近年来一种新兴的、具有显著疗效的肿瘤治疗新型方法。初步的临床试验结果表明其治疗效率非常高，各大药企纷纷寻求与其他公司合作研发肿瘤免疫相关治疗方法。而传统的三大主要治疗手段即手术治疗、化疗、放疗虽然是全球肿瘤治疗的基本手段方法，然而其治疗效果有限。手术治疗虽然可以切除较大体积的肿瘤，然而对于体积较小以及肿瘤转移之后的小型病灶无法达到切除的目的。化疗是利用化学药物杀死肿瘤细胞、抑制肿瘤细胞的生长繁殖的一种治疗方式，然而，对大多数肿瘤的治疗的有效性较低，特别对中晚期肿瘤患者，治疗效果有限，并且化疗在杀伤肿瘤细胞的同时，也将正常细胞和免疫细胞一同杀灭，导致病患者免疫能力和身体机能下降，生活质量降低。放疗是用放射线照射癌组织，以抑制和杀灭癌细胞的一种治疗方法，然而，放疗对癌细胞和正常细胞没有分辨能力，多次放疗后，患者会产生一系列毒副作用和反应，对治疗肿瘤效果非常有限。因此，随着肿瘤免疫学理论和技术的发展，免疫细胞治疗在肿瘤治疗中的作用日益受到重视。肿瘤生物治疗是继手术、放疗和化疗之后的第四大肿瘤治疗技术，具有极其光明的应用前景。
目前，免疫肿瘤疗法最热门、最有效果的疗法是基于嵌合抗原受体T细胞(ChimericantigenreceptorTcells,CART)疗法。CART免疫疗法的基本原理是首先分离患者的T细胞，然后利用基因工程改造这种T细胞，即通过逆转录病毒和慢病毒载体给T细胞加入一个能识别肿瘤细胞，并且同时激活T细胞杀死肿瘤细胞的嵌合抗体。然后将这些T细胞进行体外扩增后回输到患者体内，使免疫细胞具有特异性识别和杀伤肿瘤的能力。
嵌合抗原受体（chimericantigenreceptor,CAR）主要由三部分组成，位于细胞外的抗原结合区scFv，跨膜区以及胞内信号转导结构域组成。其中，根据胞内信号转导结构域的研究发展，CAR从第一代发展到目前第三代。第一代CART仅含有一个信号单元，大多来自于CD3ζ。第二代CART是在第一代CART的胞内信号转导结构域基础之上增加了一个共刺激结构域，比如CD28、OX40或者4-1BB。第三代CART是在第二代CART的胞内信号转导结构域基础之上再增加一个共刺激结构域，因此具有两个共刺激结构域，能够进一步提高CART的扩增倍数以及在体内存活的时间，提升肿瘤治疗效果。
尽管目前嵌合抗原受体结合T细胞在治疗一些肿瘤方面取得了非常重大的突破，然而，也存在一些致命缺陷。比如“免疫风暴”反应，这主要是由于T细胞被过度激活，从而引起全身性的激烈的免疫反应，会造成输入CART的患者死亡。另外，逆转录病毒或者慢病毒也不容易感染T细胞，这会造成表达目的嵌合抗原受体的T细胞数量较少，达不到治疗肿瘤的良好效果。并且，T细胞具有个体特异性，每个患者只能够扩增自己的T细胞，而不能够异体移植T细胞，因为会产生免疫排斥，然而肿瘤患者尤其是晚期肿瘤患者免疫系统已经遭到巨大的破坏，分离的T细胞活性不高，不容易在短时间内大规模扩增，因而最终CART的治疗效果大打折扣。
因此，现有技术还有待于改进和发展。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种嵌合抗原受体脂肪干细胞及其制备方法，旨在解决现有嵌合抗原受体T细胞治疗肿瘤容易产生“免疫风暴”、病毒感染效率低以及异体移植产生免疫排斥的问题。
本发明的技术方案如下：
一种嵌合抗原受体脂肪干细胞，其中，所述嵌合抗原受体脂肪干细胞由嵌合抗原受体、脂肪干细胞和肿瘤杀伤因子组成。
所述的嵌合抗原受体脂肪干细胞，其中，所述嵌合抗原受体由scFv抗原结合序列、跨膜序列及胞内信号转导序列组成。
所述的嵌合抗原受体脂肪干细胞，其中，所述scFv抗原结合序列包括轻链可变区序列和重链可变区序列。
所述的嵌合抗原受体脂肪干细胞，其中，所述scFv抗原结合序列包括轻链可变区序列、重链可变区序列、连接轻链可变区序列和重链可变区序列的优化联结区序列及位于轻链可变区序列之前的可溶信号肽序列。
所述的嵌合抗原受体脂肪干细胞，其中，所述scFv抗原结合序列为CEA、cMet、EGFRvIII、FAP、Her2、GD2、PSMA、Mesothelin和NCAM中的一种。
所述的嵌合抗原受体脂肪干细胞，其中，所述scFv抗原结合序列和跨膜序列之间包含一段Hinge序列。
所述的嵌合抗原受体脂肪干细胞，其中，所述跨膜序列为CD8。
所述的嵌合抗原受体脂肪干细胞，其中，所述胞内信号转导序列包括CD28胞内结构域序列、4-1BB胞内结构域序列和CD3ζ胞内结构域序列。
所述的嵌合抗原受体脂肪干细胞，其中，所述肿瘤杀伤因子为TRAIL基因、TNF-α基因及TNF家族具有肿瘤杀伤作用的基因、具有肿瘤杀伤作用的microRNA分子以及具有肿瘤杀伤作用的蛋白因子中的一种。
一种如上任一所述的嵌合抗原受体脂肪干细胞的制备方法，其中，包括步骤：
A、首先合成针对脂肪干细胞的嵌合抗原受体序列，并合成能够分泌到胞外的肿瘤杀伤因子序列；
B、然后将上述嵌合抗原受体序列和肿瘤杀伤因子序列分别构建到慢病毒载体上，得到表达嵌合抗原受体或者肿瘤杀伤因子的慢病毒；
C、将表达嵌合抗原受体或者肿瘤杀伤因子的慢病毒感染脂肪干细胞，慢病毒感染完成之后，得到分泌表达肿瘤杀伤因子的嵌合抗原受体脂肪干细胞。
有益效果：本发明结合了嵌合抗原受体特异性地结合特异肿瘤类型的高靶向性特点，以及脂肪干细胞免疫原性低、容易被病毒感染、能在短时间内大规模扩增以及肿瘤杀伤因子的抗肿瘤作用，能够解决当前CART治疗肿瘤的多个包括“免疫风暴”、嵌合抗原表达效率低以及异体移植免疫排斥等难以解决的问题，进而提高了治疗肿瘤的效果。
附图说明
图1为本发明的第三代CAR的组成示意图。
图2为本发明的CAR-Trunc-FGFR1的组成示意图。
图3为本发明实施例1中第三代CAR、脂肪干细胞以及TRAIL共表达及体外大规模扩增之后输入人体治疗肿瘤的流程示意图。
图4为本发明实施例2中CAR-Trunc-FGFR1、脂肪干细胞以及TRAIL共表达及体外大规模扩增之后输入人体治疗肿瘤的流程示意图。
图5为本发明实施例3中第三代CAR、脂肪干细胞以及TNF-α共表达及体外大规模扩增之后输入人体治疗肿瘤的流程示意图。
图6为本发明实施例4中CAR-Trunc-FGFR1、脂肪干细胞以及TNF-α共表达及体外大规模扩增之后输入人体治疗肿瘤的流程示意图。
图7为本发明实施例5中第三代CAR、脂肪干细胞以及microRNA-101共表达及体外大规模扩增之后输入人体治疗肿瘤的流程示意图。
图8为本发明实施例6中CAR-Trunc-FGFR1、脂肪干细胞以及microRNA-101共表达及体外大规模扩增之后输入人体治疗肿瘤的流程示意图。
具体实施方式
本发明提供一种嵌合抗原受体脂肪干细胞及其制备方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明提供一种嵌合抗原受体脂肪干细胞，其中，所述嵌合抗原受体脂肪干细胞由嵌合抗原受体、脂肪干细胞和肿瘤杀伤因子组成。
本发明选择脂肪干细胞来作为承载嵌合抗原受体靶向治疗肿瘤的载体，其比T细胞作为嵌合抗原受体的载体治疗肿瘤更加具有优势，这是因为脂肪干细胞来源广泛、易于分离、取材方便、给患者带来的痛苦较小、免疫原性极低并且不涉及道德伦理问题等优点而日益受到研究者的重视，在临床上治疗疾病有着广泛的应用前景。
本发明中采用的脂肪干细胞在临床治疗疾病方面已经有比较成熟、广泛的应用。例如，脂肪干细胞可以作为种子细胞；脂肪干细胞分泌多种因子可支持造血；脂肪干细胞可以调节免疫系统。尤其重要的是，脂肪干细胞还可以作为基因工程载体。带有目的基因的病毒直接用于基因治疗时，因体内的抗病毒效应以及病毒的整合性，往往达不到理想的基因治疗效果，用脂肪干细胞作为基因治疗载体后可以大大降低病毒感染对体内细胞组织的直接损伤，而且脂肪干细胞本身可以分泌一些营养因子，从而更加有助于组织缺陷的康复。
本发明所述嵌合抗原受体脂肪干细胞还包括肿瘤杀伤因子，所述肿瘤杀伤因子为TRAIL基因（又名TNFSF10）、TNF-α基因及TNF家族具有肿瘤杀伤作用的基因、microRNA-101等具有肿瘤杀伤作用的microRNA分子以及其他具有肿瘤杀伤作用的蛋白因子中的一种，上述肿瘤杀伤因子均能够在肿瘤部位高效杀伤肿瘤，进而达到治疗肿瘤的目的。
本发明结合了嵌合抗原受体特异性地结合特异肿瘤类型的高靶向性特点，以及脂肪干细胞免疫原性低、容易被病毒感染、能在短时间内大规模扩增以及肿瘤杀伤因子的抗肿瘤作用，能够解决当前CART治疗肿瘤的多个包括“免疫风暴”、嵌合抗原表达效率低以及异体移植免疫排斥等难以解决的问题，进而提高了治疗肿瘤的效果。经过本发明改造的脂肪干细胞，既具有了非常特异的迁移至特定肿瘤部位的高效靶向性，同时又避免了过度激活免疫系统从而进一步产生免疫排斥的风险，并且其携带的肿瘤杀伤因子又能够在肿瘤部位高效杀伤肿瘤，进而达到治疗肿瘤的目的。
进一步地，本发明所述嵌合抗原受体由scFv抗原结合序列、跨膜序列及胞内信号转导序列组成。本发明需构建第三代的嵌合抗原受体以及改进的针对脂肪干细胞靶向性的嵌合抗原受体（CAR-Trunc-FGFR1）。如图1所示，第三代的嵌合抗原受体由scFv抗原结合序列、跨膜序列及胞内信号转导序列组成。其中，scFv抗原结合序列包括针对不同肿瘤的序列，所述scFv抗原结合序列为CEA（序列见Seq-CEA-scFv）、cMet（序列见Seq-cMet-scFv）、EGFRvIII（序列见Seq-EGFRvIII-scFv）、FAP（序列见Seq-FAP-scFv）、Her2（序列见Seq-Her2-scFv）、GD2（序列见Seq-GD2-scFv）、PSMA（序列见Seq-PSMA-scFv）、Mesothelin（序列见Seq-Mesothelin-scFv）和NCAM（序列见Seq-NCAM-scFv）等中的一种。
进一步地，本发明所述scFv抗原结合序列包括轻链可变区序列和重链可变区序列。优选地，本发明所述scFv抗原结合序列包括轻链可变区序列、重链可变区序列、连接轻链可变区序列和重链可变区序列的优化联结区序列及位于轻链可变区序列之前的可溶信号肽序列，如图1所示。
跨膜序列在脂肪干细胞活化中起着重要的作用，对跨膜序列不同的设计能够影响导入的CAR基因的表达能力。值得注意的是，所述scFv抗原结合序列和跨膜序列之间包含一段铰链序列（Hinge序列），如图1所示。所述Hinge序列为CD8的胞外铰链结构。优选地，所述跨膜序列为CD8。而经过实验验证简化了操作，采用CD8分子的胞外铰链结构将跨膜序列与scFv抗原结合序列直接相连接。换句话说，本发明跨膜序列包括CD8的胞外铰链序列及跨膜序列（序列见Seq-CD8-hinge-trans）。
进一步地，本发明所述胞内信号转导序列包括CD28胞内结构域序列（序列见Seq-CD28-endo），4-1BB胞内结构域序列（序列见Seq-4-1BB-endo）以及CD3ζ胞内结构域序列（序列见Seq-CD3ζ-endo）。
本发明将上述不同的scFv抗原结合序列、铰链序列、跨膜序列以及胞内信号转导序列自由组合，就可以得到针对不同实体肿瘤的嵌合抗原受体脂肪干细胞。其中，所述实体肿瘤包括胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、胰腺癌等。
本发明中，改进的针对脂肪干细胞靶向性的嵌合抗原受体（CAR-Trunc-FGFR1）主要包括针对不同的实体肿瘤的scFv抗原结合序列、bFGF（fibroblastgrowthfactor2，bFGF）的主要受体FGFR1（fibroblastgrowthfactorreceptor1，FGFR1）跨膜序列及胞内信号转导序列，如图2所示。目前的研究表明，bFGF能够有效地维持脂肪干细胞的干性，因此，将bFGF的主要受体FGFR1在脂肪干细胞内高效表达能够极大地有助于维持脂肪干细胞的干性，使脂肪干细胞在体内移植之后有效地、长久地保持活性及生存。所以，本发明中，分别将针对不同肿瘤的scFv抗原结合序列和FGFR1跨膜序列及胞内信号转导序列组合成一种专门为脂肪干细胞而产生的优化CAR-Trunc-FGFR1技术。其中，各种不同的scFv抗原结合序列与在CAR中的序列相同。其中，FGFR1跨膜序列及胞内信号转导序列见Seq-FGFR1-trans-endo。
基于上述嵌合抗原受体脂肪干细胞，本发明还提供一种如上任一所述的嵌合抗原受体脂肪干细胞的制备方法，其包括步骤：
A、首先合成针对脂肪干细胞的嵌合抗原受体序列，并合成能够分泌到胞外的肿瘤杀伤因子序列；
B、然后将上述嵌合抗原受体序列和肿瘤杀伤因子序列分别构建到慢病毒载体上，得到表达嵌合抗原受体或者肿瘤杀伤因子的慢病毒；
C、将表达嵌合抗原受体或者肿瘤杀伤因子的慢病毒感染脂肪干细胞，慢病毒感染完成之后，得到分泌表达肿瘤杀伤因子的嵌合抗原受体脂肪干细胞。
通过上述制备方法，本发明结合了嵌合抗原受体特异性地结合特异肿瘤类型的高靶向性特点，以及脂肪干细胞免疫原性低、容易被病毒感染、能在短时间内大规模扩增以及肿瘤杀伤因子的抗肿瘤作用，能够解决当前CART治疗肿瘤的多个包括“免疫风暴”、嵌合抗原表达效率低以及异体移植免疫排斥等难以解决的问题，进而提高了治疗肿瘤的效果。
下面通过实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
CAR-脂肪干细胞表达TRAIL治疗肿瘤
在本实施例中，针对不同的实体肿瘤，首先结合第三代CAR、脂肪干细胞以及表达分泌型TRAIL来治疗肿瘤，如图3所示。首先需要合成第三代嵌合抗原受体即合成串联的：可溶信号肽序列-scFv抗原结合序列-CD8（铰链序列及跨膜序列）-CD28-endo-4-1BB-endo-CD3ζ序列，其中，合成的序列两端需要合成EcoRI和BamHI酶切位点。另外，还需要合成能够分泌到胞外的TRAIL基因（又名TNFSF10），其序列见Seq-TRAIL。其中，TRAIL序列的两端也分别需要加上EcoRI和BamHI酶切位点。然后将上述两种序列分别构建到PLVX慢病毒载体上。构建过称为：采用EcoRI和BamHI对PLVX载体进行双酶切，然后用胶回收试剂盒进行胶回收。将胶回收的PLVX载体与合成的可溶信号肽序列-scFv抗原结合序列-CD8（铰链序列及跨膜序列）-CD28-endo-4-1BB-endo-CD3ζ序列或者TRAIL按照摩尔比例为1:10混合（20微升体系），再加入T4DNA连接酶缓冲溶液，之后在45℃水浴热激5分钟，热激之后放置到4℃冰箱5分钟，最后加入2微升T4DNA连接酶，在16℃连接过夜。
之后将连接得到的质粒做细菌转化，其过程为：将连接得到的质粒放置在冰上，并且将DH5α细菌（每管50微升）在冰上解冻；之后用微量移液器吸取3-5微升质粒，加入细菌中，混合均匀，然后将混合物继续放置冰上5-10分钟；然后将混合物在42℃水浴热激90秒钟；然后迅速将混合物再放置在冰上冷却2-3分钟；最后加入500微升无菌LB培养基，放置在37℃振荡培养1小时；培养完成之后涂平板，然后放置在37℃培养过夜；第二天挑取克隆测序。
对于测序正确的序列，进一步需要包装成慢病毒。其过程为：将PLVX-可溶信号肽序列-scFv抗原结合序列-CD8（铰链序列及跨膜序列）-CD28-endo-4-1BB-endo-CD3ζ或者PLVX-TRAIL载体20微克，与pREV、pRRE、pVSVG各10微克混合；然后将50微升超纯水和50微升脂质体混合；之后将质粒和脂质体混合均匀，在室温放置15分钟；最后加入到汇合度为70%-80%的10厘米培养皿的293T细胞中，即图3中的转染过程。然后在6小时之后换上10mL培养基，72小时之后收集上清，用0.44微米滤器过滤之后，采用50000g/min离心90分钟，分别收集PLVX-可溶信号肽序列-scFv抗原结合序列-CD8（铰链序列及跨膜序列）-CD28-endo-4-1BB-endo-CD3ζ或者PLVX-TRAIL慢病毒，备用。
收集到PLVX-可溶信号肽序列-scFv抗原结合序列-CD8（铰链序列及跨膜序列）-CD28-endo-4-1BB-endo-CD3ζ或者PLVX-TRAIL慢病毒之后，同时将这两种慢病毒感染脂肪干细胞，其感染过程为：在10厘米培养皿中培养脂肪干细胞到40%-50%汇合度，然后将PLVX-可溶信号肽序列-scFv抗原结合序列-CD8（铰链序列及跨膜序列）-CD28-endo-4-1BB-endo-CD3ζ或者PLVX-TRAIL这两种慢病毒各1mL以及培养基8mL加入培养皿混合均匀，12小时之后换新鲜培养液即可。
慢病毒感染完成之后，就将分泌表达TRAIL的CAR脂肪干细胞大规模体外扩增。培养到足够数量之后，对细胞进行消化即加入适量胰蛋白酶消化，最后用磷酸盐缓冲液清洗三遍之后，输入人体用于移植治疗肿瘤。
实施例2
CAR-Trunc-FGFR1脂肪干细胞表达TRAIL治疗肿瘤
在本实施例中，针对不同的实体肿瘤，可以结合改进的针对脂肪干细胞的CAR-Trunc-FGFR1、脂肪干细胞以及表达分泌型TRAIL来治疗肿瘤，如图4所示。同理，首先需要合成针对脂肪干细胞的CAR-Trunc-FGFR1，各个结构域串联序列为：可溶信号肽序列-scFv抗原结合序列-FGFR1-trans-endo序列，其中，合成的序列两端需要合成EcoRI和BamHI酶切位点。另外，还需要合成能够分泌到胞外的TRAIL基因（又名TNFSF10），其序列两端也需要加上EcoRI和BamHI酶切位点。
然后将上述两种序列分别构建到PLVX慢病毒载体上。构建过称为：采用EcoRI和BamHI对PLVX载体进行双酶切，然后用胶回收试剂盒进行胶回收。将胶回收的PLVX载体与合成的可溶信号肽序列-scFv抗原结合序列-FGFR1-trans-endo序列或者TRAIL按照摩尔比例为1:10混合（20微升体系），再加入T4DNA连接酶缓冲溶液，之后在45℃水浴热激5分钟，热激之后放置到4℃冰箱5分钟，最后加入2微升T4DNA连接酶，在16℃连接过夜。
之后将连接得到的质粒做细菌转化，其过程为：将连接得到的质粒放置在冰上，并且将DH5α细菌（每管50微升）在冰上解冻；之后用微量移液器吸取3-5微升质粒，加入细菌中，混合均匀，然后将混合物继续放置冰上5-10分钟；然后将混合物在42℃水浴热激90秒钟；然后迅速将混合物再放置在冰上冷却2-3分钟；最后加入500微升无菌LB培养基，放置在37℃振荡培养1小时；培养完成之后涂平板，然后放置在37℃培养过夜；第二天挑取克隆测序。
对于测序正确的序列，进一步需要包装成慢病毒。其过程为：将PLVX-可溶信号肽序列-scFv抗原结合序列-FGFR1-trans-endo载体或者PLVX-TRAIL载体20微克，与pREV、pRRE、pVSVG各10微克混合；然后将50微升超纯水和50微升脂质体混合；之后将质粒和脂质体混合均匀，在室温放置15分钟；最后加入到汇合度为70%-80%的10厘米培养皿的293T细胞中。然后在6小时之后换上10mL培养基，72小时之后收集上清，用0.44微米滤器过滤之后，采用50000g/min离心90分钟，分别收集PLVX-可溶信号肽序列-scFv抗原结合序列-FGFR1-trans-endo或者PLVX-TRAIL慢病毒，备用。
收集到PLVX-可溶信号肽序列-scFv抗原结合序列-FGFR1-trans-endo或者PLVX-TRAIL慢病毒之后，同时将这两种慢病毒感染脂肪干细胞，其感染过程为：在10厘米培养皿中培养脂肪干细胞到40%-50%汇合度，然后将PLVX-可溶信号肽序列-scFv抗原结合序列-FGFR1-trans-endo或者PLVX-TRAIL这两种慢病毒各1mL以及培养基8mL加入培养皿混合均匀，12小时之后换新鲜培养液即可。
病毒感染完成之后，就将分泌表达TRAIL的CAR-Trunc-FGFR1脂肪干细胞大规模体外扩增。培养到足够数量之后，对细胞进行消化即加入适量胰蛋白酶消化，最后用磷酸盐缓冲液清洗三遍之后，输入人体用于移植治疗肿瘤。
实施例3
CAR-脂肪干细胞表达TNF-α治疗肿瘤
在本实施例中，针对不同的实体肿瘤，首先结合第三代CAR、脂肪干细胞以及表达肿瘤杀死因子TNF-α来治疗肿瘤，如图5所示。首先需要合成第三代嵌合抗原受体即合成串联的：可溶信号肽序列-scFv抗原结合序列-CD8（铰链及跨膜）-CD28-endo-4-1BB-endo-CD3ζ序列，其中，合成的序列两端需要合成EcoRI和BamHI酶切位点。另外，还需要合成能够分泌到胞外的TNF-α，其序列见Seq-TNF-α。
其中，TNF-α序列的两端也分别需要加上EcoRI和BamHI酶切位点。然后将上述两种序列分别构建到PLVX慢病毒载体上。构建过称为：采用EcoRI和BamHI对PLVX载体进行双酶切，然后用胶回收试剂盒进行胶回收。将胶回收的PLVX载体与合成的可溶信号肽序列-scFv抗原结合序列-CD8（铰链序列及跨膜序列）-CD28-endo-4-1BB-endo-CD3ζ序列或者TNF-α按照摩尔比例为1:10混合（20微升体系），再加入T4DNA连接酶buffer溶液，之后在45℃水浴热激5分钟，热激之后放置到4℃冰箱5分钟，最后加入2微升T4DNA连接酶，在16摄氏度连接过夜。
之后将连接的质粒做细菌转化，其过程为：将连接的质粒放置在冰上，并且将DH5α细菌（每管50微升）在冰上解冻；之后用微量移液器吸取3-5微升质粒，加入细菌中，混合均匀，然后将混合物继续放置冰上5-10分钟；然后将混合物在42℃水浴热激90秒钟；然后迅速将混合物再放置在冰上冷却2-3分钟；最后加入500微升无菌LB培养基，放置在37℃振荡培养1小时；培养完成之后涂平板，然后放置在37℃培养过夜；第二天挑取克隆测序。
对于测序正确的序列，进一步需要包装成慢病毒。其过程为：将PLVX-可溶信号肽序列-scFv抗原结合序列-CD8（铰链序列及跨膜序列）-CD28-endo-4-1BB-endo-CD3ζ或者PLVX-TNF-α载体20微克，与pREV、pRRE、pVSVG各10微克混合；然后将50微升超纯水和50微升脂质体混合；之后将质粒和脂质体混合均匀，在室温放置15分钟；最后加入到汇合度为70%-80%的10厘米培养皿的293T细胞中。然后在6小时之后换上10mL培养基，72小时之后收集上清，用0.44微米滤器过滤之后，采用50000g/min离心90分钟，分别收集PLVX-可溶信号肽序列-scFv抗原结合序列-CD8（铰链及跨膜）-CD28-endo-4-1BB-endo-CD3ζ或者PLVX-TNF-α慢病毒，备用。
收集到PLVX-可溶信号肽序列-scFv抗原结合序列-CD8（铰链及跨膜）-CD28-endo-4-1BB-endo-CD3ζ或者PLVX-TNF-α慢病毒之后，同时将这两种慢病毒感染脂肪干细胞，其感染过程为：在10厘米培养皿中培养脂肪干细胞到40%-50%汇合度，然后将PLVX-可溶信号肽序列-scFv抗原结合序列-CD8（铰链序列及跨膜序列）-CD28-endo-4-1BB-endo-CD3ζ或者PLVX-TNF-α这两种慢病毒各1mL以及培养基8mL加入培养皿混合均匀，12小时之后换新鲜培养液即可。
病毒感染完成之后，就将分泌表达TNF-α的CAR脂肪干细胞大规模体外扩增。培养到足够数量之后，对细胞进行消化即加入适量胰蛋白酶消化，最后用磷酸盐缓冲液清洗三遍之后，输入人体用于移植治疗肿瘤。
实施例4
CAR-Trunc-FGFR1脂肪干细胞表达TNF-α治疗肿瘤
在本实施例中，针对不同的实体肿瘤，可以结合改进的针对脂肪干细胞的CAR-Trunc-FGFR1、脂肪干细胞以及表达分泌型TNF-α来治疗肿瘤，如图6所示。同理，首先需要合成针对脂肪干细胞的CAR-Trunc-FGFR1，各个结构域串联序列为：可溶信号肽序列-scFv抗原结合序列-FGFR1-trans-endo序列，其中，合成的序列两端需要合成EcoRI和BamHI酶切位点。另外，还需要合成能够分泌到胞外的TNF-α基因，其序列两端也需要加上EcoRI和BamHI酶切位点。
然后将上述两种序列分别构建到PLVX慢病毒载体上。构建过称为：采用EcoRI和BamHI对PLVX载体进行双酶切，然后用胶回收试剂盒进行胶回收。将胶回收的PLVX载体与合成的可溶信号肽序列-scFv抗原结合序列-FGFR1-trans-endo序列或者TNF-α按照摩尔比例为1:10混合（20微升体系），再加入T4DNA连接酶缓冲溶液，之后在45℃水浴热激5分钟，热激之后放置到4℃冰箱5分钟，最后加入2微升T4DNA连接酶，在16摄氏度连接过夜。
之后将连接得到的质粒做细菌转化，其过程为：将连接得到的质粒放置在冰上，并且将DH5α细菌（每管50微升）在冰上解冻；之后用微量移液器吸取3-5微升质粒，加入细菌中，混合均匀，然后将混合物继续放置冰上5-10分钟；然后将混合物在42℃水浴热激90秒钟；然后迅速将混合物再放置在冰上冷却2-3分钟；最后加入500微升无菌LB培养基，放置在37℃振荡培养1小时；培养完成之后涂平板，然后放置在37℃培养过夜；第二天挑取克隆测序。
对于测序正确的序列，进一步需要包装成慢病毒。其过程为：将PLVX-可溶信号肽序列-scFv抗原结合序列-FGFR1-trans-endo载体或者PLVX-TNF-α载体20微克，与pREV、pRRE、pVSVG各10微克混合；然后将50微升超纯水和50微升脂质体混合；之后将质粒和脂质体混合均匀，在室温放置15分钟；最后加入到汇合度为70%-80%的10厘米培养皿的293T细胞中。然后在6小时之后换上10mL培养基，72小时之后收集上清，用0.44微米滤器过滤之后，采用50000g/min离心90分钟，分别收集PLVX-可溶信号肽序列-scFv抗原结合序列-FGFR1-trans-endo或者PLVX-TNF-α慢病毒，备用。
收集到PLVX-可溶信号肽序列-scFv抗原结合序列-FGFR1-trans-endo或者PLVX-TNF-α慢病毒之后，同时将这两种慢病毒感染脂肪干细胞，其感染过程为：在10厘米培养皿中培养脂肪干细胞到40%-50%汇合度，然后将PLVX-可溶信号肽序列-scFv抗原结合序列-FGFR1-trans-endo或者PLVX-TNF-α这两种慢病毒各1mL以及培养基8mL加入培养皿混合均匀，12小时之后换新鲜培养液即可。
病毒感染完成之后，就将分泌表达TNF-α的CAR-Trunc-FGFR1脂肪干细胞大规模体外扩增。培养到足够数量之后，对细胞进行消化即加入适量胰蛋白酶消化，最后用磷酸盐缓冲液清洗三遍之后，输入人体用于移植治疗肿瘤。
实施例5
CAR-脂肪干细胞表达microRNA-101治疗肿瘤
在本实施例中，针对不同的实体肿瘤，首先结合第三代CAR、脂肪干细胞以及表达microRNA-101来治疗肿瘤，如图7所示。首先需要合成第三代嵌合抗原受体即合成串联的：可溶信号肽序列-scFv抗原结合序列-CD8（铰链序列及跨膜序列）-CD28-endo-4-1BB-endo-CD3ζ序列，其中，合成的序列两端需要合成EcoRI和BamHI酶切位点。另外，还需要合成能够分泌到胞外的microRNA-101表达序列（序列见Seq-101-Forward和Seq-101-Reverse），由于序列较短，我们采用合成单链寡核苷酸链，然后退火的方法。
其中，上述序列的两端也分别加上EcoRI和BamHI酶切位点。序列合成之后，首先进行退火反应，其过程为：按照合成序列说明书将寡聚核苷酸单链用ddH2O溶解成50μM的溶液；然后将8μl的Seq-101-Forward、8μl的Seq-101-Forward以及2μl的NEBBuffer2和2μl的ddH2O混合均匀，然后把EP管放在95℃水浴5分钟。此后关闭水浴锅，让EP管在水浴锅中自然降温到常温即完成退火，得到能够表达microRNA-101的双链寡核苷酸。
然后将上述两种序列分别构建到PLVX慢病毒载体上。构建过称为：采用EcoRI和BamHI对PLVX载体进行双酶切，然后用胶回收试剂盒进行胶回收。将胶回收的PLVX载体与合成的可溶信号肽序列-scFv抗原结合序列-CD8（铰链序列及跨膜序列）-CD28-endo-4-1BB-endo-CD3ζ序列或者表达microRNA-101的双链寡核苷酸按照摩尔比例为1:10混合（20微升体系），再加入T4DNA连接酶缓冲溶液，之后在45℃水浴热激5分钟，热激之后放置到4℃冰箱5分钟，最后加入2微升T4DNA连接酶，在16℃连接过夜。
之后将连接得到的质粒做细菌转化，其过程为：将连接得到的质粒放置在冰上，并且将DH5α细菌（每管50微升）在冰上解冻；之后用微量移液器吸取3-5微升质粒，加入细菌中，混合均匀，然后将混合物继续放置冰上5-10分钟；然后将混合物在42℃水浴热激90秒钟；然后迅速将混合物再放置在冰上冷却2-3分钟；最后加入500微升无菌LB培养基，放置在37℃振荡培养1小时；培养完成之后涂平板，然后放置在37℃培养过夜；第二天挑取克隆测序。
对于测序正确的序列，进一步需要包装成慢病毒。其过程为：将PLVX-可溶信号肽序列-scFv抗原结合序列-CD8（铰链序列及跨膜序列）-CD28-endo-4-1BB-endo-CD3ζ或者PLVX-microRNA-101载体20微克，与pREV、pRRE、pVSVG各10微克混合；然后将50微升超纯水和50微升脂质体混合；之后将质粒和脂质体混合均匀，在室温放置15分钟；最后加入到汇合度为70%-80%的10厘米培养皿的293T细胞中。然后在6小时之后换上10mL培养基，72小时之后收集上清，用0.44微米滤器过滤之后，采用50000g/min离心90分钟，分别收集PLVX-可溶信号肽序列-scFv抗原结合序列-CD8（铰链序列及跨膜序列）-CD28-endo-4-1BB-endo-CD3ζ或者PLVX-microRNA-101慢病毒，备用。
收集到PLVX-可溶信号肽序列-scFv抗原结合序列-CD8（铰链序列及跨膜序列）-CD28-endo-4-1BB-endo-CD3ζ或者PLVX-microRNA-101慢病毒之后，同时将这两种病毒感染脂肪干细胞，其感染过程为：在10厘米培养皿中培养脂肪干细胞到40%-50%汇合度，然后将PLVX-可溶信号肽序列-scFv抗原结合序列-CD8（铰链序列及跨膜序列）-CD28-endo-4-1BB-endo-CD3ζ或者PLVX-microRNA-101这两种慢病毒各1mL以及培养基8mL加入培养皿混合均匀，12小时之后换新鲜培养液即可。
病毒感染完成之后，就将表达microRNA-101的CAR脂肪干细胞大规模体外扩增。培养到足够数量之后，对细胞进行消化即加入适量胰蛋白酶消化，最后用磷酸盐缓冲液清洗三遍之后，输入人体用于移植治疗肿瘤。
实施例6
在本发明中，针对不同的实体肿瘤，可以结合改进的针对脂肪干细胞的CAR-Trunc-FGFR1、脂肪干细胞以及表达microRNA-101来治疗肿瘤，如图8所示。同理，首先需要合成针对脂肪干细胞的CAR-Trunc-FGFR1，各个结构域串联序列为：可溶信号肽序列-scFv抗原结合序列-FGFR1-trans-endo序列，其中，合成的序列两端需要合成EcoRI和BamHI酶切位点。另外，还需要合成能够分泌到胞外的microRNA-101表达序列，由于序列较短，我们采用先合成带有EcoRI和BamHI双酶切位点的单链寡核苷酸链，然后利用退火的方法得到能够表达microRNA-101的双链寡核苷酸。
然后将上述两种序列分别构建到PLVX慢病毒载体上。构建过称为：采用EcoRI和BamHI对PLVX载体进行双酶切，然后用胶回收试剂盒进行胶回收。将胶回收的PLVX载体与合成的可溶信号肽序列-scFv抗原结合序列-FGFR1-trans-endo序列或者microRNA-101的双链寡核苷酸按照摩尔比例为1:10混合（20微升体系），再加入T4DNA连接酶缓冲溶液，之后在45℃水浴热激5分钟，热激之后放置到4℃冰箱5分钟，最后加入2微升T4DNA连接酶，在16℃摄氏度连接过夜。
之后将连接得到的质粒做细菌转化，其过程为：将连接得到的质粒放置在冰上，并且将DH5α细菌（每管50微升）在冰上解冻；之后用微量移液器吸取3-5微升质粒，加入细菌中，混合均匀，然后将混合物继续放置冰上5-10分钟；然后将混合物在42℃水浴热激90秒钟；然后迅速将混合物再放置在冰上冷却2-3分钟；最后加入500微升无菌LB培养基，放置在37℃振荡培养1小时；培养完成之后涂平板，然后放置在37℃培养过夜；第二天挑取克隆测序。
对于测序正确的序列，进一步需要包装成慢病毒。其过程为：将PLVX-可溶信号肽序列-scFv抗原结合序列-FGFR1-trans-endo载体或者PLVX-microRNA-101载体20微克，与pREV、pRRE、pVSVG各10微克混合；然后将50微升超纯水和50微升脂质体混合；之后将质粒和脂质体混合均匀，在室温放置15分钟；最后加入到汇合度为70%-80%的10厘米培养皿的293T细胞中。然后在6小时之后换上10mL培养基，72小时之后收集上清，用0.44微米滤器过滤之后，采用50000g/min离心90分钟，分别收集PLVX-可溶信号肽序列-scFv抗原结合序列-FGFR1-trans-endo或者PLVX-microRNA-101慢病毒，备用。
收集到PLVX-信号肽序列-scFv-FGFR1-trans-endo或者PLVX-microRNA-101慢病毒之后，同时将这两种慢病毒感染脂肪干细胞，其感染过程为：在10厘米培养皿中培养脂肪干细胞到40%-50%汇合度，然后将PLVX-可溶信号肽序列-scFv抗原结合序列-FGFR1-trans-endo或者PLVX-microRNA-101这两种慢病毒各1mL以及培养基8mL加入培养皿混合均匀，12小时之后换新鲜培养液即可。
病毒感染完成之后，就将表达microRNA-101的CAR-Trunc-FGFR1脂肪干细胞大规模体外扩增。培养到足够数量之后，对细胞进行消化即加入适量胰蛋白酶消化，最后用磷酸盐缓冲液清洗三遍之后，输入人体用于移植治疗肿瘤。
综上所述，本发明提供的一种嵌合抗原受体脂肪干细胞及其制备方法，本发明结合了嵌合抗原受体特异性地结合特异肿瘤类型的高靶向性特点，以及脂肪干细胞免疫原性低、容易被病毒感染、能在短时间内大规模扩增以及肿瘤杀伤因子的抗肿瘤作用，能够解决当前CART治疗肿瘤的多个包括“免疫风暴”、嵌合抗原表达效率低以及异体移植免疫排斥等难以解决的问题，进而提高了治疗肿瘤的效果。经过本发明改造的脂肪干细胞，既具有了非常特异的迁移至特定肿瘤部位的高效靶向性，同时又避免了过度激活免疫系统从而进一步产生免疫排斥的风险，并且其携带的肿瘤杀伤因子又能够在肿瘤部位高效杀伤肿瘤，进而达到治疗肿瘤的目的。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Seq-CEA-scFv：
acattgtgctgacacagtctcctgcttccttaactgtatctctggggCtgagg
gccaccatctcatgcagggccagcaaaagtgtcagtgcatctGgctatagttatatgcac
tggtaccaacagagaccaggacagccacccAaactcctcatctatcttgcatccaaccta
caatctggggtccctgccAggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcaccctcaac
atccatCctgtggaggaggaggatgctgcaacctattactgtcagcacagtaggGagctt
ccgacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaaGGCTCCACCTCTGGATCCGGCAAG
CCCGGATCTGGCGAGGGATCCACCAAGGGCGaggttcagctgcagcagtctggggcagag
cttgtgaggtcaggggccTcagtcaagatgtcctgcacagcttctggcttcaacattaaa
gactacTatatgcactgggtgaagcagaggcctgaacagggcctggagtggattGgatgg
attgatcctgagaatggtgatactgaatatgccccgaagttcCagggcaaggccactatg
actacagacacatcctccaacacagcctacCtgcagctcagcagcctgacatctgaggac
actgccgtctattactgtAatacacggggtctatctactatgattacgacgcgttggttc
ttcgatGtctggggcgcagggaccacggtcgccgtctcctct
Seq-cMet-scFv：
gaaacaactgtgacccagtctccagcactcatggctgcatctccaggggagaag
gtcaccatcacctgcagtgtcagctcaagtataagttccaccaacttacactggtaccag
cagaagtcagagacctcccccaaaccctggatttatggcacatccaacctggcttctgga
gtccctgttcgcttcggtggcagtggatctgggacctcttattctctcacaatcagcagc
atggaggctgaagatgctgccacttattactgtcaacagtggagtagttacccgtacacg
ttcggagggggcaccaagctggaaatcGGCTCCACCTCTGGATCCGGCAAGCCCGGATCT
GGCGAGGGATCCACCAAGGGCgaggttcagctgcagcagtctggacctgagctggtgaag
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atacactggatgaagcagaggcctggacagggacttgagtggattggatggatttatcct
gtaactggtgatacttactacaatgagaagttcaagggcaaggccacactgacttcagac
aaatcctccagcacagcctacatgcagatcagcagcctgacctctgacgactctgcggtc
tatttctgtgcaaggggcggtggaatgttttattactggggccaagggactctggtcact
gtctct
Seq-EGFRvIII-scFv：
GACATCCAGATGACCCAGAGCCCTAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGACAGA
GTGACCATCACCTGTCGGGCCAGCCAGGGCATCAGAAACAACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGAGACTGATCTACGCTGCCAGCAATCTGCAGAGCGGCGTGCCCAGCAGATTCACCGGAAGCGGCTCCGGCACCGAGTTCACCCTGATCGTGTCCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGCACCACAGCTACCCTCTGACCAGCGGCGGAGGCACCAAGGTGGAGATCAAGCGGACCGGCAGCACCAGCGGCAGCGGCAAGCCTGGCAGCGGCGAGGGAAGCGAGGTCCAGGTGCTGGAATCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCAGCCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGCCATGTCTTGGGTCCGGCAGGCTCCTGGAAAGGGCCTGGAATGGGTGTCCGCCATCAGCGGCTCTGGCGGCTCCACCAACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCGGCAGCAGCGGGTGGAGCGAGTACTGGGGCCAGGGCACACTGGTCACAGTGTCTAGC
Seq-FAP-scFv：
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCACTCTCTGCATCTACAGGAGACAGA
GTCACCATCACTTGTCGGGCGAGTCAAGATATTAGCAGTTATTTAGCCTGGTATCAACAGGCACCCGGGAAAGCCCCTCATCTCCTGATGTCTGGAGCAACCACTTTACAGACTGGAGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCACGTCCCTGCAGTCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAGTATTATATTTACCCTCCGACGTTCGGCCAAGGGACCAGGGTGGAAATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCGCGGCCGGCTCCACCTCTGGATCCGGCAAGCCCGGATCTGGCGAGGGATCCACCAAGGGCCAGGTACAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAACCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGATCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTGCTAGTGGTGGTTATATAGACTATGCCGATTCCGTGAAGGGCCGGGTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACATGGCATATCTACAAATGAGCAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCCTTTATTACTGTGCGAAAGGAGGCAACTACCAGATGCTATTGGACCACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCAAAGCTT
Seq-Her2-scFv：
GATATCCAGATGACCCAGTCCCCGAGCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATAGG
GTCACCATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGATGTGAATACTGCTGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAACTACTGATTTACTCGGCATCCTTCCTTTATTCTGGAGTCCCTTCTCGCTTCTCTGGATCTAGATCTGGGACGGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGTCAGCAACATTATACTACTCCTCCCACGTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAACGCACTGGCTCCACCTCTGGATCCGGCAAGCCCGGATCTGGCGAGGGATCCACCAAGGGCGAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTCCGTTTGTCCTGTGCAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACACCTATATACACTGGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCAAGGATTTATCCTACGAATGGTTATACTAGATATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTCACTATAAGCGCAGACACATCCAAAAACACAGCCTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGTGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTTCTAGATGGGGAGGGGACGGCTTCTATGCTATGGACGTGTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCG
Seq-GD2-scFv：
CAGGTGAAACTGCAGCAGTCAGGACCTGAACTGGTGNAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATATCCTGCAAGACTTCTGGANACAAATTCACTGAATACACCATGCACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGAGGTATTAATCCTAACAATGGTGGTACTAACTACAAGCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGTAGACAAGTCCTCCAGCACAGCCTACATGGAGCTCCGCAGCCTGACATCTGAGGATTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGAGATACTACGGTCCCGTTTGCTTACTGGGTCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGT
GGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGACATCGAGCTCACTCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGGCAGCTCAAGTATAAGTTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGCCTGTCACCTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACACATCCAAACTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTATTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGTAGATGCTGCCACTTATTACTGCCATCAGCGGAGTAGTTACCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACACAGTTGGAAATAAAACGG
Seq-PSMA-scFv：
gaaattgtgttgacacagtctccagccaccctgtctttgtctccaggggaaaga
gccaccctctcctgcagggccagtcagagtgttagcagctacttagcctggttccaacag
aaacctggccaggctcccaggctcctcatctatgatgcatccaacagggccactggcatc
ccagccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagccta
gagcctgaagattttgcagtttattactgtcagcagcgtagcaactggctcatgtacact
tttggccaggggaccaagctggagatcaaaGGCTCCACCTCTGGATCCGGCAAGCCCGGA
TCTGGCGAGGGATCCACCAAGGGCgaggtgcagttggtgcagtctggagcagaggtgaaa
aagcccggggagtctctgaagatctcctgtaagggttctggatacagttttaccagctac
tggatcggctgggcgcgccagatgcccgggaaaggcctggagtggatggggatcatctat
cctggtgactctgataccagatacagcccgtccttccaaggccaggtcaccatctcagcc
gacaagtccatcagcaccgcctacctgcagtggagcagcctgaaggcctcggacaccgcc
atgtattactgttcggccgctaattcttctcactggtacttcgatctctggggccgtggc
accctggtcactgtctcctca
Seq-Mesothelin-scFv：
caggtacagctgcagcagtcaggtccaggactcgtgacgccctcgcagaccctc
tcactcacctgtgccatctccggggacagtgtctctagcaacagtgctacttggaactgg
atcaggcagtccccatcgagaggccttgagtggctgggaaggacatactacaggtccaag
tggtataacgactatgcagtatctgtgaaaagtcgaatgagcatcaacccagacacatcc
aagaaccagttctccctgcagctgaactctgtgactcccgaggacacggctgtgtattac
tgtgcaagaggaatgatgacttactattacggtatggacgtctggggccaagggaccacg
gtcaccgtctcctcaggaattctaggatccggtggcggtggcagcggcggtggtggttcc
ggaggcggcggttctcagcctgtgctgactcagtcgtcttccctctctgcatctcctgga
gcatcagccagtctcacctgcaccttgcgcagtggcatcaatgttggtccctacaggata
tactggtaccagcagaagccagggagtcctccccagtatctcctgaactacaaatcagac
tcagataagcagcagggctctggagtccccagccgcttctctggatccaaagatgcttcg
gccaatgcaggggttttactcatctctgggctccggtctgaggatgaggctgactattac
tgtatgatttggcacagcagcgctgctgtgttcggaggaggcacccaactgaccgtcctc
tcc
Seq-NCAM-scFv：
cccagtctccagcaatcatgtctgcatctccaggggagaaggtctccAtgacc
tgcagtgccagctcaagtgtaagttacatgtactggttccaaCagaagccaggatcctcc
cccagactcctgatttatgacacatccaacCtggcttctggagtccctgttcgcttcagt
ggcagtgggtctgggaccTcttactctctcacaatcagccgaatggaggctgaagatgct
gccactTattactgccagcagtggagtagttacccgctcacgttcggtgatgggAccaag
ctggagctgaaacgaactgtgGGCTCCACCTCTGGATCCGGCAAGCCCGGATCTGGCGAGGGATCCACCAAGGGCCaggagtctggacctgagctggtaaagcctggggcttcagtgaag
atgTcctgcaaggcttctggatacacattcactagctatgttatggactggGtgaagcag
aagcctgggcagggccttgagtggattggatatattaatCcttacaatgatggtactaag
tacaatgagaagttcaaaggcaaggccAcactgacttcagacaaatcctccagcacagcc
tacatggagctcagcAgcctgacctctgaggactctgcggtctattactgtgcaagatcg
ggtAttacggactttgactactggggccaaggcaccactctcatagtctccTca
Seq-CD8-hinge-trans：
TTCGTGCCGGTCTTCCTGCCAGCGAAGCCCACCACGACGCCAG
CGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCC
CTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAG
GGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGA
CTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAACCAC
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Seq-CD28-endo：
AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACAT
GACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC
Seq-4-1BB-endo：
CGTTTCTCTGTTGTTAAACGGGGCAGAAAGAAGCTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG
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AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCC
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Seq-FGFR1-trans-endo：
atcatcatctattgcacaggggccttcctc
atctcctgcatggtggggtcggtcatcgtctacaagatgaagagtggtaccaagaagagt
gacttccacagccagatggctgtgcacaagctggccaagagcatccctctgcgcagacag
gtaacagtgtctgctgactccagtgcatccatgaactctggggttcttctggttcggcca
tcacggctctcctccagtgggactcccatgctagcaggggtctctgagtatgagcttccc
gaagaccctcgctgggagctgcctcgggacagactggtcttaggcaaacccctgggagag
ggctgctttgggcaggtggtgttggcagaggctatcgggctggacaaggacaaacccaac
cgtgtgaccaaagtggctgtgaagatgttgaagtcggacgcaacagagaaagacttgtca
gacctgatctcagaaatggagatgatgaagatgatcgggaagcataagaatatcatcaac
ctgctgggggcctgcacgcaggatggtcccttgtatgtcatcgtggagtatgcctccaag
ggcaacctgcgggagtacctgcaggcccggaggcccccagggctggaatactgctacaac
cccagccacaacccagaggagcagctctcctccaaggacctggtgtcctgcgcctaccag
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gacattcaccacatcgactactataaaaagacaaccaacggccgactgcctgtgaagtgg
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ctgccccgacacccagcccagcttgccaatggcggactcaaacgccgctga
Seq-TRAIL：
ATGCTTCTCCTGGTGACAAGCCTTCTGCTCTGTGAGTTACCACACCCAGCATTCCTCCTGATCCCAatggctatgatggaggtccaggggggacccagcctgggacagacctgcgtgctgatcgtgatcttcacagtgctcctgcagtctctctgtgtggctgtaacttacgtgtactttacc
aacgagctgaagcagatgcaggacaagtactccaaaagtggcattgcttgtttcttaaaa
gaagatgacagttattgggaccccaatgacgaagagagtatgaacagcccctgctggcaa
gtcaagtggcaactccgtcagctcgttagaaagatgattttgagaacctctgaggaaacc
atttctacagttcaagaaaagcaacaaaatatttctcccctagtgagagaaagaggtcct
cagagagtagcagctcacataactgggaccagaggaagaagcaacacattgtcttctcca
aactccaagaatgaaaaggctctgggccgcaaaataaactcctgggaatcatcaaggagt
gggcattcattcctgagcaacttgcacttgaggaatggtgaactggtcatccatgaaaaa
gggttttactacatctattcccaaacatactttcgatttcaggaggaaataaaagaaaac
acaaagaacgacaaacaaatggtccaatatatttacaaatacacaagttatcctgaccct
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tattccatctatcaagggggaatatttgagcttaaggaaaatgacagaatttttgtttct
gtaacaaatgagcacttgatagacatggaccatgaagccagtttttttggggccttttta
gttggctaa
Seq-TNF-α：
ATGCTTCTCCTGGTGACAAGCCTTCTGCTCTGTGAGTTACCACACCCAGCATTCCTCCTGATCCCAatgagcactgaaagcatgatccgggacgtggagctggccgaggaggcgctccccaagaagacaggggggccccagggctccaggcggtgcttgttcctcagcctcttctccttcctgatcgtggcaggcgccaccacgctcttctgcctgctgcactttggagtgatcggcccccagagggaaga
gttccccagggacctctctctaatcagccctctggcccaggcagtcagatcatcttctcg
aaccccgagtgacaagcctgtagcccatgttgtagcaaaccctcaagctgaggggcagct
ccagtggctgaaccgccgggccaatgccctcctggccaatggcgtggagctgagagataa
ccagctggtggtgccatcagagggcctgtacctcatctactcccaggtcctcttcaaggg
ccaaggctgcccctccacccatgtgctcctcacccacaccatcagccgcatcgccgtctc
ctaccagaccaaggtcaacctcctctctgccatcaagagcccctgccagagggagacccc
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ggagaagggtgaccgactcagcgctgagatcaatcggcccgactatctcgactttgccga
gtctgggcaggtctactttgggatcattgccctgtga
Seq-101-Forward:
5’GGATCCTACAGTACTGTGATAACTGAATTCAAGAGATTCAGTTATCACAGTACTGTATTTTTTTGAATTC3’
Seq-101-Reverse:
5’GAATTCAAAAAAATACAGTACTGTGATAACTGAATCTCTTGAATTCAGTTATCACAGTACTGTAGGATCC3’

Claims (10)

1.一种嵌合抗原受体脂肪干细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体脂肪干细胞由嵌合抗原受体、脂肪干细胞和肿瘤杀伤因子组成。
2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体脂肪干细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体由scFv抗原结合序列、跨膜序列及胞内信号转导序列组成。
3.根据权利要求2所述的嵌合抗原受体脂肪干细胞，其特征在于，所述scFv抗原结合序列包括轻链可变区序列和重链可变区序列。
4.根据权利要求2所述的嵌合抗原受体脂肪干细胞，其特征在于，所述scFv抗原结合序列包括轻链可变区序列、重链可变区序列、连接轻链可变区序列和重链可变区序列的优化联结区序列及位于轻链可变区序列之前的可溶信号肽序列。
5.根据权利要求2所述的嵌合抗原受体脂肪干细胞，其特征在于，所述scFv抗原结合序列为CEA、cMet、EGFRvIII、FAP、Her2、GD2、PSMA、Mesothelin和NCAM中的一种。
6.根据权利要求2所述的嵌合抗原受体脂肪干细胞，其特征在于，所述scFv抗原结合序列和跨膜序列之间包含一段Hinge序列。
7.根据权利要求2所述的嵌合抗原受体脂肪干细胞，其特征在于，所述跨膜序列为CD8。
8.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体脂肪干细胞，其特征在于，所述胞内信号转导序列包括CD28胞内结构域序列、4-1BB胞内结构域序列和CD3ζ胞内结构域序列。
9.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体脂肪干细胞，其特征在于，所述肿瘤杀伤因子为TRAIL基因、TNF-α基因及TNF家族具有肿瘤杀伤作用的基因、具有肿瘤杀伤作用的microRNA分子以及具有肿瘤杀伤作用的蛋白因子中的一种。
10.一种如权利要求1~9任一所述的嵌合抗原受体脂肪干细胞的制备方法，其特征在于，包括步骤：
A、首先合成针对脂肪干细胞的嵌合抗原受体序列，并合成能够分泌到胞外的肿瘤杀伤因子序列；
B、然后将上述嵌合抗原受体序列和肿瘤杀伤因子序列分别构建到慢病毒载体上，得到表达嵌合抗原受体或者肿瘤杀伤因子的慢病毒；
C、将表达嵌合抗原受体或者肿瘤杀伤因子的慢病毒感染脂肪干细胞，慢病毒感染完成之后，得到分泌表达肿瘤杀伤因子的嵌合抗原受体脂肪干细胞。
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