CN105906722A - 一种Her2特异性嵌合抗原受体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种Her2特异性嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体由人抗Her2单链抗体，人IgG1分子FC区的CH2CH3，CD28的胞内区，CD137的胞内区，及CD3ζ的胞内区串联构成。本发明还公开了上述Her2特异性嵌合抗原受体的氨基酸序列和核酸序列。该嵌合抗原受体用于修饰T淋巴细胞，修饰后的淋巴细胞可用于Her2基因表达相关肿瘤的治疗。

Description

一种Her2特异性嵌合抗原受体及其应用
技术领域
本发明涉及细胞免疫技术领域，尤其涉及一种Her2特异性嵌合抗原受体及其应用。
背景技术
在肿瘤治疗领域经历了手术、化疗、放疗等多种治疗手段的革新，但这些方法对许多肿瘤的治疗效果仍然十分有限。随着医学免疫学与分子生物学的发展，产生了过继细胞免疫治疗(ACI)方法，经过研究的不断深入，ACI逐步走向临床，给癌症患者带来新的希望。其中嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)技术以其诸多优势在近五年成为细胞免疫治疗领域的热点。嵌合抗原受体主要由胞外区、跨膜区和胞内信号转导区组成。胞外区常由针对特异性抗原的单链抗体重链可变区和轻链可变区通过特殊Linker连接而成，具备识别特异性抗原的功能；跨膜序列可以是CD3ζ、CD8，FcεRIγ等，其结能影响CAR在T细胞内的表达；胞内区承担信号传导的功能，其共刺激分子可以是CD28、CD134、CD137、CD244等。将嵌合抗原受体的基因通过基因转导技术重组到T淋巴细胞基因组，获得的CAR-T细胞即能表达该嵌合抗原受体，从而将T细胞以非MHC限制性方式靶向含有特异性抗原的肿瘤细胞，产生杀瘤作用。
CAR-T细胞用于治疗相关肿瘤，T细胞可由表面嵌合抗原受体与肿瘤表面特异性抗原结合而激活并释放各种细胞因子杀伤肿瘤细胞。肿瘤细胞表面的蛋白质、糖、糖脂都可以作为嵌合抗原受体的潜在靶点，使得CAR-T拥有更广泛的抗原谱。另外，CAR结构中的协同共刺激分子可以提高T细胞增值活性、体内存在时间，从而使CAR-T细胞获得持久的杀瘤作用。
目前ACI主要有NK细胞，DC-CIK、CAR-T细胞等。NK细胞是机体天然免疫的主要承担者，可直接杀伤肿瘤细胞，但是其在体外扩增效率低，细胞毒活性不理想，限制了其临床疗效。CIK细胞是多种细胞因子刺激后获得的具有免疫活性的异质细胞群，DC细胞是目前发现的功能最强大的抗原提呈细胞。CIK细胞因没有特异性杀瘤作用，在临床上疗效有限，而DC-CIK技术使得CIK细胞获得特异性杀瘤作用，但是DC细胞在外周血中不易获取且制备困难，限制了它的应用。
人类表皮生长因子受体2(human epidermalgrowth factor receptor-2，Her2)基因，即c-erbB-2基因，是具有酪氨酸激酶活性的跨膜受体样蛋白，通过与所在受体家族相关成员相互作用以及与配体的结合激活信号通路，调节细胞的生长、分化与增值。Her2基因产物正常表达于分泌腺上皮细胞，当其基因拷贝异常增加，将会驱动所在细胞的恶变及扩增。在临床上，Her2是重要的乳腺癌预后判断因子，与乳腺癌的扩散转移密切相关。据统计，乳腺癌患者中，约20～30％的患者为Her2阳性。相比Her2阴性的乳腺癌，Her2阳性的乳腺癌侵袭性强，复发、转移风险高，激素治疗和常规治疗反应差，预后不良，给患者带来沉重的打击。研究还发现，Her2除了参与乳腺癌的发生发展外其过表达还在胃癌、结肠癌、膀胱癌、肺癌、卵巢癌、宫颈癌、食管癌等多种形式的癌症中发生。
发明内容
基于背景技术存在的技术问题，本发明的目的在于提供一种Her2特异性嵌合抗原受体。
本发明的目的还在于提供上述嵌合抗原受体的氨基酸序列和核酸序列。
本发明的目的还在于提供上述嵌合抗原受体的应用。
为了实现上述目的，本发明提出的一种Her2特异性嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体由人抗Her2单链抗体，人IgG1分子FC区的CH2CH3，CD28的胞内区，CD137的胞内区，及CD3ζ的胞内区串联构成。
优选地，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选地，所述嵌合抗原受体的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。
优选地，所述人抗Her2单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
优选地，所述人抗Her2单链抗体的核酸序列如SEQ ID NO.4所示。
优选地，所述人抗Her2单链抗体的重链分子和轻链分子之间有一个连接肽，其氨基酸序列为Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser。
优选地，人IgG1分子FC区的CH2CH3，CD28的胞内区，CD137的胞内区，及CD3ζ的胞内区串联构成的结构为信号传导结构域，其氨基酸序列如SEQID NO.5所示。
优选地，所述信号传导结构域的核酸序列如SEQ ID NO.6所示。
本发明还提出的上述Her2特异性嵌合抗原受体在制备嵌合抗原受体T淋巴细胞及治疗Her2相关肿瘤药物中的应用。
本发明提供所述人抗Her2嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞制备方法具体过程如下：本发明根据本实验室噬菌体展示技术筛选到的人抗Her2Fab序列，将其进行密码子优化，在5’端加上信号肽，全基因合成嵌合抗原受体Her2-scFv-CH2CH3-CD3ζ-CD28-CD137，并将合成的ScFv序列克隆到pUC57载体中，构建出抗人Her2-CAR表达质粒。再通过Gateway重组克隆技术将合成的CD137片段克隆到Her2-ScFv-CH2CH3-CD28-CD3ζ中，即获得本发明的嵌合抗原受体Her2-ScFv-CH2CH3-CD28-CD137-CD3ζ。
利用该嵌合抗原受体与逆转录病毒的包装质粒RD114 env在GP293T细胞中对病毒进行包装，利用此逆转录病毒感染T淋巴细胞，使T细胞表达该嵌合抗原受体。将获得的CAR-T细胞在体外与肿瘤细胞共培养，通过流式细胞术检测CAR-T细胞表面抗原表达情况，CCK8法检测该CAR-T细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤活性，以证实该嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞对肿瘤的特异性杀伤作用。因此本发明所述的嵌合抗原受体Her2-ScFv-CH2CH3-CD28-CD137-CD3ζ可以在相关肿瘤治疗中得到应用。
本发明提供的嵌合抗原受体Her2-ScFv-CH2CH3-CD28-CD137-CD3ζ是通过逆转录病毒技术制备的逆转录病毒，可体外感染T淋巴细胞，所获得的CAR-T细胞可以通过CAR的单链抗体部分特异性识别表达Her2的肿瘤细胞，同时激活CAR-T细胞，使其释放IFN-γ、TNF等多种细胞因子杀伤肿瘤细胞。采用CAR技术制备的CAR-T具有制备周期短，重复性好，可以用于Her2相关肿瘤的治疗，制备Her2相关肿瘤的抗肿瘤药物。
附图说明
图1为本发明实施例1所得Her2-scFv目的片段的电泳图，其中1为DL2000核酸分子量标准，2为Her2-scFv目的片段。
图2为本发明实施例1所得CD8a-CD137-CD3ζ目的片段的电泳图，其中1为Her-2-ScFv-CH2CH3-CD28-CD137-CD3ζ，2为CAR载体经NcoI和BamHI酶切释放的pUC57载体，3为未酶切的CAR载体；4为DL10000kD核酸分子量标准。
图3为本发明实施例2中采用Western Blotting检测本发明所得Her2特异性嵌合抗原受体转染293T细胞后的表达，其中1为转染逆转录病毒CD19 CAR质粒的293T细胞，2为转染逆转录病毒c-Met CAR质粒的293T细胞，3为作为对照的未转染293T细胞。
图4为Western Blotting检测不同的对数生长期肿瘤细胞中Her2的表达，其中1为乳腺癌细胞MDA-MB-231，2为乳腺癌细胞MCF-7，3为人黑色素瘤细胞A375。
图5为本发明所得Her2特异性嵌合抗原受体修饰的T细胞对肿瘤细胞的杀伤检测。
图6为本发明所得Her2特异性嵌合抗原受体修饰的T细胞在受到Her2抗原刺激后IFN-γ的表达。
具体实施方式
下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
实施例1：Her2特异性嵌合抗原受体慢病毒载体的构建
1.1根据本实验室噬菌体展示技术筛选到的抗Her2胞外区的人Fab序列的VH链和VL链的氨基酸序列，利用OptimumGeneTM基因设计软件优化密码子序列，在不改变氨基酸序列的情况下使其更适合人的表达系统。在VH和VL之间加入连接肽，构建获得的嵌合抗原受体的ScFv部分结构为：VH-(Gly4 Ser)3-VL。对应的核酸序列如SEQ ID NO.4。该片段合成后克隆在载体中，连接处引入Nco I和Bam HI酶切位点，载体命名为：Her2-ScFv。
1.2提取Her2-ScFv质粒，用限制性内切酶Nco I和Bam HI(Takara公司)进行酶切鉴定。酶切体系为：2μg XX-Her2-ScFv、1μL Nco I、1μL Bam HI、2μL10X酶切缓冲液，用水补到20μL，37℃水浴过夜，酶切产物用1％的琼脂糖凝胶电泳分离出目的条带，采用DNA凝胶回收试剂盒(Axygene公司)回收目的片段；结果如图1所示，由图1可知：Her2-ScFv载体经NcoI和Bam HI酶切释放出了Her2-ScFv。
用NcoI和Bam HI酶切pSFG-CH2CH3-CD28-CD3ζ载体，方法同上。用琼脂糖凝胶电泳分离并回收所需的载体片段。将回收后的Her2-ScFv与酶切回收的载体通过T4DNA连接酶(Takara公司)连接，反应体系如下：2μL Her2-ScFv、2μL酶切回收的载体、1μL 10×连接缓冲液，1μL T4DNA连接酶,用水补到10μL，16℃水浴过夜。将连接产物转化入DH5α感受态中，37℃过夜培养。挑取单克隆并扩大培养，采用质粒提取试剂盒(Axygene公司)提取阳性克隆的质粒，经酶切和测序验证，将正确的载体命名为：Her2-scFv-CH2CH3-CD28-CD3ζ。
1.3通过gateway重组技术将CD137的序列克隆到Her2-scFv-CH2CH3-CD28-CD3ζ的CD28和CD3ζ分子之间(技术方法参考申请号为201310053109的《嵌合抗原受体及其用途》，公开日为2013年06月12日，公开号为103145849A)。质粒构建完成后用NcoI和Bam HI进行酶切鉴定，其结果如图2所示。由图2可知：阳性克隆能释放目的条带。再进行测序验证，其测序结果正确。
实施例2：Her2特异性嵌合抗原受体表达鉴定
参照无内毒素质粒大提试剂盒内(天根生物)的操作说明书提取逆转录病毒载体Her2-scFv-CH2CH3-CD28-CD137-CD3ζ，提取的质粒用PI转染试剂转染到人胚肾细胞293T中，48h后，用PBS洗一遍，用细胞蛋白提取试剂(RIPA)裂解细胞，提取转染后的293T细胞的蛋白经10％的SDS-PAGE进行分离后，恒流(300mA，1h)转印至PVDF膜上，用抗CD3ζ(1：1000)抗体孵育，4℃孵育过夜。用PBST洗涤3遍后，用HRP羊抗小鼠的二抗(1：5000)室温孵育1h。加入ECL显色后，用Bio-Rad公司的ChemiDoc XRS System进行成像，其结果如图3所示。
由图3可知：本发明所构建的重组质粒能够检测到CAR分子的表达，蛋白大小与理论的CAR蛋白大小一致，即与阳参CD19均为80KD左右，而未转染的293T细胞没有条带。
实施例3：Her2特异性嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞的制备
1.含抗Her2嵌合抗原受体慢病毒的包装
用无内毒素质粒大提试剂盒内(天根生物)的操作说明书提取逆转录病毒包装质粒pRD114和Her2-scFv-CH2CH3-CD28-CD137-CD3ζ逆转录病毒质粒在LB培养基中大量培养，用无内毒素质粒大提试剂盒内(天根生物)的操作说明书大量提取质粒。将质粒共转染到GP-293T细胞中，转染后48h收集细胞上清，4000rpm离心10min。收集上清，用0.45μm的滤膜过滤，-80℃分装冻存。
2.T淋巴细胞的制备
采取20mL健康志愿者的新鲜抗凝血，用淋巴分离液(GE公司)分立外周血单核细胞(PBMC)。分离后的细胞用CD3和CD28平板刺激48h，用T淋巴细胞培养基GT-T551(TAKARA公司)加1：5000 IL2进行诱导培养，得到T淋巴细胞。
3.CAR-T细胞的制备
用50μg/mL的RetroNectin(TAKARA公司)包被非组织培养板24孔板，每孔加入500μL，4℃过夜。每孔再加入500μL病毒上清，37℃孵育30min。去除病毒上清，再加入500μL病毒上清，37℃孵育30min，除病毒上清，每孔加入1.5mL病毒上清，再加入0.5mL稀释后的T淋巴细胞。从而获得能表达Her-2-scFv-CD8a-CD137-CD3ζ的T细胞即Her2特异性CAR-T细胞。
实施例4：Her2特异性CAR-T细胞对Her2相关肿瘤的杀伤作用
1.Western Blotting检测肿瘤细胞中Her2的表达
选取对数生长期的人黑色素瘤细胞A375、人乳腺癌细胞MDA-MB-231和人乳腺癌细胞MCF-7，用细胞蛋白提取试剂(RIPA)裂解细胞，提取细胞蛋白，进行Western Blotting检测，检测结果如图4所示，乳腺癌细胞MDA-MB-231检测到Her2高表达，乳腺癌细胞MCF-7检测到Her2的低表达，人黑色素瘤细胞A375检测不到Her2的表达。
2.CAR-T细胞对肿瘤的杀伤力检测
将肿瘤细胞用培养基调整到5×106/mL，每孔50μL，按E：T(效应细胞和靶细胞比)为16：1、8：1、4：1、2：1，分别加入肿瘤细胞2.5×106个、1.25×106个、6.25×105个、3.125×105个；待细胞完全贴壁后，收集T细胞和CAR-T细胞，调整细胞浓度为1×106/mL，每孔50μL，培养12h。弃上清加入100μL稀释的CCK8，孵育4～6小时，酶标仪检测OD450的吸光值。
上述肿瘤细胞为人黑色素瘤细胞A375、人乳腺癌细胞MDA-MB-231和人乳腺癌细胞MCF-7。
检测结果如图5所示：CAR-T细胞对Her2表达的肿瘤细胞的杀伤率高于Her2不表达的肿瘤细胞；CAR-T细胞对肿瘤细胞杀伤作用高于T细胞，高于单纯培养基。
3.ELISPOT检测CAR-T细胞在受到Her2抗原刺激后IFN-γ的表达
用无菌包被液稀释IFN-γ抗体后加入ELISPOT(Millipore，Cat.No.MAIPS4510)平板中，每孔100μL，4℃放置过夜。第二天用无菌的包被液将平板洗涤2遍。每孔加入200μL完全培养基，室温封闭1h。洗去含血清的细胞培养液RPMI-1640，用PBS洗三遍。准备Her2胞外区多肽，稀释在含血清的细胞培养液RPMI-1640，调至终浓度1μg/mL，每孔100μL。调整待检测CAR-T细胞浓度为1×106/mL，每孔加入100μL，37℃，5％CO2放置24h，弃去细胞及培养基，用ELISPOT洗涤液洗涤3遍。每孔加入生物素标记的检测抗体，100μL/孔，4℃放置过夜。再用ELISPOT洗涤液洗涤4遍。每孔加入HRP标记的亲和素，100μL/孔，室温放置45min。用ELISPOT洗涤液洗涤3遍后，用PBS洗涤2遍。每孔加入100μL ACE显色底物，室温显色20～60min。待出现明显集落点后，用无菌水洗涤3遍终止反应。空气中晾干平板，用ELISPOT读板机计算形成的斑点数，其结果如图6所示。由图6可知：CAR-T细胞在特异性Her2抗原刺激下能够分泌IFN-γ。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种Her2特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体由人抗Her2单链抗体，人IgG1分子FC区的CH2CH3，CD28的胞内区，CD137的胞内区，及CD3ζ的胞内区串联构成。
2.根据权利要求1所述Her2特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求1或2所述Her2特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.根据权利要求1-3任一项所述Her2特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述人抗Her2单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
5.根据权利要求1-4任一项所述Her2特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述人抗Her2单链抗体的核酸序列如SEQ ID NO.4所示。
6.根据权利要求1-5任一项所述Her2特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述人抗Her2单链抗体的重链分子和轻链分子之间有一个连接肽，其氨基酸序列为Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser。
7.根据权利要求1-6任一项所述Her2特异性嵌合抗原受体，其特征在于，人IgG1分子FC区的CH2CH3，CD28的胞内区，CD137的胞内区，及CD3ζ的胞内区串联构成的结构为信号传导结构域，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
8.根据权利要求7所述Her2特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述信号传导结构域的核酸序列如SEQ ID NO.6所示。
9.如权利要求1-9任一项所述Her2特异性嵌合抗原受体在制备嵌合抗原受体T淋巴细胞及治疗Her2相关肿瘤药物中的应用。
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