CN110078833A - 基于亲合体靶向her2的嵌合抗原受体及其应用 - Google Patents

基于亲合体靶向her2的嵌合抗原受体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基于亲合体靶向HER2的嵌合抗原受体及其应用，所述嵌合抗原受体由信号肽、抗Her2的亲合体、跨膜区及胞内信号转导区串联构成。本发明还公开了上述基于亲合体靶向Her2的嵌合抗原受体的氨基酸序列和核酸序列。该嵌合抗原受体用于修饰免疫细胞，如NK细胞或T淋巴细胞，修饰后的细胞可用于Her2基因表达相关肿瘤的治疗。

Description

基于亲合体靶向HER2的嵌合抗原受体及其应用
技术领域
本发明属于细胞治疗领域，具体涉及基于亲合体靶向HER2的嵌合抗原受体及其应用
背景技术
近年来，作为新型肿瘤免疫治疗技术，嵌合抗原受体(chimeric antigenreceptor，CAR)修饰的免疫细胞在恶性肿瘤的治疗中取得了良好的效果，为部分晚期患者带来了康复的希望。CAR是利用基因工程技术将能够与肿瘤抗原结合的受体部分与胞内的信号转导部分相结合而形成的一种新型受体，经CAR修饰的T细胞可通过非MHC限制性的方式杀伤肿瘤细胞，而经CAR修饰的NK细胞可拥有特异性靶向杀伤肿瘤细胞的能力。
二十多年来，人们不断改进CAR的结构，如今CAR已发展到第4代。第1代CAR能够成功识别靶抗原并激活T细胞，但由于胞内信号肽区只表达单一的信号分子(TCR/CD3ζ链或免疫球蛋白Fc受体FcεRIγ链)，缺乏协同刺激分子，从而不能充分激活T细胞，导致其修饰的T细胞增殖能力较低，细胞因子分泌水平也不高，无法在体内持续维持抗肿瘤效应。第2代CAR的信号区添加了一个协同刺激分子，因此在肿瘤细胞被CAR-T识别后，CAR中的协同刺激分子和胞内信号能够同时被活化，即实现双重活化，使T细胞持久增殖并持续释放细胞因子，从而使细胞杀瘤活性大大提升。第3代CAR在胞内信号区整合了2个以上的协同刺激分子，T细胞持续活化、增殖的能力得以实现，细胞因子的分泌得以持续，从而使T细胞增殖分泌能力和杀伤肿瘤细胞能力明显增强。第4代CAR(又称TRUCKs)在前几代CAR的结构基础上，又增加细胞因子等。这样，在转基因产生的细胞因子作用下，CAR能够产生更有效的信号；此外，IL-12等细胞因子还可以招募免疫系统的其他成员，使得抗肿瘤免疫效应得以放大。
HER2(Human epidermal growth factor receptor 2)属于表皮生长因子受体家族，是具有酪氨酸激酶活性的一种跨膜蛋白。研究表明，在约三成的乳腺癌患者中存在着HER2基因过表达的现象。这类患者中，肿瘤的恶性程度高、具有一定的抗药性，且复发和转移的速度快，病人的无病生存期与总生存期和HER2基因的表达情况成反比。在乳腺癌的病理发生过程中，HER2的表达水平变化起到至关重要的影响，因此HER2成为了科学家们研制乳腺癌治疗药物的重要靶点。
亲合体(Affibody)是一种非免疫球蛋白类的具有亲和力的人工蛋白质分子，它于1997年被人们所发现，至今已有针对40余个靶点的亲合体被人们开发出来，用于实验诊断、分子成像和靶向治疗等多种方向。目前的CAR结构胞外区绝大部分都是基于单链抗体(single-chain variable fragment,scFv)构建而成，基于亲合体构建而成的CAR结构尚未见报道。亲合体的功能和作用机制与抗体蛋白类似，但却存在很多抗体蛋白不具备的特点：1、亲合体的相对分子质量很小，且折叠速率快，重复性强；2、能通过体外筛选获得，所需过程简便，耗费时间短；3、亲合体的亲和力非常高，能够达到μmol/L-pmol/L级，而抗体通常只能达到μmol/L级；4、构成Z结构域的氨基酸中不含有C(半胱氨酸)，不会形成二硫键，所以稳定性与复性能力强。
发明内容
基于背景技术存在的技术问题，本发明的目的在于提供新型的基于亲合体靶向Her2的嵌合抗原受体。
本发明的目的还在于提供上述嵌合抗原受体的氨基酸序列和核酸序列。
本发明的目的还在于提供上述嵌合抗原受体的应用。
为了实现上述目的，本发明提出了新型的基于亲合体靶向Her2的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体由信号肽、抗Her2的亲合体、跨膜区及胞内信号转导区串联构成。
所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示，优选为SEQID NO.1。
所述嵌合抗原受体的核酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示，优选为SEQ IDNO.3。
所述抗Her2的亲合体的氨基酸序列如SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示，优选为SEQ ID NO.5。
所述抗Her2的亲合体的核酸序列如SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8所示，优选为SEQID NO.7。
所述跨膜区为选自以下蛋白质的跨膜结构域或与所述蛋白质具有90-99％同一性的氨基酸序列：T细胞受体的α、β或ζ链、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD28、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、4-1BB或CD154，优选为CD28跨膜区。
所述胞内信号转导区为通过选自以下蛋白质或与所述蛋白质具有90-99％同一性的氨基酸序列获得的功能性信号结构域的一种或几种：MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白质、细胞因子受体、整联蛋白、淋巴细胞活化信号分子、活化NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD2、CD3、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1、4-1BB、B7-H3、CD278、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM、KIRDS2、SLAMF7、NKp80、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49α、IA4、CD49D、ITGA6、VLA6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11α、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、CD29、ITGB1、ITGB2、CD18、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、CD226、CD84、CD96、CEACAM1、CRTAM、CD229、CD160、PSGL1、CD100、CD69、SLAMF6、SLAM、BLAME、CD162、LTBR、LAT、GADS或SLP-76，优选为CD28胞内区域与CD3ζ胞内区串联构成。
本发明还提出的上述基于亲合体靶向Her2的嵌合抗原受体在免疫细胞中的应用，如T淋巴细胞、NK细胞、造血干细胞、多能干细胞或胚胎干细胞培养分化的免疫细胞，优选地，选用NK-92MI细胞。
本发明提供所述基于亲合体靶向Her2的嵌合抗原受体修饰的NK-92MI细胞制备方法，具体过程如下：本发明全基因合成两种Anti-HER2Affibody基因，通过融合PCR得到嵌合抗原受体基因Affi 1 CAR与Affi2 CAR，并将合成的序列分别克隆到PLVX-puro载体中，即获得本发明的嵌合抗原受体质粒Affi1 CAR-pLVX与Affi2 CAR-pLVX。
利用上述两种嵌合抗原受体质粒分别与二代慢病毒包装质粒PMD2.G和PSPAX2在Lenti-293T细胞中对病毒进行包装，利用上述两种慢病毒感染NK-92MI细胞，使NK-92MI细胞表达该嵌合抗原受体，经嘌呤霉素筛选后获得Affi1 CAR-NK与Affi2 CAR-NK细胞。通过Western Blot检测上述两种CAR-NK细胞表面嵌合抗原受体的表达情况，LDH法检测上述两种CAR-NK细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤活性，用ELISA试剂盒检测细胞因子的表达情况，以证实本发明所述的嵌合抗原受体可以在Her2高表达肿瘤治疗中得到应用。
本发明提供的嵌合抗原受体通过慢病毒技术制备成相应慢病毒后，可体外感染NK-92MI细胞，所获得的CAR-NK细胞可以特异性识别表达Her2高表达的肿瘤细胞，同时激活CAR-NK细胞，使其释放GZMB、IFN-γ、TNF等多种细胞因子杀伤肿瘤细胞。由本发明方法制备的CAR-NK细胞具有制备周期短，稳定性好等特点，可以用于Her2相关肿瘤的治疗，成为一种现货型抗肿瘤细胞产品。
附图说明
图1为本发明中Anti-HER2 Affibody CAR结构示意图。
图2为本发明实施例1中Anti-HER2 Affibody CAR基因PCR结果，其中1泳道为Affi1CAR融合PCR结果，2泳道为Affi2CAR融合PCR结果，M泳道为DL5000 DNA marker。
图3为本发明实施例1中Affibody CAR-pLVX重组质粒酶切鉴定结果，其中M泳道为DL5000 DNA marker，1、2泳道为Affi 1 CAR-pLVX质粒经XhoI与BamH I双酶切后的结果，3、4泳道为Affi 1 CAR-pLVX质粒经XhoI与BamH I双酶切后的结果。
图4为本发明实施例3中WB检测基于亲合体靶向HER2的嵌合抗原受体在NK-92MI细胞中表达情况的结果图。
图5为本发明实施例4中基于亲合体靶向HER2的嵌合抗原受体修饰的NK-92MI细胞对乳腺癌细胞的杀伤检测结果，其中A为对Her2阴性的MCF7细胞的杀伤结果，B为对Her2阳性的BT474细胞的杀伤结果，C为对Her2阳性的SKBR3细胞的杀伤结果。
图6为本发明实施例5中基于亲合体靶向HER2的嵌合抗原受体修饰的NK-92MI细胞细胞因子的表达水平检测。
具体实施方式
下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
实施例1：基于亲合体靶向HER2的嵌合抗原受体构建
1.1Affi 1 CAR与Affi2 CAR基因的构建
Anti-Her2 Affibody CAR的构建思路如图1所示。两种Anti-Her2 Affibody序列经密码子优化后，交由上海生工生物工程有限公司全基因合成，对应的核酸序列如SEQ IDNO.5和SEQ ID NO.6。通过融合PCR技术将两种Affibody分别与下游的跨膜区及胞内信号转导区串联，得到Affi 1 CAR与Affi2 CAR结构，PCR结果如图2所示，对应的核酸序列如SEQID NO.1和SEQ ID NO.2。
1.2Affi1 CAR-pLVX与Affi2 CAR-pLVX重组质粒的构建
融合PCR所得Affi1 CAR基因与pLVX-Puro质粒经XhoI与BamH I双酶切与胶回收后进行连接，连接产物转化后，挑菌扩大培养，XhoI与BamH I双酶切鉴定构建结果，鉴定结果如图3中1、2泳道所示。两条泳道酶切结果条带单一，大小与目的基因相符，后续基因测序结果证明所构建的重组质粒序列正确。同样的方法构建Affi2 CAR重组质粒，鉴定结果如图3中3、4泳道所示。两条泳道酶切结果条带单一，大小与目的基因相符，后续基因测序结果证明所构建的重组质粒序列正确。
实施例2：基于亲合体靶向HER2的嵌合抗原受体修饰的NK-92MI细胞构建
2.1含有Affi1 CAR和Affi2 CAR的慢病毒包装
分别取20μL带有Affi1 CAR-pLVX、Affi2 CAR-pLVX、慢病毒包装质粒pMD2.G与psPAX2的不同菌液，加入到含有100mL Amp+ LB培养基的不同锥形瓶中，在摇床上培养过夜(约16h)，条件为37℃，180rpm。第二天用无内毒素质粒大提试剂盒内(天根生物)进行质粒大提。分别将不同CAR-pLVX质粒与包装质粒共转染到Lenti-293T细胞中，转染后48h收集细胞上清，4000rpm离心10min。收集上清，用0.45μm的滤膜过滤，用超速离心机收集慢病毒沉淀。离心条件为4℃，100 000×g，无刹车，离心90min。将浓缩后的慢病毒按每管200ul分装到0.5mL冻存管中，-80℃分装冻存。
2.2慢病毒转染NK-92MI细胞
(1)取状态良好的NK-92MI细胞进行计数，配制成终浓度为2×105个/mL的细胞悬液，加入6孔板中，每孔1mL。
(2)将病毒浓缩液从冰箱中取出融化，每孔加入200μL病毒浓缩液，对照孔中加入200μL培养基。
(3)每孔加入终浓度为6μg/mL的Polybrene
(4)孵育24h后，以1 000rpm离心5min，去除旧培养基，每孔加入2mL新鲜培养基重悬细胞，放入温度设置为37℃，CO2浓度为5％的饱和湿度培养箱中培养。
2.3CAR-NK细胞的筛选
(1)将状态良好的NK-92MI细胞按5×104个/孔接种于24孔板中，放入含5％CO2的37℃细胞培养箱中培养24h。
(2)用培养基配制嘌呤霉素溶液，终浓度分别为0、1.0、1.5、2.0和2.5μg/mL，以此替换各孔中NK-92MI的培养基。
(3)筛选3天后，以能将NK-92MI细胞完全杀死的最低浓度为最佳筛选浓度。
(4)对已用病毒转染的NK-92MI细胞以1 000rpm离心5min。
(5)用含最佳筛选浓度的嘌呤霉素的培养基替换原培养基，放入含5％CO2的37℃细胞培养箱中培养。
(6)3天后，仍然存活的细胞即为筛选得到的CAR-NK细胞。
实施例3 Affi1 CAR-NK细胞和Affi2 CAR-NK细胞的鉴定
提取Affi1 CAR-NK细胞和Affi2 CAR-NK细胞的蛋白，经12％的SDS-PAGE进行分离后，恒流(0.3A，50min)转印至PVDF膜上，用抗myc(1：1000)抗体孵育，4℃孵育过夜。用PBST洗涤3遍后，用羊抗兔的二抗(1：5000)室温孵育1h。用Oddesay红外双色激光扫膜仪成像，结果如图4所示。
CAR结构上带有myc标签，通过myc标签便能检测CAR结构的蛋白表达水平。通过DNA序列估算出sAffi1 CAR和Affi2 CAR蛋白大小为约34KD。实验结果中检测出的条带位置与估算相符，表明检测到的蛋白条带即为CAR结构，Affi1CAR-NK和Affi2 CAR-NK细胞构建成功。
实施例4LDH法测定CAR-NK细胞对不同乳腺癌细胞系杀伤效果
(1)将靶细胞(SKBR-3、BT474、MCF-7)消化离心，重悬细胞到浓度为8×104/mL。接种100μL/孔靶细胞到96孔板中，同时设靶细胞自发LDH释放组、靶细胞最大LDH释放组和只加培养基的空白对照组，在温度设置为37℃，CO2浓度为5％的饱和湿度培养箱中培养过夜。
(2)将96孔板中的原培养基弃掉，按不同效靶比(E/T为1:1、5:1、10:1)加入100μLNK-92MI细胞或CAR-NK细胞即为实验组。同时在空白孔中也加入不同等数量的效应细胞，设定为效应细胞自发释放组。之后将96孔板放入含有5％CO2的37℃细胞培养箱中孵育6h。
(3)孵育结束前30min，在靶细胞最大LDH释放组中每孔加入10μl Lysis Buffer，加入后用移液枪反复吹打混匀，之后放入含有5％CO2的37℃细胞培养箱中孵育。
(4)孵育结束后，将100μl Working Solution加入到每个孔中，在室温避光的条件下继续孵育30min。
(5)用排枪在每孔中添加50μl Stop Solution，用酶标仪测定样品在490nm处的吸光度A值。按如下公式计算细胞毒性百分比。
通过LDH释放试剂盒检测CAR-NK细胞对上述三种乳腺癌细胞系的杀伤效果，结果见图5。A图为对HER2-的MCF7细胞的杀伤效果评价，可以看出对于Her2阴性的细胞，CAR-NK与未修饰的NK-92MI细胞杀伤效果类似。在1:1、5:1和10：1三个效靶比的水平上未观察到显著性的区别。在10:1时，NK-92MI、Affi1CAR-NK和Affi2 CAR-NK的杀伤性分别为22.1±1.1％、27.9±2.7％和19.4±4.1％。而对于Her阳性的SKBR3和BT474，CAR-NK细胞的杀伤效果随着效靶比的增加明显上升，显著高于未修饰的NK-92MI细胞。在10:1时，NK-92MI、Affi1CAR-NK和Affi2 CAR-NK对BT474细胞杀伤性分别为23.2±1.9％、85.1±3.1％和76.6±1.9％；对SKBR3细胞的杀伤性分别为10.2±3.5％、95.1±4.7％和80.4±3.5％。
实施例5细胞因子检测
用人颗粒酶B(GZMB)、IFN-γ、TNF-αELISA检测试剂盒检测不同状态下CAR-NK细胞因子分泌的变化，具体步骤如下：
(1)分别设空白孔、标准孔与实验孔。其中空白孔加100μL抗体稀释液，标准孔设7个孔，分别加入100μL的不同浓度标准品。其余孔加入实验样品100μL，在酶标板上封膜，于37℃下孵育2h。
(2)倒掉板中液体并拍干。
(3)每孔加入100μL的A工作液，在酶标板上封膜，于37℃下孵育1h。
(4)倒掉板中液体并拍干，每孔加入200μL的洗液，浸泡1min后甩去酶标板中的液体并拍干。重复此步骤3次，于最后一次洗涤后，把孔内的洗液完全拍干。
(5)每孔加入100μL的B工作液，在酶标板上封膜，于孵箱中孵育30min。
(6)倒掉板中液体并拍干，清洗3次，步骤同(4)。
(7)在每孔中均加入90μL的底物溶液，之后在酶标板上贴上封膜，于孵箱中避光显色。反应20min。当标准孔的前4孔中有明显的蓝色出现，而后3孔梯度显色较浅时，便可终止。
(8)每孔中加入50μL终止溶液，此时将从蓝色溶液转变为黄色溶液。注意加入终止液的顺序需与加入底物溶液的顺序相一致。
(9)加入终止液后，即可用酶标仪在450nm处测量各孔的OD值。
细胞因子检测结构如图5所示，A图为GZMB的检测结果，可以看到在未刺激时，各组的GZMB分泌水平相似。当加入Her2阴性细胞后，NK-92MI和Affi1CAR-NK细胞的分泌水平略有上升，而加入Her2阳性细胞后，Aff1 CAR-NK的分泌水平显著提升，远高于NK-92MI和Aff2CAR-NK组。对于Affi2 CAR-NK组，在加入Her2阳性细胞后，GZMB的分泌相对于加入HER2阴性细胞时也有小幅提升。B图为IFN-γ的检测结果，C图为TNF-α的检测结果，两种细胞因子的变化趋势与A图相似。值得注意的是，Affi2 CAR-NK细胞的细胞因子分泌水平在加入HER2阳性细胞时并没有显著地提升，由此可部分解释Affi2 CAR-NK细胞对肿瘤细胞的杀伤效果略逊于Aff1 CAR-NK细胞的原因。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 北京工业大学
<120> 基于亲合体靶向HER2的嵌合抗原受体及其应用
<141> 2019-04-28
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 927
<212> DNA
<213> 人工序列(Abedus herberti)
<400> 1
gccaccatgc ttctcctggt gacaagcctt ctgctctgtg agttaccaca cccagcattc 60
ctcctgatcc cagagcagaa actcatctct gaagaggatc tggccgaggc caaatacgcc 120
aaggagatga gaaatgccta ctgggagatc gccctcctgc ccaacctgac caaccagcag 180
aaaagggcct tcatcagaaa gctgtacgac gaccccagcc agtctagtga actgctgagc 240
gaggccaaga agcttaacga tagccagatt gaagttatgt atcctcctcc ttacctagac 300
aatgagaaga gcaatggaac cattatccat gtgaaaggga aacacctttg tccaagtccc 360
ctatttcccg gaccttctaa gcccttttgg gtgctggtgg tggttggggg agtcctggct 420
tgctatagct tgctagtaac agtggccttt attattttct gggtgaggag taagaggagc 480
aggctcctgc acagtgacta catgaacatg actccccgcc gccccgggcc cacccgcaag 540
cattaccagc cctatgcccc accacgcgac ttcgcagcct atcgctccag agtgaagttc 600
agcaggagcg cagacgcccc cgcgtaccag cagggccaga accagctcta taacgagctc 660
aatctaggac gaagagagga gtacgatgtt ttggacaaga gacgtggccg ggaccctgag 720
atggggggaa agccgagaag gaagaaccct caggaaggcc tgtacaatga actgcagaaa 780
gataagatgg cggaggccta cagtgagatt gggatgaaag gcgagcgccg gaggggcaag 840
gggcacgatg gcctttacca gggtctcagt acagccacca aggacaccta cgacgccctt 900
cacatgcagg ccctgccccc tcgctaa 927
<210> 2
<211> 936
<212> DNA
<213> 人工序列(Abies alba)
<400> 2
gccaccatgc ttctcctggt gacaagcctt ctgctctgtg agttaccaca cccagcattc 60
ctcctgatcc cagagcagaa actcatctct gaagaggatc tggtggataa taagttcaac 120
aaggaactta ggcaggccta ttgggagatc caggccctgc ctaatctgaa ctggacccag 180
agccgggcct tcatcagaag cctgtacgac gacccaagcc agagcgccaa cctgcttgct 240
gaggcaaaaa agctgaatga cgcccaggct cctaaaattg aagttatgta tcctcctcct 300
tacctagaca atgagaagag caatggaacc attatccatg tgaaagggaa acacctttgt 360
ccaagtcccc tatttcccgg accttctaag cccttttggg tgctggtggt ggttggggga 420
gtcctggctt gctatagctt gctagtaaca gtggccttta ttattttctg ggtgaggagt 480
aagaggagca ggctcctgca cagtgactac atgaacatga ctccccgccg ccccgggccc 540
acccgcaagc attaccagcc ctatgcccca ccacgcgact tcgcagccta tcgctccaga 600
gtgaagttca gcaggagcgc agacgccccc gcgtaccagc agggccagaa ccagctctat 660
aacgagctca atctaggacg aagagaggag tacgatgttt tggacaagag acgtggccgg 720
gaccctgaga tggggggaaa gccgagaagg aagaaccctc aggaaggcct gtacaatgaa 780
ctgcagaaag ataagatggc ggaggcctac agtgagattg ggatgaaagg cgagcgccgg 840
aggggcaagg ggcacgatgg cctttaccag ggtctcagta cagccaccaa ggacacctac 900
gacgcccttc acatgcaggc cctgccccct cgctaa 936
<210> 3
<211> 308
<212> PRT
<213> 人工序列(Abies alba)
<400> 3
Ala Thr Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro
1 5 10 15
His Pro Ala Phe Leu Leu Ile Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu
20 25 30
Asp Leu Ala Glu Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Met Arg Asn Ala Tyr Trp
35 40 45
Glu Ile Ala Leu Leu Pro Asn Leu Thr Asn Gln Gln Lys Arg Ala Phe
50 55 60
Ile Arg Lys Leu Tyr Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser
65 70 75 80
Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro
85 90 95
Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys
100 105 110
Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro
115 120 125
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
130 135 140
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser
145 150 155 160
Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly
165 170 175
Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala
180 185 190
Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala
195 200 205
Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg
210 215 220
Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu
225 230 235 240
Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
245 250 255
Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
260 265 270
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
275 280 285
Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
290 295 300
Leu Pro Pro Arg
305
<210> 4
<211> 311
<212> PRT
<213> 人工序列(Abies alba)
<400> 4
Ala Thr Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro
1 5 10 15
His Pro Ala Phe Leu Leu Ile Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu
20 25 30
Asp Leu Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Leu Arg Gln Ala Tyr Trp
35 40 45
Glu Ile Gln Ala Leu Pro Asn Leu Asn Trp Thr Gln Ser Arg Ala Phe
50 55 60
Ile Arg Ser Leu Tyr Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala
65 70 75 80
Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ile Glu Val Met
85 90 95
Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile
100 105 110
His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro
115 120 125
Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys
130 135 140
Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser
145 150 155 160
Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg
165 170 175
Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg
180 185 190
Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp
195 200 205
Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn
210 215 220
Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg
225 230 235 240
Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly
245 250 255
Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu
260 265 270
Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu
275 280 285
Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His
290 295 300
Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
305 310
<210> 5
<211> 267
<212> DNA
<213> 人工序列(Abies alba)
<400> 5
gccaccatgc ttctcctggt gacaagcctt ctgctctgtg agttaccaca cccagcattc 60
ctcctgatcc cagagcagaa actcatctct gaagaggatc tggccgaggc caaatacgcc 120
aaggagatga gaaatgccta ctgggagatc gccctcctgc ccaacctgac caaccagcag 180
aaaagggcct tcatcagaaa gctgtacgac gaccccagcc agtctagtga actgctgagc 240
gaggccaaga agcttaacga tagccag 267
<210> 6
<211> 276
<212> DNA
<213> 人工序列(Abies alba)
<400> 6
gccaccatgc ttctcctggt gacaagcctt ctgctctgtg agttaccaca cccagcattc 60
ctcctgatcc cagagcagaa actcatctct gaagaggatc tggtggataa taagttcaac 120
aaggaactta ggcaggccta ttgggagatc caggccctgc ctaatctgaa ctggacccag 180
agccgggcct tcatcagaag cctgtacgac gacccaagcc agagcgccaa cctgcttgct 240
gaggcaaaaa agctgaatga cgcccaggct cctaaa 276
<210> 7
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Abies alba)
<400> 7
Ala Thr Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro
1 5 10 15
His Pro Ala Phe Leu Leu Ile Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu
20 25 30
Asp Leu Ala Glu Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Met Arg Asn Ala Tyr Trp
35 40 45
Glu Ile Ala Leu Leu Pro Asn Leu Thr Asn Gln Gln Lys Arg Ala Phe
50 55 60
Ile Arg Lys Leu Tyr Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser
65 70 75 80
Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln
85
<210> 8
<211> 92
<212> PRT
<213> 人工序列(Abies alba)
<400> 8
Ala Thr Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro
1 5 10 15
His Pro Ala Phe Leu Leu Ile Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu
20 25 30
Asp Leu Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Leu Arg Gln Ala Tyr Trp
35 40 45
Glu Ile Gln Ala Leu Pro Asn Leu Asn Trp Thr Gln Ser Arg Ala Phe
50 55 60
Ile Arg Ser Leu Tyr Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala
65 70 75 80
Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
85 90

Claims (10)

1.基于亲合体靶向Her2的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体由信号肽、抗Her2的亲合体、跨膜区及胞内信号转导区串联构成；所述嵌合抗原受体的核酸序列如SEQID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述基于亲合体靶向Her2的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。
3.根据权利要求1所述基于亲合体靶向Her2的嵌合抗原受体，其特征在于，所述抗Her2的亲合体的核酸序列如SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示。
4.根据权利要求1所述基于亲合体靶向Her2的嵌合抗原受体，其特征在于，所述抗Her2的亲合体的氨基酸序列如SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8所示。
5.根据权利要求1所述基于亲合体靶向Her2的嵌合抗原受体，其特征在于，所述跨膜区为选自以下蛋白质的跨膜结构域或与所述蛋白质具有90-99％同一性的氨基酸序列：T细胞受体的α、β或ζ链、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD28、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、4-1BB或CD154。
6.根据权利要求1所述基于亲合体靶向Her2的嵌合抗原受体，其特征在于，所述胞内信号转导区为通过选自以下蛋白质或与所述蛋白质具有90-99％同一性的氨基酸序列获得的功能性信号结构域的一种或几种：MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白质、细胞因子受体、整联蛋白、淋巴细胞活化信号分子、活化NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD2、CD3、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1、4-1BB、B7-H3、CD278、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM、KIRDS2、SLAMF7、NKp80、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49α、IA4、CD49D、ITGA6、VLA6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11α、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、CD29、ITGB1、ITGB2、CD18、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、CD226、CD84、CD96、CEACAM1、CRTAM、CD229、CD160、PSGL1、CD100、CD69、SLAMF6、SLAM、BLAME、CD162、LTBR、LAT、GADS或SLP-76。
7.根据权利要求1所述基于亲合体靶向Her2的嵌合抗原受体，其特征在于，所述胞内信号转导区为CD28胞内区域与CD3ζ胞内区串联构成。
8.一种细胞，其特征在于，所述细胞包含如权利要求1～7中任意一项所述的基于亲合体靶向Her2的嵌合抗原受体。
9.根据权利要求8所述的细胞，其特征在于所述的细胞选自免疫细胞。
10.权利要求1-7中任一项所述的嵌合抗原受体或权利要求8-9中任一项所述的免疫效应细胞在制备抗肿瘤药物或肿瘤细胞免疫疗法中的应用。
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