ES2601141T3 - Método para la expresión de moléculas de ARN pequeño dentro de una célula - Google Patents

Método para la expresión de moléculas de ARN pequeño dentro de una célula Download PDF

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Abstract

Un método de expresión de una molécula de ARN dentro de una célula, comprendiendo el método: transfectar una línea celular de encapsidación con una construcción retroviral; recuperar un retrovirus recombinante de la línea celular de encapsidación; e infectar una célula diana in vitro con el retrovirus recombinante, en el que la construcción retroviral comprende las secuencias R y U5 de una repetición terminal larga (LTR) lentiviral de 5', una LTR de 3' lentiviral auto-inactivante, un primer promotor de ARN polimerasa III, una secuencia de terminación de ARN polimerasa III y un transgén que comprende una primera región codificante de ARN operativamente unida a la primera región del promotor de ARN polimerasa III, y en el que el promotor de ARN polimerasa III y la región codificante de ARN están situadas entre la LTR de 5' y la LTR de 3'.

Description

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"Lentivirus" se refiere a un género de retrovirus que es capaz de infectar células en división y no en división. Varios ejemplos de lentivirus incluyen VIH (virus de la inmunodeficiencia humana; que incluye VIH tipo 1 y VIH tipo 2), el agente etiológico del síndrome de la inmunodeficiencia humana adquirida (SIDA); Maedi-Visna, que produce encefalitis (Visna) o neumonía (Maedi) en ovejas, el virus de la artritis-encefalitis caprina, que produce inmunodeficiencia, artritis y encefalopatía en cabras; virus de la anemia infecciosa equina, que produce anemia hemolítica autoinmunitaria y encefalopatía en caballos; virus de la inmunodeficiencia felina (VIF), que produce inmunodeficiencia en gatos; virus de la inmunodeficiencia bovina (VIB), que produce linfadenopatía, linfocitosis y posiblemente infección del sistema nervioso central en ganado vacuno; y virus de la inmunodeficiencia simia (VIS), que produce inmunodeficiencia y encefalopatía en primates sub-humanos.
Un genoma lentiviral está generalmente organizado en una repetición terminal larga (LTR) de 5', el gen gag, el gen pol, el gen env, los genes accesorios (nef, vif, vpr, vpu) y una LTR de 3'. La LTR viral se divide en tres regiones llamadas U3, R y U5. La región U3 contiene los elementos potenciador y promotor. La región U5 contiene las señales de poliadenilación. La región R (repetición) separa las regiones U3 y U5 y las secuencias transcritas de la región R aparecen en tanto los extremos 5' como 3' del ARN viral. Véanse, por ejemplo, "RNA Viruses: A Practical Approach" (Alan J. Cann, Ed., Oxford University Press, (2000)), O Narayan and Clements J. Gen. Virology 70:16171639 (1989), Fields et al. Fundamental Virology Raven Press. (1990), Miyoshi H, Blomer U, Takahashi M, Gage FH, Verma IM. J Virol. 72(10):8150-7 (1998), y la patente de EE.UU. N.º 6.013.516.
Se conocen en la técnica vectores lentivirales, que incluyen varios que se han usado para transfectar células madre hematopoyéticas. Tales vectores pueden encontrarse, por ejemplo, en las siguientes publicaciones: Evans JT et al. Hum Gene Ther 1999;10:1479-1489; Case SS, Price MA, Jordan CT et al. Proc Natl Acad Sci USA 1999;96:29882993; Uchida N, Sutton RE, Friera AM et al. Proc Natl Acad Sci USA 1998;95:11939-11944; Miyoshi H, Smith KA, Mosier DE et al. Science 1999;283:682-686; Sutton RE, Wu HT, Rigg R et al. Human immunodeficiency virus type 1 vectors efficiently transduce human hematopoietic stem cells. J Virol 1998;72:5781-5788.
"Virión", "partícula viral" y "partícula retroviral" se usan en el presente documento para referirse a un único virus que comprende un genoma de ARN, proteínas derivadas del gen pol, proteínas derivadas del gen gag y una bicapa de lípido que presenta una (gluco)proteína de la envuelta. El genoma de ARN es normalmente un genoma de ARN recombinante y así puede contener una secuencia de ARN que es exógena al genoma viral nativo. El genoma de ARN también puede comprender una secuencia viral endógena defectuosa.
Un retrovirus "pseudotipificado" es una partícula retroviral que tiene una proteína de la envuelta que es de un virus distinto del virus del que se deriva el genoma de ARN. La proteína de la envuelta puede ser de un retrovirus diferente o de un virus no retroviral. Una proteína de la envuelta preferida es la proteína del virus G de la estomatitis vesicular (VSV G). Sin embargo, para eliminar la posibilidad de infección humana, los virus pueden ser alternativamente pseudotipificados con proteína de la envuelta ecotrópica que limitan la infección a una especie específica, tales como ratones o aves. Por ejemplo, puede usarse una proteína de la envuelta ecotrópica mutante, tal como la proteína de la envuelta ecotrópica 4.17 (Powell et al. Nature Biotechnology 18(12): 1279-1282 (2000)).
El término "provirus" se usa para referirse a una secuencia de ADN de dúplex presente en un cromosoma eucariota que se corresponde con el genoma de un retrovirus de ARN. El provirus pueden transmitirse de una generación de células a la siguiente sin causar lisis o destrucción de la célula huésped.
Una "LTR de 3' auto-inactivante" es una repetición terminal larga (LTR) de 3' que contiene una mutación, sustitución
o deleción que previene que las secuencias de LTR conduzcan la expresión de un gen en la dirección 3'. Una copia de la región U3 de la LTR de 3' actúa de molde para la generación de ambas LTR en el provirus integrado. Así, cuando la LTR de 3' con una deleción o mutación inactivante se integra como la LTR de 5' del provirus, no es posible transcripción de la LTR de 5'. Esto elimina la competencia entre el potenciador/promotor viral y cualquier potenciador/promotor interno. LTR de 3' auto-inactivantes se describen, por ejemplo, en Zufferey et al. J Virol. 72:9873-9880 (1998), Miyoshi et al. J Virol. 72:8150-8157 e Iwakuma et al. Virology 261:120-132 (1999).
El término "interferencia por ARN o silenciamiento" se define ampliamente e incluye todos los mecanismos posttranscripcionales y transcripcionales de la inhibición mediada por ARN de la expresión génica, tales como aquellos descritos en (P.D. Zamore Science 296, 1265 (2002)).
En un aspecto de la invención, se usa un retrovirus recombinante para administrar un transgén que comprende una región codificante de ARN de interés a una célula diana. Preferentemente, la célula diana es una célula de mamífero. La célula puede ser una célula primaria, o puede ser una célula cultivada, por ejemplo y sin limitación, una célula HEK, CRO, COS, MEF, 293. La célula diana puede ser un ovocito o una célula embrionaria no humana, más preferentemente un embrión unicelular no humano. La región codificante de ARN y cualquier elemento genético asociado se integran así en el genoma de la célula diana como un provirus. Cuando la célula diana es un embrión no humano, puede entonces permitirse que la célula se desarrolle en un animal no humano transgénico por métodos muy conocidos en la técnica.
El retrovirus recombinante usado para administrar la región codificante de ARN es preferentemente un lentivirus
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modificado, y así es capaz de infectar tanto células en división como no en división. El retrovirus recombinante comprende preferentemente un genoma lentiviral modificado que incluye el transgén. Además, el genoma lentiviral modificado carece preferentemente de genes endógenos para las proteínas requeridas para la replicación viral, previniendo así la replicación no deseada, tal como la replicación en un animal no humano transgénico resultante. Las proteínas requeridas se proporcionan preferentemente en trans en la línea celular de encapsidación durante la producción del retrovirus recombinante, como se describe más adelante.
El retrovirus recombinante usado para administrar la región codificante de ARN puede ser un virus de Moloney modificado, por ejemplo, un virus de la leucemia murina de Moloney. El virus también pueden ser un virus de células madre murinas (Hawley, R. G., et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 10297-10302; Keller, G., et al. (1998) Blood 92:877-887; Hawley, R. G., et al. (1994) Gene Ther. 1:136-138). El retrovirus recombinante también puede ser un virus híbrido tal como aquel descrito en Choi, JK; Hoanga, N; Vilardi, AM; Conrad, P; Emerson, SG; Gewirtz, AM. (2001) Hybrid HIV/MSCV LTR Enhances Transgene Expression of Lentiviral Vectors in Human CD34+ Hematopoietic Cells. Stem Cells 19, No. 3, 236-246.
El transgén se incorpora en una construcción viral que comprende una LTR de 5' retroviral intacta y una LTR de 3' auto-inactivante. La construcción viral se introduce en una línea celular de encapsidación que encapsida el ARN genómico viral basado en la construcción viral en partículas virales con la especificidad por huésped deseada. Las partículas virales se recogen y se usan para infectar la célula huésped. Cada uno de estos aspectos se describe en detalle más adelante.
La construcción viral
La construcción viral es una secuencia de nucleótidos que comprende secuencias necesarias para la producción de retrovirus recombinante en una célula de encapsidación. La construcción viral puede comprender adicionalmente elementos genéticos que permiten la expresión deseada de una molécula de ARN o gen de interés en el huésped.
La generación de la construcción viral puede llevarse a cabo usando cualquier técnica de ingeniería genética adecuada muy conocida en la técnica, que incluye, sin limitación, las técnicas convencionales de PCR, síntesis de oligonucleótidos, digestión con endonucleasa de restricción, ligación, transformación, purificación de plásmidos y secuenciación de ADN, por ejemplo, como se describen en Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y. (1989)), Coffin et al. (Retroviruses. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y. (1997)) y "RNA Viruses: A Practical Approach" (Alan J. Cann, Ed., Oxford University Press, (2000)).
La construcción viral pueden incorporar secuencias del genoma de cualquier organismo conocido. Las secuencias pueden incorporarse en su forma nativa o pueden modificarse de cualquier forma. Por ejemplo, las secuencias pueden comprender inserciones, deleciones o sustituciones. La construcción viral comprende secuencias de un genoma de lentivirus, tal como el genoma del VIH o el genoma del VIS.
La construcción viral comprende secuencias de las LTR de 5' y 3' de un lentivirus. En particular, la construcción viral comprende las secuencias R y U5 de la LTR de 5' de un lentivirus y una LTR de 3' auto-inactivante de un lentivirus. Las secuencias de LTR pueden ser las secuencias de LTR de cualquier lentivirus de cualquier especie. Por ejemplo, pueden ser secuencias de LTR de VIH, VIS, VIF o VIB. Preferentemente, las secuencias de LTR son secuencias de LTR del VIH. El virus también pueden incorporar secuencias de MMV o MSCV.
La construcción viral comprende una LTR de 3' auto-inactivante. El elemento U3 de la LTR de 3' puede contener una deleción de su secuencia de potenciador, preferentemente la caja TATA, sitios Sp1 y NF-kappa B. Como resultado de la LTR de 3' auto-inactivante, el provirus que se integra en el genoma de la célula huésped comprenderá una LTR de 5' inactivada.
Opcionalmente, la secuencia U3 de la LTR de 5' lentiviral puede sustituirse con una secuencia promotora en la construcción viral. Esto puede aumentar el título de virus recuperado de la línea celular de encapsidación. También puede incluirse una secuencia de potenciador. Puede usarse cualquier combinación de potenciador/promotor que aumente la expresión del genoma de ARN viral en la línea celular de encapsidación. En la realización preferida se usa la secuencia de potenciador/promotora del CMV (patente de EE.UU. N.º 5.168.062; Karasuyama et al J. Exp. Med. 169:13 (1989).
La construcción viral también comprende un transgén. El transgén puede ser cualquier secuencia de nucleótidos, que incluye secuencias que sirven de marcadores para el provirus. Preferentemente, el transgén comprende una o más regiones codificantes de ARN y/o uno o más genes de interés. Diagramas esquemáticos de construcciones retrovirales a modo de ejemplo se muestran en las Figuras 1A y 1B.
Según la presente invención, el transgén comprende al menos una región codificante de ARN. Preferentemente, la región codificante de ARN es una secuencia de ADN que puede servir de molde para la expresión de una molécula de ARN deseada en la célula huésped. En una realización, la construcción viral comprende dos o más regiones
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con un plásmido que comprende secuencias que codifican una proteína asociada a la membrana que permitirá la entrada del virus en una célula huésped. Un experto en la materia será capaz de elegir el pseudotipo apropiado para la célula huésped que va a usarse. Por ejemplo, en una realización, los virus se pseudotipan con la glucoproteína de la envuelta del virus de la estomatitis vesicular (VSVg). Además de conferir una variedad de huéspedes específica, este pseudotipo puede permitir que el virus se concentre a un título muy alto. Los virus pueden ser alternativamente pseudotipificados con proteínas de la envuelta ecotrópicas que limitan la infección a una especie específica, tal como ratones o aves. Por ejemplo, puede usarse proteína de la envuelta ecotrópica mutante, tal como la proteína de la envuelta ecotrópica 4.17 (Powell et al. Nature Biotechnology 18(12): 1279-1282 (2000)). Una línea celular de encapsidación que no expresa establemente proteínas virales puede transfectarse con la construcción viral, un segundo vector que comprende el vector de encapsidación del VIH-1 con secuencias de env, nef, LTR de 5', LTR de 3' y vpu delecionadas, y un tercer vector que codifica una glucoproteína de la envuelta. Preferentemente, el tercer vector codifica la glucoproteína de la envuelta VSVg.
La actividad de interferencia por ARN de las células de encapsidación puede suprimirse para mejorar la producción de virus recombinante. Esto incluye, sin limitación, el uso de cotransfección o transfección estable de construcciones que expresan moléculas de ARNip para inhibir Dicer, un miembro de la familia de RNasa III de la ribonucleasa que es esencial para la interferencia por ARN (Hammond et al. Nat. Rev. Genet. 2:110-119 (2001)).
El virus recombinante se purifica entonces preferentemente a partir de las células de encapsidación, se valora y se diluye a la concentración deseada.
Animales transgénicos
Con el fin de de producir animales no humanos transgénicos, un ovocito o una o más células embrionarias no humanas se infectan con el virus recombinante producido como se ha descrito anteriormente. Un experto en la materia reconocerá que el método de infección y el tratamiento de la célula tras la infección dependerán del tipo de animal del que se obtiene la célula. Por ejemplo, células de mamífero se implantan preferentemente en una hembra pseudopreñada no humana tras la infección, mientras que para la generación de aves o peces transgénicos, el virus se administra preferentemente a un huevo puesto y así no se requiere la implantación.
Mientras que métodos tempranos de producción de animales transgénicos no humanos requirieron que las células estuvieran rápidamente dividiéndose, no hay tal requisito en los métodos de la presente invención. Así, la célula puede ponerse en contacto en cualquier punto en el desarrollo. Por ejemplo, un cigoto no humano puede ponerse en contacto con el virus recombinante.
Las células que van a infectarse con el virus pueden obtenerse por cualquier método conocido en la técnica y apropiado para la especie específica en la que se desea producir un animal no humano transgénico. Por ejemplo, la recuperación de ovocitos de ratón fecundados se describe en Hogan et al. (Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (1994)). Un método de obtención de ovocitos de rata fecundados se describe en Armstrong et al. (Biol. Reprod. 39,511-518 (1998)).
No es necesario que las células se pongan en contacto después de la fecundación. Por ejemplo, el virus puede administrarse a óvulos sin fecundar. El desarrollo puede entonces iniciarse, por ejemplo, por fecundación in vitro.
Administración del virus
El virus puede administrarse a la célula de cualquier modo que permita que el virus infecte la célula. Preferentemente, se deja que el virus se ponga en contacto con la membrana celular. A continuación se describen dos métodos preferidos de administración del virus a células de mamífero, inyección y contacto directo.
Inyección
El virus puede inyectarse en el espacio perivitelino entre la zona pelúcida y la membrana celular de un cigoto unicelular no humano. Se inyectan preferentemente menos de 50 picolitros de suspensión viral, más preferentemente menos de 25 picolitros e incluso más preferentemente aproximadamente 10 picolitros.
El virus está preferentemente presente en una suspensión viral y puede inyectarse por cualquier método conocido en la técnica. La suspensión viral se inyecta preferentemente mediante un inyector hidráulico. Se usa más preferentemente una micropipeta de vidrio para inyectar el virus. Puede prepararse una micropipeta estirando capilar de borosilicato vidrio sobre un estirador de pipetas. La punta se abre preferentemente y se bisela a aproximadamente 10 µm. La suspensión lentiviral puede cargarse en la micropipeta desde la punta usando presión negativa suave.
La célula puede estabilizarse con una pipeta de contención montada en un micromanipulador, tal como por presión negativa suave contra una pipeta pulida al fuego, y se usa un segundo micromanipulador para dirigir la punta de una micropipeta en el espacio entre la zona pelúcida y la membrana celular, donde se inyecta el virus.
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Contacto directo
En otra realización, la zona pelúcida se elimina de la célula para producir un embrión no humano denudado y la membrana celular se pone en contacto con el virus. La zona pelúcida puede eliminarse por cualquier método conocido en la técnica. Preferentemente se elimina por tratamiento enzimático. Por ejemplo, puede usarse tratamiento con pronasa para eliminar la zona pelúcida mientras que la membrana celular se mantiene intacta. Alternativamente, la célula puede ponerse en medio al pH al que la zona pelúcida se disuelve mientras que la membrana celular sigue intacta. Por ejemplo, la célula puede incubarse en una disolución ácida de Tyrode a temperatura ambiente durante varios minutos. Una vez se elimina la zona pelúcida, puede usarse cualquier método que permita que el virus se ponga en contacto con la membrana celular. Preferentemente, la célula se incuba en una disolución que contiene el virus. Incluso más preferentemente, la disolución es medio que facilita la supervivencia de la célula.
Las células se ponen preferentemente en contacto con el virus en placas de cultivo. El virus puede suspenderse en medio y añadirse a los pocillos de una placa de cultivo de múltiples pocillos. Las células pueden entonces sembrarse en placa en los pocillos individuales. El medio que contiene el virus puede añadirse antes de la siembra de las células o después de que las células se hayan sembrado. Preferentemente se incuban células individuales en aproximadamente 10 µl de medio. Sin embargo, puede usarse cualquier cantidad de medio en tanto que una concentración de virus apropiada se mantenga en los medios de forma que se produzca la infección de la célula huésped.
Las células se incuban preferentemente con el virus durante una cantidad de tiempo suficiente para permitir que el virus infecte las células. Preferentemente, las células se incuban con virus durante al menos 1 hora, más preferentemente al menos 5 horas e incluso más preferentemente al menos 10 horas.
Tanto las realizaciones de inyección como de contacto directo pueden aumentarse de escala ventajosamente para permitir transgénesis de alto rendimiento. Debido a la simplicidad relativa de la técnica de inyección, es posible inyectar muchos embriones no humanos rápidamente. Por ejemplo, es posible inyectar más de 200 ovocitos no humanos fecundados en menos de una hora. Con respecto a la realización de contacto directo, puede incubarse cualquier número de embriones no humanos en la suspensión viral simultáneamente. Esto puede llevarse a cabo, por ejemplo, sembrando el número deseado de cigotos unicelulares en placas de cultivo de tejido de múltiples pocillos que contienen el virus suspenso en medio apropiado para la supervivencia y el crecimiento de las células.
En ambas realizaciones, puede usarse cualquier concentración de virus que sea suficiente para infectar la célula. Preferentemente, la concentración es al menos 1 ufp/µl, más preferentemente al menos 10 ufp/µl, incluso más preferentemente al menos 400 ufp/µl e incluso más preferentemente al menos 1 x 104 ufp/µl.
Tras la infección con el virus, las células se implantan preferentemente en un animal no humano. Más preferentemente, las células infectadas con el virus se implantan en animales pseudopreñados de la misma especie de la que se obtuvieron las células infectadas. Métodos de creación de pseudo-embarazo en animales e implantación de embriones son muy conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Hogan et al. (Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (1994)).
Se prefiere transferir embriones no humano de etapa temprana (aproximadamente 0 -2,5 días p.c.) todavía con una zona pelúcida intacta al oviducto de hembras no humanas pseudopreñadas controladas (preferentemente 0,5 días p.c.), mientras que embriones no humanos que han alcanzado el estadio de blastocisto se transfieren al útero de hembras pseudopreñadas controladas (preferentemente 2,5 días p.c.). Los embriones denudados se cultivan preferentemente in vitro hasta que alcanzan el estadio de mórula o de blastocisto (48 a 72 horas en cultivo), y luego se implantan en hembras pseudopreñadas apropiadamente controladas.
Los embriones no humanos y animales resultantes pueden analizarse, por ejemplo, para la integración del transgén, el número de copias del transgén que se integraron, la localización de la integración, la capacidad para transmitir el transgén a la progenie y la expresión del transgén. Tales análisis pueden llevarse a cabo en cualquier momento y pueden llevarse a cabo por cualquier método conocido en la técnica. Técnicas convencionales se describen, por ejemplo, en Hogan et al. (arriba).
Los métodos de infección de las células desvelados anteriormente no dependen de características específicas de especie de las células. Como resultado, se extienden fácilmente a todas las especies de mamífero.
Experimentos iniciales con ratones indican que de aquellos animales que se desarrollan a término, el 80-90 % llevaron al menos una copia del transgén y que, de estos, aproximadamente el 85 % expresan el gen de interés. De los animales no humanos transgénicos aproximadamente el 25 % llevan solo 1 o 2 copias del transgén. El mayor número de inserciones provirales observadas fue aproximadamente 30. De los animales que solo llevaban 1 o 2 copias del transgén, aproximadamente el 80 % expresaron el gen de interés.
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de 5 T consecutivas puede unirse inmediatamente en la dirección 3' de la región codificante de ARN para servir de terminador. En una construcción tal, la transcripción de Pol III se termina en la segunda o tercera T del molde de ADN, y así solo 2 a 3 restos de uridina ("U") se añaden al extremo 3' de la secuencia codificante.
La secuencia de la región codificante de ARN, y así la secuencia del dúplex de ARN, se eligen preferentemente para ser complementarias a la secuencia de un gen cuya expresión va a regularse por disminución en una célula o organismo. El grado de regulación por disminución logrado con una secuencia de dúplex de ARN dada para un gen diana dado variará por secuencia. Un experto en la materia será capaz de identificar fácilmente una secuencia eficaz. Por ejemplo, con el fin de maximizar la cantidad de supresión en un animal transgénico, pueden probarse varias secuencias para su eficacia en cultivo celular antes de generar un animal transgénico.
Los métodos de la presente invención encontrarán gran aplicación comercial, por ejemplo, en biotecnología, medicina y agricultura. Por ejemplo, en agricultura, los métodos descritos pueden usarse para conferir resistencia a enfermedad expresando en una célula u organismo un ARNip que regula específicamente por disminución la expresión de un gen asociado a un patógeno o estado de enfermedad. En biotecnología, la capacidad de desarrollar rápidamente grandes números de animales transgénicos con modulación deseada de los genes específicos permitirá el análisis de la función génica y la evaluación de compuestos que posiblemente modulan la expresión génica, función de proteínas, y son útiles en el tratamiento de una enfermedad o trastorno. En particular, observando el efecto de la regulación por disminución específica genes en animales transgénicos, puede determinarse la función biológica de aquellos genes. En medicina, los métodos de la invención pueden usarse para tratar pacientes que padecen enfermedades o trastornos particulares, tales como VIH, o para conferir inmunidad o resistencia a patógenos particulares. Por ejemplo, pueden infectarse células específicas in vivo o ex vivo con retrovirus recombinante que codifica un ARNip que regula por disminución la actividad de un gen cuya actividad está asociada con una enfermedad o trastorno particular.
Los siguientes ejemplos se ofrecen para fines ilustrativos solo, y no pretenden limitar el alcance de la presente invención de ningún modo.
Ejemplos
Ejemplo 1
Se construyó una construcción lentiviral por la inserción de un casete de expresión de ARNip en el sitio PacI del vector HC-FUGW (Figura 5; SEQ ID NO: 2). El ARNip se diseñó para regular por disminución la expresión del gen lacZ. El vector HC-FUGW comprendió un marcador de gen GFP operativamente unido al promotor de ubiquitina humano. El marcador de GFP fue útil para seguir los eventos de transducción. El vector también comprendió un elemento Flap de ADN del VIH para mejorar los títulos de virus, y WRE para la expresión de alto nivel de genes virales. El casete de expresión de ARNip estuvo compuesto de un promotor Pol III y una región codificante de ARN de horquilla pequeña, seguido de un sitio terminador Pol III. El promotor Pol III (SEQ ID NO:3) se derivó de la región -240 a -9 del promotor de ARN H1 humano y se clonó como un fragmento Eco R1 por amplificación por PCR a partir de ADN genómico de HEK293. El promotor Pol III está conectado a la región codificante de ARN en la dirección 3' por una secuencia conectora de 7 pares de bases para garantizar que la transcripción se inició con precisión en el primer nucleótido de la secuencia codificante de ARN. La región codificante de ARN de horquilla pequeña comprendió una secuencia de 19 nt correspondiente a la región 1900-1918 de la hebra codificante de la secuencia codificante del gen beta-galactosidasa (lacZ) bacteriano y la secuencia complementaria inversa perfecta de 19 nt separada por una región de bucle de 9 nt. El terminador comprendió 5 restos de timidina consecutivos unidos inmediatamente en la dirección 3' de la secuencia codificante de ARN. La secuencia del ARNip de horquilla se muestra en SEQ ID NO: 1.
Ejemplo 2
Se logró la transducción de células de mamífero cultivadas con retrovirus derivado de la construcción retroviral descrita en el Ejemplo 1 (Figura 6). Se usó el vector retroviral que codifica una molécula de ARN de horquilla pequeña descrita en el Ejemplo 1 para transfectar células de mamífero cultivadas que expresan lacZ. Se observó una profunda disminución en la expresión de lacZ.
Se produjo virus de ARNip de lacZ por cotransfección del vector retroviral, un plásmido de virus auxiliar y plásmido de expresión de VSVg en células HEK293. Se recogieron las partículas de virus de los sobrenadantes de cultivo celular y se concentraron por ultracentrifugación. Se usaron las preparaciones de virus concentradas para infectar tanto fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) como células HEK293 que alojan tanto genes indicadores de lacZ como de luciferasa de luciérnaga (Luc). La infección se monitorizó por la señal de GFP que se expresa a partir del casete de gen marcador del vector viral. En las condiciones de este experimento, >98 % de las células de prueba fueron GFP+ y así se transdujeron satisfactoriamente. Los niveles de expresión de los genes indicadores lacZ y Luc se midieron por ensayos quimioluminiscentes usando kits comercialmente disponibles (kit de ensayo de lacZ de Roche y Luc de Promega). Los virus de ARNip de lacZ solo inhibieron la expresión de lacZ, pero no de Luc. La inhibición específica se determinó por la relación de la actividad de lacZ con respecto a la actividad de Luc. La
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