-
Gebiet der Erfindung
-
Diese
Erfindung betrifft Verfahren zum Screening nach Agonisten und/oder
Antagonisten für
Aktivitäten,
die mit dem Rezeptor-Aktivator von NF-κB (RANK) verbunden sind.
-
Hintergrund der Erfindung
-
RANK,
ein Akronym für
Rezeptor-Aktivator von NF-κB,
ist ein Typ I-Transmembranprotein, das ein Mitglied der Superfamilie
der Tumornekrosefaktor(TNF)-Rezeptoren ist und das, wenn ausgelöst, den
Transkriptionsfaktor NF-κB
aktiviert (Anderson et al., Nature 390:175–179 (1997); Anderson et al.,
U.S. 6,017,729 ). Das humane
RANK (616 Aminosäuren)
weist ein Signalpeptid (28 Aminosäuren), eine N-terminale extrazelluläre Domäne (184
Aminosäuren),
eine kurze Transmembrandomäne
(21 Aminosäuren)
und eine große
C-terminale cytoplasmatische Domäne
(383 Aminosäuren)
auf, und Maus-RANK ist ähnlich
angeordnet (Anderson et al., 1997). Die extrazelluläre Domäne von RANK
enthält
vier Cystein-reiche Pseudorepeats und zwei N-Glykosylierungsstellen,
wobei diese Merkmale für
die Mitglieder der TNF-Rezeptor-Superfamilie charakteristisch sind. RANK
hat eine 40 %ige Homologie mit CD40 (Anderson et al., 1997), und
wird auf T-Zellen, dendritischen Zellen und Osteoklasten exprimiert
(Anderson et al., 1997; Hofbauer et al., J Bone Min Res 15:2–12 (2000)).
-
Die
cytoplasmatische Domäne
von RANK assoziiert intrazellulär
mit einigen der mit dem TNF-Rezeptor
assoziierten Faktoren (TRAFs; Baker und Reddy, Oncogene 12:1 (1996))
einschließlich
TRAF1, TRAF2, TRAF3, TRAF5 und TRAF6 (Galibert et al., J Biol Chem
273:34120–27
(1998)). Diese TRAF-Bindungsstellen sind in zwei unterschiedlichen
Domänen
im cytoplasmatischen Schwanz von RANK gruppiert. Die TRAFs sind cytoplasmatische
Proteine, die oftmals die Signaltransduktion durch Mitglieder der
TNF-Rezeptor-Superfamilie vermitteln, und sie sind bei der Regulierung
von, zum Beispiel, Immun- und entzündlichen Reaktionen von Bedeutung.
RANK vermittelt einige oder alle seiner biologischen Aktivitäten durch
eine Kaskade von Ereignissen, welche die TRAF-Bindungsstellen beteiligen (siehe, zum
Beispiel, Galibert et al., 1998).
-
Das
Auslösen
von RANK, wie beispielsweise durch Kontakt mit membrangebundenem
oder löslichem RANK-L,
führt zu
der Stimulierung von RANK-vermittelten zellulären Reaktionen. Diese zellulären Reaktionen können die
Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-κB umfassen, einem ubiquitären Transkriptionsfaktor,
der in Zellen des Immunsystems weit verbreitet verwendet wird, oder
die Aktivierung von Jun-Kinase (JNK; siehe, zum Beispiel, Galibert
et al., 1998). RANK-Aktivierung in Vorläuferzellen für Osteoklasten
veranlasst die Vorläufermoleküle zu einer
Differenzierung zu reifen Osteoklasten. Dieser Differenzierungsprozess
geht einher mit der Neuanordnung von Aktin in „F-Aktinringe", einer spezialisierten Struktur, die
durch Anfärben
nachweisbar ist (Lakkakorpi, P. und Vaananen, J. Bone Min Res 6:817–826 (1991)).
Erhöhte
Level von c-src Tyrosinkinase-Aktivität geht ebenfalls mit einer
RANK-Aktivierung einher (Wong et al. Molecular Cell 4:1041–1049 (1999)).
Der RANK-Ligand (RANK-L) ist ein Zelloberflächenprotein, das mit RANK bindet
und es aktiviert (Anderson et al.,
U.S.
6,017,729 ). Dieses Protein ist auch bekannt als TRANCE-,
ODF- oder OPG-Ligand
(Wong et al., 1999). RANK-L ist ein Transmembranprotein vom Typ
2 und weist eine intrazelluläre
Domäne
mit etwa 50 Aminosäuren
oder weniger, eine Transmembrandomäne und eine extrazelluläre Domäne mit etwa
240 bis 250 Aminosäuren
auf. Die extrazelluläre
Domäne
von RANK-L enthält eine
RANK-Bindungsstelle. Ebenso wie andere Mitglieder der TNF-Familie,
zu der es gehört,
weist RANK-L eine „Spacer"-Region zwischen
der Transmembrandomäne
und der Rezeptorbindungsdomäne
auf, die für
die Rezeptorbindung nicht notwendig ist.
-
Im
Knochen stimuliert RANK-L die Differenzierung zu Osteoklasten, verstärkt die
Aktivität
der reifen Osteoklasten und inhibiert die Apoptose der Osteoklasten,
wodurch der Pool an aktivierten Osteoklasten ausgedehnt wird (siehe,
zum Beispiel, Hsu et al., Proc Nat'l Acad Sci USA. 96:3540–45 (1999)).
Osteoklasten sind große,
phagozytische, mehrkernige Zellen, die aus hämatopoetischen Vorläuferzellen
im Knochenmark gebildet werden. Osteoklasten fördern die Auflösung der
Knochenmatrix und die Solubilisierung der Knochensalze und werden
für die
richtige Entwicklung und das Wachstum von Knochen benötigt.
-
Östrogen
inhibiert RANK-L-induzierte Osteoklastendifferenzierung (Shevde
et al., J. Bone Min. Res. 14, Suppl. 1, Seite S150 (1999)). Für eine Übersicht
siehe Suda et al., Endocrine Reviews 13:66–80 (1992) und Roodman, Endocrine
Reviews 17:308–332
(1996).
-
RANK
Knock out-Mäuse
sind schwer osteopetrotisch und es fehlt ihnen an peripheren Lymphknoten (Dougall
et al., Genes Dev. 13:2412–24
(1999)). Als ein Mittel zur Behandlung wurde die Modulierung der RANK-
und RANK-L-Aktivität
einer Vielzahl von Störungen
vorgeschlagen, die Osteopenie oder Osteopetrose beinhalten, einschließlich, zum
Beispiel, Osteoporose, Morbus Paget, Hyperkalzämie und so weiter (siehe, zum
Beispiel,
WO 98/46751 und
WO 99/58674 ).
-
RANK
und sein Ligand spielen eine wesentliche Rolle bei der Regulierung
eines breiten Spektrums an biologischen Systemen, einschließlich der
Immunreaktion, der entzündlichen
Reaktion und der Knochenremodellierung durch Aktivierung von Osteoklasten.
Angesichts der Bedeutung von RANK bei der Regulierung eines breiten
Spektrums von biologischen Systemen besteht ein Bedarf an Verfahren
zum Screening nach Molekülen,
die eine antagonistische oder agonistische Wirkung auf die RANK-Aktivität haben.
-
Zusammenfassung der Erfindung
-
Die
vorliegende Erfindung stellt Verfahren zum Screening nach einem
Molekül
bereit, das eine antagonistische oder agonistische Wirkung auf die
RANK-Aktivität
hat.
-
In
einer Ausführungsform
der Erfindung umfassen Assays für
RANK-Agonisten oder -Antagonisten das Kultivieren von RANK-reaktiven
Zellen in einem halbfesten Medium in der Gegenwart eines Kandidatenmoleküls und Bestimmen,
ob die Geschwindigkeit der Koloniebildung oder die Geschwindigkeit
des Koloniewachstums verglichen mit einer Kontrollkultur bei Zellen
verstärkt
oder vermindert ist, die mit dem Kandidatenmolekül in Kontakt gebracht wurden.
In diesem Assay wird ein Kandidatenmolekül als ein RANK-Antagonist identifiziert,
wenn die Geschwindigkeit der Koloniebildung oder des Koloniewachstums
in den Zellen, die damit in Kontakt gebracht wurden, auch „Testzellen" genannt, erhöht ist,
verglichen mit der Geschwindigkeit der Koloniebildung oder des Wachstums
in den Kontrollreferenzzellen, die nicht mit dem Kandidatenmolekül in Kontakt
gebracht wurden, oder als ein RANK-Agonist, wenn die Geschwindigkeit
vergleichsweise vermindert ist. Abgesehen von dem Kontakt mit dem
Kandidatenmolekül,
werden Kontrollreferenzzellen ansonsten auf die gleiche Weise wie
die Testkulturen kultiviert und behandelt.
-
In
einem Aspekt der Erfindung ist das verwendete halbfeste Medium Methylcellulose,
obwohl weiches Agar, weiche Agarose oder dergleichen auch verwendet
werden können.
-
Wenn
gewünscht,
können
die Kandidatenmoleküle
für dieses
Assay chargenweise zusammengefasst werden. Bei dieser Vorgehensweise
wird eine Vielzahl an Kandidatenmolekülen zu einer Testkultur gegeben. Wird
eine Modulierung der RANK-Aktivität in solchen Kulturen beobachtet,
kann jedes Kandidatenmolekül
in dem Batch dann getrennt untersucht und Antagonisten oder Agonisten
individuell identifiziert werden.
-
Wenn
das Assay mit dem halbfesten Medium verwendet wird, um nach Molekülen zu screenen,
die eine antagonistische Wirkung auf die RANK-Aktivität haben,
wird RANK in den RANK-reaktiven Zellen bevor, während und/oder nachdem die
Testzellen dem Kandidatenmolekül
ausgesetzt werden, ausgelöst.
Wie hierin verwendet, bezieht sich das Auslösen von RANK auf ein Ereignis,
welches das RANK-Protein dazu stimuliert, ein Signal an die Zelle
zu transduzieren, in der es exprimiert wird. Zellen, die in diesem
ersten Aspekt der Erfindung von Nutzen sind, exprimieren RANK-Protein,
sind fähig,
Kolonien in einem halbfesten Medium zu bilden, und werden durch
die Wirkung von einem oder mehreren Rank-vermittelten zellulären Signalwegen
stimuliert, um zu Zelltypen zu differenzieren, die keine Kolonien
in halbfestem Medium bilden können.
-
Wenn
RANK-Aktivität
in RANK-reaktiven Zellen für
die erfindungsgemäßen Assays
in halbfestem Medium stimuliert werden, umfassen bevorzugte Verfahren
zur Stimulierung: die RANK-reaktiven Zellen mit einem RANK-L-Polypeptid
in Kontakt zubringen, wie einem RANK-L-Polypeptid, das die Aminosäuren 162–317 von
SEQ ID NO:6 oder die Aminosäuren
161–316
von SEQ ID NO:8 enthält;
die RANK-reaktiven Zellen mit agonistischen Anti-RANK Antikörpern in
Kontakt zu bringen; die RANK-reaktiven
Zellen mit einer oder mehreren Zellen in Kontakt zu bringen, die
ein RANK-L-Polypeptid exprimieren; RANK in den RANK-reaktiven Zellen zu überexprimieren;
und in den RANK-reaktiven Zellen eine mutierte Form von RANK zu
exprimieren, die bei normalen Level von RANK-Expression in der Abwesenheit
von RANK-L ein RANK-Signalisieren veranlasst. Ein Beispiel für die letztere
Art von RANK ist FEO RANK (SEQ ID NOS:9 und 10).
-
Beispiele
für RANK-L-Polypeptide
zur Stimulierung der RANK-Aktivität umfassen natives RANK-L,
wie beispielsweise endogenes RANK-L, das auf der Oberfläche von
Zellen exprimiert wird, lösliche
Formen von RANK-L, eine Leucin-Zipper-Fusion von RANK-L und eine
FLAGTM polyHis-Fusion von RANK-L. Ein weiteres Verfahren
zum Stimulieren der RANK-Aktivität
für die
betreffenden Assays ist, die RANK-reaktiven Zellen mit einem agonistischen
Anti-RANK-Antikörper
in Kontakt zu bringen. Beispiele für agonistische Anti-RANK-Antikörper für diesen
Zweck umfassen M330-Antikörper
und M331-Antikörper,
die beide gegen humanes RANK gerichtet sind, und M395- und M396-Antikörper, die
gegen murines RANK gerichtet sind.
-
In
einem Aspekt der Erfindung wird die Geschwindigkeit der Koloniebildung
oder des Koloniewachstums in halbfestem Medium durch visuelle Überprüfung der
Platten bestimmt, nachdem die Zellen dem Kandidatenmolekül ausgesetzt
worden sind. Die Anzahl an Kolonien oder die Größen der beobachteten Kolonien wird
bei Platten verglichen, die dem Kandidatenmolekül ausgesetzt waren, und gleichartigen
Kulturen, die den Kandidatenmolekülen nicht ausgesetzt waren.
-
Ein
Mittel, die RANK-reaktiven Zellen mit einem Kandidatenmolekül in Kontakt
zu bringen, umfasst die Einführung
eines DNA-Moleküls
in die Testzellen, das entweder ein Kandidatennucleinsäuremolekül kodiert oder
ein Kandidatenproteinmolekül
kodiert. Zum Beispiel kann die eingeführte DNA ein cDNA-Molekül sein, das
ein einzelnes Protein kodiert, oder eine cDNA-Bibliothek, die eine
zu testende Gruppe von Proteinen kodiert. Nachdem sie in die Zellen
eingeführt
wurde, kann diese DNA in das Genom der RANK-reaktiven Zellen integriert
werden oder nicht. Techniken für
stabile Transfektion und transiente Transfektion sind bekannt und beide
Arten von Techniken können
verwendet werden. In einigen Beispielen ist das kodierte Kandidatenmolekül ein Nucleinsäuremolekül wie ein
Antisense-Oligonucleotid
oder eine RNA mit Ribozymaktivität.
In einem Aspekt der Erfindung werden cDNAs, bei denen eine Kodierung
für einen
RANK-Agonisten oder -Antagonisten nachgewiesen wurde, aus den Kolonien
der Testzellen, die in dem halbfesten Medium gezogen wurden, isoliert und
gereinigt.
-
Andere
Mittel, die RANK-reaktiven Zellen mit Kandidatenmolekülen in Kontakt
zu bringen, umfasst die Zugabe des Kandidatenmoleküls direkt
zu dem halbfesten Medium, entweder durch Mischen derselben mit dem
Medium vor dem Ausgießen
auf die Platten oder durch Überschichten
der gegossenen Platten mit einer Schicht aus dem das Kandidatenmolekül enthaltenden
Medium. Zum Beispiel können
die vorgenannten Verfahren verwendet werden, wenn das Kandidatenmolekül ein Protein
oder ein kleines organisches Molekül ist. Wenn gewünscht, kann
eine Vielzahl von Proteinen oder anderen Testmolekülen zu den
Testkulturen gegeben werden.
-
In
einem Aspekt der Erfindung werden RANK-reaktive Zellen eingesetzt,
die ein defektes RANK-Molekül exprimieren,
und das Screening erfolgt nach einem Agonisten, der dieses defekte
RANK-Molekül komplementiert.
Ein Beispiel für
ein defektes RANK für
diesen Zweck ist humanes RANKΔ340-42.
-
Geeignete
RANK-reaktive Zellen für
die oben beschriebenen Assays umfassen primäre hämatopoetische Zellen, einschließlich hämatopoetische
Vorläuferzellen,
die aus dem Knochenmark, der Milz, der fötalen Leber oder peripherem
Blut gewonnen werden, sowie primäre
hämatopoetische
Zellen, die aus dem Knochenmark, der Milz, der fötalen Leber oder peripherem
Blut gewonnen und mit Vorläufer
für Osteoklasten
angereichert wurden. In weiteren Aspekten der Erfindung sind die
RANK-reaktiven Zellen eine Zelllinie. Geeignete Zelllinien umfassen
RAW 264.7-Zellen, C7-Zellen und BCL-XI/Tag-Zellen.
-
Ein
weiterer Aspekt der Erfindung nutzt die Fähigkeit von Promotorsequenzen,
die aus dem Gen der Tartrat-resistenten sauren Phosphatase (TRAP)
(SEQ ID NO: 12) oder dem MMP-9-Gen (SEQ ID NO:11) erhalten werden,
um direkt auf die Signaltransduktion zu reagieren, die eine Folge
der Auslösung
von RANK ist. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der MMP-9-Promotor
die Nucleotide 1769–3591
von SEQ ID NO:11. Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zum
Screening nach einem RANK-Agonisten oder -Antagonisten durch die
Verwendung von rekombinanten DNA-Konstrukten
bereit, in denen ein TRAP- oder MMP-9-Promotor funktionell mit einem
Nucleinsäuremolekül verknüpft ist,
das für
ein Reporterprotein kodiert. Reporterproteine, die für diesen
Zweck geeignet sind, umfassen, zum Beispiel, Luciferase, β-Galactosidase, Grün fluoreszierendes
Protein, alkalische Phosphatase oder ein heterologes Oberflächenprotein,
das durch Antikörperbindungsverfahren
nachgewiesen werden kann. Beispiele für letzteres umfassen den humanen IL-2-Rezeptor,
den murinen IL-4-Rezeptor, das humane CD2-Protein, das humane CD4-Protein und das humane
CD8-Protein.
-
Für diese
Assays wird ein Reporter/Promotor-Konstrukt, wie es hierin beschrieben
wurde, in die kultivierten RANK-reaktiven Zellen eingeführt. Geeignete
RANK-reaktive Zellen umfassen hämatopoetische
Zellen. Beispiele für
geeignete hämatopoetische
Zellen umfassen RAW 264.7-Zellen.
Um diese Vorgehensweise zum Screening nach einem RANK-Antagonisten
zu verwenden, werden die Konstrukte in die Testzellen eingeführt, die
dann mit einem Agonisten für
eine RANK-Aktivität behandelt
werden, wie beispielsweise löslichem RANK-L,
das RANK in den Zellen auslöst
und dadurch die Promotoraktivität
in dem Konstrukt auslöst,
was zur Expression des Reportergens führt. Kandidatenmoleküle für den Antagonisten
werden mit den ausgelösten Zellen
in Kontakt gebracht, um deren Fähigkeit
zu untersuchen, diese RANK-vermittelte Expression von Reportergen
zu unterdrücken.
Die Testzellen werden mit dem Kandidatenanatagonisten vor, während oder
nach dem RANK-Auslosungsschritt in Kontakt gebracht.
-
Kandidatenmoleküle können, zum
Beispiel, zu dem Kulturmedium gegeben werden. In einer Ausführungsform
der Erfindung ist das Kandidatenmolekül ein Protein; in einer weiteren
Ausführungsform
ist es ein kleines organisches Molekül.
-
In
einem Aspekt der Erfindung ist das Kandidatenmolekül ein Protein
oder eine Gruppe von Proteinen, die durch cDNA kodiert wird, die
in die Testzellen eingeführt
wurde, bevor die Zellen dem Auslösen
von RANK ausgesetzt wurden. Im Allgemeinen wird die cDNA mindestens
48 Stunden vor dem Auslösen
von RANK eingeführt.
Die cDNA kann aus Zellen isoliert werden, die einen veränderten
Level an Reportergenexpression aufweisen.
-
Geeignete
Verfahren zum Auslösen
von RANK in den Assays mit den oben beschriebenen Reporter/Promotor-Konstrukten
umfassen, die Testzellen Zellen auszusetzen, die RANK-L auf ihrer
Oberfläche
exprimieren, die Testzellen löslichem
RANK auszusetzen, RANK in den Testzellen zu überexprimieren, humanes RANKΔ340-42 in
den Testzellen zu exprimieren oder die Testzellen einem agonistischen
Antikörper
auszusetzen, der für
das RANK-Protein spezifisch ist. In einem Aspekt der Erfindung wird
RANK in den RANK-reaktiven Zellen ausgelöst, indem diese mit einem RANK-L-Polypeptid in Kontakt
gebracht werden, das Aminosäuren 162–317 von
SEQ ID NO:6 oder Aminosäuren
161–316
von SEQ ID NO:8 umfasst.
-
Testzellen,
in denen RANK ausgelöst
wurde, werden mit dem Kandidatenmolekül in Kontakt gebracht und die
Zellen werden anschließend
analysiert, um zu bestimmen, ob der Level an Reporterproteinexpression als
Folge dieses Kontakts verstärkt
oder vermindert ist. Der Level an Reporterexpression wird durch
jedes beliebig geeignete Assay bestimmt, wie beispielsweise einem
auf Fluoreszenz basierenden Assay, einem kolorimetrischen Assay,
einem Festphasenassay oder Assays, die eine radioaktive Verbindung
einsetzen. Ein Mittel zur Bestimmung des Levels an Reportergenprodukt
ist die Verwendung von herkömmlichen
Verfahren, um durch auf Fluoreszenz basierender Durchflusscytometrie
solche Zellen physikalisch zu isolieren, die das Reportermolekül exprimieren.
Verstärkung
oder Verminderung der Reporterproteinexpression in den Testzellen wird
durch Vergleichen des Levels an Reporterproteinexpression in den
Testzellen mit dem Expressionslevel in Kontrollkulturen bestimmt,
die nicht mit dem Kandidatenmolekül in Kontakt gebracht wurden.
Wenn das Kandidatenmolekül
ein RANK-Antagonist ist, wird der Level an Reporterexpression vergleichsweise
vermindert sein.
-
Die
oben beschriebenen Konstrukte werden auch zum Screenen nach RANK-Agonisten
verwendet. In diesem Fall wird RANK in den Testzellen nicht absichtlich
ausgelöst,
sondern das Kandidatenmolekül
wird eher auf seine Fähigkeit
hin untersucht, RANK auszulösen.
Zellen, die in diesem Aspekt der Erfindung von Nutzen sind, exprimieren
RANK-Protein und enthalten mindestens einen Signaltransduktionsweg,
der durch die Aktivierung von RANK stimuliert wird. In einigen Fällen wird
der Agonist mit den Zellen in Kontakt gebracht, indem in die Zellen
eine cDNA eingeführt
wird, die für
einen Agonisten des Kandidatenproteins kodiert, oder indem eine
cDNA-Bibliothek eingeführt
wird, die für
eine Vielzahl an Agonisten des Kandidatenproteins kodiert. In solchen
Fällen
kann ein Agonist durch Gewinnung und Reinigung der cDNA aus solchen
Kolonien isoliert werden, die verstärkte Expression von Reportergen
aufweisen. Weiterhin kann gezeigt werden, unter Verwendung von herkömmlichen
Techniken, dass das gereinigte Kandidatenmolekül tatsächlich mit RANK wechselwirkt.
-
In
einem Aspekt der Erfindung werden die Reporter/Promotor-Konstrukte
verwendet, um RANK-Agonisten
zu identifizieren, indem Zellen verwendet werden, die ein defektes
RANK-Molekül
exprimieren, und das Screening ist für einen Agonisten, der dieses
defekte RANK-Molekül komplementiert.
Zum Beispiel können Zellen,
die humanes RANKΔ340-42
exprimieren, für
diesen Zweck verwendet werden.
-
In
einem weiteren Aspekt der Erfindung umfasst das Screening nach Antagonisten
oder Agonisten für die
RANK-Aktivität,
ein Kandidatenmolekül
mit RANK-reaktiven Zellen in Kontakt zu bringen, die in der Lage sind,
als Reaktion auf das Auslösen
von RANK zu Osteoklasten zu differenzieren. Um nach RANK-Antagonisten
zu screenen, löst
man RANK in den Zellen aus, setzt die Zellen dem Kandidatenantagonisten
aus und beobachtet den Level der c-src-Aktivität oder F-Aktin-Bildung im Vergleich
zu dem Level an c-src-Aktivität
oder F-Aktin-Bildung in Bezug auf RANK-reaktive Zellen, die nicht
mit dem Kandidatenmolekül
in Kontakt gebracht wurden. Wenn der Kandidat ein Antagonist ist,
wird die Geschwindigkeit der c-src-Aktivität und F-Aktinringbildung vergleichsweise
vermindert sein. Wenn der Kandidat nach einer RANK-Agonistaktivität gescreent
werden soll, wird der Schritt des RANK-Auslösens ausgelassen, und ein positives
Ergebnis wird aus der Beobachtung in einer verstärkten c-src-Aktivierung und
F-Aktinbildung bestehen.
-
In
noch einem weiteren Aspekt der Erfindung werden Kandidaten für RANK-Agonisten
oder -Antagonisten gescreent, indem ein Kandidatenmolekül mit RANK-reaktiven
Zellen in Kontakt gebracht wird, die in der Lage sind, als Reaktion
auf das Auslösen
von RANK in diesen Zellen zu Osteoklasten zu differenzieren, RANK in
den Zellen ausgelöst
wird und anschließend
die Zellen auf einem Film aus Ca3(PO4)2 kultiviert werden.
Differenzierte Osteoklasten werden das Ca3(PO4)2 in ihrer direkten
Nachbarschaft resorbieren, und so eine Vertiefung in dem Film erzeugen.
Dann werden die Anzahl der Vertiefungen in dem Film verglichen,
die durch die kultivierten Zellen verursacht werden, die in Kontakt
gebracht wurden, mit der Anzahl an Vertiefungen, die in einem gleichartigen
Film mit Bezug auf RANK-reaktive Zellen verursacht werden, in denen
RANK ausgelöst wird,
die aber nicht mit dem Kandidatenmolekül in Kontakt gebracht wurden.
Man kann dann ein Kandidatenmolekül als einen RANK-Agonisten
identifizieren, wenn eine größere Anzahl
an Vertiefungen durch die mit Kandidatenmolekül behandelten Zellen verursacht
wird, als durch die Referenzzellen, und als ein RANK-Antagonisten,
wenn die Anzahl an Vertiefungen, die durch die behandelten Zellen
verursacht werden, geringer ist, als die Anzahl, die durch die Kontrollzellen
verursacht wird.
-
Detaillierte Beschreibung der bevorzugten
Ausführungsform
-
Die
vorliegende Erfindung stellt Verfahren zum Screening nach einem
Molekül
bereit, das eine antagonistische oder agonistische Wirkung auf die
RANK-Aktivität
hat. Obwohl verschiedene Assays zum Nachweis von Antagonisten und
Agonisten von RANK auf dem Fachgebiet bekannt sind (siehe, zum Beispiel,
U.S. 6,017,729 ), sind die
hierin beschriebenen Screening-Strategien bisher noch nicht beschrieben
worden.
-
Wie
hier verwendet, bezieht sich der Begriff „RANK-Agonist" oder grammatikalische Äquivalente
davon auf ein Molekül,
das die RANK-Aktivität
stimuliert, einschließlich
eines Moleküls,
das RANK auslöst.
Ein RANK-Agonist kann direkt mit RANK wechselwirken oder er kann
die RANK-Aktivität
indirekt verstärken. RANK-L,
zum Beispiel, könnte
als ein RANK-Agonist betrachtet werden. Ebenso wirken Antikörper, die
spezifisch RANK binden, oftmals als Agonisten für die RANK-Aktivität.
-
Wie
hier verwendet, bezieht sich der Begriff „RANK-Antagonist" oder grammatikalische Äquivalente davon
auf ein Molekül,
das die RANK-Aktivität
inhibiert. Ein RANK-Antagonist kann direkt oder indirekt mit RANK
Wechselwirken. RANK:Fc (beschrieben in
U.S. 6,017,729 ) und Osteoprotegerin
(beschrieben in
U.S. 6,015,938) sind
Beispiele für
RANK-Antagonisten, wobei ersteres ein Fusionsprotein ist, das die
extrazelluläre Domäne von RANK
fusioniert mit der Fc-Region von Immunglobulin enthält, und
letzteres ein natürlich
vorkommendes Protein ist. Diese beiden Proteine haben eine antagonistische
Wirkung auf RANK durch Bindung von RANK-L, wodurch das RANK-L an
einer Bindung mit RANK-reaktiven Zellen gehindert wird.
-
Der
Begriff „RANK", wie er hier verwendet
wird, bezieht sich auf ein Protein mit der Fähigkeit NF-κB zu aktivieren oder die Fähigkeit,
mit TRAF1, TRAF2, TRAF3, TRAF5 oder TRAF6 zu binden, und mit einer
mindestens 80 %igen Aminosäure-Identität mit der
in SEQ ID NO:2 oder SEQ ID NO:4 gezeigten Aminosäuresequenz. Erfindungsgemäße RANK-Proteine
sind in der Lage, mit Antikörpern
zu binden, die spezifisch an ein Protein zu binden, das die Aminosäuresequenz
von SEQ ID NO:2 oder SEQ ID NO:4 aufweist.
-
Der
Begriff „RANK-L" ist ein Akronym
für RANK-Ligand,
welcher ein Transmembranprotein vom Typ 2 ist, das an RANK bindet
und es aktiviert. Die Sequenzen der beiden Nucleinsäuremoleküle, die
für charakteristische
RANK-L-Proteine kodieren, sind in SEQ ID NO:5 (humanes RANK-L) und
SEQ ID NO:7 (murines RANK-L) dargelegt, und die Sequenzen der RANK-L-Proteine,
die durch diese beiden Nucleinsäuresequenzen kodiert
werden, sind in SEQ ID NO:6 bzw. SEQ ID NO:8 dargelegt. Es versteht
sich, dass „RANK-L", wie es hier verwendet
wird, sowohl Volllängen-RANK-L-Proteine
sowie membrangebundene oder lösliche
Formen des RANK-L-Proteins umfasst, einschließlich chimärer Moleküle, die Teile von RANK-L enthalten,
und multimerer RANK-L-Moleküle.
-
RANK
und RANK-L sind an der Kontrolle der Bildung von reifen Osteoklasten
beteiligt, dem primären Zelltyp,
der an der Knochenresorption beteiligt ist. Eine Steigerung der
Geschwindigkeit der Knochenresorption (über die der Knochenbildung
hinaus) kann zu verschiedenen Knochenstörungen führen, die zusammengefasst als
Osteopenien bezeichnet werden und Osteoporose, Osteomyelitis, Hyperkalzämie, durch
Chirurgie oder Steroidverabreichung verursachte Osteopenie, Morbus
Paget, Osteonekrose, Verlust an Knochensubstanz aufgrund von rheumatoider
Arthritis, periodontalen Verlust an Knochensubstanz, prothetischen
Verlust oder Lockerwerden und osteolytische Metastasierung umfassen.
Agonisten und Antagonisten für
RANK können
verwendet werden, um die Bildung von Osteoklasten zu modulieren
und können
Patienten verabreicht werden, die an Knochenstörungen leiden, um diese Zustände zu verbessern.
-
Weiterhin
metastasieren viele Krebsarten in den Knochen und verursachen einen
Zusammenbruch des Knochens durch lokale Unterbrechung der normalen
Knochenwiederherstellung. Solche Krebsarten können mit einer erhöhten Anzahl
an Osteoklasten und erhöhten
Mengen an osteoklastischer Knochenresorption einhergehen, was zu
Hyperkalzämie
führt (siehe,
zum Beispiel, Guise et al. Endocrine Reviews, 19(1): 18–54, 1998.).
Andere Krebsarten metastasieren nicht notwendigerweise in den Knochen,
führen
aber zu Hyperkalzämie
und Knochenverlust (z. B., Plattenepithelkarzinome). Agonisten und
Antagonisten von RANK können
Patienten verabreicht werden, die an Krebs leiden, um dessen Symptome
zu lindern, einschließlich,
aber nicht beschränkt
auf solche, die an Brustkrebs, multiplem Myelom, Melanomen, Lungenkrebs,
Prostata-, hämatologischem,
Kopf- und Hals- und Nierenkrebs leiden. Antagonisten der RANK/RANK-L-Wechselwirkung sind
insbesondere für
die Behandlung von Krebs von Nutzen.
-
Außerdem können durch
die vorliegenden Screening-Assays identifizierte RANK-Antagonisten
oder -Agonisten verwendet werden, um kardiovaskuläre Erkrankungen
oder andere Zustände,
die durch arterielle Verkalkung gekennzeichnet sind, zu verhindern
oder zu behandeln. Ebenso sind die hierin identifizierten Antagonisten
und Agonisten von RANK bei der Behandlung von Immunerkrankungen
und/oder entzündlichen
Erkrankungen, wie beispielsweise toxischem oder septischem Schock
oder Transplantat-gegen-Empfänger-Reaktionen
(wie beispielsweise über
die Inhibierung der NF-PB-Aktivierung)
von Nutzen. Da das Auslösen
von RANK die T-Zell-Aktivierung stimuliert, sind die hierin identifizierten
RANK-Agonisten als Adjuvanzien beim Impfen von Nutzen.
-
Tumorzellen
reagieren stärker
auf Strahlung, wenn ihr NF-κB
blockiert ist; daher werden Antagonisten der RANK-Signalgebung als
eine Kombinationstherapie für
Erkrankungen von Nutzen sein, die durch neoplastische Zellen gekennzeichnet
sind, die RANK exprimieren. Umgekehrt werden Agonisten für RANK bei
der Stimulierung von RANK-vermittelten zellulären Reaktionen von Nutzen sein
und bestimmte RANK-Agonisten können
in der Lage sein, inaktive RANK-Mutanten zu komplementieren.
-
Kandidatenmoleküle, die auf RANK-Agonist- oder
-Antagonistaktivität
untersucht werden sollen:
-
Beispiele
für Kandidatenmoleküle, hierin
auch als „Testmoleküle" bezeichnet, die
auf RANK-Agonist- oder
-Antagonistaktivität
untersucht werden sollen, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf,
Kohlenhydrate, kleine Moleküle
(gewöhnlich
organische Moleküle
oder Peptide), Proteine und Nucleinsäuremoleküle (einschließlich Oligonucleotidfragmenten,
die typischerweise aus 8 bis 30 Nucleinsäureresten bestehen). Zu untersuchende
Peptide bestehen typischerweise aus 5 bis 25 Aminosäureresten.
Weiterhin können
Nucleinsäuremolekülkandidaten
Antisense-Nucleinsäuresequenzen
sein und/oder können
Ribozymaktivität
besitzen. Wenn gewünscht,
können
Antisense- oder Ribozym-RNAs in eine Zielzelle durch Mittel zur
Einführung
eines DNA-Moleküls
in die Zellen eingeführt
werden, das für
die Antisense- oder Ribozym-RNA kodiert.
-
Kleine
Moleküle,
die unter Verwendung der hier beschriebenen Screening-Assays gescreent
werden sollen, können
einem Patienten, der diese benötigt,
typischerweise oral oder durch Injektion verabreicht werden. Kleine
Moleküle,
die oral verabreicht werden können,
sind besonders bevorzugt. Die erfindungsgemäßen kleinen Moleküle werden
vorzugsweise nicht toxisch sein in den Dosen, die benötigt werden,
damit sie als pharmazeutische Mittel wirksam sind, und sie unterliegen
vorzugsweise nicht einem schnellen Verlust an Aktivität im Körper, wie
beispielsweise einem Verlust an Aktivität, der aus schnellem enzymatischem
oder chemischem Abbau folgen kann. Außerdem sind pharmazeutisch
nützliche
kleine Moleküle
vorzugsweise nicht immunogen.
-
Die
erfindungsgemäßen Verfahren
können
verwendet werden, um nach Antisense-Molekülen zu screenen, die RANK-Aktivität durch
Stören
der funktionalen Expression von einem oder mehreren mRNA-Molekülen inhibieren,
die ein oder mehrere Proteine kodieren, welche eine RANK-abhängige zelluläre Reaktion vermitteln.
Ein Antisense-Nucleinsäuremolekül ist komplementär zu einem Nucleinsäureziel,
das innerhalb der Wirtszelle exprimiert wird, und durch Bildung
von Doppelsträngen
mit dem Ziel hindern sie das Ziel so an seiner Funktion. Antisense-Nucleinsäuren können die
Transkription eines Zielgens durch Doppelstrangbildung mit jedem
der beiden Stränge
der DNA verhindern, die das Gen kodieren, oder durch Doppelstrangbildung
mit einem regulierenden Element, das die Expression des Zielgens
kontrolliert. Alternativ können
sie mit einer mRNA einen Doppelstrang bilden und so seine Translation
behindern oder blockieren. Ein Antisense-Nucleinsäuremolekül kann auf eine Anzahl an verschiedenen
Wegen konstruiert werden, unter der Voraussetzung, dass es in der
Lage ist, die Expression eines Zielgens zu stören. Typische, zu screenende
Antisense-Oligonucleotide haben vorzugsweise eine Länge von
20–50
Nucleotiden und mehr bevorzugt eine Länge von 30–40 Nucleotiden. Das Antisense-Nucleinsäuremolekül wird im
Allgemeinen im Wesentlichen identisch in seiner Nucleotidsequenz
mit einem Strang des Zielgens sein. Die minimale Identität wird typischerweise
größer als
etwa 65 % sein, aber eine höhere
Identität
kann eine wirksamere Unterdrückung
der Expression der endogenen Sequenzen ausüben. Eine wesentlich größere Identität von mehr
als etwa 80 % ist bevorzugt, obwohl etwa 95 % bis absolute Identität am meisten
bevorzugt ist.
-
Kandidaten
für das
Nucleinsäuremolekül können Ribozymaktivität besitzen.
So können
die erfindungsgemäßen Verfahren
verwendet werden, um nach Ribozym-Molekülen zu screenen, welche die
funktionale Expression von einem oder mehreren mRNA-Molekülen inhibieren,
die für
ein oder mehrere Proteine kodieren, welche eine RANK-abhängige zelluläre Reaktion
vermitteln. Ribozyme sind katalytische RNA-Moleküle, welche Nucleinsäuremoleküle mit einer
Sequenz, die vollständig
oder teilweise zu der Sequenz des Ribozyms homolog ist, spalten
können.
Es ist möglich,
Ribozym-Transgene
zu entwerfen, die für
RNA-Ribozyme kodieren, die sich spezifisch mit einer Ziel-RNA paaren
und das Phosphodiester-Grundgerüst
an einer spezifischen Stelle spalten, wodurch die Ziel-RNA funktional inaktiviert
wird. Indem diese Spaltung ausgeführt wird, wird das Ribozym
selbst nicht verändert
und ist so in der Lage, weiter andere Ziel-RNA-Moleküle zu spalten.
Der Einschluss von Ribozymsequenzen in die Antisense-RNAs überträgt auf diese
RNA-Spaltungsaktivität,
wodurch die Aktivität
der Antisense-Konstrukte erhöht
wird.
-
Das
Design und die Verwendung von für
die Ziel-RNA spezifischen Ribozymen wird beschrieben in Haseloff
et al. (Nature, 334: 585–591
(1988)) (siehe auch
U.S. Patent
Nr. 5,646,023 ); beide Veröffentlichungen sind durch Bezugnahme
hier aufgenommen. Tabler et al. (Gene 108:175 (1991)) haben die
Konstruktion von katalytischen RNAs stark vereinfacht, indem sie
die Vorteile der Antisense-RNA und der Ribozym-Technologien in einem
einzigen Konstrukt vereinigt haben. Für Ribozymkatalyse werden kleinere
Regionen mit Homologie benötigt;
daher kann dies die Unterdrückung
von verschiedenen Mitgliedern einer großen Genfamilie fördern, wenn
die Spaltungsstellen konserviert werden.
-
RANK- und RANK-L-Moleküle
-
Im
Allgemeinen umfassen die hier beschriebenen Screening-Assays ein
RANK- oder ein RANK-L-Protein.
-
RANK
und sein Bindungspartner RANK-L und Nucleinsäuren, die diese Proteine kodieren,
sind auf dem Fachgebiet bekannt und wurden wohl charakterisiert
mit Bezug auf ihre physikalischen Eigenschaften, ihrer Anlage innerhalb
der Zelle und mit Bezug auf viele der biologischen Aktivitäten, die
mit der Bindung von RANK und RANK-L einhergehen. Beispiele für murines
und/oder humanes RANK und auch Beispiele für murines und/oder humanes
RANK-L werden in
U.S. 6,017,729 ,
U.S. 5,843,678 (die "Osteoprotegerin-bindendes Protein" offenbaren, welches
hier als murines RANK-L beschrieben wird),
WO 98/25958 (das „488E9" offenbart, welches hier als murines
RANK-L beschrieben wird);
WO
98/44751 (das murines „ODAR" offenbart, hier als murines RANK bezeichnet);
und
EP 0 911 342 (das
ein „OCIF-bindendes
Molekül" offenbart, hier
als murines RANK-L bezeichnet) offenbart. Andere haben RANK-L beschrieben
und es als „TRANCE" bezeichnet (siehe,
zum Beispiel, Wong et al., Molec Cell 4:1041–49 (1999)). Jegliches dieser
RANK- und RANK-L-Moleküle
kann in den hier beschriebenen Assays verwendet werden.
-
Die
Sequenzen von zwei Nucleinsäuremolekülen, die
für charakteristische
RANK-Proteine kodieren, sind in SEQ ID NO:1 (humanes RANK) und SEQ
ID NO:3 (murines RANK) dargelegt, und die durch diese Nucleinsäuremoleküle kodierten
Aminosäuresequenzen
sind jeweils in SEQ ID NOS:2 und 4 dargelegt. Die Sequenzen von
beispielhaften humanen und Maus-RANK-L-Sequenzen sind in SEQ ID
NOS:6 und 8 gezeigt, und Nucleinsäuren, die für diese Proteine kodieren,
in SEQ ID NOS:5 und 7. Es versteht sich jedoch, dass andere RANK-
und RANK-L-Varianten außer
den in diesen Beispielen gezeigten in den hier offenbarten Assays verwendet
werden können,
einschließlich
anderer im Fachgebiet bekannter RANK- und RANK-L-Moleküle oder
Varianten mit Aminosäure-Unterschieden,
welche weder die Bindung von RANK an RANK-L beeinflussen noch das
Auslösen
von RANK, das normalerweise eine Folge dieser Bindung ist.
-
Sequenzvarianten
von nativen RANK- und RANK-L-Polypeptiden sind in der Ausführung der
vorliegenden Erfindung in solchen Fällen von Nutzen, in denen das
native RANK- oder RANK-L-Polypeptid
verwendet wird, unter der Voraussetzung, dass die Variante jegliche
biologische Aktivität
besitzt, die für
das Assay erforderlich ist. Allgemein gilt für diese Assays, dass geeignete
RANK-Varianten RANK-L
binden werden und dadurch RANK-Aktivität stimulieren und dass geeignete
RANK-1-Varianten
an RANK binden werden und dadurch RANK-Aktivität stimulieren. In solchen Varianten
vorkommende Mutationen können,
zum Beispiel, Substitutionen, Deletionen und Insertionen von Aminosäuren umfassen.
Allele Formen oder mutierte Formen von RANK und RANK-L können für die Verwendung
in diesen Assays erhalten werden, in dem eine Vielzahl von auf dem
Fachgebiet bekannten Techniken eingesetzt werden, einschließlich, zum
Beispiel, ortsgerichtete Mutagenese, Oligonucleotid-gerichtete Mutagenese
und so weiter.
-
RANK-Moleküle, die
für die
offenbarten Verfahren von Nutzen sind, umfassen Wildtyp-RANK sowie variante
Formen von RANK. Die Varianten können
sich in der Aminosäuresequenz
von den RANK-Molekülen von
SEQ ID NOS:2 oder 4 unterscheiden, werden jedoch ihre Fähigkeit
beibehalten, mindestens eines der biologischen Signale zu übermitteln,
die mit dem Auslösen
von Wildtyp-RANK verbunden sind, wie beispielsweise Aktivierung
von NF-κB.
Geeignete Varianten umfassen natürlich vorkommende
allele Varianten, mutierte Formen von RANK (wie beispielsweise FEO
RANK) oder Varianten, die unter Verwendung von rekombinanten DNA-Techniken
konstruiert wurden.
-
RANK-L-Proteine,
einschließlich
löslicher
Formen von RANK-L, die für
das Auslösen
von RANK von Nutzen sind, werden die RANK-Bindungsdomäne enthalten,
die in der extrazellulären
Region des Moleküls enthalten
ist. Für
humanes RANK-L umfasst die extrazelluläre Domäne etwa 249 Aminosäuren am
Carboxyende des Proteins (Aminosäuren
69 bis 317 von SEQ ID NO:6), und für Maus-RANK-L umfasst sie etwa
247 Aminosäuren
am Carboxyterminus des Proteins (Aminosäuren 70–316 von SEQ ID NO:8). Lösliches
RANK-L zum Auslösen
von RANK kann die gesamte extrazelluläre Region enthalten oder kann
nur den Teil von RANK-L enthalten, der die RANK-Bindungsdomäne enthält, die für humanes RANK-L in einem Fragment
mit den Aminosäuren
69 bis 317 von SEQ ID NO:6 gefunden wird, oder mehr bevorzugt mit
den Aminosäuren 162–317 von
SEQ ID NO:6, oder für
murines RANK-L in einem Fragment mit den Aminosäuren 70 bis 316 von SEQ ID
NO:8, oder mehr bevorzugt mit den Aminosäuren 161–316 von SEQ ID NO:8.
-
Lösliches
RANK-L zum Auslösen
von RANK kann weiterhin ein Signalpeptid enthalten, das die Sekretion
des löslichen
Proteins steuert, und kann weiterhin auch ein zweites Polypeptid
enthalten, wie, zum Beispiel, ein Polypeptid, das, wenn es anwesend
ist, die Oligomerisierung des löslichen
RANK-L-Fusionsproteins stimulieren wird. RANK-L-Fragmente für die Konstruktion
von löslichen
RANK-Ls können
unter Verwendung bekannter Rekombinationstechniken hergestellt werden,
um einen gewünschten
Teil der extrazellulären
Region zu isolieren. Verschiedene RANK-L-Derivate zum Auslösen von
RANK umfassen kovalente oder aggregative Konjugate der Proteine
oder deren Fragmente mit anderen Proteinen oder Polypeptiden, wie
beispielsweise durch Synthese in rekombinanter Kultur als N-terminale
oder C-terminale Fusionen. Zum Beispiel kann das konjugierte Peptid
eine Signal- (oder Leader-) Polypeptidsequenz an der N-terminalen
Region des Proteins sein, die cotranslational oder posttranslational
den Transfer des Proteins von seinem Herstellungsort an seinen Funktionsort
außerhalb
der Zellmembran oder -wand steuert (z. B. den Hefe α-Faktor-Leader).
Alternativ kann RANK-L in einigen Fällen mit einem poly-His- oder
FLAG
®-Tag
konjugiert werden, wie in
U.S.
6,017,729 beschrieben.
-
Wenn
RANK-L zum Auslösen
von RANK verwendet wird, wird das RANK-L im Allgemeinen aus der gleichen
Spezies gewonnen (zum Beispiel, Mensch), aus der das RANK gewonnen
wurde. Jedoch ist Maus-RANK-L in der Lage humanes RANK auszulösen und
humanes RANK-L ist in der Lage, Maus-RANK auszulösen.
-
RANK-Proteine,
die in der Ausführung
der vorliegenden Erfindung von Nutzen sind, haben typischerweise
eine Aminosäuresequenz,
die zu mindestens 80 % identisch oder zu mindestens 85 % identisch
oder vorzugsweise mindestens zu 90 % identisch ist mit der gesamten
oder einem Teil der nativen RANK-Aminosäuresequenzen, die in SEQ ID
NOS:2 oder 4 dargelegt sind. RANK-L-Proteine, die in der Ausführung der
vorliegenden Erfindung von Nutzen sind, haben typischerweise eine
Aminosäuresequenz,
die zu mindestens 80 % identisch oder zu mindestens 85 % identisch
oder vorzugsweise zu mindestens 90 % identisch ist mit der gesamten
oder einem Teil der nativen RANK- L-Aminosäuresequenzen,
die in SEQ ID NOS:6 oder 8 dargelegt sind. Die erfindungsgemäßen RANK-Proteine sind, wenn
ausgelöst,
in der Lage, NF-κB-Aktivitat
zu aktivieren.
-
Die
Prozentidentität
wird wie folgt bestimmt. Die Identität der Aminosäuresequenz
ist definiert als der Prozentsatz an Aminosäureresten, die in SEQ ID NOS:2,
4, 6 oder 8 dargelegt sind, der mit einem Teil oder allen einer
weiteren Proteinsequenz identisch sind (welche Teil einer größeren Proteinsequenz
sein kann), nach Alignment der Sequenzen und Einführung von
Lücken,
wenn erforderlich, um eine maximale Prozentidentität zu erreichen.
Um Aminosäuresequenzen
von ungleicher Länge
zu vergleichen, wird die Prozentidentität auf der Grundlage der kleineren
der beiden Sequenzen berechnet. Prozentidentität kann unter Verwendung eines
Computerprogramms bestimmt werden, zum Beispiel, dem GAP-Computerprogramm,
das von Devereux et al. (Nucl. Acids Res 12:387, 1984) beschrieben
wurde, das von der University of Wisconsin Genetics Computer Group
(UWGCG) erhältlich
ist, oder jegliches andere geeignete Computerprogramm, das in der Lage
ist, zwei oder mehr Aminosäuresequenzen
anzuordnen und zu vergleichen. Bei Verwendung des GAP-Programms umfassen
die bevorzugten vorgegebenen Parameter für die Ausführung des Vergleichs: (1) eine
unäre Vergleichsmatrix
(enthaltend einen Wert von 1 für
Identitäten
und 0 für
Nicht-Identitäten) für Aminosäuren und
die gewichtete Vergleichsmatrix von Gribskov und Burgess, Nucl.
Acids Res. 14:6145, 1986, wie von Schwartz und Dayhoff, Hrgs., Atlas
of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation,
pp. 353–358,
1979 beschrieben; (2) eine Strafe von 3,0 für jede Lücke und eine zusätzliche
0,10 Strafe für
jedes Symbol in jeder Lücke,
und (3) keine Strafe für
Endlücken.
Ein weiteres für
die Bestimmung der Prozentidentität nützliches Programm ist das BESTFIT-Programm,
das auch von der University of Wisconsin als Teil des GCG-Computerpakets erhältlich ist.
Vorgegebene Parameter für
die Verwendung des BESTFIT-Programms sind die gleichen, wie oben
für die
Verwendung des GAP-Programms beschriebenen.
-
Einige
Ausführungsformen
der Erfindung setzen mutierte Formen des RANK-Proteins ein. Ein
Beispiel für
diese Art von RANK-Mutante ist die mutierte Form von RANK, die aus
Patienten isoliert wurde, die einen Zustand aufweisen, der als „familiäre expansile
Osteolyse" (FEO)
bekannt ist, der eine seltene autosomal dominante Knochendysplasie
mit Ähnlichkeit
zur Morbus Paget am Knochen ist. Diese Erkrankungen sind durch scharf
begrenzte Gebiete von erhöhter
Knochenremodellierung gekennzeichnet, die zu Deformation und Invalidität führen. Das
FEO-Gen und das Gen, das mit der familiären Morbus Paget am Knochen
verbunden ist, ist dem Chromosom 18q21 zugeordnet, was der gleiche
Ort ist, der das RANK-Gen enthält.
Eine beispielhafte FEO-RANK-DNA wird in Hughes et al., Nat Genet
24:45–48
(2000) beschrieben.
-
Mutierte
Formen von RANK sind insbesondere in Assays von Nutzen, die zur
Identifizierung von Molekülen
entworfen wurden, die in der Lage sind, den Defekt in Zellen, die
diese Form von RANK exprimieren, zu komplementieren; als solche
können
Moleküle
als therapeutische Mittel zur Behandlung von Erkrankungen dienen,
die mit der RANK-Mutation einhergehen. Die hier beschriebenen Assays
sind für
das Screening nach Molekülen
von Nutzen, welche die Fähigkeit
besitzen, den RANK-Defekt in dem FEO RANK-Gen zu komplementieren.
Die Sequenzen für
ein FEO RANK sind in SEQ ID NOS:9 und 10 gegeben. Moleküle mit dieser Fähigkeit
sind „FEO
RANK- Agonisten" und werden für die Behandlung
von Patienten, die an FEO, Morbus Paget oder verwandten Erkrankungen
leiden, oder für
die Entwicklung von Wirkstoffen, die zu diesem Zweck verwendet werden
können.
Es wird erwartet, dass man nachweisen wird, dass RANK-Mutationen
eine Rolle in anderen Knochenerkrankungen außer FEO und Morbus Paget spielen.
DNA, die für
diese mutierten Formen von RANK kodiert, wird in den hier beschriebenen
Screening-Assays isoliert und untersucht, um Behandlungen für die Erkrankungen
zu identifizieren.
-
RANK-Aktivierung:
-
Viele
der hier beschriebenen Assays umfassen die Verwendung von RANK-reaktiven
Zellen. Wie hier verwendet, bezieht sich der Ausdruck „RANK-reaktive
Zelle" auf eine
Zelle, die ein Membran gebundenes RANK-Protein exprimiert, das in
der Lage ist, ein intrazelluläres
Signal zu übermitteln
oder eine wahrnehmbare biologische Reaktion in der Zelle zu stimulieren
(wie beispielsweise Differenzierung von einem Zelltyp zu einem anderen
Zelltyp), wenn das RANK-Protein durch Bindung an ein RANK-L ausgelöst wird
oder wenn das RANK durch einige andere Mittel ausgelöst wird.
-
Wie
hier verwendet, bezieht sich der Ausdruck „RANK-Aktivität" auf die biologische
Aktivität
in der Zelle, die auftritt, nachdem RANK selbst eine Aktivierung
erfahren hat, das heißt,
nachdem RANK „ausgelöst" wurde. Im Allgemeinen
wird „RANK-Aktivität" durch Auslösen von
RANK angeregt und die RANK-Aktivität wird durch Messen von einer
oder mehreren biologischen Reaktionen nachgewiesen, die typischerweise
direkt oder indirekt durch ein ausgelöstes Wildtyp-RANK-Protein induziert
wird. Wenn RANK ausgelöst
wird, oligomerisiert es mit anderen RANK-Molekülen in seiner direkten Nachbarschaft
in der Zellmembran. Wenn, zum Beispiel, ein RANK-spezifischer, als
Agonist wirkender Antikörper
verwendet wird, um RANK auszulösen, bringt
der Antikörper
zwei RANK-Moleküle in nächste Nähe und ermöglicht ihnen
so, zu dimerisieren, wodurch RANK-Aktivität ausgelöst wird. Es ist möglich, dass
mehr als zwei RANK-Moleküle
oligomerisieren werden, wenn RANK ausgelöst wird. Vermutlich stimuliert
die Oligomerisierung eine Konformationsänderung in dem cytoplasmatischen
Schwanz des RANK-Proteins, wodurch eine Kette von Ereignissen in
Gang gesetzt wird, die zu einer wahrnehmbaren biologischen Reaktion
führen.
-
Das
Auslösen
von RANK ist ein Schritt, der für
viele der hier beschriebenen Screening-Assay erforderlich ist, insbesondere
wenn es gewünscht
ist, nach RANK-Antagonisten zu screenen. Dies kann auf vielen verschiedenen
Wegen erreicht werden, einschließlich des Aussetzens gegenüber einem
RANK-L-Protein, das eine RANK-Bindungsdomäne besitzt. Es kann Volllängen-RANK-L
verwendet werden, wie beispielsweise Membran gebundenes RANK-L oder
lösliche
RANK-L-Moleküle, wie
die oben beschriebenen. Das RANK-L-Polypeptid muss zumindest RANK
binden können,
muss also den Teil der extrazelluären RANK-L-Region besitzt,
der diese Fähigkeit
aufweist. Ein Beispiel für
eine Art von RANK-L, die zur Stimulierung von RANK-Aktivität von Nutzen
ist, ist eine Leucin-Zipper-Fusion von RANK-L, wie beispielsweise
die Leucin-Zipper-Fusion von RANK-L, die in
U.S. 6,017,729 beschrieben wurde,
oder andere Leucin-Zipper-Konstrukte, wie sie in dieser Literatur
oder anderswo beschrieben werden.
-
Ein
weiteres Beispiel für
eine Art von RANK-L, das zur Stimulierung von RANK-Aktivität von Nutzen ist,
ist eine FLAG
TM poly-His-Fusion von RANK-L,
wie beispielsweise die FLAG
TM poly-His-Fusion
von RANK-L, die in
U.S. Patent
6,017,729 beschrieben wird.
-
RANK
kann auf eine Vielzahl von Wegen ausgelöst werden, einschließlich, aber
nicht eingeschränkt auf: Überexpression
von RANK in einer Zelle; Coexpression von RANK und RANK-L in der
gleichen Zelle; Zellen, die Membran gebundenes RANK exprimieren,
mit löslichem
RANK-L in Kontakt zu bringen; RANK exprimierende Zellen mit Zellen
in Kontakt zu bringen, die Membran gebundenes RANK-L exprimieren;
und Zugabe von agonistischen Antikörpern, die gegen RANK gerichtet
sind, zu Zellen, die RANK exprimieren. Zusätzlich zu dem Vorhergehenden,
kann jegliches andere gewünschte
Verfahren zum Auslösen
von RANK in den hier offenbarten Assays verwendet werden. Ein bevorzugtes
Verfahren zum Auslösen
von RANK ist, RANK-reaktive Zellen mit agonistischen anti-RANK-Antikörpern in
Kontakt zu bringen, d. h. mit Antikörpern, die an RANK binden und
RANK-Aktivität stimulieren.
Beispiele für
agonistische anti-RANK-Antikörper
umfassen anti-humane M330-Antikörper,
anti-humane M331-Antikörper,
anti-Maus-M395-Antikörper
und anti-Maus-M396-Antikörper.
-
Noch
ein weiterer Weg, RANK-Aktivität
in RANK-reaktiven Zellen zu stimulieren, ist, RANK-reaktive Zellen
mit einer oder mehreren Zellarten in Kontakt zu bringen, die RANK-L
exprimieren, wie beispielsweise Zellen, die RANK-L auf ihrer Oberfläche exprimieren
oder die ein lösliches
RANK-L-Protein sezernieren.
Zum Beispiel können
RANK-reaktive Zellen in flüssigem
oder halbfestem Medium mit einer oder mehreren Zelllinien, die RANK-L
exprimieren, co-kultiviert werden. Typische Beispiele für Zellarten,
die RANK-L exprimieren, umfassen jegliche Zellart, die mit einem
Nucleinsäuremolekül, das für RANK-L
cDNA kodiert, (entweder transient oder stabil) unter Bedingungen
transfiziert wird, welche die funktionale Expression von RANK-L
durch die transfizierten Zellen ermöglichen. Zusätzliche
Beispiele für
Zellarten, die RANK-L exprimieren, umfassen primäre T-Zellen (aktiviert mit
anti-CD3-Antikörpern),
B-Zellen (wie beispielsweise der 70z3-Zelllinie) und die Maus-Thymom-Zelllinie
EL-4 (Anderson et al., Nature 390:175–179 (1997)). Außerdem exprimieren
ein Anzahl an Osteoblasten- und Stromazellen des Knochenmarks von
sowohl humaner wie muriner Abstammung RANK-L, einschließlich ST2
(Yasuda et al., Proc. Nat'l.
Acad. Sci USA 95: 3597–3602
(1998)) und MC3T3-E1, hMS (Hofbauer et al., J. Bone Min. Res. 15:
2–12,
2000) und auch Osteosarkomzelllinien ROS und MG-63 (Hofbauer et
al., 2000). Expression von RANK-L kann in diesen vorgenannten Zellarten
unter Verwendung von Knochen resorbierenden Faktoren wie Glukokortikoide,
1,25-Dihydroxyvitamin
D3, Interleukin 1(IL-1), IL-6, IL-17, TNFα, Prostaglandin E2 oder Parathyroidhormon
hochreguliert werden (siehe Hofbauer et al., 2000).
-
Ebenso
können
Zellen, die ein lösliches
RANK-L exprimieren, auf der festen Oberfläche eines Kulturwells kultiviert
werden und die RANK-reaktiven Zellen, die in halbfestem Medium resuspendiert
wurden, werden über
die RANK-L exprimierenden Zellen geschichtet. RANK in diesen RANK-reaktiven Zellen
wird durch den Kontakt mit RANK-L ausgelöst, das in das halbfeste Medium
sezerniert wird und sich in diesem überall verteilt.
-
In
einigen Ausführungsformen
sezernieren die RANK-L exprimierenden Zellen eine lösliche Form
des Moleküls.
Typische Beispiele von Zellarten, die lösliches RANK-L sezernieren,
umfassen primäre
T-Zellen, die mit
anti-CD3- und/oder anti-CD28-Antikörpern aktiviert wurden (Kong
et al., Nature 402: 304–309
(1999)), und humane 293-Fibroblasten, die mit einem Nucleinsäuremolekül transfiziert
wurden, das für
RANK-L kodiert (Lacey et al., Cell 93: 165–178 (1998)).
-
Noch
ein weiterer Weg, RANK-Aktivität
in RANK-reaktiven Zellen zu stimulieren, ist RANK in den RANK-reaktiven
Zellen zu überexprimieren,
zum Beispiel durch genetische Transformation von RANK-reaktiven
Zellen mit einem DNA-Konstrukt, das eine Nucleinsäuresequenz
enthält,
die für
RANK kodiert, unter der Kontrolle eines starken, konstitutiven Promotors.
Zum Beispiel aktivieren in der Abwesenheit von exogen zugegebenem
RANK-L, mit einem Expressionsvektor (pDC409-hRANK) transfizierte
293/EBNA-Zellen NF-κB-Aktivität (siehe,
Anderson et al., 1997, supra) und einen NF-κB-reaktiven Promotor-Reporter als Folge der
RANK-Überexpression
(siehe Galibert et al., J. Biol. Chem. 273:34120–27 (1998)). Die Konzentration
von RANK in der Membran von Zellen, die RANK überexprimieren, ist so hoch,
dass RANK in diesen Membranen spontan oligomerisiert, wodurch RANK-Aktivität ausgelöst wird.
Geeignete RANK-Nucleinsäuren
für die
Verwendung in Konstrukten, um RANK-Überexpression zu induzieren,
umfassen DNAs, die in der Lage sind, für die in SEQ ID NOS:2 und 4
gezeigten RANK-Proteine zu kodieren (solche DNAs werden beispielhaft
durch die in SEQ ID NOS:1 und 3 gezeigten Nucleinsäuresequenzen
dargestellt), oder Varianten davon, die für Proteine kodieren mit mindestens
85 %iger Homologie der Aminosäuresequenz
mit einem Protein gemäß SEQ ID
NO:2 oder 4, wobei dieses Protein weiterhin die Fähigkeit,
RANK-Aktivität
auszulösen,
wenn es in einer Zelle überexprimiert
wird, beibehält.
-
Typische
Beispiele für
Expressionsvektoren, die zur Überexpression
von RANK verwendet werden können,
umfassen, sind aber nicht beschränkt
auf: Vektoren der pDC400-Serie (Girl et al., EMBO J. 13: 2822–2830 (1994));
Vektoren der pDC300-Serie; der retrovirale Vektor pBMNZ, der die
Molony Long Terminal Repeats(LTR)-Promotoren verwendet (Kinsella
und Nolan, Human Gene Therapy 7: 1405–1413 (1996)) oder retrovirale
Vektoren, die ein Hybrid Tetracyclin induzierbares Element (pREVTRE)
enthalten, die erhältlich
sind von Clontech (1020 East Meadow Circle, Palo Alto, CA 94303–4230, USA).
Diese gleichen Vektoren können verwendet
werden, um RANK- oder RANK-L-DNA
in Zellen einzuführen,
wenn die Einführung
von solcher DNA für
andere Aspekte dieser Erfindung erforderlich sein kann.
-
Ein
weiteres Verfahren RANK-Aktivität
auszulösen,
ist die Expression einer Form von RANK-Protein in RANK-reaktiven
Zellen, was einen oder mehrere RANK-vermittelte Signalisierungswege
ohne Bindung von RANK-L aktiviert, wenn es in den RANK-reaktiven
Zellen in normalen Levels exprimiert wird, wie beispielsweise FEO
RANK (SEQ ID NO:10).
-
Zusätzlich zur
Aktivierung von NF-κB
umfassen nachweisbare, biologische Reaktionen, die eine Folge des
Auslösens
von RANK sind, zum Beispiel, Aktivierung der Kinase c-src, Aktivierung
der JNK, Differenzierung von Vorläufermolekülen der Osteoklasten, Aktivierung
von T-Zellen und so weiter. C-src
ist bei der ordnungsgemäßen Osteoklastenfunktion
von Bedeutung (siehe, zum Beispiel, Lowe et al., Proc Natl Acad
Sci USA 90:4485–89
(1993)). In einem Aspekt der Erfindung wird RANK-Aktivität bestimmt,
indem die Menge oder der Level eines Reporterproteins bewertet wird,
der durch ein Promotor/Reporter-Konstrukt exprimiert wird, in welchem
das Reportergen funktionell mit einem RANK-reaktiven Promotor verknüpft ist.
-
Wie
hier verwendet, bezieht sich der Begriff „funktionell verbunden" auf Nucleinsäuresequenzen,
die funktionell miteinander verbunden sind, und die vorzugsweise
zusammenhängend
in einer einzelnen Nucleinsäurekette
angeordnet sind. Zum Beispiel, ist eine regulatorische Nucleinsäuresequenz
mit einer kodierenden Sequenz funktionell verknüpft (wie einer Sequenz, die
für ein
Reporterprotein kodiert), wenn die regulatorische Nucleinsäuresequenz
(entweder selber oder in Zusammenhang mit einer oder mehreren anderen
regulatorischen Nucleinsäuresequenzen)
die Transkription der kodierenden Sequenz kontrolliert. Typischerweise
sind die funktionell verbundenen Nucleinsäuresequenzen in dem gleichen
Nucleinsäuremolekül zusammenhängend, aber
in einigen Fällen
kann die regulatorische Sequenz „trans-wirkend" sein oder auf einem
anderen Nucleinsäuremolekül vorkommen.
-
Screening-Assays für RANK-Agonisten und -Antagonisten:
-
Assays in halbfestem Medium
-
In
einer Ausführungsform
der Erfindung werden Verfahren bereitgestellt, welche die Schritte
umfassen: (a) RANK-reaktive Zellen mit einem Kandidatenmolekül in Kontakt
zu bringen, wobei die RANK-reaktive Zelle in einem halbfesten Medium
kultiviert wird; und (b) eine erhöhte oder verminderte Geschwindigkeit
der Koloniebildung durch die in Kontakt gebrachten RANK-reaktiven
Zellen in dem halbfesten Medium zu beobachten, verglichen mit der
Geschwindigkeit der Koloniebildung von einer oder mehreren RANK-reaktiven
Zellen, die nicht mit dem Kandidatenmolekül in Kontakt gebracht wurden.
Wenn sie für
das Screening nach einem Molekül,
das als Antagonist der RANK-Aktivität wirkt, verwendet werden,
umfassen die Verfahren von diesem Aspekt der Erfindung, weiterhin
den Schritt, die RANK-Aktivität
in den RANK-reaktiven Zelle zu stimulieren.
-
Wie
hier verwendet, bezieht sich der Begriff „halbfestes Medium" auf ein Zellwachstumsmedium,
das kein festes Substrat liefert, an das sich die Zellen binden
können,
und das ausreichend viskos ist, so dass Zellen, die zu dem halbfesten
Medium gegeben werden, darin suspendiert werden und dadurch daran
gehindert werden, durch das halbfeste Medium zu sinken und mit der
inneren Oberfläche
des Behälters,
in dem das halbfeste Medium verteilt wurde, in Kontakt zu treten
und darauf zu haften. Halbfeste Medien, die bei der Ausführung der
vorliegenden Erfindung von Nutzen sind, umfassen typischerweise
ein Geliermittel (wie Agar oder Methylcellulose), das in einem wässrigen
Medium in einer Menge von 0,1 % bis 5 Gew.-% gelöst ist.
-
In
dieser Ausführungsform
der Erfindung, werden die RANK-reaktiven Zellen in einem halbfesten
Medium in der Gegenwart von einem oder mehreren Molekülen ausplattiert,
die auf ihre Fähigkeit,
RANK-Aktivität zu
modulieren, untersucht werden sollen. Die Zellen, die bei der Ausführung dieser
Ausführungsform
der Erfindung verwendet werden, exprimieren RANK, sind fähig, Kolonien
in einem halbfesten Medium zu bilden, und werden durch RANK-Aktivierung
dazu stimuliert, in Zelltypen zu differenzieren, die in halbfestem
Medium langsam wachsen oder die in halbfestem Medium nicht wachsen
können.
Das Testmolekül
kann mit den Zellen vor oder zu der Zeit, in der sie in das halbfeste
Medium ausplattiert werden, oder nachdem sie ausplattiert wurden, in
Kontakt gebracht werden.
-
In
diesen Assays können
RANK-reaktive Zellen in halbfestem Medium suspendiert werden, das
dann auf die Oberfläche
einer Schicht aus halbfestem Medium aufgebracht wird, die eine höhere Konzentration
an Geliermittel umfasst, als in dem halbfesten Medium vorhanden
ist, in welches die Zellen suspendiert wurden. Zum Beispiel können RANK-reaktive
Zellen in einem halbfesten Medium suspendiert werden, das Agar in
einer Konzentration von 0,3 Gew.-% enthält. Die suspendierten Zellen
können
dann auf eine Schicht des halbfesten Mediums ausplattiert werden,
das Agar in einer höheren
Konzentration enthält,
wie beispielsweise einer Konzentration von 0,5 Gew.-%.
-
Ein
ungewöhnliches
Merkmal dieser Vorgehensweise mit halbfestem Medium zum Nachweis
von RANK-Antagonisten ist, dass eine positive Reaktion (das heißt Koloniebildung
und/oder Koloniewachstum) verstärkt
wird, wenn ein Antagonist anwesend ist, wohingegen Assays zum Nachweis
von Antagonisten typischerweise so entworfen werden, dass die gemessene
Reaktion in der Gegenwart eines Antagonisten aufgehoben wird. Darüber hinaus
erlaubt das vorliegende Assay die Aufbereitung von Zellen, die auf
den Antagonisten reagieren; ein Merkmal, das besonders von Nutzen
ist, wenn das Testmolekül
den Zellen in der Form einer rekombinanten cDNA-Bibliothek zur Verfügung gestellt
wurde (siehe unten).
-
Bei
Verwendung eines Assays im halbfesten Medium, wird die Fähigkeit
eines Testmoleküls,
agonistisch auf RANK zu wirken, nachgewiesen, indem RANK-reaktive
Zellen mit dem Testmolekül
in Kontakt gebracht werden und eine verminderte Geschwindigkeit
der Koloniebildung oder des Koloniewachstums im halbfesten Medium
beobachtet wird, verglichen mit der Geschwindigkeit der Koloniebildung
in einer Referenzkultur der gleichen RANK-reaktiven Zellen, die
nicht mit dem Testmolekül
in Kontakt gebracht wurden. Wenn gewünscht, können zum Nachweis von RANK-Agonisten positive
Kontrollkulturen verwendet werden, um eine Referenz zum Vergleich
zu liefern, in welchem die Referenzzellen mit einem bekannten RANK-Agonisten,
wie beispielsweise RANK-L oder einem agonistischen anti-RANK-Antikörper in
Kontakt gebracht werden.
-
Zellen,
die für
halbfeste Medien einsetzende Assays von Nutzen sind, umfassen jegliche
Zellen, die RANK exprimieren, die fähig sind, Kolonien in einem
halbfesten Medium zu bilden, und die durch Auslösen von RANK dazu stimuliert
werden, in Zelltypen zu differenzieren, die in halbfestem Medium
keine Kolonien bilden können.
Im Allgemeinen differenzieren diese Zellen zu Osteoklasten, wenn
RANK ausgelöst
wird. 253:395–400
(1998)). RAW 264.7-Zellen (eine Makrophagen-Zelllinie der Maus)
werden durch die Zugabe von RANK-L stimuliert, um zu mehrkernigen
Osteoklasten zu differenzieren (die keine Kolonien in halbfesten
Medien bilden können).
-
Koloniebildung
wird bewertet, indem visuell die Größe und/oder Anzahl an Kolonien
in Kulturen, die mit einem Testmolekül in Kontakt gebracht wurden,
mit der Größe und/oder
Anzahl an Referenzkolonien verglichen werden, die in Kontrollkulturen
der gleichen RANK-reaktiven Zellen anwesend sind, die nicht mit
einem möglichen
Agonisten oder Antagonisten von RANK in Kontakt gebracht wurden.
Die Größe und/oder
Anzahl an Kolonien wird nach einer gewünschten Zeitdauer bewertet,
wie beispielsweise von 1 bis 10 Tage nachdem die RANK-reaktiven
Zellen mit dem Testmolekül
in Kontakt gebracht wurden, oder mehr bevorzugt von 5 bis 10 Tage
nachdem die Zellen mit dem Testmolekül in Kontakt gebracht wurden.
Visueller Vergleich der Kulturen kann, zum Beispiel, unter Verwendung
von Licht- oder Phasenkonstrastmikroskopie durchgeführt werden.
-
Wiederum
als Beispiel, kann die Geschwindigkeit der Koloniebildung innerhalb
eines Kulturwells unter Verwendung von Veränderungen der Durchlässigkeit
für sichtbares
Licht gemessen werden, zum Beispiel spektrophotometrisch. Außerdem kann,
wenn die Zellen vor dem Wachstum in halbfesten Medien unter Verwendung
eines vitalen Fluoreszenzfarbstoffs markiert wurden, die Geschwindigkeit
der Koloniebildung fluorimetrisch bewertet werden. Der DNA-Gehalt
von Zellen in einem Kulturwell kann auch unter Verwendung von Standardmitteln
zur Bewertung der Geschwindigkeit der Koloniebildung gemessen werden.
-
Wird
die zuvor beschriebene Vorgehensweise mit halbfestem Medium verwendet,
um RANK-Antagonisten
nachzuweisen, umfasst das Assay einen Schritt, der die Aktivierung
von RANK in den Zellen beinhaltet. Die Zellen werden mit dem Testmolekül (das heißt, dem
putativen RANK-Antagonisten)
vor, während
oder nach dem RANK-Aktivierungsschritt in Kontakt gebracht. RANK-Aktivierung kann,
zum Beispiel, durch Überexprimieren
von RANK in den Zellen erreicht werden, oder indem die Zellen mit
einem agonistischen anti-RANK-Antikörper oder mit RANK-L in Kontakt
gebracht werden. Alternativ kann das Auslösung durch Co-Expression von
RANK-L in den RANK-reaktiven Zellen erreicht werden, indem RANK-L
zu den Kulturen als lösliches
RANK-L zugegeben wird, oder es kann durch andere Mittel als hier
beschriebene bereitgestellt werden. Wenn das Testmolekül ein RANK-Antagonist
ist, werden sich die Zellen mehr teilen als in gleichartigen Kulturen,
zu denen das Testmolekül
nicht gegeben wurde. Wenn ein Testmolekül, das ein RANK-Antagonist
ist, vor dem Auslösen
von RANK zugegeben wird, werden mehr Kolonien in den Kulturen auftreten,
die mit dem Testmolekül
in Kontrakt gebracht wurden, als in Kulturen, die nicht mit dem
Testmolekül
in Kontakt gebracht wurden. Wenn der Antagonist zugegeben wird,
nachdem sich die Kolonien gebildet haben, werden die Kolonien, die
dem Antagonisten ausgesetzt sind, größer als Kolonien in Kontrollkulturen,
die dem Antagonisten nicht ausgesetzt wurden.
-
Bei
Verwendung der zuvor beschriebenen Zellen wird die Fähigkeit
eines Testmoleküls,
als ein RANK-Agonist zu wirken, nachgewiesen, indem die RANK-reaktiven
Zellen mit dem Testmolekül
in Kontakt gebracht werden und eine verminderte Geschwindigkeit
der Koloniebildung im halbfesten Medium beobachtet wird, verglichen
mit der Geschwindigkeit der Koloniebildung einer Kontrollkultur
der gleichen RANK-reaktiven Zellen, die nicht mit dem Testmolekül in Kontakt
gebracht wurden. In diesem Assay wird ein RANK-Agonist die Zellen
dazu stimulieren, in einen Zelltyp zu differenzieren, der keine
Kolonien in halbfesten Medien bilden kann. Zellen, die typischerweise
für diese
Assays verwendet werden, werden zu Osteoklasten differenzieren,
wenn sie einem Testmolekül
ausgesetzt werden, das eine RANK-Agonist ist. Kontroll-RANK-Agonisten,
die für
diese Assays verwendet werden können,
umfassen Membran gebundenes RANK-L und lösliche Formen von RANK-L.
-
In
einer Variation des Assays mit halbfestem Medium, wird diese Strategie
verwendet, um eine Nucleinsäurebibliothek
zu screenen, wie beispielsweise eine cDNA-Bibliothek, die für eine Population
von Kandidatenproteinmolekülen
kodiert, die auf ihre Fähigkeit
gescreent werden, eine antagonistische oder agonistische Wirkung
auf die RANK-Aktivität
auszuüben.
Die cDNA-Bibliothek wird in eine Population von RANK-reaktiven Zellen
durch jegliches auf dem Fachgebiet anerkannte Mittel eingeführt, wie
beispielsweise durch Transfektion oder Transduktion, wie weiter
unten genauer beschrieben wird. Wenn RANK-Antagonisten gesucht werden, werden
Zellen, in welche die cDNA-Moleküle eingeführt wurden,
in einem halbfesten Medium kultiviert und RANK wird in den Zellen
durch eines der hierin beschriebenen Verfahren oder durch ein anderes
geeignetes Verfahren ausgelöst.
Die Geschwindigkeit der Koloniebildung oder die Geschwindigkeit
des Koloniewachstums in den suspendierten, genetisch modifizierten
Zellen wird mit der in gleichartigen Zellen verglichen, in welche
keine DNA außer
einer Kontroll-DNA eingeführt
wurde. Geeignete Kontrollzellen können, zum Beispiel, eine Vektor-DNA
an Stelle der cDNA-Bibliothek erhalten. Kolonien in der genetisch
modifizierten Population, die deutlich schneller wachsen als Kolonien
in der Kontrollpopulation, können
isoliert und weiter untersucht werden. Die fremde DNA kann aus solchen
Kolonien gewonnen werden, um den RANK-Antagonisten, der für ein verstärktes Koloniewachstum
verantwortlich war, zu identifizieren und zu isolieren. Zum Beispiel
können die
eingeführten
Nucleinsäuremoleküle aus den
schnell wachsenden Kolonien isoliert werden und die Nucleinsäuresequenz
von jedem von ihnen kann bestimmt werden. Das durch das isolierte,
sequenzierte Nucleinsäuremolekül kodierte
Protein kann exprimiert und/oder chemisch hergestellt werden, und
seine Fähigkeit,
antagonistisch auf die RANK-Aktivität zu wirken,
wird bestätigt
und untersucht.
-
Agonisten
von RANK werden in diesem Assay erkannt, indem das Assay wie oben
beschrieben ausgeführt
wird, jedoch ohne Auslösen
von RANK; Zellen, die eine für
einen RANK-Agonisten kodierende cDNA enthalten, werden langsamer
wachsen oder werden keine Kolonien bilden. Für den RANK-Agonisten kodierende
cDNA wird aus diesen langsam wachsenden wie oben beschrieben gewonnen.
-
Es
wurden viele verschiedene Arten für den Transfer von Säugetiergen
und Expressionsvektoren entwickelt, die für die Einführung einer für Proteine
kodierenden cDNA-Bibliothek geeignet sind, die in dem oben genannten
Assay im halbfesten Medium auf ihre Fähigkeit getestet werden sollen,
die RANK-Aktivität
zu modulieren (siehe, Miller und Calos, Hrgs., "Gene Transfer Vectors for Mammalian
Cells," Current
Comm. Mol. Biol, Cold Spring Harbor Laborstory, New York, 1987).
Nackte DNA kann in Säugetierzellen
physikalisch eingeführt
werden, indem unter Verwendung von einer aus einer Vielzahl an Techniken
transfiziert wird, einschließlich,
aber nicht beschränkt
auf, Calciumphosphat-Transfektion
(Berman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 7176, 1984); DEAE-Dextrantransfektion,
Fusion von Protoplasten (Deans et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci USA 81: 1292, 1984); Elektroporation,
Lipofektion (Feigner et al., Proc. Nat'l. Acad. Sic. USA 84: 7413, 1987), Polybrentransfektion
(Kawai und Nishzawa, Mol. Cell. Biol. 4: 1172, 1984) und direkten
Gentransfer durch Lasermikropunktur von Zellmembranen (Tao et al.,
Proc Natl. Acad. Sc. USA 84:4180, 1987)
-
Außerdem wurden
verschiedene Infektionstechniken entwickelt, welche rekombinante,
infektiöse
Virenpartikel für
den Gentransport verwenden. Vol. 2. Cold Spring Harbor Laborstory,
New York). Diese gleichen Virenvektoren können verwendet werden, um RANK-
oder RANK-L-DNA in Zellen einzuführen,
wenn die Einführung
von solcher DNA für
andere Aspekte dieser Erfindung erforderlich sein kann.
-
Es
gibt eine Vielzahl an Gentransfer- und Expressionsverfahren und
diese dienen im Wesentlichen dazu, genetisches Material in Säugetierzellen
einzuführen
und zu exprimieren. Einige der oben beschriebenen Techniken wurden
verwendet, um hämatopoetische
oder lymphoide Zellen zu transduzieren, einschließlich Calciumphosphattransfektion
(Berman et al., supra, 1984); Fusion von Protoplasten (Deans et
al., supra 1984); Elektroporation (Cann et al. Oncogene 3: 123,
1988) und Infektion mit rekombinantem Adenovirus (Karlsson et al.,
supra, Ruether et al. Mol. Cell Biol. 6: 123, 1986); adenoassoziierter
Virus (LaFace et al., supra); und Retrovirus-Vektor (Overell et
al., Oncogene 4: 1425, 1989). Primäre T-Lymphozyten wurden erfolgreich
durch Elektroporation (Cann et al., supra, 1988) und durch retrovirale
Infektion (Nishihara et al., Cancer Res 48: 4730, 1988); Kasid et
al., supra, 1990} transduziert.
-
Assays,
welche die zuvor beschriebene Screening-Strategie mit halbfestem
Medium umfassen, sind wie folgt von Nutzen beim Screening von Molekülsammlungen
wie beispielsweise Bibliotheken von kleinen organischen Molekülen oder
Peptiden. Mikrotiterplatten, wie beispielsweise 96-Well Mikrotiterplatten,
können verwendet
werden und in jeden Well wird ein anderer Kandidatenagonisten oder
-antagonist der RANK-Aktivität
zusammen mit einem Aliquot von RANK-reaktiven Zellen in halbfestem
Medium gegeben. Für
diesen Assay verwendete Zellen sind Zellen, die normalerweise differenzieren
und die Teilung als Reaktion auf das Auslösen von RANK stoppen werden
(siehe oben für
eine Beschreibung von geeigneten Zellen). Wenn es gewünscht wird,
Moleküle
mit antagonistischer RANK-Aktivität nachzuweisen, wird ein Stimulans
für das
Auslösen
von RANK bereitgestellt, wie beispielsweise RANK-L, welches zu dem
Medium gegeben werden kann oder welches durch ein anderes Mittel,
wie hierin beschrieben, bereitgestellt werden kann. Wiederum beispielhaft
kann ein Kandidatenmolekül
in dem halbfesten Medium gelöst
und überall
darin verteilt werden, oder es kann (in Form einer Lösung) auf
die obere Oberfläche
des halbfesten Mediums aufgebracht werden und kann überall darin
diffundieren.
-
Wenn
gewünscht,
können
die in die RANK-reaktiven Zellen eingeführten Nucleinsäuremoleküle stabil in
das Genom der RANK-reaktiven Zellen integriert werden. Zum Beispiel
kann eine cDNA-Bibliothek, die in einem retroviralen Vektor konstruiert
wurde, verwendet werden, um eine RANK-reaktive Zelllinie zu transfizieren.
Der Vorteil einer stabilen Integration der eingeführten DNA-Moleküle in das
Genom der RANK-reaktiven Zellen ist, dass typischerweise eine kontinuierliche
Genexpression mit hohem Level erhalten wird. Beispiel 2 hierin beschreibt
ein charakteristisches Protokoll zum Screening nach Agonisten oder
Antagonisten von RANK-Signalgebung, unter Verwendung von RAW 264.7-Zellen
und einer retroviralen Expressionsbibliothek.
-
Eine
weitere Anwendung der Verfahren der Erfindung ist, nach Molekülen (wie
beispielsweise cDNAs, Proteinen und Peptiden) zu screenen, die ein
defektes RANK-Signal komplementieren. Zum Beispiel kann eine Form
des humanen RANK (bezeichnet als „RANKΔ340-421"), in welcher die TRAF6-Bindungsstelle fehlt, die
Bildung von Osteoklasten aus hämatopoetischen
Vorläuferzellen
nicht stimulieren. Diese Form von RANK wird beschrieben in Galibert
et al., J. Biol Chem. 273:34120, 1998, hat eine Aminosäuresequenz,
die der von humanem RANK (SEQ ID NO:2) entspricht, in welcher aber
die TRAF6-Bindungsstelle (Aminosäuren
340–421 von
SEQ ID NO:2) deletiert sind. Die Verfahren der vorliegende Erfindung
können
daher verwendet werden, um nach Molekülen zu screenen, welche die
RANKΔ340-421
Signalgebungsmutation komplementieren und dadurch die Bildung von
Osteoklasten aus hämatopoetischen
Vorläuferzellen
erlauben. Beispiel 3 hierin beschreibt die Herstellung einer RANK-reaktiven
Zelllinie, die RANKΔ340-421
exprimiert.
-
Promotor/Reporterassays, die den MMP-9-
oder TRAP-Promotor verwenden
-
In
einem weiteren Aspekt der Erfindung werden hierin Screening-Assays
bereitgestellt, die Promotor/Reporter-Konstrukte verwenden, die
Promotoren verwenden, von denen früher nicht bekannt war, dass
sie in der Lage sind, auf RANK-Aktivierung durch erhöhte Expression
von Protein zu reagieren, das für
Sequenzen kodiert, mit welchen die Promotoren funktionell verbunden
sind. Insbesondere verwenden die vorliegenden Promotor/Reporter-Konstrukte
einen Promotor, der aus einem TRAP-Gen oder aus einem MMP-9-Gen
gewonnen wird. Beispiel 4 hierin beschreibt ein Konstrukt des murinen
MMP-9-Promotors (Sato et al., J Biol Chem 268:23460–68 (1993);
Sato und Seiki, Oncogene 8:395–405
(1993)), das an den humanen IL-2α-Rezeptor
fusioniert ist. Der humane MMP-9-Promotor oder ein TRAP-Promotor
(human oder murin; siehe, zum Beispiel, Reddy et al., Bone 16:587–593 (1995))
kann auch für
diese Screening-Verfahren verwendet werden.
-
Assays
gemäß diesem
Aspekt der Erfindung umfassen die Schritte: (a) eine kultivierte
RANK-reaktive Zelle mit einem Testmolekül in Kontakt zu bringen, wobei
die RANK-reaktive Zelle ein für
ein Reportermolekül kodierendes
Nucleinsäuremolekül umfasst,
wobei das für
ein Reportermolekül
kodierende Nucleinsäuremolekül funktionell
verbunden ist mit einer regulatorischen RANK-reaktiven Nucleinsäuresequenz;
und (b) einen erhöhten
oder verminderten Expressionslevel des Reportermoleküls in den
RANK-reaktiven Zellen zu beobachten, die in Kontakt gebracht wurden,
verglichen mit dem Expressionslevel an Reportermolekül in einer
oder mehreren RANK-reaktiven Referenzzellen, die nicht mit dem Kandidatenmolekül in Kontakt
gebracht wurden. Wenn sie für
das Screening nach einem Molekül,
das als Antagonist der RANK-Aktivität wirkt, verwendet werden,
umfassen die Verfahren von diesem Aspekt der Erfindung weiterhin
den Schritt, die RANK-Aktivität
in den RANK-reaktiven Zellen zu stimulieren.
-
RANK-Agonisten
werden in dieser Art von Assay nachgewiesen, indem ein erhöhter Level
an Expression von Reportermolekül
in den mit dem RANK-Agonisten in Kontakt gebrachten RANK-reaktiven Zellen nachgewiesen
wird, verglichen mit dem Level an Expression von Reportermolekül in RANK-reaktiven
Kontrollzellen, die nicht mit dem RANK-Agonisten oder mit einem
anderen Aktivator der RANK-Aktivität in Kontakt gebracht wurden.
Die Kontrollzellen sind typischerweise von der gleichen Art von
RANK-reaktiven Zellen wie die RANK-reaktiven Zellen, die mit dem
RANK-Agonisten in Kontakt gebracht wurden. Wenn die Assays darauf abzielen,
RANK-Agonisten zu identifizieren, umfasst das Protokoll nicht den
Schritt der Auslösung
von RANK, wie beispielsweise die Zellen absichtlich mit RANK-L in
Kontakt zu bringen.
-
Die
Gegenwart eines RANK-Antagonisten wird nachgewiesen, indem ein verminderter
Level oder die Abwesenheit von Reportermolekülexpression in RANK-reaktiven
Zellen beobachtet wird, in denen RANK ausgelöst wurde und die mit einem
Kandidatenantagonisten in Kontakt gebracht wurden. Der Level oder
Reporterexpression wird untersucht, indem er mit dem Level an Reporterexpression
in RANK-reaktiven Kontrollzellen verglichen wird, die mit einem
RANK-Aktivator in Kontakt gebracht wurden, aber nicht mit dem Kandidaten-RANK-Antagonisten
in Kontakt gebracht wurden. Die Kontrollzellen sind typischerweise
von der gleichen Art RANK-reaktiver Zellen wie die RANK-reaktiven
Zellen, die mit dem RANK-Antagonisten in Kontakt gebracht wurden.
-
Wenn
diese Art von Assay für
das Screening nach Antagonisten der RANK-Aktivität verwendet wird, muss RANK-Aktivität in den
RANK-reaktiven Zellen stimuliert werden. Typischerweise wird RANK-Aktivität ausgelöst, bevor
oder zur gleichen Zeit wie die RANK-reaktiven Zellen mit dem/den
Kandidatenmolekül(en)
in Kontakt gebracht werden. In einigen Fällen kann es wünschenswert
sein, RANK-Aktivität
zu stimulieren, nachdem die RANK-reaktiven Zellen mit dem Kandidatenmolekül in Kontakt
gebracht wurden. Es kann jeglicher Arbeitsschritt, der die RANK-Aktivität stimuliert,
angewandt werden, wie beispielsweise solche Arbeitsschritte zur Stimulierung
von RANK-Aktivität,
die oben beschrieben wurden.
-
Zellen,
die in diesem Aspekt der Erfindung von Nutzen sind, exprimieren
RANK-Protein und enthalten mindestens einen Signaltransduktionsweg,
der durch die Aktivierung von RANK stimuliert wird. Einige Zellen, die
in diesem Aspekt der Erfindung von Nutzen sind, exprimieren RANK
natürlich
und enthalten mindestens einen Signaltransduktionsweg, der durch
die Aktivierung von RANK stimuliert wird. Beispiele für diese
Art von Zelle umfassen RAW 264.7-Zellen, die BCL-XI/Tag-Osteoklastenzelllinie,
die zu TRAP + Osteoklasten differenziert werden kann (Hentunen et
al., J. Clin. Invest. 102: 88–97
(1998)), und die Makrophagen-ähnliche
Vorläufer-Zelllinie
C7 für
Osteoklasten aus der Maus (Nakagawa et al., Bioch. Biophys. Res.
Comm. 253: 395–400 (1998)).
-
Andere
Zellen, die in diesem Aspekt der Erfindung von Nutzen sind, sind
genetisch verändert,
um RANK zu exprimieren und/oder enthalten mindestens einen Signaltransduktionsweg,
der durch die Aktivierung von RANK stimuliert wird. Beispiele für diese
letztere Art von Zelle umfassen 293/EBNA-Zellen. Nahezu jede dieser Zellarten,
die zu Wachstum in Kultur fähig
ist, kann genetisch modifiziert werden, um RANK für Zwecke dieser
Assays zu exprimieren. Eine Vielzahl von anderen geeigneten Verfahren
zur Einführung
von RANK-DNA in eine Zelle werden an anderer Stelle in dieser Offenbarung
beschrieben und umfassen virale Vektoren und andere Verfahren wie
Elektroporation, Lipofektion und so weiter.
-
Die
RANK-reaktiven Zellen können
auf jegliche geeignete Weise mit einem oder mehreren Kandidatenmolekülen in Kontakt
gebracht werden, wie beispielsweise durch Verwendung solcher Arbeitsgänge, die oben
beschrieben werden, oder durch jegliches andere gewünschte Verfahren.
-
Reportermoleküle, die
in dieser Ausführungsform
der Erfindung von Nutzen sind, umfassen Luciferase, β-Galactosidase,
Grün fluoreszierendes
Protein, alkalische Phosphatase und jegliches heterologe Oberflächenprotein,
das auf der Oberfläche
einer RANK-reaktiven Zelle nachgewiesen werden kann, wie beispielsweise
durch Verwendung eines spezifischen, gegen das heterologe Protein gerichteten
Antikörpers.
Beispiele für
nützliche
heterologe Oberflächenproteine
umfassen den humanen IL-2-Rezeptor, den murinen IL-4-Rezeptor (abgekürzt als
mIL-4R), die humanen CD2-, CD4- oder CD8-Proteine.
-
Assays, die auf dem Nachweis von c-src-Aktivität oder F-Aktinringen
beruhen
-
In
einem weiteren Aspekt der Erfindung werden Assays für das Screening
nach einem molekularen RANK- und RANK-L-Antagonisten bereitgestellt,
indem das Ausmaß gemessen
wird, mit dem ein Kandidatenmolekül die RANK-vermittelte Induktion
der c-src Tyrosinkinase-Aktivität
und/oder F-Aktinringbildung
verstärkt oder
hemmt. (Lakkakorpi und Vaananen, J. Bone Min.Res. 6:817–26 (1991)).
-
Um
F-Aktinringe nachzuweisen, werden Zellen fixiert, indem sie beispielsweise
3 %igem Paraformaldehyd ausgesetzt werden, und durch Anfärben der
Zellen mit einer fluoreszierenden Sonde visualisiert, die spezifisch
mit Aktin binden. Ein geeignetes Fluoreszenz-Tag ist Phalloidin,
das von Molecular Probes, Eugene, OR, erhalten werden kann. Das
Fluoreszenzsignal wird nachgewiesen, zum Beispiel, indem ein Standardfluoreszenzmikroskop
verwendet wird, und die Anzahl an Zellen mit F-Aktinringen wird
visuell quantifiziert. Ein F-Aktinring wird als ein kontinuierlicher
Ring aus F-Aktin in den Außenbereichen
einer Zelle identifiziert und diese ausgeprägten Strukturen sind durch
ein Mikroskop sichtbar. F-Aktinringe treten in keinen weiteren Zellarten
auf außer
Osteoklasten.
-
Um
c-src-Aktivität
nachzuweisen, wird die Phosphotransferase-Aktivität dieses
Enzyms gemessen, unter Verwendung eines synthetischen Substrats
wie beispielsweise dem p34/cdc2-Peptid (KVEKIGEGTYGVVYK) (SEQ ID
NO:13), das als ein Substrat für
das Enzym wirkt. Ein beispielhaftes Assay für die Messung der c-src-Aktivität wird in
Beispiel 8 dargestellt.
-
Dieser
Aspekt der Erfindung verwendet Zellen, die ein RANK-Protein exprimieren,
das zu einer Aktivierung der Zellen zur Differenzierung zu Osteoklasten
fähig ist,
oder jegliche Zellen, die auf das Auslösen von RANK durch Aktivierung
der c-src-Aktivität
reagieren. In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts der
Erfindung, induziert das RANK-Protein erhöhte Level an c-src Tyrosinkinase-Aktivität und F-Aktinringbildung,
während
die Zellen eine Differenzierung erfahren. Beispielhafte Zellen,
die für
diese Ausführungsform von
Nutzen sind, sind jegliche Zellen, die zu einer Differenzierung
zu Osteoklasten als Reaktion auf das Auslösen von RANK fähig sind
und die auch eine Form von RANK exprimieren, das zu einer Induzierung
der c-src-Aktivität
und F-Aktinringbildung fähig
ist. Solche Zellen umfassen primäre
hämatopoetische
Zellen, die mit Vorläufern
für Osteoklasten
angereichert wurden, oder eine Zelllinie wie beispielsweise RAW
264.7-Zellen. Geeignete primäre
hämatopoetische
Vorläufer
können
aus Knochenmarkszellen, fötaler
Leber oder peripherem Blut gewonnen werden. Geeignete Zellen umfassen
auch Zellen, die genetisch modifiziert wurden, um RANK zu exprimieren,
unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren.
-
Für diese
Art von Assay kann das Testmolekül
zu dem Kulturmedium bis zu etwa fünf Tagen, nachdem die Differenzierung
vollständig
ist, zugegeben werden. C-src-Aktivität oder F-Aktinringbildung wird untersucht, nachdem
die Zellen dem Testmolekül über einen
passenden Zeitraum ausgesetzt wurden. Zum Beispiel wird die Aktivität nach 6
bis 12 Stunden gemessen, nach einem Tag, nach zwei Tagen, nach drei
Tagen, nach vier Tagen, nach fünf
Tagen oder nach einer längeren
Zeit des Einwirkens. Ein Testmolekül wird als ein RANK-Agonist
identifiziert, wenn die Menge an F-Aktinringen oder c-src-Aktivität, die in
diesen Zellen nachgewiesen wird, nachdem sie dem Testmolekül ausgesetzt
wurden, verglichen mit dem Level erhöht ist, der in RANK -/- Kontrollzellen
beobachtet wird, in die keine RANK-DNA eingeführt wurde.
-
In
dieser Art von Assay können
die Testmoleküle
auch auf ihre Fähigkeit
hin untersucht werden, bestimmte biologische Aktivitäten, die
für das
Wildtyp RANK-Protein charakteristisch sind, zu komplementieren. Im
Allgemeinen nutzt diese Art von Assay die Tatsache aus, dass Wildtyp
RANK-Protein c-src-Aktivität und F-Aktinringbildung
in Zellen induzieren kann, die den Prozess der Differenzierung zu
Osteoklasten durchlaufen. Jedoch können diese beiden Aktivitäten von
RANK durch Deletion der TRAF6-Bindungsdomäne aus dem RANK-Protein aufgehoben
werden (siehe Beispiel 8), obwohl die TRAF6-Bindungsdomäne nicht
erforderlich ist, damit die RANK-Aktivierung die Differenzierung
zu Osteoklasten induzieren kann. Wenn in Vorläufern der Osteoklasten TRAF6-Deletionsmutanten
des RANK-Proteins exprimiert werden, wird daher das Auslösen von RANK
die Zellen zu einer Differenzierung veranlassen, wird sie aber weder
dazu veranlassen, höhere
Level der c-src-Aktivität
zu exprimieren, noch werden diese Zellen F-Aktinringe zeigen. Für das humane
RANK-Protein ist
die TRAF6-Bindungsdomäne
innerhalb einer Region enthalten, die durch die Aminosäuren 340–421 von
SEQ ID NO:2 definiert wird. Daher können Zellen, in denen solche
RANK-Mutanten exprimiert werden, in Assays verwendet werden, um
nach Molekülen
zu screenen, die fähig
sind, die Deletion der TRAF6-Bindungsstelle in dem mutierten RANK
zu komplementieren. Die Fähigkeit
eines Testmoleküls,
diesen Defekt zu komplementieren, wird nachgewiesen, indem man beobachtet,
dass, wenn das Testmolekül
mit Zellen, welche die RANK-Mutante exprimieren, in Kontakt gebracht
wird, c-src-Aktivierung
und F-Aktinbildung auftreten, wenn RANK ausgelöst wird.
-
Zellen,
die für
die Verwendung mit TRAF6-Mutanten von RANK von Nutzen sind, umfassen
primäre hämatopoetische
Vorläuferzellen
von RANK Knock-out Tieren, wie beispielsweise die früher beschriebenen RANK-/-
Mäuse (Dougall
et al., 1999). Um dieses Assay auszuführen, werden Zellen von einem
RANK Knock-out Tier genetisch modifiziert, indem eine DNA eingeführt wird,
die für
ein mutiertes RANK-Protein kodiert, dem eine TRAF6-Bindungsregion
fehlt. Beispielhafte DNAs für
diesen Zweck sind Maus- oder humane RANK-DNA, aus der die Sequenzen,
die für
die TRAF6-Bindungsdomäne kodieren,
deletiert wurden. Geeignete Mittel zur Einführung der RANK-DNA umfassen
Infektion mit einem viralen Vektor (wie beispielsweise einem retroviralen
oder Adenovirus-Vektor),
in den die für
das Protein kodierenden DNA ligiert wurde, oder eines der anderen,
oben diskutierten Mittel. Nach Einführung der mutierten RANK-DNA
werden die Zellen induziert, um zu Osteoklasten zu differenzieren,
indem das RANK-Protein ausgelöst
wird, unter Verwendung eines der Mittel zum Auslösen von RANK, die oben beschrieben
wurden, oder durch irgendein anderes gewünschtes Mittel zum Auslösen von
RANK. Zur Bestimmung, ob ein Testmolekül den Defekt in dieser mutierten
Form von RANK komplementiert, wird das Molekül während eines Teils oder der
gesamten Inkubationsdauer, während der
die Zellen eine Differenzierung durchlaufen, zum Kulturmedium gegeben.
-
Screening-Assays, die Ca3(PO4)2-Resorption umfassen
-
Es
werden auch Verfahren zum Screening nach RANK-Agonisten oder -Antagonisten
in Assays bereitgestellt, die auf der RANK-abhängigen Resorption einer synthetischen
Matrix aus Calciumphosphat beruhen. Wildtyp RANK-Protein kann Zellen
in die Lage versetzen, zu Osteoklasten zu differenzieren, die fähig sind,
Calciumphosphat (Ca3(PO4)2) zu resorbieren, während Signale von einem RANK-Protein,
dem eine TRAF6-Bindungsstelle fehlt, keine Ca3(PO4)2-Resorption initiiert.
Zellen, die für
dieses Screening-Assay von Nutzen sind, umfassen jegliche Zellen,
in denen die Aktivierung von RANK zu Ca3(PO4)2-Resorption führt, das heißt, Zellen,
die zu Osteoklasten differenzieren, wenn RANK ausgelöst wird.
Beispielhafte Zellen für
die Verwendung in diesem Assay umfassen primäre hämatopoetische Vorläufer, primäre hämatopoetische
Zellen, RAW 264.7-Zellen oder jegliche Zelle, die mit einer Form
von RANK transfiziert ist, welche diese Aktivität unterstützt (wie beispielsweise Vorläuferzellen
für Osteoklasten
aus RANK-/- Mäusen).
-
In
einer Ausführungsform
der Erfindung wird dieses Verfahren verwendet, um nach Molekülen zu screenen,
die inaktive RANK-Mutanten komplementieren, wie beispielsweise die
TRAF6-Deletionsmutanten, wie
oben beschrieben.
-
Geeignete
Arbeitsschritte zur Durchführung
dieses Assays werden beispielhaft durch solche in Beispiel 9 dargelegten
erläutert.
Im Allgemeinen werden Zellen auf kommerziell erhältlichen, dünnen Mikroskopobjektträgern kultiviert,
die dünn
mit Ca3(PO4)2 beschichtet sind. So gezüchtete RANK-reaktive Zellen werden auf
das Auslösen
von RANK durch Differenzierung zu Zellen reagieren, die Ca3(PO4)2 resorbieren,
was zu der Bildung einer diskreten Vertiefung in dem Ca3(PO4)2-Film führt. Um
einen RANK-Antagonisten nachzuweisen, wird die Anzahl an Vertiefungen
auf Objektträgern,
die mit dem Testmolekül
in Kontakt gebracht wurden, mit der Anzahl an Vertiefungen von Objektträgern verglichen,
die nicht mit dem Testmolekül
in Kontakt gebracht wurden.
-
RANK-Agonisten
werden in dieser Art von Assay dadurch nachgewiesen, dass geeignete
Zellen auf Ca3(PO4)2-Filmen gezüchtet werden und diese Zellen
mit einem Testmolekül
in Kontakt gebracht werden, ohne dass zunächst RANK in den Zellen ausgelöst wird.
-
Die
folgenden Beispiele stellen die beste Art der Ausführung der
Erfindung dar, die nun in Betracht gezogen wird, sollten aber nicht
als Einschränkung
der Erfindung ausgelegt werden.
-
BEISPIEL 1.
-
Dieses
Beispiel beschreibt die Bewertung von murinen 3T3-Zellen, die mit
Plasmiden transfiziert wurden, die für humanes FEO RANK (SEQ ID
NO:9) kodierende DNA enthalten, und von murinen 3T3-Zellen, die rekombinante,
für das
humane Wildtyp RANK (SEQ ID NO:1) kodierende DNA exprimieren, bezüglich ihrer
relativen Fähigkeit,
endogene c-jun-Kinase (JNK) in Abwesenheit von RANK-L-Stimulierung
zu aktivieren. Von JNK ist bekannt, das sie als eine Folge der RANK
Signaltransduktion aktiviert wird.
-
Für JNK-Assays
wurden ganze Zellextrakte aus 3T3-Zellen 24 Stunden nach Transfektion
hergestellt. Die Zellen wurden in einem Puffer lysiert, der 20 mM
HEPES, pH 7,4, 2 mM EGTA, 50 mM β-Glycerinphosphat, 1
mM DTT, 1 mM Natriumorthovanadat, 1 % Triton-X 100, 10 % Glycerin
und die Proteaseinhibitoren Leupeptin, Pepstatin A und PMSF enthält. Geklärte Lysate
wurden immunpräzipitiert
mit jeweils 1 μg
anti-JNK (FL) und anti-JNK (C17) Antikörper (beide von Santa Cruz Biotechnology,
Inc. Santa Cruz, CA). Die Immunkomplexe wurden dreimal mit dem Lysepuffer
gewaschen, zweimal mit Waschpuffer (500 mM LiCl, 100 mM Tris, pH 7,5,
0,1 % Triton X-100, 1 mM DTT) und dreimal in Assaypuffer (20 mM
MOPS, pH 7,0, 2 mM EGTA, 10 mM MgCl2, 1
mM DTT, 0,1 % Triton X-100). Die JNK-Aktivität wurde durch ein Immunkomplex-Assay
bestimmt, unter Verwendung von 1 μg
eines Fusionsproteins aus Glutathion-S-Transferase und Aminosäuren 1–169 der c-jun-Kinase
(GST-cJun (1–169))
(UBI, Lake Placid, NY) und 5 μCi
an [32P]-ATP als Substrat in 40 μl Assaypuffer
bei 30 °C
für 20
min. Reaktionsprodukte wurden auf einem 4–20 % SDS/PAGE aufgelöst und durch
Autoradiographie sichtbar gemacht.
-
JNK
wurde als Reaktion auf die Expression von FEO RANK aktiviert, aber
nicht als Reaktion auf die Expression von Wildtyp RANK.
-
BEISPIEL 2
-
Dieses
Beispiel beschreibt ein Screening nach Antagonisten von RANK-Signalgebung,
unter Verwendung von RAW 264.7-Zellen und einer retroviralen Expressionsbibliothek
in einem Assay mit halbfestem Medium.
-
Es
wird eine retrovirale cDNA-Bibliothek in pBMNZ konstruiert. Vorzugsweise
wird die cDNA gegen eine mRNA synthetisiert, die aus Zellen isoliert
wurde, die keine Osteoklasten bilden, d. h. Zellen, die Antagonisten
der RANK-Aktivität
exprimieren können
(z. B. mit GM-CSF oder IL-10 aktivierte Makrophagen). Retrovirale
Partikel werden unter Verwendung der Phoenix-Zelllinien (bereitgestellt
von Dr. Gary Nolan, Stanford University, USA) und von geeignetem
Hüllprotein
(wie zum Beispiel ekotropisches Hüllprotein, amphotropisches
Hüllprotein
oder polytropes Hüllprotein)
verpackt. Zum Beispiel werden, im Falle von transient hergestellten
retroviralen Vektoren, Phoenix Verpackungszellen mit Konstrukten
transfiziert, die in dem retroviralen pBMNZ-Vektor erzeugt wurden,
und der Kulturüberstand
wird 48 Stunden nach der Transfektion geerntet. Die retroviralen
Partikel werden unter Verwendung von Standardtechniken isoliert.
Zum Beispiel werden virale Partikel von Membranfragmenten durch
sterile Filtration durch einen 0,45 Mikron Filter gereinigt.
-
RAW
264.7-Zellen werden mit der verpackten retroviralen cDNA-Bibliothek
unter Bedingungen infiziert, die zu einer optimalen Infektion führen. Zum
Beispiel können
optimale Infektionsbedingungen bestimmt werden, indem die Expression
eines Reportergens überwacht
wird, das von einem retroviralen Testkonstrukt exprimiert wird.
Retrovirale Konstrukte, die für β-Galactosidase
kodieren (z. B. pBMNZ/LZRS; Kinsella und Nolan, 1996, supra), können zur
Herstellung von retroviralen Partikeln verwendet werden. Nach Infektion
der Zellen mit einer seriellen Verdünnung der Viruskulturen kann
die Anzahl an β-Galactosidase
exprimierenden Zellen 24 Stunden nach der Infektion überwacht
werden. Verschiedene Bedingungen, einschließlich der Wahl des Hüllproteins,
der Infektionsmultiplizität,
der Länge
der Inkubationszeit zur Infektion, der Vorbehandlung der Zellen
unter Bedingungen, die den Zellzyklus fördern, Kofaktoren wie Polybren
oder rekombinante Fibronektinfragmente, können variiert werden, um die
Bedingungen zu bestimmten, unter denen die größte Menge an Testvirus in die
Zellen gelangt.
-
Die
Zellen werden dann nach einer angemessenen Zeit in ein halbfestes
Medium ausplattiert, das eine Expression von cDNAs in den infizierten
Zellen ermöglicht.
Beispielhafte Bedingungen zum Ausplattieren von infizierten Zellen
sind das Ausplattieren von 3 ml 0,3 Gew.-% Methylcellulose-Medium, das infizierte
Zellen mit einer Zelldichte von 1 × 105 Zellen/ml
bis 1 × 106 Zellen/ml enthält, in jeden Well einer 24-Wellplatte.
In das halbfeste Medium wird eine lösliche Leucin-Zipper-Form von
RANK-L (200 ng/ml) eingeschlossen.
-
Die
Zellen werden über
einen Zeitraum von 5 Tagen und 8 Tagen kultiviert und Kolonien,
die von der infizierten Zellpopulation abstammen, die deutlich schneller
wachsen, als die Kolonien, die von der nicht infizierten Kontrollpopulation
abstammen, werden für
weitere Analyse isoliert. Zum Beispiel werden die Kolonien von Interesse
keimfrei isoliert und weiter in der Abwesenheit von RANK-Aktivierung gezüchtet, um
die Anzahl an Zellen zu erhöhen.
Die cDNA-Klone innerhalb der Zellen von jeder Kolonie werden durch
jegliche auf dem Fachgebiet anerkannte Technik gewonnen, wie beispielsweise
RT-PCR der exprimierten viralen Transgene, PCR des eingebauten Provirus
oder über
eine virale Helferrekombination oder Rückgewinnung der viralen Partikel.
Zum Beispiel wurde die Amplifizierung von eingebauten cDNAs beschrieben
von Kitamura et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:9146–9150 (1995).
-
Eine
Variation dieses Assays zieht einen Vorteil aus der Zellfusion und
abschließenden
Differenzierung, die auftritt, wenn RAW 264.7-Zellen mit RANK-L
in Kontakt gebracht werden. Um diese Variation des Assays auszuführen, werden
RAW 264.7-Zellen auf einer 6-Well Kulturplatte ausplattiert, eine
lösliche
Leuzin-Zipper-Form von RANK-L wird zu diesen Wells gegeben und die
Platten werden für
3 bis 5 Tage in der Gegenwart des Leucin-Zipper RANK-L-Polypeptids
inkubiert. Die Zellen, die positiv auf das Auslösen von RANK-L reagieren, werden
in größere, mehrkernige,
differenzierte Osteoklasten fusioniert und verlieren ihr Potenzial,
sich in Kultur zu teilen. Wenn gewünscht, können andere Formen von RANK-L
außer
Leucin-Zipper RANK-L als das Stimulans in diesem Assay verwendet
werden. Um dieses Assay zu verwenden, um verschiedene Mittel auf
ihre Fähigkeit,
eine antagonistische Wirkung auf RANK auszuüben, zu prüfen, wird putativer Antagonist
zu den Wells gegeben, vor und/oder während es dem RANK-Stimulans
ausgesetzt ist. Setzt ein Kandidatenantagonist, wie beispielsweise
eine exprimierte cDNA, die Reaktion von Zellen auf RANK-L außer Kraft,
behalten die Zellen ihre Fähigkeit,
sich in diesen Kulturen zu teilen, bei. Zellen aus diesen Platten,
die weiterhin in Kultur wachsen können, können abgetrennt und aus den
fusionierten, differenzierten Osteoklasten durch kräftiges Pipettieren
oder durch Trypsin-Verdauung gewonnen werden. Diese gewonnenen Zellen
werden in normalen Wachstumsmedien in der Lage sein, in der Abwesenheit
von RANK-L zu wachsen, und können
so unter Verwendung von herkömmlichen
Techniken ausgezählt
und vermehrt werden. Wie oben beschrieben, werden die cDNAs innerhalb
der vermehrten Zellen durch herkömmliche
Techniken gewonnen, wie beispielsweise Reverse Transkriptase-PCR
der exprimierten viralen Transgene, PCR des eingebauten Provirus
oder über
eine virale Helferrekombination oder Rückgewinnung der viralen Partikel.
-
BEISPIEL 3
-
Dieses
Beispiel beschreibt die Herstellung einer RANK-reaktiven Zelllinie,
die RANKΔ340-421
exprimiert (siehe Galibert et al., 1998 für eine Beschreibung von RANKΔ340-421).
-
Es
wurden Milzzellen aus 3–6
Wochen alten RANK-/- Mäusen
isoliert (die einen Defekt bei der Osteoklastenbildung aufweisen
und osteopetrotisch sind) und wurden auf die folgende Weise an Linien
depletiert. T-Zellen wurden durch Immunabsorption unter Verwendung
von biotinylierten anti-CD3
Antikörpern
entfernt; erythroide Zellen wurden durch Immunabsorption unter Verwendung
von biotinylierten anti-Ter-119 Antikörpern entfernt und Granulozyten
wurden durch Immunabsorption unter Verwendung von biotinylierten
Anti-GR-1 Antikörpern
entfernt. Diese Antikörper-Zell-Komplexe
wurden durch Binden der Biotineinheit an mit Streptavidin konjugierte
magnetische Beads entfernt, die anschließend über eine metallische MACS-Depletionssäule passiert
wurden.
-
Die
an Linien depletierten Zellen wurden dann für 48 Stunden in 40 ng/ml CSF-1
inkubiert und unter Verwendung von retroviralen Überständen (MOI von 5) in der Gegenwart
von rekombinanten Fibronektinfragmenten (Retronectin, PanVera Corp,
Madison, WI) für
zusätzliche
48 Stunden in 40 ng/ml CSF-1 infiziert. Nach der Infektion wurden
die Milzzellen geerntet und in MEM 10 % FBS ausplattiert, das 40
ng/ml CSF-1 und 200 ng/ml murines RANK-L enthielt. Die Zellen wurden
unter diesen Bedingungen für
5 Tage kultiviert, um die Differenzierung zu Osteoklasten zu ermöglichen.
Die Retroviren, die für
die Transfektion verwendet wurden, wurden durch Subklonierung von
für RANKΔ340-421 kodierende
DNA in den pBMNZ-Vektor hergestellt (Kinsella and Nolan, 1996, Human
Gene Therapy 7:1405–1413).
Die gesamte RANKΔ340-421
cDNA wurde aus pDC304/RANKΔ340-421
ausgeschnitten (Galibert et al., J. Biol. Chem. 273:34120, 1998),
unter Verwendung der Restriktionsendonucleasen BglII und NotI. Dieses
cDNA-Insertionsfragment wurde in den retroviralen Vektor pBMNZ ligiert
(Kinsella and Nolan, 1996, supra), der mit BamHI und NotI verdaut
wurde. Das resultierende Plasmid wurde gereinigt, die DNA-Sequenz
bestätigt
und mit pBMNZ/RANKΔ340-421
bezeichnet. Die Herstellung von infektiösen, retroviralen Vektorpartikeln
in 293-E Phoenix Verpackungszellen wurde ausgeführt wie beschrieben (Kinsella
und Nolan, 1996, supra).
-
BEISPIEL 4
-
Dieses
Beispiel beschreibt die Herstellung von Promotor/Reporter-Vektoren
des murinen MMP-9-Promotors
(SEQ ID NO: 11), der an den humanen IL-2α-Rezeptor fusioniert ist.
-
Ein
DNA-Fragment, das die Promotorregion des murinen MMP-9-Gens enthält, wurde
wie folgt mit einem cDNA-Molekül
fusioniert, das für
den humanen IL-2α-Rezeptor
kodiert. Ein Plasmid, das 4,15 kb der murinen MMP-9-Promotorregion
(SEQ ID NO: 11) enthält,
wurde in den promotorlosen pGL2 Basic-Vektor einkloniert (Promega,
Madison, 25 WI), der das Luciferase-Reportergen enthält, wie
beschrieben von Roach et al., Gene 208:117–122 (1998). Das resultierende
Plasmid wurde mit pGB-coINK1
bezeichnet. Ein ungefähr
3,5 kb SmaI/EcoRI-Fragment, das die 5'-benachbarte MMP-9-Promotersequenz (SEQ ID NO:11) enthält, wurde
aus pGB-coINK1 ausgeschnitten und in den SIN retroviralen Vektor
pSIR (Clontech) an der BamHI-Stelle subkloniert, die geglättet worden
war.
-
Eine
für den
humanen IL-2α-Rezeptor
kodierende cDNA wurde in CAVNOT subkloniert, wie beschrieben in
Cosman, D., et al. "Cloning
and expression of human and mouse 1L-2 receptor cDNAs". In: Lymphokines:
Molecular Cloning and Analysis of Lymphokines. D.R. Webb und D.V.
Goeddel (Hrgs.) Academic Press, 1987, S. 109.
-
Die
cDNA für
den humanen IL-2α-Rezeptor
wurde aus dem CAVNOT-Konstrukt unter Verwendung von PCR amplifiziert,
so dass das 5'-Ende
so modifiziert wurde, dass es eine BglII-Stelle enthielt, und das 3'-Ende wurde so modifiziert,
dass es eine PflM1-Stelle enthielt. Dieses amplifizierte Produkt
wurde in den pGEM-T-Vektor (Promega) ligiert. Die cDNA für den humanen
IL-2α-Rezeptor
wurde aus diesem Plasmid unter Verwendung von BglII und PflM1 Restriktionsstellen
ausgeschnitten und in pGL2 Basic (Promega) ligiert, welcher mit
BglII und PflM1 verdaut wurde, um die Luciferase-Reporter-cDNA auszuschneiden. Der humane IL-2α-Rezeptor
ersetzt so den Luciferasereporter in pGL2 und das resultierende
Plasmid wurde als pGL2/hIL-2-Rezeptor bezeichnet.
-
Der
pGL2/hIL-2-Rezeptor wurde mit KpnI und BglII innerhalb des Polylinkers
stromaufwärts
der cDNA verdaut, die für
den humanen IL-2α-Rezeptor
kodiert. Ein 3,5 kb KpnI/NheI-Fragment, das aus dem pGB-colNK1-Plasmid
isoliert wurde, das für
den MMP-9-Promotor (SEQ ID NO: 11) kodiert, und das zusammenhängenden
NheI bis BglII (653 bp) Fragment des verbleibenden MMP-9-Promotors
wurden in einer trimolekularen Ligation mit dem pGL2/hIL-2-Rezeptor
ligiert unter Bildung des Plasmids, das mit pGL2-MMP-9/humaner IL-2-Rezeptor
bezeichnet wurde, in welchem die gesamte 5'-benachbarte 4,15 kb Sequenz der Maus-MMP-9
benachbarten Region direkt stromaufwärts der cDNA für den hIL-2α-Rezeptor
fusioniert wurde. Dieses Konstrukt zeigt Reaktionsfähigkeit
auf RANK. Um die inhibitorische Aktivität eines Kandidatenmoleküls unter
Verwendung dieses Systems zu untersuchen, kann das Kandidatenmolekül vor, gleichzeitig
mit oder nach Zugabe des Agonisten für die RANK-Aktivität zugegeben
werden. Der Level an IL-2α-Rezeptorexpression
auf der Oberfläche
ist ein Maß für den Level
an RANK-Aktivierung.
-
Die
Lokalisierung des RANK-reaktiven Teils des MMP-9-Promotors wurde
enger identifiziert, indem weitere Trunkierungen des Promotors untersucht
wurden. Ein PVUII/BGL2-Restriktionsfragment, welches das 5'-proximale 1822 bp
des MMP-9-Promotors enthält,
wurde mit einem BLGII/EcoRI-Restriktionsfragment
fusioniert, das für
den humanen IL-2-Rezeptor in der multiplen Klonierungsstelle des
pSIR retroviralen Vektors (Clontech) kodiert. Das resultierende
Plasmid, das pSIR/MMP-9 genannt wurde, reagiert auf RANK und ist
in Assays zur Identifizierung von RANK-Antagonisten von Nutzen.
Die Region des MMP-9-Promotors, der in pSIR/MMP-9 vorkommt, entspricht
den Nucleotiden 1769–3591
von SEQ ID NO:11.
-
pSIR/MMP-9
wurde wie folgt in die RANK-reaktiven Zellen eingeführt. Es
wurden retrovirale Partikel nach Transfektion von 293/E Verpackungszellen
mit pSIR/MMP-9 hergestellt. RAW 264.7-Zellen wurden mit diesen Partikeln
infiziert und gegen Neomycin resistente Kolonien, die den Reporter
stabil exprimierten, wurden isoliert. Behandlung dieser Zellen mit
RANK-L führte
zu einer Erhöhung
der Expression auf der Zelloberfläche des hIL-2αR, wie durch
Durchflusscytometrie unter Verwendung des Maus-mAb (Klon 2A3) anti-humanem
IL-2αR als
Reagenz für
den Nachweis des IL-2R nachgewiesen. Expression von hIL-2α-Rezeptor
wurde innerhalb von 4 Stunden beobachtet und erreichte den maximalen
beobachteten Level innerhalb von 48 Stunden.
-
Oberflächenexpression
von humanem IL-2α-Rezeptor
wird durch Durchflusscytometrie auf die folgende Weise nachgewiesen.
Es wurden Zellen geerntet und bekannte, spezifische Antikörperbindungsstellen
wurden unter Verwendung einer PBS-Lösung blockiert, die 5 % normales Ziegenserum
enthielt, für
30 Minuten bei 4 C. Die Zellen wurden dann gewaschen und mit dem
monoklonalen Antikörperklon
des anti-humanen IL-2α-Rezeptors
bei einer Antikörperkonzentration
von 5 μg/ml
für 1 Stunde
bei 4 C inkubiert. Im Anschluss an diese Inkubation wurden die Zellen
gewaschen, und ein fluoreszierend konjugierter, sekundärer anti-Maus IgG-Antikörper wird
mit Zellen für
weitere dreißig
Minuten bei 4 C inkubiert. Nach dem Waschen der Zellen wurde die
Fluoreszenzintensität
unter Verwendung eines Durchflusscytometers gemessen, wie beispielsweise
einem FACS-Scan (Becton Dickinson).
-
Zusätzlich kann
die Oberflächenexpression
von humanem IL-2α-Rezeptor
unter Verwendung eines radioaktiven Antikörpers gegen den IL-2α-Rezeptor
analysiert werden. Für
das mIL-4R-spezifische Radioimmunassay wurde ein monoklonaler Maus
anti-humaner IL-2α-Antikörper, der
mit mIL-4R reagiert, mit 125I über das Chloramin
T-Konjugationsverfahren markiert; die resultierende spezifische
Aktivität
beträgt
typischerweise 1,5 × 1016 cpm/nmol. Nach 48 Stunden wurden mit pGL2-MMP-9/humanem IL-2-Rezeptor
transfizierte Zellen einmal mit Medien (DMEM, 12 5% FBS) gewaschen.
Nicht spezifische Bindungsstellen wurden durch die Zugabe von vorgewärmten Bindungsmedien,
die 5 % fettfreie trockene Milch enthielten, und Inkubation bei
37° C/5% CO2 in einem Inkubator für Gewebekultur für eine Stunde
blockiert. Die blockierende Medien wurden abdekantiert und Bindungspuffer,
der 125I anti-mIL-4R (Klon M1; Ratten IgG1)
enthielt, wurde zu den Zellen gegeben und unter Schütteln bei
Raumtemperatur für
1 Stunde inkubiert. Nach Inkubation der Zellen mit dem radioaktiv markierten
Antikörper
wurden die Zellen ausgiebig mit Bindungspuffer (2 ×) und zweimal
mit Phosphat gepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen. Die Zellen
wurden in 1 ml 0,5M NaOH lysiert und die Gesamtradioaktivität wurde
mit einem Gammazähler
gemessen. Unter Verwendung dieses Assays zeigten 293/EBNA, die mit
für RANK
kodierenden DNAs cotransfiziert wurden, transkriptionelle Aktivierung,
wie durch den Nachweis von muIL-4R auf der Zelloberfläche gezeigt. Überexpression
von RANK führt
zu einer Transkription von muIL-4R, was auch durch das Auslösen von
RANK durch RANK-L bewirkt wurde. Gleichartige Ergebnisse werden
beobachtet, wenn RANK von agonistischen Antikörpern ausgelöst wird.
-
Weiterhin
können
Zellen, die den humanen IL-2α-Rezeptor
auf ihrer Oberfläche
exprimieren, unter Verwendung einer Panning-Technik isoliert werden,
wie beispielsweise der Technik, die beschrieben wird von Aruffo
und Seep, PNAS 84:8573–8577
(1987). Kurz gesagt, wird ein zweiter Antikörper, der den ersten Antikörper erkennt,
auf bakteriologischen 60 Millimeter Platten immobilisiert. Die Zellen,
die einem Panning unterzogen werden sollen, werden als Einzelzell-Suspension
in PBS hergestellt, das 0,5 mM EDTA und 5% FBS enthielt. Die Antikörper für den Zelloberflächenmarker
werden mit etwa 5 μg/ml
zugegeben, worauf sich Inkubation auf Eis für 30 Minuten anschließt. Die
Zellen werden einmal gewaschen und zu den mit dem zweiten Antikörper beschichteten
Platten in PBS/EDTA/5% FBS gegeben und bei Raumtemperatur für 1–3 Stunden inkubiert. Überschüssige Zellen,
die nicht auf der Platte haften, werden durch sanftes Waschen mit
PBS/5% FBS entfernt.
-
BEISPIEL 5
-
Dieses
Beispiel beschreibt die Aktivierung des TRAP-Promotors. Ein 2,6
kb DNA-Fragment, welches den humanen TRAP-Promotor enthält, wurde
durch Verdauung des Plasmids pBL2HT2.2 mit der Restriktionsendonuclease
ApaI erhalten. Das Klonieren der 5'-Region des humanen TRAP-Gens und die
Konstruktion von pBL2HT2.2 werden vollständig beschrieben in Reddy et
al. (Bone 16:587–593
(1995)). Eine DNA, die den TRAP-Promotor der Maus (SEQ ID NO:12)
enthält,
und eine DNA, die den murinen MMP-9-Promotor (SEQ ID NO:11) enthält, wurden
ebenfalls für
diese Experimente verwendet. DNAs, welche die Promotoren enthielten, wurden
mit dem Luciferase-Reportergen fusioniert. Diese Promotor/Reporter-Konstrukte
wurden in humane 293/EBNA Zellen transfiziert, zusammen mit verschiedenen
Kombinationen von Expressionsvektoren, die für humane Volllängen-RANK- (SEQ ID NO:2)
und humane Volllängen-RANK-L-Proteine
(SEQ ID NO:6) kodieren.
-
Für den TRAP-Promotor
der Maus (SEQ ID NO:12), wurden 2 × 105 293/EBNA
Zellen transfiziert unter Verwendung von DEAE/Dextran mit 40 ng
eines Plasmids, das für
ungefähr
2 kb des TRAP-Promotors
der Maus (SEQ ID NO: 12) kodiert, fusioniert an einen Luciferasereporter,
20 ng eines Expressionsvektors, der für RANK-L (SEQ ID NO:6) kodiert,
und 0,4 ng eines Expressionsvektors, der für RANK (SEQ ID NO:2) kodiert. Vierundzwanzig
Stunden nach der Transfektion wurde die Luciferaseaktivität in Zelllysaten
gemäß den Vorschriften
des Herstellers (Promega) unter Verwendung eines EG&G/Berthold Luminometers
gemessen. Die Expression von RANK war ausreichend, um die Reporterexpression
zu verstärken
(ungefähr
um das Zweifache), während
die Kombination aus RANK (SEQ ID NO:2) und RANK-L (SEQ ID NO:6)
die Reporterexpression ungefähr
um das Vierfache verstärkte.
-
Für den humanen
TRAP-Promotor wurde das 1,9 kb ApaII-Fragment, das die Promotoraktivität isoliert von
der Region stromaufwärts
des humanen TRAP-Gens (Reddy et al., 1995) enthält, mit einem Luciferasereporter
fusioniert und in 293/EBNA-Zellen transfiziert (40 ng). Die Kombination
aus humanem RANK (SEQ ID NO:2) und humanem RANK-L (SEQ ID NO:6)
verstärkte
die Reporterexpression ungefähr
um das 1,5fache.
-
Für die Experimente
mit murinem MMP-9-Promotor wurden 4,1 kb des murinen MMP-9-Promotors (SEQ
ID NO:11) mit einem Luciferase-Gen fusioniert und in 293/EBNA Zellen
transfiziert (40 ng). Transfektion von entweder RANK (SEQ ID NO:2)
allein oder der Kombination aus RANK (SEQ ID NO:2) und RANK-L (SEQ ID
NO:6) verstärkte
die Reporterexpression ungefähr
um das 2,5fache.
-
Außerdem wurden
RAW 264.7-Zellen (6 × 106 Zellen) mit 15 μg MMP-9 (SEQ ID NO:11)/Luciferase-Plasmid-DNA unter
Verwendung von DEAE/Dextran transfiziert. Zwei Stunden nach der
Transfektion wurden die Zellen in zwei gleiche Mengen geteilt und
weiter für
24 Stunden inkubiert. Zugabe von 1 μg/ml einer Leucin-Zipper-Form
von murinem RANK-L für
18 Stunden war ausreichend, um den MMP-9 (SEQ ID NO:11)/Luciferasepromotor
10-15fach zu induzieren.
-
Quantitative
RT-PCR-Messungen von Maus-TRAP und Maus-MMP-9 mRNA in RAW 264.7-Zellen nach
Behandlung mit entweder Maus-RANK-L/LZ (200 ng/ml) oder TNFα (20 ng/ml)
für verschiedene
Zeiträume
ergab, dass TRAP mRNA durch RANK-L um mehr als das 250fache erhöht wird,
aber von TNFα nur
um etwa das 2,3fache verstärkt
wird. MMP-9 mRNA wird durch RANK-L um mehr als das 350fache erhöht, aber nicht
durch TNFα verstärkt. Diese
Spezifizität
ist für
das Screening nach Inhibitoren der RANK-Signaltransduktion hilfreich.
-
BEISPIEL 6
-
Dieses
Beispiel erläutert
die Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen RANK-L. Präparate mit gereinigtem
rekombinantem RANK-L, zum Beispiel, oder mit TransFix behandelte
Zellen, die hohe Level an RANK-L exprimieren, werden eingesetzt,
um monoklonale Antikörper
gegen RANK-L zu erzeugen, unter Verwendung von herkömmlichen
Techniken, wie sie im
U.S. Pat.
No. 4,411,993 beschrieben werden, welches durch Bezugnahme
hier aufgenommen wird. Für
RANK-L kodierende DNA kann ebenfalls als ein Immunogen verwendet
werden, zum Beispiel wie in dem Review von Pardoll und Beckerleg
in Immunity 3: 165, 1995 beschrieben. Solche Antikörper sind
wahrscheinlich von Nutzen, um bei der RANK-L-Signalgebung zu stören (antagonistische
oder blockierende Antikörper),
als Bestandteile von diagnostischen oder Forschungsassays für RANK-L-
oder RANK-L-Aktivität oder bei
der Affinitätsreinigung
von RANK-L.
-
Die
DNA kann intradermal gegeben werden (Raz et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 91: 9519, 1994) oder intramuskulär (Wang et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 90: 4156, 1993); es wurde gefunden, dass Kochsalzlösung ein
geeignetes Verdünnungsmittel
für auf
DNA basierende Antigene ist. Zehn Tage bis drei Wochen später werden
die immunisierten Tiere mit zusätzlichem
Immunogen reimmunisiert und danach periodisch nach einem wöchentlichen,
zweiwöchentlichen
oder einem Immunisierungszeitplan für alle drei Wochen reimmunisiert.
-
Es
wurden periodisch Serumproben durch retroorbitalen Aderlass oder
Entfernung der Schwanzspitze entnommen, um durch Dot-Blot-Assay
(Antikörper-Sandwich),
ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), Immunfällung oder
andere geeignete Assays einschließlich FACS-Analyse zu untersuchen.
Im Anschluss an den Nachweis eines geeigneten Antikörpertiters
wird positiven Tieren eine intravenöse Injektion mit Antigen in
Kochsalzlösung
gegeben. Drei bis vier Tage später
werden die Tiere geopfert, die Milzzellen geerntet und mit einer
murinen Myeloma-Zelllinie fusioniert (z. B., NS1 oder vorzugsweise
Ag 8.653 [ATCC CRL 1580]). Die durch diesen Arbeitsgang erzeugten
Hybridoma-Zelllinien
werden auf multiplen Mikrotiterplatten in einem selektiven Medium
(zum Beispiel einem, das Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin,
oder HAT, enthält)
ausplattiert, um Proliferation von nicht fusionierten Zellen, Myelom-Myelom-Hybriden
und Milzzellen-Milzzellen-Hybriden zu inhibieren.
-
Die
so erzeugten Hybridoma-Klone können
mittels ELISA auf Reaktivität
mit RANK-L gescreent werden, zum Beispiel, durch Anpassungen der
Techniken, die in Engvall et al., (Immunochem. 8: 871, 1971) und im
U.S. Patent 4,703,004 beschrieben
werden. Eine bevorzugte Screening-Technik ist die von Beckmann et al.,
J. Immunol. 144:4212, 1990, beschriebene Antikörpqer-Fangmethode. Positive
Klone werden dann in die peritonealen Hohlräume von syngeneischen Nagern
injiziert, um Aszites zu erzeugen, die hohe Konzentrationen (> 1 mg/ml) an monoklonalen
Anti-RANK-L Antikörpern
enthalten. Die resultierenden monoklonalen Antikörper können durch Ammoniumsulfat-Fällung, gefolgt
von Gelausschlusschromatographie gereinigt werden. Alternativ kann
auch Affinitätschromatographie
basierend auf der Bindung eines Antikörpers an Protein A oder Protein
G verwendet werden, sowie Affinitätschromatographie basierend
auf der Bindung an ein RANK-L-Protein. Unter Verwendung der hier
beschriebenen Verfahren zur Überwachung
der Aktivität
der mAbs, werden sowohl blockierende (d.h., Antikörper, die
RANK-L binden und Bindung an RANK inhibieren) wie auch nicht blockierende
(d.h., Antikörper,
die RANK-L binden und die Bindung nicht inhibieren) isoliert.
-
BEISPIEL 7
-
Dieses
Beispiel erläutert
die Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen RANK.-Präparate mit gereinigtem,
rekombinantem RANK, zum Beispiel, oder transfizierte Zellen, die
hohe Level an RANK exprimieren, werden eingesetzt, um monoklonale
Antikörper
gegen RANK zu erzeugen, unter Verwendung von herkömmlichen
Techniken, wie sie im
U.S. Pat.
Nr. 4,411,993 beschrieben werden. Für RANK kodierende DNA kann
ebenfalls als ein Immunogen verwendet werden, zum Beispiel, wie
in dem Review von Pardoll und Beckerleg in Immunity 3:165, 1995
beschrieben.
-
Die
DNA kann intradermal gegeben werden (Raz et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 91: 9519, 1994) oder intramuskulär (Wang et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 90:4156: 1993,); es wurde gefunden, dass Kochsalzlösung ein
geeignetes Verdünnungsmittel
für auf
DNA basierenden Antigene ist. Zehn Tage bis drei Wochen später werden
die immunisierten Tiere mit zusätzlichem
Immunogen reimmunisiert und danach periodisch nach einem wöchentlichen,
zweiwöchentlichen
oder einem Immunisierungszeitplan für alle drei Wochen reimmunisiert.
-
Es
wurden periodisch Serumproben durch retroorbitalen Aderlass oder
Entfernung der Schwanzspitze entnommen, um durch Dot-Blot-Assay
(Antikörper-Sandwich),
ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), Immunfällung oder
andere geeignete Assays einschließlich FACS-Analyse zu untersuchen.
Im Anschluss an den Nachweis eines geeigneten Antikörpertiters
wird positiven Tieren eine intravenöse Injektion mit Antigen in
Kochsalzlösung
gegeben. Drei bis vier Tage später
werden die Tiere geopfert, die Milzzellen geerntet und mit einer
murinen Myeloma-Zelllinie fusioniert (z. B., NS1 oder vorzugsweise
Ag 8.653 [ATCC CRL 1580]). Die durch diesen Arbeitsgang erzeugten
Hybridoma-Zelllinien
werden auf multiplen Mikrotiterplatten in einem selektiven Medium
(zum Beispiel einem, das Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin,
oder HAT, enthält)
ausplattiert, um Proliferation von nicht fusionierten Zellen, Myelom-Myelom-Hybriden
und Milzzellen-Milzzellen-Hybriden zu inhibieren.
-
Die
so erzeugten Hybridoma-Klone können
mittels ELISA auf Reaktivität
mit RANK gescreent werden, zum Beispiel, durch Anpassungen der Techniken,
die in Engvall et al., (Immunochem. 8: 871, 1971) und im
U.S. Patent 4,703,004 beschrieben
werden. Eine bevorzugte Screening-Technik ist die von Beckmann et
al., J. Immunol. 144:4212, 1990, beschriebene Antikörper-Fangmethode.
Positive Klone werden dann in die peritonealen Hohlräume von
syngeneischen Nagern injiziert, um Aszites zu erzeugen, die hohe
Konzentrationen (> 1
mg/ml) an monoklonalen anti-RANK Antikörpern enthalten. Die resultierenden
monoklonalen Antikörper können durch
Ammoniumsulfat-Fällung,
gefolgt von Gelausschlusschromatographie gereinigt werden. Alternativ
kann auch Affinitätschromatographie
basierend auf der Bindung eines Antikörpers an Protein A oder Protein
G verwendet werden, sowie Affinitätschromatographie, basierend
auf der Bindung an ein RANK-Protein.
-
Es
werden monoklonale Antikörper
unter Verwendung von RANK/Fc-Fusionsprotein als dem Immunogen erzeugt.
Diese Reagenzien wurden gescreent, um Reaktivität gegen das RANK-Protein zu
bestätigen.
Unter Verwendung der hier beschriebenen Verfahren zur Überwachung
der Aktivität
der mAbs, wurden sowohl blockierende (d.h., Antikörper, die
RANK binden und Bindung eines Liganden an RANK inhibieren) wie auch nicht
blockierende (d.h., Antikörper,
die RANK binden und die Liganden-Bindung nicht inhibieren) isoliert.
-
BEISPIEL 8
-
In
diesem Assay werden Testmoleküle
identifiziert, die eine mit RANK einhergehende Aktivität modulieren
können,
indem die Induktion von c-src Tyrosinkinase oder F-Aktinringbildung
in der Gegenwart des Testmoleküls
gemessen wird.
-
Es
wurden Experimente ausgeführt,
in denen DNA, die für
Wildtyp oder humane RANK/TRAF6 Bindungsmutanten (RANKΔ340-421)
kodiert, in aus RANK-/- Mäusen
isolierte, hämatopoetische
Zellen eingeführt
wurden. Volllängen-
und mutierte humane RANK DNAs wurden in den retroviralen pBMNZ Vektor
subkloniert, wie früher
beschrieben (Kinsella und Nolan, 1996, Human Gene Therapy 7:1405–1413).
Infektiöse, RANK
enthaltende Retroviren wurden in 293-E Phoenix Verpackungszellen
hergestellt, wie beschrieben (Kinsella und Nolan, 1996). Es wurden Überstände von
diesen Zellen als eine Quelle für
infektiöse
Viruspartikel verwendet.
-
Die
Erzeugung der in diesen Assays verwendeten RANK-/- Mäuse wurde
bereits früher
beschrieben (Dougall et al., 1999). Milzzellen wurden aus 3–6 Wochen
alten RANK-/- Mäusen
isoliert und auf Vorläufer
von Osteoklasten durch Depletion der anfänglichen Zellpopulation um
verschiedene Arten von Zellen außer den Vorläufern von
Osteoklasten angereichert. Für
diesen „Depletions" schritt wurden die
Zellen mit biotinylierten Antikörpern
gegen CD3 (spezifisch für
T-Zellen), Ter-119 (spezifisch für
Erythrozyten) und GR-1 (spezifisch für Granulozyten) inkubiert.
Nachdem die Antikörper
an ihre jeweiligen Zielzellen gebunden hatten, wurden mit Streptavidin
konjugierte, magnetische Beads zu der Kultur gegeben und die Zellmischung
wird über
magnetische Säulen
passiert (MACS Depletionssäulen;
MILLTENNYI). Zellen, die nicht an den MACS-Säulen haften blieben, galten
als mit Vorläufern
für Osteoklasten
angereichert und wurden für
die Assays verwendet. Die mit Vorläufern für Osteoklasten angereicherten
Zellen wurden dann für
48 Stunden in 40 ng/ml CSF-1 inkubiert, bevor sie mit den retroviralen Überständen (MOI
von 5) in der Gegenwart von rekombinanten Fibronektinfragmenten
(Retronectin, PanVera Corp, Madison, WI) für zusätzliche 48 Stunden in 40 ng/ml
CSF-1 infiziert wurden. Sowohl die Zellen wie auch die Viruspartikel
neigen zu einer Haftung an Fibronektin, so dass die Fibronektinfragmente
dazu dienten, die Geschwindigkeit der Infektion durch Erzeugung
einer lokalen hohen Konzentration sowohl an Zellen und Virus zu
verstärken.
Im Anschluss an die Infektion wurden die Zellen geerntet und in
a-MEM 10 % fötalem
Rinderserum, das 40ng/ml CSF-1 und 200 ng/ml mRANK-L enthielt, ausplattiert und
für 5 Tage
in diesem Medium inkubiert.
-
Bei
infizierten Kulturen, die Wildtyp RANK-DNA erhielten, waren die
c-src-Level im Anschluss an die Differenzierung ziemlich hoch. In
einem typischen Experiment bauen Extrakte von Wild-typ RANK exprimierenden
Zellen etwa 15-mal mehr 32P in ein c-src-spezifisches
Substrat ein, als Extrakte aus Zellen, denen es an RANK fehlt. Sowohl
fötales
Rinderserum wie auch CSF-1 tragen zum Grundlevel der c-src Aktivität bei; daher
wurde dieser Grundlevel durch „Hungern
lassen" der Zellen
für 18
Stunden in MEM, das 0,5 % an Stelle von 10 % fötales Rinderserum enthielt
und 10 ng/ml an Stelle von 40 ng/ml CSF-1, gefolgt von 2 Stunden
in MEM, das 0,5 % FBS und kein CSF-1 enthielt, vermindert.
-
Um
c-src und F-Aktinringe zu induzieren, wurde rekombinantes mRANK-L/Leucin-Zipper-Protein
zu den Kulturen in einer Konzentration von 1 μg/ml zu verschiedenen Zeiten
gegeben, nach denen die Zellen in einem Puffer lysiert wurden, der
50 mM HEPES (pH 7,2), 10 % Glycerin, 250 mM NaCl und 1 % Triton
X-100 enthielt. Das c-src-Protein wurde durch Immunfällung unter
Verwendung des monoklonalen Antikörpers GD-11 gereinigt. C-src-Aktivität in dem
Immunkomplex wurde unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen
Kits überwacht
(Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY). Kurz gesagt, verursacht
die Messung der c-src-Aktivität die
Messung der Phosphotransferase-Aktivität unter Verwendung von γ-markiertem
ATP und dem p34/cdc2-Peptid (KVEKIGEGTYGVVYK) (SEQ ID NO: 13), welches
ein Substrat für
die c-src Kinase bietet. Die Kinaseassays wurde bei 30 °C für 10 Minuten
in einem Puffer inkubiert, der 10 μCi an gamma-markiertem ATP,
MnCl2 (75 mM), ATP (500 μM), MOPS (20 mM), beta-Glycerinphosphat
(25 mM), EGTA (5 mM), Natriumorthovanadat (1 mM) und Dithiothrietol
(1 mM) enthielt. Das phosphorylierte Substratpeptid wurde dann von dem
restlichen markierten ATP unter Verwendung von Phosphocellulosepapier
abgetrennt und markiertes Peptid wurde unter Verwendung eines Sczintillationszählers quantifiziert.
Die Immunfällung
und das in vitro Immunkomplex-Kinase-Assay wurden ausgeführt wie
beschrieben (Musch, et al. J. Biol. Chem. (1999) 274:7923–7928).
-
Wurde
c-src Induktion wie oben beschrieben untersucht, wurde beobachtet,
dass wenn Zellen zu einer Differenzierung nach der Einführung eines
Volllängen-RANK
Transgens induziert wurden, die Zellen hohe Level an c-src-Aktivität enthielten.
Im Gegensatz dazu, unterscheidet sich die c-src-Aktivität nicht merklich von den Untergrundlevel
in Extrakten von Zellen, die nach Infektion mit entweder einem Kontrollvirus
(der für
lacZ kodiert) oder mit RANK-DNA, welcher die TRAF6 Bindungsdomäne fehlt
(RANK Δ340-421),
ausdifferenzierten. Untergrundlevel wurden unter Verwendung von
RANK-/- Zellen bestimmt, die nicht mit Retrovirus infiziert waren.
-
Ein
Verfahren, um F-Aktinringe nachzuweisen, wurde wie folgt ausgeführt. Primäre hämatopoetische Zellen
von den RANK-/- Mäusen
wurden mit retroviralen Konstrukten infizierte, die entweder für humane
Volllängen-RANK
cDNA oder die RANK/TRAF6 Bindungsmutante (RANK Δ340-421) kodieren. Zellen wurden
auf LabTek Chamber Objektträgern
mit #1 Borsilicat-Abdeckplatten (Nalge/Nunc) kultiviert. Nach Inkubation
für 5 Tage
in MEM, das 10 % fötales
Rinderserum enthielt, das 40 ng/ml CSF-1 und 200 ng/ml mRANK-L enthielt, wurde
das Medium abgesaugt, zweimal in PBS gewaschen und dann in einer
Lösung
aus 3 %igem Paraformaldehyd für
10 Minuten fixiert und im Anschluss daran in 50 mM NH4Cl
abgeschreckt. Die F-Aktinringe wurden durch Anfärben der Zellen mit einer fluoreszenten
Sonde für
Aktin, Phalloidin (Molecular Probes, Eugene, OR), sichtbar gemacht.
Das Fluoreszenzsignal wurde unter Verwendung eines standardmäßigen Fluoreszenzmikroskops
nachgewiesen, und die F-Aktinringe wurden als zusammenhängende Ringe
von F-Aktin in den Außenbereichen
der einzelnen Zellen identifiziert.
-
Die
F-Aktinringe wurden in den Zellen durch Anfärben mit fluoreszierendem Phalloidin
sichtbar gemacht. Bei mit Wildtyp RANK-DNA infizierten Zellen wurden
F-Aktinringe in mehr als 50 % der Zellen nachgewiesen. Wenn die
Zellen jedoch mit der humanen RANK/TRAF6 Bindungsmutante infiziert
worden waren, wiesen alle Zellen eine unorganisierte zytoskelettale
F-Aktin-Struktur auf und es wurden keine F-Aktinringe unterschieden.
-
Um
nach einem Agonisten der RANK-Aktivität zu suchen, wird ein Testmolekül zu dem
Kulturmedium gegeben, während
es dem RANK-L ausgesetzt wird oder nachdem der Differenzierungsschritt
vollständig
ist. Wenn das Testmolekül
ein Agonist der RANK-Aktivität
ist, werden Zellen, die mit der oben beschriebenen Deletionsmutante
infiziert sind, F-Aktinringe exprimieren oder werden eine nachweisbare
c-src-Aktivität
exprimieren oder beides. RANK-Agonisten jedoch, welche die Gegenwart
einer TRAF6 Bindungsstelle in dem RANK-Molekül benötigen, werden in RANK-/- Zellen,
die mit einer RANK TRAF6 Deletionsmutante infiziert sind, nicht
positiv testen.
-
BEISPIEL 9
-
Die
Resorption von Ca3(PO4)2, auf welcher dieses Assay beruht, gilt
als ein Maß für die Osteoklasten-Aktivität. Es wurden
Milzzellen aus 3–6
Wochen alten RANK-/- Mäusen
isoliert und wie in Beispiel 8 beschrieben behandelt, um Zellen
zu entfernen, welche die CD3-, Ter-119- und GR-1-Antigene exprimieren.
Zellen, die keines dieser Antigene exprimieren, wurden geerntet
und wie in Beispiel 8 beschrieben mit retroviralen Vektorpartikeln
infiziert, die Volllängen-
oder Deletionsmutanten der TRAF6-Bindungsstelle von RANK enthielten.
-
Im
Anschluss an die Infektion wurden die Milzzellen geerntet und in
MEM, das 10 % fötales
Rinderserum enthielt, das 40 ng/ml CSF-1 und 200 ng/ml mRANK-L enthielt,
auf 16 Well Quarzobjektträgern
ausplattiert, die mit einem dünnen
Film aus Ca3(PO4)2 beschichtet waren (Osteologic, BD Biosystems).
Nach 5 Tagen in Kultur wurden die Objektträger gewaschen, die Zellen durch
Waschen mit Bleiche entfernt und die Zellen wiederum mit Puffer
gewaschen. Zellen, die mit Volllängen-RANK
infiziert worden waren, resorbieren die Ca3(PO4)2-Matrix, wie durch
eine Vielzahl an klaren Vertiefungen (auch resorptive Lakunen genannt)
bestimmt, die durch Phasenkontrastmikroskopie sichtbar gemacht wurden.
Die Anzahl an Vertiefungen in dem Ca3(PO4)2-Film ist ein Maß für das Ausmaß, in dem
das RANK-L die auf diesem Objektträger gezüchteten Zellen dazu induzierte,
zu Osteoklasten zu differenzieren.
-
Wenn
gewünscht,
kann der Ca3(PO4)2-Film angefärbt werden, unter Verwendung
einer 0,5 %igen Lösung
von Alizarinrot für
4 bis 5 Minuten, gefolgt von Waschen in Wasser. Nach dem Anfärben werden
die resorptiven Lakunen durch Phasenkontrastmikroskopie als ein
klares Gebiet auf einem roten Hintergrund sichtbar gemacht.
-
Zellen,
die unter Verwendung des Volllängen-RANK
Transgens differenziert wurden, enthielten höhere Level an Ca3(PO4)2-Resorption. Während Zellen,
die entweder mit einem Kontrollvirus (kodierend für lacZ) oder
mit dem RANK-Konstrukt, dem die TRAF6 Bindungsdomäne (RANKΔ340-421) fehlt, differenziert
wurden, wiesen unbedeutende Level an Ca3(PO4)2-Resorption auf.
Während
die bevorzugte Ausführungsform
der Erfindung dargestellt und beschrieben wurde, ist zu erkennen,
dass daran verschiedene Veränderungen
durchgeführt
werden können.
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-