DE60129254T2 - Screeningverfahren für agonisten und antagonisten des rezeptoraktivators von nf-kappa b - Google Patents

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Diese Erfindung betrifft Verfahren zum Screening nach Agonisten und/oder Antagonisten für Aktivitäten, die mit dem Rezeptor-Aktivator von NF-κB (RANK) verbunden sind.
  • Hintergrund der Erfindung
  • RANK, ein Akronym für Rezeptor-Aktivator von NF-κB, ist ein Typ I-Transmembranprotein, das ein Mitglied der Superfamilie der Tumornekrosefaktor(TNF)-Rezeptoren ist und das, wenn ausgelöst, den Transkriptionsfaktor NF-κB aktiviert (Anderson et al., Nature 390:175–179 (1997); Anderson et al., U.S. 6,017,729 ). Das humane RANK (616 Aminosäuren) weist ein Signalpeptid (28 Aminosäuren), eine N-terminale extrazelluläre Domäne (184 Aminosäuren), eine kurze Transmembrandomäne (21 Aminosäuren) und eine große C-terminale cytoplasmatische Domäne (383 Aminosäuren) auf, und Maus-RANK ist ähnlich angeordnet (Anderson et al., 1997). Die extrazelluläre Domäne von RANK enthält vier Cystein-reiche Pseudorepeats und zwei N-Glykosylierungsstellen, wobei diese Merkmale für die Mitglieder der TNF-Rezeptor-Superfamilie charakteristisch sind. RANK hat eine 40 %ige Homologie mit CD40 (Anderson et al., 1997), und wird auf T-Zellen, dendritischen Zellen und Osteoklasten exprimiert (Anderson et al., 1997; Hofbauer et al., J Bone Min Res 15:2–12 (2000)).
  • Die cytoplasmatische Domäne von RANK assoziiert intrazellulär mit einigen der mit dem TNF-Rezeptor assoziierten Faktoren (TRAFs; Baker und Reddy, Oncogene 12:1 (1996)) einschließlich TRAF1, TRAF2, TRAF3, TRAF5 und TRAF6 (Galibert et al., J Biol Chem 273:34120–27 (1998)). Diese TRAF-Bindungsstellen sind in zwei unterschiedlichen Domänen im cytoplasmatischen Schwanz von RANK gruppiert. Die TRAFs sind cytoplasmatische Proteine, die oftmals die Signaltransduktion durch Mitglieder der TNF-Rezeptor-Superfamilie vermitteln, und sie sind bei der Regulierung von, zum Beispiel, Immun- und entzündlichen Reaktionen von Bedeutung. RANK vermittelt einige oder alle seiner biologischen Aktivitäten durch eine Kaskade von Ereignissen, welche die TRAF-Bindungsstellen beteiligen (siehe, zum Beispiel, Galibert et al., 1998).
  • Das Auslösen von RANK, wie beispielsweise durch Kontakt mit membrangebundenem oder löslichem RANK-L, führt zu der Stimulierung von RANK-vermittelten zellulären Reaktionen. Diese zellulären Reaktionen können die Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-κB umfassen, einem ubiquitären Transkriptionsfaktor, der in Zellen des Immunsystems weit verbreitet verwendet wird, oder die Aktivierung von Jun-Kinase (JNK; siehe, zum Beispiel, Galibert et al., 1998). RANK-Aktivierung in Vorläuferzellen für Osteoklasten veranlasst die Vorläufermoleküle zu einer Differenzierung zu reifen Osteoklasten. Dieser Differenzierungsprozess geht einher mit der Neuanordnung von Aktin in „F-Aktinringe", einer spezialisierten Struktur, die durch Anfärben nachweisbar ist (Lakkakorpi, P. und Vaananen, J. Bone Min Res 6:817–826 (1991)). Erhöhte Level von c-src Tyrosinkinase-Aktivität geht ebenfalls mit einer RANK-Aktivierung einher (Wong et al. Molecular Cell 4:1041–1049 (1999)). Der RANK-Ligand (RANK-L) ist ein Zelloberflächenprotein, das mit RANK bindet und es aktiviert (Anderson et al., U.S. 6,017,729 ). Dieses Protein ist auch bekannt als TRANCE-, ODF- oder OPG-Ligand (Wong et al., 1999). RANK-L ist ein Transmembranprotein vom Typ 2 und weist eine intrazelluläre Domäne mit etwa 50 Aminosäuren oder weniger, eine Transmembrandomäne und eine extrazelluläre Domäne mit etwa 240 bis 250 Aminosäuren auf. Die extrazelluläre Domäne von RANK-L enthält eine RANK-Bindungsstelle. Ebenso wie andere Mitglieder der TNF-Familie, zu der es gehört, weist RANK-L eine „Spacer"-Region zwischen der Transmembrandomäne und der Rezeptorbindungsdomäne auf, die für die Rezeptorbindung nicht notwendig ist.
  • Im Knochen stimuliert RANK-L die Differenzierung zu Osteoklasten, verstärkt die Aktivität der reifen Osteoklasten und inhibiert die Apoptose der Osteoklasten, wodurch der Pool an aktivierten Osteoklasten ausgedehnt wird (siehe, zum Beispiel, Hsu et al., Proc Nat'l Acad Sci USA. 96:3540–45 (1999)). Osteoklasten sind große, phagozytische, mehrkernige Zellen, die aus hämatopoetischen Vorläuferzellen im Knochenmark gebildet werden. Osteoklasten fördern die Auflösung der Knochenmatrix und die Solubilisierung der Knochensalze und werden für die richtige Entwicklung und das Wachstum von Knochen benötigt.
  • Östrogen inhibiert RANK-L-induzierte Osteoklastendifferenzierung (Shevde et al., J. Bone Min. Res. 14, Suppl. 1, Seite S150 (1999)). Für eine Übersicht siehe Suda et al., Endocrine Reviews 13:66–80 (1992) und Roodman, Endocrine Reviews 17:308–332 (1996).
  • RANK Knock out-Mäuse sind schwer osteopetrotisch und es fehlt ihnen an peripheren Lymphknoten (Dougall et al., Genes Dev. 13:2412–24 (1999)). Als ein Mittel zur Behandlung wurde die Modulierung der RANK- und RANK-L-Aktivität einer Vielzahl von Störungen vorgeschlagen, die Osteopenie oder Osteopetrose beinhalten, einschließlich, zum Beispiel, Osteoporose, Morbus Paget, Hyperkalzämie und so weiter (siehe, zum Beispiel, WO 98/46751 und WO 99/58674 ).
  • RANK und sein Ligand spielen eine wesentliche Rolle bei der Regulierung eines breiten Spektrums an biologischen Systemen, einschließlich der Immunreaktion, der entzündlichen Reaktion und der Knochenremodellierung durch Aktivierung von Osteoklasten. Angesichts der Bedeutung von RANK bei der Regulierung eines breiten Spektrums von biologischen Systemen besteht ein Bedarf an Verfahren zum Screening nach Molekülen, die eine antagonistische oder agonistische Wirkung auf die RANK-Aktivität haben.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zum Screening nach einem Molekül bereit, das eine antagonistische oder agonistische Wirkung auf die RANK-Aktivität hat.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung umfassen Assays für RANK-Agonisten oder -Antagonisten das Kultivieren von RANK-reaktiven Zellen in einem halbfesten Medium in der Gegenwart eines Kandidatenmoleküls und Bestimmen, ob die Geschwindigkeit der Koloniebildung oder die Geschwindigkeit des Koloniewachstums verglichen mit einer Kontrollkultur bei Zellen verstärkt oder vermindert ist, die mit dem Kandidatenmolekül in Kontakt gebracht wurden. In diesem Assay wird ein Kandidatenmolekül als ein RANK-Antagonist identifiziert, wenn die Geschwindigkeit der Koloniebildung oder des Koloniewachstums in den Zellen, die damit in Kontakt gebracht wurden, auch „Testzellen" genannt, erhöht ist, verglichen mit der Geschwindigkeit der Koloniebildung oder des Wachstums in den Kontrollreferenzzellen, die nicht mit dem Kandidatenmolekül in Kontakt gebracht wurden, oder als ein RANK-Agonist, wenn die Geschwindigkeit vergleichsweise vermindert ist. Abgesehen von dem Kontakt mit dem Kandidatenmolekül, werden Kontrollreferenzzellen ansonsten auf die gleiche Weise wie die Testkulturen kultiviert und behandelt.
  • In einem Aspekt der Erfindung ist das verwendete halbfeste Medium Methylcellulose, obwohl weiches Agar, weiche Agarose oder dergleichen auch verwendet werden können.
  • Wenn gewünscht, können die Kandidatenmoleküle für dieses Assay chargenweise zusammengefasst werden. Bei dieser Vorgehensweise wird eine Vielzahl an Kandidatenmolekülen zu einer Testkultur gegeben. Wird eine Modulierung der RANK-Aktivität in solchen Kulturen beobachtet, kann jedes Kandidatenmolekül in dem Batch dann getrennt untersucht und Antagonisten oder Agonisten individuell identifiziert werden.
  • Wenn das Assay mit dem halbfesten Medium verwendet wird, um nach Molekülen zu screenen, die eine antagonistische Wirkung auf die RANK-Aktivität haben, wird RANK in den RANK-reaktiven Zellen bevor, während und/oder nachdem die Testzellen dem Kandidatenmolekül ausgesetzt werden, ausgelöst. Wie hierin verwendet, bezieht sich das Auslösen von RANK auf ein Ereignis, welches das RANK-Protein dazu stimuliert, ein Signal an die Zelle zu transduzieren, in der es exprimiert wird. Zellen, die in diesem ersten Aspekt der Erfindung von Nutzen sind, exprimieren RANK-Protein, sind fähig, Kolonien in einem halbfesten Medium zu bilden, und werden durch die Wirkung von einem oder mehreren Rank-vermittelten zellulären Signalwegen stimuliert, um zu Zelltypen zu differenzieren, die keine Kolonien in halbfestem Medium bilden können.
  • Wenn RANK-Aktivität in RANK-reaktiven Zellen für die erfindungsgemäßen Assays in halbfestem Medium stimuliert werden, umfassen bevorzugte Verfahren zur Stimulierung: die RANK-reaktiven Zellen mit einem RANK-L-Polypeptid in Kontakt zubringen, wie einem RANK-L-Polypeptid, das die Aminosäuren 162–317 von SEQ ID NO:6 oder die Aminosäuren 161–316 von SEQ ID NO:8 enthält; die RANK-reaktiven Zellen mit agonistischen Anti-RANK Antikörpern in Kontakt zu bringen; die RANK-reaktiven Zellen mit einer oder mehreren Zellen in Kontakt zu bringen, die ein RANK-L-Polypeptid exprimieren; RANK in den RANK-reaktiven Zellen zu überexprimieren; und in den RANK-reaktiven Zellen eine mutierte Form von RANK zu exprimieren, die bei normalen Level von RANK-Expression in der Abwesenheit von RANK-L ein RANK-Signalisieren veranlasst. Ein Beispiel für die letztere Art von RANK ist FEO RANK (SEQ ID NOS:9 und 10).
  • Beispiele für RANK-L-Polypeptide zur Stimulierung der RANK-Aktivität umfassen natives RANK-L, wie beispielsweise endogenes RANK-L, das auf der Oberfläche von Zellen exprimiert wird, lösliche Formen von RANK-L, eine Leucin-Zipper-Fusion von RANK-L und eine FLAGTM polyHis-Fusion von RANK-L. Ein weiteres Verfahren zum Stimulieren der RANK-Aktivität für die betreffenden Assays ist, die RANK-reaktiven Zellen mit einem agonistischen Anti-RANK-Antikörper in Kontakt zu bringen. Beispiele für agonistische Anti-RANK-Antikörper für diesen Zweck umfassen M330-Antikörper und M331-Antikörper, die beide gegen humanes RANK gerichtet sind, und M395- und M396-Antikörper, die gegen murines RANK gerichtet sind.
  • In einem Aspekt der Erfindung wird die Geschwindigkeit der Koloniebildung oder des Koloniewachstums in halbfestem Medium durch visuelle Überprüfung der Platten bestimmt, nachdem die Zellen dem Kandidatenmolekül ausgesetzt worden sind. Die Anzahl an Kolonien oder die Größen der beobachteten Kolonien wird bei Platten verglichen, die dem Kandidatenmolekül ausgesetzt waren, und gleichartigen Kulturen, die den Kandidatenmolekülen nicht ausgesetzt waren.
  • Ein Mittel, die RANK-reaktiven Zellen mit einem Kandidatenmolekül in Kontakt zu bringen, umfasst die Einführung eines DNA-Moleküls in die Testzellen, das entweder ein Kandidatennucleinsäuremolekül kodiert oder ein Kandidatenproteinmolekül kodiert. Zum Beispiel kann die eingeführte DNA ein cDNA-Molekül sein, das ein einzelnes Protein kodiert, oder eine cDNA-Bibliothek, die eine zu testende Gruppe von Proteinen kodiert. Nachdem sie in die Zellen eingeführt wurde, kann diese DNA in das Genom der RANK-reaktiven Zellen integriert werden oder nicht. Techniken für stabile Transfektion und transiente Transfektion sind bekannt und beide Arten von Techniken können verwendet werden. In einigen Beispielen ist das kodierte Kandidatenmolekül ein Nucleinsäuremolekül wie ein Antisense-Oligonucleotid oder eine RNA mit Ribozymaktivität. In einem Aspekt der Erfindung werden cDNAs, bei denen eine Kodierung für einen RANK-Agonisten oder -Antagonisten nachgewiesen wurde, aus den Kolonien der Testzellen, die in dem halbfesten Medium gezogen wurden, isoliert und gereinigt.
  • Andere Mittel, die RANK-reaktiven Zellen mit Kandidatenmolekülen in Kontakt zu bringen, umfasst die Zugabe des Kandidatenmoleküls direkt zu dem halbfesten Medium, entweder durch Mischen derselben mit dem Medium vor dem Ausgießen auf die Platten oder durch Überschichten der gegossenen Platten mit einer Schicht aus dem das Kandidatenmolekül enthaltenden Medium. Zum Beispiel können die vorgenannten Verfahren verwendet werden, wenn das Kandidatenmolekül ein Protein oder ein kleines organisches Molekül ist. Wenn gewünscht, kann eine Vielzahl von Proteinen oder anderen Testmolekülen zu den Testkulturen gegeben werden.
  • In einem Aspekt der Erfindung werden RANK-reaktive Zellen eingesetzt, die ein defektes RANK-Molekül exprimieren, und das Screening erfolgt nach einem Agonisten, der dieses defekte RANK-Molekül komplementiert. Ein Beispiel für ein defektes RANK für diesen Zweck ist humanes RANKΔ340-42.
  • Geeignete RANK-reaktive Zellen für die oben beschriebenen Assays umfassen primäre hämatopoetische Zellen, einschließlich hämatopoetische Vorläuferzellen, die aus dem Knochenmark, der Milz, der fötalen Leber oder peripherem Blut gewonnen werden, sowie primäre hämatopoetische Zellen, die aus dem Knochenmark, der Milz, der fötalen Leber oder peripherem Blut gewonnen und mit Vorläufer für Osteoklasten angereichert wurden. In weiteren Aspekten der Erfindung sind die RANK-reaktiven Zellen eine Zelllinie. Geeignete Zelllinien umfassen RAW 264.7-Zellen, C7-Zellen und BCL-XI/Tag-Zellen.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung nutzt die Fähigkeit von Promotorsequenzen, die aus dem Gen der Tartrat-resistenten sauren Phosphatase (TRAP) (SEQ ID NO: 12) oder dem MMP-9-Gen (SEQ ID NO:11) erhalten werden, um direkt auf die Signaltransduktion zu reagieren, die eine Folge der Auslösung von RANK ist. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der MMP-9-Promotor die Nucleotide 1769–3591 von SEQ ID NO:11. Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zum Screening nach einem RANK-Agonisten oder -Antagonisten durch die Verwendung von rekombinanten DNA-Konstrukten bereit, in denen ein TRAP- oder MMP-9-Promotor funktionell mit einem Nucleinsäuremolekül verknüpft ist, das für ein Reporterprotein kodiert. Reporterproteine, die für diesen Zweck geeignet sind, umfassen, zum Beispiel, Luciferase, β-Galactosidase, Grün fluoreszierendes Protein, alkalische Phosphatase oder ein heterologes Oberflächenprotein, das durch Antikörperbindungsverfahren nachgewiesen werden kann. Beispiele für letzteres umfassen den humanen IL-2-Rezeptor, den murinen IL-4-Rezeptor, das humane CD2-Protein, das humane CD4-Protein und das humane CD8-Protein.
  • Für diese Assays wird ein Reporter/Promotor-Konstrukt, wie es hierin beschrieben wurde, in die kultivierten RANK-reaktiven Zellen eingeführt. Geeignete RANK-reaktive Zellen umfassen hämatopoetische Zellen. Beispiele für geeignete hämatopoetische Zellen umfassen RAW 264.7-Zellen. Um diese Vorgehensweise zum Screening nach einem RANK-Antagonisten zu verwenden, werden die Konstrukte in die Testzellen eingeführt, die dann mit einem Agonisten für eine RANK-Aktivität behandelt werden, wie beispielsweise löslichem RANK-L, das RANK in den Zellen auslöst und dadurch die Promotoraktivität in dem Konstrukt auslöst, was zur Expression des Reportergens führt. Kandidatenmoleküle für den Antagonisten werden mit den ausgelösten Zellen in Kontakt gebracht, um deren Fähigkeit zu untersuchen, diese RANK-vermittelte Expression von Reportergen zu unterdrücken. Die Testzellen werden mit dem Kandidatenanatagonisten vor, während oder nach dem RANK-Auslosungsschritt in Kontakt gebracht.
  • Kandidatenmoleküle können, zum Beispiel, zu dem Kulturmedium gegeben werden. In einer Ausführungsform der Erfindung ist das Kandidatenmolekül ein Protein; in einer weiteren Ausführungsform ist es ein kleines organisches Molekül.
  • In einem Aspekt der Erfindung ist das Kandidatenmolekül ein Protein oder eine Gruppe von Proteinen, die durch cDNA kodiert wird, die in die Testzellen eingeführt wurde, bevor die Zellen dem Auslösen von RANK ausgesetzt wurden. Im Allgemeinen wird die cDNA mindestens 48 Stunden vor dem Auslösen von RANK eingeführt. Die cDNA kann aus Zellen isoliert werden, die einen veränderten Level an Reportergenexpression aufweisen.
  • Geeignete Verfahren zum Auslösen von RANK in den Assays mit den oben beschriebenen Reporter/Promotor-Konstrukten umfassen, die Testzellen Zellen auszusetzen, die RANK-L auf ihrer Oberfläche exprimieren, die Testzellen löslichem RANK auszusetzen, RANK in den Testzellen zu überexprimieren, humanes RANKΔ340-42 in den Testzellen zu exprimieren oder die Testzellen einem agonistischen Antikörper auszusetzen, der für das RANK-Protein spezifisch ist. In einem Aspekt der Erfindung wird RANK in den RANK-reaktiven Zellen ausgelöst, indem diese mit einem RANK-L-Polypeptid in Kontakt gebracht werden, das Aminosäuren 162–317 von SEQ ID NO:6 oder Aminosäuren 161–316 von SEQ ID NO:8 umfasst.
  • Testzellen, in denen RANK ausgelöst wurde, werden mit dem Kandidatenmolekül in Kontakt gebracht und die Zellen werden anschließend analysiert, um zu bestimmen, ob der Level an Reporterproteinexpression als Folge dieses Kontakts verstärkt oder vermindert ist. Der Level an Reporterexpression wird durch jedes beliebig geeignete Assay bestimmt, wie beispielsweise einem auf Fluoreszenz basierenden Assay, einem kolorimetrischen Assay, einem Festphasenassay oder Assays, die eine radioaktive Verbindung einsetzen. Ein Mittel zur Bestimmung des Levels an Reportergenprodukt ist die Verwendung von herkömmlichen Verfahren, um durch auf Fluoreszenz basierender Durchflusscytometrie solche Zellen physikalisch zu isolieren, die das Reportermolekül exprimieren. Verstärkung oder Verminderung der Reporterproteinexpression in den Testzellen wird durch Vergleichen des Levels an Reporterproteinexpression in den Testzellen mit dem Expressionslevel in Kontrollkulturen bestimmt, die nicht mit dem Kandidatenmolekül in Kontakt gebracht wurden. Wenn das Kandidatenmolekül ein RANK-Antagonist ist, wird der Level an Reporterexpression vergleichsweise vermindert sein.
  • Die oben beschriebenen Konstrukte werden auch zum Screenen nach RANK-Agonisten verwendet. In diesem Fall wird RANK in den Testzellen nicht absichtlich ausgelöst, sondern das Kandidatenmolekül wird eher auf seine Fähigkeit hin untersucht, RANK auszulösen. Zellen, die in diesem Aspekt der Erfindung von Nutzen sind, exprimieren RANK-Protein und enthalten mindestens einen Signaltransduktionsweg, der durch die Aktivierung von RANK stimuliert wird. In einigen Fällen wird der Agonist mit den Zellen in Kontakt gebracht, indem in die Zellen eine cDNA eingeführt wird, die für einen Agonisten des Kandidatenproteins kodiert, oder indem eine cDNA-Bibliothek eingeführt wird, die für eine Vielzahl an Agonisten des Kandidatenproteins kodiert. In solchen Fällen kann ein Agonist durch Gewinnung und Reinigung der cDNA aus solchen Kolonien isoliert werden, die verstärkte Expression von Reportergen aufweisen. Weiterhin kann gezeigt werden, unter Verwendung von herkömmlichen Techniken, dass das gereinigte Kandidatenmolekül tatsächlich mit RANK wechselwirkt.
  • In einem Aspekt der Erfindung werden die Reporter/Promotor-Konstrukte verwendet, um RANK-Agonisten zu identifizieren, indem Zellen verwendet werden, die ein defektes RANK-Molekül exprimieren, und das Screening ist für einen Agonisten, der dieses defekte RANK-Molekül komplementiert. Zum Beispiel können Zellen, die humanes RANKΔ340-42 exprimieren, für diesen Zweck verwendet werden.
  • In einem weiteren Aspekt der Erfindung umfasst das Screening nach Antagonisten oder Agonisten für die RANK-Aktivität, ein Kandidatenmolekül mit RANK-reaktiven Zellen in Kontakt zu bringen, die in der Lage sind, als Reaktion auf das Auslösen von RANK zu Osteoklasten zu differenzieren. Um nach RANK-Antagonisten zu screenen, löst man RANK in den Zellen aus, setzt die Zellen dem Kandidatenantagonisten aus und beobachtet den Level der c-src-Aktivität oder F-Aktin-Bildung im Vergleich zu dem Level an c-src-Aktivität oder F-Aktin-Bildung in Bezug auf RANK-reaktive Zellen, die nicht mit dem Kandidatenmolekül in Kontakt gebracht wurden. Wenn der Kandidat ein Antagonist ist, wird die Geschwindigkeit der c-src-Aktivität und F-Aktinringbildung vergleichsweise vermindert sein. Wenn der Kandidat nach einer RANK-Agonistaktivität gescreent werden soll, wird der Schritt des RANK-Auslösens ausgelassen, und ein positives Ergebnis wird aus der Beobachtung in einer verstärkten c-src-Aktivierung und F-Aktinbildung bestehen.
  • In noch einem weiteren Aspekt der Erfindung werden Kandidaten für RANK-Agonisten oder -Antagonisten gescreent, indem ein Kandidatenmolekül mit RANK-reaktiven Zellen in Kontakt gebracht wird, die in der Lage sind, als Reaktion auf das Auslösen von RANK in diesen Zellen zu Osteoklasten zu differenzieren, RANK in den Zellen ausgelöst wird und anschließend die Zellen auf einem Film aus Ca3(PO4)2 kultiviert werden. Differenzierte Osteoklasten werden das Ca3(PO4)2 in ihrer direkten Nachbarschaft resorbieren, und so eine Vertiefung in dem Film erzeugen. Dann werden die Anzahl der Vertiefungen in dem Film verglichen, die durch die kultivierten Zellen verursacht werden, die in Kontakt gebracht wurden, mit der Anzahl an Vertiefungen, die in einem gleichartigen Film mit Bezug auf RANK-reaktive Zellen verursacht werden, in denen RANK ausgelöst wird, die aber nicht mit dem Kandidatenmolekül in Kontakt gebracht wurden. Man kann dann ein Kandidatenmolekül als einen RANK-Agonisten identifizieren, wenn eine größere Anzahl an Vertiefungen durch die mit Kandidatenmolekül behandelten Zellen verursacht wird, als durch die Referenzzellen, und als ein RANK-Antagonisten, wenn die Anzahl an Vertiefungen, die durch die behandelten Zellen verursacht werden, geringer ist, als die Anzahl, die durch die Kontrollzellen verursacht wird.
  • Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform
  • Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zum Screening nach einem Molekül bereit, das eine antagonistische oder agonistische Wirkung auf die RANK-Aktivität hat. Obwohl verschiedene Assays zum Nachweis von Antagonisten und Agonisten von RANK auf dem Fachgebiet bekannt sind (siehe, zum Beispiel, U.S. 6,017,729 ), sind die hierin beschriebenen Screening-Strategien bisher noch nicht beschrieben worden.
  • Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „RANK-Agonist" oder grammatikalische Äquivalente davon auf ein Molekül, das die RANK-Aktivität stimuliert, einschließlich eines Moleküls, das RANK auslöst. Ein RANK-Agonist kann direkt mit RANK wechselwirken oder er kann die RANK-Aktivität indirekt verstärken. RANK-L, zum Beispiel, könnte als ein RANK-Agonist betrachtet werden. Ebenso wirken Antikörper, die spezifisch RANK binden, oftmals als Agonisten für die RANK-Aktivität.
  • Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „RANK-Antagonist" oder grammatikalische Äquivalente davon auf ein Molekül, das die RANK-Aktivität inhibiert. Ein RANK-Antagonist kann direkt oder indirekt mit RANK Wechselwirken. RANK:Fc (beschrieben in U.S. 6,017,729 ) und Osteoprotegerin (beschrieben in U.S. 6,015,938) sind Beispiele für RANK-Antagonisten, wobei ersteres ein Fusionsprotein ist, das die extrazelluläre Domäne von RANK fusioniert mit der Fc-Region von Immunglobulin enthält, und letzteres ein natürlich vorkommendes Protein ist. Diese beiden Proteine haben eine antagonistische Wirkung auf RANK durch Bindung von RANK-L, wodurch das RANK-L an einer Bindung mit RANK-reaktiven Zellen gehindert wird.
  • Der Begriff „RANK", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf ein Protein mit der Fähigkeit NF-κB zu aktivieren oder die Fähigkeit, mit TRAF1, TRAF2, TRAF3, TRAF5 oder TRAF6 zu binden, und mit einer mindestens 80 %igen Aminosäure-Identität mit der in SEQ ID NO:2 oder SEQ ID NO:4 gezeigten Aminosäuresequenz. Erfindungsgemäße RANK-Proteine sind in der Lage, mit Antikörpern zu binden, die spezifisch an ein Protein zu binden, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2 oder SEQ ID NO:4 aufweist.
  • Der Begriff „RANK-L" ist ein Akronym für RANK-Ligand, welcher ein Transmembranprotein vom Typ 2 ist, das an RANK bindet und es aktiviert. Die Sequenzen der beiden Nucleinsäuremoleküle, die für charakteristische RANK-L-Proteine kodieren, sind in SEQ ID NO:5 (humanes RANK-L) und SEQ ID NO:7 (murines RANK-L) dargelegt, und die Sequenzen der RANK-L-Proteine, die durch diese beiden Nucleinsäuresequenzen kodiert werden, sind in SEQ ID NO:6 bzw. SEQ ID NO:8 dargelegt. Es versteht sich, dass „RANK-L", wie es hier verwendet wird, sowohl Volllängen-RANK-L-Proteine sowie membrangebundene oder lösliche Formen des RANK-L-Proteins umfasst, einschließlich chimärer Moleküle, die Teile von RANK-L enthalten, und multimerer RANK-L-Moleküle.
  • RANK und RANK-L sind an der Kontrolle der Bildung von reifen Osteoklasten beteiligt, dem primären Zelltyp, der an der Knochenresorption beteiligt ist. Eine Steigerung der Geschwindigkeit der Knochenresorption (über die der Knochenbildung hinaus) kann zu verschiedenen Knochenstörungen führen, die zusammengefasst als Osteopenien bezeichnet werden und Osteoporose, Osteomyelitis, Hyperkalzämie, durch Chirurgie oder Steroidverabreichung verursachte Osteopenie, Morbus Paget, Osteonekrose, Verlust an Knochensubstanz aufgrund von rheumatoider Arthritis, periodontalen Verlust an Knochensubstanz, prothetischen Verlust oder Lockerwerden und osteolytische Metastasierung umfassen. Agonisten und Antagonisten für RANK können verwendet werden, um die Bildung von Osteoklasten zu modulieren und können Patienten verabreicht werden, die an Knochenstörungen leiden, um diese Zustände zu verbessern.
  • Weiterhin metastasieren viele Krebsarten in den Knochen und verursachen einen Zusammenbruch des Knochens durch lokale Unterbrechung der normalen Knochenwiederherstellung. Solche Krebsarten können mit einer erhöhten Anzahl an Osteoklasten und erhöhten Mengen an osteoklastischer Knochenresorption einhergehen, was zu Hyperkalzämie führt (siehe, zum Beispiel, Guise et al. Endocrine Reviews, 19(1): 18–54, 1998.). Andere Krebsarten metastasieren nicht notwendigerweise in den Knochen, führen aber zu Hyperkalzämie und Knochenverlust (z. B., Plattenepithelkarzinome). Agonisten und Antagonisten von RANK können Patienten verabreicht werden, die an Krebs leiden, um dessen Symptome zu lindern, einschließlich, aber nicht beschränkt auf solche, die an Brustkrebs, multiplem Myelom, Melanomen, Lungenkrebs, Prostata-, hämatologischem, Kopf- und Hals- und Nierenkrebs leiden. Antagonisten der RANK/RANK-L-Wechselwirkung sind insbesondere für die Behandlung von Krebs von Nutzen.
  • Außerdem können durch die vorliegenden Screening-Assays identifizierte RANK-Antagonisten oder -Agonisten verwendet werden, um kardiovaskuläre Erkrankungen oder andere Zustände, die durch arterielle Verkalkung gekennzeichnet sind, zu verhindern oder zu behandeln. Ebenso sind die hierin identifizierten Antagonisten und Agonisten von RANK bei der Behandlung von Immunerkrankungen und/oder entzündlichen Erkrankungen, wie beispielsweise toxischem oder septischem Schock oder Transplantat-gegen-Empfänger-Reaktionen (wie beispielsweise über die Inhibierung der NF-PB-Aktivierung) von Nutzen. Da das Auslösen von RANK die T-Zell-Aktivierung stimuliert, sind die hierin identifizierten RANK-Agonisten als Adjuvanzien beim Impfen von Nutzen.
  • Tumorzellen reagieren stärker auf Strahlung, wenn ihr NF-κB blockiert ist; daher werden Antagonisten der RANK-Signalgebung als eine Kombinationstherapie für Erkrankungen von Nutzen sein, die durch neoplastische Zellen gekennzeichnet sind, die RANK exprimieren. Umgekehrt werden Agonisten für RANK bei der Stimulierung von RANK-vermittelten zellulären Reaktionen von Nutzen sein und bestimmte RANK-Agonisten können in der Lage sein, inaktive RANK-Mutanten zu komplementieren.
  • Kandidatenmoleküle, die auf RANK-Agonist- oder -Antagonistaktivität untersucht werden sollen:
  • Beispiele für Kandidatenmoleküle, hierin auch als „Testmoleküle" bezeichnet, die auf RANK-Agonist- oder -Antagonistaktivität untersucht werden sollen, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Kohlenhydrate, kleine Moleküle (gewöhnlich organische Moleküle oder Peptide), Proteine und Nucleinsäuremoleküle (einschließlich Oligonucleotidfragmenten, die typischerweise aus 8 bis 30 Nucleinsäureresten bestehen). Zu untersuchende Peptide bestehen typischerweise aus 5 bis 25 Aminosäureresten. Weiterhin können Nucleinsäuremolekülkandidaten Antisense-Nucleinsäuresequenzen sein und/oder können Ribozymaktivität besitzen. Wenn gewünscht, können Antisense- oder Ribozym-RNAs in eine Zielzelle durch Mittel zur Einführung eines DNA-Moleküls in die Zellen eingeführt werden, das für die Antisense- oder Ribozym-RNA kodiert.
  • Kleine Moleküle, die unter Verwendung der hier beschriebenen Screening-Assays gescreent werden sollen, können einem Patienten, der diese benötigt, typischerweise oral oder durch Injektion verabreicht werden. Kleine Moleküle, die oral verabreicht werden können, sind besonders bevorzugt. Die erfindungsgemäßen kleinen Moleküle werden vorzugsweise nicht toxisch sein in den Dosen, die benötigt werden, damit sie als pharmazeutische Mittel wirksam sind, und sie unterliegen vorzugsweise nicht einem schnellen Verlust an Aktivität im Körper, wie beispielsweise einem Verlust an Aktivität, der aus schnellem enzymatischem oder chemischem Abbau folgen kann. Außerdem sind pharmazeutisch nützliche kleine Moleküle vorzugsweise nicht immunogen.
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren können verwendet werden, um nach Antisense-Molekülen zu screenen, die RANK-Aktivität durch Stören der funktionalen Expression von einem oder mehreren mRNA-Molekülen inhibieren, die ein oder mehrere Proteine kodieren, welche eine RANK-abhängige zelluläre Reaktion vermitteln. Ein Antisense-Nucleinsäuremolekül ist komplementär zu einem Nucleinsäureziel, das innerhalb der Wirtszelle exprimiert wird, und durch Bildung von Doppelsträngen mit dem Ziel hindern sie das Ziel so an seiner Funktion. Antisense-Nucleinsäuren können die Transkription eines Zielgens durch Doppelstrangbildung mit jedem der beiden Stränge der DNA verhindern, die das Gen kodieren, oder durch Doppelstrangbildung mit einem regulierenden Element, das die Expression des Zielgens kontrolliert. Alternativ können sie mit einer mRNA einen Doppelstrang bilden und so seine Translation behindern oder blockieren. Ein Antisense-Nucleinsäuremolekül kann auf eine Anzahl an verschiedenen Wegen konstruiert werden, unter der Voraussetzung, dass es in der Lage ist, die Expression eines Zielgens zu stören. Typische, zu screenende Antisense-Oligonucleotide haben vorzugsweise eine Länge von 20–50 Nucleotiden und mehr bevorzugt eine Länge von 30–40 Nucleotiden. Das Antisense-Nucleinsäuremolekül wird im Allgemeinen im Wesentlichen identisch in seiner Nucleotidsequenz mit einem Strang des Zielgens sein. Die minimale Identität wird typischerweise größer als etwa 65 % sein, aber eine höhere Identität kann eine wirksamere Unterdrückung der Expression der endogenen Sequenzen ausüben. Eine wesentlich größere Identität von mehr als etwa 80 % ist bevorzugt, obwohl etwa 95 % bis absolute Identität am meisten bevorzugt ist.
  • Kandidaten für das Nucleinsäuremolekül können Ribozymaktivität besitzen. So können die erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, um nach Ribozym-Molekülen zu screenen, welche die funktionale Expression von einem oder mehreren mRNA-Molekülen inhibieren, die für ein oder mehrere Proteine kodieren, welche eine RANK-abhängige zelluläre Reaktion vermitteln. Ribozyme sind katalytische RNA-Moleküle, welche Nucleinsäuremoleküle mit einer Sequenz, die vollständig oder teilweise zu der Sequenz des Ribozyms homolog ist, spalten können. Es ist möglich, Ribozym-Transgene zu entwerfen, die für RNA-Ribozyme kodieren, die sich spezifisch mit einer Ziel-RNA paaren und das Phosphodiester-Grundgerüst an einer spezifischen Stelle spalten, wodurch die Ziel-RNA funktional inaktiviert wird. Indem diese Spaltung ausgeführt wird, wird das Ribozym selbst nicht verändert und ist so in der Lage, weiter andere Ziel-RNA-Moleküle zu spalten. Der Einschluss von Ribozymsequenzen in die Antisense-RNAs überträgt auf diese RNA-Spaltungsaktivität, wodurch die Aktivität der Antisense-Konstrukte erhöht wird.
  • Das Design und die Verwendung von für die Ziel-RNA spezifischen Ribozymen wird beschrieben in Haseloff et al. (Nature, 334: 585–591 (1988)) (siehe auch U.S. Patent Nr. 5,646,023 ); beide Veröffentlichungen sind durch Bezugnahme hier aufgenommen. Tabler et al. (Gene 108:175 (1991)) haben die Konstruktion von katalytischen RNAs stark vereinfacht, indem sie die Vorteile der Antisense-RNA und der Ribozym-Technologien in einem einzigen Konstrukt vereinigt haben. Für Ribozymkatalyse werden kleinere Regionen mit Homologie benötigt; daher kann dies die Unterdrückung von verschiedenen Mitgliedern einer großen Genfamilie fördern, wenn die Spaltungsstellen konserviert werden.
  • RANK- und RANK-L-Moleküle
  • Im Allgemeinen umfassen die hier beschriebenen Screening-Assays ein RANK- oder ein RANK-L-Protein.
  • RANK und sein Bindungspartner RANK-L und Nucleinsäuren, die diese Proteine kodieren, sind auf dem Fachgebiet bekannt und wurden wohl charakterisiert mit Bezug auf ihre physikalischen Eigenschaften, ihrer Anlage innerhalb der Zelle und mit Bezug auf viele der biologischen Aktivitäten, die mit der Bindung von RANK und RANK-L einhergehen. Beispiele für murines und/oder humanes RANK und auch Beispiele für murines und/oder humanes RANK-L werden in U.S. 6,017,729 , U.S. 5,843,678 (die "Osteoprotegerin-bindendes Protein" offenbaren, welches hier als murines RANK-L beschrieben wird), WO 98/25958 (das „488E9" offenbart, welches hier als murines RANK-L beschrieben wird); WO 98/44751 (das murines „ODAR" offenbart, hier als murines RANK bezeichnet); und EP 0 911 342 (das ein „OCIF-bindendes Molekül" offenbart, hier als murines RANK-L bezeichnet) offenbart. Andere haben RANK-L beschrieben und es als „TRANCE" bezeichnet (siehe, zum Beispiel, Wong et al., Molec Cell 4:1041–49 (1999)). Jegliches dieser RANK- und RANK-L-Moleküle kann in den hier beschriebenen Assays verwendet werden.
  • Die Sequenzen von zwei Nucleinsäuremolekülen, die für charakteristische RANK-Proteine kodieren, sind in SEQ ID NO:1 (humanes RANK) und SEQ ID NO:3 (murines RANK) dargelegt, und die durch diese Nucleinsäuremoleküle kodierten Aminosäuresequenzen sind jeweils in SEQ ID NOS:2 und 4 dargelegt. Die Sequenzen von beispielhaften humanen und Maus-RANK-L-Sequenzen sind in SEQ ID NOS:6 und 8 gezeigt, und Nucleinsäuren, die für diese Proteine kodieren, in SEQ ID NOS:5 und 7. Es versteht sich jedoch, dass andere RANK- und RANK-L-Varianten außer den in diesen Beispielen gezeigten in den hier offenbarten Assays verwendet werden können, einschließlich anderer im Fachgebiet bekannter RANK- und RANK-L-Moleküle oder Varianten mit Aminosäure-Unterschieden, welche weder die Bindung von RANK an RANK-L beeinflussen noch das Auslösen von RANK, das normalerweise eine Folge dieser Bindung ist.
  • Sequenzvarianten von nativen RANK- und RANK-L-Polypeptiden sind in der Ausführung der vorliegenden Erfindung in solchen Fällen von Nutzen, in denen das native RANK- oder RANK-L-Polypeptid verwendet wird, unter der Voraussetzung, dass die Variante jegliche biologische Aktivität besitzt, die für das Assay erforderlich ist. Allgemein gilt für diese Assays, dass geeignete RANK-Varianten RANK-L binden werden und dadurch RANK-Aktivität stimulieren und dass geeignete RANK-1-Varianten an RANK binden werden und dadurch RANK-Aktivität stimulieren. In solchen Varianten vorkommende Mutationen können, zum Beispiel, Substitutionen, Deletionen und Insertionen von Aminosäuren umfassen. Allele Formen oder mutierte Formen von RANK und RANK-L können für die Verwendung in diesen Assays erhalten werden, in dem eine Vielzahl von auf dem Fachgebiet bekannten Techniken eingesetzt werden, einschließlich, zum Beispiel, ortsgerichtete Mutagenese, Oligonucleotid-gerichtete Mutagenese und so weiter.
  • RANK-Moleküle, die für die offenbarten Verfahren von Nutzen sind, umfassen Wildtyp-RANK sowie variante Formen von RANK. Die Varianten können sich in der Aminosäuresequenz von den RANK-Molekülen von SEQ ID NOS:2 oder 4 unterscheiden, werden jedoch ihre Fähigkeit beibehalten, mindestens eines der biologischen Signale zu übermitteln, die mit dem Auslösen von Wildtyp-RANK verbunden sind, wie beispielsweise Aktivierung von NF-κB. Geeignete Varianten umfassen natürlich vorkommende allele Varianten, mutierte Formen von RANK (wie beispielsweise FEO RANK) oder Varianten, die unter Verwendung von rekombinanten DNA-Techniken konstruiert wurden.
  • RANK-L-Proteine, einschließlich löslicher Formen von RANK-L, die für das Auslösen von RANK von Nutzen sind, werden die RANK-Bindungsdomäne enthalten, die in der extrazellulären Region des Moleküls enthalten ist. Für humanes RANK-L umfasst die extrazelluläre Domäne etwa 249 Aminosäuren am Carboxyende des Proteins (Aminosäuren 69 bis 317 von SEQ ID NO:6), und für Maus-RANK-L umfasst sie etwa 247 Aminosäuren am Carboxyterminus des Proteins (Aminosäuren 70–316 von SEQ ID NO:8). Lösliches RANK-L zum Auslösen von RANK kann die gesamte extrazelluläre Region enthalten oder kann nur den Teil von RANK-L enthalten, der die RANK-Bindungsdomäne enthält, die für humanes RANK-L in einem Fragment mit den Aminosäuren 69 bis 317 von SEQ ID NO:6 gefunden wird, oder mehr bevorzugt mit den Aminosäuren 162–317 von SEQ ID NO:6, oder für murines RANK-L in einem Fragment mit den Aminosäuren 70 bis 316 von SEQ ID NO:8, oder mehr bevorzugt mit den Aminosäuren 161–316 von SEQ ID NO:8.
  • Lösliches RANK-L zum Auslösen von RANK kann weiterhin ein Signalpeptid enthalten, das die Sekretion des löslichen Proteins steuert, und kann weiterhin auch ein zweites Polypeptid enthalten, wie, zum Beispiel, ein Polypeptid, das, wenn es anwesend ist, die Oligomerisierung des löslichen RANK-L-Fusionsproteins stimulieren wird. RANK-L-Fragmente für die Konstruktion von löslichen RANK-Ls können unter Verwendung bekannter Rekombinationstechniken hergestellt werden, um einen gewünschten Teil der extrazellulären Region zu isolieren. Verschiedene RANK-L-Derivate zum Auslösen von RANK umfassen kovalente oder aggregative Konjugate der Proteine oder deren Fragmente mit anderen Proteinen oder Polypeptiden, wie beispielsweise durch Synthese in rekombinanter Kultur als N-terminale oder C-terminale Fusionen. Zum Beispiel kann das konjugierte Peptid eine Signal- (oder Leader-) Polypeptidsequenz an der N-terminalen Region des Proteins sein, die cotranslational oder posttranslational den Transfer des Proteins von seinem Herstellungsort an seinen Funktionsort außerhalb der Zellmembran oder -wand steuert (z. B. den Hefe α-Faktor-Leader). Alternativ kann RANK-L in einigen Fällen mit einem poly-His- oder FLAG®-Tag konjugiert werden, wie in U.S. 6,017,729 beschrieben.
  • Wenn RANK-L zum Auslösen von RANK verwendet wird, wird das RANK-L im Allgemeinen aus der gleichen Spezies gewonnen (zum Beispiel, Mensch), aus der das RANK gewonnen wurde. Jedoch ist Maus-RANK-L in der Lage humanes RANK auszulösen und humanes RANK-L ist in der Lage, Maus-RANK auszulösen.
  • RANK-Proteine, die in der Ausführung der vorliegenden Erfindung von Nutzen sind, haben typischerweise eine Aminosäuresequenz, die zu mindestens 80 % identisch oder zu mindestens 85 % identisch oder vorzugsweise mindestens zu 90 % identisch ist mit der gesamten oder einem Teil der nativen RANK-Aminosäuresequenzen, die in SEQ ID NOS:2 oder 4 dargelegt sind. RANK-L-Proteine, die in der Ausführung der vorliegenden Erfindung von Nutzen sind, haben typischerweise eine Aminosäuresequenz, die zu mindestens 80 % identisch oder zu mindestens 85 % identisch oder vorzugsweise zu mindestens 90 % identisch ist mit der gesamten oder einem Teil der nativen RANK- L-Aminosäuresequenzen, die in SEQ ID NOS:6 oder 8 dargelegt sind. Die erfindungsgemäßen RANK-Proteine sind, wenn ausgelöst, in der Lage, NF-κB-Aktivitat zu aktivieren.
  • Die Prozentidentität wird wie folgt bestimmt. Die Identität der Aminosäuresequenz ist definiert als der Prozentsatz an Aminosäureresten, die in SEQ ID NOS:2, 4, 6 oder 8 dargelegt sind, der mit einem Teil oder allen einer weiteren Proteinsequenz identisch sind (welche Teil einer größeren Proteinsequenz sein kann), nach Alignment der Sequenzen und Einführung von Lücken, wenn erforderlich, um eine maximale Prozentidentität zu erreichen. Um Aminosäuresequenzen von ungleicher Länge zu vergleichen, wird die Prozentidentität auf der Grundlage der kleineren der beiden Sequenzen berechnet. Prozentidentität kann unter Verwendung eines Computerprogramms bestimmt werden, zum Beispiel, dem GAP-Computerprogramm, das von Devereux et al. (Nucl. Acids Res 12:387, 1984) beschrieben wurde, das von der University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG) erhältlich ist, oder jegliches andere geeignete Computerprogramm, das in der Lage ist, zwei oder mehr Aminosäuresequenzen anzuordnen und zu vergleichen. Bei Verwendung des GAP-Programms umfassen die bevorzugten vorgegebenen Parameter für die Ausführung des Vergleichs: (1) eine unäre Vergleichsmatrix (enthaltend einen Wert von 1 für Identitäten und 0 für Nicht-Identitäten) für Aminosäuren und die gewichtete Vergleichsmatrix von Gribskov und Burgess, Nucl. Acids Res. 14:6145, 1986, wie von Schwartz und Dayhoff, Hrgs., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353–358, 1979 beschrieben; (2) eine Strafe von 3,0 für jede Lücke und eine zusätzliche 0,10 Strafe für jedes Symbol in jeder Lücke, und (3) keine Strafe für Endlücken. Ein weiteres für die Bestimmung der Prozentidentität nützliches Programm ist das BESTFIT-Programm, das auch von der University of Wisconsin als Teil des GCG-Computerpakets erhältlich ist. Vorgegebene Parameter für die Verwendung des BESTFIT-Programms sind die gleichen, wie oben für die Verwendung des GAP-Programms beschriebenen.
  • Einige Ausführungsformen der Erfindung setzen mutierte Formen des RANK-Proteins ein. Ein Beispiel für diese Art von RANK-Mutante ist die mutierte Form von RANK, die aus Patienten isoliert wurde, die einen Zustand aufweisen, der als „familiäre expansile Osteolyse" (FEO) bekannt ist, der eine seltene autosomal dominante Knochendysplasie mit Ähnlichkeit zur Morbus Paget am Knochen ist. Diese Erkrankungen sind durch scharf begrenzte Gebiete von erhöhter Knochenremodellierung gekennzeichnet, die zu Deformation und Invalidität führen. Das FEO-Gen und das Gen, das mit der familiären Morbus Paget am Knochen verbunden ist, ist dem Chromosom 18q21 zugeordnet, was der gleiche Ort ist, der das RANK-Gen enthält. Eine beispielhafte FEO-RANK-DNA wird in Hughes et al., Nat Genet 24:45–48 (2000) beschrieben.
  • Mutierte Formen von RANK sind insbesondere in Assays von Nutzen, die zur Identifizierung von Molekülen entworfen wurden, die in der Lage sind, den Defekt in Zellen, die diese Form von RANK exprimieren, zu komplementieren; als solche können Moleküle als therapeutische Mittel zur Behandlung von Erkrankungen dienen, die mit der RANK-Mutation einhergehen. Die hier beschriebenen Assays sind für das Screening nach Molekülen von Nutzen, welche die Fähigkeit besitzen, den RANK-Defekt in dem FEO RANK-Gen zu komplementieren. Die Sequenzen für ein FEO RANK sind in SEQ ID NOS:9 und 10 gegeben. Moleküle mit dieser Fähigkeit sind „FEO RANK- Agonisten" und werden für die Behandlung von Patienten, die an FEO, Morbus Paget oder verwandten Erkrankungen leiden, oder für die Entwicklung von Wirkstoffen, die zu diesem Zweck verwendet werden können. Es wird erwartet, dass man nachweisen wird, dass RANK-Mutationen eine Rolle in anderen Knochenerkrankungen außer FEO und Morbus Paget spielen. DNA, die für diese mutierten Formen von RANK kodiert, wird in den hier beschriebenen Screening-Assays isoliert und untersucht, um Behandlungen für die Erkrankungen zu identifizieren.
  • RANK-Aktivierung:
  • Viele der hier beschriebenen Assays umfassen die Verwendung von RANK-reaktiven Zellen. Wie hier verwendet, bezieht sich der Ausdruck „RANK-reaktive Zelle" auf eine Zelle, die ein Membran gebundenes RANK-Protein exprimiert, das in der Lage ist, ein intrazelluläres Signal zu übermitteln oder eine wahrnehmbare biologische Reaktion in der Zelle zu stimulieren (wie beispielsweise Differenzierung von einem Zelltyp zu einem anderen Zelltyp), wenn das RANK-Protein durch Bindung an ein RANK-L ausgelöst wird oder wenn das RANK durch einige andere Mittel ausgelöst wird.
  • Wie hier verwendet, bezieht sich der Ausdruck „RANK-Aktivität" auf die biologische Aktivität in der Zelle, die auftritt, nachdem RANK selbst eine Aktivierung erfahren hat, das heißt, nachdem RANK „ausgelöst" wurde. Im Allgemeinen wird „RANK-Aktivität" durch Auslösen von RANK angeregt und die RANK-Aktivität wird durch Messen von einer oder mehreren biologischen Reaktionen nachgewiesen, die typischerweise direkt oder indirekt durch ein ausgelöstes Wildtyp-RANK-Protein induziert wird. Wenn RANK ausgelöst wird, oligomerisiert es mit anderen RANK-Molekülen in seiner direkten Nachbarschaft in der Zellmembran. Wenn, zum Beispiel, ein RANK-spezifischer, als Agonist wirkender Antikörper verwendet wird, um RANK auszulösen, bringt der Antikörper zwei RANK-Moleküle in nächste Nähe und ermöglicht ihnen so, zu dimerisieren, wodurch RANK-Aktivität ausgelöst wird. Es ist möglich, dass mehr als zwei RANK-Moleküle oligomerisieren werden, wenn RANK ausgelöst wird. Vermutlich stimuliert die Oligomerisierung eine Konformationsänderung in dem cytoplasmatischen Schwanz des RANK-Proteins, wodurch eine Kette von Ereignissen in Gang gesetzt wird, die zu einer wahrnehmbaren biologischen Reaktion führen.
  • Das Auslösen von RANK ist ein Schritt, der für viele der hier beschriebenen Screening-Assay erforderlich ist, insbesondere wenn es gewünscht ist, nach RANK-Antagonisten zu screenen. Dies kann auf vielen verschiedenen Wegen erreicht werden, einschließlich des Aussetzens gegenüber einem RANK-L-Protein, das eine RANK-Bindungsdomäne besitzt. Es kann Volllängen-RANK-L verwendet werden, wie beispielsweise Membran gebundenes RANK-L oder lösliche RANK-L-Moleküle, wie die oben beschriebenen. Das RANK-L-Polypeptid muss zumindest RANK binden können, muss also den Teil der extrazelluären RANK-L-Region besitzt, der diese Fähigkeit aufweist. Ein Beispiel für eine Art von RANK-L, die zur Stimulierung von RANK-Aktivität von Nutzen ist, ist eine Leucin-Zipper-Fusion von RANK-L, wie beispielsweise die Leucin-Zipper-Fusion von RANK-L, die in U.S. 6,017,729 beschrieben wurde, oder andere Leucin-Zipper-Konstrukte, wie sie in dieser Literatur oder anderswo beschrieben werden.
  • Ein weiteres Beispiel für eine Art von RANK-L, das zur Stimulierung von RANK-Aktivität von Nutzen ist, ist eine FLAGTM poly-His-Fusion von RANK-L, wie beispielsweise die FLAGTM poly-His-Fusion von RANK-L, die in U.S. Patent 6,017,729 beschrieben wird.
  • RANK kann auf eine Vielzahl von Wegen ausgelöst werden, einschließlich, aber nicht eingeschränkt auf: Überexpression von RANK in einer Zelle; Coexpression von RANK und RANK-L in der gleichen Zelle; Zellen, die Membran gebundenes RANK exprimieren, mit löslichem RANK-L in Kontakt zu bringen; RANK exprimierende Zellen mit Zellen in Kontakt zu bringen, die Membran gebundenes RANK-L exprimieren; und Zugabe von agonistischen Antikörpern, die gegen RANK gerichtet sind, zu Zellen, die RANK exprimieren. Zusätzlich zu dem Vorhergehenden, kann jegliches andere gewünschte Verfahren zum Auslösen von RANK in den hier offenbarten Assays verwendet werden. Ein bevorzugtes Verfahren zum Auslösen von RANK ist, RANK-reaktive Zellen mit agonistischen anti-RANK-Antikörpern in Kontakt zu bringen, d. h. mit Antikörpern, die an RANK binden und RANK-Aktivität stimulieren. Beispiele für agonistische anti-RANK-Antikörper umfassen anti-humane M330-Antikörper, anti-humane M331-Antikörper, anti-Maus-M395-Antikörper und anti-Maus-M396-Antikörper.
  • Noch ein weiterer Weg, RANK-Aktivität in RANK-reaktiven Zellen zu stimulieren, ist, RANK-reaktive Zellen mit einer oder mehreren Zellarten in Kontakt zu bringen, die RANK-L exprimieren, wie beispielsweise Zellen, die RANK-L auf ihrer Oberfläche exprimieren oder die ein lösliches RANK-L-Protein sezernieren. Zum Beispiel können RANK-reaktive Zellen in flüssigem oder halbfestem Medium mit einer oder mehreren Zelllinien, die RANK-L exprimieren, co-kultiviert werden. Typische Beispiele für Zellarten, die RANK-L exprimieren, umfassen jegliche Zellart, die mit einem Nucleinsäuremolekül, das für RANK-L cDNA kodiert, (entweder transient oder stabil) unter Bedingungen transfiziert wird, welche die funktionale Expression von RANK-L durch die transfizierten Zellen ermöglichen. Zusätzliche Beispiele für Zellarten, die RANK-L exprimieren, umfassen primäre T-Zellen (aktiviert mit anti-CD3-Antikörpern), B-Zellen (wie beispielsweise der 70z3-Zelllinie) und die Maus-Thymom-Zelllinie EL-4 (Anderson et al., Nature 390:175–179 (1997)). Außerdem exprimieren ein Anzahl an Osteoblasten- und Stromazellen des Knochenmarks von sowohl humaner wie muriner Abstammung RANK-L, einschließlich ST2 (Yasuda et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci USA 95: 3597–3602 (1998)) und MC3T3-E1, hMS (Hofbauer et al., J. Bone Min. Res. 15: 2–12, 2000) und auch Osteosarkomzelllinien ROS und MG-63 (Hofbauer et al., 2000). Expression von RANK-L kann in diesen vorgenannten Zellarten unter Verwendung von Knochen resorbierenden Faktoren wie Glukokortikoide, 1,25-Dihydroxyvitamin D3, Interleukin 1(IL-1), IL-6, IL-17, TNFα, Prostaglandin E2 oder Parathyroidhormon hochreguliert werden (siehe Hofbauer et al., 2000).
  • Ebenso können Zellen, die ein lösliches RANK-L exprimieren, auf der festen Oberfläche eines Kulturwells kultiviert werden und die RANK-reaktiven Zellen, die in halbfestem Medium resuspendiert wurden, werden über die RANK-L exprimierenden Zellen geschichtet. RANK in diesen RANK-reaktiven Zellen wird durch den Kontakt mit RANK-L ausgelöst, das in das halbfeste Medium sezerniert wird und sich in diesem überall verteilt.
  • In einigen Ausführungsformen sezernieren die RANK-L exprimierenden Zellen eine lösliche Form des Moleküls. Typische Beispiele von Zellarten, die lösliches RANK-L sezernieren, umfassen primäre T-Zellen, die mit anti-CD3- und/oder anti-CD28-Antikörpern aktiviert wurden (Kong et al., Nature 402: 304–309 (1999)), und humane 293-Fibroblasten, die mit einem Nucleinsäuremolekül transfiziert wurden, das für RANK-L kodiert (Lacey et al., Cell 93: 165–178 (1998)).
  • Noch ein weiterer Weg, RANK-Aktivität in RANK-reaktiven Zellen zu stimulieren, ist RANK in den RANK-reaktiven Zellen zu überexprimieren, zum Beispiel durch genetische Transformation von RANK-reaktiven Zellen mit einem DNA-Konstrukt, das eine Nucleinsäuresequenz enthält, die für RANK kodiert, unter der Kontrolle eines starken, konstitutiven Promotors. Zum Beispiel aktivieren in der Abwesenheit von exogen zugegebenem RANK-L, mit einem Expressionsvektor (pDC409-hRANK) transfizierte 293/EBNA-Zellen NF-κB-Aktivität (siehe, Anderson et al., 1997, supra) und einen NF-κB-reaktiven Promotor-Reporter als Folge der RANK-Überexpression (siehe Galibert et al., J. Biol. Chem. 273:34120–27 (1998)). Die Konzentration von RANK in der Membran von Zellen, die RANK überexprimieren, ist so hoch, dass RANK in diesen Membranen spontan oligomerisiert, wodurch RANK-Aktivität ausgelöst wird. Geeignete RANK-Nucleinsäuren für die Verwendung in Konstrukten, um RANK-Überexpression zu induzieren, umfassen DNAs, die in der Lage sind, für die in SEQ ID NOS:2 und 4 gezeigten RANK-Proteine zu kodieren (solche DNAs werden beispielhaft durch die in SEQ ID NOS:1 und 3 gezeigten Nucleinsäuresequenzen dargestellt), oder Varianten davon, die für Proteine kodieren mit mindestens 85 %iger Homologie der Aminosäuresequenz mit einem Protein gemäß SEQ ID NO:2 oder 4, wobei dieses Protein weiterhin die Fähigkeit, RANK-Aktivität auszulösen, wenn es in einer Zelle überexprimiert wird, beibehält.
  • Typische Beispiele für Expressionsvektoren, die zur Überexpression von RANK verwendet werden können, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf: Vektoren der pDC400-Serie (Girl et al., EMBO J. 13: 2822–2830 (1994)); Vektoren der pDC300-Serie; der retrovirale Vektor pBMNZ, der die Molony Long Terminal Repeats(LTR)-Promotoren verwendet (Kinsella und Nolan, Human Gene Therapy 7: 1405–1413 (1996)) oder retrovirale Vektoren, die ein Hybrid Tetracyclin induzierbares Element (pREVTRE) enthalten, die erhältlich sind von Clontech (1020 East Meadow Circle, Palo Alto, CA 94303–4230, USA). Diese gleichen Vektoren können verwendet werden, um RANK- oder RANK-L-DNA in Zellen einzuführen, wenn die Einführung von solcher DNA für andere Aspekte dieser Erfindung erforderlich sein kann.
  • Ein weiteres Verfahren RANK-Aktivität auszulösen, ist die Expression einer Form von RANK-Protein in RANK-reaktiven Zellen, was einen oder mehrere RANK-vermittelte Signalisierungswege ohne Bindung von RANK-L aktiviert, wenn es in den RANK-reaktiven Zellen in normalen Levels exprimiert wird, wie beispielsweise FEO RANK (SEQ ID NO:10).
  • Zusätzlich zur Aktivierung von NF-κB umfassen nachweisbare, biologische Reaktionen, die eine Folge des Auslösens von RANK sind, zum Beispiel, Aktivierung der Kinase c-src, Aktivierung der JNK, Differenzierung von Vorläufermolekülen der Osteoklasten, Aktivierung von T-Zellen und so weiter. C-src ist bei der ordnungsgemäßen Osteoklastenfunktion von Bedeutung (siehe, zum Beispiel, Lowe et al., Proc Natl Acad Sci USA 90:4485–89 (1993)). In einem Aspekt der Erfindung wird RANK-Aktivität bestimmt, indem die Menge oder der Level eines Reporterproteins bewertet wird, der durch ein Promotor/Reporter-Konstrukt exprimiert wird, in welchem das Reportergen funktionell mit einem RANK-reaktiven Promotor verknüpft ist.
  • Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „funktionell verbunden" auf Nucleinsäuresequenzen, die funktionell miteinander verbunden sind, und die vorzugsweise zusammenhängend in einer einzelnen Nucleinsäurekette angeordnet sind. Zum Beispiel, ist eine regulatorische Nucleinsäuresequenz mit einer kodierenden Sequenz funktionell verknüpft (wie einer Sequenz, die für ein Reporterprotein kodiert), wenn die regulatorische Nucleinsäuresequenz (entweder selber oder in Zusammenhang mit einer oder mehreren anderen regulatorischen Nucleinsäuresequenzen) die Transkription der kodierenden Sequenz kontrolliert. Typischerweise sind die funktionell verbundenen Nucleinsäuresequenzen in dem gleichen Nucleinsäuremolekül zusammenhängend, aber in einigen Fällen kann die regulatorische Sequenz „trans-wirkend" sein oder auf einem anderen Nucleinsäuremolekül vorkommen.
  • Screening-Assays für RANK-Agonisten und -Antagonisten:
  • Assays in halbfestem Medium
  • In einer Ausführungsform der Erfindung werden Verfahren bereitgestellt, welche die Schritte umfassen: (a) RANK-reaktive Zellen mit einem Kandidatenmolekül in Kontakt zu bringen, wobei die RANK-reaktive Zelle in einem halbfesten Medium kultiviert wird; und (b) eine erhöhte oder verminderte Geschwindigkeit der Koloniebildung durch die in Kontakt gebrachten RANK-reaktiven Zellen in dem halbfesten Medium zu beobachten, verglichen mit der Geschwindigkeit der Koloniebildung von einer oder mehreren RANK-reaktiven Zellen, die nicht mit dem Kandidatenmolekül in Kontakt gebracht wurden. Wenn sie für das Screening nach einem Molekül, das als Antagonist der RANK-Aktivität wirkt, verwendet werden, umfassen die Verfahren von diesem Aspekt der Erfindung, weiterhin den Schritt, die RANK-Aktivität in den RANK-reaktiven Zelle zu stimulieren.
  • Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „halbfestes Medium" auf ein Zellwachstumsmedium, das kein festes Substrat liefert, an das sich die Zellen binden können, und das ausreichend viskos ist, so dass Zellen, die zu dem halbfesten Medium gegeben werden, darin suspendiert werden und dadurch daran gehindert werden, durch das halbfeste Medium zu sinken und mit der inneren Oberfläche des Behälters, in dem das halbfeste Medium verteilt wurde, in Kontakt zu treten und darauf zu haften. Halbfeste Medien, die bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung von Nutzen sind, umfassen typischerweise ein Geliermittel (wie Agar oder Methylcellulose), das in einem wässrigen Medium in einer Menge von 0,1 % bis 5 Gew.-% gelöst ist.
  • In dieser Ausführungsform der Erfindung, werden die RANK-reaktiven Zellen in einem halbfesten Medium in der Gegenwart von einem oder mehreren Molekülen ausplattiert, die auf ihre Fähigkeit, RANK-Aktivität zu modulieren, untersucht werden sollen. Die Zellen, die bei der Ausführung dieser Ausführungsform der Erfindung verwendet werden, exprimieren RANK, sind fähig, Kolonien in einem halbfesten Medium zu bilden, und werden durch RANK-Aktivierung dazu stimuliert, in Zelltypen zu differenzieren, die in halbfestem Medium langsam wachsen oder die in halbfestem Medium nicht wachsen können. Das Testmolekül kann mit den Zellen vor oder zu der Zeit, in der sie in das halbfeste Medium ausplattiert werden, oder nachdem sie ausplattiert wurden, in Kontakt gebracht werden.
  • In diesen Assays können RANK-reaktive Zellen in halbfestem Medium suspendiert werden, das dann auf die Oberfläche einer Schicht aus halbfestem Medium aufgebracht wird, die eine höhere Konzentration an Geliermittel umfasst, als in dem halbfesten Medium vorhanden ist, in welches die Zellen suspendiert wurden. Zum Beispiel können RANK-reaktive Zellen in einem halbfesten Medium suspendiert werden, das Agar in einer Konzentration von 0,3 Gew.-% enthält. Die suspendierten Zellen können dann auf eine Schicht des halbfesten Mediums ausplattiert werden, das Agar in einer höheren Konzentration enthält, wie beispielsweise einer Konzentration von 0,5 Gew.-%.
  • Ein ungewöhnliches Merkmal dieser Vorgehensweise mit halbfestem Medium zum Nachweis von RANK-Antagonisten ist, dass eine positive Reaktion (das heißt Koloniebildung und/oder Koloniewachstum) verstärkt wird, wenn ein Antagonist anwesend ist, wohingegen Assays zum Nachweis von Antagonisten typischerweise so entworfen werden, dass die gemessene Reaktion in der Gegenwart eines Antagonisten aufgehoben wird. Darüber hinaus erlaubt das vorliegende Assay die Aufbereitung von Zellen, die auf den Antagonisten reagieren; ein Merkmal, das besonders von Nutzen ist, wenn das Testmolekül den Zellen in der Form einer rekombinanten cDNA-Bibliothek zur Verfügung gestellt wurde (siehe unten).
  • Bei Verwendung eines Assays im halbfesten Medium, wird die Fähigkeit eines Testmoleküls, agonistisch auf RANK zu wirken, nachgewiesen, indem RANK-reaktive Zellen mit dem Testmolekül in Kontakt gebracht werden und eine verminderte Geschwindigkeit der Koloniebildung oder des Koloniewachstums im halbfesten Medium beobachtet wird, verglichen mit der Geschwindigkeit der Koloniebildung in einer Referenzkultur der gleichen RANK-reaktiven Zellen, die nicht mit dem Testmolekül in Kontakt gebracht wurden. Wenn gewünscht, können zum Nachweis von RANK-Agonisten positive Kontrollkulturen verwendet werden, um eine Referenz zum Vergleich zu liefern, in welchem die Referenzzellen mit einem bekannten RANK-Agonisten, wie beispielsweise RANK-L oder einem agonistischen anti-RANK-Antikörper in Kontakt gebracht werden.
  • Zellen, die für halbfeste Medien einsetzende Assays von Nutzen sind, umfassen jegliche Zellen, die RANK exprimieren, die fähig sind, Kolonien in einem halbfesten Medium zu bilden, und die durch Auslösen von RANK dazu stimuliert werden, in Zelltypen zu differenzieren, die in halbfestem Medium keine Kolonien bilden können. Im Allgemeinen differenzieren diese Zellen zu Osteoklasten, wenn RANK ausgelöst wird. 253:395–400 (1998)). RAW 264.7-Zellen (eine Makrophagen-Zelllinie der Maus) werden durch die Zugabe von RANK-L stimuliert, um zu mehrkernigen Osteoklasten zu differenzieren (die keine Kolonien in halbfesten Medien bilden können).
  • Koloniebildung wird bewertet, indem visuell die Größe und/oder Anzahl an Kolonien in Kulturen, die mit einem Testmolekül in Kontakt gebracht wurden, mit der Größe und/oder Anzahl an Referenzkolonien verglichen werden, die in Kontrollkulturen der gleichen RANK-reaktiven Zellen anwesend sind, die nicht mit einem möglichen Agonisten oder Antagonisten von RANK in Kontakt gebracht wurden. Die Größe und/oder Anzahl an Kolonien wird nach einer gewünschten Zeitdauer bewertet, wie beispielsweise von 1 bis 10 Tage nachdem die RANK-reaktiven Zellen mit dem Testmolekül in Kontakt gebracht wurden, oder mehr bevorzugt von 5 bis 10 Tage nachdem die Zellen mit dem Testmolekül in Kontakt gebracht wurden. Visueller Vergleich der Kulturen kann, zum Beispiel, unter Verwendung von Licht- oder Phasenkonstrastmikroskopie durchgeführt werden.
  • Wiederum als Beispiel, kann die Geschwindigkeit der Koloniebildung innerhalb eines Kulturwells unter Verwendung von Veränderungen der Durchlässigkeit für sichtbares Licht gemessen werden, zum Beispiel spektrophotometrisch. Außerdem kann, wenn die Zellen vor dem Wachstum in halbfesten Medien unter Verwendung eines vitalen Fluoreszenzfarbstoffs markiert wurden, die Geschwindigkeit der Koloniebildung fluorimetrisch bewertet werden. Der DNA-Gehalt von Zellen in einem Kulturwell kann auch unter Verwendung von Standardmitteln zur Bewertung der Geschwindigkeit der Koloniebildung gemessen werden.
  • Wird die zuvor beschriebene Vorgehensweise mit halbfestem Medium verwendet, um RANK-Antagonisten nachzuweisen, umfasst das Assay einen Schritt, der die Aktivierung von RANK in den Zellen beinhaltet. Die Zellen werden mit dem Testmolekül (das heißt, dem putativen RANK-Antagonisten) vor, während oder nach dem RANK-Aktivierungsschritt in Kontakt gebracht. RANK-Aktivierung kann, zum Beispiel, durch Überexprimieren von RANK in den Zellen erreicht werden, oder indem die Zellen mit einem agonistischen anti-RANK-Antikörper oder mit RANK-L in Kontakt gebracht werden. Alternativ kann das Auslösung durch Co-Expression von RANK-L in den RANK-reaktiven Zellen erreicht werden, indem RANK-L zu den Kulturen als lösliches RANK-L zugegeben wird, oder es kann durch andere Mittel als hier beschriebene bereitgestellt werden. Wenn das Testmolekül ein RANK-Antagonist ist, werden sich die Zellen mehr teilen als in gleichartigen Kulturen, zu denen das Testmolekül nicht gegeben wurde. Wenn ein Testmolekül, das ein RANK-Antagonist ist, vor dem Auslösen von RANK zugegeben wird, werden mehr Kolonien in den Kulturen auftreten, die mit dem Testmolekül in Kontrakt gebracht wurden, als in Kulturen, die nicht mit dem Testmolekül in Kontakt gebracht wurden. Wenn der Antagonist zugegeben wird, nachdem sich die Kolonien gebildet haben, werden die Kolonien, die dem Antagonisten ausgesetzt sind, größer als Kolonien in Kontrollkulturen, die dem Antagonisten nicht ausgesetzt wurden.
  • Bei Verwendung der zuvor beschriebenen Zellen wird die Fähigkeit eines Testmoleküls, als ein RANK-Agonist zu wirken, nachgewiesen, indem die RANK-reaktiven Zellen mit dem Testmolekül in Kontakt gebracht werden und eine verminderte Geschwindigkeit der Koloniebildung im halbfesten Medium beobachtet wird, verglichen mit der Geschwindigkeit der Koloniebildung einer Kontrollkultur der gleichen RANK-reaktiven Zellen, die nicht mit dem Testmolekül in Kontakt gebracht wurden. In diesem Assay wird ein RANK-Agonist die Zellen dazu stimulieren, in einen Zelltyp zu differenzieren, der keine Kolonien in halbfesten Medien bilden kann. Zellen, die typischerweise für diese Assays verwendet werden, werden zu Osteoklasten differenzieren, wenn sie einem Testmolekül ausgesetzt werden, das eine RANK-Agonist ist. Kontroll-RANK-Agonisten, die für diese Assays verwendet werden können, umfassen Membran gebundenes RANK-L und lösliche Formen von RANK-L.
  • In einer Variation des Assays mit halbfestem Medium, wird diese Strategie verwendet, um eine Nucleinsäurebibliothek zu screenen, wie beispielsweise eine cDNA-Bibliothek, die für eine Population von Kandidatenproteinmolekülen kodiert, die auf ihre Fähigkeit gescreent werden, eine antagonistische oder agonistische Wirkung auf die RANK-Aktivität auszuüben. Die cDNA-Bibliothek wird in eine Population von RANK-reaktiven Zellen durch jegliches auf dem Fachgebiet anerkannte Mittel eingeführt, wie beispielsweise durch Transfektion oder Transduktion, wie weiter unten genauer beschrieben wird. Wenn RANK-Antagonisten gesucht werden, werden Zellen, in welche die cDNA-Moleküle eingeführt wurden, in einem halbfesten Medium kultiviert und RANK wird in den Zellen durch eines der hierin beschriebenen Verfahren oder durch ein anderes geeignetes Verfahren ausgelöst. Die Geschwindigkeit der Koloniebildung oder die Geschwindigkeit des Koloniewachstums in den suspendierten, genetisch modifizierten Zellen wird mit der in gleichartigen Zellen verglichen, in welche keine DNA außer einer Kontroll-DNA eingeführt wurde. Geeignete Kontrollzellen können, zum Beispiel, eine Vektor-DNA an Stelle der cDNA-Bibliothek erhalten. Kolonien in der genetisch modifizierten Population, die deutlich schneller wachsen als Kolonien in der Kontrollpopulation, können isoliert und weiter untersucht werden. Die fremde DNA kann aus solchen Kolonien gewonnen werden, um den RANK-Antagonisten, der für ein verstärktes Koloniewachstum verantwortlich war, zu identifizieren und zu isolieren. Zum Beispiel können die eingeführten Nucleinsäuremoleküle aus den schnell wachsenden Kolonien isoliert werden und die Nucleinsäuresequenz von jedem von ihnen kann bestimmt werden. Das durch das isolierte, sequenzierte Nucleinsäuremolekül kodierte Protein kann exprimiert und/oder chemisch hergestellt werden, und seine Fähigkeit, antagonistisch auf die RANK-Aktivität zu wirken, wird bestätigt und untersucht.
  • Agonisten von RANK werden in diesem Assay erkannt, indem das Assay wie oben beschrieben ausgeführt wird, jedoch ohne Auslösen von RANK; Zellen, die eine für einen RANK-Agonisten kodierende cDNA enthalten, werden langsamer wachsen oder werden keine Kolonien bilden. Für den RANK-Agonisten kodierende cDNA wird aus diesen langsam wachsenden wie oben beschrieben gewonnen.
  • Es wurden viele verschiedene Arten für den Transfer von Säugetiergen und Expressionsvektoren entwickelt, die für die Einführung einer für Proteine kodierenden cDNA-Bibliothek geeignet sind, die in dem oben genannten Assay im halbfesten Medium auf ihre Fähigkeit getestet werden sollen, die RANK-Aktivität zu modulieren (siehe, Miller und Calos, Hrgs., "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells," Current Comm. Mol. Biol, Cold Spring Harbor Laborstory, New York, 1987). Nackte DNA kann in Säugetierzellen physikalisch eingeführt werden, indem unter Verwendung von einer aus einer Vielzahl an Techniken transfiziert wird, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Calciumphosphat-Transfektion (Berman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 7176, 1984); DEAE-Dextrantransfektion, Fusion von Protoplasten (Deans et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci USA 81: 1292, 1984); Elektroporation, Lipofektion (Feigner et al., Proc. Nat'l. Acad. Sic. USA 84: 7413, 1987), Polybrentransfektion (Kawai und Nishzawa, Mol. Cell. Biol. 4: 1172, 1984) und direkten Gentransfer durch Lasermikropunktur von Zellmembranen (Tao et al., Proc Natl. Acad. Sc. USA 84:4180, 1987)
  • Außerdem wurden verschiedene Infektionstechniken entwickelt, welche rekombinante, infektiöse Virenpartikel für den Gentransport verwenden. Vol. 2. Cold Spring Harbor Laborstory, New York). Diese gleichen Virenvektoren können verwendet werden, um RANK- oder RANK-L-DNA in Zellen einzuführen, wenn die Einführung von solcher DNA für andere Aspekte dieser Erfindung erforderlich sein kann.
  • Es gibt eine Vielzahl an Gentransfer- und Expressionsverfahren und diese dienen im Wesentlichen dazu, genetisches Material in Säugetierzellen einzuführen und zu exprimieren. Einige der oben beschriebenen Techniken wurden verwendet, um hämatopoetische oder lymphoide Zellen zu transduzieren, einschließlich Calciumphosphattransfektion (Berman et al., supra, 1984); Fusion von Protoplasten (Deans et al., supra 1984); Elektroporation (Cann et al. Oncogene 3: 123, 1988) und Infektion mit rekombinantem Adenovirus (Karlsson et al., supra, Ruether et al. Mol. Cell Biol. 6: 123, 1986); adenoassoziierter Virus (LaFace et al., supra); und Retrovirus-Vektor (Overell et al., Oncogene 4: 1425, 1989). Primäre T-Lymphozyten wurden erfolgreich durch Elektroporation (Cann et al., supra, 1988) und durch retrovirale Infektion (Nishihara et al., Cancer Res 48: 4730, 1988); Kasid et al., supra, 1990} transduziert.
  • Assays, welche die zuvor beschriebene Screening-Strategie mit halbfestem Medium umfassen, sind wie folgt von Nutzen beim Screening von Molekülsammlungen wie beispielsweise Bibliotheken von kleinen organischen Molekülen oder Peptiden. Mikrotiterplatten, wie beispielsweise 96-Well Mikrotiterplatten, können verwendet werden und in jeden Well wird ein anderer Kandidatenagonisten oder -antagonist der RANK-Aktivität zusammen mit einem Aliquot von RANK-reaktiven Zellen in halbfestem Medium gegeben. Für diesen Assay verwendete Zellen sind Zellen, die normalerweise differenzieren und die Teilung als Reaktion auf das Auslösen von RANK stoppen werden (siehe oben für eine Beschreibung von geeigneten Zellen). Wenn es gewünscht wird, Moleküle mit antagonistischer RANK-Aktivität nachzuweisen, wird ein Stimulans für das Auslösen von RANK bereitgestellt, wie beispielsweise RANK-L, welches zu dem Medium gegeben werden kann oder welches durch ein anderes Mittel, wie hierin beschrieben, bereitgestellt werden kann. Wiederum beispielhaft kann ein Kandidatenmolekül in dem halbfesten Medium gelöst und überall darin verteilt werden, oder es kann (in Form einer Lösung) auf die obere Oberfläche des halbfesten Mediums aufgebracht werden und kann überall darin diffundieren.
  • Wenn gewünscht, können die in die RANK-reaktiven Zellen eingeführten Nucleinsäuremoleküle stabil in das Genom der RANK-reaktiven Zellen integriert werden. Zum Beispiel kann eine cDNA-Bibliothek, die in einem retroviralen Vektor konstruiert wurde, verwendet werden, um eine RANK-reaktive Zelllinie zu transfizieren. Der Vorteil einer stabilen Integration der eingeführten DNA-Moleküle in das Genom der RANK-reaktiven Zellen ist, dass typischerweise eine kontinuierliche Genexpression mit hohem Level erhalten wird. Beispiel 2 hierin beschreibt ein charakteristisches Protokoll zum Screening nach Agonisten oder Antagonisten von RANK-Signalgebung, unter Verwendung von RAW 264.7-Zellen und einer retroviralen Expressionsbibliothek.
  • Eine weitere Anwendung der Verfahren der Erfindung ist, nach Molekülen (wie beispielsweise cDNAs, Proteinen und Peptiden) zu screenen, die ein defektes RANK-Signal komplementieren. Zum Beispiel kann eine Form des humanen RANK (bezeichnet als „RANKΔ340-421"), in welcher die TRAF6-Bindungsstelle fehlt, die Bildung von Osteoklasten aus hämatopoetischen Vorläuferzellen nicht stimulieren. Diese Form von RANK wird beschrieben in Galibert et al., J. Biol Chem. 273:34120, 1998, hat eine Aminosäuresequenz, die der von humanem RANK (SEQ ID NO:2) entspricht, in welcher aber die TRAF6-Bindungsstelle (Aminosäuren 340–421 von SEQ ID NO:2) deletiert sind. Die Verfahren der vorliegende Erfindung können daher verwendet werden, um nach Molekülen zu screenen, welche die RANKΔ340-421 Signalgebungsmutation komplementieren und dadurch die Bildung von Osteoklasten aus hämatopoetischen Vorläuferzellen erlauben. Beispiel 3 hierin beschreibt die Herstellung einer RANK-reaktiven Zelllinie, die RANKΔ340-421 exprimiert.
  • Promotor/Reporterassays, die den MMP-9- oder TRAP-Promotor verwenden
  • In einem weiteren Aspekt der Erfindung werden hierin Screening-Assays bereitgestellt, die Promotor/Reporter-Konstrukte verwenden, die Promotoren verwenden, von denen früher nicht bekannt war, dass sie in der Lage sind, auf RANK-Aktivierung durch erhöhte Expression von Protein zu reagieren, das für Sequenzen kodiert, mit welchen die Promotoren funktionell verbunden sind. Insbesondere verwenden die vorliegenden Promotor/Reporter-Konstrukte einen Promotor, der aus einem TRAP-Gen oder aus einem MMP-9-Gen gewonnen wird. Beispiel 4 hierin beschreibt ein Konstrukt des murinen MMP-9-Promotors (Sato et al., J Biol Chem 268:23460–68 (1993); Sato und Seiki, Oncogene 8:395–405 (1993)), das an den humanen IL-2α-Rezeptor fusioniert ist. Der humane MMP-9-Promotor oder ein TRAP-Promotor (human oder murin; siehe, zum Beispiel, Reddy et al., Bone 16:587–593 (1995)) kann auch für diese Screening-Verfahren verwendet werden.
  • Assays gemäß diesem Aspekt der Erfindung umfassen die Schritte: (a) eine kultivierte RANK-reaktive Zelle mit einem Testmolekül in Kontakt zu bringen, wobei die RANK-reaktive Zelle ein für ein Reportermolekül kodierendes Nucleinsäuremolekül umfasst, wobei das für ein Reportermolekül kodierende Nucleinsäuremolekül funktionell verbunden ist mit einer regulatorischen RANK-reaktiven Nucleinsäuresequenz; und (b) einen erhöhten oder verminderten Expressionslevel des Reportermoleküls in den RANK-reaktiven Zellen zu beobachten, die in Kontakt gebracht wurden, verglichen mit dem Expressionslevel an Reportermolekül in einer oder mehreren RANK-reaktiven Referenzzellen, die nicht mit dem Kandidatenmolekül in Kontakt gebracht wurden. Wenn sie für das Screening nach einem Molekül, das als Antagonist der RANK-Aktivität wirkt, verwendet werden, umfassen die Verfahren von diesem Aspekt der Erfindung weiterhin den Schritt, die RANK-Aktivität in den RANK-reaktiven Zellen zu stimulieren.
  • RANK-Agonisten werden in dieser Art von Assay nachgewiesen, indem ein erhöhter Level an Expression von Reportermolekül in den mit dem RANK-Agonisten in Kontakt gebrachten RANK-reaktiven Zellen nachgewiesen wird, verglichen mit dem Level an Expression von Reportermolekül in RANK-reaktiven Kontrollzellen, die nicht mit dem RANK-Agonisten oder mit einem anderen Aktivator der RANK-Aktivität in Kontakt gebracht wurden. Die Kontrollzellen sind typischerweise von der gleichen Art von RANK-reaktiven Zellen wie die RANK-reaktiven Zellen, die mit dem RANK-Agonisten in Kontakt gebracht wurden. Wenn die Assays darauf abzielen, RANK-Agonisten zu identifizieren, umfasst das Protokoll nicht den Schritt der Auslösung von RANK, wie beispielsweise die Zellen absichtlich mit RANK-L in Kontakt zu bringen.
  • Die Gegenwart eines RANK-Antagonisten wird nachgewiesen, indem ein verminderter Level oder die Abwesenheit von Reportermolekülexpression in RANK-reaktiven Zellen beobachtet wird, in denen RANK ausgelöst wurde und die mit einem Kandidatenantagonisten in Kontakt gebracht wurden. Der Level oder Reporterexpression wird untersucht, indem er mit dem Level an Reporterexpression in RANK-reaktiven Kontrollzellen verglichen wird, die mit einem RANK-Aktivator in Kontakt gebracht wurden, aber nicht mit dem Kandidaten-RANK-Antagonisten in Kontakt gebracht wurden. Die Kontrollzellen sind typischerweise von der gleichen Art RANK-reaktiver Zellen wie die RANK-reaktiven Zellen, die mit dem RANK-Antagonisten in Kontakt gebracht wurden.
  • Wenn diese Art von Assay für das Screening nach Antagonisten der RANK-Aktivität verwendet wird, muss RANK-Aktivität in den RANK-reaktiven Zellen stimuliert werden. Typischerweise wird RANK-Aktivität ausgelöst, bevor oder zur gleichen Zeit wie die RANK-reaktiven Zellen mit dem/den Kandidatenmolekül(en) in Kontakt gebracht werden. In einigen Fällen kann es wünschenswert sein, RANK-Aktivität zu stimulieren, nachdem die RANK-reaktiven Zellen mit dem Kandidatenmolekül in Kontakt gebracht wurden. Es kann jeglicher Arbeitsschritt, der die RANK-Aktivität stimuliert, angewandt werden, wie beispielsweise solche Arbeitsschritte zur Stimulierung von RANK-Aktivität, die oben beschrieben wurden.
  • Zellen, die in diesem Aspekt der Erfindung von Nutzen sind, exprimieren RANK-Protein und enthalten mindestens einen Signaltransduktionsweg, der durch die Aktivierung von RANK stimuliert wird. Einige Zellen, die in diesem Aspekt der Erfindung von Nutzen sind, exprimieren RANK natürlich und enthalten mindestens einen Signaltransduktionsweg, der durch die Aktivierung von RANK stimuliert wird. Beispiele für diese Art von Zelle umfassen RAW 264.7-Zellen, die BCL-XI/Tag-Osteoklastenzelllinie, die zu TRAP + Osteoklasten differenziert werden kann (Hentunen et al., J. Clin. Invest. 102: 88–97 (1998)), und die Makrophagen-ähnliche Vorläufer-Zelllinie C7 für Osteoklasten aus der Maus (Nakagawa et al., Bioch. Biophys. Res. Comm. 253: 395–400 (1998)).
  • Andere Zellen, die in diesem Aspekt der Erfindung von Nutzen sind, sind genetisch verändert, um RANK zu exprimieren und/oder enthalten mindestens einen Signaltransduktionsweg, der durch die Aktivierung von RANK stimuliert wird. Beispiele für diese letztere Art von Zelle umfassen 293/EBNA-Zellen. Nahezu jede dieser Zellarten, die zu Wachstum in Kultur fähig ist, kann genetisch modifiziert werden, um RANK für Zwecke dieser Assays zu exprimieren. Eine Vielzahl von anderen geeigneten Verfahren zur Einführung von RANK-DNA in eine Zelle werden an anderer Stelle in dieser Offenbarung beschrieben und umfassen virale Vektoren und andere Verfahren wie Elektroporation, Lipofektion und so weiter.
  • Die RANK-reaktiven Zellen können auf jegliche geeignete Weise mit einem oder mehreren Kandidatenmolekülen in Kontakt gebracht werden, wie beispielsweise durch Verwendung solcher Arbeitsgänge, die oben beschrieben werden, oder durch jegliches andere gewünschte Verfahren.
  • Reportermoleküle, die in dieser Ausführungsform der Erfindung von Nutzen sind, umfassen Luciferase, β-Galactosidase, Grün fluoreszierendes Protein, alkalische Phosphatase und jegliches heterologe Oberflächenprotein, das auf der Oberfläche einer RANK-reaktiven Zelle nachgewiesen werden kann, wie beispielsweise durch Verwendung eines spezifischen, gegen das heterologe Protein gerichteten Antikörpers. Beispiele für nützliche heterologe Oberflächenproteine umfassen den humanen IL-2-Rezeptor, den murinen IL-4-Rezeptor (abgekürzt als mIL-4R), die humanen CD2-, CD4- oder CD8-Proteine.
  • Assays, die auf dem Nachweis von c-src-Aktivität oder F-Aktinringen beruhen
  • In einem weiteren Aspekt der Erfindung werden Assays für das Screening nach einem molekularen RANK- und RANK-L-Antagonisten bereitgestellt, indem das Ausmaß gemessen wird, mit dem ein Kandidatenmolekül die RANK-vermittelte Induktion der c-src Tyrosinkinase-Aktivität und/oder F-Aktinringbildung verstärkt oder hemmt. (Lakkakorpi und Vaananen, J. Bone Min.Res. 6:817–26 (1991)).
  • Um F-Aktinringe nachzuweisen, werden Zellen fixiert, indem sie beispielsweise 3 %igem Paraformaldehyd ausgesetzt werden, und durch Anfärben der Zellen mit einer fluoreszierenden Sonde visualisiert, die spezifisch mit Aktin binden. Ein geeignetes Fluoreszenz-Tag ist Phalloidin, das von Molecular Probes, Eugene, OR, erhalten werden kann. Das Fluoreszenzsignal wird nachgewiesen, zum Beispiel, indem ein Standardfluoreszenzmikroskop verwendet wird, und die Anzahl an Zellen mit F-Aktinringen wird visuell quantifiziert. Ein F-Aktinring wird als ein kontinuierlicher Ring aus F-Aktin in den Außenbereichen einer Zelle identifiziert und diese ausgeprägten Strukturen sind durch ein Mikroskop sichtbar. F-Aktinringe treten in keinen weiteren Zellarten auf außer Osteoklasten.
  • Um c-src-Aktivität nachzuweisen, wird die Phosphotransferase-Aktivität dieses Enzyms gemessen, unter Verwendung eines synthetischen Substrats wie beispielsweise dem p34/cdc2-Peptid (KVEKIGEGTYGVVYK) (SEQ ID NO:13), das als ein Substrat für das Enzym wirkt. Ein beispielhaftes Assay für die Messung der c-src-Aktivität wird in Beispiel 8 dargestellt.
  • Dieser Aspekt der Erfindung verwendet Zellen, die ein RANK-Protein exprimieren, das zu einer Aktivierung der Zellen zur Differenzierung zu Osteoklasten fähig ist, oder jegliche Zellen, die auf das Auslösen von RANK durch Aktivierung der c-src-Aktivität reagieren. In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung, induziert das RANK-Protein erhöhte Level an c-src Tyrosinkinase-Aktivität und F-Aktinringbildung, während die Zellen eine Differenzierung erfahren. Beispielhafte Zellen, die für diese Ausführungsform von Nutzen sind, sind jegliche Zellen, die zu einer Differenzierung zu Osteoklasten als Reaktion auf das Auslösen von RANK fähig sind und die auch eine Form von RANK exprimieren, das zu einer Induzierung der c-src-Aktivität und F-Aktinringbildung fähig ist. Solche Zellen umfassen primäre hämatopoetische Zellen, die mit Vorläufern für Osteoklasten angereichert wurden, oder eine Zelllinie wie beispielsweise RAW 264.7-Zellen. Geeignete primäre hämatopoetische Vorläufer können aus Knochenmarkszellen, fötaler Leber oder peripherem Blut gewonnen werden. Geeignete Zellen umfassen auch Zellen, die genetisch modifiziert wurden, um RANK zu exprimieren, unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren.
  • Für diese Art von Assay kann das Testmolekül zu dem Kulturmedium bis zu etwa fünf Tagen, nachdem die Differenzierung vollständig ist, zugegeben werden. C-src-Aktivität oder F-Aktinringbildung wird untersucht, nachdem die Zellen dem Testmolekül über einen passenden Zeitraum ausgesetzt wurden. Zum Beispiel wird die Aktivität nach 6 bis 12 Stunden gemessen, nach einem Tag, nach zwei Tagen, nach drei Tagen, nach vier Tagen, nach fünf Tagen oder nach einer längeren Zeit des Einwirkens. Ein Testmolekül wird als ein RANK-Agonist identifiziert, wenn die Menge an F-Aktinringen oder c-src-Aktivität, die in diesen Zellen nachgewiesen wird, nachdem sie dem Testmolekül ausgesetzt wurden, verglichen mit dem Level erhöht ist, der in RANK -/- Kontrollzellen beobachtet wird, in die keine RANK-DNA eingeführt wurde.
  • In dieser Art von Assay können die Testmoleküle auch auf ihre Fähigkeit hin untersucht werden, bestimmte biologische Aktivitäten, die für das Wildtyp RANK-Protein charakteristisch sind, zu komplementieren. Im Allgemeinen nutzt diese Art von Assay die Tatsache aus, dass Wildtyp RANK-Protein c-src-Aktivität und F-Aktinringbildung in Zellen induzieren kann, die den Prozess der Differenzierung zu Osteoklasten durchlaufen. Jedoch können diese beiden Aktivitäten von RANK durch Deletion der TRAF6-Bindungsdomäne aus dem RANK-Protein aufgehoben werden (siehe Beispiel 8), obwohl die TRAF6-Bindungsdomäne nicht erforderlich ist, damit die RANK-Aktivierung die Differenzierung zu Osteoklasten induzieren kann. Wenn in Vorläufern der Osteoklasten TRAF6-Deletionsmutanten des RANK-Proteins exprimiert werden, wird daher das Auslösen von RANK die Zellen zu einer Differenzierung veranlassen, wird sie aber weder dazu veranlassen, höhere Level der c-src-Aktivität zu exprimieren, noch werden diese Zellen F-Aktinringe zeigen. Für das humane RANK-Protein ist die TRAF6-Bindungsdomäne innerhalb einer Region enthalten, die durch die Aminosäuren 340–421 von SEQ ID NO:2 definiert wird. Daher können Zellen, in denen solche RANK-Mutanten exprimiert werden, in Assays verwendet werden, um nach Molekülen zu screenen, die fähig sind, die Deletion der TRAF6-Bindungsstelle in dem mutierten RANK zu komplementieren. Die Fähigkeit eines Testmoleküls, diesen Defekt zu komplementieren, wird nachgewiesen, indem man beobachtet, dass, wenn das Testmolekül mit Zellen, welche die RANK-Mutante exprimieren, in Kontakt gebracht wird, c-src-Aktivierung und F-Aktinbildung auftreten, wenn RANK ausgelöst wird.
  • Zellen, die für die Verwendung mit TRAF6-Mutanten von RANK von Nutzen sind, umfassen primäre hämatopoetische Vorläuferzellen von RANK Knock-out Tieren, wie beispielsweise die früher beschriebenen RANK-/- Mäuse (Dougall et al., 1999). Um dieses Assay auszuführen, werden Zellen von einem RANK Knock-out Tier genetisch modifiziert, indem eine DNA eingeführt wird, die für ein mutiertes RANK-Protein kodiert, dem eine TRAF6-Bindungsregion fehlt. Beispielhafte DNAs für diesen Zweck sind Maus- oder humane RANK-DNA, aus der die Sequenzen, die für die TRAF6-Bindungsdomäne kodieren, deletiert wurden. Geeignete Mittel zur Einführung der RANK-DNA umfassen Infektion mit einem viralen Vektor (wie beispielsweise einem retroviralen oder Adenovirus-Vektor), in den die für das Protein kodierenden DNA ligiert wurde, oder eines der anderen, oben diskutierten Mittel. Nach Einführung der mutierten RANK-DNA werden die Zellen induziert, um zu Osteoklasten zu differenzieren, indem das RANK-Protein ausgelöst wird, unter Verwendung eines der Mittel zum Auslösen von RANK, die oben beschrieben wurden, oder durch irgendein anderes gewünschtes Mittel zum Auslösen von RANK. Zur Bestimmung, ob ein Testmolekül den Defekt in dieser mutierten Form von RANK komplementiert, wird das Molekül während eines Teils oder der gesamten Inkubationsdauer, während der die Zellen eine Differenzierung durchlaufen, zum Kulturmedium gegeben.
  • Screening-Assays, die Ca3(PO4)2-Resorption umfassen
  • Es werden auch Verfahren zum Screening nach RANK-Agonisten oder -Antagonisten in Assays bereitgestellt, die auf der RANK-abhängigen Resorption einer synthetischen Matrix aus Calciumphosphat beruhen. Wildtyp RANK-Protein kann Zellen in die Lage versetzen, zu Osteoklasten zu differenzieren, die fähig sind, Calciumphosphat (Ca3(PO4)2) zu resorbieren, während Signale von einem RANK-Protein, dem eine TRAF6-Bindungsstelle fehlt, keine Ca3(PO4)2-Resorption initiiert. Zellen, die für dieses Screening-Assay von Nutzen sind, umfassen jegliche Zellen, in denen die Aktivierung von RANK zu Ca3(PO4)2-Resorption führt, das heißt, Zellen, die zu Osteoklasten differenzieren, wenn RANK ausgelöst wird. Beispielhafte Zellen für die Verwendung in diesem Assay umfassen primäre hämatopoetische Vorläufer, primäre hämatopoetische Zellen, RAW 264.7-Zellen oder jegliche Zelle, die mit einer Form von RANK transfiziert ist, welche diese Aktivität unterstützt (wie beispielsweise Vorläuferzellen für Osteoklasten aus RANK-/- Mäusen).
  • In einer Ausführungsform der Erfindung wird dieses Verfahren verwendet, um nach Molekülen zu screenen, die inaktive RANK-Mutanten komplementieren, wie beispielsweise die TRAF6-Deletionsmutanten, wie oben beschrieben.
  • Geeignete Arbeitsschritte zur Durchführung dieses Assays werden beispielhaft durch solche in Beispiel 9 dargelegten erläutert. Im Allgemeinen werden Zellen auf kommerziell erhältlichen, dünnen Mikroskopobjektträgern kultiviert, die dünn mit Ca3(PO4)2 beschichtet sind. So gezüchtete RANK-reaktive Zellen werden auf das Auslösen von RANK durch Differenzierung zu Zellen reagieren, die Ca3(PO4)2 resorbieren, was zu der Bildung einer diskreten Vertiefung in dem Ca3(PO4)2-Film führt. Um einen RANK-Antagonisten nachzuweisen, wird die Anzahl an Vertiefungen auf Objektträgern, die mit dem Testmolekül in Kontakt gebracht wurden, mit der Anzahl an Vertiefungen von Objektträgern verglichen, die nicht mit dem Testmolekül in Kontakt gebracht wurden.
  • RANK-Agonisten werden in dieser Art von Assay dadurch nachgewiesen, dass geeignete Zellen auf Ca3(PO4)2-Filmen gezüchtet werden und diese Zellen mit einem Testmolekül in Kontakt gebracht werden, ohne dass zunächst RANK in den Zellen ausgelöst wird.
  • Die folgenden Beispiele stellen die beste Art der Ausführung der Erfindung dar, die nun in Betracht gezogen wird, sollten aber nicht als Einschränkung der Erfindung ausgelegt werden.
  • BEISPIEL 1.
  • Dieses Beispiel beschreibt die Bewertung von murinen 3T3-Zellen, die mit Plasmiden transfiziert wurden, die für humanes FEO RANK (SEQ ID NO:9) kodierende DNA enthalten, und von murinen 3T3-Zellen, die rekombinante, für das humane Wildtyp RANK (SEQ ID NO:1) kodierende DNA exprimieren, bezüglich ihrer relativen Fähigkeit, endogene c-jun-Kinase (JNK) in Abwesenheit von RANK-L-Stimulierung zu aktivieren. Von JNK ist bekannt, das sie als eine Folge der RANK Signaltransduktion aktiviert wird.
  • Für JNK-Assays wurden ganze Zellextrakte aus 3T3-Zellen 24 Stunden nach Transfektion hergestellt. Die Zellen wurden in einem Puffer lysiert, der 20 mM HEPES, pH 7,4, 2 mM EGTA, 50 mM β-Glycerinphosphat, 1 mM DTT, 1 mM Natriumorthovanadat, 1 % Triton-X 100, 10 % Glycerin und die Proteaseinhibitoren Leupeptin, Pepstatin A und PMSF enthält. Geklärte Lysate wurden immunpräzipitiert mit jeweils 1 μg anti-JNK (FL) und anti-JNK (C17) Antikörper (beide von Santa Cruz Biotechnology, Inc. Santa Cruz, CA). Die Immunkomplexe wurden dreimal mit dem Lysepuffer gewaschen, zweimal mit Waschpuffer (500 mM LiCl, 100 mM Tris, pH 7,5, 0,1 % Triton X-100, 1 mM DTT) und dreimal in Assaypuffer (20 mM MOPS, pH 7,0, 2 mM EGTA, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 0,1 % Triton X-100). Die JNK-Aktivität wurde durch ein Immunkomplex-Assay bestimmt, unter Verwendung von 1 μg eines Fusionsproteins aus Glutathion-S-Transferase und Aminosäuren 1–169 der c-jun-Kinase (GST-cJun (1–169)) (UBI, Lake Placid, NY) und 5 μCi an [32P]-ATP als Substrat in 40 μl Assaypuffer bei 30 °C für 20 min. Reaktionsprodukte wurden auf einem 4–20 % SDS/PAGE aufgelöst und durch Autoradiographie sichtbar gemacht.
  • JNK wurde als Reaktion auf die Expression von FEO RANK aktiviert, aber nicht als Reaktion auf die Expression von Wildtyp RANK.
  • BEISPIEL 2
  • Dieses Beispiel beschreibt ein Screening nach Antagonisten von RANK-Signalgebung, unter Verwendung von RAW 264.7-Zellen und einer retroviralen Expressionsbibliothek in einem Assay mit halbfestem Medium.
  • Es wird eine retrovirale cDNA-Bibliothek in pBMNZ konstruiert. Vorzugsweise wird die cDNA gegen eine mRNA synthetisiert, die aus Zellen isoliert wurde, die keine Osteoklasten bilden, d. h. Zellen, die Antagonisten der RANK-Aktivität exprimieren können (z. B. mit GM-CSF oder IL-10 aktivierte Makrophagen). Retrovirale Partikel werden unter Verwendung der Phoenix-Zelllinien (bereitgestellt von Dr. Gary Nolan, Stanford University, USA) und von geeignetem Hüllprotein (wie zum Beispiel ekotropisches Hüllprotein, amphotropisches Hüllprotein oder polytropes Hüllprotein) verpackt. Zum Beispiel werden, im Falle von transient hergestellten retroviralen Vektoren, Phoenix Verpackungszellen mit Konstrukten transfiziert, die in dem retroviralen pBMNZ-Vektor erzeugt wurden, und der Kulturüberstand wird 48 Stunden nach der Transfektion geerntet. Die retroviralen Partikel werden unter Verwendung von Standardtechniken isoliert. Zum Beispiel werden virale Partikel von Membranfragmenten durch sterile Filtration durch einen 0,45 Mikron Filter gereinigt.
  • RAW 264.7-Zellen werden mit der verpackten retroviralen cDNA-Bibliothek unter Bedingungen infiziert, die zu einer optimalen Infektion führen. Zum Beispiel können optimale Infektionsbedingungen bestimmt werden, indem die Expression eines Reportergens überwacht wird, das von einem retroviralen Testkonstrukt exprimiert wird. Retrovirale Konstrukte, die für β-Galactosidase kodieren (z. B. pBMNZ/LZRS; Kinsella und Nolan, 1996, supra), können zur Herstellung von retroviralen Partikeln verwendet werden. Nach Infektion der Zellen mit einer seriellen Verdünnung der Viruskulturen kann die Anzahl an β-Galactosidase exprimierenden Zellen 24 Stunden nach der Infektion überwacht werden. Verschiedene Bedingungen, einschließlich der Wahl des Hüllproteins, der Infektionsmultiplizität, der Länge der Inkubationszeit zur Infektion, der Vorbehandlung der Zellen unter Bedingungen, die den Zellzyklus fördern, Kofaktoren wie Polybren oder rekombinante Fibronektinfragmente, können variiert werden, um die Bedingungen zu bestimmten, unter denen die größte Menge an Testvirus in die Zellen gelangt.
  • Die Zellen werden dann nach einer angemessenen Zeit in ein halbfestes Medium ausplattiert, das eine Expression von cDNAs in den infizierten Zellen ermöglicht. Beispielhafte Bedingungen zum Ausplattieren von infizierten Zellen sind das Ausplattieren von 3 ml 0,3 Gew.-% Methylcellulose-Medium, das infizierte Zellen mit einer Zelldichte von 1 × 105 Zellen/ml bis 1 × 106 Zellen/ml enthält, in jeden Well einer 24-Wellplatte. In das halbfeste Medium wird eine lösliche Leucin-Zipper-Form von RANK-L (200 ng/ml) eingeschlossen.
  • Die Zellen werden über einen Zeitraum von 5 Tagen und 8 Tagen kultiviert und Kolonien, die von der infizierten Zellpopulation abstammen, die deutlich schneller wachsen, als die Kolonien, die von der nicht infizierten Kontrollpopulation abstammen, werden für weitere Analyse isoliert. Zum Beispiel werden die Kolonien von Interesse keimfrei isoliert und weiter in der Abwesenheit von RANK-Aktivierung gezüchtet, um die Anzahl an Zellen zu erhöhen. Die cDNA-Klone innerhalb der Zellen von jeder Kolonie werden durch jegliche auf dem Fachgebiet anerkannte Technik gewonnen, wie beispielsweise RT-PCR der exprimierten viralen Transgene, PCR des eingebauten Provirus oder über eine virale Helferrekombination oder Rückgewinnung der viralen Partikel. Zum Beispiel wurde die Amplifizierung von eingebauten cDNAs beschrieben von Kitamura et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:9146–9150 (1995).
  • Eine Variation dieses Assays zieht einen Vorteil aus der Zellfusion und abschließenden Differenzierung, die auftritt, wenn RAW 264.7-Zellen mit RANK-L in Kontakt gebracht werden. Um diese Variation des Assays auszuführen, werden RAW 264.7-Zellen auf einer 6-Well Kulturplatte ausplattiert, eine lösliche Leuzin-Zipper-Form von RANK-L wird zu diesen Wells gegeben und die Platten werden für 3 bis 5 Tage in der Gegenwart des Leucin-Zipper RANK-L-Polypeptids inkubiert. Die Zellen, die positiv auf das Auslösen von RANK-L reagieren, werden in größere, mehrkernige, differenzierte Osteoklasten fusioniert und verlieren ihr Potenzial, sich in Kultur zu teilen. Wenn gewünscht, können andere Formen von RANK-L außer Leucin-Zipper RANK-L als das Stimulans in diesem Assay verwendet werden. Um dieses Assay zu verwenden, um verschiedene Mittel auf ihre Fähigkeit, eine antagonistische Wirkung auf RANK auszuüben, zu prüfen, wird putativer Antagonist zu den Wells gegeben, vor und/oder während es dem RANK-Stimulans ausgesetzt ist. Setzt ein Kandidatenantagonist, wie beispielsweise eine exprimierte cDNA, die Reaktion von Zellen auf RANK-L außer Kraft, behalten die Zellen ihre Fähigkeit, sich in diesen Kulturen zu teilen, bei. Zellen aus diesen Platten, die weiterhin in Kultur wachsen können, können abgetrennt und aus den fusionierten, differenzierten Osteoklasten durch kräftiges Pipettieren oder durch Trypsin-Verdauung gewonnen werden. Diese gewonnenen Zellen werden in normalen Wachstumsmedien in der Lage sein, in der Abwesenheit von RANK-L zu wachsen, und können so unter Verwendung von herkömmlichen Techniken ausgezählt und vermehrt werden. Wie oben beschrieben, werden die cDNAs innerhalb der vermehrten Zellen durch herkömmliche Techniken gewonnen, wie beispielsweise Reverse Transkriptase-PCR der exprimierten viralen Transgene, PCR des eingebauten Provirus oder über eine virale Helferrekombination oder Rückgewinnung der viralen Partikel.
  • BEISPIEL 3
  • Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung einer RANK-reaktiven Zelllinie, die RANKΔ340-421 exprimiert (siehe Galibert et al., 1998 für eine Beschreibung von RANKΔ340-421).
  • Es wurden Milzzellen aus 3–6 Wochen alten RANK-/- Mäusen isoliert (die einen Defekt bei der Osteoklastenbildung aufweisen und osteopetrotisch sind) und wurden auf die folgende Weise an Linien depletiert. T-Zellen wurden durch Immunabsorption unter Verwendung von biotinylierten anti-CD3 Antikörpern entfernt; erythroide Zellen wurden durch Immunabsorption unter Verwendung von biotinylierten anti-Ter-119 Antikörpern entfernt und Granulozyten wurden durch Immunabsorption unter Verwendung von biotinylierten Anti-GR-1 Antikörpern entfernt. Diese Antikörper-Zell-Komplexe wurden durch Binden der Biotineinheit an mit Streptavidin konjugierte magnetische Beads entfernt, die anschließend über eine metallische MACS-Depletionssäule passiert wurden.
  • Die an Linien depletierten Zellen wurden dann für 48 Stunden in 40 ng/ml CSF-1 inkubiert und unter Verwendung von retroviralen Überständen (MOI von 5) in der Gegenwart von rekombinanten Fibronektinfragmenten (Retronectin, PanVera Corp, Madison, WI) für zusätzliche 48 Stunden in 40 ng/ml CSF-1 infiziert. Nach der Infektion wurden die Milzzellen geerntet und in MEM 10 % FBS ausplattiert, das 40 ng/ml CSF-1 und 200 ng/ml murines RANK-L enthielt. Die Zellen wurden unter diesen Bedingungen für 5 Tage kultiviert, um die Differenzierung zu Osteoklasten zu ermöglichen. Die Retroviren, die für die Transfektion verwendet wurden, wurden durch Subklonierung von für RANKΔ340-421 kodierende DNA in den pBMNZ-Vektor hergestellt (Kinsella and Nolan, 1996, Human Gene Therapy 7:1405–1413). Die gesamte RANKΔ340-421 cDNA wurde aus pDC304/RANKΔ340-421 ausgeschnitten (Galibert et al., J. Biol. Chem. 273:34120, 1998), unter Verwendung der Restriktionsendonucleasen BglII und NotI. Dieses cDNA-Insertionsfragment wurde in den retroviralen Vektor pBMNZ ligiert (Kinsella and Nolan, 1996, supra), der mit BamHI und NotI verdaut wurde. Das resultierende Plasmid wurde gereinigt, die DNA-Sequenz bestätigt und mit pBMNZ/RANKΔ340-421 bezeichnet. Die Herstellung von infektiösen, retroviralen Vektorpartikeln in 293-E Phoenix Verpackungszellen wurde ausgeführt wie beschrieben (Kinsella und Nolan, 1996, supra).
  • BEISPIEL 4
  • Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung von Promotor/Reporter-Vektoren des murinen MMP-9-Promotors (SEQ ID NO: 11), der an den humanen IL-2α-Rezeptor fusioniert ist.
  • Ein DNA-Fragment, das die Promotorregion des murinen MMP-9-Gens enthält, wurde wie folgt mit einem cDNA-Molekül fusioniert, das für den humanen IL-2α-Rezeptor kodiert. Ein Plasmid, das 4,15 kb der murinen MMP-9-Promotorregion (SEQ ID NO: 11) enthält, wurde in den promotorlosen pGL2 Basic-Vektor einkloniert (Promega, Madison, 25 WI), der das Luciferase-Reportergen enthält, wie beschrieben von Roach et al., Gene 208:117–122 (1998). Das resultierende Plasmid wurde mit pGB-coINK1 bezeichnet. Ein ungefähr 3,5 kb SmaI/EcoRI-Fragment, das die 5'-benachbarte MMP-9-Promotersequenz (SEQ ID NO:11) enthält, wurde aus pGB-coINK1 ausgeschnitten und in den SIN retroviralen Vektor pSIR (Clontech) an der BamHI-Stelle subkloniert, die geglättet worden war.
  • Eine für den humanen IL-2α-Rezeptor kodierende cDNA wurde in CAVNOT subkloniert, wie beschrieben in Cosman, D., et al. "Cloning and expression of human and mouse 1L-2 receptor cDNAs". In: Lymphokines: Molecular Cloning and Analysis of Lymphokines. D.R. Webb und D.V. Goeddel (Hrgs.) Academic Press, 1987, S. 109.
  • Die cDNA für den humanen IL-2α-Rezeptor wurde aus dem CAVNOT-Konstrukt unter Verwendung von PCR amplifiziert, so dass das 5'-Ende so modifiziert wurde, dass es eine BglII-Stelle enthielt, und das 3'-Ende wurde so modifiziert, dass es eine PflM1-Stelle enthielt. Dieses amplifizierte Produkt wurde in den pGEM-T-Vektor (Promega) ligiert. Die cDNA für den humanen IL-2α-Rezeptor wurde aus diesem Plasmid unter Verwendung von BglII und PflM1 Restriktionsstellen ausgeschnitten und in pGL2 Basic (Promega) ligiert, welcher mit BglII und PflM1 verdaut wurde, um die Luciferase-Reporter-cDNA auszuschneiden. Der humane IL-2α-Rezeptor ersetzt so den Luciferasereporter in pGL2 und das resultierende Plasmid wurde als pGL2/hIL-2-Rezeptor bezeichnet.
  • Der pGL2/hIL-2-Rezeptor wurde mit KpnI und BglII innerhalb des Polylinkers stromaufwärts der cDNA verdaut, die für den humanen IL-2α-Rezeptor kodiert. Ein 3,5 kb KpnI/NheI-Fragment, das aus dem pGB-colNK1-Plasmid isoliert wurde, das für den MMP-9-Promotor (SEQ ID NO: 11) kodiert, und das zusammenhängenden NheI bis BglII (653 bp) Fragment des verbleibenden MMP-9-Promotors wurden in einer trimolekularen Ligation mit dem pGL2/hIL-2-Rezeptor ligiert unter Bildung des Plasmids, das mit pGL2-MMP-9/humaner IL-2-Rezeptor bezeichnet wurde, in welchem die gesamte 5'-benachbarte 4,15 kb Sequenz der Maus-MMP-9 benachbarten Region direkt stromaufwärts der cDNA für den hIL-2α-Rezeptor fusioniert wurde. Dieses Konstrukt zeigt Reaktionsfähigkeit auf RANK. Um die inhibitorische Aktivität eines Kandidatenmoleküls unter Verwendung dieses Systems zu untersuchen, kann das Kandidatenmolekül vor, gleichzeitig mit oder nach Zugabe des Agonisten für die RANK-Aktivität zugegeben werden. Der Level an IL-2α-Rezeptorexpression auf der Oberfläche ist ein Maß für den Level an RANK-Aktivierung.
  • Die Lokalisierung des RANK-reaktiven Teils des MMP-9-Promotors wurde enger identifiziert, indem weitere Trunkierungen des Promotors untersucht wurden. Ein PVUII/BGL2-Restriktionsfragment, welches das 5'-proximale 1822 bp des MMP-9-Promotors enthält, wurde mit einem BLGII/EcoRI-Restriktionsfragment fusioniert, das für den humanen IL-2-Rezeptor in der multiplen Klonierungsstelle des pSIR retroviralen Vektors (Clontech) kodiert. Das resultierende Plasmid, das pSIR/MMP-9 genannt wurde, reagiert auf RANK und ist in Assays zur Identifizierung von RANK-Antagonisten von Nutzen. Die Region des MMP-9-Promotors, der in pSIR/MMP-9 vorkommt, entspricht den Nucleotiden 1769–3591 von SEQ ID NO:11.
  • pSIR/MMP-9 wurde wie folgt in die RANK-reaktiven Zellen eingeführt. Es wurden retrovirale Partikel nach Transfektion von 293/E Verpackungszellen mit pSIR/MMP-9 hergestellt. RAW 264.7-Zellen wurden mit diesen Partikeln infiziert und gegen Neomycin resistente Kolonien, die den Reporter stabil exprimierten, wurden isoliert. Behandlung dieser Zellen mit RANK-L führte zu einer Erhöhung der Expression auf der Zelloberfläche des hIL-2αR, wie durch Durchflusscytometrie unter Verwendung des Maus-mAb (Klon 2A3) anti-humanem IL-2αR als Reagenz für den Nachweis des IL-2R nachgewiesen. Expression von hIL-2α-Rezeptor wurde innerhalb von 4 Stunden beobachtet und erreichte den maximalen beobachteten Level innerhalb von 48 Stunden.
  • Oberflächenexpression von humanem IL-2α-Rezeptor wird durch Durchflusscytometrie auf die folgende Weise nachgewiesen. Es wurden Zellen geerntet und bekannte, spezifische Antikörperbindungsstellen wurden unter Verwendung einer PBS-Lösung blockiert, die 5 % normales Ziegenserum enthielt, für 30 Minuten bei 4 C. Die Zellen wurden dann gewaschen und mit dem monoklonalen Antikörperklon des anti-humanen IL-2α-Rezeptors bei einer Antikörperkonzentration von 5 μg/ml für 1 Stunde bei 4 C inkubiert. Im Anschluss an diese Inkubation wurden die Zellen gewaschen, und ein fluoreszierend konjugierter, sekundärer anti-Maus IgG-Antikörper wird mit Zellen für weitere dreißig Minuten bei 4 C inkubiert. Nach dem Waschen der Zellen wurde die Fluoreszenzintensität unter Verwendung eines Durchflusscytometers gemessen, wie beispielsweise einem FACS-Scan (Becton Dickinson).
  • Zusätzlich kann die Oberflächenexpression von humanem IL-2α-Rezeptor unter Verwendung eines radioaktiven Antikörpers gegen den IL-2α-Rezeptor analysiert werden. Für das mIL-4R-spezifische Radioimmunassay wurde ein monoklonaler Maus anti-humaner IL-2α-Antikörper, der mit mIL-4R reagiert, mit 125I über das Chloramin T-Konjugationsverfahren markiert; die resultierende spezifische Aktivität beträgt typischerweise 1,5 × 1016 cpm/nmol. Nach 48 Stunden wurden mit pGL2-MMP-9/humanem IL-2-Rezeptor transfizierte Zellen einmal mit Medien (DMEM, 12 5% FBS) gewaschen. Nicht spezifische Bindungsstellen wurden durch die Zugabe von vorgewärmten Bindungsmedien, die 5 % fettfreie trockene Milch enthielten, und Inkubation bei 37° C/5% CO2 in einem Inkubator für Gewebekultur für eine Stunde blockiert. Die blockierende Medien wurden abdekantiert und Bindungspuffer, der 125I anti-mIL-4R (Klon M1; Ratten IgG1) enthielt, wurde zu den Zellen gegeben und unter Schütteln bei Raumtemperatur für 1 Stunde inkubiert. Nach Inkubation der Zellen mit dem radioaktiv markierten Antikörper wurden die Zellen ausgiebig mit Bindungspuffer (2 ×) und zweimal mit Phosphat gepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen. Die Zellen wurden in 1 ml 0,5M NaOH lysiert und die Gesamtradioaktivität wurde mit einem Gammazähler gemessen. Unter Verwendung dieses Assays zeigten 293/EBNA, die mit für RANK kodierenden DNAs cotransfiziert wurden, transkriptionelle Aktivierung, wie durch den Nachweis von muIL-4R auf der Zelloberfläche gezeigt. Überexpression von RANK führt zu einer Transkription von muIL-4R, was auch durch das Auslösen von RANK durch RANK-L bewirkt wurde. Gleichartige Ergebnisse werden beobachtet, wenn RANK von agonistischen Antikörpern ausgelöst wird.
  • Weiterhin können Zellen, die den humanen IL-2α-Rezeptor auf ihrer Oberfläche exprimieren, unter Verwendung einer Panning-Technik isoliert werden, wie beispielsweise der Technik, die beschrieben wird von Aruffo und Seep, PNAS 84:8573–8577 (1987). Kurz gesagt, wird ein zweiter Antikörper, der den ersten Antikörper erkennt, auf bakteriologischen 60 Millimeter Platten immobilisiert. Die Zellen, die einem Panning unterzogen werden sollen, werden als Einzelzell-Suspension in PBS hergestellt, das 0,5 mM EDTA und 5% FBS enthielt. Die Antikörper für den Zelloberflächenmarker werden mit etwa 5 μg/ml zugegeben, worauf sich Inkubation auf Eis für 30 Minuten anschließt. Die Zellen werden einmal gewaschen und zu den mit dem zweiten Antikörper beschichteten Platten in PBS/EDTA/5% FBS gegeben und bei Raumtemperatur für 1–3 Stunden inkubiert. Überschüssige Zellen, die nicht auf der Platte haften, werden durch sanftes Waschen mit PBS/5% FBS entfernt.
  • BEISPIEL 5
  • Dieses Beispiel beschreibt die Aktivierung des TRAP-Promotors. Ein 2,6 kb DNA-Fragment, welches den humanen TRAP-Promotor enthält, wurde durch Verdauung des Plasmids pBL2HT2.2 mit der Restriktionsendonuclease ApaI erhalten. Das Klonieren der 5'-Region des humanen TRAP-Gens und die Konstruktion von pBL2HT2.2 werden vollständig beschrieben in Reddy et al. (Bone 16:587–593 (1995)). Eine DNA, die den TRAP-Promotor der Maus (SEQ ID NO:12) enthält, und eine DNA, die den murinen MMP-9-Promotor (SEQ ID NO:11) enthält, wurden ebenfalls für diese Experimente verwendet. DNAs, welche die Promotoren enthielten, wurden mit dem Luciferase-Reportergen fusioniert. Diese Promotor/Reporter-Konstrukte wurden in humane 293/EBNA Zellen transfiziert, zusammen mit verschiedenen Kombinationen von Expressionsvektoren, die für humane Volllängen-RANK- (SEQ ID NO:2) und humane Volllängen-RANK-L-Proteine (SEQ ID NO:6) kodieren.
  • Für den TRAP-Promotor der Maus (SEQ ID NO:12), wurden 2 × 105 293/EBNA Zellen transfiziert unter Verwendung von DEAE/Dextran mit 40 ng eines Plasmids, das für ungefähr 2 kb des TRAP-Promotors der Maus (SEQ ID NO: 12) kodiert, fusioniert an einen Luciferasereporter, 20 ng eines Expressionsvektors, der für RANK-L (SEQ ID NO:6) kodiert, und 0,4 ng eines Expressionsvektors, der für RANK (SEQ ID NO:2) kodiert. Vierundzwanzig Stunden nach der Transfektion wurde die Luciferaseaktivität in Zelllysaten gemäß den Vorschriften des Herstellers (Promega) unter Verwendung eines EG&G/Berthold Luminometers gemessen. Die Expression von RANK war ausreichend, um die Reporterexpression zu verstärken (ungefähr um das Zweifache), während die Kombination aus RANK (SEQ ID NO:2) und RANK-L (SEQ ID NO:6) die Reporterexpression ungefähr um das Vierfache verstärkte.
  • Für den humanen TRAP-Promotor wurde das 1,9 kb ApaII-Fragment, das die Promotoraktivität isoliert von der Region stromaufwärts des humanen TRAP-Gens (Reddy et al., 1995) enthält, mit einem Luciferasereporter fusioniert und in 293/EBNA-Zellen transfiziert (40 ng). Die Kombination aus humanem RANK (SEQ ID NO:2) und humanem RANK-L (SEQ ID NO:6) verstärkte die Reporterexpression ungefähr um das 1,5fache.
  • Für die Experimente mit murinem MMP-9-Promotor wurden 4,1 kb des murinen MMP-9-Promotors (SEQ ID NO:11) mit einem Luciferase-Gen fusioniert und in 293/EBNA Zellen transfiziert (40 ng). Transfektion von entweder RANK (SEQ ID NO:2) allein oder der Kombination aus RANK (SEQ ID NO:2) und RANK-L (SEQ ID NO:6) verstärkte die Reporterexpression ungefähr um das 2,5fache.
  • Außerdem wurden RAW 264.7-Zellen (6 × 106 Zellen) mit 15 μg MMP-9 (SEQ ID NO:11)/Luciferase-Plasmid-DNA unter Verwendung von DEAE/Dextran transfiziert. Zwei Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen in zwei gleiche Mengen geteilt und weiter für 24 Stunden inkubiert. Zugabe von 1 μg/ml einer Leucin-Zipper-Form von murinem RANK-L für 18 Stunden war ausreichend, um den MMP-9 (SEQ ID NO:11)/Luciferasepromotor 10-15fach zu induzieren.
  • Quantitative RT-PCR-Messungen von Maus-TRAP und Maus-MMP-9 mRNA in RAW 264.7-Zellen nach Behandlung mit entweder Maus-RANK-L/LZ (200 ng/ml) oder TNFα (20 ng/ml) für verschiedene Zeiträume ergab, dass TRAP mRNA durch RANK-L um mehr als das 250fache erhöht wird, aber von TNFα nur um etwa das 2,3fache verstärkt wird. MMP-9 mRNA wird durch RANK-L um mehr als das 350fache erhöht, aber nicht durch TNFα verstärkt. Diese Spezifizität ist für das Screening nach Inhibitoren der RANK-Signaltransduktion hilfreich.
  • BEISPIEL 6
  • Dieses Beispiel erläutert die Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen RANK-L. Präparate mit gereinigtem rekombinantem RANK-L, zum Beispiel, oder mit TransFix behandelte Zellen, die hohe Level an RANK-L exprimieren, werden eingesetzt, um monoklonale Antikörper gegen RANK-L zu erzeugen, unter Verwendung von herkömmlichen Techniken, wie sie im U.S. Pat. No. 4,411,993 beschrieben werden, welches durch Bezugnahme hier aufgenommen wird. Für RANK-L kodierende DNA kann ebenfalls als ein Immunogen verwendet werden, zum Beispiel wie in dem Review von Pardoll und Beckerleg in Immunity 3: 165, 1995 beschrieben. Solche Antikörper sind wahrscheinlich von Nutzen, um bei der RANK-L-Signalgebung zu stören (antagonistische oder blockierende Antikörper), als Bestandteile von diagnostischen oder Forschungsassays für RANK-L- oder RANK-L-Aktivität oder bei der Affinitätsreinigung von RANK-L.
  • Die DNA kann intradermal gegeben werden (Raz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 9519, 1994) oder intramuskulär (Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 4156, 1993); es wurde gefunden, dass Kochsalzlösung ein geeignetes Verdünnungsmittel für auf DNA basierende Antigene ist. Zehn Tage bis drei Wochen später werden die immunisierten Tiere mit zusätzlichem Immunogen reimmunisiert und danach periodisch nach einem wöchentlichen, zweiwöchentlichen oder einem Immunisierungszeitplan für alle drei Wochen reimmunisiert.
  • Es wurden periodisch Serumproben durch retroorbitalen Aderlass oder Entfernung der Schwanzspitze entnommen, um durch Dot-Blot-Assay (Antikörper-Sandwich), ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), Immunfällung oder andere geeignete Assays einschließlich FACS-Analyse zu untersuchen. Im Anschluss an den Nachweis eines geeigneten Antikörpertiters wird positiven Tieren eine intravenöse Injektion mit Antigen in Kochsalzlösung gegeben. Drei bis vier Tage später werden die Tiere geopfert, die Milzzellen geerntet und mit einer murinen Myeloma-Zelllinie fusioniert (z. B., NS1 oder vorzugsweise Ag 8.653 [ATCC CRL 1580]). Die durch diesen Arbeitsgang erzeugten Hybridoma-Zelllinien werden auf multiplen Mikrotiterplatten in einem selektiven Medium (zum Beispiel einem, das Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin, oder HAT, enthält) ausplattiert, um Proliferation von nicht fusionierten Zellen, Myelom-Myelom-Hybriden und Milzzellen-Milzzellen-Hybriden zu inhibieren.
  • Die so erzeugten Hybridoma-Klone können mittels ELISA auf Reaktivität mit RANK-L gescreent werden, zum Beispiel, durch Anpassungen der Techniken, die in Engvall et al., (Immunochem. 8: 871, 1971) und im U.S. Patent 4,703,004 beschrieben werden. Eine bevorzugte Screening-Technik ist die von Beckmann et al., J. Immunol. 144:4212, 1990, beschriebene Antikörpqer-Fangmethode. Positive Klone werden dann in die peritonealen Hohlräume von syngeneischen Nagern injiziert, um Aszites zu erzeugen, die hohe Konzentrationen (> 1 mg/ml) an monoklonalen Anti-RANK-L Antikörpern enthalten. Die resultierenden monoklonalen Antikörper können durch Ammoniumsulfat-Fällung, gefolgt von Gelausschlusschromatographie gereinigt werden. Alternativ kann auch Affinitätschromatographie basierend auf der Bindung eines Antikörpers an Protein A oder Protein G verwendet werden, sowie Affinitätschromatographie basierend auf der Bindung an ein RANK-L-Protein. Unter Verwendung der hier beschriebenen Verfahren zur Überwachung der Aktivität der mAbs, werden sowohl blockierende (d.h., Antikörper, die RANK-L binden und Bindung an RANK inhibieren) wie auch nicht blockierende (d.h., Antikörper, die RANK-L binden und die Bindung nicht inhibieren) isoliert.
  • BEISPIEL 7
  • Dieses Beispiel erläutert die Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen RANK.-Präparate mit gereinigtem, rekombinantem RANK, zum Beispiel, oder transfizierte Zellen, die hohe Level an RANK exprimieren, werden eingesetzt, um monoklonale Antikörper gegen RANK zu erzeugen, unter Verwendung von herkömmlichen Techniken, wie sie im U.S. Pat. Nr. 4,411,993 beschrieben werden. Für RANK kodierende DNA kann ebenfalls als ein Immunogen verwendet werden, zum Beispiel, wie in dem Review von Pardoll und Beckerleg in Immunity 3:165, 1995 beschrieben.
  • Die DNA kann intradermal gegeben werden (Raz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 9519, 1994) oder intramuskulär (Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:4156: 1993,); es wurde gefunden, dass Kochsalzlösung ein geeignetes Verdünnungsmittel für auf DNA basierenden Antigene ist. Zehn Tage bis drei Wochen später werden die immunisierten Tiere mit zusätzlichem Immunogen reimmunisiert und danach periodisch nach einem wöchentlichen, zweiwöchentlichen oder einem Immunisierungszeitplan für alle drei Wochen reimmunisiert.
  • Es wurden periodisch Serumproben durch retroorbitalen Aderlass oder Entfernung der Schwanzspitze entnommen, um durch Dot-Blot-Assay (Antikörper-Sandwich), ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), Immunfällung oder andere geeignete Assays einschließlich FACS-Analyse zu untersuchen. Im Anschluss an den Nachweis eines geeigneten Antikörpertiters wird positiven Tieren eine intravenöse Injektion mit Antigen in Kochsalzlösung gegeben. Drei bis vier Tage später werden die Tiere geopfert, die Milzzellen geerntet und mit einer murinen Myeloma-Zelllinie fusioniert (z. B., NS1 oder vorzugsweise Ag 8.653 [ATCC CRL 1580]). Die durch diesen Arbeitsgang erzeugten Hybridoma-Zelllinien werden auf multiplen Mikrotiterplatten in einem selektiven Medium (zum Beispiel einem, das Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin, oder HAT, enthält) ausplattiert, um Proliferation von nicht fusionierten Zellen, Myelom-Myelom-Hybriden und Milzzellen-Milzzellen-Hybriden zu inhibieren.
  • Die so erzeugten Hybridoma-Klone können mittels ELISA auf Reaktivität mit RANK gescreent werden, zum Beispiel, durch Anpassungen der Techniken, die in Engvall et al., (Immunochem. 8: 871, 1971) und im U.S. Patent 4,703,004 beschrieben werden. Eine bevorzugte Screening-Technik ist die von Beckmann et al., J. Immunol. 144:4212, 1990, beschriebene Antikörper-Fangmethode. Positive Klone werden dann in die peritonealen Hohlräume von syngeneischen Nagern injiziert, um Aszites zu erzeugen, die hohe Konzentrationen (> 1 mg/ml) an monoklonalen anti-RANK Antikörpern enthalten. Die resultierenden monoklonalen Antikörper können durch Ammoniumsulfat-Fällung, gefolgt von Gelausschlusschromatographie gereinigt werden. Alternativ kann auch Affinitätschromatographie basierend auf der Bindung eines Antikörpers an Protein A oder Protein G verwendet werden, sowie Affinitätschromatographie, basierend auf der Bindung an ein RANK-Protein.
  • Es werden monoklonale Antikörper unter Verwendung von RANK/Fc-Fusionsprotein als dem Immunogen erzeugt. Diese Reagenzien wurden gescreent, um Reaktivität gegen das RANK-Protein zu bestätigen. Unter Verwendung der hier beschriebenen Verfahren zur Überwachung der Aktivität der mAbs, wurden sowohl blockierende (d.h., Antikörper, die RANK binden und Bindung eines Liganden an RANK inhibieren) wie auch nicht blockierende (d.h., Antikörper, die RANK binden und die Liganden-Bindung nicht inhibieren) isoliert.
  • BEISPIEL 8
  • In diesem Assay werden Testmoleküle identifiziert, die eine mit RANK einhergehende Aktivität modulieren können, indem die Induktion von c-src Tyrosinkinase oder F-Aktinringbildung in der Gegenwart des Testmoleküls gemessen wird.
  • Es wurden Experimente ausgeführt, in denen DNA, die für Wildtyp oder humane RANK/TRAF6 Bindungsmutanten (RANKΔ340-421) kodiert, in aus RANK-/- Mäusen isolierte, hämatopoetische Zellen eingeführt wurden. Volllängen- und mutierte humane RANK DNAs wurden in den retroviralen pBMNZ Vektor subkloniert, wie früher beschrieben (Kinsella und Nolan, 1996, Human Gene Therapy 7:1405–1413). Infektiöse, RANK enthaltende Retroviren wurden in 293-E Phoenix Verpackungszellen hergestellt, wie beschrieben (Kinsella und Nolan, 1996). Es wurden Überstände von diesen Zellen als eine Quelle für infektiöse Viruspartikel verwendet.
  • Die Erzeugung der in diesen Assays verwendeten RANK-/- Mäuse wurde bereits früher beschrieben (Dougall et al., 1999). Milzzellen wurden aus 3–6 Wochen alten RANK-/- Mäusen isoliert und auf Vorläufer von Osteoklasten durch Depletion der anfänglichen Zellpopulation um verschiedene Arten von Zellen außer den Vorläufern von Osteoklasten angereichert. Für diesen „Depletions" schritt wurden die Zellen mit biotinylierten Antikörpern gegen CD3 (spezifisch für T-Zellen), Ter-119 (spezifisch für Erythrozyten) und GR-1 (spezifisch für Granulozyten) inkubiert. Nachdem die Antikörper an ihre jeweiligen Zielzellen gebunden hatten, wurden mit Streptavidin konjugierte, magnetische Beads zu der Kultur gegeben und die Zellmischung wird über magnetische Säulen passiert (MACS Depletionssäulen; MILLTENNYI). Zellen, die nicht an den MACS-Säulen haften blieben, galten als mit Vorläufern für Osteoklasten angereichert und wurden für die Assays verwendet. Die mit Vorläufern für Osteoklasten angereicherten Zellen wurden dann für 48 Stunden in 40 ng/ml CSF-1 inkubiert, bevor sie mit den retroviralen Überständen (MOI von 5) in der Gegenwart von rekombinanten Fibronektinfragmenten (Retronectin, PanVera Corp, Madison, WI) für zusätzliche 48 Stunden in 40 ng/ml CSF-1 infiziert wurden. Sowohl die Zellen wie auch die Viruspartikel neigen zu einer Haftung an Fibronektin, so dass die Fibronektinfragmente dazu dienten, die Geschwindigkeit der Infektion durch Erzeugung einer lokalen hohen Konzentration sowohl an Zellen und Virus zu verstärken. Im Anschluss an die Infektion wurden die Zellen geerntet und in a-MEM 10 % fötalem Rinderserum, das 40ng/ml CSF-1 und 200 ng/ml mRANK-L enthielt, ausplattiert und für 5 Tage in diesem Medium inkubiert.
  • Bei infizierten Kulturen, die Wildtyp RANK-DNA erhielten, waren die c-src-Level im Anschluss an die Differenzierung ziemlich hoch. In einem typischen Experiment bauen Extrakte von Wild-typ RANK exprimierenden Zellen etwa 15-mal mehr 32P in ein c-src-spezifisches Substrat ein, als Extrakte aus Zellen, denen es an RANK fehlt. Sowohl fötales Rinderserum wie auch CSF-1 tragen zum Grundlevel der c-src Aktivität bei; daher wurde dieser Grundlevel durch „Hungern lassen" der Zellen für 18 Stunden in MEM, das 0,5 % an Stelle von 10 % fötales Rinderserum enthielt und 10 ng/ml an Stelle von 40 ng/ml CSF-1, gefolgt von 2 Stunden in MEM, das 0,5 % FBS und kein CSF-1 enthielt, vermindert.
  • Um c-src und F-Aktinringe zu induzieren, wurde rekombinantes mRANK-L/Leucin-Zipper-Protein zu den Kulturen in einer Konzentration von 1 μg/ml zu verschiedenen Zeiten gegeben, nach denen die Zellen in einem Puffer lysiert wurden, der 50 mM HEPES (pH 7,2), 10 % Glycerin, 250 mM NaCl und 1 % Triton X-100 enthielt. Das c-src-Protein wurde durch Immunfällung unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers GD-11 gereinigt. C-src-Aktivität in dem Immunkomplex wurde unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Kits überwacht (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY). Kurz gesagt, verursacht die Messung der c-src-Aktivität die Messung der Phosphotransferase-Aktivität unter Verwendung von γ-markiertem ATP und dem p34/cdc2-Peptid (KVEKIGEGTYGVVYK) (SEQ ID NO: 13), welches ein Substrat für die c-src Kinase bietet. Die Kinaseassays wurde bei 30 °C für 10 Minuten in einem Puffer inkubiert, der 10 μCi an gamma-markiertem ATP, MnCl2 (75 mM), ATP (500 μM), MOPS (20 mM), beta-Glycerinphosphat (25 mM), EGTA (5 mM), Natriumorthovanadat (1 mM) und Dithiothrietol (1 mM) enthielt. Das phosphorylierte Substratpeptid wurde dann von dem restlichen markierten ATP unter Verwendung von Phosphocellulosepapier abgetrennt und markiertes Peptid wurde unter Verwendung eines Sczintillationszählers quantifiziert. Die Immunfällung und das in vitro Immunkomplex-Kinase-Assay wurden ausgeführt wie beschrieben (Musch, et al. J. Biol. Chem. (1999) 274:7923–7928).
  • Wurde c-src Induktion wie oben beschrieben untersucht, wurde beobachtet, dass wenn Zellen zu einer Differenzierung nach der Einführung eines Volllängen-RANK Transgens induziert wurden, die Zellen hohe Level an c-src-Aktivität enthielten. Im Gegensatz dazu, unterscheidet sich die c-src-Aktivität nicht merklich von den Untergrundlevel in Extrakten von Zellen, die nach Infektion mit entweder einem Kontrollvirus (der für lacZ kodiert) oder mit RANK-DNA, welcher die TRAF6 Bindungsdomäne fehlt (RANK Δ340-421), ausdifferenzierten. Untergrundlevel wurden unter Verwendung von RANK-/- Zellen bestimmt, die nicht mit Retrovirus infiziert waren.
  • Ein Verfahren, um F-Aktinringe nachzuweisen, wurde wie folgt ausgeführt. Primäre hämatopoetische Zellen von den RANK-/- Mäusen wurden mit retroviralen Konstrukten infizierte, die entweder für humane Volllängen-RANK cDNA oder die RANK/TRAF6 Bindungsmutante (RANK Δ340-421) kodieren. Zellen wurden auf LabTek Chamber Objektträgern mit #1 Borsilicat-Abdeckplatten (Nalge/Nunc) kultiviert. Nach Inkubation für 5 Tage in MEM, das 10 % fötales Rinderserum enthielt, das 40 ng/ml CSF-1 und 200 ng/ml mRANK-L enthielt, wurde das Medium abgesaugt, zweimal in PBS gewaschen und dann in einer Lösung aus 3 %igem Paraformaldehyd für 10 Minuten fixiert und im Anschluss daran in 50 mM NH4Cl abgeschreckt. Die F-Aktinringe wurden durch Anfärben der Zellen mit einer fluoreszenten Sonde für Aktin, Phalloidin (Molecular Probes, Eugene, OR), sichtbar gemacht. Das Fluoreszenzsignal wurde unter Verwendung eines standardmäßigen Fluoreszenzmikroskops nachgewiesen, und die F-Aktinringe wurden als zusammenhängende Ringe von F-Aktin in den Außenbereichen der einzelnen Zellen identifiziert.
  • Die F-Aktinringe wurden in den Zellen durch Anfärben mit fluoreszierendem Phalloidin sichtbar gemacht. Bei mit Wildtyp RANK-DNA infizierten Zellen wurden F-Aktinringe in mehr als 50 % der Zellen nachgewiesen. Wenn die Zellen jedoch mit der humanen RANK/TRAF6 Bindungsmutante infiziert worden waren, wiesen alle Zellen eine unorganisierte zytoskelettale F-Aktin-Struktur auf und es wurden keine F-Aktinringe unterschieden.
  • Um nach einem Agonisten der RANK-Aktivität zu suchen, wird ein Testmolekül zu dem Kulturmedium gegeben, während es dem RANK-L ausgesetzt wird oder nachdem der Differenzierungsschritt vollständig ist. Wenn das Testmolekül ein Agonist der RANK-Aktivität ist, werden Zellen, die mit der oben beschriebenen Deletionsmutante infiziert sind, F-Aktinringe exprimieren oder werden eine nachweisbare c-src-Aktivität exprimieren oder beides. RANK-Agonisten jedoch, welche die Gegenwart einer TRAF6 Bindungsstelle in dem RANK-Molekül benötigen, werden in RANK-/- Zellen, die mit einer RANK TRAF6 Deletionsmutante infiziert sind, nicht positiv testen.
  • BEISPIEL 9
  • Die Resorption von Ca3(PO4)2, auf welcher dieses Assay beruht, gilt als ein Maß für die Osteoklasten-Aktivität. Es wurden Milzzellen aus 3–6 Wochen alten RANK-/- Mäusen isoliert und wie in Beispiel 8 beschrieben behandelt, um Zellen zu entfernen, welche die CD3-, Ter-119- und GR-1-Antigene exprimieren. Zellen, die keines dieser Antigene exprimieren, wurden geerntet und wie in Beispiel 8 beschrieben mit retroviralen Vektorpartikeln infiziert, die Volllängen- oder Deletionsmutanten der TRAF6-Bindungsstelle von RANK enthielten.
  • Im Anschluss an die Infektion wurden die Milzzellen geerntet und in MEM, das 10 % fötales Rinderserum enthielt, das 40 ng/ml CSF-1 und 200 ng/ml mRANK-L enthielt, auf 16 Well Quarzobjektträgern ausplattiert, die mit einem dünnen Film aus Ca3(PO4)2 beschichtet waren (Osteologic, BD Biosystems). Nach 5 Tagen in Kultur wurden die Objektträger gewaschen, die Zellen durch Waschen mit Bleiche entfernt und die Zellen wiederum mit Puffer gewaschen. Zellen, die mit Volllängen-RANK infiziert worden waren, resorbieren die Ca3(PO4)2-Matrix, wie durch eine Vielzahl an klaren Vertiefungen (auch resorptive Lakunen genannt) bestimmt, die durch Phasenkontrastmikroskopie sichtbar gemacht wurden. Die Anzahl an Vertiefungen in dem Ca3(PO4)2-Film ist ein Maß für das Ausmaß, in dem das RANK-L die auf diesem Objektträger gezüchteten Zellen dazu induzierte, zu Osteoklasten zu differenzieren.
  • Wenn gewünscht, kann der Ca3(PO4)2-Film angefärbt werden, unter Verwendung einer 0,5 %igen Lösung von Alizarinrot für 4 bis 5 Minuten, gefolgt von Waschen in Wasser. Nach dem Anfärben werden die resorptiven Lakunen durch Phasenkontrastmikroskopie als ein klares Gebiet auf einem roten Hintergrund sichtbar gemacht.
  • Zellen, die unter Verwendung des Volllängen-RANK Transgens differenziert wurden, enthielten höhere Level an Ca3(PO4)2-Resorption. Während Zellen, die entweder mit einem Kontrollvirus (kodierend für lacZ) oder mit dem RANK-Konstrukt, dem die TRAF6 Bindungsdomäne (RANKΔ340-421) fehlt, differenziert wurden, wiesen unbedeutende Level an Ca3(PO4)2-Resorption auf. Während die bevorzugte Ausführungsform der Erfindung dargestellt und beschrieben wurde, ist zu erkennen, dass daran verschiedene Veränderungen durchgeführt werden können.
  • SEQUENZLISTE
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Claims (24)

  1. Verfahren zum Screening nach einem Molekül, das die RANK-Aktivität moduliert, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) In-Kontakt-Bringen von kultivierten RANK-reaktiven Zellen mit einem Kandidatenmolekül, wobei diese RANK-reaktiven Zellen ein Nucleinsäuremolekül umfassen, das für ein Reporterprotein kodiert, wobei dieses Nucleinsäuremolekül funktionell mit einer RANK-reaktiven, regulatorischen Nucleinsäuresequenz verbunden ist, die ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus einem MMP-9-Promotor und einem TRAP-Promotor, wobei die RANK-reaktiven Zellen vor, während oder nachdem sie mit diesem Kandidatenmolekül in Kontakt gebracht wurden, einem Auslöser für RANK ausgesetzt werden; (b) Bestimmen, ob der Level an Reportermolekülexpression in den in Kontakt gebrachten RANK-reaktiven Zellen verglichen mit dem Level an Reportermolekülexpression in einer Kultur von RANK-reaktiven Referenzzellen, die nicht mit dem Kandidatenmolekül in Kontakt gebracht wurden, verstärkt oder vermindert ist; und (c) Identifizieren des Kandidatenmoleküls als einen RANK-Agonisten, wenn der Level an Reportermolekülexpression in den in Kontakt gebrachten Zellen vergleichsweise erhöht ist, und Identifizieren des Kandidatenmoleküls als einen RANK-Antagonisten, wenn der Level an Reportermolekülexpression in den in Kontakt gebrachten Zellen vergleichsweise vermindert ist.
  2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei RANK in den RANK-reaktiven Zellen durch ein Verfahren ausgelöst wird, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) In-Kontakt-Bringen der RANK-reaktiven Zellen mit einem RANK-L-Polypeptid, wobei das RANK-L-Polypeptid Aminosäuren 162–317 von SEQ ID NO:6 oder Aminosäuren 161–316 von SEQ ID NO:8 umfasst; (b) In-Kontakt-Bringen der RANK-reaktiven Zellen mit einem agonistischen Anti-RANK-Antikörper; (c) In-Kontakt-Bringen der RANK-reaktiven Zellen mit Zellen, die RANK-L exprimieren, wobei RANK-L ein Polypeptid ist, das Aminosäuren 162–317 von SEQ ID NO:6 oder Aminosäuren 161–316 von SEQ ID NO:8 umfasst; (d) Überexprimieren von RANK in diesen RANK-reaktiven Zellen; und (e) Exprimieren eines defekten RANK-Polypeptids mit einer wie in SEQ ID NO:10 gezeigten Aminosäuresequenz in diesen RANK-reaktiven Zellen.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei RANK in den RANK-reaktiven Zellen ausgelöst wird durch In-Kontakt-Bringen der Zellen mit einem RANK-L-Polypeptid, das Aminosäuren 162–317 von SEQ ID NO:6 oder Aminosäuren 161–316 von SEQ ID NO:8 umfasst, und wobei weiterhin dieses RANK-L-Polypeptid ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus nativem RANK-L, einer Leucin-Zipper-Fusion von RANK-L und einer FLAG-polyHis-Fusion von RANK-L.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die RANK-reaktive, regulatorische Nucleinsäure ein MMP-9-Promotor ist.
  5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei der MMP-9-Promotor Nucleotide 1769–3591 von SEQ ID NO:11 enthält.
  6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Schritt, RANK-reaktive Zellen mit einem Kandidatenmolekül in Kontakt zu bringen, das Exprimieren eines eingeführten DNA-Moleküls in diesen RANK-reaktiven Zellen umfasst, das für ein Kandidatennucleinsäuremolekül oder ein Kandidatenproteinmolekül kodiert.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei dieses eingeführte DNA-Molekül ein cDNA-Molekül ist.
  8. Verfahren nach Anspruch 6, wobei dieses eingeführte DNA-Molekül in das Genom von diesen RANK-reaktiven Zellen integriert wird.
  9. Verfahren nach Anspruch 6, wobei dieses eingeführte DNA-Molekül nicht in das Genom von diesen RANK-reaktiven Zellen integriert wird.
  10. Verfahren nach Anspruch 6, wobei dieses Kandidatenmolekül ein Protein ist, das durch das eingeführte DNA-Molekül kodiert wird.
  11. Verfahren nach Anspruch 6, wobei dieses Kandidatenmolekül ein Nucleinsäuremolekül ist, das durch das eingeführte DNA-Molekül kodiert wird.
  12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei dieses Nucleinsäuremolekül Ribozymaktivität besitzt.
  13. Verfahren nach Anspruch 6, weiterhin umfassend die Isolierung von diesem eingeführten DNA-Molekül aus einer Kolonie, die aus diesen in Kontakt gebrachten RANK-reaktiven Zellen gebildet wird.
  14. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Schritt, RANK-reaktive Zellen mit einem Kandidatenmolekül in Kontakt zu bringen, das Kultivieren von diesen RANK-reaktiven Zellen in der Gegenwart des Kandidatenmoleküls umfasst, und wobei weiterhin das Kandidatenmolekül ein Protein ist.
  15. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Schritt, RANK-reaktive Zellen mit einem Kandidatenmolekül in Kontakt zu bringen, das Kultivieren von diesen RANK-reaktiven Zellen in der Gegenwart einer Vielzahl an Kandidatenproteinen umfasst.
  16. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Reportermolekül ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Luciferase, Grün fluoreszierendem Protein, alkalischer Phosphatase und einem heterologen Oberflächenprotein.
  17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei das Reportermolekül ein heterologes Oberflächenprotein ist, das ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus humanem IL-2-Rezeptor, murinem IL- 4-Rezeptor, humanem CD2-Protein, humanem CD4-Protein, humanem CD8-Protein, Luciferaseprotein, β-Galactosidase und Grün fluoreszierendem Protein.
  18. Verfahren nach Anspruch 1, wobei diese RANK-reaktiven Zellen ein defektes RANK-Molekül exprimieren und wobei dieses Screening für einen Agonisten ist, der diese defekte RANK-Aktivität komplementiert.
  19. Verfahren nach Anspruch 1, wobei diese RANK-reaktiven Zellen blutbildende Zellen sind.
  20. Verfahren nach Anspruch 1, wobei diese RANK-reaktiven Zellen RAW 264.7-Zellen sind.
  21. Verfahren nach Anspruch 1, weiterhin umfassend den Schritt der Reinigung des Kandidatenmoleküls aus Zellen, in denen bestimmt wurde, dass das Level an exprimiertem Reportermolekül vergleichsweise erhöht oder vermindert ist.
  22. Verfahren nach Anspruch 21, weiterhin umfassend den Schritt nachzuweisen, dass das gereinigte Kandidatenmolekül mit RANK wechselwirkt.
  23. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Level an Reportermolekülexpression durch ein Assay bestimmt wird, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem auf Fluoreszenz basierendem Assay, einem Festphasenassay und einem Assay, bei dem eine radioaktive Verbindung verwendet wird.
  24. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Bestimmen des Levels an exprimiertem Reportermolekül die physikalische Isolierung durch auf Fluoreszenz basierender Durchflusscytometrie der Zellen umfasst, die dieses Reportermolekül exprimieren.
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