JPH119269A - 破骨細胞系細胞 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 新規な破骨細胞前駆細胞、並びに該破骨細胞
前駆細胞を用いた破骨細胞系細胞に対する分化促進因子
の検出法およびスクリーニング法を提供することを課題
とする。 【解決手段】 マウス骨髄細胞をM−CSFの存在下でマウ
ス頭蓋骨由来のストローマ細胞と共存培養することによ
り、新規な破骨細胞前駆細胞を調製することに成功し
た。調製した高純度の破骨細胞前駆細胞を用いることに
より、破骨細胞系細胞に対する分化促進因子を検出し、
スクリーニングすることが可能であることを見いだし
た。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規な破骨細胞前
駆細胞、および該細胞を用いた破骨細胞系細胞の分化促
進因子の検出方法およびスクリーニング方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】マウス骨髄細胞はマウス骨髄由来のスト
ローマ細胞上で造血発生し、リンパ球系細胞、顆粒球系
細胞、赤芽球等の細胞を試験管内で形成させることが可
能である。その際、分化誘導するそれぞれの細胞系譜に
より添加するサイトカインや造血因子は異なるが、基本
的にストローマ細胞の造血支持活性が必要である。一
方、マウスにおける破骨細胞形成は、マウス頭蓋骨由来
のストローマ細胞、または、マウス骨髄由来のストロー
マ細胞とマウス骨髄細胞を骨吸収因子（1α，25(OH)₂D
3、副甲状腺ホルモン、プロスタグランジンE2、IL−6や
IL−11などのgp130を介したシグナルを伝達するサイト
カイン）の存在下で共存培養すると試験管内で観察でき
る。しかし、破骨細胞が形成される過程は未だ殆ど解明
されておらず、また、破骨細胞に分化する前駆細胞の細
胞系譜に関しては様々な論争がある。

【０００３】宇田川らは、肺胞マクロファージが非常に
高い確率でストローマ細胞との共存培養により破骨細胞
に分化することを示し、マクロファージが破骨細胞の前
駆細胞であることを主張したが、この細胞は破骨細胞に
分化するのに10日間を要し、破骨細胞に分化す能力を保
持しているが、生理的な破骨細胞前駆細胞であるとは考
えがたい（N．Udagawa et al． Proc．Natl．Acad．Sc
i．USA 87，7260−7264（1990）、N．Takahashi et a
l． J．B．M．R 6，977−985（1991））。Chambersら
は、破骨細胞前駆細胞はCFU-MOというマクロファージと
破骨細胞に分化するメチルセルロース中でのコロニー形
成細胞の存在を仮定しているが、この細胞は増殖期にあ
り、プロジェニター（増殖能を保持した前駆細胞）であ
る可能性は高いが、増殖を介さずに分化する破骨細胞前
駆細胞とは異なると考えられる（G．Hattersley et a
l． Endocrinology 128，259−262（1991）、S．Tanaka
et al．J．Clin．Invest 91，257−263（1993）、T．
J． Chambers et al． Proc．Natl．Acad．Sci．USA 9
0，5578−5582（1993））。高橋らは、共存培養におい
て破骨細胞前駆細胞の存在を示唆する実験を行っている
が、直接の証明はされておらず、共存培養系からの破骨
細胞前駆細胞の純化に関する記載も無い（N．Takahashi
et al． Developmental Biology 163，212−221（199
4））。さらに藤川らは、ヒトの末梢単核細胞をヒト型
のM−CSF存在下でマウス由来のストローマ細胞と共存培
養すると、1α，25(OH)₂D3 の添加により破骨細胞が誘
導される事を示した（S．Hayashi et al． J．Cell．Ph
ysiol 170，241−247（1997））。また最近、西川ら
は、骨髄細胞内の造血系細胞をフローサイトメトリーに
よりソーティングし、c−kit 陽性、c−fms 陰性の細胞
が破骨細胞前駆細胞を多く含む画分であることを証明し
たが、この細胞群の破骨細胞への分化には6日間のスト
ローマ細胞との共存培養を要し、これもやはりプロジェ
ニターであると考えられる（Y． Fujikawa et al． End
ocinology 137，4058−4060（1996））。このように、
これまでに共存培養系において短時間で破骨細胞へ分化
しうる破骨細胞前駆細胞を単離した報告例は皆無であ
る。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明は、新
規な破骨細胞前駆細胞を提供することを課題とする。さ
らに、本発明は、該破骨細胞前駆細胞を用いた破骨細胞
系細胞に対する分化促進因子の検出法およびスクリーニ
ング法を提供することを課題とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく鋭意研究を行った結果、マウス骨髄細胞を
M−CSFの存在下でマウス頭蓋骨由来のストローマ細胞と
共存培養することにより、新規な破骨細胞前駆細胞を調
製することに成功した。さらに、本発明者らは、調製し
た高純度の破骨細胞前駆細胞を用いることにより、破骨
細胞系細胞に対する分化促進因子を検出し、スクリーニ
ングすることが可能であることを見いだした。

【０００６】即ち、本発明は、（１） Ｍ−ＣＳＦ及び
頭蓋骨由来のストローマ細胞の存在下で、造血前駆細胞
を培養することを特徴とする、カルシトニン受容体陰
性、酒石酸抵抗性酸フォスファタ−ゼ陰性の破骨細胞前
駆細胞の調製方法、（２） Ｍ−ＣＳＦ及び頭蓋骨由来
のストローマ細胞の存在下で、造血前駆細胞を培養する
ことにより得ることができる、カルシトニン受容体陰
性、酒石酸抵抗性酸フォスファタ−ゼ陰性の破骨細胞前
駆細胞、（３） 骨吸収因子の存在下で、４８時間以内
に前破骨細胞に分化することができる、破骨細胞前駆細
胞、（４） 骨吸収因子が１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ３、
副甲状腺ホルモン、またはプロスタグランジンＥ２であ
る、（３）の破骨細胞前駆細胞、（５） 細胞表面マー
カーが、Ｇｒ−１陽性、Ｍａｃ−１陽性、Ｍａｃ−２陽
性、Ｆ４／８０陰性である、（２）〜（４）のいずれか
に記載の破骨細胞前駆細胞、（６） 造血前駆細胞から
（２）もしくは（３）に記載の破骨細胞前駆細胞への分
化、（２）もしくは（３）に記載の破骨細胞前駆細胞か
ら前破骨細胞への分化、または造血前駆細胞から前破骨
細胞への分化を、被験蛋白質及びＭ−ＣＳＦの存在下で
観察する工程を含む、破骨細胞系細胞に対する分化促進
因子の検出方法、（７） 造血前駆細胞から（２）もし
くは（３）に記載の破骨細胞前駆細胞への分化、（２）
もしくは（３）に記載の破骨細胞前駆細胞から前破骨細
胞への分化、または造血前駆細胞から前破骨細胞への分
化を、被験蛋白質及びＭ−ＣＳＦの存在下で観察し、分
化能を有する蛋白質を選択する工程を含む、破骨細胞系
細胞に対する分化促進因子のスクリーニング方法、
（８） 造血前駆細胞から（２）もしくは（３）に記載
の破骨細胞前駆細胞への分化、（２）もしくは（３）に
記載の破骨細胞前駆細胞から前破骨細胞への分化、また
は造血前駆細胞から前破骨細胞への分化を、被験遺伝子
が発現可能に導入された細胞およびＭ−ＣＳＦの存在下
で観察する工程を含む、破骨細胞系細胞に対する分化促
進因子をコードする遺伝子の検出方法、（９） 造血前
駆細胞から（２）もしくは（３）に記載の破骨細胞前駆
細胞への分化、（２）もしくは（３）に記載の破骨細胞
前駆細胞から前破骨細胞への分化、または造血前駆細胞
から前破骨細胞への分化を、被験遺伝子が発現可能に導
入された細胞およびＭ−ＣＳＦの存在下で観察し、分化
能を有する遺伝子を選択する工程を含む、破骨細胞系細
胞に対する分化促進因子をコードする遺伝子のスクリー
ニング方法、（１０） Ｍ−ＣＳＦ遺伝子を発現するベ
クターを導入した細胞と分化を観察する細胞とを共培養
することにより、Ｍ−ＣＳＦ遺伝子を発現するベクター
導入した細胞から分化を観察する細胞にＭ−ＣＳＦを供
給することを特徴とする、（６）〜（９）のいずれかに
記載の方法、（１１） （７）の方法によって選択され
た、破骨細胞系細胞に対する分化促進因子、（１２）
（９）の方法によって選択された、破骨細胞系細胞に対
する分化促進因子をコードする遺伝子、に関する。

【０００７】なお、本発明において「造血前駆細胞」と
は、多能性幹細胞または造血幹細胞から発生する細胞
で、主として顆粒球−マクロファージ系の細胞に分化す
る細胞を指す。本発明において「ストローマ細胞」と
は、様々な分化系譜の未分化な前駆細胞の増殖や分化を
指示する活性を有する細胞を指す。また、本発明におい
て「骨吸収因子」とは、生体内で血中カルシウムイオン
濃度を維持するために働く局所因子、ホルモン、サイト
カインなどを指す。本発明において「前破骨細胞」と
は、単独で骨吸収活性を有する細胞であって、カルシト
ニン受容体陽性、酒石酸抵抗性酸フォスファタ−ゼ陽性
の細胞を指す。さらに、本発明において「破骨細胞系細
胞」とは、破骨細胞に分化する細胞、または破骨細胞を
指す。

【０００８】

【発明の実施の形態】本発明の破骨細胞前駆細胞(Mouse
Calvarial cells Initiating Osteoclast Precursors
; MC-IOPs)は、造血前駆細胞由来マクロファージや骨
髄細胞に含まれる造血系細胞とも分化段階が異なる細胞
群であり、ストローマ細胞との共存培養系で極めて短時
間内に破骨細胞の形質を有する細胞（酒石酸抵抗性酸フ
ォスファタ−ゼ(以下、単に「TRAP」と称する)陽性細
胞）に分化する。破骨細胞への分化過程においてこのよ
うな細胞の存在は報告されておらず、本発明者等により
初めて見いだされた細胞である。本発明の破骨細胞前駆
細胞は具体的には、以下のような特性を有する。

【０００９】即ち、まず、カルシトニン受容体陰性、TR
AP陰性の特徴を有し、骨吸収因子の存在下で、48時間以
内にカルシトニン受容体陽性、TRAP陽性である前破骨細
胞（Experimental Cell Research (1995) 219,p679-68
6）に分化することができる。また、細胞表面マーカー
が、Gr−1陽性、Mac−1陽性、Mac−2陽性、F4／80陰性
であるという特徴を有し、細胞表面マーカーが、Gr−1
陰性、Mac−1陰性、Mac−2陽性、F4／80陰性である前破
骨細胞と相違する。なお、カルシトニン受容体の存在
は、例えば、¹²⁵I-カルシトニンを用いたオートラジオ
グラフィーにより検出することが可能であり、TRAPの存
在は、実施例2(3)に記載のTRAP染色液による染色により
検出することが可能である。また、細胞表面マーカー
は、FACScaliverを用いたフローサイトメトリーにより
検出することが可能である。

【００１０】また、本発明の破骨細胞前駆細胞は、M−C
SF及び頭蓋骨由来のストローマ細胞の存在下で、造血前
駆細胞を培養することにより調製することが可能であ
る。「M−CSF及び頭蓋骨由来のストローマ細胞の存在
下」とは何らかの形で両者が存在すれば足り、例えば、
M−CSFを産生する頭蓋骨由来のストローマ細胞の存在下
である。但し、M−CSFを産生しない頭蓋骨由来のストロ
ーマ細胞、例えば、OP／OPマウス（M-CSF欠損変異マウ
ス）の頭蓋骨由来のストローマ細胞を用いる場合には、
別途M−CSFを添加する。用いるストローマ細胞量は、通
常、サブコンフルエントになる程度である。なお、用い
る頭蓋骨由来のストローマ細胞としては、初代培養より
調製した頭蓋骨細胞が好ましい。頭蓋骨由来のストロー
マ細胞の調製は、例えば、実施例１に記載の方法に従っ
て行うことが可能である。

【００１１】頭蓋骨由来のストローマ細胞と造血前駆細
胞との共存培養は、例えば、牛胎児血清を含むa-MEM培
地にて、5% CO₂、37℃、湿度100%の条件で行い、形成さ
れる破骨細胞前駆細胞は、共存培養後3〜7日目に採取し
うる。なお、高純度の破骨細胞前駆細胞を調製するため
には、例えば、培養後の細胞群に対しSephadex G−10な
どを用いると好ましい。

【００１２】また、本発明の破骨細胞前駆細胞を、M−C
SF及び骨吸収因子で処理した頭蓋骨由来のストローマ細
胞の存在下で培養することにより、前破骨細胞を調製す
ることが可能である。前破骨細胞の調製に用いるM−CSF
は、上記した本発明の破骨細胞前駆細胞の調製と同様、
頭蓋骨細胞により生産されていてもよく、また別途添加
してもよい。

【００１３】頭蓋骨由来のストローマ細胞は、破骨細胞
への分化を促進する因子を発現させるために、骨吸収因
子による処理を行う。用いられる骨吸収因子としては、
破骨細胞前駆細胞の破骨細胞への分化を促進する因子を
頭蓋骨細胞に発現させるものであれば特に制限はない
が、例えば、1α，25（OH）₂D3、副甲状腺ホルモン、プ
ロスタグランジンE2、インターロイキン1、インターロ
イキン6＋可溶性インターロイキン6受容体などが好まし
く、特に1α，25(OH)₂D3が好ましい。頭蓋骨細胞の処理
に用いる骨吸収因子量は、骨吸収因子の種類により変動
しうるが、例えば、骨吸収因子として1α，25(OH)₂D3や
副甲状腺ホルモンを用いる場合には、通常、10^-8M〜10
^-7M程度、骨吸収因子としてプロスタグランジンE2を用
いる場合には、通常10^-7〜10^-6程度である。破骨細胞前
駆細胞との共培養に用いる頭蓋骨細胞量は、通常、サブ
コンフルエントになる程度である。用いる頭蓋骨細胞と
しては、上記した本発明の破骨細胞前駆細胞の調製方法
と同様に初代培養より調製した頭蓋骨細胞が好ましい。

【００１４】本発明の破骨細胞前駆細胞とストローマ細
胞との共存培養は、例えば、牛胎児血清を含むa-MEM培
地にて、5% CO₂、37℃、湿度100%の条件で行う。この共
培養により、本発明の破骨細胞前駆細胞を、48時間以内
に前破骨細胞（TRAP陽性細胞）へ分化させることができ
る。

【００１５】本発明の応用として、上記の破骨細胞への
分化系を用いた、破骨細胞系細胞に対する分化促進因子
の検出およびスクリーニングが考えられる。

【００１６】上記破骨細胞への分化系における造血前駆
細胞から本発明の破骨細胞前駆細胞への分化、および本
発明の破骨細胞前駆細胞から前破骨細胞への分化には、
M-CSFの存在以外にストローマ細胞との共培養を要する
ため、該ストローマ細胞は破骨細胞系細胞に対する分化
促進因子を発現しているといえる。従って、M−CSFと被
検タンパク質の存在下で造血前駆細胞を培養し、造血前
駆細胞の本発明の破骨細胞前駆細胞への分化を観察する
ことにより、被検タンパク質が造血前駆細胞から本発明
の破骨細胞前駆細胞への分化の促進因子であるか否かを
検出することが可能である。同様に、M−CSFと被検タン
パク質の存在下で本発明の破骨細胞前駆細胞を培養し、
本発明の破骨細胞前駆細胞から前破骨細胞への分化を観
察することにより、被検タンパク質が本発明の破骨細胞
前駆細胞から前破骨細胞への分化の促進因子であるか否
かを検出することが可能である。さらには、M−CSFと被
検タンパク質の存在下で造血前駆細胞を培養し、造血前
駆細胞から前破骨細胞への分化を観察することにより、
被検タンパク質が造血前駆細胞から前破骨細胞への分化
の促進因子であるか否かを検出することが可能である。
本発明の破骨細胞前駆細胞や前破骨細胞への分化は、TR
AP染色後、顕微鏡下で観察することにより検出すること
が可能である。また、被検タンパク質の中から分化能が
検出された蛋白質を選択することにより、破骨細胞系細
胞に対する分化促進因子をスクリーニングすることも可
能である。

【００１７】一方、造血前駆細胞から本発明の破骨細胞
前駆細胞への分化、本発明の破骨細胞前駆細胞から前破
骨細胞への分化または造血前駆細胞から前破骨細胞への
分化を、被験遺伝子が発現可能に導入された細胞および
M−CSFの存在下で観察することにより、被検遺伝子が破
骨細胞系細胞に対する分化促進因子をコードするか否か
を検出することも可能である。

【００１８】被検遺伝子を導入する細胞としては、例え
ば、COS-7細胞、CHO細胞、MOP細胞、COP細胞、繊維芽細
胞、上皮細胞、ES細胞、間葉系細胞などが挙げられる。
被検遺伝子は、適当なベクターに組み込んで細胞へ導入
することも可能である。好適なベクターとしては、例え
ば、pAP3neo（TAKARA社製）、pCDNA3.1（Invitrogen社
製）、pCDM8（Invitrogen社製）、pCD（ATCC 53149）、
pMX（ATCC 67092）などが挙げられる。細胞への被検遺
伝子の導入は、当業者に公知の方法、例えば、リン酸カ
ルシウム法、リポフェクション法、DEAE-デキストラン
法、エレクトロポレーション法、レトロウイルスやアデ
ノウイルスによる感染法、マイクロインジェクション法
などにより行うことが可能である。

【００１９】また、例えば、遺伝子のライブラリーを用
い、分化能を有する遺伝子を選択することにより、破骨
細胞系細胞に対する分化促進因子をコードする遺伝子を
スクリーニングすることも可能である。遺伝子ライブラ
リーは、例えば、リンカープライマー法（実験医学別冊
バイオマニュアルシリーズ 2.p79-94）に従い、1α，25
(OH)₂D3で処理した頭蓋骨由来のストローマ細胞から調
製することが可能である。また、骨芽細胞系のストロー
マ細胞を用いることも可能である。遺伝子ライブラリー
から目的の遺伝子をスクリーニングする方法としては、
例えば、COS-7細胞に上記ライブラリーを導入して発現
クローニングする方法（Sibling法：実験医学別冊バイ
オマニュアルシリーズ 3.p118-130）が挙げられる。

【００２０】上記の検出またはスクリーニングに用いら
れるM−CSFは、直接培養液に添加されていてもよく、ま
たM-CSF遺伝子を発現するベクターを導入した細胞を共
培養することにより供給されてもよい。M-CSFを発現さ
せるための細胞としては、例えば、L929細胞やCOS細胞
を好適に用いることができる。該細胞へ導入する、M-CS
F遺伝子を発現させるためのベクターとしては、例え
ば、M-CSF遺伝子が挿入されているpCCSF-17（ATCC 5314
9、Science 230:291-296(1985)）やp3ACSF-69（ATCC 67
092、Science 235:1504-1508(1987)）を用いることが可
能である、また、例えば、pCDNA3.1Zeo（Invitrogen社
製）にM-CSF遺伝子を挿入して用いることも可能であ
る。

【００２１】スクリーニングされた、破骨細胞系細胞に
対する分化促進因子またはその遺伝子は、例えば、骨粗
鬆症などの骨量減少症の改善、リウマチや変形性関節症
などの骨代謝異常症などの改善、大理石病などの骨量増
加症の改善、多発性骨髄腫や癌の骨転移などの骨代謝異
常疾患の治療および改善などに用いることが考えられ、
またこれらの疾患の免疫学的診断を確立するための抗原
の探索に利用することも考えられる。

【００２２】

【実施例】

[実施例１] （１） マウス頭蓋骨由来のストローマ細胞(Mouse Cal
varial cells ; 以下、単に「MCs」と称する)の調製 A) ddyマウス哺乳1日齢を5腹分をと殺し、70％アルコー
ルに浸けて滅菌した。前頭骨と頭頂骨を採取した後、a-
MEM培地（大日本製薬社）により1回洗浄した。酵素液
（0.1%コラゲナーゼ（和光純薬社）、0.2%ディスパーゼ
（合同酒精社））を含むa-MEM培地 10ml を加えて37℃
で5分間振とうした後、1000xgで遠心して上清を廃棄し
た。さらに、ペッレットに酵素液10mlを加えて37℃で10
分間振とうし、細胞浮遊液を回収した。この操作をさら
に3回繰り返して細胞を回収した。細胞をa-MEMで1回洗
った後、10%の牛胎児血清（JRH バイオサイエンス社）
を含むa-MEM培地に懸濁させ、10cmのカルチャーディッ
シュ（コーニング社）5枚に播種して 5% CO₂、37℃、湿
度100%にて培養した。サブコンフルエントになったとこ
ろでトリプシン-EDTA（ギブコBRL社）処理により細胞を
回収し、ディッシュ1枚からディッシュ5枚に継代した。
さらに、サブコンフルエントになったところで細胞を回
収し、1x10⁶ cells/mlにセルバンカー（ダイアトロン
社）に調製した後、1mlずつ凍結用チューブ（ファルコ
ン社）に入れて-80℃で凍結保存した。

【００２３】B) OP/OPマウス哺乳1日齢をと殺し、70％
アルコールに浸けて滅菌した。前頭骨と頭頂骨を採取し
た後、a-MEM培地により1回洗浄し、ナイフを用いてミン
スした。骨片をセルバンカーに浮遊させた後、-80℃で
凍結保存した。

【００２４】（２） マウス骨髄細胞(Mouse Bone Marr
ow cells ; 以下、単に「BMs」と称する)の調製 ddyマウス（6から8週齢、雄（清水実験材料社））から
脛骨をクリーンベンチ内で無菌的に採取し、ペニシリン
注射針を用いてa-MEM培地で押し出して調製した。な
お、調製した骨髄細胞中には、造血前駆細胞が含まれ、
この細胞が本発明の破骨細胞前駆細胞(Mouse Calvarial
cells Initiating Osteoclast Precursors ; 以下、単
に「MC-IOPs」と称する)に分化しうる。

【００２５】（３） 共存培養 10cmのカルチャーディッシュに、（1）で調製した「MC
s」1x10⁶ cells と、（2）で調製した脛骨2本分の「BM
s」を10%の牛胎児血清を含む a-MEM培地10mlに懸濁させ
て播種し、5% CO₂、37℃、湿度100%にて培養した。培養
後2日目と5日目に培地を全量廃棄し、10%の牛胎児血清
を含むa-MEM培地10mlを加えて7日間培養した。

【００２６】（４) 「MC-IOPs」の調製 （3）で生成した全細胞をセルスクレイパー（ヌンク
社）を用いて回収し、先端の口径が大きなガラスピペッ
トを用いて細胞を十分にピペッティングした。さらに、
40μm のメッシュ（ファルコン社）に通し、1000xgで遠
心した後上清を廃棄し、ペッレットをカルチャーディッ
シュ1枚から回収された細胞に対して10%の牛胎児血清を
含む a-MEM培地 1ml を用いて懸濁した。次に、上記方
法により調製した細胞懸濁液 1 ml を、Sephadex G-10
カラム（PBSで十分に洗浄した後 PBSに対して60% のス
ラリーとして懸濁し、 110℃、20分間オートクレーブし
て滅菌したSephadex G-10 担体（ファルマシア社）2ml
を、0.7 cm x 5 cm のエコノカラム（バイオラッド社）
に充填した後、10%の牛胎児血清を含むa-MEM培地 5 ml
により平衡化した）に添加した。 細胞懸濁液が担体の
上部まで浸潤した後、10%の牛胎児血清を含むa-MEM培地
5 ml により洗浄し、素通り細胞を回収した。1000 x g
で5分間遠心した後上清を廃棄し、10%の牛胎児血清を含
むa-MEM培地に懸濁して 「MC-IOPs」として実験に供し
た。

【００２７】[実施例２] （１） 「MCs」と「BMs」の共存培養における、「MC-IO
Ps」生成過程の観察 実施例1（3）の方法により生成した造血系細胞を、培養
後2日目、4日目、7日目にそれぞれセルスクレイパーを
用いて回収し、先端の口径が大きなガラスピペットを用
いて細胞を十分にピペッティングした。さらに、40μm
のメッシュに通し、1000xgで遠心した後上清を廃棄し、
PBSに懸濁した。7日目の細胞は、さらに実施例1（4）の
方法に従い調製した。回収した 細胞をPBSを用いて 1x1
0⁵ cells/ml に調製し、その 1ml をサイトスピンを用
いて500回転、1分間遠心してスライドガラス（マツナミ
社）に固定した。室温で風乾した後、Wright-Giemsa染
色液（シグマ社）1ml をスライドガラスに添加し、30秒
間静置した。染色液を廃棄した後、イオン交換水 1ml
を添加してさらに 5分間静置した。スライドガラスを細
胞が剥がれないように水道水で洗浄した後、風乾して検
鏡に供した。

【００２８】この結果、培養2日目と4日目には顆粒球系
の細胞が多く観察されたが、7日目にはマクロファージ
系の細胞が多く観察された。また、Sephadex G-10カラ
ムを通すことによりマクロファージ系の細胞が除かれる
のが観察された（図1）。なお、図中(A)は共培養後3日
目の細胞、(B)は5日目の細胞、(C)は7日目の細胞、(D)
はSephadex G-10カラムにて精製した7日目の細胞（MC-I
OPs）である。

【００２９】（２） 「MC-IOPs」のメチルセルロース中
でのコロニー形成能の解析 実施例１（４）の方法に従い調製した「MC-IOPs」と、
「MCs」の代わりにST2細胞株（造血支持能があり、in v
itroで造血前駆細胞を維持できる）とOP9細胞株（ST2細
胞と同様の活性を有するが、M-CSFを産生しないために
マクロファージ系の細胞は生成されない）を用いて実施
例1（4）の方法に従い調製した造血系細胞、さらに実施
例1（2）の方法により調製した骨髄細胞を、1x10⁵ cell
s/ml となるようにa-MEM培地に懸濁した。次に、2.2%
メチルセルロース（メチルセルロース4000Cp （和光純
薬社）11g と蒸留水 250 ml をそれぞれ120℃、20分間
オートクレーブした後混合し、ホットプレート上で1時
間攪拌した。37℃まで冷却した後、37℃に保温しておい
た 2 x a-MEM培地 250 mlを混合し、室温で1時間攪拌し
た。次に、氷冷しながら1時間混合して調製した） 4 m
l、a-MEM培地 3 ml、牛胎児血清 1 ml、5x10^-2M 2-merc
aptoethanol 20μl、細胞懸濁液 2 mlを混合した後、ボ
ルテックスミキサーを用いて十分に懸濁した。細胞懸濁
液を10mlのディスポーザブルシリンジと18G の注射針を
用いて採取した後、12穴のカルチャープレート（コーニ
ング社）に 2ml ずつ添加した。各種サイトカインに対
する反応性は、PBSに対して1μg/ml に調製した rmG-CS
F （R&D社）を 10μl、1μg/mlに調製した rmGM-CSF（R
&D社）10μl、10μg/ml に調製した rhM-CSF（森永乳業
社）10μlをそれぞれ添加して、5% CO₂、37℃、湿度100
%にて 6日間培養した。各種支持細胞により支持された
造血系細胞のコロニー形成能を表１に示す。

【００３０】

【表１】 ────────────────────────────────── コロニーの型 ────────────────────────── 細胞 CFU-G CFU-GM CFU-M ────────────────────────────────── ST2細胞株 13.7±2.1 57.3±7.8 62.0±3.0 OP9細胞株 21.0±2.0 122.0±7.6 106.7±4.5 MC-IOPs 4.7±2.1 13.0±2.7 8.7±1.5 ────────────────────────────────── ST2細胞株とOP9細胞株により支持された造血細胞は、各
種CSFによりコロニーを形成する造血前駆細胞が維持さ
れていたが、「MCs」により支持された「MC-IOPs」は、
いずれのCSFによってもコロニーを形成しなかった。こ
のことから「MCs」により支持された「MC-IOPs」が増殖
能を失っていることが判明した。

【００３１】（３） 「MC-IOPs」の分化過程の解析 :
「MCs」を用いたアッセイ法 A) 実施例1（1）の方法により調製した「MCs」を 4x10
⁴ cells ずつ 400μlの10%の牛胎児血清を含む a-MEM培
地に懸濁した後、48ウェルカルチャープレート（コーニ
ング社）に播種し、5% CO₂、37℃、湿度100%にて2日間
培養した。培地を廃棄した後、実施例1（4）の方法に従
い調製した「MC-IOPs」 2x10³ cellsを400μl の 10%の
牛胎児血清を含む a-MEM培地に懸濁して播種し、1x10^-7
M の1α,25(OH)₂D3を4μlずつ添加して、5% CO₂、37
℃、湿度100%にて培養した。経時的に培地を廃棄した
後、10%ホルマリン（和光純薬社）/PBS溶液にて室温で5
分間固定し、さらにエタノール/アセトン（1:1)溶液に
て室温で1分間固定した。風乾後、酸性フォスファター
ゼ染色液（Naphthol AS-MX phosphate （シグマ社）5 m
g をN,N-dimethyl folmamide（和光純薬社）100μlに溶
解した後、 Fast red violet LB salt（シグマ社） 30
mg を添加してTRAP緩衝液（0.1M Acetate buffer(pH5.
0)、50mM Sodium Tartrate（和光純薬）) 50 mlで溶解
したもの）を用いて細胞を染色し、水道水で洗浄して検
鏡に供した。この結果、「MC-IOPs」（図中の黒丸）
は、24時間目からTRAP陽性細胞（前破骨細胞）に分化す
るのが観察され、48時間までTRAP陽性細胞数は増加し
た。また、「BMs」（図中の白丸）は、培養 72時間後か
らTRAP陽性細胞に分化するのが観察された（図2A）。

【００３２】B) A) の方法により調製した48ウェルカ
ルチャープレート の各ウェルに、実施例1(4)の方法に
従い調製した「MC-IOPs」 を1x10² cells から1x10⁴ ce
lls まで細胞数を変えて400μl の 10%の牛胎児血清を
含む a-MEM培地に懸濁して播種した後、1x10^-7M の1α,
25(OH)₂D3を 4μlずつ添加して、5% CO₂、37℃、湿度10
0%にて48 時間培養した。培養終了後、実施例2（3）A)
の方法に従いTRAP染色を施した後、検鏡に供した。この
結果、「MC-IOPs」（図中の黒丸）は、はん種した細胞
数に比例してTRAP陽性細胞に分化した（図2B）。

【００３３】（４） 「MC-IOPs」の細胞系譜の解析 造血前駆細胞由来のマクロファージは、実施例1（2）の
方法により調製した骨髄細胞から実施例2（2）の方法に
従いメチルセルロース中で rhCSF-1 により生成させた
マクロファージコロニーを、先端の口径が大きなガラス
ピペットを用いて細胞を十分にピペッティングして細胞
を回収し、a-MEM培地で1回洗浄した細胞を用いた。実施
例1（4）の方法に従い調製した「MC-IOPs」と、実施例1
（2）の方法により調製した骨髄細胞、さらに造血前駆
細胞由来のマクロファージをそれぞれ 2x10³ cells ず
つ 400μl の 10%の牛胎児血清を含む a-MEM培地に懸濁
し、実施例2（3）A) の方法により調製したカルチャー
プレート に播種した後、1x10^-7M の1α,25(OH)₂D3を4
μlずつ添加して、5% CO₂、37℃、湿度100%にて48時間
培養した。培養終了後、実施例2（3）A) の方法に従いT
RAP染色を施し、検鏡に供した。

【００３４】各種細胞の貪食能の解析は、FITCで蛍光標
識された粒子経約0.75μmのラテックスビーズ（ポリサ
イエンス社）を用いて解析した。15 mlの遠心チューブ
に 10%の牛胎児血清を含む a-MEM培地で100倍に希釈し
たラテックスビーズ 1.5 ml と、細胞懸濁液 0.4 ml を
混合して 37℃で振とうしながら1時間保温した。細胞を
1000xgで遠心後、上清を廃棄して a-MEM培地で2回洗浄
し、10%の牛胎児血清を含む a-MEM培地に懸濁した。さ
らに、実施例2（3）A) の方法により調製した48ウェル
カルチャープレート に播種した後、1x10^-7M の1α,25
(OH)₂D3を 4μlずつ添加して、5% CO₂、37℃、湿度100%
にて48 時間培養した。培養終了後、実施例2（3）A) の
方法に従いTRAP染色を施し、蛍光顕微鏡下で検鏡に供し
た。この結果、「MC-IOPs」は、48時間以内にTRAP陽性
細胞に分化したが、その他の破骨細胞前駆細胞は、48時
間以内に分化しなかった（図3）。

【００３５】（５） 「MC-IOPs」のFACSによる解析 A) 実施例1（2）の方法により調製した骨髄細胞と、実
施例1（4）の方法により調製した「MC-IOPs」をPBSに懸
濁した後、35μmのメッシュ付きチューブ（ファルコン
社）に通し、1.5 ml のマイクロチューブ（トレフ社）
に分注した。細胞懸濁液を2,500rpmで5分間遠心した
後、約50μlを残して上清を吸引廃棄した。10倍希釈し
た抗Mac-2抗体 （ベーリンガー社）を 20μl添加した
後、細胞をタッピングにより懸濁して氷上で 30 分間静
置した。氷冷したPBSを1ml加え、3秒間ボルテックスミ
キサーにより懸濁した後、2,500rpmで5分間遠心した。
約50μlを残して上清を吸引廃棄した後、100倍希釈した
FITC標識された抗ラットIgG抗体（ジャクソン社、生化
学工業）を 20μl添加した後、細胞をタッピングにより
懸濁して氷上で 30 分間静置した。氷冷したPBSを1ml加
え、3秒間ボルテックスミキサーにより懸濁した後、2,5
00rpmで5分間遠心した。約50μlを残して上清を吸引廃
棄した後、10μg/ml のラットIgG（ジャクソン社、生化
学工業）を10μl添加し、細胞をタッピングにより懸濁
して氷上で 10分間静置した。さらに、100倍希釈したビ
オチン標識された抗Ly-6G(Gr-1)抗体（ファーミンジェ
ン社）を 20μl添加して細胞を懸濁した後、氷上で 30
分間静置した。氷冷したPBSを1ml加え、3秒間ボルテッ
クスミキサーにより懸濁した後、2,500rpmで5分間遠心
した。約50μlを残して上清を吸引廃棄した後、10倍希
釈したPE標識したストレプトアビジン（ベクター社、フ
ナコシ）を 20μl 添加して細胞を懸濁した後、氷上で3
0分間静置した。氷冷したPBSを1ml加え、3秒間ボルテッ
クスミキサーにより懸濁した後、2,500rpmで5分間遠心
した。上清を吸引廃棄した後、PBS 1 ml に懸濁してFAC
Scaliver（ベクトン-ディッキンソン社）を用いて2カラ
ーで解析した（図4A）。

【００３６】B) 実施例1（2）の方法により調製した骨
髄細胞と、実施例1（4）の方法により調製した「MC-IOP
s」をPBSに懸濁した後、35μmのメッシュ付きチューブ
に通し、1.5 ml のマイクロチューブに分注した。細胞
懸濁液を2,500rpmで5分間遠心した後、約50μlを残して
上清を吸引廃棄した。10倍希釈した抗F4/80抗体（セロ
テック社）、抗Mac-1抗体（セロテック社）、ビオチン
標識された抗B220抗体（ファーミンジェン社）、ビオチ
ン標識された抗CD3e抗体（ファーミンジェン社）をそれ
ぞれ 20μl 添加した後、細胞をタッピングにより懸濁
して氷上で 30分間静置した。氷冷したPBSを1ml加え、3
秒間ボルテックスミキサーにより懸濁した後、2,500rpm
で5分間遠心した。約50μlを残して上清を吸引廃棄した
後、抗F4/80抗体と抗Mac-1抗体に対しては、100倍希釈
したFITC標識された抗ラットIgG抗体を 20μl添加し、
また、ビオチン標識された抗B220抗体とビオチン標識さ
れた抗CD3e抗体に対しては、10倍希釈したPE標識したス
トレプトアビジンを 10μl 添加した後、細胞をタッピ
ングにより懸濁して氷上で30分間静置した。氷冷したPB
Sを1ml加え、3秒間ボルテックスミキサーにより懸濁し
た後、2,500rpmで5分間遠心した。上清を吸引廃棄した
後、PBS 1ml に懸濁して FACScaliverを用いて1カラー
で解析した（図4B）。

【００３７】以上、A）およびB)の結果、「MC-IOPs」
は、抗Mac-2, Mac-1, Gr-1抗体陽性で、抗F4/80, B22
0, CD3e抗体陰性であった。

【００３８】なお、Mac-2は破骨細胞およびマクロファ
ージに発現しているマーカー、Mac-1は顆粒球、マクロ
ファージに発現しているマーカー、Gr-1は顆粒球に発現
しているマーカー、F4/80は成熟マクロファージに発現
しているマーカー、B220はB細胞に発現しているマーカ
ー、CD3eはT細胞に発現しているマーカーである。

【００３９】[実施例３] （１） OP/OPマウスの頭蓋骨細胞を用いた「MC-IOPs」
の生成過程の解析 A) 実施例1（1）B)により調製したOP/OPの「MCs」を凍
結融解し、25Tフラスコ（ファルコン社）に播種してサ
ブコンフルエントになるまで培養した。細胞をトリプシ
ン-EDTAにより回収した後、OP/OPの「MCs」 1x10⁶ cell
s と、実施例1（2）で調製した脛骨2本分の「BMs」を10
%の牛胎児血清を含む a-MEM培地 20mlに懸濁させ、10 c
m のカルチャーディッシュに播種した後、10μg/ml rhC
SF-1を200μl 添加して、5% CO₂、37℃、湿度100%にて
培養した。培養後2日目と5日目に培地を全量廃棄し、10
0 ng/ml の rhCSF-1及び 10%の牛胎児血清を含む a-MEM
培地20mlを加えて7日間培養した。さらに、実施例1
（4）の方法により細胞を調製し、実施例2（5）A) の方
法に従い抗Mac-2抗体と抗Gr-1抗体を用いて2重染色し、
FACScaliver により解析した。

【００４０】B) A) ので調製した細胞を用いて、実施例
2（3）A) 同様の方法でアッセイを行った。

【００４１】以上の結果、op/op マウスの「MCs」によ
って支持された造血細胞は抗Mac-2抗体陰性であった
が、CSF-1存在下で抗Mac-2抗体陽性の細胞に分化した
（図5A）。

【００４２】また、破骨細胞への分化誘導アッセイにお
いてop/opマウスの「MCs」と共存培養して得られた細胞
はTRAP陽性細胞に分化できなかったが、CSF-1(100ng/m
l)存在下でop/opマウスの「MCs」と共存培養した細胞
は、TRAP陽性細胞に分化した（図5B）。なお、図中の白
抜きの棒グラフは、1α,25(OH)₂D3の代わりにベヒクル
を用いた対照である。

【００４３】（２） ストローマ細胞株を用いた「MC-IO
Ps」の生成過程の解析 実施例1（4）の方法に従い調製した「MC-IOPs」と、「M
Cs」の代わりにST2細胞株とOP9細胞株を用いて実施例1
（4）の方法により細胞を調製し、実施例2（5）A) の方
法に従い抗Mac-2抗体と抗Gr-1抗体を用いて2重染色し、
FACScaliverにより解析した。この結果、ST2細胞株とOP
9細胞株を用いた場合には、Mac-2陽性とGr-1陽性の「MC
-IOPs」は形成されなかった（図6）。また、ST2細胞株
とOP9細胞株を用いて生成した細胞を用いて 実施例2
（3）A) 同様の方法でアッセイを行ったが、いずれの48
時間までにTRAP陽性細胞へは分化しなかった。なお、図
中のAは、ST2細胞株を用いたもの、BはOP9細胞株を用い
たもの、CはOP9細胞株を用いM-CSFを100ng/ml添加した
ものである。

【００４４】[実施例４] （１）「MC-IOPs」の分化に必要な「MCs」の骨吸収因子
（1α,25(OH)₂D3、副甲状腺ホルモン, プロスタグラン
ジンE2)による処理条件と細胞の形状の解析「MCs」 を1
α,25(OH)₂D3 で前処理する場合には、実施例2（3）A)
の方法で「MCs」を 48ウェルカルチャープレートに用意
し、10%の牛胎児血清を含む a-MEM培地を400 μl 及び
10^-6 M の 1α,25(OH)₂D3 を4μl 添加して、2日間培養
した後、a-MEM培地 で 2回洗浄した。さらに、「MCs」
と 「MC-IOPs」を接触させてアッセイを行う場合には、
実施例1（4）の方法に従い調製した「MC-IOPs」 2x10³
cells を400μl の 10%の牛胎児血清を含む a-MEM培地
に懸濁して播種し 、5% CO₂、37℃、湿度100%で2 時間
培養した。培地を廃棄した後、 10%牛胎児血清を含む0.
08 % コラーゲンゲル（新田ゼラチン社）200μl をゆっ
くりと重層した後、10%の牛胎児血清を含む a-MEM培地
200μl を添加して、5% CO₂、37℃、湿度100%にて48 時
間培養した。「MCs」 と 「MC-IOPs」 の接触を阻止す
る場合には、「MCs」 の単層に10%牛胎児血清を含む 0.
08 % コラーゲンゲル200μl をゆっくりと重層し、実施
例1（4）の方法に従い調製した「MC-IOPs」 2x10³ cell
sを200μl の 10%の牛胎児血清を含む a-MEM培地に懸濁
して播種し 、5% CO₂、37℃、湿度100%にて48 時間培養
した。

【００４５】「MCs」 を1α,25(OH)₂D3 で後処理する場
合には、実施例2（3）A) の方法で「MCs」を48ウェルカ
ルチャープレートに用意し、10%の牛胎児血清を含む a-
MEM培地を添加して 2 日間培養し、「MCs」 を a-MEM培
地 で 2回洗浄した。さらに、「MCs」 と 「MC-IOPs」
を接触させてアッセイを行う場合には、実施例1（4）の
方法に従い調製した「MC-IOPs」 2x10³ cellsを400μl
の 10%の牛胎児血清を含む a-MEM培地に懸濁して播種
し 、5% CO₂、37℃、湿度100%にて2時間培養した。培地
を廃棄した後、 10%牛胎児血清を含む 0.08 % コラーゲ
ンゲル200μlをゆっくりと重層した後、10%の牛胎児血
清を含む a-MEM培地 200μl を添加し、さらに 10^-6M
の 1α,25(OH)₂D3 を 4μl 添加して、5% CO₂、37℃、
湿度100%で48 時間培養した。「MCs」 と 「MC-IOPs」
の接触を阻止する場合には、「MCs」 の単層に10%牛胎
児血清を含む 0.1 % コラーゲンゲル200μl をゆっくり
と重層し、実施例1（4）の方法に従い調製した「MC-IOP
s」 2x10³ cells を200μlの 10%の牛胎児血清を含む a
-MEM培地に懸濁して播種し 、さらに 10^-6 M の 1α,25
(OH)₂D3 を 4μl 添加して、5% CO₂、37℃、湿度100%で
48 時間培養した。培養終了後、実施例2（3）A) の方法
に従いTRAP染色を施した後検鏡に供した。この結果、
「MC-IOPs」は、1α,25(OH)₂D3 で前処理した「MCs」
上でも接触を介してTRAP陽性細胞に分化した（図7）。

【００４６】（２） 「MC-IOPs」 の分化に必要な「MC
s」の形状の解析 実施例4（1）A) の方法に従い「MCs」を1α,25(OH)₂D3
と副甲状腺ホルモンにより前処理した後、「MCs」をa-M
EM培地で2回洗浄した。a-MEM培地 400μl を添加した
後、-80℃のディープフリーザーで完全に凍結した。さ
らに、37℃のインキュベーター内で融解した。同様の操
作をさらに1回繰り返した後、a-MEM培地を廃棄して、a-
MEM培地で1回リンスした。さらに、10%の牛胎児血清を
含む a-MEM培地を添加して、5% CO₂、37℃、湿度100%で
48時間培養した。培養終了後、実施例2（3）A) の方法
に従いTRAP染色を施した後検鏡に供した。

【００４７】また、 カルシトニン受容体を確認するた
めに、24ウェルカルチャープレートに静置したセルディ
スク（住友ベークライト社）上で実施例4（1）B) の方
法に従い実験を行った後、a-MEM培地で1回洗浄し、0.2
nM の¹²⁵I標識したヒトカルシトニンを200μl 添加して
室温で 1 時間静置した。氷冷した a-MEM培地で5回洗浄
した後、2% ホルマリン/ 2% グルタールアルデヒド溶液
（0.1 M のカコジレート緩衝液（0.2 M cacodyrate 50
ml（和光純薬社）、0.1M HCl 4.15 ml を蒸留水を用い
て 100 ml に調製した）で希釈しで 10 分間固定し、カ
コジレート緩衝液で2回洗浄した後、実施例2（3）に従
いTRAP染色を施した。風乾後、セルディスクをユーキッ
トを用いてスライドガラスに固定し、乳剤（アマシャム
社）で包埋しで 4 ℃で2週間露光させた。現像後、検鏡
に供した。1α,25(OH)₂D3で前処理した「MCs」の結果を
図8に示す。Aはコントロール「MCs」（phase contras
t）、Bはコントロール「MCs」（light field）、Cは凍
結融解により細胞膜を固定した「MCs」（phase contras
t）、Dは凍結融解により細胞膜を固定した「MCs」（lig
ht field）である。この結果、凍結融解した細胞膜上で
も「MC-IOPs」はカルシトニン受容体陽性の前破骨細胞
へ分化した。

【００４８】また、骨吸収因子として1α,25(OH)₂D3、
副甲状腺ホルモン、プロスタグランジンE2を用いてTRAP
染色を行った結果、プロスタグランジンE2を用いた場合
には、凍結融解した細胞膜上ではTRAP陽性細胞へ分化し
なかった（表2）。

【００４９】

【表２】 ────────────────────────────────── TRAP陽性細胞数／ウェル ─────────────────── 前処理(48時間) 対照 凍結融解 ────────────────────────────────── ベヒクル 0 0 1α,25(OH)₂D3(1x10^-8M) 290.6±39.2 100.3±20.9 副甲状腺ホルモン(1x10^-8M) 246.6±67.7 53.3±9.2 プロスタグランジンE2(1x10^-6M) 150.3±37.6 0 ────────────────────────────────── （３） OP／OPマウスの頭蓋骨細胞を用いた「MC-IOPs」
の分化過程の解析 実施例1（1）B）により調製したOP／OP マウスと＋／？
（ヘテロ体）マウスの「MCs」を凍結融解し、25Tフラス
コに播種してサブコンフルエントになるまで培養した。
細胞をトリプシン−EDTAにより回収した後、実施例2
（3）A） の方法に従い 48ウェルプレートに細胞を調製
した。実施例1（4）の方法に従い調製した「MC-IOPs」
2x10³ cells を 10％の牛胎児血清を含む a−MEM培地
400μl に懸濁して播種し 、 10μg／ml のrhCSF−14μ
l を OP／OPマウスの 「MCs」 に添加して、 5％ CO₂、
37℃、湿度100％にて 48時間培養した。培養終了後、実
施例2（3）A）の方法に従いTRAP染色を施した後検鏡に
供した。この結果、op／opマウスの「MCs」上では、1
α，25(OH)₂D3 存在下においてもTRAP陽性細胞に分化せ
ず、CSF−1を添加したときのみ1α，25(OH)₂D3 存在下
でTRAP陽性細胞に分化した（図9）。なお、図中の白抜
きの棒グラフは、1α,25(OH)₂D3の代わりにベヒクルを
用いた対照である。

【００５０】

【発明の効果】本発明により骨細胞への分化過程におい
て生ずる破骨細胞前駆細胞が提供された。本発明の破骨
細胞への分化系を用いれば、破骨細胞系細胞の分化を決
定する因子を検出し、単離することが可能であり、ま
た、単離される分化促進因子またはその遺伝子は、例え
ば、骨粗鬆症などの骨量減少症の改善、リウマチや変形
性関節症などの骨代謝異常症などの改善、大理石病など
の骨量増加症の改善、多発性骨髄腫や癌の骨転移などの
骨代謝異常疾患の治療および改善などに用いられること
が考えられ、さらにこれらの疾患の免疫学的診断を確立
するための抗原の探索への利用も考えられる。

【図面の簡単な説明】

【図１】第１図は、「BMs」と「MCs」の共存培養におけ
る、造血系細胞の分化による経時的な形態変化をライト
-ギムザ染色により示す。

【図２】第２図Ａは、「MC-IOPs」と「BMs」の「MCs」
上での破骨細胞への分化過程を経時的に解析した結果を
示す。第２図Ｂは、はん種した「MC-IOPs」と「BMs」の
細胞数とTRAP陽性細胞へ分化した細胞数との相関を示
す。

【図３】弟３図は、「MC-IOPs」と各種破骨細胞前駆細
胞との分化段階を比較した結果を示す。

【図４】第４図は、「MC-IOPs」の形状を表面抗原に対
する抗体を用いてFACScaliverで解析した結果を示す。

【図５】第５図は、「MC-IOPs」 の生成における「MC
s」の産生するCSF-1の役割を、op/opマウスの「MCs」と
骨髄細胞との共存培養を用いて解析した結果を示す。

【図６】第６図は、ストローマ細胞株を用いた「MC-IOP
s」の生成の解析を示す。

【図７】第７図 は、「MC-IOPs」の分化に必要な、1α,
25(OH)₂D3 の処理条件とそれによる「MCs」の形状を検
討した結果を示す。

【図８】第８図は、1α,25(OH)₂D3 で前処理した後、凍
結融解した「MCs」上でTRAP陽性細胞に分化した「MC-IO
Ps」 のカルシトニン受容体を¹²⁵I標識したヒトカルシ
トニンの結合により検出した像を示す。

【図９】第９図は、「MC-IOPs」 の分化に必要な「MC
s」の形質を、 op/opマウスの「MCs」を用いて検討した
結果を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 肥山 良之 京都府京都市山科区四ノ宮南河原町14 科 研製薬株式会社総合研究所内 (72)発明者 須田 立雄 東京都品川区旗の台１−５−８ 昭和大学 歯学部生化学教室内 (72)発明者 高橋 直之 東京都品川区旗の台１−５−８ 昭和大学 歯学部生化学教室内 (72)発明者 仲村 一郎 東京都品川区旗の台１−５−８ 昭和大学 歯学部生化学教室内 (72)発明者 自見 英治郎 東京都品川区旗の台１−５−８ 昭和大学 歯学部生化学教室内 (72)発明者 宇田川 信之 東京都品川区旗の台１−５−８ 昭和大学 歯学部生化学教室内

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 Ｍ−ＣＳＦ及び頭蓋骨由来のストローマ
   細胞の存在下で、造血前駆細胞を培養することを特徴と
   する、カルシトニン受容体陰性、酒石酸抵抗性酸フォス
   ファタ−ゼ陰性の破骨細胞前駆細胞の調製方法。
2. 【請求項２】 Ｍ−ＣＳＦ及び頭蓋骨由来のストローマ
   細胞の存在下で、造血前駆細胞を培養することにより得
   ることができる、カルシトニン受容体陰性、酒石酸抵抗
   性酸フォスファタ−ゼ陰性の破骨細胞前駆細胞。
3. 【請求項３】 骨吸収因子の存在下で、４８時間以内に
   前破骨細胞に分化することができる、破骨細胞前駆細
   胞。
4. 【請求項４】 骨吸収因子が１α，２５（ＯＨ）₂Ｄ
   ３、副甲状腺ホルモン、またはプロスタグランジンＥ２
   である、請求項３の破骨細胞前駆細胞。
5. 【請求項５】 細胞表面マーカーが、Ｇｒ−１陽性、Ｍ
   ａｃ−１陽性、Ｍａｃ−２陽性、Ｆ４／８０陰性であ
   る、請求項２〜４のいずれかに記載の破骨細胞前駆細
   胞。
6. 【請求項６】 造血前駆細胞から請求項２もしくは３に
   記載の破骨細胞前駆細胞への分化、請求項２もしくは３
   に記載の破骨細胞前駆細胞から前破骨細胞への分化、ま
   たは造血前駆細胞から前破骨細胞への分化を、被験蛋白
   質及びＭ−ＣＳＦの存在下で観察する工程を含む、破骨
   細胞系細胞に対する分化促進因子の検出方法。
7. 【請求項７】 造血前駆細胞から請求項２もしくは３に
   記載の破骨細胞前駆細胞への分化、請求項２もしくは３
   に記載の破骨細胞前駆細胞から前破骨細胞への分化、ま
   たは造血前駆細胞から前破骨細胞への分化を、被験蛋白
   質及びＭ−ＣＳＦの存在下で観察し、分化能を有する蛋
   白質を選択する工程を含む、破骨細胞系細胞に対する分
   化促進因子のスクリーニング方法。
8. 【請求項８】 造血前駆細胞から請求項２もしくは３に
   記載の破骨細胞前駆細胞への分化、請求項２もしくは３
   に記載の破骨細胞前駆細胞から前破骨細胞への分化、ま
   たは造血前駆細胞から前破骨細胞への分化を、被験遺伝
   子が発現可能に導入された細胞およびＭ−ＣＳＦの存在
   下で観察する工程を含む、破骨細胞系細胞に対する分化
   促進因子をコードする遺伝子の検出方法。
9. 【請求項９】 造血前駆細胞から請求項２もしくは３に
   記載の破骨細胞前駆細胞への分化、請求項２もしくは３
   に記載の破骨細胞前駆細胞から前破骨細胞への分化、ま
   たは造血前駆細胞から前破骨細胞への分化を、被験遺伝
   子が発現可能に導入された細胞およびＭ−ＣＳＦの存在
   下で観察し、分化能を有する遺伝子を選択する工程を含
   む、破骨細胞系細胞に対する分化促進因子をコードする
   遺伝子のスクリーニング方法。
10. 【請求項１０】 Ｍ−ＣＳＦ遺伝子を発現するベクター
    導入した細胞と分化を観察する細胞とを共培養すること
    により、Ｍ−ＣＳＦ遺伝子を発現するベクターを導入し
    た細胞から分化を観察する細胞にＭ−ＣＳＦを供給する
    ことを特徴とする、請求項６〜９のいずれかに記載の方
    法。
11. 【請求項１１】 請求項７の方法によって選択された、
    破骨細胞系細胞に対する分化促進因子。
12. 【請求項１２】 請求項９の方法によって選択された、
    破骨細胞系細胞に対する分化促進因子をコードする遺伝
    子。