JP4722508B2 - 多能性幹細胞の同定及び分離培養方法 - Google Patents
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Dulbecco’s Modified Eagle MediumとF−12培地の1:1混合培養液(Gibco)に、ウシ胎児血清(FBS、10%)、100unit/mLペニシリン(Sigma)と100μg/mLストレプトマイシン(ベーリンガー)を加えて調製した(以降、培地1と記す)。また、幹細胞の培養には間葉系幹細胞用培地(三光純薬株式会社)を用いた(以降、培地2と記す)。
ICRマウス(雄、4週齢)の大腿骨を無菌的に摘出し、周囲の結合組織を出来る限り除去した後、両骨端を骨尖刃刀にて切り落とした。その後、25G針付の注射筒を一方の骨端に突き刺し、PBS(−)を注入し骨髄を50mL容の遠沈管(Falcon)に押し出した。その後、セルストレーナー(Falcon)を通しながら別の50mL容の遠沈管に移し、遠心分離した。上清を除去し、新たに培地2を加えて細胞を分散させ洗浄した。この洗浄操作を2回繰り返した。洗浄後、培地2を用いて培養を行った。
ICRマウス(雄、4週齢)の肝臓、膵臓及び腹部皮下脂肪組織をそれぞれ別々に無菌的に摘出し、PBS(−)で3回洗浄した後、直径6cmの組織培養ディッシュ(Falcon)に移した。それぞれの組織を、尖刃刀により約2mm角に細切し、0.2%コラゲナーゼ溶液(新田ゼラチン)を加え、プラスチックディッシュを上下左右に揺らして溶液中に拡散させた。これらを、37℃で30分間インキュベートすることで細胞外マトリックスを消化した後、穏やかにピペッティングし細胞を分散させた。この細胞分散液を50mL容の遠沈管(Falcon)にセルストレーナー(Falcon)を通しながら移した。さらに、培地1を適量添加し、よくピペッティングした後、5分間遠心分離した。遠心後、上清画分を除去し、新たに培地1を加えて細胞を分散させ洗浄した。この洗浄操作を2回繰り返した。洗浄後、培地2を用いて培養を行った。
各組織から調製した細胞を、それぞれ5%FBS添加ハンクス液(Hank‘s balanced salt solution)中で、抗p75NTRポリクローナル抗体(CHEMICON)、抗c−Kitポリクローナル抗体(Santa Cruz)、抗CD44ポリクローナル抗体(Santa Cruz)、抗CD105ポリクローナル抗体(Santa Cruz)、抗CD106ポリクローナル抗体(Santa Cruz)及び抗Wnt10bポリクローナル抗体(Santa Cruz)と30分間氷中にて反応させた。反応後、5%FBS添加ハンクス液にて3回洗浄し、続いてAlexa Fruo 488、又はPEで標識した抗IgGモノクローナル抗体(インビトロジェン株式会社)と30分間氷中にて反応させた。最後に、5%FBSを含むハンクス液にて3回洗浄し、PI(Propidium iodide)5μg/mLを含む5%FBS添加ハンクス液中に細胞を懸濁した。これら蛍光標識した細胞を、FACS Vantage(ベックトン・ディッキンソン株式会社)にて解析した。ゲートの設定はネガティブコントロールを指標にした。まず、前方散乱光(forward scatter)、側方散乱光(side scatter)及びPIにより、残存する赤血球、細胞の残骸、細胞の凝集魂を除いた部分にゲート(R1)をかけた。次に、ゲート(R1)内のp75NTR+、c−Kit+、CD44+、CD105+、CD106+及びWnt10b+細胞を解析し、さらに、染色の組み合わせによりp75NTR+のみ、あるいはp75NTR+に加えてc−Kit+(以下、p75NTR+/c−Kit+と記す)、同様にp75NTR+/CD44+、p75NTR+/CD105+、p75NTR+/CD106+、p75NTR+/Wnt10b+、c−Kit+/CD44+及びc−Kit+/Wnt10b+の組み合わせで細胞に回収ゲートを設定し、それぞれのマーカータンパク質を合成している細胞を回収した。なお、遠心分離操作のみで細胞を回収する方法を従来の方法とした。
FACS Vantageにより回収した細胞を、脂肪細胞誘導用培地(TOYOBO)にて、37℃、5%CO2の条件で14日間培養した。培地は3日間毎に新鮮な脂肪細胞誘導用培地に交換した。脂肪細胞への分化誘導確認は細胞を4%パラホルムアルデヒド溶液により固定した後、オイルレッドO染色により行った。
FACS Vantageにより回収した細胞を、骨芽細胞誘導用培地(TOYOBO)にて、37℃、5%CO2の条件で14日間培養した。培地は3日間毎に新鮮な骨芽細胞誘導用培地に交換した。骨芽細胞への分化誘導確認は細胞を4%パラホルムアルデヒド溶液により固定した後、アルカリフォスファターゼ染色により行った。
FACS Vantageにより回収した細胞を、軟骨細胞誘導用培地(TOYOBO)にて、37℃、5%CO2の条件で14日間培養した。培地は3日間毎に新鮮な軟骨細胞誘導用培地に交換した。軟骨細胞への分化誘導確認は細胞を4%パラホルムアルデヒド溶液により固定した後、アルシアンブルー染色により行った。
FACS Vantageにより回収した細胞を、神経細胞誘導用培地(TOYOBO)にて、37℃、5%CO2の条件で14日間培養した。培地は3日間毎に新鮮な神経細胞誘導用培地に交換した。神経細胞への分化誘導確認は細胞を4%パラホルムアルデヒド溶液により固定した後、免疫染色(βIII−チューブリンの有無)により行った。
FACS Vantageにより回収した細胞を、平滑筋細胞誘導用培地(TOYOBO)にて、37℃、5%CO2の条件で14日間培養した。培地は3日間毎に新鮮な平滑筋細胞誘導用培地に交換した。平滑筋細胞への分化誘導確認は細胞を4%パラホルムアルデヒド溶液により固定した後、免疫染色(α―Smooth muscle actinの有無)により行った。
FACS Vantageにより回収した細胞を、線維芽細胞誘導用培地(TOYOBO)にて、37℃、5%CO2の条件で14日間培養した。培地は3日間毎に新鮮な線維芽細胞誘導用培地に交換した。線維芽細胞への分化誘導確認は細胞を4%パラホルムアルデヒド溶液により固定した後、免疫染色(フィブロネクチンの有無)により行った。
細胞の分化誘導率(%)の評価基準は、分化誘導率が10%以下を「−」、10〜30%を「+」、30〜50%を「++」、50%以上を「+++」とした。それぞれ骨髄、肝臓、膵臓、脂肪組織からp75NTR+、c−Kit+、CD44+、Wnt10b+、又は、p75NTR+/c−Kit+、p75NTR+/CD44+、p75NTR+/Wnt10b+、c−Kit+/CD44+、c−Kit+/Wnt10b+をマーカータンパク質として分離した細胞について分化誘導率の評価を行い、結果を表1〜4に示した。
Claims (8)
- p75NTR+をマーカータンパク質とし、これに対する特異的親和性を有する抗体と、CD44+、CD105+及びCD106+から選択されるマーカータンパク質に対する特異的親和性を有する抗体を1種組み合わせることで、既に摘出された哺乳動物の組織から多能性幹細胞をインビトロにおいて選択的に分離する方法。
- p75NTR+をマーカータンパク質とし、これに対する特異的親和性を有する抗体と、CD44+、CD105+及びCD106+から選択されるマーカータンパク質に対する特異的親和性を有する抗体を1種組み合わせることで、既に摘出された哺乳動物の組織から多能性幹細胞をインビトロにおいて同定する方法。
- p75NTR+とCD44+をマーカータンパク質とし、これらに対する特異的親和性を有する抗体を組み合わせることで、既に摘出された哺乳動物の組織から多能性幹細胞をインビトロにおいて選択的に分離する方法。
- p75NTR+とCD105+をマーカータンパク質とし、これらに対する特異的親和性を有する抗体を組み合わせて使用することで、既に摘出された哺乳動物の組織から多能性幹細胞をインビトロにおいて選択的に分離する方法。
- p75NTR+とCD44+をマーカータンパク質とし、これらに対する特異的親和性を有する抗体を組み合わせることで、既に摘出された哺乳動物の組織から多能性幹細胞をインビトロにおいて同定する方法。
- p75NTR+とCD105+をマーカータンパク質とし、これらに対する特異的親和性を有する抗体を組み合わせて使用することで、既に摘出された哺乳動物の組織から多能性幹細胞をインビトロにおいて同定する方法。
- 哺乳動物の組織が脂肪、肝臓、膵臓及び/又は骨髄由来である、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1から7のいずれか一項に記載の方法により得られた、既に摘出された哺乳動物の組織からインビトロにおいて選択的に分離された多能性幹細胞。
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