JP2006230235A

JP2006230235A - 多能性幹細胞の同定及び分離培養方法

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Publication number: JP2006230235A
Application number: JP2005047043A
Authority: JP
Inventors: Yasushi Hasegawa; 靖司長谷川; Hatsuo Kojima; 肇夫小島; Hirohiko Akamatsu; 浩彦赤松; Kayoko Matsunaga; 佳世子松永; Naoki Yamamoto; 直樹山本; Tooru Marunouchi; 棣丸野内
Original assignee: Nippon Menard Cosmetic Co Ltd
Current assignee: Nippon Menard Cosmetic Co Ltd
Priority date: 2005-02-23
Filing date: 2005-02-23
Publication date: 2006-09-07
Anticipated expiration: 2025-02-23
Also published as: JP4722508B2

Abstract

【課題】本発明は、哺乳動物の生体組織から、多能性分化能を有した幹細胞を効率よく同定し、分離培養及び分化誘導する方法を提供することを目的とする。
【解決手段】
幹細胞が特異的に合成しているｐ７５ＮＴＲ^＋をマーカータンパク質とすることで、これに特異的親和性を有する抗体を用いて哺乳動物の生体組織から多能性幹細胞を同定、分離培養及び分化誘導する方法を提供する。さらに、ｐ７５ＮＴＲ^＋に加えて、ｃ−Ｋｉｔ^＋、ＣＤ４４^＋、ＣＤ１０５^＋及びＣＤ１０６^＋から選択されるマーカータンパク質を１種以上組み合わせることで、相乗的に幹細胞の同定、分離培養及び分化誘導の効率が向上することを発見した。すなわち、本発明は、従来の方法に比べて哺乳動物の骨髄、肝臓、膵臓及び脂肪組織などの生体組織から、より効率よく多能性幹細胞を同定し、分離培養及び分化誘導する方法を提供するものである。

Description

本発明は、哺乳動物の多能性幹細胞の分離・同定方法、ならびに当該細胞の用途に関する。

脊椎動物、特に哺乳動物の組織は、傷害もしくは疾患、又は加齢などに伴い細胞・臓器の損傷が起こった場合、再生系が働き、細胞・臓器の損傷を回復しようとする。この作用に、当該組織に備わる幹細胞が大きな役割を果している。幹細胞は、あらゆる細胞・臓器に分化する多能性を有しており、この性質により細胞・組織の損傷部を補うことで回復に導くと考えられている。このような多能性を有した細胞は、多能性幹細胞（以降、幹細胞と記す）と呼ばれ、次世代の医療である再生医療への応用が期待されている。

哺乳動物おける幹細胞研究で最も進んでいる組織は骨髄である。骨髄には生体の造血幹細胞が存在しており、全ての血液細胞（例えば、赤血球、白血球、リンパ球など）へ分化することから、血液の主要な供給源と考えられている。さらに骨髄には、造血幹細胞とは別に、その他の臓器（例えば、骨、軟骨、筋肉、脂肪など）へ分化可能な幹細胞が包含されていることが報告されている（非特許文献１）。

ＰｉｔｔｅｎｇｅｒＭ．Ｆ．，ｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９，２８４，１４３−１４７

さらに、近年、骨髄以外にも、肝臓、膵臓、脂肪など、あらゆる臓器に幹細胞が存在することが明らかにされている（非特許文献２、３、４、５）。これら幹細胞を再生医療へ利用するためには、まずはじめに、生体組織から幹細胞を分離し、培養、さらには分化誘導を行う必要がある。

ＧｏｏｄｅｌｌＭ．Ｆ．，ｅｔａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，１９９７，３，１３３７−１３４５ＺｕｌｅｗｓｋｉＨ．，ｅｔａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，２００１，５０，５２１−５３３ＳｕｚｕｋｉＡ．，ｅｔａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２０００，３２，１２３０−１２３９ＺｕｋＰ.Ａ．，ｅｔａｌ．，ＴｉｓｓｕｅＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２００１，７，２１１−２２８

現在までに、骨髄、肝臓、膵臓、脂肪などからの幹細胞の分離、培養及び分化誘導に関する幾つかの報告がある。従来までは、酵素処理などで各臓器から細胞分散液を調製し、遠心操作により幹細胞を分離する方法が主であった。例えば、Ｖａｎらは、骨髄から調製した細胞分散液から、パーコールグラディエント遠心法により、幹細胞を分離する方法を報告している（非特許文献６）。また、Ｚｕｋらは、同様に脂肪から遠心分離法を用いて幹細胞を分離する方法を報告している（非特許文献７）。しかし、これらの方法では、血液細胞、血管内皮細胞や脂肪組織周囲の細胞などが混入し、幹細胞のみを効率よく分離する技術としては満足いくものではなかった。

ＶａｎｄｅｎＢｏｓ，Ｃ．，ｅｔａｌ．，ＨｕｍａｎＣｅｌｌ，１９９７，１０，４５−５０ＺｕｋＰ.Ａ．，ｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙｏｆｔｈｅＣｅｌｌ，２００２，１３，４２７９−４２９５

そこで、さらに分離効率の高い幹細胞の分離法として、遠心分離法以外の方法の開発が進められてきた。近年の報告から、各臓器に存在する幹細胞は、特殊なタンパク質をそれぞれ合成していることが明らかにされている。この特殊なタンパク質はマーカータンパク質と呼ばれ、各臓器の幹細胞に特異的なものであり、これを利用することで、幹細胞を同定し、分離する技術の検討が行われている。

例えば、Ｒｅｙｅｓらは、骨髄に存在する幹細胞のマーカータンパク質（ＡＣ１３３）を発見し、これを利用することで、幹細胞を分離し、特殊な培養液により培養する技術について報告している（非特許文献８）。また、膵臓からの幹細胞の分離法に関しても同様に、マーカータンパク質（ｃ-Ｍｅｔ、ｃ-Ｋｉｔ、ＣＤ４５及びＴＥＲ１１９）を利用した選択的分離法に関する特許が公開されている（特許文献１）。さらに、その他の方法では、肝臓における幹細胞のマーカータンパク質（Ｔｔｍ２Ａ）をコードするｍＲＮＡを利用することで幹細胞の分離法についての発明が開示されている（特許文献２）。このように、マーカータンパク質を利用することで、幹細胞を選択的に分離することが可能になると考えられている。

ＲｅｙｅｓＭ．，ｅｔａｌ．，Ｊ.Ｃｌｉｎ.Ｉｎｖｅｓｔ.，２００２，１０９，３３７−３４６ＷＯ２００２／０８８３３５号特開２００４−１８７６７９号

しかし、幹細胞におけるマーカータンパク質は、各臓器によって異なっており、これらを全て把握することは困難である。それ故、未だそれぞれの臓器における幹細胞のマーカータンパク質の研究は進んでおらず、効率よく幹細胞を分離できるマーカータンパク質の発見が望まれていた。

かかる状況に鑑み、本発明は、上記のような従来技術における問題点を解決し、哺乳動物の生体組織から、あらゆる組織に分化可能な幹細胞を効率よく同定し、分離、培養及び分化誘導する方法を提供することにある。

この様な事情により、本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、現在まで皮膚などの外胚葉系組織における幹細胞のマーカータンパク質と考えられていた神経栄養因子であるニューロトロフィンの受容体であるＮｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃＦａｃｔｏｒＲｅｃｅｐｔｏｒｐ７５（以降、ｐ７５ＮＴＲと記す）が、外胚葉系組織以外の骨髄、肝臓、膵臓、脂肪組織の幹細胞においても合成されていることを見出した。また、これをマーカータンパク質とすることで、幹細胞の効率的な同定及び分離方法を確立した。さらに、ｐ７５ＮＴＲ^＋に加えて、現在までにマーカータンパク質として報告されているｃ−Ｋｉｔ^＋、ＣＤ４４^＋、ＣＤ１０５^＋及びＣＤ１０６^＋から選択されるマーカータンパク質を１種以上組み合わせることで、相乗的に幹細胞の同定、分離、培養及び分化誘導の効率が向上することを発見し、本発明を完成するに至った。

本発明により、哺乳動物の骨髄、肝臓、膵臓、脂肪組織をはじめとする生体組織における幹細胞を効率よく同定し、従来の技術に比べて、より優れた高い純度で幹細胞を分離回収することが可能になった。以上より、本発明は、再生医学の分野において大きく貢献できるものと期待される。

以下、次に本発明を詳細に説明するため、具体的且つ詳細な実施例を挙げるが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。

骨髄、肝臓、膵臓及び脂肪組織それぞれから、ｐ７５ＮＴＲ^＋、ｃ−Ｋｉｔ^＋、ＣＤ４４^＋、ＣＤ１０５^＋、ＣＤ１０６^＋及びＷｎｔ１０ｂ^＋をマーカータンパク質として分離した細胞について、その分化誘導率を下記の方法にて評価した。

細胞培養液の調製
Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅＭｅｄｉｕｍとＦ−１２培地の１：１混合培養液（Ｇｉｂｃｏ）に、ウシ胎児血清（ＦＢＳ、１０％）、１００ｕｎｉｔ／ｍＬペニシリン（Ｓｉｇｍａ）と１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（ベーリンガー）を加えて調製した（以降、培地１と記す）。また、幹細胞の培養には間葉系幹細胞用培地（三光純薬株式会社）を用いた（以降、培地２と記す）。

骨髄からの細胞の調製
ＩＣＲマウス（雄、４週齢）の大腿骨を無菌的に摘出し、周囲の結合組織を出来る限り除去した後、両骨端を骨尖刃刀にて切り落とした。その後、２５Ｇ針付の注射筒を一方の骨端に突き刺し、ＰＢＳ（−）を注入し骨髄を５０ｍＬ容の遠沈管（Ｆａｌｃｏｎ）に押し出した。その後、セルストレーナー（Ｆａｌｃｏｎ）を通しながら別の５０ｍＬ容の遠沈管に移し、遠心分離した。上清を除去し、新たに培地２を加えて細胞を分散させ洗浄した。この洗浄操作を２回繰り返した。洗浄後、培地２を用いて培養を行った。

肝臓、膵臓及び脂肪組織からの細胞の調製
ＩＣＲマウス（雄、４週齢）の肝臓、膵臓及び腹部皮下脂肪組織をそれぞれ別々に無菌的に摘出し、ＰＢＳ（−）で３回洗浄した後、直径６ｃｍの組織培養ディッシュ（Ｆａｌｃｏｎ）に移した。それぞれの組織を、尖刃刀により約２ｍｍ角に細切し、０．２％コラゲナーゼ溶液（新田ゼラチン）を加え、プラスチックディッシュを上下左右に揺らして溶液中に拡散させた。これらを、３７℃で３０分間インキュベートすることで細胞外マトリックスを消化した後、穏やかにピペッティングし細胞を分散させた。この細胞分散液を５０ｍＬ容の遠沈管（Ｆａｌｃｏｎ）にセルストレーナー（Ｆａｌｃｏｎ）を通しながら移した。さらに、培地１を適量添加し、よくピペッティングした後、５分間遠心分離した。遠心後、上清画分を除去し、新たに培地１を加えて細胞を分散させ洗浄した。この洗浄操作を２回繰り返した。洗浄後、培地２を用いて培養を行った。

フローサイトメトリーによる細胞の単離回収及び解析
各組織から調製した細胞を、それぞれ５％ＦＢＳ添加ハンクス液（Ｈａｎｋ‘ｓｂａｌａｎｃｅｄｓａｌｔｓｏｌｕｔｉｏｎ）中で、抗ｐ７５ＮＴＲポリクローナル抗体（ＣＨＥＭＩＣＯＮ）、抗ｃ−Ｋｉｔポリクローナル抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ）、抗ＣＤ４４ポリクローナル抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ）、抗ＣＤ１０５ポリクローナル抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ）、抗ＣＤ１０６ポリクローナル抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ）及び抗Ｗｎｔ１０ｂポリクローナル抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ）と３０分間氷中にて反応させた。反応後、５％ＦＢＳ添加ハンクス液にて３回洗浄し、続いてＡｌｅｘａＦｒｕｏ４８８、又はＰＥで標識した抗ＩｇＧモノクローナル抗体（インビトロジェン株式会社）と３０分間氷中にて反応させた。最後に、５％ＦＢＳを含むハンクス液にて３回洗浄し、ＰＩ（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍｉｏｄｉｄｅ）５μｇ／ｍＬを含む５％ＦＢＳ添加ハンクス液中に細胞を懸濁した。これら蛍光標識した細胞を、ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅ（ベックトン・ディッキンソン株式会社）にて解析した。ゲートの設定はネガティブコントロールを指標にした。まず、前方散乱光（ｆｏｒｗａｒｄｓｃａｔｔｅｒ）、側方散乱光（ｓｉｄｅｓｃａｔｔｅｒ）及びＰＩにより、残存する赤血球、細胞の残骸、細胞の凝集魂を除いた部分にゲート（Ｒ１）をかけた。次に、ゲート（Ｒ１）内のｐ７５ＮＴＲ^＋、ｃ−Ｋｉｔ^＋、ＣＤ４４^＋、ＣＤ１０５^＋、ＣＤ１０６^＋及びＷｎｔ１０ｂ^＋細胞を解析し、さらに、染色の組み合わせによりｐ７５ＮＴＲ^＋のみ、あるいはｐ７５ＮＴＲ^＋に加えてｃ−Ｋｉｔ^＋（以下、ｐ７５ＮＴＲ^＋／ｃ−Ｋｉｔ^＋と記す）、同様にｐ７５ＮＴＲ^＋／ＣＤ４４^＋、ｐ７５ＮＴＲ^＋／ＣＤ１０５^＋、ｐ７５ＮＴＲ^＋／ＣＤ１０６^＋、ｐ７５ＮＴＲ^＋／Ｗｎｔ１０ｂ^＋、ｃ−Ｋｉｔ^＋／ＣＤ４４^＋及びｃ−Ｋｉｔ^＋／Ｗｎｔ１０ｂ^＋の組み合わせで細胞に回収ゲートを設定し、それぞれのマーカータンパク質を合成している細胞を回収した。なお、遠心分離操作のみで細胞を回収する方法を従来の方法とした。

ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅにより、それぞれのマーカータンパク質をもとに回収した細胞を用いて、以下の方法で分化誘導培養を行い、分化誘導の確認を行った。

脂肪細胞への分化誘導確認
ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅにより回収した細胞を、脂肪細胞誘導用培地（ＴＯＹＯＢＯ）にて、３７℃、５％ＣＯ_２の条件で１４日間培養した。培地は３日間毎に新鮮な脂肪細胞誘導用培地に交換した。脂肪細胞への分化誘導確認は細胞を４％パラホルムアルデヒド溶液により固定した後、オイルレッドＯ染色により行った。

骨芽細胞への分化誘導確認
ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅにより回収した細胞を、骨芽細胞誘導用培地（ＴＯＹＯＢＯ）にて、３７℃、５％ＣＯ_２の条件で１４日間培養した。培地は３日間毎に新鮮な骨芽細胞誘導用培地に交換した。骨芽細胞への分化誘導確認は細胞を４％パラホルムアルデヒド溶液により固定した後、アルカリフォスファターゼ染色により行った。

軟骨細胞への分化誘導確認
ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅにより回収した細胞を、軟骨細胞誘導用培地（ＴＯＹＯＢＯ）にて、３７℃、５％ＣＯ_２の条件で１４日間培養した。培地は３日間毎に新鮮な軟骨細胞誘導用培地に交換した。軟骨細胞への分化誘導確認は細胞を４％パラホルムアルデヒド溶液により固定した後、アルシアンブルー染色により行った。

神経細胞への分化誘導確認
ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅにより回収した細胞を、神経細胞誘導用培地（ＴＯＹＯＢＯ）にて、３７℃、５％ＣＯ_２の条件で１４日間培養した。培地は３日間毎に新鮮な神経細胞誘導用培地に交換した。神経細胞への分化誘導確認は細胞を４％パラホルムアルデヒド溶液により固定した後、免疫染色（βＩＩＩ−チューブリンの有無）により行った。

平滑筋細胞への分化誘導確認
ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅにより回収した細胞を、平滑筋細胞誘導用培地（ＴＯＹＯＢＯ）にて、３７℃、５％ＣＯ_２の条件で１４日間培養した。培地は３日間毎に新鮮な平滑筋細胞誘導用培地に交換した。平滑筋細胞への分化誘導確認は細胞を４％パラホルムアルデヒド溶液により固定した後、免疫染色（α―Ｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅａｃｔｉｎの有無）により行った。

線維芽細胞への分化誘導確認
ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅにより回収した細胞を、線維芽細胞誘導用培地（ＴＯＹＯＢＯ）にて、３７℃、５％ＣＯ_２の条件で１４日間培養した。培地は３日間毎に新鮮な線維芽細胞誘導用培地に交換した。線維芽細胞への分化誘導確認は細胞を４％パラホルムアルデヒド溶液により固定した後、免疫染色（フィブロネクチンの有無）により行った。

以上の分化誘導確認により、骨髄、肝臓、膵臓、脂肪組織から、それぞれ各マーカータンパク質をもとに分離した細胞の分化誘導率を指標に評価した。具体的には、顕微鏡観察にて細胞の分化有無を計測し、その結果をもとに分化誘導率（総細胞数に対する分化した細胞数の割合％）を算出した。この分化誘導率（％）をもとに、最も優れた幹細胞の分離用のマーカータンパク質及びそれらの組み合わせの比較を行った。

各組織から分離した幹細胞の分化誘導率（％）の評価
細胞の分化誘導率（％）の評価基準は、分化誘導率が１０％以下を「−」、１０〜３０％を「＋」、３０〜５０％を「＋＋」、５０％以上を「＋＋＋」とした。それぞれ骨髄、肝臓、膵臓、脂肪組織からｐ７５ＮＴＲ^＋、ｃ−Ｋｉｔ^＋、ＣＤ４４^＋、Ｗｎｔ１０ｂ^＋、又は、ｐ７５ＮＴＲ^＋／ｃ−Ｋｉｔ^＋、ｐ７５ＮＴＲ^＋／ＣＤ４４^＋、ｐ７５ＮＴＲ^＋／Ｗｎｔ１０ｂ^＋、ｃ−Ｋｉｔ^＋／ＣＤ４４^＋、ｃ−Ｋｉｔ^＋／Ｗｎｔ１０ｂ^＋をマーカータンパク質として分離した細胞について分化誘導率の評価を行い、結果を表1〜４に示した。

その結果、骨髄、肝臓、膵臓、脂肪いずれの組織においても、ｐ７５ＮＴＲ^＋をマーカータンパク質として分離した細胞は、従来の方法で分離した細胞よりも分化誘導能が顕著に優れていた。さらに、ｐ７５ＮＴＲ^＋は、現在までに報告されているマーカータンパク質、ｃ−Ｋｉｔ^＋、ＣＤ４４^＋、Ｗｎｔ１０ｂ^＋に比べても優れていた。なお、その他のマーカータンパク質（ＣＤ１０５^＋、ＣＤ１０６^＋）と比べても同様に、ｐ７５ＮＴＲ^＋をマーカータンパク質とすることで分化誘導能の高い細胞を分離できた。さらに、ｐ７５ＮＴＲ^＋／ｃ−Ｋｉｔ^＋、又は、ｐ７５ＮＴＲ^＋／ＣＤ４４^＋による組み合わせにおいて、さらに高い分化誘導能を備えた細胞を分離できた。このような、顕著な相乗効果は、ｐ７５ＮＴＲ^＋／ＣＤ１０５^＋及びｐ７５ＮＴＲ^＋／ＣＤ１０６^＋でも確認できた。これに対し、ｐ７５ＮＴＲ^＋／Ｗｎｔ１０ｂ^＋、ｃ−Ｋｉｔ^＋／ＣＤ４４^＋、ｃ−Ｋｉｔ^＋／Ｗｎｔ１０ｂ^＋の細胞では、この様な相乗効果はみられず、必ずしもマーカータンパク質を組み合わせることが、幹細胞の分離効率の向上にはつながらなかった。以上の結果から、マーカータンパク質には最適な組み合わせがあり、本発明の、ｐ７５ＮＴＲ^＋をマーカータンパク質とし、これに加えて、ｃ−Ｋｉｔ^＋、ＣＤ４４^＋、ＣＤ１０５^＋及びＣＤ１０６^＋から選択されるマーカータンパク質を１種以上組み合わせた幹細胞の分離方法は、他のマーカータンパク質の組み合わせに比べて極めて効率的であり相乗的に働く優れた組み合わせであることを確認した。

以上の結果から、骨髄、肝臓、膵臓及び脂肪組織のいずれにおいても、ｐ７５ＮＴＲ^＋をマーカータンパク質とすることで、分化誘導能の高い幹細胞を分離回収できた。さらに、ｐ７５ＮＴＲ^＋をマーカータンパク質とし、これに加えて、ｃ−Ｋｉｔ^＋、ＣＤ４４^＋、ＣＤ１０５^＋及びＣＤ１０６^＋から選択されるマーカータンパク質を１種以上組み合わせることで、さらに分化誘導能の高い幹細胞を分離できることを発見した。また、これらマーカータンパク質を指標とすることで生体組織における幹細胞の同定が可能であることを確認した。本発明で明らかにした、これらのマーカータンパク質の組み合わせは、生体組織からの幹細胞の分離に極めて優れており、今後の幹細胞研究に大きく貢献できるものである。

本発明の活用例として、再生医療への応用が期待される。例えば、本発明により、従来に比べて骨髄、肝臓、膵臓及び脂肪組織から高純度で幹細胞を分離培養することが可能になった。これにより、難治性疾患の根本治療として、対象臓器への幹細胞移植治療や分化誘導後の臓器移植などへの応用が期待される。さらに、本発明は、様々な生体組織からの幹細胞の分離が可能であると考えられ、より汎用性の高い幹細胞の分離法といえる。また、本発明は、化粧品、食品、医薬部外品及び医薬品開発への応用も期待される。従来より純度の高い幹細胞を用いることで、より正確なスクリーニングが可能になり、目的の機能を示す化粧品、食品、医薬部外品及び医薬品における有効成分あるいは原料開発への応用が期待される。

Claims

ｐ７５ＮＴＲ^＋、ＣＤ４４^＋、ＣＤ１０５^＋及びＣＤ１０６^＋から選択されるマーカータンパク質に特異的親和性を有する抗体１種を用いて哺乳動物の生体組織から多能性幹細胞を分離する方法。
ｐ７５ＮＴＲ^＋をマーカータンパク質とし、これに対する特異的親和性を有する抗体と、ｃ−Ｋｉｔ^＋、ＣＤ４４^＋、ＣＤ１０５^＋及びＣＤ１０６^＋から選択されるマーカータンパク質に対する特異的親和性を有する抗体を１種以上組み合わせることで、効率よく哺乳動物の生体組織から多能性幹細胞を分離する方法。
ｐ７５ＮＴＲ^＋、ＣＤ４４^＋、ＣＤ１０５^＋及びＣＤ１０６^＋から選択されるマーカータンパク質に特異的親和性を有する抗体１種を用いて哺乳動物の生体組織における多能性幹細胞を同定する方法。
ｐ７５ＮＴＲ^＋をマーカータンパク質とし、これに対する特異的親和性を有する抗体と、ｃ−Ｋｉｔ^＋、ＣＤ４４^＋、ＣＤ１０５^＋及びＣＤ１０６^＋から選択されるマーカータンパク質に対する特異的親和性を有する抗体を１種以上組み合わせることで、哺乳動物の生体組織から多能性幹細胞を同定する方法。
生体組織がヒトを含む哺乳類由来である、請求項１から４のいずれかの方法。
生体組織が脂肪、肝臓、膵臓及び／又は骨髄由来である、請求項１から５のいずれかの方法。
脂肪が皮下脂肪由来である、請求項１から６のいずれかの方法。
脂肪が内臓脂肪由来である、請求項１から６のいずれかの方法。
請求項１から８のいずれかの方法により得られた、生体組織から分離された多能性幹細胞。