JP2002537802A - 細胞表面マーカー発現に基づく無培養組織からの神経幹細胞の単離および富化 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、哺乳動物末梢神経系からの神経幹細胞の見込みのある同定、単離、および自己複製の方法、ならびに無培養組織に由来する神経幹細胞の組成物を提供する。フローサイトメトリーを使用して、胚の末梢神経の神経堤由来細胞を、細胞表面マーカーに基づいて分画した。胚の坐骨神経から単離されたｐ７５⁺Ｐ₀細胞は、神経管外植片培養物から以前に単離された神経堤幹細胞（ＮＣＳＣ）と表現型的および機能的に区別不可能であった。さらに、新たに単離されたｐ７５ ⁺Ｐ₀細胞は、インビボで移植された場合に、ニューロンおよびグリアの両方を生じた。細胞周期分析およびＢｒｄＵ標識により、ｐ７５⁺Ｐ₀ＮＣＳＣは、神経堤移動の終了後、自己複製分裂を経験することによって、末梢神経に残存することが示された。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の技術分野） 本発明は、一般に、神経幹細胞の培養方法、そして特に神経幹細胞の単離また
は富化に関する。

【０００２】 （発明の背景） 幹細胞は、所定の時期の所定の組織において最も広範な発生能を有する、自己
複製（ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗｉｎｇ）する多能性前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏ
ｒ）である（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、８８ Ｃｅｌｌ ２８７−２９８（１９９７
）を参照）。神経発生を理解することの重要性だけでなく、神経変性疾患の処置
におけるその治療潜在能力の重要性からも、神経系における幹細胞の研究が近年
大きな関心を呼んでいる。

【０００３】 神経幹細胞の研究における制限は、インビボで神経幹細胞を見込みをもって同
定できないことであった（Ｇａｇｅ、８ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉ
ｎ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ６７１−６７６（１９９８）を参照）。これま
では、インビボで、限られた神経前駆細胞から神経幹細胞を単離するかまたは神
経幹細胞を区別するために利用可能なマーカーはなかった。これまでは、神経幹
細胞は、培養でのある期間の増殖後にのみ単離されてきたが、この増殖はその細
胞の性質を変化させ得る。したがって、インビトロで多能性および自己複製を示
す細胞の集団が、インビボで同様な性質を有する対応する細胞に由来するかどう
か未だ明らかでない。さらに、これらの細胞が、インビトロでの培養の間に、イ
ンビボに移植された場合に植え付き、そして分化するその細胞の能力を減少させ
るように性質を変化させるかどうか明かでない。

【０００４】 神経堤は、哺乳動物の神経幹細胞の生物学を研究するためのモデル系である（
Ａｎｄｅｒｓｏｎら、米国特許第５，５８９，３７６号、第５，８２４，４８９
号、第５，６５４，１８３号、第５，６９３，４８２号、第５，６７２，４９９
号、および第５，８４９，５５３号（すべて参考として援用する）を参照）。神
経堤幹細胞は、妊娠中期ラットの神経管外植片を培養中で２４時間インキュベー
トすることによって単離され得る。神経堤細胞は、培養神経管から外へ移動し、
培養皿中に単層を形成する。これらの培養物において、低アフィニティーニュー
ロトロフィンレセプターｐ７５を発現する細胞は、神経堤幹細胞（ＮＣＳＣ）の
ほぼ純粋な集団である。したがって、ＮＣＳＣは、インビトロにおいて、自己複
製し得、そしてニューロン、グリア、および平滑筋を生じ得る細胞と規定される
。ＮＣＳＣは、指令系統決定因子（ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｖｅ ｌｉｎｅａｇｅ
ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）である骨形成因子（ＢＭＰ２）、
グリア増殖因子（ＧＧＦ）、およびトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−
β）に対して、それぞれニューロン、グリア、および平滑筋に分化することによ
って応答する（それぞれ、Ｓｈａｈら、７７ Ｃｅｌｌ ３４９−３６０（１９
９４）；Ｓｈａｈら、８５ Ｃｅｌｌ ３３１−３４３（１９９６）；Ｓｈａｈ
およびＡｎｄｅｒｓｏｎ、９４ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ １１３６９−１１３７４（１９９７）を参照）。

【０００５】 インビボにおいて、神経堤細胞は、背側神経管から離層し、そして広範囲に移
動した後、凝集して末梢神経系（ＰＮＳ）の神経節および神経内分泌組織を形成
する。末梢神経は神経堤に由来するグリア（シュワン）細胞を含む。ラットにお
いて、Ｅ１４．５（体幹神経管からの神経堤移動が終了した２〜４日後）までは
、坐骨神経はシュワン細胞前駆体を含む。次の２〜３日の発生期にわたって、こ
れらのシュワン細胞前駆体は明白にシュワン細胞に分化する。現在まで、これら
のシュワン細胞前駆体が、既にグリアとなる運命に方向付られているのか、また
は他の発生能もなお保持しているのかは知られていない。これら前駆細胞が真に
方向付けられた系統であるかどうかの知識は、増殖因子および転写因子が末梢神
経発生をどのように調節するかを理解するうえで重要である。

【０００６】 （発明の要旨） 本発明は、幹細胞を他の細胞から分離するために細胞表面マーカーおよびフロ
ーサイトメトリーを使用する、無培養組織（ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄ ｔｉｓｓｕ
ｅ）からの幹細胞の見込みのある同定、単離、富化、および自己複製の方法を提
供する。本発明はまた、無培養神経組織に由来する神経幹細胞の組成物を提供す
る。

【０００７】 １つの実施形態において、本発明は、インビボにおいて、移動後の神経堤細胞
の集団の中から、自己複製する多能性神経堤幹細胞（ＮＣＳＣ）を見込みをもっ
て同定、単離、または富化する方法を提供する。以前には、このような見込みの
ある単離方法はなかったので、末梢神経系（ＰＮＳ）におけるＮＣＳＣについて
だけではなく、中枢神経系（ＣＮＳ）における神経幹細胞についてもまた、イン
ビボにおける神経幹細胞自己複製の証明が妨げられていた。

【０００８】 本発明の神経幹細胞は、神経細胞の分化および成熟に関連する因子の単離およ
び評価におけるスクリーニングアッセイに有用である。神経幹細胞、細胞の分化
および成熟に関連する因子の単離および評価はまた、被験体への移植に有用であ
る。１つの実施形態において、移植されたＮＣＳＣは、新たなニューロン、グリ
アまたは平滑筋へ分化し得る。したがって、ＮＣＳＣは、損傷を修復するため、
神経変性疾患を寛解するため、または遺伝子治療用に遺伝的に改変した細胞を植
え付けるために有用である。ＮＣＳＣの残存（本明細書において証明される）は
治療上重要である可能性があり、そしてヒトにおけるいくつかのＰＮＳ腫瘍の起
源を説明し得る。

【０００９】 （発明の詳細な説明） （序論）本発明は、従来の幹細胞技術を拡張し、そして神経系幹細胞の生物学
の分野全体にとって重要な新たな基本的進歩を提供する。

【００１０】 細胞表面マーカーに対する抗体を使用して、当業者は、フローサイトメトリー
により、胚の末梢神経の神経堤由来細胞を分画し得る。これら分画された神経堤
由来細胞は、神経堤幹細胞（ＮＣＳＣ）と表現型的および機能的に区別不可能で
ある。本方法は、インビトロで大規模な培養を行わず、無培養組織から直接のＮ
ＣＳＣの単離または富化を提供する。以前は、ＮＣＳＣは、妊娠中期神経管の外
植片培養物から外へ移動する神経堤細胞から単離された。

【００１１】 １つの実施形態において、これらｐ７５⁺Ｐ₀ ^-細胞は、ＮＣＳＣに富む細胞の
集団を提供するために、胚の末梢神経（例えば、坐骨神経）の他の細胞から分画
される。単離後、これら多能性で自己複製する移動後の神経堤細胞はインビトロ
で培養されても良いし、あるいは培養することなくインビボに直接移植されても
良い。インビボで、これらの細胞は幹細胞の性質（自己複製および多系統分化を
含む）を示す。新たに単離されたｐ７５⁺Ｐ₀ ^-細胞は、ニワトリ（ｃｈｉｃｋ）
胚への直接移植後、ニューロンおよびグリアの両方を生じた。このことは、これ
らの細胞のニューロン能が培養による人為的結果でないことを証明する。最後に
、インビボ細胞周期分析およびブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）標識により
、ｐ７５⁺Ｐ₀ ^-ＮＣＳＣは、神経堤移動の終了後、自己複製分裂を経験すること
によって、末梢神経に残存することが示される。したがって、幹細胞は、表面マ
ーカー発現により、ＰＮＳ中の他の細胞型と区別可能である。まとめると、これ
らのデータは、多能性神経堤細胞がインビボで自己複製し、そして妊娠後期（ラ
ットにおいて神経堤移動開始の少なくとも１週間後）（および他の動物およびヒ
トにおける等価な妊娠時期）にも残存することを示す。

【００１２】 本発明は、任意の神経系幹細胞を、細胞表面マーカー発現に基づいて無培養組
織から単離し得る方法を初めて提供する。したがって、本発明は、細胞表面マー
カーに対するモノクローナル抗体を使用して、幹細胞について富化し、無培養細
胞から幹細胞を単離し、そして幹細胞を同定するという、重要な方法論的革新で
あって他の神経幹細胞の集団にも拡張可能な方法を提供する。したがって、造血
幹細胞に使用される適用の多く（移植および遺伝子治療を含む）は、神経幹細胞
に適用可能である。より具体的には、本発明は、ＮＣＳＣが単離され得る供給源
を大きく拡げることによって、ＮＣＳＣの単離を容易にする。ここでは、妊娠中
期の神経管から細胞を単離する必要はない。なぜなら、ＮＣＳＣは妊娠後期の坐
骨神経から入手し得るからである。本発明は、造血幹細胞と同じ容易さで神経幹
細胞の操作を初めて可能にする。

【００１３】 当業者は、無培養組織（例えば、分離された神経）から幹細胞を単離または富
化し得る。神経組織は酵素により分離され得る。例えば、Ｅ１４の坐骨神経は酵
素の組合せ（例えば、ヒアルロニダーゼおよびコラゲナーゼ）を使用して分離さ
れ得る（実施例１を参照）。酵素の他の組合せもまた使用され得る（例えば、ト
リプシン）。Ｅ１４坐骨神経はまた、酵素によらず、粉砕または他の機械的分離
技術により分離され得る。胚発生の後期段階（例えば、Ｅ１７以上の坐骨神経）
では、酵素分離がおそらく必要である。単離に使用する表面マーカーの選択およ
びフローサイトメトリーによる幹細胞富化の可能性は、組織分離法に依存する。
なぜなら、プロテアーゼを含む方法はいくつかのタンパク質およびタンパク質関
連細胞表面抗原の喪失を引き起こし得るからである。

【００１４】 （幹細胞）用語「幹細胞」は、（１）細胞が１種類以上の分化誘導体を発生さ
せ得る未分化細胞であること；（２）細胞が非常な増殖能を有すること；および
（３）細胞が自己複製可能であるか自己維持可能であること（Ｐｏｔｔｅｎら、
１１０ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １００１（１９９０）を参照）を意味する。
用語「神経堤幹細胞」（ＮＣＳＣ）は、（１）自己複製および（２）非対称分裂
（すなわち、１つの細胞が分裂して、２つの異なる娘細胞を生じる。一方は自己
であり（複製）、他方は、親の神経堤幹細胞と比較して、より制限された発生能
を有する細胞である）の性質を有することにより特徴付けられる、神経堤由来の
細胞をいう（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、米国特許第５，５８９，３７６号、第５，８
２４，４８９号、第５，６５４，１８３号、第５，６９３，４８２号、第５，６
７２，４９９号、および第５，８４９，５５３号（すべて参考として援用する）
を参照）。しかし、このことは、神経堤幹細胞のすべての細胞分裂が非対称分裂
を生じるという意味ではない（下記の実施例２を参照）。神経堤幹細胞の分裂は
また、自己複製のみを生じ得るか、発生学的により制限された子孫のみの産生を
生じ得るか、または自己複製した幹細胞および制限された発生能を有する細胞の
産生を生じ得る。

【００１５】 用語「多能性神経幹細胞」は、神経堤幹細胞の性質と同様な性質を有するが、
必ずしも神経堤に由来しない細胞をいう。より適切には、そのような多能性神経
幹細胞は、種々の他の組織（成体もしくは胚の中枢神経系（ＣＮＳ）の脳または
脊髄からの神経上皮組織あるいはＰＮＳを包含する組織に存在し得る神経上皮組
織を含む）に由来し得る。さらに、多能性神経幹細胞は、本明細書に開示された
方法を利用して、肺、骨などのような他の組織から誘導され得る。このような細
胞は、再生し得、そして神経幹細胞がＮＣＳＣである場合、異なる型のニューロ
ンまたはグリア（例えば、ＰＮＳおよびＣＮＳニューロンおよびグリア）かまた
は平滑筋細胞へ、あるいはニューロンまたはグリアの前駆細胞へ分化し得る。し
たがって、上記の神経堤幹細胞（ＮＣＳＣ）は、インビトロでの自己再生ならび
にニューロン、グリアおよび平滑筋への分化が記載の条件下にて可能である点で
、少なくとも多能性である。したがって、ＮＣＳＣは、特定の組織（すなわち、
胚の神経管）に由来する多能性神経幹細胞である。

【００１６】 神経幹細胞（ＮＣＳＣを含む）は、操作上、細胞表面マーカーによって特徴付
けられ得る。これらの細胞表面マーカーは、この細胞表面マーカーに特異的に結
合する試薬により結合され得る。例えば、神経幹細胞の表面のタンパク質または
炭水化物は、その特定のタンパク質または炭水化物に特異的な抗体によって免疫
学的に認識され得る。神経幹細胞の細胞表面に存在するマーカーのセットは、神
経幹細胞に特徴的である。したがって、神経幹細胞は、細胞表面マーカーのポジ
ティブ選択およびネガティブ選択により選択され得る。神経幹細胞の「ポジティ
ブマーカー」（すなわち、神経幹細胞の細胞表面に存在するマーカー）に結合す
る試薬は、神経幹細胞のポジティブ選択に使用され得る。神経幹細胞の「ネガテ
ィブマーカー」（すなわち、神経幹細胞の細胞表面に存在しないマーカー）に結
合する試薬は、集団中の神経幹細胞でない細胞のネガティブ選択のため（すなわ
ち、神経幹細胞でない細胞の排除のため）に使用され得る。「試薬の組合せ」は
、神経幹細胞の表面に存在する細胞表面マーカー（ポジティブマーカー）または
存在しない細胞表面マーカー（ネガティブマーカー）のいずれかに結合するか、
あるいはポジティブマーカーおよびネガティブマーカーの組合せ（例えば、ｐ７
５およびＰ₀）に結合する、少なくとも２つの試薬である。

【００１７】 神経幹細胞のポジティブマーカーもまた、神経幹細胞において見出されること
に加えて、神経幹細胞由来の他の細胞（例えば、ＰＮＳおよびＣＮＳのグリア前
駆細胞およびニューロン前駆細胞）において見出され得る。１つの例は、ｐ７５
（ラット、ヒトおよびサルの神経堤幹細胞において見出される低アフィニティー
神経増殖因子レセプター（ＬＮＧＦＲ））の細胞表面発現である。ｐ７５は、神
経堤細胞およびシュワン細胞（ＰＮＳのグリア細胞）を含むいくつかの哺乳動物
細胞型上および鳥類細胞型上、ならびに胚性ＣＮＳ中の細胞の表面において見出
される（例えば、Ｙａｎら、８Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３４８１〜３４９６（１
９８８）（ラット）；Ｈｅｕｅｒら、５ Ｎｅｕｒｏｎ ２８３〜２９６（１９
８０）（ニワトリ）を参照のこと）。ｐ７５に特異的な抗体が、ラット由来のｐ
７５（２１７ｃ；Ｐｅｎｇら、２１５ Ｓｃｉｅｎｃｅ １１０２〜１１０４（
１９８２）を参照のこと；１９２−Ｉｇ；Ｂｒｏｃｋｅｓら、２６６ Ｎａｔｕ
ｒｅ ３６４〜３６６（１９７７）を参照のこと）、およびヒト由来のｐ７５（
Ｒｏｓｓら、８１ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、 ６６８
１〜６６８５（１９８４））について同定されている。ヒトｐ７５に対するモノ
クローナル抗体は、サル由来のｐ７５と交差反応する。当業者に公知の技術を使
用して、任意の記載された種由来のｐ７５に特異的なモノクローナル抗体を生成
し得る（Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８８）を参照のこと）。種特異的であるポリクローナル抗
体またはモノクローナル抗体を生成することは、常に必要なわけではない。１つ
の種由来の抗原決定基に対するモノクローナル抗体は、１つより多くの種由来の
その抗原に対して反応し得る。例えば、上述のように、ヒトｐ７５に対する抗体
は、サル細胞上のｐ７５もまた、認識する。

【００１８】 ネガティブ選択のために、成熟ＰＮＳニューロン細胞または成熟ＰＮＳグリア
細胞に関連する細胞表面マーカーの不存在によって、ＮＣＳＣを単離または富化
し得る。これらのマーカーとしては、ＰＮＳグリア細胞中のミエリンタンパク質
Ｐ₀が挙げられる。Ｐ₀は、方向付けられたシュワン細胞（ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ
Ｓｃｈｗａｎｎ ｃｅｌｌ）によって発現される末梢ミエリンタンパク質である
。Ｐ₀はまた、鳥類および哺乳動物の両方における移動している神経堤細胞のサ
ブセット（ｓｕｂｓｅｔ）において、比較的低レベルで発現する。初期の坐骨神
経に移動する間または移動したすぐ後のＰ₀発現は、神経堤細胞のグリアの運命
への初期の拘束の反映として解釈されている（Ｌｅｅら、８ Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ３３６〜３５０（
１９９７）を参照のこと）。しかし、いくつかのＮＣＳＣ（ならびにＭのみの（
Ｍ−ｏｎｌｙ）前駆体）は、ｐ７５⁺Ｐ₀ ⁺画分に存在し（表３を参照のこと）、
そしてｐ７５^-/lowＰ₀ ⁺細胞の９９％は、Ｍのみのコロニーを生じる（表３を参
照のこと）。これらの結果は、Ｐ₀の発現がグリアの運命に対する拘束を必ずし
も示すわけではないことを示す。さらに、ＮＣＳＣを含む神経幹細胞は、Ｐ₀タ
ンパク質マーカーを発現するとして検出可能に同定されることなく、かつフロー
サイトメトリーによってＰ₀ ⁺として選択されることなく、検出可能なレベルのＰ ₀ のｍＲＮＡを発現し得、そして可能性として低レベルのＰ₀タンパク質を発現し
得る。

【００１９】 １つの実施形態において、「試薬の組合せ」は、ｐ７５に対する抗体とＰ₀に
対する抗体である。

【００２０】 神経幹細胞表面マーカーに対して特異的な抗体の使用は、胚性神経管以外の組
織に由来する多能性神経幹細胞の単離または富化のために有用である、本発明の
方法をもたらす。例えば、ｐ７５は、ラットおよびニワトリの胚性ＣＮＳの細胞
中で発現する。他の哺乳動物種および鳥類種は、類似のｐ７５発現パターンを有
する；ヒトｐ７５に対するモノクローナル抗体を用いるＬｏｙら（２７ Ｊ．Ｎ
ｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．６５１〜６５４（１９９０））によるヒトにおける研
究は、この予測と一致する。従って、本発明の方法は、ヒト神経幹細胞の富化ま
たは単離のために有用である。また、ＮＣＳＣが胎児発生の間において予測され
るよりも後にまで残存するという知見は、ＮＣＳＣが、出生後に末梢神経中に残
存することを示す。小数のニューロンが、出生後の坐骨神経の体外移植組織から
出現することが、報告されている（Ｂａｒａｋａｔ−Ｗａｌｔｅｒ、１６１ Ｄ
ｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２６３〜２７３（１９９４））。
さらに、神経幹細胞はまた、ＣＮＳにおいて見出されるので（Ｗｅｉｓｓら、米
国特許第５，７５０，３７６号および同５，８５１，８３２号、Ｊｏｈｅ、米国
特許第５，７５３，５０６号を参照のこと。これらの全てを参考として援用する
）、神経細胞特異的表面マーカーに対する抗体は、ＣＮＳ、ＰＮＳおよび他の組
織供給源由来の多能性神経幹細胞の単離において有用である。神経細胞特異的表
面マーカーに対する抗体を使用する方法は、神経組織供給源由来の多能性神経上
皮幹細胞の単離において有用である（Ｒａｏら、ＰＣＴ／ＵＳ９８／０９３６３
０；Ｒａｏら、９５（７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ３
９９６〜４００１（１９９８）を参照のこと、この両方を参考として援用する）
。

【００２１】 用語「ニューロン前駆細胞」とは、完全に分化したニューロン細胞と、その完
全に分化したニューロン細胞が発生する前駆体の多能性神経幹細胞との間の中間
体である細胞をいう。用語「ＰＮＳニューロン前駆細胞」とは、哺乳動物の神経
堤幹細胞から分化した細胞を意味する。この哺乳動物の神経堤幹細胞は、１つ以
上のＰＮＳニューロン系列に拘束され、そして分裂している細胞であるが、より
分化した分裂していないＰＮＳニューロン細胞において見出される表面マーカー
または細胞内マーカーをまだ発現していない。そのような前駆細胞は、好ましく
は、さらなる分化をした胚性神経堤より単離された神経堤幹細胞より得られる。
しかし、等価な細胞を、他の組織から誘導し得る。ＰＮＳニューロン前駆細胞が
、適切な培養条件下に配置される場合、その細胞は、適切な分化マーカー（例え
ば、ぺリフェリン（ｐｅｒｉｐｈｅｒｉｎ）、神経フィラメントおよび高ポリシ
アル酸神経細胞接着分子（高ＰＳＡ−ＮＣＡＭ））を発現する成熟したＰＮＳニ
ューロンに分化する。

【００２２】 （培養） 本発明はまた多能性神経幹細胞培養の組成物を提供する。これらの細胞培養物
は、本発明の単離方法の開発なしには、提供され得なかった。本発明は、ＮＣＳ
Ｃ組成物を提供する。この組成物は、神経堤細胞誘導物（例えば、ＰＮＳのニュ
ーロン前駆体およびＰＮＳのグリア前駆体）の供給源として作用し得る。次に、
ＰＮＳのニューロン前駆体およびＰＮＳのグリア前駆体は、ＰＮＳニューロンお
よびＰＮＳグリアの供給源である。本発明はまた、幹細胞を無培養の組織から調
製するＣＮＳ神経幹細胞組成物を提供する（Ｗｅｉｓｓら、米国特許第５，７５
０，３７６号および同５，８５１，８３２号を比較のこと。この両方を参考とし
て援用する）。本発明はまた、神経末梢幹細胞が無培養の組織から調製される、
神経末梢幹細胞組成物を提供する（Ｒａｏら、ＰＣＴ／ＵＳ９８／０９３６３０
；Ｒａｏら、９５（７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ３９
９６〜４００１、１９９８を比較のこと、この両方を参考として援用する）。

【００２３】 培養培地は、化学的に規定された培地であり得る。この培地は、ラット神経堤
幹細胞の増殖および自己複製を可能にするマイトジェンおよび生存因子（ｓｕｒ
ｖｉｖａｌ ｆａｃｔｏｒ）の供給源としてニワトリ胚抽出物（ＣＥＥ）で補充
される（以下の実施例１を参照のこと）。当業者に公知の、多能性神経幹細胞増
殖を誘導するために有効な、１つ以上の予め決定された増殖因子を含む、血清を
含有しない他の培養培地を使用して、他の鳥類種および哺乳動物種（例えば、ヒ
ト（Ｗｅｉｓｓら、米国特許第５，７５０，３７６号および同５，８５１，８３
２号、Ｊｏｈｅ、米国特許第５，７５３，５０６号；Ａｔｌａｓら、Ｈａｎｄｂ
ｏｏｋ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉａ（ＣＲＣ Ｐｒｅ
ｓｓ、Ｂｏｃａ、Ｒａｔｏｎ、Ｌｏｕｉｓｉａｎａ、１９９３）； Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｎ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ、Ａ Ｍ
ａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、第３版（Ｗｉｌｅｙ−Ｌ
ｉｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９４）を参照のこと。これらの全てを参考とし
て援用する））から、神経堤幹細胞を単離して増殖させ得る。

【００２４】 従って、神経幹細胞の増殖のための培養培地は、神経幹細胞および増殖した子
孫の増殖を支持する。「増殖した子孫」は、未分化の神経細胞であり、神経幹細
胞を含む。なぜなら、神経幹細胞は、培養中での自己複製能力を有するからであ
る（実施例２を参照のこと）。本発明のインビトロ細胞培養組成物は、高いパー
セント（好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは６０％）の自己複製する
多能性神経幹細胞を含む（表３に記載される）。本発明のインビトロ細胞培養組
成物はまた、神経幹細胞に特徴的な細胞表面マーカーを有する高いパーセントの
細胞を含み得る。１つの実施形態において、細胞培養物は、少なくとも８０％の
ｐ７５⁺細胞を含む。

【００２５】 ＮＣＳＣ組成物について、培養培地は、指令因子（ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｖｅ
ｆａｃｔｏｒ）（例えば、ＴＧＦ−βスーパーファミリー由来の増殖因子）を含
み得る。用語「指令因子」とは、主に単一の系列（例えば、グリア細胞、ニュー
ロン細胞または平滑筋細胞）にまで神経幹細胞の分化を生じ得る１つ以上の因子
をいう。従って、平滑筋細胞の分化に指令因子は、神経幹細胞のグリア細胞また
はニューロン細胞のような他の系列への分化を犠牲にして、そのような神経幹細
胞の平滑筋細胞への分化を生じる因子である。哺乳動物の血清が、平滑筋細胞分
裂についての１つ以上の指令因子を含むことを同定する、すなわち、そのような
指令因子を、哺乳動物血清を分画して、そのような画分の１つ以上を神経幹細胞
培地に戻して添加して、平滑筋細胞分化についての指令因子を含む１つ以上の画
分を同定することによって同定し得る。次に、平滑筋細胞に対する指令的分化に
必要な１つ以上の成分を同定するまで、ポジティブ因子をさらに分画して、そし
て再アッセイし得る。

【００２６】 用語「ＴＧＦ−βスーパーファミリー由来の増殖因子」とは、トランスフォー
ミング増殖因子β１（「ＴＧＦ−β１」）に関連する増殖因子を意味する。その
ようなＴＧＦ−βスーパーファミリー増殖因子は、ＴＧＦ−β１（ＴＧＦ−βス
ーパーファミリーのプロトタイプなメンバー）と類似の生物学的効果を発揮して
もしなくてもよい。例として、増殖因子のＴＧＦ−βスーパーファミリーのメン
バーは、天然に生じるアナログ（例えば、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ
−β４）、ならびに、骨形成因子２および４（「ＢＭＰ−２」および「ＢＭＰ−
４」）によって例示される関連する増殖因子に加え、ＴＧＦ−β１の任意の公知
の合成アナログまたは天然のアナログを含むが、これらに限定されない。これら
の化合物を、天然の供給源から精製し得るか、または組換えＤＮＡ技術によって
産生し得る。そしてこれらの化合物は、実質的に純粋であっても、そうでなくて
もよい。分化を生じる性質を保持する改変体およびフラグメントも、このスーパ
ーファミリーのメンバーの定義に含まれる。さらに、用語骨形態形成タンパク質
（「ＢＭＰ」）とは、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーである増殖因子
の群をいう。本明細書において記載される増殖因子を、個別に、またはお互いに
組合せて、投与し得る。

【００２７】 指令因子は、追加的に、または代替的にＮＲＧ−１であり得る。ＮＲＧ−１は
、神経の運動軸索において発現し、そして適切なシュワン細胞発生にとって遺伝
的に必須である。ＮＲＧ−１（グリア増殖因子としても公知）は、指令的な様式
において、ＮＣＳＣによるグリア分化を促進し（Ｓｈａｈら、７７ Ｃｅｌｌ、
３４９〜３６０（１９９４））、そして細胞死を生じずに、ＮＣＳＣによる神経
原性能力の迅速な損失を生じ得る（ＳｈａｈおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ、９４ Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １１３６９〜１１３７４（１９
９７））。ニューレグリン（ｎｅｕｒｅｇｕｌｉｎ）もまた、シュワン細胞およ
びその子孫の生存および増殖を促進する。

【００２８】 以下の実施例３において実証されるように、ＮＲＧ−１は、坐骨神経から単離
されたＮＣＳＣに対して指令的に作用する。ＮＲＧ−１はまた、全ての神経前駆
体の生存（プレーティング効率について表３および５を参照のこと）、ならびに
坐骨神経内のシュワン（Ｓのみの（Ｓ−ｏｎｌｙ））前駆体および筋線維芽細胞
（Ｍのみの（Ｍ−ｏｎｌｙ））前駆体の増殖を促進する。これらの効果は、独立
しており、そしてお互いに明確に区別され得る；生存の促進は、指令効果を説明
し得ず、指令効果は、生存の促進を説明し得ない。従って、これらの異なるニュ
ーレグリン機能の間の矛盾はない。ともに考慮すると、これらのデータは、末梢
神経中のＮＲＧ−１が、シュワン細胞発生の複数の役割（ＮＣＳＣの神経原性で
ない運命への制限を含む）を担うという考えと一致する。

【００２９】 （神経幹細胞の富化およびプレーティング効率） ｐ７５⁺Ｐ₀ ^-細胞のプレーティング効率は、標準的条件（表１）およびＢＭＰ
２を補充した培養中の両方の下で、約２５％である。この計算は、多能性神経前
駆体の以前のクローン分析と、有望に匹敵するが（Ｒｅｙｎｏｌｄｓら、１２
Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．４５６５〜４５７４（１９９２）；Ｋｉｌｐａｔｒｉｃ
ｋおよびＢａｒｔｌｅｔｔ、１０ Ｎｅｕｒｏｎ ２５５〜２６５（１９９３）
；Ｇｒｉｔｔｉら、１６ Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１０９１〜１１００（１９９
６）；Ｊｏｈｅら、１０ Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖ．３１２９〜３１４０（１９
９６））、これらの培養条件下でコロニーを形成しない他の前駆体のタイプが、
ｐ７５⁺Ｐ₀ ^-集団中に潜伏し得るか否かという質問を生じる。坐骨神経内の全て
の他の前駆体のタイプが本発明者らの培養条件下でコロニーを形成すると仮定す
ると、この可能性は、ありそうにもない。実際、これらの他の前駆体集団は、ｐ
７５⁺Ｐ₀ ^-細胞よりも高いプレーティング効率（ｐｌａｔｉｎｇ ｅｆｆｉｃｉ
ｅｎｃｙ）を有した（表３）。

【００３０】 （末梢神経中の系列拘束は、以前に予測されたよりも複雑かつ動的である） 本明細書に記載する結果は、ＰＮＳの発生が、驚くべきことに、以前に考えれ
られていたよりも動的かつ可塑性であることを示す。

【００３１】 ＰＮＳは、妊娠初期から中期の間に比較的迅速に形成され、神経堤前駆体の移
動後の迅速な分化をともなうと考えられた。多能性前駆体（例えば、胚性神経管
細胞内の前駆体、および初期の移動している神経堤細胞内の前駆体）は、移動の
間に非常に迅速に拘束されるようになると考えられ、そして移動後の神経堤細胞
中では、非常に長期間残存はしない。鳥類において使用される研究的アプローチ
は、ＮＣＳＣが比較的迅速に分化して、その結果、移動後の数日間内に、全ての
細胞の運命がＰＮＳ内で決定されることを示唆した。

【００３２】 Ｅ１４坐骨神経内の神経堤由来細胞は、以前には、シュワン細胞前駆体であり
、シュワン細胞に分化する運命であると考えられていた。これらシュワン前駆体
の発生の可能性は、神経堤前駆体とは異なると考えられていた。なぜなら、坐骨
神経由来のｐ７５⁺細胞は、抗ＧＡＰ−４３抗体で染色されるが、神経堤の成長
物は染色されないことが観察されたからである。本発明者らは、抗ＧＡＰ−４３
モノクローナル抗体および抗ＧＡＰ−４３ポリクローナル抗体を、種々の固定条
件および培養条件下で試験したが、ＮＣＳＣコロニーに分化するニューロン内以
外の染色は観察されなかった。

【００３３】 坐骨神経がＧＡＰ−４３を発現してもしなくても、Ｅ１４．５坐骨神経細胞は
、マーカー発現および発生の可能性に関して、前駆体の不均一な集合を含み、有
意な割合は、表現型および機能的にＮＣＳＣと区別できないが、比較的小さな割
合は、シュワン細胞の運命に拘束されているようである。Ｅ１４．５坐骨神経よ
り培養された前駆体のタイプは、ＮＣＳＣが末梢神経中で筋線維芽細胞誘導体と
シュワン細胞の両方を生成し得ることを示す。筋線維芽細胞誘導体は、神経周膜
、神経上膜、および血管平滑筋を含み得る。

【００３４】 同様の方法において、Ｍａｃ−１（成熟骨髄細胞のマーカー）が、胎児造血性
幹細胞において発現されることが示されている（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２、１０３０２〜１０３０６（１９
９５））。そのような現象は、幹細胞の多能性が、その産物が最終的に異なる幹
細胞誘導体を規定する遺伝子の低レベル転写において分子レベルを反映し得ると
いう考えと一致する。

【００３５】 （神経幹細胞の移植）本発明の神経幹細胞培養物は、産生され得、そして宿主
中に移植され得る（実施例６を参照のこと）。従って、移殖の方法は、種々の宿
主（好ましくは、ヒト患者）への移植に使用され得る。ヒト患者に移植された神
経幹細胞は、ＰＮＳにおける、ＣＮＳにおける、および全身性の種々の障害の処
置に有用である。末梢神経の生検から神経幹細胞を単離する能力は、重要な治療
適用を有し得る。なぜなら、ＮＣＳＣは、特に生体の神経の環境がＮＣＳＣ生存
、自己複製、および分化に依然として許容される場合、神経損傷部位に移殖され
得るからである。

【００３６】 細胞は、当該分野において公知の任意の適切な手段によって被験体に送達され
る。ＣＮＳに送達される場合、細胞は、脳の周囲の領域の統合性を維持する任意
の方法を使用して（好ましくは、注入カニューレによって）特定の領域に投与さ
れる。Ｄｕｃａｎら，１７Ｊ，Ｎｅｕｒｏｃｙｔｏｌｏｇｙ ３５１〜３６１（
１９８８）によって使用される方法によって例示され、ヒトでの使用にスケール
アップされかつ改変される注入方法が、好ましい。ＣＮＳへの細胞懸濁液（例え
ば、線維芽細胞）の注入のための方法もまた、神経前駆細胞の注入に用いられる
。さらなるアプローチおよび方法が、Ｎｅｕｒａｌ Ｇｒａｆｔｉｎｇ ｉｎ
ｔｈｅ Ｍａｍｍａｌｉａｎ ＣＮＳ，Ｂｊｏｒｋｌｕｎｄ＆Ｓｔｅｎｅｖｉ編
（１９８５）に見出され得る。

【００３７】 本発明の神経幹細胞培養物は、種々の神経変性障害を処置するために、上記の
手順を使用して産生され、そして移殖され得る。このようなＣＮＳ障害としては
、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病およびパーキンソン病）、急性脳傷
害（例えば、発作、頭部傷害、大脳麻痺）および多数のＣＮＳ機能不全（例えば
、うつ病、てんかん、精神分裂病）のような多くの病気が挙げられる。近年、神
経変性疾患が、これらの障害について最大の危険性がある増えている高齢者の集
団に起因して重要な関心事になっている。アルツハイマー病、多発性硬化症（Ｍ
Ｓ）、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、およびパーキンソン病を含むこれ
らの疾患が、ＣＮＳの特定の位置における神経細胞の変性と関連している。この
ことは、これらの細胞または脳領域がそれらの意図された機能を遂行し得ないこ
とにつながる。特定の異なる増殖因子を通じて１以上の選択された系列への成熟
、増殖および分化について提供することによって、前駆細胞は、方向付けられた
細胞の供給源として使用され得る。１つのシリーズの実施形態において、コラゲ
ナーゼ処理した神経幹細胞培養物は、脱髄疾患の処置のための上記の手順を使用
して産生され、そして移殖され得る。脱髄標的の近傍に細胞を移植するための任
意の適切な方法は、細胞が脱髄軸索と関連し得るように使用され得る。

【００３８】 本発明に従って作製された神経幹細胞培養物はまた、種々の血液細胞型（骨髄
細胞またはリンパ細胞、および初期造血細胞を含む）を産生するために使用され
得る（Ｂｊｏｒｎｓｏｎら、２８３ Ｓｃｉｅｎｃｅ ５３４（１９９９）（本
明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。

【００３９】 （神経幹細胞に対する因子の効果をスクリーニングするための方法）インビト
ロで培養された、本発明の神経幹細胞培養物は、細胞の分化および成熟と関連す
る組成物中の因子の単離および評価のために、潜在的な神経学的治療組成物をス
クリーニングするために使用され得る。これらの組成物は、種々の投薬量で培養
中の細胞に適用され得、そして細胞の応答が、種々の時間でモニターされ得る。
細胞の物理的特徴は、細胞および軸索の成長を顕微鏡で観察することによって分
析され得る。新規のタンパク質もしくは増加したレベルのタンパク質（例えば、
酵素、レセプターおよび他の細胞表面分子）、あるいは神経伝達物質、アミノ酸
、ニューロペプチド、および生体アミンの発現の誘導は、当該分野で公知の任意
の技術（この技術によってこのような分子のレベルの変化が同定され得る）を用
いて分析され得る。これらの技術としては、このような分子に対する抗体を使用
する免疫組織化学、または生化学分析が挙げられる。このよな生化学分析として
は、タンパク質アッセイ、酵素アッセイ、レセプター結合アッセイ、酵素結合免
疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、電気泳動分析、高速液体クロマトグラフィー（
ＨＰＬＣ）による分析、ウエスタンブロット、および放射免疫アッセイ（ＲＩＡ
）が挙げられる。ノーザンブロットのような核酸分析が、これらの分子、または
これらの分子を合成する酵素をコードするｍＲＮＡレベルを試験するために使用
され得る。あるいは、これらの薬学的組成物で処理された細胞が、動物に移植さ
れ、そしてそれらの生存、神経接続を形成する能力、ならびに生化学特徴および
免疫学的特徴が、上記のように試験される。

【００４０】 本発明の神経幹細胞培養物は、神経細胞に対する生物学的因子の効果を決定す
る方法において使用され得る。用語「生物学的因子」とは、任意の因子（例えば
、ウイルス、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、糖質、核酸、ヌクレオチ
ド、薬物、プロドラッグ、またはこのような効果が有害であるか、有益であるか
、もしくはそれ以外であるかにかかわらず神経細胞に対する効果を有し得る他の
物質）をいう。神経細胞に有益である生物学的因子は、本明細書中で、「神経学
的因子」といわれる。この用語は、ＣＮＳ細胞の増殖、分化または機能に、ある
いは神経学的疾患もしくは障害の処置についての潜在的な有用性を証明し得る、
任意の生物学的または薬学的に活性な物質を含む。神経細胞に対する潜在的な生
物学的因子の効果を決定するために、コラゲナーゼ処理した神経幹細胞培養物を
入手し、そして増殖を誘導する増殖因子の存在下でインビトロで増殖させる。一
般的に、生物学的因子は可溶化され、そして各用量での因子の効果を決定するた
めに種々の濃度で培養培地に添加される。培養培地は、ある程度一定に因子の濃
度を保つように、隔日で生物学的因子を量的に補充され得る。

【００４１】 従って、移殖の目的のために多数の細胞を生成するに有用である前駆細胞の増
殖能を増大させる生物学的因子についてスクリーニングすることが可能である。
コラゲナーゼ処理した神経幹細胞培養物を使用して、前駆細胞の増殖を阻害する
生物学的因子についてスクリーニングすることもまた可能である。また、種々の
生物学的因子が分化した神経細胞の数および性質をいくつかの他の様式で増大、
減少または改変する能力が、分化を誘導した、コラゲナーゼ処理した神経幹細胞
培養物に対してスクリーニングされ得る。次いで、分化および分化した神経細胞
の生存に対する生物学的因子または生物学的因子の組合せの効果が、決定され得
る。分化前に生物学的因子を神経幹細胞培養物に適用することによって、分化プ
ロセスに対する生物学的因子の効果を決定することもまた、可能である。

【００４２】 （坐骨神経幹細胞およびＰＮＳ腫瘍の起源）ＮＣＳＣ残存の本発明の発見は、
特定のＰＮＳ癌の病因における重要な洞察を提供する。末梢性神経外胚葉腫瘍お
よびユーイング肉腫は、しばしば、いくつかの異なるニューロン系列および中外
胚葉系列に分化する能力を有する始原細胞を含む。これらの腫瘍は神経堤前駆体
の形質転換と関連し得るが、この関連は、神経堤前駆体が胎児の発生において初
期に最終分化するという見込みを考慮すると神秘的であった。ＮＣＳＣが残存す
るという本発明の発見は、ユーイング肉腫（これは、子供の骨に主に生じる）が
骨膜を神経支配する末梢神経線維に存在するＮＣＳＣの不死化から駆動し得ると
いうことを示す。同様に、シュワンおよび筋原線維特性を有する細胞を含む神経
線維腫は、子供の末梢神経において生じ、そしてまた、胎児後期または生後の発
達の間に、ＮＣＳＣ（またはＳ＋Ｍ前駆体）の形質転換から駆動し得る。ＮＣＳ
Ｃがげっ歯類の末梢神経で残存するという知見は、従って、ＰＮＳ疾患の診断お
よび処置に重要であり得る。

【００４３】 以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態をより十分に例示するために提示
される。これらの実施例は、添付の特許請求の範囲に規定される、本発明の範囲
を制限するものとしていかなる様式にも解釈されるべきではない。

【００４４】 （実施例１） （胎児坐骨神経は、多能性および方向付けられた神経前駆細胞を含む） （序論）坐骨神経が方向付けられていない神経前駆細胞を含むことを示すため
に、本発明者らは、Ｅ１４．５〜Ｅ１７．５ラット坐骨神経を分離させ、そして
クローン（ｃｌｏｎａｌ）密度で培養物中に単一の細胞をプレーティングした。
個々の単離された細胞を自己複製させ、そしてニューロン、グリア、および平滑
筋様筋線維芽細胞を含むクローンを生じた。

【００４５】 （坐骨神経細胞培養物の調製）受胎したＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット
を、Ｓｉｍｏｎｓｅｎ（Ｇｉｌｒｏｙ，ＣＡ）から入手した。受胎期に関して、
動物を午後および午前にひとまとめにして、その時にプラグ（ｐｌｕｇ）を観察
して、Ｅ０．５と命名した。坐骨神経を、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）
（Ｇｉｂｃｏ）を含む氷冷Ｃａ⁺⁺、Ｍｇ⁺⁺を含まないハンクス平衡化塩溶液（Ｈ
ＢＳＳ）（Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）中に切
開した。神経を、室温で３（分間）４５０×ｇで遠心分離することによってペレ
ットにした。Ｅ１４〜Ｅ１７神経を、一般的に、０．０２５％トリプシン（Ｇｉ
ｂｃｏ ｐｒｏｄｕｃｔ ２５３００−０５４、Ｃａ⁺⁺、Ｍｇ⁺⁺を含まないＨＢ
ＳＳで１：１に希釈した）および１ｍｇ/ｍＬの３型コラゲナーゼ（Ｗｏｒｔｈ
ｉｎｇｔｏｎ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）中で、３７℃で４分間（分）インキュベ
ートすることによって分離させた。いくつかの試験において、神経を、１．２ｍ
ｇ／ｍＬのヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ｐｒｏｄｕｃｔ
Ｈ−３８８４）および２ｍｇ／ｍＬの３型コラゲナーゼ中で、３７℃で１０分
間インキュベートすることによって分離した。インキュベーション期間の後に、
消化を、２容量の染色培地：１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ（Ｇｉｂｃｏ ｐｒｏｄｕｃ
ｔ １１０１９−０２３）、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、ペニシリン
／ストレプトマイシン（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）および
２５Ｕｇ／ｍＬデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）１型（Ｓｉｇｍａ，Ｄ
−４５２７）を含むＬ１５培地を用いて停止した。遠心分離の後に、神経細胞を
トリチウム化し、そして染色培地中に再懸濁した。分離された細胞を、常に、染
色培地中で、時折、ＤＮａｓｅなしで維持した。

【００４６】 （坐骨神経細胞の培養）高いプレーティング効率を促進し、かつニューロン分
化、グリア分化および中外胚葉分化が生じ得る条件に到達するために、分離およ
び培養条件を最適化した。標準条件下で、クローン培養物を１４日間発達させ、
次いで固定し、そして免疫細胞化学マーカーで分析した。

【００４７】 坐骨神経前駆細胞を、代表的には、クローン密度（１４日間の培養については
３０クローン／ウェル未満、または１〜４日の培養については６０クローン／ウ
ェル）で６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋ）中で培養した。プレートを、５０：ｇ／ｍＬポリ−ｄ−リジン（ＰＤＬ）（
Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｔｏｕｇｈｔｏｎ ＭＡ
）水をプレート上にピペットして次いで、２分以内にピペットして吸い取ること
によって、ＰＤＬでコーティングした。乾燥後に、プレートを滅菌蒸留水（Ｂｉ
ｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）で洗浄し、そして再度乾燥させる。次いで、プレートを
、Ｄ−ＰＢＳ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）中に一晩溶解した０．１５ｍｇ／ｍ
Ｌのヒトフィブロネクチン（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
）でコーティングした。一連の試験を行い、培養培地の組成を最適化した。高い
プレーティング効率および良好なコロニー増殖を、以下の培地中でラット細胞で
一貫して得た：Ｓｔｅｍｐｌｅ＆Ａｎｄｅｒｓｏｎ，７１ Ｃｅｌｌ ９７３〜
９８５（１９９２）（また、Ａｎｄｅｒｓｏｎら、米国特許第５，５８９，３７
６号、同第５，８２４，４８９号、同第５，６５４，１８３号、同第５，６９３
，４８２号、同第５，６７２，４９９号および同第５，８４９，５５３号（全て
が参考として援用される）を参照のこと）によって記載される１５％ニワトリ胚
抽出物、２０ｎｇ／ｍＬ組換えヒトｂＦＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎ
ｎｅａｐｏｌｉｓ）、Ｎ２補充物（Ｇｉｂｃｏ),Ｂ２７補充物（Ｇｉｂｃｏ）、
５０：Ｍ２−メルカプトエタノール、３５ｍｇ／ｍＬ（１１０ｎＭ）レチノイン
酸（Ｓｉｇｍａ）、およびペニシリン／ストレプトマイシン（ＢｉｏＷｈｉｔｔ
ａｋｅｒ）を含む、ＤＭＥＭ−ｌｏｗ（Ｇｉｂｃｏ ｐｒｏｄｕｃｔ １１８８
５−０８５）。この培地の組成は、標準的な培地として記載される。標準的な条
件下では、細胞を、標準培地で６日間培養し、次いでコロニー組成物の免疫組織
化学分析前にさらに８日間分化をもたらす同様の培地（１％ニワトリ胚抽出物（
ＣＥＥ）および１０ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦを含む）に切り換えた。培養物を６〜
８％ＣＯ₂の加湿したインキュベーター中で維持した。

【００４８】 （免疫組織化学）ＢｒｄＵ染色に関して、細胞を、Ｒａｆｆら、３３３ Ｎａ
ｔｕｒｅ ５６２〜５６５（１９８８）に記載されるように固定化し、ＰＧＮ（
４％ヤギ血清、０．５％ＢＳＡ、０．１％ＮＰ−４０［Ｉｇｅｐａｌ、Ｓｉｇｍ
ａ］、０．０５％アジ化ナトリウムのＤ−ＰＢＳ）中で室温にて１５分間ブロッ
クし、次いでＰＧＮ中で１／１００希釈した抗ＢｒｄＵ抗体（ＩＵ−４、Ｃａｌ
ｔａｇ）で４５分間インキュベートした。ＰＧＮでの洗浄後に、細胞を、ウマ西
洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ
ＣＡ）に結合体化した抗マウスＩｇＧ抗体とともに２５分間インキュベートした
。ＨＲＰを検出する組織化学反応を、ジアミノベンジジンおよび硫酸ニッケルを
基質として使用して行った。ＢｒｄＵ染色は、常に、核であり、従って、ネガテ
ィブコントロール細胞では一次抗体または二次抗体からのバックグランドは存在
しなかった。

【００４９】 コロニーの細胞組成が評価されたほとんどの試験では、培養物を、酸エタノー
ル（１００％エタノール中の５％氷酢酸）で−２０℃にて２０分間固定化した。
プレートを、ＰＢＳでリンスして、続いてＰＧＮで２回リンスした。培養物を、
ＰＧＮ中で１５分間インキュベートすることによってブロックした。ペリフェリ
ンを、ＰＧＮ中１／１０００の抗ペリフェリン抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）で３０
分間インキュベートすることによって最初に染色した。ＰＧＮでの３回の洗浄後
に、ペリフェリン染色を、ＨＲＰ（Ｖｅｃｔｏｒ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ ＣＡ
）に結合体化した抗ウサギ抗体中でインキュベートして、続いてニッケル−ＤＡ
Ｂ染色によって発色させた。次いで、培養物を、室温にて４５分間、ＰＧＮ中１
／２００希釈の抗ＧＦＡＰ（Ｓｉｇｍａ，Ｇ−３８９３）および１／２００抗Ｓ
ＭＡ（Ｓｉｇｍａ，Ａ−２Ｓ４７）の混合物中でインキュベートした。洗浄後に
、培養物を、ＰＧＭ中１/２００希釈の抗マウスＩｇＧ₁−フィコエリトリン（ｐ
ｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）および抗マウスＩｇＧ_2a−ＦＩＴＣ（Ｓｏｕｔｈｅ
ｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）中で、室温にて２
５分間インキュベートした。洗浄後に、核を、時折、ＰＧＮ中の１０：ｇ／ｍＬ
ＤＡＰＩ中でインキュベートすることによって染色した。

【００５０】 培養物を、抗ＧＦＡＰまたは抗ＢｒｄＵを含まない抗体の組合せで染色したと
きに、この培養物を、一般的に、４％パラホルムアルデヒド中で室温で１０分間
固定化した。ＭＡＳＨ−１染色を、Ｓｈａｈら、７７ Ｃｅｌｌ ３４９〜３６
０（１９９４）により記載されるように行った。

【００５１】 （ＰＮＳ細胞の発生能についてのアッセイ）発生能をアッセイするために、培
養物に分化を誘導する増殖因子を添加することによって、細胞をチャレンジした
。ニューロン能についてアッセイするために、細胞を、５０ｎｇ／ｍＬ（１．６
ｎＭ）の組換えヒトＢＭＰ２（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を標準
的な培養物中に添加することによってチャレンジした。これは、ＮＣＳＣにおけ
るニューロン分化を指令することに関しての飽和用量である（Ｓｈａｈら、８５
Ｃｅｌｌ ３３１−３４３（１９９６）を参照のこと）。ＢＭＰ２によってチ
ャレンジされた細胞を、免疫組織化学的分析の前に、１〜４日間インキュベート
した。グリア能をアッセイするために、培養物を、５０ｎｇ／ｍＬ（１ｎＭ）の
組換えヒトＮＲＧ−１（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を
添加することによって、チャレンジした。これは、ＮＣＳＣにおいてグリア分化
を指令することに関するＮＲＧ−１の飽和用量である（Ｓｈａｈ＆Ａｎｄｅｒｓ
ｏｎ，９４ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １１３６９−１
１３７４（１９９７））。細胞を、分析の前に１４日間、ＮＲＧ−１の存在下で
培養した。

【００５２】 （結果）３つの細胞型が、これらの培養物中に存在する：（１）ニューロン；
（２）シュワン細胞、（３）および平滑筋様筋線維芽細胞。ニューロンを、ペリ
フェリンの発現によって同定した。グリア細胞を、ＧＦＡＰ、ｐ７５、および細
胞質Ｓ１００βの発現によって同定した。グリア細胞は、ペリフェリンまたはα
平滑筋アクチン（ＳＭＡ）を発現しなかった。

【００５３】 筋線維芽細胞を、ＳＭＡおよびカルポニンの同時発現によって同定した。類似
のＮＣＳＣ由来の細胞が、以前に平滑筋細胞としてＳｈａｈら、８５ Ｃｅｌｌ
３３１−３４３（１９９６）によって言及されたが、坐骨神経由来細胞は、平
滑筋マーカーデスミンまたはミオシン軽鎖キナーゼを発現しなかった。従って、
それらの全体的なマーカープロフィールは、Ｓａｐｐｉｎｏら、６３ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ １４４−１６１（１９９０）によ
って筋線維芽細胞として記載されている関連する細胞型と、より一致した。筋線
維芽細胞は、神経マーカーＧＦＡＰ、ペリフェリン、およびｐ７５を発現しなか
ったが、ビメンチンおよびＳ１００βを発現した。Ｓ１００βは、シュワン細胞
分化のマーカーとして使用されてきたが、本発明者らのグリアおよび筋線維芽細
胞の両方におけるＳ１００βの観察は、非神経細胞型（平滑筋細胞および筋上皮
細胞を含む）におけるその広汎な発現（Ｈａｉｍｏｔｏら、５７ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ４８９−４９８（１９８７））と一致
する。

【００５４】 ペリフェリン、ＧＦＡＰ、およびＳＭＡに対する抗体の三重標識により、本発
明者らは、異なる年齢からの坐骨神経のクローン培養物におけるコロニーの５つ
の型を同定した（表１）。

【００５５】

【表１】

【００５６】 実質的数のコロニーが、ニューロン、シュワン細胞、および筋線維芽細胞（Ｎ
＋Ｓ＋Ｍ）を含有していた。培養の１４日後（約１６〜１７の二倍化に対応する
）において、観察されコロニーの数が最も大きく、それらは、平均で１．０７±
０．３３×１０⁵細胞（平均±標準偏差）を有していた。これらの多能性前駆細
胞は、Ｅ１４．５でコロニーのほぼ１６％を表すが、それらの頻度は、発生の日
毎に有意に減少し、その結果、多能性前駆細胞は、Ｅ１７．５坐骨神経からの前
駆細胞の２％未満を表した（表１）。少数の試験において、いくつかの頻度コロ
ニーは、ニューロンおよびシュワン細胞（Ｎ＋Ｓ）のみを含有し、これらのＮ＋
Ｓコロニーは、非常に大きかった。

【００５７】 より頻度の高いものは、ニューロンを含有するが、シュワン細胞および筋線維
芽細胞（Ｓ＋Ｍ）を含有しないコロニーであった。これらは、Ｅ１４．５とＥ１
７．５との間の発達の段階にかかわらず、コロニーの１０％までを表す（表１）
。これらのＳ＋Ｍコロニーは、サイズが中程度であり、代表的には、数千の細胞
を含有する。

【００５８】 坐骨神経はまた、単一の細胞型のみを生じる前駆細胞を含有していた。予想通
り、統計学的な数のコロニーが、シュワン細胞のみを含有していた（Ｓのみ）。
ニューロンを含有するコロニー中のシュワン細胞は、常に、ＧＦＡＰを発現した
が、ニューロンを含有しないコロニーは、ときどき、検出可能なＧＦＡＰを発現
しなかったが、ＧＦＡＰ発現細胞から形態学的に区別不可能であり、そして常に
ｐ７５および細胞質Ｓ１００βを発現したが、ペリフェリンまたはＳＭＡを発現
しなかった。Ｓのみの前駆体の頻度は、Ｅ１４．５のコロニーの２０％からＥ１
７．５の全てのコロニーの４２％までの発達をともなって有意に増加した（表１
）。標準的な培養条件において、これらのコロニーは、代表的には、数百から数
千の細胞を含有していた。発達の全ての段階において、約５０％のコロニーが筋
線維芽細胞のみ（Ｍのみ）を含有していた。筋線維芽細胞のみのコロニーは、と
きどき、１０個より少ない細胞を含有していたが、その他の場合には、数百より
多い細胞を含有していた。

【００５９】 （実施例２） （坐骨神経多能性前駆細胞の培養中での自己複製） （インビトロ自己複製アッセイ）自己複製を、多能性前駆細胞をサブクローニ
ングすることによってインビトロでアッセイした。Ｅ１４．５坐骨神経由来の単
一のｐ７５⁺細胞を、ＦＡＣＳによって９６ウェルプレートの個々のウェルに選
別し、７〜１１日間標準的な培地中で再給餌なしに培養した。７日と１１日との
後に、そのウェルを試験し、そして多能性コロニーをそれらの外見によって同定
した。神経前駆細胞は、小さな細胞の密なコロニーを生じたが、筋線維芽細胞の
前駆細胞は、大きな平べったい筋線維芽細胞の分散したコロニーを生じた。多能
性前駆細胞は、他の神経前駆細胞から区別され得る。なぜなら、それらは、培養
の７日後においてさえ、ＳのみまたはＳ＋Ｍ前駆細胞よりも大きなコロニーを生
じるからである。コロニーは、培養培地を吸引し、そしてトリプシン−ＥＤＴＡ
溶液（Ｇｉｂｃｏ）をそのウェルに添加することによりサブクローン化された。
２分後および穏やかに粉砕した後、個々のウェルからの細胞を１５ｍＬのチュー
ブに移し、そこでそのトリプシンを、培地をニワトリ胚抽出物を添加して染色す
ることによってクエンチした。その細胞を遠心して落とし、染色培地中で再懸濁
し、クローン密度で複数の６ウェルプレートウェルに再びプレーティングし、そ
して標準的条件下で培養した。１４日後、二次コロニーの組成物を、免疫組織化
学的に分析した。

【００６０】 （結果）坐骨神経由来の多能性前駆細胞によって形成されたコロニーは、ＮＣ
ＳＣを移動することによって形成したものを連想させた（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、
米国特許第５，５８９，３７６号、同第５，８２４，４８９号、同第５，６５４
，１８３号、同第５，６９３，４８２号、同第５，６７２，４９９号、および同
第５，８４９，５５３号（全て参考として援用する）；ＳｔｅｍｐｌｅおよびＡ
ｎｄｅｒｓｏｎ、７１ Ｃｅｌｌ ９７３−９８５（１９９２）；Ｓｈａｈら、
７７ Ｃｅｌｌ ３４９−３６０（１９９４）；Ｓｈａｈら、８５ Ｃｅｌｌ
３３１−３４３（１９９６）を参照のこと）。サブクローニング試験における坐
骨神経多能性前駆細胞の自己複製能を、表２に示す。

【００６１】

【表２】

【００６２】 ２０の症例のうちの１８で、各多能性コロニーは、Ｓ＋Ｍサブクローンおよび
Ｓのみのサブクローンと同様に、多数の多能性（Ｎ＋Ｓ＋Ｍ）サブクローンを生
じた（表２）。大部分の場合において、多能性コロニーはまた、ＭのみおよびＮ
＋Ｓサブクローンを同様に生じた。平均して、各多能性創始細胞は、クローニン
グの日に関係なく１００より多くの二次的な多能性クローンを生じた。これは、
最小限６〜７の対称的な自己複製分裂に相当する。Ｅ１６．５坐骨神経からのク
ローン密度でプレーティングされた多能性コロニーもまた、クローニング輪（ｃ
ｌｏｎｉｎｇ ｒｉｎｇ）を有するコロニーを単離することによってサブクロー
ニングされた。これらのコロニーもまた、培養中で自己複製した。従って、多能
性前駆細胞は、培養中で自己複製するのみならず、胎児の坐骨神経において観察
されたすべての他のクラスの前駆細胞（Ｍのみの筋線維芽細胞の前駆細胞を含む
）を生じた。多能性前駆細胞由来の筋線維芽細胞のみの二次的なコロニー（表２
）は、新鮮に分離された坐骨神経細胞の培養物において観察されるコロニー（表
１）と表現型的に区別できなかった。

【００６３】 （分析）従って、単一のｐ７５⁺Ｐ₀ ^-細胞は、培養において示される自己複製
能を有する。

【００６４】 （実施例３） （フローサイトメトリーによる、機能的に区別できる坐骨神経前駆細胞の分離
） （序論）ラットＥ１４．５坐骨神経の細胞を、細胞表面抗原に対する抗体を使
用して、フローサイトメトリーによって分画した。坐骨神経から分離された細胞
を、それらのｐ７５（これは、低アフィニティーニューロトロフィンレセプター
であり、神経堤幹細胞（ＮＣＳＣ）のマーカーである（ＳｔｅｍｐｌｅおよびＡ
ｎｄｅｒｓｏｎ、７１ Ｃｅｌｌ ９７３−９８５（１９９２）））、およびＰ ₀ （グリア分化と関連する末梢ミエリンタンパク質）の発現における差違に基づ
いて、５つの別個の亜集団に分画した。驚くべきことに、Ｅ１４．５坐骨神経細
胞の１５％より多くが、インビトロでＮＣＳＣから機能的に区別できなかった。

【００６５】 単離された個々の細胞は、自己複製しそしてニューロン、グリア、および平滑
筋様筋線維芽細胞を含むクローンを生じた。これらの自己複製多能性細胞は、ｐ
７５⁺Ｐ₀ ^-サブフラクションにおいて高度に富化された。これらの自己複製する
多能性細胞は、ＮＣＳＣから区別できない様式で指令系統決定因子（例えば、Ｂ
ＭＰ２およびニューレグリン−１（ＮＲＧ−１、グリア増殖因子としてもまた公
知））に応答した（Ｓｈａｈら、７７ Ｃｅｌｌ ３４９−３６０（１９９４）
；Ｓｈａｈら、８５ Ｃｅｌｌ ３３１−３４３（１９９６）を参照のこと）。
従って、ｐ７５⁺Ｐ₀ ^-表面マーカー表現型は、Ｅ１４．５坐骨神経からの移動後
のそれぞれの同定および単離を可能にした。

【００６６】 （フローサイトメトリー手順）すべての選別および分析を、ＦＡＣＳＶａｎｔ
ａｇデュアルレーザーフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏ
ｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ）で行った。ＮＣＳＣを単離するために、Ｅ１４．５坐骨
神経細胞を、ｐ７５およびＰ₀に対する抗体を用いて染色した。分離された坐骨
神経細胞を、最初に、１／２０００希釈の、Ｐ₀に対するＰ０７モノクローナル
抗体（Ｊ．Ｊ．Ａｒｃｈｅｌｏｓ，Ｍｕｎｉｃｈ）中に懸濁した。より高濃度に
おいては、Ｐ０７は非特異的に結合する傾向があるが、この希釈においては、Ｐ
０７は、胎児肝臓および分離された終脳細胞を染色しなかった。すべての抗体の
インキュベーションは、氷上で２０〜２５分間行った。インキュベーション時間
の最後に、細胞を、１０〜４０容量の染色媒体中で希釈すること、４５０×ｇで
３分間遠心分離することによって細胞をペレット化すること、および次いで染色
媒体を吸引すること、によって洗浄した。Ｐ０７染色は、フィコエリトリンに結
合体化した抗マウスＩｇＧ₁二次抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ ＡＬ）中でインキュ
ベートすることによって発色させる。坐骨神経細胞、胎児肝臓細胞、または終脳
細胞ではこの二次抗体に由来するバックグラウンド染色は存在しなかった。洗浄
後、細胞を、フルオレセインと直接結合体化した１９２ ＩｇＧ抗体（ｐ７５に
対する）中に再懸濁した。０．１ｍｇ／ｍＬ マウスＩｇＧ１（Ｓｉｇｍａ）を
、１９２Ｉ ＩｇＧとともに含めて、細胞表面上の二次抗体に対する結合をブロ
ックした。洗浄後、細胞を２：ｍｇ／ｍＬ ７−アミノアクチノマイシンＤ（７
−ＭＤ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ）、生存可能色素、
を含む染色媒体中に再懸濁した。死滅した細胞を、前方および側方の散乱でゲー
トを開閉すること、ならびに７−ＭＤポジティブ事象を削除することによって除
外した。Ｃｌｏｎｅ−Ｃｙｔｅ機能を使用して、培養プレートの個々のウェルに
直接に既知の細胞数を入れることによって行った。プレーティングの効率を計算
するために、Ｃｌｏｎｅ−Ｃｙｔｅ選別計数の正確さは、ガラススライド上の細
胞を選別すること、および実際に選別された細胞の数を計数することによって、
定期的にチェックされた。選別の前および後に、組織培養プレートを、５％ＣＯ ₂ を満たした、シールされたプラスチックバッグ中に保って、空気と平衡するこ
とによって培養培地のｐＨが塩基性になるのを防いだ。

【００６７】 ＮＣＳＣの細胞周期分析を、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（Ｓｉｇｍａ）を用
いて染色してＤＮＡ含量を測定すること、およびピロニンＹ（Ｓｉｇｍａ）を用
いて染色してＲＮＡ含量を測定することによって行った。Ｅ１４．５坐骨神経か
ら少なくとも５５００のｐ７５⁺Ｐ₀ ^-細胞を染色培地中に選別し、次いで氷冷７
０％エタノール中にピペットで移す。その細胞を、４℃で一晩、エタノール中に
放置し、次いで、フローサイトメトリー再分析の前に、２０分間、１：ｇ／ｍＬ
のＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２および２：ｇ／ｍＬピロニンＹ中に再懸濁した。
少なくとも１５００のｐ７５⁺Ｐ₀ ^-細胞を、複製あたり再分析した。ＤＮＡ含量
およびＲＮＡ含量を分析するための機器パラメーターは、休止コントロール細胞
（成体ラット脾臓細胞）および活発に分裂しているコントロール細胞（ラット終
脳）に基づいて設定された。

【００６８】 （結果）図１は、ｐ７５およびＰ₀を用いて染色していないか、またはこれら
を用いて染色したかのいずれかでの、分離されたＥ１４．５坐骨神経細胞のプロ
ットを示す。表現型分析について、本発明者らは、以下の２つの異なる分離条件
を使用した：（１）ヒアルロニダーゼ＋コラゲナーゼ、これは、プロテアーゼ活
性を最小化し、従って、細胞表面マーカーの保持に有利である、または（２）ト
リプシン＋コラゲナーゼ、これは、細胞生存および高いプレーティング効率に有
利である。抗ｐ７５および抗Ｐ₀で二重標識したヒアルロニダーゼ＋コラゲナー
ゼ分離細胞を、染色していない細胞と比較することによって、それらの表現型的
に別個の４つの坐骨神経細胞の集団を、ｐ７５およびＰ₀の発現に従って規定し
た：（１）ｐ７５⁺Ｐ₀ ^-、（２）ｐ７５⁺Ｐ₀ ⁺、（３）ｐ７５^-/lowＰ₀ ⁺、および
（４）ｐ７５^-/lowＰ₀ ^-（図１Ａ、Ｂ）。予想されたように、大部分の（６５％
）Ｅ１４．５坐骨神経細胞はＰ₀を発現し、そして多くの（４７％）細胞は、ヒ
アルロニダーゼ＋コラゲナーゼ消化後にｐ７５を発現した。これらの抗体のいず
れもが、終脳または胎児肝臓のコントロール細胞でのＦＡＣＳによって試験され
た場合に、坐骨神経細胞を染色するために使用される濃度において、非特異的染
色を示さなかった。

【００６９】 不運にも、ヒアルロニダーゼ＋コラゲナーゼ分離細胞の相対的に低い割合が、
培養中にコロニーを形成し、このことは、これらの集団の発生の可能性を比較す
る本発明者らの能力を妨害する。しかし、短い（４分間）トリプシン＋コラゲナ
ーゼ処理によって分離された細胞は、効率的にコロニーを形成した；従って、す
べての機能的な分析を、このようなトリプシン＋コラゲナーゼ分離細胞で行った
。ＦＡＣＳプロットは、わずかなＰ₀エピトープの損失を示したが、この分離手
順によっては、ｐ７５エピトープの損失はなかった（図１Ｂと１Ｃを比較のこと
）。Ｐ₀染色のこの不明瞭さによって、本発明者らは、トリプシン＋コラゲナー
ゼ分離細胞を５つのサブセットに分けた（図１Ｃ）。ｐ７５⁺Ｐ₀ ^-細胞は坐骨神
経細胞の１２±２％を示し、ｐ７５⁺Ｐ₀ ^-細胞は坐骨神経細胞の１２±２％を示
し、ｐ７５⁺Ｐ₀ ^-/low細胞は坐骨神経細胞の１８±５％を示し、ｐ７５⁺Ｐ₀ ⁺細胞
は坐骨神経細胞の１１±７％を示し、ｐ７５^-/lowＰ₀ ^-細胞は坐骨神経細胞の２
０±９％を示し、そしてｐ７５^-/lowＰ₀ ^-/low細胞は坐骨神経細胞の３９±１０
％を示した。

【００７０】 トリプシン＋コラゲナーゼ分離坐骨神経由来の５集団のそれぞれを、標準的な
条件下で培養した。その集団は、表３に示すように、発生能の顕著な差違を示し
た。

【００７１】

【表３】

【００７２】 大部分のｐ７５⁺Ｐ₀ ^-細胞は、多能性コロニーを形成し（６０％）、類似の数
の細胞が、他のクラスのコロニーを生じた。ｐ７５⁺Ｐ₀ ^-細胞は、多能性コロニ
ー（５０％）とシュワンのみのコロニー（３７％）との混合物を生じた。これら
の画分の両方は、低い割合のＭのみのコロニー（＜１０％）を生じた。ｐ７５⁺
Ｐ₀ ^-集団は、多能性前駆細胞（２８％）、シュワンのみの前駆細胞（３４％）、
および筋線維芽細胞のみの前駆細胞（２２％）の混合物を含んだ。従って、Ｐ₀
を発現するものを含む全てのｐ７５⁺Ｐ₀ ^-集団は、有意な数の多能性前駆細胞を
含んだが、Ｐ₀発現が増加するにつれて形成されたコロニーがいかに減少したか
という細胞間の多能性前駆細胞の見かけの頻度を除く。両方のｐ７５流動集団（
Ｐ₀ ⁺およびＰ₀）は、純粋であったか、または筋線維芽細胞のみを生じる前駆細
胞のほぼ純粋な集団であった。

【００７３】 （ｐ７５⁺Ｐ₀ ^-Ｅ１４．５坐骨神経細胞はＮＣＳＣを富化される）ｐ７５⁺Ｐ₀ ^- 集団をＮＣＳＣに関して富化したが、これは純粋ではなかった。標準的な培養物
における細胞の６０％が、自己複製多能性コロニーを形成した。細胞の８０％よ
り多くが、ＢＭＰ２の存在下でニューロンを生成し得た。方向付けられたニュー
ロン前駆細胞は、坐骨神経の本研究または以前の研究において検出されず、そし
てＢＭＰ２の非存在下では、ニューロン前駆細胞活性は常に、多能性前駆細胞と
関連した（表１および３）；従って、ＢＭＰ２の存在下での結果は、標準的な条
件下で形成される非神経原性コロニー型のいくつかが、アッセイした時点でそれ
らのニューロン能を「読み出さ」なかったＮＣＳＣであったかもしれないことを
示唆する。従って、本発明者らの培養条件下でコロニーを形成したｐ７５⁺Ｐ₀ ^-
細胞の８０％までは、ＮＣＳＣであり得る。分画されなかった坐骨神経細胞の１
５〜１６％のみがＮＣＳＣとして挙動したので（表１）、ｐ７５⁺Ｐ₀ ^-画分は、
幹細胞に関して約４〜５倍富化される。

【００７４】 （実施例４） （ＢＭＰ２チャレンジにより決定されるニューロン能） ＢＭＰ２は、ＮＣＳＣに、ニューロンに分化するよう指令する。従って、１．
６ｎＭ ＢＭＰ２を、分離していない坐骨神経細胞またはフローサイトメトリー
により単離した各部分集合由来の細胞の、標準的な培養物に添加した。ＢＭＰ２
を用いて２４時間後に、いくらかの培養物を固定し、そしてＭＡＳＨ−１（自律
性神経発生の初期の転写因子マーカー）に関して染色した。ＢＭＰ２を用いて４
日後に、姉妹培養物を固定し、そしてペリフェリン（成熟ＰＮＳニューロンのマ
ーカー）に関して染色した。平均すると、分離されない坐骨神経細胞の１８〜２
０％は、ＭＡＳＨ−１またはペリフェリン発現のいずれかにより判断されるよう
に（表４）、ニューロン分化し得た。

【００７５】

【表４】

【００７６】 これらの結果は、分離されていない坐骨神経細胞の１６％が、標準的な培養物
にニューロンを含むコロニーを形成したという本発明者らの観察（表１）に一致
する。

【００７７】 ６０％の細胞が標準的な培養物において多能性前駆細胞を生じたｐ７５⁺Ｐ₀ ^-
集団（表３）において、これらの細胞の８０％より多くが、ＢＭＰ２の存在下で
ニューロンに分化した（表４）。従って、ＢＭＰ２の存在下では、より高い割合
の細胞が、神経原性能を示した。ｐ７５⁺Ｐ₀ ^-集団およびｐ７５⁺Ｐ₀ ⁺集団におい
て、有意であるがより少数の細胞（それぞれ６８％および５２％）が、ＢＭＰ２
の影響下でニューロンに分化した。このことは、これらの集団における多くの細
胞が多能性前駆細胞であり、ニューロン分化し得たという観察に一致する（表３
）。対照的に、両方のｐ７５集団（Ｐ₀ ⁺およびＰ₀ ^-）において、ＢＭＰ２によっ
てチャレンジされた場合でさえも、ほとんどの細胞がニューロン分化し得なかっ
た（表３および４）。このことは、これらの集団における大部分の細胞がニュー
ロン能を欠くことを実証し、そしてこれらの集団におけるほとんど全ての細胞が
筋線維芽細胞発生運命に関して制限される可能性に一致する。

【００７８】 ＢＭＰ２は、細胞の殺傷も、細胞の部分集団の生存の促進も、いずれも行わな
いようであった。なぜなら、いずれの場合においても、２４時間後または４日後
のいずれにおいても、ＢＭＰ２ありおよびなしの並列培養物を比較して、プレー
ティング効率に差異が存在しなかったからである。ＢＭＰ２の非存在下において
、ペリフェリン染色は、標準的な培養条件下で１３日目まで明らかではなかった
が、ＢＭＰ２の存在下では、ニューロン分化が４日以内に起こった。ＢＭＰ２の
非存在下において、ｐ７５⁺Ｐ₀ ^-コロニーの細胞のほんの少数のみが、ニューロ
ンであった。ＢＭＰ２の存在下では、大部分のｐ７５⁺Ｐ₀コロニーの全ての細胞
が、ニューロンであった。ＢＭＰ２はニューロン分化を加速し、そしてクローン
におけるニューロンの割合を劇的に増加させたが、細胞生存には影響を与えない
ようであったので、データは、ＢＭＰ２がニューロン能を有する細胞に対して有
益に作用したことを示唆する。

【００７９】 ＢＭＰ２が有益に作用していたことを確認するために、Ｅ１４．５坐骨神経由
来のｐ７５⁺Ｐ₀ ^-細胞を培養物に選別した。４時間後、この培養物を微視的に試
験し、そしてプレートに付着した生存細胞を、培養プレートの下側を円形にエッ
チングすることによって、マークした。細胞を円形にした後に、ＢＭＰ２をいく
つかの培養物に添加した。ＢＭＰ２の添加の２４時間後、培養物を固定し、そし
てＭＡＳＨ−１に関して染色した。ＢＭＰ２を含まない培養物において、平均８
８．９％の細胞が生存し、そしていずれの細胞もＭＡＳＨ−１を発現しなかった
（２つの試験において４５の創始細胞を研究した）。ＢＭＰ２細胞を添加した培
養物において、平均８７．５％の細胞が生存し、そしてこれらの細胞のうちの６
２．７％がＭＡＳＨ−１を発現した（２つの試験において４０の創始細胞を研究
した）。従って、ＢＭＰ２は、選択的には作用せず、坐骨神経多能性前駆細胞を
、ニューロン系列に分化するよう指令した。これは、Ｓｈａｈら、８５ Ｃｅｌ
ｌ ３３１−３４３（１９９６）により示されるように、Ｅ１０．５神経管体外
移植片から得られるＮＣＳＣに対するその効果に類似する。

【００８０】 （実施例５） （ＮＲＧ−１チャレンジにより決定されるグリア能） ＮＲＧ−１は、移動するＮＣＳＣがグリアに分化するように指令する。各集団
の培養物（Ｅ１４．５坐骨神経由来のＦＡＣＳによって単離される）を、１ｎＭ
のＮＲＧ−１を加えることによってチャレンジした。１４日後、培養物を固定し
、ペリフェリン、ＧＦＡＰ、およびＳＭＡについて染色した。結果を表５に示す
。

【００８１】

【表５】

【００８２】 標準条件下でのｐ７５⁺Ｐ₀ ^-細胞の培養物（表３）において見られたニューロ
ン分化と対照的に、ＮＲＧ−１の存在下では、ニューロン含有コロニーは観測さ
れず（表５、Ｎ＋Ｓ＋Ｍ）、そして９５％のコロニーがシュワン細胞のみを含ん
だ。実際、ニューロン分化は、分離されていない細胞とｐ７５⁺集団の両方の培
養物においてＮＲＧ−１の存在下で抑制されたが、一方、シュワン細胞のみを含
むコロニーの頻度が劇的に増加した（表１、３、および５におけるＳのみの値と
比較して−これらの表におけるデータが同じ試験の並んだ培養物において得られ
たことに注意すること）。プレーティング効率もまた、ＮＲＧ−１の存在下でｐ
７５⁺集団について有意に高かった（表３および５におけるプレーティング効率
と比較して）。このように、ＮＲＧ−１はまた、以前に報告された（Ｄｏｎｇら
、１９９５）ように、ニューロン前駆細胞の生存因子として作用した。プレーテ
ィング効率もｐ７５前駆細胞の分化も、ＮＲＧ−１チャレンジによって影響しな
かった。ｐ７５前駆細胞由来のコロニーの１００％が、ＮＲＧ−１の存在下でさ
え、筋線維芽細胞発現ＳＭＡのみを含んだ（表５）。このように、これらの筋線
維芽細胞前駆細胞は、グリア能もニューロン能も有しないようである。しかし、
ＮＲＧ−１は、ｐ７５前駆細胞から誘導されるコロニーの細胞の増殖を促進する
。

【００８３】 ＮＲＧ−１もまた指令的に作用し、Ｅ１４．５坐骨神経由来の多能性前駆細胞
によるグリア分化を促進したことを確かめるために、本発明者は、ＮＲＧ−１の
非存在下で、ｐ７５⁺Ｐ₀ ^-細胞をプレーティングした。プレーティング４時間後
、生きたｐ７５⁺Ｐ₀細胞を取り囲み、次いで、ＮＲＧ−１を培養物に加えた。１
４日後、培養物を固定し染色した。ＮＲＧ−１の存在下で、平均９５．２％のコ
ロニーが生き残り、これらの細胞の全てが、形態学、およびｐ７５またはＳ１０
０β染色（６０のコロニーを３つの試験で試験した）によって判断されるように
、グリア含有コロニーを生じた。このように、ＮＲＧ−１は、多能性前駆細胞を
殺傷することなくグリアの分化を促進し、これは、ＮＲＧ−１が指令的に作用し
たことを示す。この指令効果に加えて、上記プレーティング効率の増加は、ＮＲ
Ｇ−１がまたｐ７５⁺前駆細胞の生き残りを促進し得ることを示唆する。

【００８４】 前記のデータは、Ｅ１４．５坐骨神経の多能性前駆細胞が、Ｅ１０．５神経管
外植片から単離された移動するＮＣＳＣと、以下の基準で、表現型的にそして機
能的に識別不可能であったことを示唆した：（１）両方がｐ７５を発現する（Ｓ
ｔｅｍｐｌｅおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ、７１ Ｃｅｌｌ ９７３−９８５（１９
９２））；（２）両方が、ニューロン、グリア、およびＳＭＡ⁺筋線維芽細胞を
含む多能性コロニーを生成し、培養物中で自己複製する（Ｓｔｅｍｐｌｅおよび
Ａｎｄｅｒｓｏｎ、７１ Ｃｅｌｌ ９７３−９８５（１９９２））；Ｓｈａｈ
ら、８５ Ｃｅｌｌ ３３１−３４１（１９９６））；（３）両方が、２４時間
以内のＭＡＳＨ−１の発現および４日以内のペリフェリンの発現によって証明さ
れるように、ＢＭＰ２によって指令されてニューロンに分化する；そして（４）
両方が、ＮＲＧ−１によって指令されてグリアに分化する。移動するＮＣＳＣの
唯一の他の公開された機能的特徴は、ＴＧＦ−βが、それらをＳＭＡ⁺カルポニ
ン⁺細胞（Ｓｈａｒら、８５ Ｃｅｌｌ ３３１−３４３（１９９６）による平
滑筋細胞として記載された）に分化させることであるが、これは、筋線維芽細胞
として本明細書中に記載される細胞とは形態学的にそして抗原的に識別不可能で
ある。ＮＣＳＣは、神経管外植片から再プレートされ、Ｅ１４．５坐骨神経由来
のｐ７５⁺Ｐ₀ ^-細胞が、標準培養条件下でＴＧＦ−βチャレンジに対して識別不
能に応答した。明らかではない理由のために、本試験において、高い割合の細胞
が、ＴＧＦ−βにおいて、Ｓｈａｈら、８５ Ｃｅｌｌ ３３１−３４３（１９
９６）によって観測されたよりも、生き残らなかったが、生き残った細胞は、Ｓ
ＭＡ⁺筋線維芽細胞について富化し、ＴＧＦ−βについての指令の役割と一致し
た。このように、胎児坐骨神経において観測された多能性前駆細胞が、ＮＣＳＣ
である。

【００８５】 （実施例６） （Ｅ１４．５坐骨神経由来のｐ７５⁺Ｐ₀ ^-ＮＣＳＣは、インビボでの移植時に
ニューロンおよびグリアを生じる） （序論）新たに単離された坐骨神経ｐ７５⁺Ｐ₀ ^-細胞がインビボで多能性であ
るか否かを決定するため、およびそれらのニューロン能がインビトロでの脱分化
によって獲得されないことを確実にするために、本発明者は、ラット神経堤細胞
のニワトリ胚への移植のためのシステムを使用した。新鮮に分離された坐骨神経
由来のｐ７５⁺Ｐ₀細胞をＦＡＣＳによって単離し、そしてステージ１８ニワトリ
胚の前肢または仙骨レベルのいずれかで体節に注射した。このように、ドナー細
胞を、腹部神経堤経路に、宿主堤移動が十分起きた発達段階で配置した。

【００８６】 （坐骨神経前駆細胞のインビボ移植）受精した白色レグホンの卵をＨａｍｂｕ
ｒｇｅｒおよびＨａｍｉｌｔｏｎステージ１８にインキュベーションした。Ｅ１
４．５坐骨神経由来の２０，０００〜９０，０００のｐ７５⁺Ｐ₀ ^-細胞をＦＡＣ
Ｓによって単離し、引張られた（ｄｒａｗｎ）ガラスキャピラリーチューブに加
え、４℃で３０分間、先端に向かって重力によって沈澱させた。注射プロセスを
、Ｂｒｏｎｎｅｒ−Ｆｒａｓｅｒら、７７ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ １３０−１４１（１９８０）によって記載されるように実施した。
カルシウムおよびマグネシウムを含まないＴｙｒｏｄｅ塩溶液中の１０％Ｉｎｄ
ｉａインクの少量ボーラスを胞胚葉下で注射し、胚を視覚化した。細胞を、ＭＭ
３３マイクロマニピュレーター（Ｆｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｏｏｌｓ）およ
び非常に穏やかな空気圧を使用して、各胚の１つまたは２つの体腔の前方、中間
端に注射した。多くの胚を各細胞調製物とともに注射した。ラット神経堤増殖物
を用いてなされた類似のコントロール試験において、多くの注射された胚をすぐ
に固定し、そして注射された細胞の数をカウントした。改変体がこの方法におい
て固有であるが、２００〜６００の細胞が、胚内で局在化して、一貫して観測さ
れた。注射された胚をさらに３日間、ステージ２９までインキュベーションした
。胚を、新鮮な氷冷４％パラホルムアルデヒド（リン酸緩衝液中）に少なくとも
１６時間浸すことによって固定し、１５％ショ糖に沈め、ＯＣＴに埋め込み、そ
して−８０℃で凍結保存した。選択された部分または胚の１５μｍの区分を切断
した。正常なラットおよびニワトリの胚をインサイチュハイブリダイゼーション
のためにポジティブおよびネガティブコントロールとして並行処理した。

【００８７】 （インサイチュハイブリダイゼーション手順）注射３日後に、ニワトリ胚を収
穫し、切り出し、そしてニューロンおよびグリアのマーカーに対するラットおよ
びニワトリ特異的プローブとのインサイチュハイブリダイゼーションによって染
色した。本発明者は、３日のインキュベーションが、ラットドナー細胞が正常な
堤位置に移動し、そして分化のプロセスを開始するのに十分であることを決定し
た。

【００８８】 ラット特異的遺伝子に対するアンチセンスプローブを、ジゴキシゲニン結合ヌ
クレオチドを用いて合成し、そしてニワトリ特異的遺伝子に対するアンチセンス
プローブを、フルオレセイン結合ヌクレオチドを用いて合成した。詳細なプロト
コールは、必要に応じて利用可能である。簡単には、断片を、予め固定し、プロ
テイナーゼＫで消化し、そしてアセチル化する。次いで、このサンプルを、６５
℃で１〜３時間プレハイブリダイズし、そして６５℃で一晩１ｍｇ／ｍｌのプロ
ーブでハイブリダイズした。０．２×ＳＳＣを用いた３回の高ストリンジェンシ
ー洗浄を、６５℃で実施した。ブロック化を室温で１時間、２０％のヒツジ血清
を用いて実施し、そしてスライドを、ブロッキング溶液中の予め吸着させたアル
カリホスファターゼ結合抗ジゴキシゲニン抗体を用いて室温で１時間インキュベ
ートした。スライドを、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）および５−ブロ
モ−４−クロロ−３インドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）を用いて展開した。Ｎ
ＢＴ／ＢＣＩ Ｐで展開後、このジゴシゲニン結合アルカリホスファターゼを、
８５℃まで加熱することによりインキュベートし；このスライドを、アルカリホ
スファターゼ結合抗フルオレセイン抗体中で不活化し、そして２−［４−ヨード
フェニル］−３−［４−ニトロフェニル］−５−フェニルテトラゾリウムクロリ
ド（ＩＮＴ）およびＢＣＩＰで展開し、これにより橙色の生成物を得る。この組
合せにより、移植片を宿主と正確に識別した。なぜならば、ニワトリのプローブ
は、ネガティブコントロールのニワトリの胚および注入された胚のＣＮＳモータ
ーニューロンプールにおいて、ラットのプローブとの交差ハイブリダイゼーショ
ンを効果的に妨げるからである。ラットの細胞のみが、各胚の一方の側に注入さ
れるので、同じ胚の反対側は、染色特異性のさらなる内部コントロールとして役
立つ。

【００８９】 （移植結果） Ｅ１４．５ｐ７５⁺Ｐ₀ ^-ドナー細胞が効率的に移植され、そし
て多様なＰＮＳ位置にニューロンおよびグリアを生じさせる。２つの試験で、こ
のような細胞を全部で２２のニワトリの胚に注入した。ラットの細胞の移植を、
１８の前肢に注入したニワトリの胚中１６でおよび４の仙骨に注入したニワトリ
の胚中４で実施し、全部で２０のキメラを得た。ドナーに誘導されたニューロン
（ラット特異的プローブ（ニューロンマーカーＳＣＧ１０）でインサイチュハイ
ブリダイゼーションすることで同定）を、ニワトリ特異的ＳＣＧ１０プローブ（
橙色染色）で宿主ニューロンカウンター染色される近い関係の、４キメラの交感
神経節（３つの前肢および１つの仙骨注入）で検出した。交感神経節で移植され
たラットの細胞はまた、Ｐｈｏｘ２ｂを発現する。このＰｈｏｘ２ｂは、交感神
経節に適切な自律神経の分化のマーカーである。仙骨レベルで注入されたニワト
リの中で、ラットのニューロンは、以前にＲｅｍａｋ神経節（トリの腸管神経シ
ステムの成分）で検出された。

【００９０】 ニューロンの移植に加えて、Ｐ₀およびＮＲＧ−１レセプターｅｒｂＢ３を発
現する細胞が、全キメラの末梢神経において検出され、しばしば数百を数える。
これらの細胞は、隣接断片でＳＣＧ１０を発現しなかった。

【００９１】 （分析） 従って、いくつかの移植したラット細胞は、シュワン細胞（ニュー
ロンではない）を形成することによって末梢神経で適切に分化した。総合すると
、これらの結果は、培養増殖の任意の干渉期間なしでフローサイトメトリーでの
単離の後、直接移植した場合、坐骨神経ｐ７５⁺Ｐ₀ ^-細胞が、インビボにおいて
ニューロンおよびグリアを生じ得ることを実証する。

【００９２】 （実施例７） （坐骨神経での自己複製によるＮＣＳＣ残存） （序論） 胎児坐骨神経中のＮＣＳＣの残存は、神経堤からの移動の前に有糸
分裂休止状態における生存に影響を与え得る。あるいは、細胞は、自己複製分裂
を受けることによって残存し得る。

【００９３】 これらの可能性を識別するために、本発明者は、第１にＥ１４．５坐骨神経か
らのｐ７５⁺Ｐ₀ ^-細胞の細胞周期状態を試験した。ｐ７５⁺Ｐ₀ ^-細胞をＦＡＣＳに
よって単離し、次いでＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２およびピロニンＹで染色し、
そしてＦＡＣＳによって再分析し、それらのＤＮＡおよびＲＮＡ含量を決定した
。このアプローチを使用して、細胞を、細胞周期のＧ₀、Ｇ₁、またはＳ／Ｇ₂／
Ｍフェーズに当てはめ得る。分画されていないＥ１４．５坐骨神経細胞（図２Ｃ
，２Ｄ）およびｐ７５⁺Ｐ₀ ^-細胞（図２Ｅ，２Ｆ）の両方は、Ｓ／Ｇ₂／Ｍ中の多
くの細胞およびＧ₁中の少しの細胞または細胞なしで迅速な周期集団であると思
われる。分画されていない坐骨神経細胞の約１０％は、Ｓ／Ｇ₂／Ｍであり、一
方、同じ神経のｐ７５⁺Ｐ₀ ^-細胞の約１５％が、Ｓ／Ｇ₂／Ｍ中である。

【００９４】 ほとんどのＮＣＳＣが、インビボで自己複製するかどうかを直接アッセイする
ために、妊娠中のラットに、チミジンアナログＢｒｄＵを、Ｅ１４．５（すなわ
ち、Ｅ１３．７５）の胎児坐骨神経の収穫１８時間前に投与した。

【００９５】 （自己複製アッセイ） 自己複製を、パップ（ｐｕｐ）のＥ１４．５から坐骨
神経を収集する１８時間前に、妊娠中のラットに５’−ブロモ−２’−デオキシ
ウリジン（ＢｒｄＵ，Ｓｉｇｍａ）を投与することによってインビボでアッセイ
した。５０ｐｇ／ｇ（体重）に等価なＢｒｄＵ用量を、０．００７ＭのＮａＯＨ
を含む１ｍＬのＤ−ＰＢＳに溶解し、そして腹腔内に注射して、１８時間、１６
時間、１４時間、４時間、および２時間で収穫した。さらに、１４時間で収穫し
、ラットの正常な水を、２ｍｇ／ｍＬのＢｒｄＵを含む水によって置換した。坐
骨神経を解剖した後、この細胞を上記のように染色し、そしてｐ７５⁺Ｐ₀ ^-細胞
を培養中に保存した。標準的な培養条件下で３〜４時間洗浄した培養に細胞を接
着させた後に、この細胞を、ＢｒｄＵに対する抗体で染色した。

【００９６】 （結果） 分画されていない坐骨細胞およびＦＡＣＳによって単離されたｐ７
５⁺Ｐ₀ ^-細胞を、プレーティングし、固定し、そしてＢｒｄＵの取り込みのため
に染色した。８０％の坐骨細胞およびｐ７５⁺Ｐ０^-細胞のほぼ９０％を、インビ
ボで１８時間パルスをかけてＢｒｄＵを取り込ませた（表６）。

【００９７】

【表６】

【００９８】 本発明者は、ＢｒｄＵ投与により、坐骨神経内の正常の展開を崩壊させない数
種の方法を確認した。ＢｒｄＵからの未分化の坐骨神経細胞を投与し、そして正
常のラットは、ＦＡＣＳプロフィールおよびｐ７５およびＰ₀の発現の期間、識
別不可能であった。正常の坐骨神経由来の未分化細胞およびｐ７５⁺Ｐ₀ ^-細胞（
図２Ｄ、２Ｆ）ならびにＢｒｄＵを投与されたラット（図２Ｅ）はまた、細胞周
期状態の期間とは異なった。ＢｒｄＵ投与されたラット由来の未分化細胞は、２
４時間のＢＭＰ２の負荷試験後にＭＡＳＨ−１を発現した細胞の数、または２週
間の培養後に形成されたＮ＋Ｓ＋Ｍコロニーの数という観点で、正常のラットと
は有意には異ならなかった。

【００９９】 （分析） 胎児ＣＮＳおよび網膜中での発現を標識する早期レトロウイルス直
系により、ニューロンおよびグリアを含むクローン内での増殖ついての証拠を提
供した。しかし、幹細胞と方向付けられた前駆細胞とを識別するためのマーカー
の欠如は、このような増殖が、多能性前駆細胞の自己複製または拘束された前駆
細胞の拡大を反映したか否かを試験することを不可能としていた。特にレトロウ
イルス標識が展開能力を示さず、従って、最終的に血清細胞を同定し得ないこと
に注目すべきである（Ｔｕｎｅｒら、４ Ｎｅｕｒｏｎ ８３３−８４５（１９
９０））。

【０１００】 Ｅ１４．５〜Ｅ１７．５坐骨神経において本発明者らが同定したＮＣＳＣは、
数日前に神経堤を移動した神経堤細胞に由来する。これらの多能性細胞の残存は
、神経におけるそれらの自己複製を反映し得る。あるいは、これらの細胞は、イ
ンビボで休止状態で残存し得、それからこれらの細胞は、インビトロでの培養に
際して細胞周期に再び入るように誘導され得る。９０％のｐ７５⁺Ｐ₀ ^-細胞を、
Ｅ１３．７５からＥ１４．５に投与されたＢｒｄＵの１８時間（ｈｒ）パルスに
よって、インビボで標識化した。したがって、これらの細胞は、Ｅ１４．５での
単離の前に、活性な分裂を受けていた。さらに、これらは、神経管からの移動の
前ではなく、神経へのそれらの到着の後にＢｒｄＵを取り込んだに相違ない。な
ぜなら、ラットにおける腹側外側経路に沿った体幹神経堤細胞の移動は、Ｅ１１
．５〜Ｅ１２．０までわたるようであるからである。ニワトリにおける脊柱脊髄
（ｄｏｒｓａｌ ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ）からの後期移動（ｌａｔｅ−ｅｍｉ
ｇｒａｔｉｎｇ）細胞は、脊髄神経節においてニューロンおよび衛星細胞に分化
するが、個々の細胞が多能性であること、またはそれが末梢神経に寄与したこと
の証拠は見られなかった。従って、Ｅ１３．７５でのＢｒｄＵ投与の時点までに
、神経堤由来の細胞は、数日間、末梢神経において既に残存していたようである
。インビボでＢｒｄＵを取り込んだ細胞は、その後に単離された場合に、ニュー
ロン、シュワン細胞および筋線維芽細胞を生成するその能力を保持していた；さ
らに、これらの細胞は、Ｅ１０．５神経管の２４ｈｒ外植片から単離されたＮＣ
ＳＣと機能的に同一であった。

【０１０１】 したがって、これらの細胞がインビボで受けた分裂は、自己複製であったに相
違ない。

【０１０２】 これらのデータは、ｐ７５⁺Ｐ₀ ^-細胞が急速に分裂したことを実証するにおい
て、細胞周期分析と一致する。本発明者らは、このような細胞の８６％がＢＭＰ
２チャレンジの２４時間後にＭＡＳＨ−１を発現していたこと、そして標準的な
培養条件において、このような細胞によって形成された平均５０％のコロニーが
ニューロン、シュワン細胞、および筋線維芽細胞を含んでいたこと（Ｎ＋Ｓ＋Ｍ
）を観察することによって、ＢｒｄＵ投与されたラット由来のｐ７５⁺Ｐ₀ ^-集団
がＮＣＳＣについて富化されたまま持続したことを確認した。９０％のｐ７５⁺
Ｐ₀ ^-細胞がＢｒｄＵ⁺であったので、これらのデータにより、単離後に多系統分
化活性を保持していた大半または全ての細胞が、インビボで予めＢｒｄＵを取り
込んでいたことが示される。これらのデータにより、ＮＣＳＣがインビボで自己
複製分裂を受けることが示される。

【０１０３】 ｐ７５⁺Ｐ₀ ^-集団内のＮＣＳＣの頻度は、むしろ過小評価され得る。なぜなら
、ＮＣＳＣは、ｐ７５⁺Ｐ₀ ^-集団においてまた観察された制限された前駆細胞よ
りも低い効率でコロニーを形成し得るからである。ｐ７５⁺Ｐ₀ ^-集団は、わずか
に６０〜８０％の純度であり得るが、この純度のレベルは、ＢｒｄＵ標識化によ
って自己複製を実証するに十分な量よりも多かった。なぜなら、ほぼ９０％のｐ
７５⁺Ｐ₀ ^-がＢｒｄＵを取り込んだからである（表６）。さらに、この９０％の
ＢｒｄＵ細胞の算出は、標準的培養条件下でプレーティングされた細胞に基づく
。したがって、標準的培養において生存し得ない細胞は、ＢｒｄＵ分析を歪め得
ることは特に可能性が低い。

【０１０４】 本発明の１つ以上の実施形態の詳細が上記に付随して示されるが、本明細書中
に記載されるものと類似または等価な任意の方法および材料が、本発明の実施ま
たは試験において使用され得、好ましい方法および材料が記載されている。本発
明の他の特徴、目的、および利点が、この記載および特許請求の範囲から明らか
である。明細書および添付の特許請求の範囲では、その内容が明らかに他を示さ
ない限り、単一の形態が複数の参照を含む。他に規定されない限り、本明細書中
に使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者
によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中において引用される
すべての特許および刊行物を参考として援用する。

【０１０５】 前述の記載は、例示の目的のためのみに提示され、そして開示される厳密な形
態に本発明を制限することを意図せず、ここに添付された特許請求の範囲によっ
て制限されることが意図される。

【図面の簡単な説明】

【図１】 Ｅ１４．５ラット坐骨神経細胞の一連の蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）プロ
フィールである。坐骨神経をトリプシンおよびコラゲナーゼ（図１Ａおよび１Ｃ
）、またはヒアルロニダーゼおよびコラゲナーゼ（図１Ｂ）のいずれかで処理す
ることにより分離した。細胞は染色されていない（図１Ａ）か、またはｐ７５お
よびＰ₀に対する抗体で染色されている（図１Ｂ、１Ｃ）かのいずれかである。
使用した濃度では、いずれの抗体も、終脳または胎仔肝臓細胞についてＦＡＣＳ
により試験した場合、非特異的染色を示さなかった。表現型で規定した細胞サブ
セットを図１Ｂおよび１Ｃに示す。

【図２】 ＦＡＣＳによる、分離されていないｐ７５⁺Ｐ₀ ^-坐骨神経細胞の細胞周期分析
の結果である。各細胞の集団を、ＤＮＡ含量を示すためにＨｏｅｃｈｓｔ３３３
４０で、そしてＲＮＡ含量を示すためにピロニンＹで染色した。各パネルにおい
て、左下の象現は細胞周期のＧ₀期の細胞（２ｎ ＤＮＡ、低ＲＡＮ含量）を含
み、左上の象現はＧ₁期の細胞（２ｎ ＤＮＡ、より高いＲＮＡ含量）を含み、
そして右上の象現はＳ期，Ｇ₂期、およびＭ期の細胞（＞２ｎ ＤＮＡ、高ＲＮ
Ａ含量）を含む。Ｓ／Ｇ₂／Ｍ期の生存細胞の割合が示されている。図２Ａは成
体ラット脾臓細胞（休止コントロール）を示す。図２ＢはＥ１４．５ラット終脳
細胞（急速に細胞周期を進行しつつあるコントロール集団）を示す。図２Ｃおよ
び２Ｄは、２匹の異なるラットからの分離されていないＥ１４．５ラット坐骨神
経細胞を示す。図２Ｅおよび２Ｆは、同じ２匹のラットからのｐ７５⁺Ｐ₀ ^-坐骨
神経細胞を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 モリソン， シーン アメリカ合衆国 カリフォルニア 91106， パサデナ， アーデン ロード 1196 Ｆターム(参考） 4B065 AA90X AA93X BA25 BB23 BB32 BB34 BD14 BD45 CA44

Claims (35)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 神経幹細胞について無培養細胞の集団を富化する方法であっ
   て、以下： （ａ）インタクトな組織を分離することによって、神経幹細胞を含む無培養細
   胞の集団を得る工程、 （ｂ）該集団と試薬の組合せとを接触させる工程であって、ここで該組合せに
   おける各試薬は、神経幹細胞ポジティブマーカーまたは神経幹細胞ネガティブマ
   ーカーのいずれかに対して選択的に結合する、工程；および （ｃ）ポジティブマーカーに選択的に結合する試薬に結合する細胞、もしくは
   ネガティブマーカーに選択的に結合する試薬に結合しない細胞、またはその組合
   せを選択する工程であって、ここで該選択された細胞が、前記無培養細胞の集団
   と比較して神経幹細胞において少なくとも５０％まで富化される、工程、 を包含する、方法。
2. 【請求項２】 前記神経幹細胞が、神経堤幹細胞（ＮＣＳＣ）である、請求
   項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 前記神経幹細胞が、中枢神経系（ＣＮＳ）神経幹細胞である
   、請求項１に記載の方法。
4. 【請求項４】 前記選択された細胞が、少なくとも５０％が神経幹細胞であ
   る、請求項１に記載の方法。
5. 【請求項５】 工程（ｂ）における前記試薬が抗体である、請求項１に記載
   の方法。
6. 【請求項６】 ポジティブマーカーに選択的に結合する前記試薬が、抗ｐ７
   ５（低アフィニティーニューロトロフィンレセプター）抗体である、請求項１に
   記載の方法。
7. 【請求項７】 ネガティブマーカーに選択的に結合する前記試薬が、抗Ｐ₀
   抗体である、請求項１に記載の方法。
8. 【請求項８】 前記無培養細胞の集団が神経堤から得られる、請求項１に記
   載の方法。
9. 【請求項９】 前記無培養細胞の集団が、分離された神経組織である、請求
   項１に記載の方法。
10. 【請求項１０】 前記無培養細胞の集団が、分離された末梢神経である、請
    求項１に記載の方法。
11. 【請求項１１】 前記選択する工程がフローサイトメトリーによる、請求項
    １に記載の方法。
12. 【請求項１２】 以下： （ｄ）前記選択された細胞を宿主に移植する工程 をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
13. 【請求項１３】 神経幹細胞について無培養細胞の集団を富化する方法であ
    って、以下： （ａ）神経幹細胞の画分を含む細胞の集団とｐ７５（低アフィニティーニュー
    ロトロフィンレセプター）に特異的に結合する試薬とを接触させる工程；および （ｂ）ｐ７５⁺細胞を選択する工程であって、ここで該選択されたｐ７５⁺細胞
    が、選択されていない細胞の集団と比較して、少なくとも５０％が神経幹細胞で
    あるように富化される、工程、 を包含する、方法。
14. 【請求項１４】 以下： （ｃ）前記選択されたｐ７５⁺細胞とＰ₀抗原に特異的に結合する試薬とを接触
    させる工程；および （ｄ）Ｐ₀ ^-細胞を選択する工程であって、ここで該選択されたｐ７５⁺Ｐ₀ ^-細
    胞は、神経細胞の集団と比較して、神経幹細胞の画分において富化される、工程
    、 をさらに包含する、請求項１３に記載の方法。
15. 【請求項１５】 神経幹細胞を単離する方法であって、以下： （ａ）神経幹細胞を含む無培養細胞の集団と試薬の組合せとを接触させる工程
    であって、ここで該組合せにおける各試薬は、神経幹細胞ポジティブマーカーま
    たは神経幹細胞ネガティブマーカーのいずれかに対して選択的に結合する、工程
    ； （ｂ）ポジティブマーカーに選択的に結合する試薬に結合する細胞、もしくは
    ネガティブマーカーに選択的に結合する試薬に結合しない細胞、またはその組合
    せを選択する工程； （ｃ）少なくとも１つの選択された細胞を、神経幹細胞の増殖を支持する培養
    培地に導入する工程；および （ｄ）該培養培地において該選択された細胞を増殖させる工程であって、ここ
    で増殖した子孫細胞は、単離された神経幹細胞から得られる、工程、 を包含する、方法。
16. 【請求項１６】 神経幹細胞の増殖を支持する前記培養培地が、ニワトリ胚
    抽出物を含む無血清培地を含む、請求項１５に記載の方法。
17. 【請求項１７】 以下： （ｅ）ニューロン、グリア、筋線維芽細胞およびそれらの組合せからなる群か
    ら選択される分化した細胞を含む細胞培養物を生成するために、前記増殖した子
    孫細胞を分化させる工程、 をさらに包含する、請求項１５に記載の方法。
18. 【請求項１８】 以下： （ｅ）前記増殖した子孫細胞を宿主に移植する工程 をさらに包含する、請求項１５に記載の方法。
19. 【請求項１９】 以下： （ｅ）前記増殖した子孫細胞と生物学的因子とを接触させる工程；および （ｆ）該増殖した子孫細胞に対する該生物学的因子の効果を決定する工程、 をさらに包含する、請求項１５に記載の方法。
20. 【請求項２０】 以下： （ｅ）前記増殖した子孫細胞を、生物学的因子を含む第２培養培地において分
    化するように誘導する工程；および （ｆ）該分化した細胞に対する該生物学的因子の効果を決定する工程、 をさらに包含する、請求項１５に記載の方法。
21. 【請求項２１】 以下： （ｅ）前記増殖した子孫細胞を、生物学的因子を含む第２培養において分化す
    るように誘導する工程； （ｆ）該分化した細胞と該生物学的因子とを接触させる工程；および （ｇ）分化した前記神経細胞に対する該生物学的因子の効果を決定する工程、 をさらに包含する、請求項１５に記載の方法。
22. 【請求項２２】 インビトロ細胞培養組成物であって、以下： （ａ）請求項１に記載の方法に従って神経幹細胞を富化した無培養細胞の集団
    ；および （ｂ）神経幹細胞の増殖を支持する培養培地 を含む、インビトロ細胞培養組成物。
23. 【請求項２３】 前記無培養細胞の集団が分離された神経に由来する、請求
    項２２に記載の組成物。
24. 【請求項２４】 前記無培養細胞の集団が一次末梢神経系組織に由来する、
    請求項２２に記載の組成物。
25. 【請求項２５】 前記無培養細胞の集団が一次中枢神経系組織に由来する、
    請求項２２に記載の組成物。
26. 【請求項２６】 前記無培養細胞の集団が抗ｐ７５（低アフィニティーニュ
    ーロトロフィンレセプター）抗体を使用する免疫選択によって誘導される、請求
    項２２に記載の組成物。
27. 【請求項２７】 前記無培養細胞の集団が抗Ｐ₀抗体を使用する免疫選択に
    よって誘導される、請求項２２に記載の組成物。
28. 【請求項２８】 前記無培養細胞の集団が少なくとも８０％のｐ７５⁺細胞
    を有する、請求項２２に記載の組成物。
29. 【請求項２９】 前記神経幹細胞がラット由来である、請求項２２に記載の
    組成物。
30. 【請求項３０】 前記神経幹細胞がニワトリ由来である、請求項２２に記載
    の組成物。
31. 【請求項３１】 前記神経幹細胞がヒト由来である、請求項２２に記載の組
    成物。
32. 【請求項３２】 前記培養培地がニワトリ胚抽出物を含む無血清培地を含む
    、請求項２２に記載の組成物。
33. 【請求項３３】 前記培養培地が指令因子を含む、請求項２２に記載の組成
    物。
34. 【請求項３４】 前記指令因子がＴＧＦ−βスーパーファミリーの増殖因子
    である、請求項３３に記載の組成物。
35. 【請求項３５】 前記指令因子がニューレグリン（ＮＲＧ−１）である、請
    求項３３に記載の組成物。