JP2014511139A

JP2014511139A - 新規心筋細胞マーカー

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Publication number: JP2014511139A
Application number: JP2013544921A
Authority: JP
Inventors: 潤山下; 英毅魚崎
Original assignee: Kyoto University
Current assignee: Kyoto University
Priority date: 2011-03-31
Filing date: 2012-04-02
Publication date: 2014-05-12
Anticipated expiration: 2032-04-02
Also published as: US9164093B2; EP2691513A4; US20140057287A1; JP6025067B2; WO2012133954A1; EP2691513A1

Abstract

本発明は、心筋細胞および／または心筋前駆細胞を含有する細胞集団よりVCAM1が陽性であることを指標として心筋細胞および／または心筋前駆細胞を抽出する工程を含む、心筋細胞および／または心筋前駆細胞の製造方法または検出方法を提供する。

Description

本発明は新規心筋細胞マーカーならびにそれを利用した心筋細胞および／または心筋前駆細胞の製造方法、筋細胞および／または心筋前駆細胞の抽出方法、および筋細胞および／または心筋前駆細胞の抽出または検出用キットに関する。

心筋細胞は出生と同時にその分裂能を喪失し、再生が困難である。したがって、近年、心筋梗塞、心筋炎または老化等を原因とする傷害心組織に対して、胚性幹細胞（ES細胞）や人工多能性幹細胞（iPS細胞）など多能性を有する細胞（特許文献１）を分化誘導して得られる心筋細胞を移植する補充療法に興味が注がれている。これら多能性幹細胞からの心筋細胞への分化誘導法は多数報告されているが（特許文献２、特許文献３および非特許文献１）、移植用細胞として用いるためにはソーティング等により心筋細胞の純度を高める必要がある。現在、心筋細胞もしくは心筋前駆細胞に対する表面マーカーとして、CD166(ALCM)（非特許文献２）やN-カドヘリン（特許文献４または非特許文献３）などが報告されているが、心筋細胞の純度を高めるためにはさらに多くのマーカーの探索が必要であると考えられる。

WO/2007/069666 WO2007/002136 WO2009/118928 特開2010-158206

Yan P, et al, Biochem Biophys Res Commun. 379:115-20 (2009) Rust W, et al, Regen Med. 4, 225-37 (2009) Honda M, et al, Biochem Biophys Res Commun. 29, 351, 877-82 (2006)

本発明の目的は、心筋細胞および／または心筋前駆細胞を含有する細胞集団より該心筋細胞および／または該心筋前駆細胞を抽出することである。したがって、本発明の課題は、心筋細胞および／または心筋前駆細胞に特異的なマーカーを提供することである。

本発明者らは、上記の課題を解決すべく、細胞表面膜タンパク質であるVCAM1に着目し、多能性幹細胞より分化誘導した心筋細胞および／または心筋前駆細胞を含む細胞集団よりVCAM1が陽性であることを指標として用いることで、心筋細胞および／または心筋前駆細胞を得られることを確認した。さらに、PDGFRβまたはN-カドヘリンが陽性であることを指標として用いることで、より高率で心筋細胞および／または心筋前駆細胞を抽出できることを確認した。
以上の結果から、本発明者らは、心筋細胞および／または心筋前駆細胞を単離精製することに成功し、本発明を完成するに至った。

本発明の一態様は、心筋細胞および／または心筋前駆細胞を含有する細胞集団よりVCAM1が陽性であることを指標として心筋細胞および／または心筋前駆細胞を抽出する工程を含む、心筋細胞および／または心筋前駆細胞の製造方法を提供することである。
本発明の他の態様は、PDGFRβが陰性であることを指標として心筋細胞および／または心筋前駆細胞を抽出する工程をさらに含む、前記方法を提供することである。
本発明の他の態様は、N-カドヘリンが陽性であることを指標として心筋細胞および／または心筋前駆細胞を抽出する工程をさらに含む、前記方法を提供することである。
本発明の他の態様は、前記心筋細胞および／または心筋前駆細胞がヒト心筋細胞および／またはヒト心筋前駆細胞である、前記方法を提供することである。
本発明の他の態様は、前記心筋細胞および／または心筋前駆細胞を含有する細胞集団が、多能性幹細胞から分化誘導された細胞集団または摘出組織細胞から成る細胞集団である、前記方法を提供することである。
本発明の他の態様は、前記心筋細胞および／または心筋前駆細胞への分化誘導が、サイトカインを含有する培地で培養する工程を含む分化誘導である、前記方法を提供することである。
本発明の他の態様は、前記サイトカインが、アクチビンAおよびBMP4（bone morphogenetic protein 4）から成る群より少なくとも一つ選択されるサイトカインである、前記方法を提供することである。
本発明の他の態様は、心筋細胞および／または心筋前駆細胞を含有する細胞集団よりVCAM1が陽性であることを指標として心筋細胞および／または心筋前駆細胞を検出する工程を含む、心筋細胞および／または心筋前駆細胞の検出方法を提供することである。
本発明の他の態様は、PDGFRβが陰性であることを指標として心筋細胞および／または心筋前駆細胞を検出する工程をさらに含む、前記方法を提供することである。
本発明の他の態様は、N-カドヘリンが陽性であることをさらに指標として心筋細胞および／または心筋前駆細胞を検出する工程を含む、前記方法を提供することである。
本発明の他の態様は、前記心筋細胞および／または心筋前駆細胞がヒト心筋細胞および／またはヒト心筋前駆細胞である、前記方法を提供することである。
本発明の他の態様は、前記心筋細胞および／または心筋前駆細胞を含有する細胞集団が、多能性幹細胞から分化誘導された細胞集団または摘出組織細胞から成る細胞集団である、前記方法を提供することである。
本発明の他の態様は、VCAM1に親和性を有する試薬を含む心筋細胞および／または心筋前駆細胞抽出または検出用キットを提供することである。
本発明の他の態様は、PDGFRβに親和性を有する試薬をさらに含む、前記キットを提供することである。
本発明の他の態様は、N-カドヘリンに親和性を有する試薬をさらに含む、前記キットを提供することである。
本発明の他の態様は、前記心筋細胞および／または心筋前駆細胞がヒト心筋細胞および／またはヒト心筋前駆細胞である、前記キットを提供することである。

VCAM1陰性N-カドヘリン陽性（Q1）、VCAM1陽性N-カドヘリン陽性（Q2）、VCAM1陰性N-カドヘリン陰性（Q3）およびVCAM1陽性N-カドヘリン陰性（Q4）のカテゴリーによるソーティング後3日間接着培養させたヒトiPS細胞由来の心筋細胞のDAPI（青色）およびcTnT（赤色）に対する免疫染色像（写真）を示す。多能性細胞から心筋細胞を分化誘導方法するプロトコールを示す。図３Aは、多能性幹細胞の分化誘導開始から7日目、9日目、11日目におけるフローサイトメトリーの結果を示す。図中、横軸はVCAM1の強度、縦軸はcTnTの強度を示す。図３Bは、多能性幹細胞の分化誘導開始から11日目におけるフローサイトメトリーの結果を示す。図中、横軸はVCAM1（上）またはcTnT（下）の強度を示し、縦軸は細胞数を示し、横線より上の領域は、VCAM1またはcTnTが陽性である領域を示す。下図において、左のピークはアイソタイプ抗体染色の結果（ネガティブコントロール）を示し、右の灰色のピークはcTnT抗体染色の結果を示す。図３Cは、MACSにより純化した結果を示し、VCAM1陽性率およびcTnT陽性率を示す。 VCAM1陽性細胞単離後7日間培養した細胞のcTnT（左図）およびα-アクチニン（右図）に対する免疫染色像（写真）を示す。 ES細胞株（KhES1）およびiPS細胞株（253G1、253G4および201B7）より分化誘導した細胞に対するフローサイトメトリーの結果を示す。スキャッタープロット（左図）はcTnT抗体（縦軸）およびVCAM1抗体（横軸）の蛍光強度を示す。ヒストグラム（右図）は、VCAM1抗体陽性細胞に対するcTnT抗体の強度を示し、図中の数字は、横線にて示された範囲の細胞（cTnT陽性細胞）の含有率を示す。各多能性幹細胞（Kh-ES1（上）、Kh-ES3（中）および253G1（下））より分化誘導した細胞に対するフローサイトメトリーの結果を示す。左図では、横軸にVCAM1の強度、縦軸にcTnTの強度を示し、中央図では、横軸にVCAM1の強度、縦軸にPDGFRβの強度を、右図ではVCAM1陽性、PDGFRβ陰性細胞におけるcTnTの発現強度を示す（灰色領域）。

本発明を以下に詳細に説明する。
本発明は、上記のとおり、心筋細胞および／または心筋前駆細胞を含有する細胞集団よりVCAM1が陽性であることを指標として心筋細胞および／または心筋前駆細胞を抽出する工程を含む、心筋細胞および／または心筋前駆細胞の製造方法、または心筋細胞および／または心筋前駆細胞を含有する細胞集団よりVCAMが陽性であることを指標として心筋細胞および／または心筋前駆細胞を検出する工程を含む、心筋細胞および／または心筋前駆細胞の検出方法に関する。

本発明において、心筋細胞および／または心筋前駆細胞を含有する細胞集団とは、心筋細胞および／または心筋前駆細胞を含有している細胞の集合体であれば、その由来は特に問わない。例えば、任意の方法で得られた末梢血、心臓、骨髄組織、脂肪組織、骨格筋組織、羊膜組織、胎盤組織、臍帯血などに含まれる細胞であってもよいし、また、多能性幹細胞から分化誘導された細胞であってもよい。

本発明において、心筋細胞および／または心筋前駆細胞を抽出とは、他の細胞種と比して心筋細胞および／または心筋前駆細胞の割合を多くすることを意味し、好ましくは、心筋細胞および／または心筋前駆細胞を細胞集団において50％、60％、70％、80％または90％以上含有するよう濃縮させることである。心筋細胞および／または心筋前駆細胞の抽出とは、より好ましくは、心筋細胞および／または心筋前駆細胞を細胞集団において100％になるまで精製することである。

本発明において、VCAM1とはvascular cell adhesion molecule 1 (VCAM-1) またはCD106として知られる細胞接着に関連する蛋白質である。例えば、ヒトの場合、NCBI（National Center for Biotechnology Information）のアクセッション番号NM_001078、NM_001199834またはNM_080682に記載された遺伝子または遺伝子によってコードされるタンパク質であり、6個または7個のイムノグロブリンドメインを有する。VCAM1には、選択的スプライシングによるアイソフォームも含まれる。

本発明において、PDGFRβ陰性細胞を心筋細胞および心筋前駆細胞として抽出または検出する工程をさらに含んでもよい。ここで、PDGFRβとはplatelet-derived growth facto
r receptor, beta polypeptideまたはPDGFR1として知られる細胞表面受容体である。例えば、ヒトの場合、PDGFRβをコードする遺伝子はNCBIのアクセッション番号NM_002609に記載された配列を有する。

本発明において、N-カドヘリンが陽性であることを指標として心筋細胞および心筋前駆細胞として抽出または検出する工程をさらに含んでもよい。ここで、N-カドヘリンとはCDH2として知られる細胞接着に関連する蛋白質である。例えば、ヒトの場合、NCBIのアクセッション番号NM_001792に記載された配列を有する遺伝子または本配列によってコードされるタンパク質であり、細胞外に5個の約100アミノ酸からなる繰り返し配列（ECドメイン）を有する。

本発明において、心筋細胞とは、自己拍動の特性を有する心筋の細胞を意味する。また、心筋前駆細胞とは、前記心筋細胞の前駆細胞であって、拍動筋肉と電気伝導組織を形成する心筋細胞および血管平滑筋を生じる能力を有する細胞を意味する。ここで、心筋細胞および心筋前駆細胞は互いに混在していてもよく、また、単離されていてもよい。
心筋細胞および心筋前駆細胞とは、心筋マーカーである心筋トロポニン（cTnTまたはtroponin T type 2）陽性および/またはαMHC（α myosin heavy chain）陽性であることによって特徴づけられる。

＜多能性幹細胞＞
本発明で使用可能な多能性幹細胞は、生体に存在するすべての細胞に分化可能である多能性を有し、かつ、増殖能をも併せもつ幹細胞であり、それには、以下のものに限定されないが、例えば胚性幹(ES)細胞、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹(ntES)細胞、精子幹細胞（「GS細胞」）、胚性生殖細胞（「EG細胞」）、人工多能性幹(iPS)細胞などが含まれる。好ましい多能性幹細胞は、ES細胞、ntES細胞、およびiPS細胞である。

(A) 胚性幹細胞
ES細胞は、ヒトやマウスなどの哺乳動物の初期胚（例えば胚盤胞）の内部細胞塊から樹立された、多能性と自己複製による増殖能を有する幹細胞である。

ES細胞は、受精卵の8細胞期、桑実胚後の胚である胚盤胞の内部細胞塊に由来する胚由来の幹細胞であり、成体を構成するあらゆる細胞に分化する能力、いわゆる分化多能性と、自己複製による増殖能とを有している。ES細胞は、マウスで1981年に発見され(M.J. Evans and M.H. Kaufman (1981), Nature 292:154-156)、その後、ヒト、サルなどの霊長類でもES細胞株が樹立された (J.A. Thomson et al. (1998), Science 282:1145-1147; J.A. Thomson et al. (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:7844-7848;J.A. Thomson et al. (1996), Biol. Reprod., 55:254-259; J.A. Thomson and V.S. Marshall (1998), Curr. Top. Dev. Biol., 38:133-165)。

ES細胞は、対象動物の受精卵の胚盤胞から内部細胞塊を取出し、内部細胞塊を線維芽細胞のフィーダー上で培養することによって樹立することができる。また、継代培養による細胞の維持は、白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor (LIF))、塩基性線維芽細胞成長因子(basic fibroblast growth factor (bFGF))などの物質を添加した培養液を用いて行うことができる。ヒトおよびサルのES細胞の樹立と維持の方法については、例えばUSP5,843,780; Thomson JA, et al. (1995), Proc Natl. Acad. Sci. U S A. 92:7844-7848； Thomson JA, et al. (1998), Science. 282:1145-1147； H. Suemori et al. (2006),
Biochem. Biophys. Res. Commun., 345:926-932； M. Ueno et al. (2006), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:9554-9559； H. Suemori et al. (2001), Dev. Dyn., 222:273-279;H. Kawasaki et al. (2002), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:1580-1585；Klimanskaya I, et al. (2006), Nature. 444:481-485などに記載されている。

ES細胞作製のための培養液として、例えば0.1mM 2-メルカプトエタノール、0.1mM 非必須アミノ酸、2mM L-グルタミン酸、20% KSR及び4ng/ml bFGFを補充したDMEM/F-12培養液を使用し、37℃、2% CO₂/98% 空気の湿潤雰囲気下でヒトES細胞を維持することができる(O. Fumitaka et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26:215-224)。また、ES細胞は、3〜4日おきに継代する必要があり、このとき、継代は、例えば1mM CaCl₂及び20% KSRを含有するPBS中の0.25% トリプシン及び0.1mg/mlコラゲナーゼIVを用いて行うことができる。

ES細胞の選択は、一般に、アルカリホスファターゼ、Oct-3/4、Nanogなどの遺伝子マーカーの発現を指標にしてReal-Time PCR法で行うことができる。特に、ヒトES細胞の選択では、OCT-3/4、NANOG、ECADなどの遺伝子マーカーの発現を指標とすることができる(E. Kroon et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26:443-452)。
ヒトＥＳ細胞株は、例えばWA01(H1)およびWA09(H9)は、WiCell Reserch Instituteから、KhES-1、KhES-2及びKhES-3は、京都大学再生医科学研究所(京都、日本)から入手可能である。

(B) 精子幹細胞
精子幹細胞は、精巣由来の多能性幹細胞であり、精子形成のための起源となる細胞である。この細胞は、ES細胞と同様に、種々の系列の細胞に分化誘導可能であり、例えばマウス胚盤胞に移植するとキメラマウスを作出できるなどの性質をもつ(M. Kanatsu-Shinohara et al. (2003) Biol. Reprod., 69:612-616; K. Shinohara et al. (2004), Cell, 119:1001-1012)。神経膠細胞系由来神経栄養因子(glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF))を含む培養液で自己複製可能であるし、またES細胞と同様の培養条件下で継代を繰り返すことによって、精子幹細胞を得ることができる(竹林正則ら(2008),実験医学,26巻,5号(増刊),41〜46頁,羊土社(東京、日本))。

(C) 胚性生殖細胞
胚性生殖細胞は、胎生期の始原生殖細胞から樹立される、ES細胞と同様な多能性をもつ細胞であり、LIF、bFGF、幹細胞因子(stem cell factor)などの物質の存在下で始原生殖細胞を培養することによって樹立しうる(Y. Matsui et al. (1992), Cell, 70:841-847; J.L. Resnick et al. (1992), Nature, 359:550-551)。

(D) 人工多能性幹細胞
人工多能性幹(iPS)細胞は、特定の初期化因子を、DNA又はタンパク質の形態で体細胞に導入することによって作製することができる、ES細胞とほぼ同等の特性、例えば分化多能性と自己複製による増殖能、を有する体細胞由来の人工の幹細胞である（K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cell, 126:663-676; K. Takahashi et al. (2007), Cell, 131:861-872; J. Yu et al. (2007), Science, 318:1917-1920; Nakagawa, M.ら,Nat. Biotechnol. 26:101-106 (2008)；国際公開WO 2007/069666）。初期化因子は、ES細胞に特異的に発現している遺伝子、その遺伝子産物もしくノンコーディング RNAまたはES細胞の未分化維持に重要な役割を果たす遺伝子、その遺伝子産物もしくはノンコーディング RNA、あるいは低分子化合物によって構成されてもよい。初期化因子に含まれる遺伝子として、例えば、Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Klf4、Klf2、c-Myc、N-Myc、L-Myc、Nanog、Lin28、Fbx15、ERas、ECAT15-2、Tcl1、beta-catenin、Lin28b、Sall1、Sall4、Esrrb、Nr5a2、Tbx3、Glis1等が例示され、これらの初期化因子は、単独で用いても良く、組み合わせて用いても良い。初期化因子の組み合わせとしては、WO2007/069666、WO2008/118820、WO2009/007852、WO2009/032194、WO2009/058413、WO2009/057831、WO2009/075119、WO2009/079007、WO2009/091659、WO2009/101084、WO2009/101407、WO2009/102983、WO2009/114949、WO2009/117439、WO2009/126250、WO2009/126251、WO2009/126655、WO2009/157593、WO2010/009015、WO2010/033906、WO2010/033920、WO2010/042800、WO2010/050626
、WO 2010/056831、WO2010/068955、WO2010/098419、WO2010/102267、WO 2010/111409、WO 2010/111422、WO2010/115050、WO2010/124290、WO2010/147395、WO2010/147612、Huangfu D, et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26: 795-797、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 2: 525-528、Eminli S, et al. (2008), Stem Cells. 26:2467-2474、Huangfu
D, et al. (2008), Nat Biotechnol. 26:1269-1275、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem
Cell, 3, 568-574、Zhao Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3:475-479、Marson A, (2008), Cell Stem Cell, 3, 132-135、Feng B, et al. (2009), Nat Cell Biol. 11:197-203、R.L. Judson et al., (2009), Nat. Biotech., 27:459-461、Lyssiotis CA, et al.
(2009), Proc Natl Acad Sci U S A. 106:8912-8917、Kim JB, et al. (2009), Nature.
461:649-643、Ichida JK, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5:491-503、Heng JC, et al. (2010), Cell Stem Cell. 6:167-74、Han J, et al. (2010), Nature. 463:1096-100、Mali P, et al. (2010), Stem Cells. 28:713-720、Maekawa M, et al. (2011),Nature. 474:225-229に記載の組み合わせが例示される。

上記初期化因子には、ヒストンデアセチラーゼ（HDAC）阻害剤［例えば、バルプロ酸 (VPA)、トリコスタチンA、酪酸ナトリウム、MC 1293、M344等の低分子阻害剤、HDACに対するsiRNAおよびshRNA（例、HDAC1 siRNA Smartpool（登録商標）(Millipore)、HuSH 29mer
shRNA Constructs against HDAC1 (OriGene)等）等の核酸性発現阻害剤など］、MEK阻害剤（例えば、PD184352、PD98059、U0126、SL327およびPD0325901）、Glycogen synthase kinase-3阻害剤（例えば、BioおよびCHIR99021）、DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、5-azacytidine）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、BIX-01294 等の低分子阻害剤、Suv39hl、Suv39h2、SetDBlおよびG9aに対するsiRNAおよびshRNA等の核酸性発現阻害剤など）、L-channel calcium agonist (例えばBayk8644)、酪酸、TGFβ阻害剤またはALK5阻害剤（例えば、LY364947、SB431542、616453およびA-83-01）、p53阻害剤（例えばp53に対するsiRNAおよびshRNA）、ARID3A阻害剤（例えば、ARID3Aに対するsiRNAおよびshRNA）、miR-291-3p、miR-294、miR-295およびmir-302などのmiRNA、Wnt Signaling（例えばsoluble Wnt3a）、神経ペプチドY、プロスタグランジン類（例えば、プロスタグランジンE2およびプロスタグランジンJ2）、hTERT、SV40LT、UTF1、IRX6、GLISl、PITX2、DMRTBl等の樹立効率を高めることを目的として用いられる因子も含まれており、本明細書においては、これらの樹立効率の改善目的にて用いられた因子についても初期化因子と別段の区別をしないものとする。

初期化因子は、タンパク質の形態の場合、例えばリポフェクション、細胞膜透過性ペプチド（例えば、HIV由来のTATおよびポリアルギニン）との融合、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入してもよい。

一方、DNAの形態の場合、例えば、ウイルス、プラスミド、人工染色体などのベクター、リポフェクション、リポソーム、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入することができる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター（以上、Cell, 126, pp.663-676, 2006; Cell, 131, pp.861-872, 2007; Science, 318, pp.1917-1920, 2007）、アデノウイルスベクター(Science, 322, 945-949, 2008)、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクター（WO 2010/008054）などが例示される。また、人工染色体ベクターとしては、例えばヒト人工染色体(HAC)、酵母人工染色体(YAC)、細菌人工染色体(BAC、PAC)などが含まれる。プラスミドとしては、哺乳動物細胞用プラスミドを使用しうる(Science, 322:949-953, 2008)。ベクターには、核初期化物質が発現可能なように、プロモーター、エンハンサー、リボゾーム結合配列、ターミネーター、ポリアデニル化サイトなどの制御配列を含むことができるし、さらに、必要に応じて、薬剤耐性遺伝子(例えばカナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子など）、チミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリアトキシン遺伝子などの選択マーカー配列、緑色蛍光タンパク質(GFP)、βグルクロニダーゼ(GU
S)、FLAGなどのレポーター遺伝子配列などを含むことができる。また、上記ベクターには、体細胞への導入後、初期化因子をコードする遺伝子もしくはプロモーターとそれに結合する初期化因子をコードする遺伝子を共に切除するために、それらの前後にLoxP配列を有してもよい。

また、RNAの形態の場合、例えばリポフェクション、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入しても良く、分解を抑制するため、5-メチルシチジンおよびプソイドウリジン(TriLink Biotechnologies)を取り込ませたRNAを用いても良い（Warren
L, (2010) Cell Stem Cell. 7:618-630）。

iPS細胞誘導のための培養液としては、例えば、10〜15％FBSを含有するDMEM、DMEM/F12又はDME培養液（これらの培養液にはさらに、LIF、ペニシリン/スプレプトマイシン、ピューロマイシン、L-グルタミン、非必須アミノ酸類、β-メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）または市販の培養液[例えば、マウスES細胞培養用培養液(TX-WES培養液、トロンボＸ社)、霊長類ES細胞培養用培養液（霊長類ES/iPS細胞用培養液、リプロセル社）、無血清培地（mTeSR、Stemcell Technology社）]などが含まれる。

培養法の例としては、たとえば、37℃、5％CO₂存在下にて、10％FBS含有DMEM又はDMEM/F12培養液上で体細胞と初期化因子とを接触させ約4〜7日間培養し、その後、細胞をフィーダー細胞(たとえば、マイトマイシンC処理STO細胞、SNL細胞等)上にまきなおし、体細胞と初期化因子の接触から約10日後からbFGF含有霊長類ES細胞培養用培養液で培養し、該接触から約30〜約45日又はそれ以上ののちにiPS様コロニーを生じさせることができる。

あるいは、37℃、5% CO₂存在下にて、フィーダー細胞(たとえば、マイトマイシンC処理STO細胞、SNL細胞等)上で10％FBS含有DMEM培養液（これにはさらに、LIF、ペニシリン/ストレプトマイシン、ピューロマイシン、L-グルタミン、非必須アミノ酸類、β-メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）で培養し、約25〜約30日又はそれ以上ののちにES様コロニーを生じさせることができる。望ましくは、フィーダー細胞の代わりに、初期化される体細胞そのものを用いる（Takahashi K, et al. (2009), PLoS One. 4:e8067またはWO2010/137746）、もしくは細胞外基質（例えば、Laminin-5（WO2009/123349）およびマトリゲル（BD社））を用いる方法が例示される。
この他にも、血清を含有しない培地を用いて培養する方法も例示される（Sun N, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci U S A. 106:15720-15725）。さらに、樹立効率を上げるため、低酸素条件（0.1％以上、15％以下の酸素濃度）によりiPS細胞を樹立しても良い（Yoshida Y, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5:237-241またはWO2010/013845）。

上記培養の間には、培養開始2日目以降から毎日1回新鮮な培養液と培養液交換を行う。また、核初期化に使用する体細胞の細胞数は、限定されないが、培養ディッシュ100cm²あたり約5×10³〜約5×10⁶細胞の範囲である。

iPS細胞は、形成したコロニーの形状により選択することが可能である。一方、体細胞が初期化された場合に発現する遺伝子（例えば、Oct3/4、Nanog）と連動して発現する薬剤耐性遺伝子をマーカー遺伝子として導入した場合は、対応する薬剤を含む培養液（選択培養液）で培養を行うことにより樹立したiPS細胞を選択することができる。また、マーカー遺伝子が蛍光タンパク質遺伝子の場合は蛍光顕微鏡で観察することによって、発光酵素遺伝子の場合は発光基質を加えることによって、また発色酵素遺伝子の場合は発色基質を加えることによって、iPS細胞を選択することができる。

本明細書中で使用する「体細胞」なる用語は、卵子、卵母細胞、ES細胞などの生殖系列細胞または分化全能性細胞を除くあらゆる動物細胞（好ましくは、ヒトを含む哺乳動物細
胞）をいう。体細胞には、非限定的に、胎児(仔)の体細胞、新生児(仔)の体細胞、及び成熟した健全なもしくは疾患性の体細胞のいずれも包含されるし、また、初代培養細胞、継代細胞、及び株化細胞のいずれも包含される。具体的には、体細胞は、例えば（1）神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）、（2）組織前駆細胞、（3）リンパ球、上皮細胞、内皮細胞、筋肉細胞、線維芽細胞（皮膚細胞等）、毛細胞、肝細胞、胃粘膜細胞、腸細胞、脾細胞、膵細胞(膵外分泌細胞等)、脳細胞、肺細胞、腎細胞および脂肪細胞等の分化した細胞などが例示される。

また、iPS細胞を移植用細胞の材料として用いる場合、拒絶反応が起こらないという観点から、移植先の個体のHLA遺伝子型が同一もしくは実質的に同一である体細胞を用いることが望ましい。ここで、「実質的に同一」とは、移植した細胞に対して免疫抑制剤により免疫反応が抑制できる程度にHLA遺伝子型が一致していることであり、例えば、HLA-A、HLA-BおよびHLA-DRの3遺伝子座あるいはHLA-Cを加えた4遺伝子座が一致するHLA型を有する体細胞である。

(E) 核移植により得られたクローン胚由来のES細胞
nt ES細胞は、核移植技術によって作製されたクローン胚由来のES細胞であり、受精卵由来のES細胞とほぼ同じ特性を有している（T. Wakayama et al. (2001), Science, 292:740-743; S. Wakayama et al. (2005), Biol. Reprod., 72:932-936; J. Byrne et al.
(2007), Nature, 450:497-502）。すなわち、未受精卵の核を体細胞の核と置換することによって得られたクローン胚由来の胚盤胞の内部細胞塊から樹立されたES細胞がnt ES(nuclear transfer ES)細胞である。nt ES細胞の作製のためには、核移植技術（J.B. Cibelli et al. (1998), Nature Biotechnol., 16:642-646）とES細胞作製技術(上記)との組み合わせが利用される(若山清香ら(2008),実験医学,26巻,5号(増刊), 47〜52頁)。核移植においては、哺乳動物の除核した未受精卵に、体細胞の核を注入し、数時間培養することで初期化することができる。

＜多能性幹細胞から心筋細胞および／または心筋前駆細胞を製造する方法＞
多能性幹細胞から心筋細胞および／または心筋前駆細胞への分化誘導方法は特に限定されないが、例えば、以下の方法を用いることができる。

多能性幹細胞を任意の方法で分離し、浮遊培養またはコーティング処理された培養皿を用いて接着培養を行ってもよい。ここで、分離の方法としては、力学的、EDTA溶液（例えば、0.5mM EDTA溶液またはVersene（invitrogen社）が挙げられる）、プロテアーゼ活性とコラゲナーゼ活性を有する分離溶液（例えば、Accutase(TM)およびAccumax(TM)が挙げられる）またはコラゲナーゼ活性のみを有する分離液を用いてもよい。ここで、浮遊培養においては、培養皿の表面が、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、細胞外マトリックス等によるコーティング処理）されていないもの、もしくは、人工的に接着を抑制する処理（例えば、ポリヒドロキシエチルメタクリル酸（poly-HEMA）によるコーティング処理）したものを使用できる。接着培養においては、例えば、マトリゲル（BD）、I型コラーゲン、IV型コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、またはエンタクチン、およびこれらの組み合わせを用いてコーティング処理された培養皿を使用できる。

ここで、浮遊培養および接着培養を組み合わせて行ってもよい。本発明の態様において、組み合わせた場合、浮遊培養後、そのまま接着培養を行ってもよく、もしくは浮遊培養により作製された中胚葉系の細胞を選択した後、接着培養を行ってもよい。ここで、中胚葉とは、発生の過程で体腔およびそれを裏打ちする中皮、筋肉、骨格、皮膚真皮、結合組織、心臓・血管（血管内皮も含む）、血液（血液細胞も含む）、リンパ管や脾臓、腎臓および尿管、性腺（精巣、子宮、性腺上皮）をつくる能力を有した細胞から構成される胚葉
を包含する。例えば、T、KDR、FOXF1、FLK1およびBMP4と言ったマーカーの発現により示される。好ましくは、KDRまたはFLK1を発現する細胞である。

本発明において、接着培養はフィーダー細胞と共培養を行ってもよい。ここで、共培養に用いられるフィーダー細胞は、OP9細胞(Nishikawa, S.I. et al, Development 125, 1747-1757 (1998))またはEND-2細胞（Mummery C, et al, Circulation. 107:2733-40 (2003)）が例示されるが、移植用細胞の材料として用いる場合、他種の細胞の混入を防ぐ観点から、共培養を行わないことが望まれる。

本工程における培地は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えばIMDM培地、Medium 199培地、Eagle’s Minimum Essential Medium (EMEM)培地、αMEM培地、Doulbecco’s modified Eagle’s Medium (DMEM)培地、Ham’s F12培地、RPMI 1640培地、Fischer’s培地、およびこれらの混合培地などが包含される。好ましくは、RPMI 1640培地である。培地には、血清が含有されていてもよいし、あるいは無血清でもよい。必要に応じて、例えば、アルブミン、トランスフェリン、Knockout Serum Replacement(KSR)(ES細胞培養時のFBSの血清代替物)、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール、3’-チオールグリセロール、ITS−サプリメントなどの1つ以上の血清代替物を含んでもよいし、B27-サプリメント、N2-サプリメント、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、Glutamax（Invitrogen）、非必須アミノ酸、ビタミン、サイトカイン、Wntシグナル阻害剤、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、シクロスポリンAなどの1つ以上の物質も含有しうる。サイトカインとして、アクチビンＡおよびＢＭＰ４が例示される。Wntシグナル阻害剤として、XAV939（Shih-Min A. Huang, et al, Nature 461, 614-620, 2009）、ビタミンA（レチノイン酸），リチウム，フラボノイド、Dickkopf1（Dkk1）、インスリン様増殖因子結合タンパク質（IGFBP）（WO2009/131166）、βカテニンに対するsiRNA等が例示される。
好ましい培地として、B27-サプリメントを含有するRPMI 1640培地が例示され、さらに薬剤を加える場合、培養時期ごと加える薬剤を変えてもよい。

培養温度は、以下に限定されないが、約30〜40℃、好ましくは約37℃であり、CO₂含有空気の雰囲気下で培養が行われ、CO₂濃度は、好ましくは約2〜5％である。培養時間は、心筋トロポニンおよび/またはαMHCが発現するために必要な日数であり、例えば7日以上である。

本発明において、多能性幹細胞から心筋細胞および／または心筋前駆細胞を製造する方法として、マトリゲルによりコートされた培養皿を用いて、アクチビンＡおよびB27-サプリメントを含有するRPMI 1640培地で1日間、続いてBMP4、bFGFおよびB27-サプリメントを含有するRPMI 1640培地で4日間培養、さらに、Dkk1およびB27-サプリメントを含有するRPMI 1640培地で2日間培養する条件が例示される。
このように製造された心筋細胞および／または心筋前駆細胞は、心筋細胞および／または心筋前駆細胞のみからなる細胞集団でもよいが、通常は、他の種類の細胞が含有された細胞集団である。後者の場合、心筋細胞および／または心筋前駆細胞の純度を上げるため、本発明の方法によって心筋細胞および／または心筋前駆細胞を抽出する必要がある。

＜心筋細胞および／または心筋前駆細胞の抽出または検出方法＞
心筋細胞および／または心筋前駆細胞を含有する細胞集団より心筋細胞および／または心筋前駆細胞の抽出または検出のために、VCAM1、PDGFRβまたはN-カドヘリンに特異的親和性を有する試薬であれば何でもよく、抗体、アプタマー、ペプチドまたは特異的に認識する化合物などを用いることができ、好ましくは、抗体もしくはその断片である。
本発明において、抗体はポリクローナルまたはモノクローナル抗体であってよい。これらの抗体は、当業者に周知の技術を用いて作成することが可能である（Current protocol
s in Molecular Biology edit.Ausubel et al.(1987) Publish.John Wiley and Sons.Section 11.12-11.13）。具体的には、抗体がポリクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し精製したVCAM1、PDGFRβまたはN-カドヘリンがコードするタンパク質、あるいは部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドを合成して、家兎等の非ヒト動物に免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。一方、モノクローナル抗体の場合には、上述の免疫された非ヒト動物から得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞の中から得ることができる（Current protocols in Molecular Biology edit.Ausubel et al.(1987) Publish.John Wiley and Sons.Section 11.4-11.11）。抗体の断片としては、抗体の一部(たとえばFab断片)または合成抗体断片(たとえば、一本鎖Fv断片「ScFv」)が例示される。FabおよびF(ab)₂断片などの抗体の断片もまた、遺伝子工学的に周知の方法によって作製することができる。

結合した細胞を区別、分離するため、当該VCAM1、PDGFRβ またはN-カドヘリンに親和性を有する試薬は、たとえば、蛍光標識、放射性標識、化学発光標識、酵素、ビオチンまたはストレプトアビジン等の検出可能な物質またはプロテインA、プロテインG、ビーズまたは磁気ビーズ等の単離抽出を可能とさせる物質と結合または接合されていてもよい。

当該VCAM1、PDGFRβ またはN-カドヘリンに親和性を有する試薬は、間接的に標識してもよい。当業者に公知の様々な方法を使用して行い得るが、例えば、VCAM1、PDGFRβまたはN-カドヘリンに対する抗体に特異的に結合する予め標識された抗体（二次抗体）を用いる方法が挙げられる。
心筋細胞および／または心筋前駆細胞を検出する方法には、たとえば、フローサイトメーターまたは単離精製した後、別途細胞を検出する方法（例えば、プロテインチップ）を用いることが含まれる。

心筋細胞および／または心筋前駆細胞を抽出する方法には、当該VCAM1、PDGFRβ またはN-カドヘリンに親和性を有する試薬へ大きな粒子を接合させて細胞を沈降させる方法、磁気ビーズを用いて磁性により細胞を選別する方法(例えば、MACS)、蛍光標識を用いて細胞ソーターを用いる方法、または抗体等が固定化された担体（例えば、細胞濃縮カラム）を用いる方法等が例示される。

本発明において、多能性幹細胞より得られた心筋細胞および／または心筋前駆細胞を含む細胞集団において、例えば、５０％以上、６０％以上、７０以上、８０％以上、９０％以または１００％以上の細胞が、VCAM1もしくはN-カドヘリン陽性、またはPDGFRβ陰性であった場合、検出する工程を以って抽出する工程と見なすことができる。

以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明がこれらに限定されないことは言うまでもない。

多能性幹細胞の培養
ヒトES細胞（KhES-1およびKhES-3）は、京都大学再生医科学研究所より受領した(Suemori H, et al. Biochem Biophys Res Commun. 345: 926-32, 2006)。ヒトiPS細胞（201B6、201B7、253G1、253G4、TIG107-3F1、TIG107-4F1、TIG114-4F1およびTIG120-4F1）は、京都大学の山中教授より受領した(Takahashi K, et al. Cell. 131: 861-72, 2007およびNakagawa M, et al. Nat Biotechnol. 26: 101-6, 2008)。ヒトES細胞およびヒトiPS細胞は、growth factor-reduced Matrigel （#354230; Becton-Dickinson）でコートしたディッシュ上でMEF（Mouse Embryo Fibroblast）の馴化培地（MMC（mitomycin C）処理後のMEFを1日間、20%KSR、4ng/mL bFGF , 1 mM L-glutamine, 0.1 mM β-mercaptoethanolおよ
び1% nonessential amino acids含有 DMEMで培養した培養上清）を用いて培養した。

実施例１
心筋細胞／心筋前駆細胞の誘導法
ヒトES細胞またはiPS細胞を20〜35×10⁴個/200mm²の濃度でマトリゲルコートしたディッシュへ播種し、MEFの馴化培地（MMC処理後のMEFを1日間、20%KSR、4ng/mL bFGF, 1 mM L-glutamine, 0.1 mM β-mercaptoethanolおよび1% nonessential amino acids含有 DMEMで培養した培養上清）で2日間培養した。続いて、B27サプリメント(without insulin)（Invitrogen）および2mM L-glutamineを含有したRPMI1640（Invitrogen）（RPMI/B27）へ100ng/mlのアクチビンA（R & D Systems）を添加した培地へ交換した。翌日、10ng/mlのBMP4（R & D Systems）を添加したRPMI/B27へ培地交換し、4日間培養した。続いて、培地をRPMI/B27のみへ交換した。2日毎にRPMI/B27を交換すると、RPMI/B27へ交換後、4日目以後に拍動する細胞が観察できた。

心筋細胞／心筋前駆細胞マーカーによる細胞評価
上述した方法により誘導したヒトiPS細胞由来の心筋細胞／心筋前駆細胞を（１）VCAM1陰性N-カドヘリン陽性、（２）VCAM1陽性N-カドヘリン陽性、（３）VCAM1陰性N-カドヘリン陰性および（４）VCAM1陽性N-カドヘリン陰性の４つのカテゴリーに分けてソーティングした後、0.1%ゼラチンをコートしたディッシュへ播種し、3日間 10%FBS含有・MEM(Invitrogen)にて培養したところ、VCAM1陽性N-カドヘリン陽性細胞にcTnT陽性細胞が最も多く、続いてVCAM1陽性N-カドヘリン陰性細胞であることが確認された（図１）。
以上より、VCAM1のみ、またはVCAM1およびN-カドヘリンを指標とすることで、心筋細胞／心筋前駆細胞の識別が可能であることが示唆された。

実施例２
心筋細胞／心筋前駆細胞の誘導法
ヒトES細胞またはiPS細胞を20〜35×10⁴個/200mm²の濃度でマトリゲルコートしたディッシュへ播種し、4ng/mL のbFGF を再添加したMEFの馴化培地（MMC処理後のMEFを1日間、20%KSR、4ng/mL bFGF、1 mM L-glutamine、0.1 mM β-mercaptoethanolおよび1% nonessential amino acidsを含有したknockout DMEMで培養した培養上清）で培養した後、マトリゲルを添加し1日間培養を継続した。続いて、B27サプリメント（Invitrogen）および2mM L-glutamineを含有したRPMI1640（Invitrogen）（RPMI/B27）へ100ng/mlのアクチビンA（R & D Systems）を添加した培地へ交換した。翌日、10ng/mlのBMP4（R & D Systems）および10ng/ml bFGFを添加したRPMI/B27へ培地交換し、4日間培養した。さらに、10ng/ml Dkk1を含有するRPMI/B27へ交換した。その後、RPMI/B27培地へ交換し2日毎に培地を交換し4日間培養を続けた。本プロトコールを図２へ示す。RPMI/B27培地へ交換後1から2日目に拍動する細胞が観察できた。

心筋細胞／心筋前駆細胞マーカーによる細胞評価
上述した方法で誘導したヒトiPS細胞（201B6）由来の心筋細胞／心筋前駆細胞を誘導7日目、9日目、11日目にVCAM1抗体（BioLegend）およびcTnT抗体（NeoMarker）にて染色し、フローサイトメトリーを用いて評価したところ、誘導11日目には、VCAM1の陽性とcTnTの陽性に相関がみられた（図３A）。また、この誘導11日目のVCAM1陽性細胞を純化した場合、約95％の細胞がcTnT陽性であることが確認された（図３BおよびC）。
また、誘導11日目に純化した細胞をさらに7日間培養したところ、cTnTと共にアクチン線維が確認できた（図４）。さらに、他のヒトES細胞株（KhES1）またはiPS細胞株（201B7、253G1および253G4）においても同様の方法によりVCAM1が陽性であることを指標として心筋細胞／心筋前駆細胞を効率よく単離できることが確認された（図５）。以上より、VCAM1が陽性であることを指標として心筋細胞／心筋前駆細胞を効率よく単離精製することができることが確認された。
また、上述した方法により誘導したヒトES細胞（KhES1およびKhES3）およびiPS細胞（253G1）由来の心筋細胞／心筋前駆細胞をVCAM1、cTnTおよびPDGFRβにて染色し、FACSにより解析したところ、いずれの細胞においてもVCAM1陽性およびPDGFRβ陰性の細胞群では、ほとんどがcTnT陽性細胞であることが確認された（図６）。以上より、VCAM1の陽性に加えPDGFRβが陰性であることを指標とすることで、心筋細胞／心筋前駆細胞のより効率的な識別が可能であることが示唆された。

本発明は再生医療などに有用である。

Claims

心筋細胞および／または心筋前駆細胞を含有する細胞集団よりVCAM1が陽性であることを指標として心筋細胞および／または心筋前駆細胞を抽出する工程を含む、心筋細胞および／または心筋前駆細胞の製造方法。
PDGFRβが陰性であることを指標として心筋細胞および／または心筋前駆細胞を抽出する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
N-カドヘリンが陽性であることを指標として心筋細胞および／または心筋前駆細胞を抽出する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
前記心筋細胞および／または心筋前駆細胞がヒト心筋細胞および／またはヒト心筋前駆細胞である、請求項１に記載の方法。
前記心筋細胞および／または心筋前駆細胞を含有する細胞集団が、多能性幹細胞から分化誘導された細胞集団または摘出組織細胞から成る細胞集団である、請求項１に記載の方法。
前記心筋細胞および／または心筋前駆細胞への分化誘導が、サイトカインを含有する培地で培養する工程を含む分化誘導である、請求項５に記載の方法。
前記サイトカインが、アクチビンAおよびBMP4から成る群より少なくとも一つ選択されるサイトカインである、請求項６に記載の方法。
心筋細胞および／または心筋前駆細胞を含有する細胞集団よりVCAM1が陽性であることを指標として心筋細胞および／または心筋前駆細胞を検出する工程を含む、心筋細胞および／または心筋前駆細胞の検出方法。
PDGFRβが陰性であることを指標として心筋細胞および／または心筋前駆細胞を検出する工程をさらに含む、請求項８に記載の方法。
N-カドヘリンが陽性であることをさらに指標として心筋細胞および／または心筋前駆細胞を検出する工程を含む、請求項８に記載の方法。
前記心筋細胞および／または心筋前駆細胞がヒト心筋細胞および／またはヒト心筋前駆細胞である、請求項８に記載の方法。
前記心筋細胞および／または心筋前駆細胞を含有する細胞集団が、多能性幹細胞から分化誘導された細胞集団または摘出組織細胞から成る細胞集団である、請求項８に記載の方法。
VCAM1に親和性を有する試薬を含む心筋細胞および／または心筋前駆細胞抽出または検出用キット。
PDGFRβに親和性を有する試薬をさらに含む、請求項１３に記載のキット。
N-カドヘリンに親和性を有する試薬をさらに含む、請求項１３に記載のキット。
前記心筋細胞および／または心筋前駆細胞がヒト心筋細胞および／またはヒト心筋前駆細胞である、請求項１３に記載のキット。