JPWO2016043168A1 - 多能性幹細胞由来心筋細胞集団の製造方法 - Google Patents
多能性幹細胞由来心筋細胞集団の製造方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2016043168A1 JPWO2016043168A1 JP2016548885A JP2016548885A JPWO2016043168A1 JP WO2016043168 A1 JPWO2016043168 A1 JP WO2016043168A1 JP 2016548885 A JP2016548885 A JP 2016548885A JP 2016548885 A JP2016548885 A JP 2016548885A JP WO2016043168 A1 JPWO2016043168 A1 JP WO2016043168A1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- laminin
- cells
- fragment
- cardiomyocytes
- cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 210000004413 cardiac myocyte Anatomy 0.000 title claims abstract description 173
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 62
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 46
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 323
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 88
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims abstract description 44
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 claims abstract description 29
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 claims abstract description 29
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 28
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims abstract description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 83
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 25
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 25
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 13
- 108010085895 Laminin Proteins 0.000 description 213
- 102000007547 Laminin Human genes 0.000 description 213
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 64
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 41
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 32
- 238000007667 floating Methods 0.000 description 25
- 102000004987 Troponin T Human genes 0.000 description 17
- 108090001108 Troponin T Proteins 0.000 description 17
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 11
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 10
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 10
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 9
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 8
- 230000008859 change Effects 0.000 description 8
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 8
- 230000002107 myocardial effect Effects 0.000 description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 8
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 8
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 7
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 7
- 108010049955 Bone Morphogenetic Protein 4 Proteins 0.000 description 6
- 102100024505 Bone morphogenetic protein 4 Human genes 0.000 description 6
- 210000002242 embryoid body Anatomy 0.000 description 6
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 5
- 102000016387 Pancreatic elastase Human genes 0.000 description 5
- 108010067372 Pancreatic elastase Proteins 0.000 description 5
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 5
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 5
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 5
- 230000036962 time dependent Effects 0.000 description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 108010030465 Integrin alpha6beta1 Proteins 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 210000002363 skeletal muscle cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 3
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 3
- 108010023082 activin A Proteins 0.000 description 3
- 210000004900 c-terminal fragment Anatomy 0.000 description 3
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 3
- 238000012758 nuclear staining Methods 0.000 description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 102100030074 Dickkopf-related protein 1 Human genes 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N HA peptide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N 0.000 description 2
- 101000864646 Homo sapiens Dickkopf-related protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 2
- 102100022762 R-spondin-1 Human genes 0.000 description 2
- 101710110302 R-spondin-1 Proteins 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 108010092830 integrin alpha7beta1 Proteins 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 108010049976 Bone Morphogenetic Protein 5 Proteins 0.000 description 1
- 102100022526 Bone morphogenetic protein 5 Human genes 0.000 description 1
- ZGSXEXBYLJIOGF-ALFLXDJESA-N IWR-1-endo Chemical compound C=1C=CC2=CC=CN=C2C=1NC(=O)C(C=C1)=CC=C1N1C(=O)[C@@H]2[C@H](C=C3)C[C@H]3[C@@H]2C1=O ZGSXEXBYLJIOGF-ALFLXDJESA-N 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000031146 intracellular signal transduction Effects 0.000 description 1
- 108010028309 kalinin Proteins 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 108010038862 laminin 10 Proteins 0.000 description 1
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 description 1
- 239000011435 rock Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004509 vascular smooth muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0657—Cardiomyocytes; Heart cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/34—Muscles; Smooth muscle cells; Heart; Cardiac stem cells; Myoblasts; Myocytes; Cardiomyocytes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0696—Artificially induced pluripotent stem cells, e.g. iPS
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
- C12N2533/50—Proteins
- C12N2533/52—Fibronectin; Laminin
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Virology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
[1](1)多能性幹細胞を心筋細胞へ分化誘導する工程、(2)分化誘導された細胞集団を、ラミニンα2β1γ1、ラミニンα2β2γ1、ラミニンα1β1γ1およびラミニンα1β2γ1からなる群より選択されるラミニンまたは該ラミニンのインテグリン結合活性を有するフラグメントと接触させる工程、および(3)前記ラミニンまたは前記フラグメントに付着した細胞を回収する工程、を含むことを特徴とする心筋細胞集団の製造方法。
[2]さらに、分化誘導された細胞集団から未分化細胞を除去する工程を含むことを特徴とする前記[1]に記載の製造方法。
[3]前記未分化細胞を除去する工程が、前記工程(1)と(2)の間に設けられ、(A)分化誘導された細胞集団を、ラミニンα5β1γ1、ラミニンα5β2γ1、ラミニンα3β1γ1、ラミニンα3β2γ1およびラミニンα3β3γ2からなる群より選択されるラミニンまたは該ラミニンのインテグリン結合活性を有するフラグメントと接触させる工程、および(B)前記ラミニンまたは前記フラグメントに付着しない細胞を回収する工程、を含むことを特徴とする前記[2]に記載の製造方法。
[4]前記工程(2)および/または工程(A)において、培養器の培養面または担体にコーティングされたラミニンまたは該ラミニンのインテグリン結合活性を有するフラグメントと、分化誘導された細胞集団を接触させることを特徴とする前記[1]〜[3]のいずれかに記載の製造方法。
[5]ラミニンのインテグリン結合活性を有するフラグメントが、ラミニンE8フラグメントである前記[1]〜[4]のいずれかに記載の製造方法。
[6]ラミニンE8フラグメントのコーティング濃度が0.1μg/cm2〜2μg/cm2である前記[5]に記載の製造方法。
[7]前記工程(2)における接触時間が15分〜180分である前記[5]または[6]に記載の製造方法。
[8]前記工程(A)における接触時間が5分〜30分である前記[5]〜[7]のいずれかに記載の製造方法。
[9]心筋細胞集団における心筋細胞の純度が50%〜90%である前記[1]〜[8]のいずれかに記載の製造方法。
[10]多能性幹細胞から心筋細胞へ分化誘導された細胞集団における心筋細胞の純度を向上させる方法であって、工程1:ラミニンα2β1γ1、ラミニンα2β2γ1、ラミニンα1β1γ1およびラミニンα1β2γ1からなる群より選択されるラミニンまたは該ラミニンのインテグリン結合活性を有するフラグメントと、前記細胞集団とを接触させる工程、および工程2:前記ラミニンまたは前記フラグメントに付着した細胞を回収する工程、を含むことを特徴とする方法。
[11]前記インテグリン結合活性を有するフラグメントが、ラミニンE8フラグメントである前記[10]に記載の方法。
本発明は、心筋細胞集団の製造方法(以下、「本発明の製造方法」という。)を提供する。本発明の製造方法は、以下の工程(1)、工程(2)および工程(3)を含むものであればよい。
(1)多能性幹細胞を心筋細胞へ分化誘導する工程
(2)分化誘導された細胞集団を、ラミニンα2β1γ1、ラミニンα2β2γ1、ラミニンα1β1γ1およびラミニンα1β2γ1からなる群より選択されるラミニンまたは該ラミニンのインテグリン結合活性を有するフラグメントと接触させる工程
(3)前記ラミニンまたは前記フラグメントに付着した細胞を回収する工程
また、本発明の製造方法は、工程(3)の後に、工程(3)で回収した細胞を培養する工程(4)を含んでもよい。
(A)分化誘導された細胞集団を、ラミニンα5β1γ1、ラミニンα5β2γ1、ラミニンα3β1γ1、ラミニンα3β2γ1およびラミニンα3β3γ2からなる群より選択されるラミニンまたは該ラミニンのインテグリン結合活性を有するフラグメントと接触させる工程
(B)前記ラミニンまたは前記フラグメントに付着しない細胞を回収する工程
ラミニン結合性インテグリンにはα3β1、α6β1、α6β4およびα7β1がある(Hynes et al., Cell Vol.110, 673-687, 2002)。これらのインテグリンの生体内での発現部位にはそれぞれ特徴があり、筋組織にはインテグリンα7β1が選択的に発現していることが知られている。また、インテグリンα7β1には、α7鎖の選択的スプライシングにより生じるα7X1β1とα7X2β1の2つのタイプがあり、心筋細胞や骨格筋細胞ではα7X2β1が主に発現していることが報告されている(Israeli-rosenberg et al., Circ Res. 2014;114:572-586)。インテグリンα7X2β1に対して結合特異性が高いラミニンとしては、ラミニンα2β1γ1、ラミニンα2β2γ1、ラミニンα1β1γ1、ラミニンα1β2γ1が報告されている(Taniguchi et al., The Journal of Biological Chemistry, 7820-7831, 2009)。したがって、工程(2)では、インテグリンα7X2β1に対して結合特異性が高いラミニンα2β1γ1、ラミニンα2β2γ1、ラミニンα1β1γ1またはラミニンα1β2γ1を用いることが好ましい。以下、それぞれラミニン211、ラミニン221、ラミニン111、ラミニン121と記す。
また、本発明の製造方法の工程(2)で用いるラミニンを細胞ごとに使い分けることにより、多能性幹細胞から分化誘導した様々な細胞を、当該ラミニンをコーティングした基材を用いて接着依存的に選別することが可能である。具体的には、ヒト多能性幹細胞から分化誘導した肝臓前駆細胞はラミニン111にインテグリンα6β1依存的に接着することが報告されている(Takayama K. et al. Stem Cell Reports 1:322-335, 2013)。ラミニン111は再生肝において一過的に発現することが報告されている(Kikkawa Y et al. Experimental Cell Research 305:99-109, 2005)。これらの知見を踏まえて、ヒト多能性幹細胞から分化誘導した肝臓前駆細胞を、ラミニン111をコーティングした基材を使って選別し、純化することが可能である。すなわち、本発明の製造方法において、工程(1)を多能性幹細胞を肝臓前駆細胞へ分化誘導する工程に変更し、工程(2)で用いるラミニンをラミニン111に変更することにより、肝臓前駆細胞の製造方法を提供することができる。
本発明は、多能性幹細胞から心筋細胞へ分化誘導された細胞集団における心筋細胞の純度を向上させる方法を提供する。本発明の心筋細胞の純度向上方法は、以下の工程1および工程2を含むものであればよい。
工程1:ラミニンα2β1γ1、ラミニンα2β2γ1、ラミニンα1β1γ1およびラミニンα1β2γ1からなる群より選択されるラミニンまたは該ラミニンのインテグリン結合活性を有するフラグメントと、前記細胞集団とを接触させる工程
工程2:前記ラミニンまたは前記フラグメントに付着した細胞を回収する工程
工程1および工程2の内容は、上記本発明の製造方法の工程(2)および工程(3)と同じである。本発明の心筋細胞の純度向上方法は、上記本発明の製造方法と同様に実施することができる。
(1)ヒトラミニンE8
ヒトラミニン511E8、ヒトラミニン332E8、ヒトラミニン311E8、ヒトラミニン221E8およびヒトラミニン211E8の5種類のヒトラミニンE8を使用した。以下、実施例において、それぞれ511E8、332E8、311E8、221E8および211E8と略記する。
511E8は、iMatrix−511(商品名、株式会社ニッピ)を購入して使用した。511E8以外のラミニンE8は、Idoら(Hiroyuki Ido et al., The Journal of Biological Chemistry, 282, 11144-11154, 2007)、Taniguchiら(Yukimasa Taniguchi et al., The Journal of Biological Chemistry, 7820-7831, 2009)に記載の方法に従って作製した。すなわち、ヒトα3鎖E8フラグメント(N末端側に6×Hisタグを含む)発現ベクター、ヒトα2鎖E8フラグメント(N末端側に6×Hisタグを含む)発現ベクター、ヒトβ3鎖E8フラグメント(N末端側にHAタグを含む)発現ベクター、ヒトβ2鎖E8フラグメント(N末端側にHAタグを含む)発現ベクター、ヒトβ1鎖E8フラグメント(N末端側にHAタグを含む)発現ベクター、ヒトγ2鎖E8フラグメント(N末端側にFLAGタグを含む)発現ベクターおよびヒトγ1鎖E8フラグメント(N末端側にFLAGタグを含む)発現ベクターをそれぞれ作成し、α鎖、β鎖およびγ鎖の組み合わせを選択して、ヒト腎臓由来293細胞にトランスフェクトし、72時間培養を行った後、培養液を回収し、Ni−NTA agaroseとANTI−FLAG M2 affinity Gelを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。
培養皿には、6穴または12穴マルチウェルプレート(BDファルコン社)を用いた。ラミニンE8を所望の濃度にPBSで希釈し、1ウェルあたり1ml(6穴)または0.4ml(12穴)を添加した。37℃で2時間以上静置した後、ラミニン液を除去し、PBSでプレート表面を2回洗浄した。培養皿のコーティングは、使用直前に行った。実施例1〜4および9では6穴マルチウェルプレートを用い、実施例5〜8では12穴マルチウェルプレートを用いた。
ヒトiPS細胞株253G1を理化学研究所から購入して使用した。Matsuuraら(Matsuura K et al., Biochem Biophys Res Commun, 2012 Aug 24;425(2):321-7, doi: 10.1016/j.bbrc.2012.07.089. Epub 2012 Jul 25)に記載の方法に従いリアクターを用いて心筋分化誘導を行った。具体的には、Primate ES培地(リプロセル社)に5ng/mlのbFGFを添加したものを未分化維持培地として用い、マイトマイシンC処理を行ったMEF上で未分化253G1細胞を培養した。10cm培養皿10枚分の未分化253G1細胞を、剥離液(リプロセル社)を用いて回収し、10μMのY27632(ROCK阻害剤)を添加したmTeSR培地(ステムセルテクノロジーズ)100mlに懸濁した後、ベッセルに移し、バイオリアクター(エイブル社)で撹拌培養を開始した。1日後、培地からY27632を除いた。1〜3日後に培地をStemPro−34(ライフテクノロジーズ)に置換し、3日〜4日後に0.5ng/mlのBMP4を添加し、4〜7日後に10ng/mlのBMP4と5ng/mlのbFGFと3ng/mlのアクチビンAを添加し、7〜9日後に4μMのIWR-1を添加し、9日目以降は5ng/mlのVEGFと10ng/mlのbFGFを添加して撹拌を続け、16〜18日後に細胞を回収した。
253G1細胞を心筋細胞に分化誘導した後、0.05%トリプシン−EDTA液(ライフテクノロジーズ)を用いて細胞塊をほぐし、70μmのメッシュフィルターで濾過して細胞懸濁液を調製した。毎分1500回転5分間遠心分離した。沈渣をPBSで懸濁し、再度毎分1500回転5分間遠心分離した。沈渣を1ml当り20万個細胞になるように培地(1%ウシ血清アルブミン含DMEM)で懸濁した。
ラミニンE8でコーティングした6穴マルチウェルプレートに、1ウェル当り3mlの細胞懸濁液(60万個の細胞)を播種した。または、ラミニンE8でコーティングした12穴マルチウェルプレートに、1ウェル当り1.2mlの細胞懸濁液(24万個の細胞)を播種した。一定の処理時間(接触時間)経過後、浮遊細胞および付着細胞を分別回収した。すなわち、培養上清を回収し、培養面をPBSで洗浄して洗浄液を回収し、再度培養面をPBSで洗浄して洗浄液を回収した。培養上清と2回の洗浄液に含まれる細胞を浮遊細胞とした。一方、PBSで2回洗浄した後の培養面にEDTA液を添加しピペッティングにて剥離させて細胞を回収した。さらにPBSで培養面を洗浄して洗浄液を回収した。EDTAで剥離した細胞とその後の洗浄液中の細胞を付着細胞とした。
それぞれ遠心分離(毎分1500回転5分間)の後、上清を除去した。沈渣を心筋型トロポニンT(心筋細胞を検出)またはBC2LCN(未分化細胞を検出)で染色し、フローサイトメトリーまたは免疫染色を用いて評価した。
253G1細胞を心筋細胞に分化誘導した後、511E8、311E8または332E8で30分間処理し、浮遊細胞および付着細胞をそれぞれ回収した。ラミニンE8の濃度は、0、1、2.5、5および10μg/ml(0、0.1、0.25、0.5および1μg/cm2)の5段階とした。回収した浮遊細胞および付着細胞におけるBC2LCN陽性細胞率(未分化細胞率)をそれぞれフローサイトメトリーで評価した。
結果を図1に示した。上段が未分化細胞率であり、下段が細胞回収数である。図中LN511は511E8、LN311は311E8、LN332は332E8をそれぞれ表す。ラミニン処理前の未分化細胞率は1.7%であったのに対し、いずれのラミニンE8で処理した場合も、浮遊細胞中の未分化細胞率は濃度依存的に減少した。特に511E8では、低濃度でも未分化細胞率の減少を認め、コーティング濃度0.5μg/cm2の未分化細胞率は0.8%まで減少した。回収した浮遊細胞数は、いずれのラミニンE8で処理した場合も濃度依存的に減少した。
253G1細胞を心筋細胞に分化誘導した後、コーティング濃度0.5μg/cm2の511E8または1μg/cm2の221E8で30分間処理し、浮遊細胞および付着細胞をそれぞれ回収した。回収した浮遊細胞および付着細胞におけるBC2LCN陽性細胞率(未分化細胞率)をそれぞれフローサイトメトリーで評価した。
結果を図2に示した。図中LN511は511E8、LN221は221E8をそれぞれ表す。処理前は未分化細胞率が2.5%であったのに対し、0.5μg/cm2の511E8で処理後の浮遊細胞における未分化細胞率は1.6%に低下した。また、付着細胞における未分化細胞率は3.7%に上昇した。一方、1μg/cm2のラミニン221で処理後の浮遊細胞および付着細胞における未分化細胞率はいずれも2.7%であった。
253G1細胞を心筋細胞に分化誘導した後、221E8、211E8または511E8で30分間処理し、浮遊細胞および付着細胞をそれぞれ回収した。ラミニンE8のコーティング濃度は、0、0.25、0.5、1および2μg/cm2の5段階とした。回収した浮遊細胞および付着細胞における心筋型トロポニンT陽性細胞率(心筋細胞率)をそれぞれフローサイトメトリーで評価した。
結果を図3に示した。上段が心筋型トロポニンT陽性細胞率(心筋細胞率)であり、下段が細胞回収数である。図中LN221は221E8、LN211は211E8、LN511は511E8をそれぞれ表す。ラミニン処理前の心筋細胞率は18.5%であった。浮遊細胞における心筋細胞率は、いずれのラミニンE8で処理した場合も処理前の値とほぼ同等であったのに対し、221E8または211E8で処理した付着細胞における心筋細胞率は共に上昇した。一方、511E8で処理した場合は、付着細胞および浮遊細胞における心筋細胞率に大きな差は認められなかった。回収した付着細胞数は、いずれのラミニンE8で処理した場合も濃度依存的に上昇した。
253G1細胞を心筋細胞に分化誘導した後、コーティング濃度1μg/cm2の221E8で処理し、経時的に付着細胞を回収して、その細胞数と心筋細胞率(心筋型トロポニンT陽性細胞率)をフローサイトメトリーで評価した。
結果を図4A、B、Cに示した。Aは221E8の処理時間が15、20、25および30分の付着細胞数、Bは221E8の処理時間が0.5、1、8および24時間の付着細胞数(Aの実験とは別の実験の結果)、Cは221E8の処理時間が15、20、25、30および60分の付着細胞数における心筋細胞率である。なお、接触時間0の心筋細胞率は221E8処理前の心筋細胞率である。付着細胞数は221E8の処理時間が15〜30分の間で経時的に増加し(図4A)、1〜8時間で漸増した後、24時間まで減少傾向にあった(図4B)。221E8の処理前の心筋細胞率は16.1%であった。221E8の処理後15分における心筋細胞率は35.9%に上昇しており、その後経時的に減少傾向が認められた(図4C)。
253G1細胞を心筋細胞に分化誘導した後、コーティング濃度1μg/cm2の511E8、211E8または221E8で処理し、処理開始から15分、30分、60分、120分後に浮遊細胞を回収し、回収した浮遊細胞の細胞数と未分化細胞率(BC2LCN陽性細胞率)をフローサイトメトリーで評価した。未分化細胞率は処理前の未分化細胞数に対する変化率、すなわち処理後のBC2LCN陽性細胞数を処理前のBC2LCN陽性細胞数で除算した値で表した。
(1)処理時間(接触時間)による心筋細胞率および付着細胞数の変化
253G1細胞を心筋細胞に分化誘導した後、コーティング濃度1μg/cm2の511E8、211E8または221E8で処理し、処理開始から15分、30分、60分、120分後に付着細胞を回収し、回収した付着細胞の細胞数と心筋細胞率(心筋型トロポニンT陽性細胞率)をフローサイトメトリーで評価した。心筋細胞率は処理前の心筋細胞数に対する変化率、すなわち処理後の心筋型トロポニンT陽性細胞数を処理前の心筋型トロポニンT陽性細胞数で除算した値で表した。
253G1細胞を心筋細胞に分化誘導した後、511E8、211E8または221E8を0.25、0.5、1および2μg/cm2の4段階のコーティング濃度で処理し、処理開始から30分後に付着細胞を回収し、回収した付着細胞の細胞数と心筋細胞率(心筋型トロポニンT陽性細胞率)をフローサイトメトリーで評価した。心筋細胞率は処理前の心筋細胞数に対する変化率、すなわち処理後の心筋型トロポニンT陽性細胞数を処理前の心筋型トロポニンT陽性細胞数で除算した値で表した。
253G1細胞を心筋細胞に分化誘導した後、コーティング濃度1μg/cm2の511E8または221E8で30分間処理し、付着細胞を回収して心筋細胞率(心筋型トロポニンT陽性細胞率)をフローサイトメトリーで測定した。また、30分間処理後浮遊細胞を除去し、1μg/cm2の511E8または221E8をコーティングしたプレートで付着細胞を3日間培養し、心筋型トロポニンT陽性細胞を免疫染色した。対比染色としてDAPIを用いて核染色を行った。
253G1細胞を心筋細胞に分化誘導した後、すなわち、上記〔実験材料および方法〕の(3)の方法で16〜18日後に回収した細胞を等量ずつ2本に分け、一方は無糖培地処理に供し、他方は221E8処理に供した。
無糖培地処理はTohyamaらの方法(Shugo Tohyama et al., Cell Stem Cell, 12, 127-137, 2013)に従って行った。すなわち、分化誘導後にトリプシン−EDTA処理を行わず、胚様体のまま無糖培地、すなわちグルコースを含まないDMEM培地(ライフテクノロジーズ)に4mMの乳酸(和光純薬)を添加したもので6日間培養した。対照としては、上記無糖培地の代わりに通常培地(1%ウシ血清アルブミン含DMEM)を用いて培養した細胞を用いた。3時間後および3日後に培地を交換した。6日後に0.05%トリプシン−EDTAで胚様体をほぐし、細胞を回収した。
221E8処理群は0.05%トリプシン−EDTAで胚様体をほぐした後、221E8を1μg/cm2の濃度でコーティングしたプレートで処理した。対照としては、221E8の代わりにウシ胎児血清をコートしたプレート上で処理した細胞を用いた。処理開始から3時間後に非付着細胞を除去した。付着した細胞に新しい培地を加え、同一のプレート、すなわち221E8を1μg/cm2の濃度でコーティングしたプレートまたはウシ胎児血清をコーティングしたプレートで6日間培養した。3日後に培地交換を行い、6日後に0.05%トリプシン−EDTAで処理して細胞を回収した。
6日後に回収した各群の細胞について、心筋型トロポニンT陽性細胞率(心筋細胞率)およびBC2LCN陽性率(未分化細胞率)をフローサイトメトリーで評価した。
図9Aに示したように、回収細胞数は胚様体のまま培養した無糖培地群およびその対照群では10万個程度であったのに対し、接着培養を行った221E8処理群およびその対照群では100万個以上と顕著に高く、無糖培地処理と比べて221E8処理は細胞毒性が低く、加えて心筋細胞の維持にも有効であることを示している。
図9Bに示したように、処理前の心筋細胞率は42.1%であった(図9Bのグラフ上の横線)。6日間培養後の心筋細胞率は、無糖培地対照群(通常の胚様体培養)が25.6%であったのに対し、無糖培地群は38.7%に上昇した。また、221E8処理対照群(通常の接着培養)が42.6%であったのに対し、221E8処理群は57.2%に上昇した。いずれの処理も対照群と比較して心筋細胞率が上昇したが、221E8処理群の心筋細胞率は処理前の心筋細胞率より顕著に高くなっていた。
図9Cに示したように、6日間培養後の未分化細胞率は、無糖培地対照群(通常の胚様体培養)が13.8%であったのに対し、無糖培地群は0.5%であった。また、221E8処理対照群(通常の接着培養)が1.4%であったのに対し、221E8処理群は0.4%であった。対照群と比較した場合、相対的な未分化細胞除去率は、無糖培地処理の方が221E8処理より高くなっているが、処理後の未分化細胞率はどちらも0.4%〜0.5%であり、未分化細胞の残存率という観点では両者はほぼ同等であった。
Claims (11)
- (1)多能性幹細胞を心筋細胞へ分化誘導する工程、
(2)分化誘導された細胞集団を、ラミニンα2β1γ1、ラミニンα2β2γ1、ラミニンα1β1γ1およびラミニンα1β2γ1からなる群より選択されるラミニンまたは該ラミニンのインテグリン結合活性を有するフラグメントと接触させる工程、および
(3)前記ラミニンまたは前記フラグメントに付着した細胞を回収する工程、
を含むことを特徴とする心筋細胞集団の製造方法。 - さらに、分化誘導された細胞集団から未分化細胞を除去する工程を含むことを特徴とする請求項1に記載の製造方法。
- 前記未分化細胞を除去する工程が、前記工程(1)と(2)の間に設けられ、
(A)分化誘導された細胞集団を、ラミニンα5β1γ1、ラミニンα5β2γ1、ラミニンα3β1γ1、ラミニンα3β2γ1およびラミニンα3β3γ2からなる群より選択されるラミニンまたは該ラミニンのインテグリン結合活性を有するフラグメントと接触させる工程、および
(B)前記ラミニンまたは前記フラグメントに付着しない細胞を回収する工程、
を含むことを特徴とする請求項2に記載の製造方法。 - 前記工程(2)および/または工程(A)において、培養器の培養面または担体にコーティングされたラミニンまたは該ラミニンのインテグリン結合活性を有するフラグメントと、分化誘導された細胞集団を接触させることを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載の製造方法。
- ラミニンのインテグリン結合活性を有するフラグメントが、ラミニンE8フラグメントである請求項1〜4のいずれかに記載の製造方法。
- ラミニンE8フラグメントのコーティング濃度が0.1μg/cm2〜2μg/cm2である請求項5に記載の製造方法。
- 前記工程(2)における接触時間が15分〜180分である請求項5または6に記載の製造方法。
- 前記工程(A)における接触時間が5分〜30分である請求項5〜7のいずれかに記載の製造方法。
- 心筋細胞集団における心筋細胞の純度が50%〜90%である請求項1〜8のいずれかに記載の製造方法。
- 多能性幹細胞から心筋細胞へ分化誘導された細胞集団における心筋細胞の純度を向上させる方法であって、
工程1:ラミニンα2β1γ1、ラミニンα2β2γ1、ラミニンα1β1γ1およびラミニンα1β2γ1からなる群より選択されるラミニンまたは該ラミニンのインテグリン結合活性を有するフラグメントと、前記細胞集団とを接触させる工程、および
工程2:前記ラミニンまたは前記フラグメントに付着した細胞を回収する工程、
を含むことを特徴とする方法。 - 前記インテグリン結合活性を有するフラグメントが、ラミニンE8フラグメントである請求項10に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2014188180 | 2014-09-16 | ||
JP2014188180 | 2014-09-16 | ||
PCT/JP2015/076072 WO2016043168A1 (ja) | 2014-09-16 | 2015-09-14 | 多能性幹細胞由来心筋細胞集団の製造方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2016043168A1 true JPWO2016043168A1 (ja) | 2017-06-22 |
JP6265515B2 JP6265515B2 (ja) | 2018-01-24 |
Family
ID=55533205
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2016548885A Active JP6265515B2 (ja) | 2014-09-16 | 2015-09-14 | 多能性幹細胞由来心筋細胞集団の製造方法 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US10696948B2 (ja) |
EP (1) | EP3196297B1 (ja) |
JP (1) | JP6265515B2 (ja) |
CN (1) | CN106715685B (ja) |
WO (1) | WO2016043168A1 (ja) |
Families Citing this family (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109937251B (zh) * | 2016-11-11 | 2023-12-29 | 国立大学法人大阪大学 | 由多能干细胞向体细胞的分化诱导方法 |
JP2018093823A (ja) * | 2016-12-15 | 2018-06-21 | Heartseed株式会社 | 未分化幹細胞除去剤及び未分化幹細胞除去方法 |
KR102241349B1 (ko) * | 2017-01-13 | 2021-04-15 | 고꾸리쯔 다이가꾸 호우징 오사까 다이가꾸 | 각막상피세포 집단의 제조 방법 |
US20200283735A1 (en) | 2017-09-29 | 2020-09-10 | National University Corporation Tokyo Medical And Dental University | Organoid and method for producing the same |
US20230084457A1 (en) * | 2020-02-10 | 2023-03-16 | Public University Corporation Nagoya City University | Coating agent for inducing differentiation of pluripotent stem cells into brain microvascular endothelium-like cells and use thereof |
WO2021187602A1 (ja) * | 2020-03-19 | 2021-09-23 | 国立大学法人京都大学 | 心筋細胞の精製方法 |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2003339373A (ja) * | 2002-05-24 | 2003-12-02 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 細胞の分別法 |
JP2008543338A (ja) * | 2005-06-22 | 2008-12-04 | ジェロン・コーポレーション | 心筋細胞系列細胞への霊長類多能性幹細胞の分化 |
JP2011078370A (ja) * | 2009-10-08 | 2011-04-21 | Osaka Univ | ヒト多能性幹細胞用培養基材およびその利用 |
JP2012100625A (ja) * | 2010-11-12 | 2012-05-31 | Zhonggang Feng | 細胞分離のための細胞富化方法 |
WO2014014119A1 (en) * | 2012-07-17 | 2014-01-23 | Kyoto University | Novel cardiomyocyte marker |
JP2014511139A (ja) * | 2011-03-31 | 2014-05-12 | 国立大学法人京都大学 | 新規心筋細胞マーカー |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR2896511B1 (fr) * | 2006-01-26 | 2012-10-26 | Centre Nat Rech Scient | Procede de culture de cellules issues du tissu adipeux et leurs applications. |
SG169359A1 (en) | 2006-01-31 | 2011-03-30 | Univ Keio | A method for purifying cardiomyocytes or programmed cardiomyocytes derived from stem cells or fetuses |
JP2010207133A (ja) | 2009-03-10 | 2010-09-24 | Sony Corp | 細胞分離方法 |
WO2012056997A1 (ja) | 2010-10-28 | 2012-05-03 | 国立大学法人熊本大学 | 多能性幹細胞の分化誘導効率を改善するための方法及び培地 |
JP5761826B2 (ja) | 2011-04-08 | 2015-08-12 | 国立大学法人大阪大学 | 改変ラミニンおよびその利用 |
WO2012147992A1 (en) | 2011-04-25 | 2012-11-01 | The Ritsumeikan Trust | ANTI-iPS/ES CELL-SPECIFIC ANTIBODY AND USE THEREOF |
WO2013156855A1 (en) * | 2012-04-20 | 2013-10-24 | Biolamina Ab | Maintenance of differentiated cells with laminins |
US20130330825A1 (en) * | 2012-06-07 | 2013-12-12 | City Of Hope | Attachment substrates for directed differentiation of human embryonic stem cells in culture |
DK3017038T3 (da) | 2013-07-02 | 2019-08-19 | Nat Univ Singapore | Differentiering af pluripotente stamceller og hjerteprogenitorceller i tværstribede kardiomyocytfibre under anvendelse af lamininer ln-511, ln-521 og ln-221 |
-
2015
- 2015-09-14 EP EP15841142.1A patent/EP3196297B1/en active Active
- 2015-09-14 WO PCT/JP2015/076072 patent/WO2016043168A1/ja active Application Filing
- 2015-09-14 JP JP2016548885A patent/JP6265515B2/ja active Active
- 2015-09-14 US US15/511,275 patent/US10696948B2/en active Active
- 2015-09-14 CN CN201580050669.4A patent/CN106715685B/zh active Active
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2003339373A (ja) * | 2002-05-24 | 2003-12-02 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 細胞の分別法 |
JP2008543338A (ja) * | 2005-06-22 | 2008-12-04 | ジェロン・コーポレーション | 心筋細胞系列細胞への霊長類多能性幹細胞の分化 |
JP2011078370A (ja) * | 2009-10-08 | 2011-04-21 | Osaka Univ | ヒト多能性幹細胞用培養基材およびその利用 |
JP2012100625A (ja) * | 2010-11-12 | 2012-05-31 | Zhonggang Feng | 細胞分離のための細胞富化方法 |
JP2014511139A (ja) * | 2011-03-31 | 2014-05-12 | 国立大学法人京都大学 | 新規心筋細胞マーカー |
WO2014014119A1 (en) * | 2012-07-17 | 2014-01-23 | Kyoto University | Novel cardiomyocyte marker |
Non-Patent Citations (11)
Title |
---|
BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN., vol. 375, JPN6014033683, 2008, pages 27 - 32, ISSN: 0003692732 * |
LEE, S.T., ET AL.: "Development of three dimensional culture and expression of integrin heterodimers in human embryonic", ORGANOGENESIS, vol. 9(3), JPN6015050045, 2013, pages 143 - 148, ISSN: 0003692724 * |
LEUNG, E., ET AL.: "A Novel Extracellular Domain Variant of the Human Integrin α7 Subunit Generated by Alternative Intr", BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN., vol. 243, JPN6015050037, 1998, pages 317 - 325, XP055418167, ISSN: 0003692726 * |
MAITRA, N., ET AL.: "Expression of α and β integrins during terminal differentiation of cardiomyocytes", CARDIOVASCULAR RESEARCH, vol. 47, JPN6015050038, 2000, pages 715 - 725, XP055418142, ISSN: 0003692727, DOI: 10.1016/S0008-6363(00)00140-1 * |
MATRIX BIOLOGY, vol. 25, JPN6014033685, 2006, pages 189 - 197, ISSN: 0003692730 * |
SINGH, A., ET AL.: "Adhesion strength-based, label-free isolation of human pluripotent stem cells", NATURE METHODS, vol. 10(5), JPN6015050042, 2013, pages 438 - 444, ISSN: 0003692733 * |
TANIGUCHI, Y., ET AL.: "The C-terminal Region of Laminin β Chains Modulates the Integrin Binding Affinities of Laminins", J. BIOL. CHEM., vol. 284(12), JPN6014013816, 20 March 2009 (2009-03-20), pages 7820 - 7831, ISSN: 0003692731 * |
VON DER MARK, H., ET AL.: "Alternative Splice Variants of α7β1 Integrin Selectively Recognize Different Laminin Isoforms", J. BIOL. CHEM., vol. 277(8), JPN6015050040, 2002, pages 6012 - 6016, ISSN: 0003692728 * |
ZIOBER, B.L., ET AL.: "Alternative Extracellular and Cytoplasmic Domains of the Integrin α7 Subunit Are Differentially Exp", J. BIOL. CHEM., vol. 268(35), JPN6015050035, 1993, pages 26773 - 26783, XP055418138, ISSN: 0003692725 * |
今西悠基子ら: "ヒトiPS由来心筋細胞におけるラミニン用いた細胞精製法の検討", 再生医療, vol. 14(suppl.), JPN6015050046, 1 February 2015 (2015-02-01), pages 355, ISSN: 0003692723 * |
西内涼子ら: "細胞接着因子の生物学", ティッシュエンジニアリング2007, vol. 第1版第1刷, JPN6010071893, 27 June 2007 (2007-06-27), pages 88 - 95, ISSN: 0003692729 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US10696948B2 (en) | 2020-06-30 |
JP6265515B2 (ja) | 2018-01-24 |
EP3196297A1 (en) | 2017-07-26 |
US20190153391A1 (en) | 2019-05-23 |
CN106715685B (zh) | 2021-04-02 |
EP3196297B1 (en) | 2020-11-04 |
CN106715685A (zh) | 2017-05-24 |
EP3196297A4 (en) | 2018-03-07 |
WO2016043168A1 (ja) | 2016-03-24 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6265515B2 (ja) | 多能性幹細胞由来心筋細胞集団の製造方法 | |
JP6850455B2 (ja) | 網膜色素上皮細胞の製造方法 | |
CN108350417B (zh) | 使用含有层粘连蛋白片段的培养基的细胞培养方法 | |
AU2018215170B2 (en) | Differentiation control method for pluripotent stem cells | |
JP2023052609A (ja) | 細胞培養物の製造方法 | |
EP3540049B1 (en) | Method for inducing pluripotent stem cells to differentiate into somatic cells | |
JP2010158206A (ja) | ヒト心筋前駆細胞の選別方法 | |
JP6916523B2 (ja) | 筋衛星細胞培養用材料および筋衛星細胞の培養方法 | |
CN110168076B (zh) | 角膜上皮细胞群的制造方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A529 | Written submission of copy of amendment under article 34 pct |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A5211 Effective date: 20170310 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20170310 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170605 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20171205 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20171215 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6265515 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |