CN106715685B - 来自多能干细胞的心肌细胞群的制造方法 - Google Patents

来自多能干细胞的心肌细胞群的制造方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种在短时间内以简便的操作使用由多能干细胞向心肌细胞分化诱导后的细胞群来制造能够用于临床的、安全且损伤小的心肌细胞群的方法。本发明为心肌细胞群的制造方法，其包含：(1)将多能干细胞向心肌细胞分化诱导的工序，(2)使分化诱导后的细胞群与选自由层粘连蛋白α2β1γ1、层粘连蛋白α2β2γ1、层粘连蛋白α1β1γ1及层粘连蛋白α1β2γ1组成的组中的层粘连蛋白或者该层粘连蛋白的具有整联蛋白结合活性的片段接触的工序，及(3)回收附着于上述层粘连蛋白或上述片段的细胞的工序。

Description

来自多能干细胞的心肌细胞群的制造方法
技术领域
本发明涉及来自多能干细胞的心肌细胞群的制造方法。
背景技术
作为由人多能干细胞向心肌细胞的分化诱导方法，已经报道了例如下述方法：使用激活素A和骨形成蛋白4(Bone Morphogenetic Protein 4，BMP4)对在饲养细胞上维持培养的人多能干细胞进行分化诱导的方法(非专利文献1、2)，使用Wnt3a、R-Spondin-1及DKK1对在Matrigel上维持培养的人多能干细胞进行分化诱导的方法(非专利文献3)，使用生物反应器对在饲养细胞上维持培养的人多能干细胞大量地进行分化诱导的方法(非专利文献3)等。
在进行由多能干细胞向心肌细胞的分化诱导时，通常会在批次间观察到该心肌细胞分化效率不稳定。在作为再生医疗的移植细胞源使用时，在作为移植细胞的心肌细胞纯度不满足基准值时则有必要对心肌细胞进行纯化。关于用于再生医疗的来自人多能干细胞的心肌细胞的纯度，有报道指出：并非必须以100％为目标，反而是70％左右时在功能性方面更良好(非专利文献4)。因此，将来自人多能干细胞的心肌细胞纯度小于70％的细胞群的心肌细胞纯度提高到70％左右，特别是在细胞治疗中的移植细胞制备中意义重大。此外，由于难以将心肌细胞分化效率在批次间调整到同一程度，因此可预测，在药物开发筛选研究中分化效率的批次间差异会影响结果的重复性。进而，为了灵敏地检测心肌细胞的药剂响应性，需要使除心肌细胞以外的细胞所产生的背景强度为最低限度。
已经报道了几种提高分化诱导后的心肌细胞的纯度的方法，大体上可以分为两类方法。第一类方法为利用细胞营养缺陷的方法，即使用去除了除心肌细胞以外的细胞生存所必需的营养源的培养基进行培养，来除去心肌细胞以外的细胞。例如，专利文献1记载了用低葡萄糖浓度的培养基来提高心肌细胞的纯度的方法。但是，担心该方法不仅损伤除心肌细胞以外的细胞，连心肌细胞也会损伤显著。此外，还存在心肌细胞的挑选需要长时间(至少数天)的问题。
第二类方法是用针对心肌细胞特异性表面抗原、糖链的抗体来分离获得心肌细胞的方法，即使用流式细胞术、磁珠的方法。但是，用流式细胞术分离获得细胞时，存在根据所需的细胞量而需要相当长的时间的问题。此外，存在担心使用流式细胞术、磁珠而使所回收的细胞损伤、污染的问题。因此，在像细胞移植这样需要大量细胞的情况下，采用该方法是不现实的。进而，使用该方法时，需要评价抗体、磁珠的残存，需要时间和功夫。如果检测到磁珠残存，则难以确保移植细胞的安全性。
就纯化来自人多能干细胞的分化细胞来制备移植用细胞的理想方法而言，不仅要提高分化细胞的纯度、细胞收获量，而且要确保对于接受移植的人的安全性，同时可以制备出移植后可在体内发挥目标功能的细胞，这些都是不可或缺的。更理想的是，期望一种对细胞的损伤低、且可以在短时间内处理大量细胞的简单方法。但是，很难说通过目前报道的方法可以制备能够用于临床的细胞。因此，迫切需要开发出能够简便且大量地制备能够用于临床的细胞、即安全且损伤少的细胞的新方法。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2013-143968号公报
非专利文献
非专利文献1：Yang L et al.,Nature,2008 May 22；453(7194):524-8,doi:10.1038/nature06894,Epub 2008 Apr 23
非专利文献2：Takahashi K et al.,Cell,2007 Nov 30；131(5):861-72
非专利文献3：Kawamura M et al.,Circulation,2012 Sep 11；126(11Suppl 1):S29-37
非专利文献4：Thavandiran N et al.,Proc Natl Acad Sci U S A.2013 Dec 3；110(49):E4698-707,doi:10.1073/pnas.1311120110,Epub 2013 Nov 19
发明内容
发明所要解决的问题
本发明的课题在于，提供一种在短时间内以简便的操作使用由多能干细胞向心肌细胞分化诱导后的细胞群来制造能够用于临床的、安全且损伤少的心肌细胞群的方法。
用于解决问题的方法
为了解决上述课题，本发明包括以下的各发明。
[1]一种心肌细胞群的制造方法，其特征在于，包含：(1)将多能干细胞向心肌细胞分化诱导的工序，(2)使分化诱导后的细胞群与选自由层粘连蛋白α2β1γ1、层粘连蛋白α2β2γ1、层粘连蛋白α1β1γ1及层粘连蛋白α1β2γ1组成的组中的层粘连蛋白或者该层粘连蛋白的具有整联蛋白结合活性的片段接触的工序，及(3)回收附着于上述层粘连蛋白或上述片段的细胞的工序。
[2]根据上述[1]所述的制造方法，其特征在于，还包含从分化诱导后的细胞群除去未分化细胞的工序。
[3]根据上述[2]所述的制造方法，其特征在于，上述除去未分化细胞的工序设置在上述工序(1)和(2)之间，上述除去未分化细胞的工序包含：(A)使分化诱导后的细胞群与选自由层粘连蛋白α5β1γ1、层粘连蛋白α5β2γ1、层粘连蛋白α3β1γ1、层粘连蛋白α3β2γ1及层粘连蛋白α3β3γ2组成的组中的层粘连蛋白或者该层粘连蛋白的具有整联蛋白结合活性的片段接触的工序，及(B)回收未附着于上述层粘连蛋白或上述片段的细胞的工序。
[4]根据上述[1]～[3]中任一项所述的制造方法，其特征在于，在上述工序(2)和/或工序(A)中，使包被在培养器具的培养面或载体上的层粘连蛋白或该层粘连蛋白的具有整联蛋白结合活性的片段与分化诱导后的细胞群接触。
[5]根据上述[1]～[4]中任一项所述的制造方法，其中，层粘连蛋白的具有整联蛋白结合活性的片段为层粘连蛋白E8片段。
[6]根据上述[5]所述的制造方法，其中，层粘连蛋白E8片段的包被浓度为0.1μg/cm2～2μg/cm2。
[7]根据上述[5]或[6]所述的制造方法，其中，上述工序(2)中的接触时间为15分钟～180分钟。
[8]根据上述[5]～[7]中任一项所述的制造方法，其中，上述工序(A)中的接触时间为5分钟～30分钟。
[9]根据上述[1]～[8]中任一项所述的制造方法，其中，心肌细胞群的心肌细胞的纯度为50％～90％。
[10]一种提高由多能干细胞向心肌细胞分化诱导后的细胞群的心肌细胞的纯度的方法，其特征在于，包含以下工序1及工序2，工序1：使选自由层粘连蛋白α2β1γ1、层粘连蛋白α2β2γ1、层粘连蛋白α1β1γ1及层粘连蛋白α1β2γ1组成的组中的层粘连蛋白或该层粘连蛋白的具有整联蛋白结合活性的片段与上述细胞群接触的工序，工序2：回收附着于上述层粘连蛋白或上述片段的细胞的工序。
[11]根据上述[10]所述的方法，其中，上述具有整联蛋白结合活性的片段为层粘连蛋白E8片段。
发明效果
根据本发明，可以在短时间内以简便的操作使用由多能干细胞向心肌细胞分化诱导后的细胞群来制造能够用于临床的、安全且损伤少的心肌细胞群。此外，根据本发明，可以在短时间内以简便的操作提高由多能干细胞向心肌细胞分化诱导后的细胞群的心肌细胞的纯度。
附图说明
图1是示出研究使用人层粘连蛋白E8片段(511E8、311E8、332E8)来除去由人iPS细胞分化诱导成心肌细胞的细胞群中的未分化细胞的结果的图。
图2是示出将人层粘连蛋白511E8片段对未分化细胞的特异性与人层粘连蛋白221E8片段对未分化细胞的特异性进行比较研究的结果的图。
图3是示出对使用人层粘连蛋白E8片段(221E8、211E8、511E8)来提高由人iPS细胞分化诱导成心肌细胞的细胞群的心肌细胞率、以及所使用的人层粘连蛋白E8片段对心肌细胞的特异性进行研究的结果的图。
图4是示出用人层粘连蛋白221E8片段处理由人iPS细胞分化诱导成心肌细胞的细胞群、经时地回收附着细胞、研究附着细胞中的心肌细胞率的结果的图。
图5是示出对于使用人层粘连蛋白E8片段(511E8、221E8、211E8)来除去由人iPS细胞分化诱导成心肌细胞的细胞群中的未分化细胞、改变处理时间(接触时间)进行研究的结果的图。
图6是示出对于使用人层粘连蛋白E8片段(511E8、221E8、211E8)来进行由人iPS细胞分化诱导成心肌细胞的细胞群的心肌细胞的纯化、改变处理时间(接触时间)进行研究的结果的图。
图7是示出对于使用人层粘连蛋白E8片段(511E8、221E8、211E8)来进行由人iPS细胞分化诱导成心肌细胞的细胞群的心肌细胞的纯化、改变人层粘连蛋白E8片段的包被浓度进行研究的结果的图。
图8是示出对221E8处理和511E8处理时的由人iPS细胞分化诱导成心肌细胞的细胞群的心肌细胞富集效果进行比较的结果的图。
图9是示出对221E8处理和无糖培养基处理时的由人iPS细胞分化诱导成心肌细胞的细胞群的心肌细胞的纯化进行比较的结果的图。
具体实施方式
〔心肌细胞群的制造方法〕
本发明提供一种心肌细胞群的制造方法(以下称为“本发明的制造方法”)。本发明的制造方法包含以下的工序(1)、工序(2)及工序(3)即可：
(1)将多能干细胞向心肌细胞分化诱导的工序；
(2)使分化诱导后的细胞群与选自由层粘连蛋白α2β1γ1、层粘连蛋白α2β2γ1、层粘连蛋白α1β1γ1及层粘连蛋白α1β2γ1组成的组中的层粘连蛋白或者该层粘连蛋白的具有整联蛋白结合活性的片段接触的工序；
(3)回收附着于上述层粘连蛋白或上述片段的细胞的工序。
本发明的制造方法优选还包含从由多能干细胞向心肌细胞分化诱导后的细胞群除去未分化细胞的工序。该除去未分化细胞的工序优选设置在工序(1)和(2)之间。通常认为，来自多能干细胞的心肌细胞群中残存的未分化细胞越少，则移植细胞的安全性越提高。
此外，本发明的制造方法中，在工序(3)之后可以包含对工序(3)所回收的细胞进行培养的工序(4)。
上述除去未分化细胞的工序可以适当使用公知的未分化细胞除去方法。作为公知的未分化细胞除去方法，可以列举：国际公开WO2012/056997号中记载的方法、国际公开WO2012/147992号中记载的方法、国际公开WO2012/133674号中记载的方法、国际公开WO2012/012803号(日本特表2013-535194)中记载的方法、国际公开WO2012/078153号(日本特表2014-501518)中记载的方法、日本特开2013-143968号公报及Cell Stem Cell Vol.12January 2013,Page 127-137中记载的方法、PNAS 2013Aug 27；110(35):E3281-90中记载的方法等。
本发明的制造方法中，优选使用包含以下的工序(A)及工序(B)的方法作为上述除去未分化细胞的方法：
(A)使分化诱导后的细胞群与选自由层粘连蛋白α5β1γ1、层粘连蛋白α5β2γ1、层粘连蛋白α3β1γ1、层粘连蛋白α3β2γ1及层粘连蛋白α3β3γ2组成的组中的层粘连蛋白或者该层粘连蛋白的具有整联蛋白结合活性的片段接触的工序；
(B)回收未附着于上述层粘连蛋白或上述片段的细胞的工序。
通过本发明的制造方法制造的“心肌细胞群”是指包含由多能干细胞分化诱导的心肌细胞的细胞群。“心肌细胞群”的心肌细胞中包括成熟心肌细胞及心肌前体细胞两者。此外，“心肌细胞群”中还可以包含除心肌细胞以外的细胞。作为除心肌细胞以外的细胞，可以列举例如：由多能干细胞向心肌细胞分化过程中的细胞。此外，还可以包含由多能干细胞分化的血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、其它细胞。所得到的心肌细胞群可以优选作为临床中用于移植治疗的心肌细胞群使用。例如，可以用于制作移植用心肌片层，或者用于通过导管或注射针直接注入心脏。此外，所得到的心肌细胞群作为药物开发筛选、发生研究等研究用细胞也是非常有用的。
作为本发明的制造方法中使用的多能干细胞，可以列举：ES细胞(胚胎干细胞)、iPS细胞(诱导多能干细胞)、mGS细胞(多能生殖干细胞)、ES细胞与体细胞的融合细胞等。优选ES细胞或iPS细胞，更优选iPS细胞。多能干细胞优选为来自哺乳动物的干细胞。对哺乳动物没有特别限定，可以列举：人、小鼠、大鼠、牛、猪等。其中优选人。通过使用人多能干细胞，可以制造对人安全的心肌细胞群。
层粘连蛋白为由α链、β链及γ链这3条亚基链构成的异三聚体分子。已知α链有α1～α5这5种、β链有β1～β3这3种、γ链有γ1～γ3这3种，通过它们的组合，存在至少12种以上的异形体。在本发明的制造方法中，工序(2)中使用的层粘连蛋白优选为对在心肌细胞的细胞表面表达的整联蛋白具有结合特异性的层粘连蛋白。
层粘连蛋白结合性整联蛋白有α3β1、α6β1、α6β4及α7β1(Hynes et al.,CellVol.110,673-687,2002)。已知这些整联蛋白在生物体内的表达部位分别具有特征性，肌组织中选择性表达整联蛋白α7β1。此外报道了：整联蛋白α7β1中有由于α7链的选择性剪接而产生的α7X1β1和α7X2β1这2个类型，在心肌细胞、骨骼肌细胞中主要表达α7X2β1(Israeli-rosenberg et al.,Circ Res.2014；114:572-586)。作为对整联蛋白α7X2β1的结合特异性高的层粘连蛋白，报道了层粘连蛋白α2β1γ1、层粘连蛋白α2β2γ1、层粘连蛋白α1β1γ1、层粘连蛋白α1β2γ1(Taniguchi et al.,The Journal of Biological Chemistry,7820-7831,2009)。因此，在工序(2)中，优选使用对整联蛋白α7X2β1的结合特异性高的层粘连蛋白α2β1γ1、层粘连蛋白α2β2γ1、层粘连蛋白α1β1γ1或层粘连蛋白α1β2γ1。以下分别记作层粘连蛋白211、层粘连蛋白221、层粘连蛋白111、层粘连蛋白121。
在本发明的制造方法中，从分化诱导后的细胞群除去未分化细胞的工序、即工序(A)中使用的层粘连蛋白优选为对在未分化的多能干细胞表面表达的整联蛋白具有结合特异性的层粘连蛋白。已知多能干细胞、特别是人多能干细胞较多表达整联蛋白中的α6β1(Miyazaki T et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.,375:27-32,2008)。作为对整联蛋白α6β1的结合特异性高的层粘连蛋白，报道了层粘连蛋白α5β1γ1、层粘连蛋白α5β2γ1、层粘连蛋白α3β3γ2(Nishiuchi et al.,Matrix Biol.,25:189-197,2006)。因此，在工序(A)中，优选使用对整联蛋白α6β1的结合特异性高的层粘连蛋白α5β1γ1、层粘连蛋白α5β2γ1或层粘连蛋白α3β3γ2。此外，发明人们确认了与层粘连蛋白α3β3γ2同样包含α3链的层粘连蛋白α3β1γ1、层粘连蛋白α3β2γ1对整联蛋白α6β1的结合特异性也高，这些也可以优选用于工序(A)中。以下分别记作层粘连蛋白511、层粘连蛋白521、层粘连蛋白332、层粘连蛋白311、层粘连蛋白321。
本发明的制造方法中使用的层粘连蛋白可以是全长层粘连蛋白，也可以是具有整联蛋白结合活性的层粘连蛋白片段。即，可以为由全长α链、全长β链及全长γ链构成的全长层粘连蛋白，也可以为包含α链、β链及γ链中的至少1个以上为比全长短的片段的层粘连蛋白片段。层粘连蛋白片段优选形成异三聚体。层粘连蛋白片段具有整联蛋白结合活性这一点可以通过使用了作为结合对象的整联蛋白的固相结合分析等来确认。层粘连蛋白片段形成异三聚体这一点可以通过将层粘连蛋白片段供于SDS-PAGE并检测条带数等来确认。
作为具有整联蛋白结合活性的层粘连蛋白片段，可以优选使用层粘连蛋白E8片段(以下记作“层粘连蛋白E8”)。层粘连蛋白E8是将小鼠层粘连蛋白111用弹性蛋白酶消化得到的形成了异三聚体的片段中被鉴定为具有强细胞粘附活性的片段(Edgar D et al.,J.Cell Biol.,105:589-598,1987)。推测对除小鼠层粘连蛋白111以外的层粘连蛋白用弹性蛋白酶进行消化时也存在与小鼠层粘连蛋白111E8相当的片段，但还没有将除小鼠层粘连蛋白111以外的层粘连蛋白用弹性蛋白酶消化并分离、鉴定了层粘连蛋白E8的报告。因此，本发明中使用的层粘连蛋白E8并不要求为层粘连蛋白的弹性蛋白酶消化产物，只要为具有与小鼠层粘连蛋白111E8同样的细胞粘附活性、具有同样的结构、具有同程度的分子量的层粘连蛋白的片段即可。
对层粘连蛋白或层粘连蛋白片段的来源没有特别限定，可以使用来自各种生物的层粘连蛋白或层粘连蛋白片段。优选来自哺乳动物的层粘连蛋白或层粘连蛋白片段。作为哺乳动物，可以列举例如：人、小鼠、大鼠、牛、猪等，但不被限定。其中，特别优选使用来自人的层粘连蛋白片段。为了制造对人安全的心肌细胞群而要求在制造工序中排除来自异种生物的成分的使用，因此优选使用来自人的层粘连蛋白片段。
层粘连蛋白可以为天然型，也可以为在维持其生物学活性的状态下1个或1个以上的氨基酸残基被修饰的修饰型。对层粘连蛋白的制造方法没有特别限定，可以列举例如：由层粘连蛋白高表达细胞纯化的方法、和以重组蛋白形式来制造的方法等。对层粘连蛋白片段的制造方法没有特别限定，可以列举例如：将全长层粘连蛋白用弹性蛋白酶等蛋白水解酶消化，并分离、纯化目标片段的方法，和以重组蛋白形式来制造的方法等。从制造量、品质的均匀性、制造成本等观点出发，层粘连蛋白及层粘连蛋白片段两者均优选以重组蛋白形式来制造。
重组层粘连蛋白、重组层粘连蛋白片段可以通过适当使用公知的基因重组技术来制造。作为重组层粘连蛋白、重组层粘连蛋白片段的制造方法，例如可以通过如下方法制造：分别获取编码α链、β链及γ链的各全长蛋白或部分蛋白的DNA，将其分别插入表达载体，将所得到的3种表达载体共导入合适的宿主细胞并使其表达，通过公知方法来纯化形成了三聚体的蛋白质。作为重组层粘连蛋白(全长)的制造方法，可以列举例如Ido等(HiroyukiIdo et al.,The Journal of Biological Chemistry,279,10946-10954,2004)的方法等，但不受其限定。作为重组层粘连蛋白片段(层粘连蛋白E8)的制造方法，可以列举例如Ido等(Hiroyuki Ido et al.,The Journal of Biological Chemistry,282,11144-11154,2007)的方法，但不受该方法限定。
编码构成主要的哺乳动物的层粘连蛋白的α链、β链、γ链的基因的碱基序列信息和各链的氨基酸序列信息可以从公知的数据库(GenBank等)获取。对于包括人在内的主要的哺乳动物，表1示出构成层粘连蛋白的各链的登录号。这些以外的来自各种生物的层粘连蛋白构成链的碱基序列信息及氨基酸序列信息也同样可以从公知的数据库(GenBank等)获取。
[表1]
氨基酸序列 碱基序列
人层粘连蛋白α1链 NP_005550 NM_005559
人层粘连蛋白α2链 NP_000417 NM_000426
人层粘连蛋白α3链 NP_000218 NM_000227
人层粘连蛋白α4链 NP_002281 NM_002290
人层粘连蛋白α5链 NP_005551 NM_005560
人层粘连蛋白β1链 NP_002282 NM_002291
人层粘连蛋白β2链 NP_002283 NM_002292
人层粘连蛋白β3链 NP_000219 NM_000228
人层粘连蛋白γ1链 NP_002284 NM_002293
人层粘连蛋白γ2链 NP_005553 NM_005562
人层粘连蛋白γ3链 NP_006050 NM_006059
小鼠层粘连蛋白α5链 NP_001074640 NM_001081171
小鼠层粘连蛋白β1链 NP_032508 NM_008482
小鼠层粘连蛋白γ1链 NP_034813 NM_010683
大鼠层粘连蛋白α5链 NP_001178538 NM_001191609
大鼠层粘连蛋白β1链 NP_001100191 NM_001106721
大鼠层粘连蛋白γ1链 NP_446418 NM_053966
层粘连蛋白E8是α链的从C末端片段除去球形结构域4和5后的片段(以下记作“α链E8”)、β链的C末端片段(以下记作“β链E8”)及γ链的C末端片段(以下记作“γ链E8”)形成三聚体后的片段，三聚体的分子量为约150～约170kDa。α链E8通常由约770个氨基酸构成，N末端侧的约230个氨基酸与三聚体形成有关。β链E8通常由约220～约230个氨基酸构成。γ链E8通常由约240～约250个氨基酸构成。γ链E8的C末端部起第3位的谷氨酸残基对于层粘连蛋白E8的整联蛋白结合活性是必须的(Hiroyuki Ido et al.,The Journal ofBiological Chemistry,282,11144-11154,2007)。
在本发明的工序(1)中，将多能干细胞向心肌细胞分化诱导的方法可以适当使用公知的分化诱导方法。可以列举例如：使用激活素A和BMP4(Bone Morphogenetic Protein4，骨形成蛋白4)对在饲养细胞上维持培养的人多能干细胞进行分化诱导的方法(非专利文献1、2)，使用Wnt3a、R-Spondin-1及DKK1对在Matrigel上维持培养的人多能干细胞进行分化诱导的方法(非专利文献3)，使用生物反应器对在饲养细胞上维持培养的人多能干细胞大量地进行分化诱导的方法(非专利文献3)，仅通过已知组成的添加因子对人多能干细胞进行由维持培养至分化诱导的方法(国际公开WO2014/078414号)等。其中，作为适于制造能够向人移植的心肌细胞群的分化诱导方法，可以列举例如：上述国际公开WO2014/078414号中记载的方法、将在人层粘连蛋白511E8上维持培养的人多能干细胞(日本特开2011-078370号公报)分化诱导成心肌细胞的方法等。
在本发明的工序(2)及工序(A)中，使工序(1)中分化诱导成心肌细胞的细胞群与层粘连蛋白或其片段接触的方法不受特别限定。可以列举例如：在培养皿等培养器具的培养面包被层粘连蛋白或其片段，在其中添加分化诱导成心肌细胞的细胞群的细胞悬浮液并静置一定时间的方法。此外，可以列举例如：在小珠等载体上包被层粘连蛋白或其片段，将该载体投入分化诱导成心肌细胞的细胞群的细胞悬浮液中并静置一定时间的方法。此外，可以列举例如：使用中空纤维膜作为载体，在中空纤维膜的内部包被层粘连蛋白或其片段，将分化诱导成心肌细胞的细胞群的细胞悬浮液注入中空纤维膜内并使其通过的方法等。
在工序(2)及工序(A)中，对层粘连蛋白或层粘连蛋白片段的包被浓度没有特别限定，可以适当选择并使用可实现工序(2)及工序(A)的目的的包被浓度。例如，优选从约0.1～约2.0μg/cm2的范围中选择。在本发明的制造方法中使用层粘连蛋白E8的情况下，对工序(2)及工序(A)中层粘连蛋白E8的包被浓度没有特别限定，优选为约0.1～约2.0μg/cm2，更优选为约0.25～约1.0μg/cm2，进一步优选为约0.5～约1.0μg/cm2。
在工序(2)及工序(A)中，使层粘连蛋白或层粘连蛋白片段与细胞接触的时间(层粘连蛋白处理时间)不受特别限定，根据所使用的包被浓度使用可实现工序(2)及工序(A)的目的的时间即可。在本发明的制造方法中使用层粘连蛋白E8的情况下，对工序(2)中层粘连蛋白E8与细胞的接触时间没有特别限定，优选为约15分钟～约180分钟，更优选为约15分钟～约120分钟，进一步优选为约15分钟～约60分钟，进一步优选为约25分钟～约60分钟。此外，对工序(A)中层粘连蛋白E8与细胞的接触时间没有特别限定，优选为约30分钟以下，更优选为约5分钟～约30分钟，进一步优选为约5分钟～约15分钟。
在本发明的工序(3)中，对回收附着于层粘连蛋白或层粘连蛋白片段的细胞的方法没有特别限定，可以适当选择并使用将附着细胞剥离的公知方法。例如，在除去未附着的细胞后，对层粘连蛋白或层粘连蛋白片段的包被面添加EDTA液或将载体投入EDTA液中，通过吹打等使细胞剥离并进行回收。或者，可以使用胰蛋白酶液代替EDTA液来剥离细胞。此外，在工序(3)后进行对所回收的细胞进行培养的工序(4)的情况下，也可以仅除去未附着的细胞。
在本发明的工序(B)中，对回收未附着于层粘连蛋白或层粘连蛋白片段的细胞的方法没有特别限定。例如，在使用包被有层粘连蛋白或层粘连蛋白片段的培养器具的情况下，可以通过离心分离等来回收包含在所回收的培养基以及用PBS等洗涤包被表面数次而得的洗涤液中的细胞。在将包被有层粘连蛋白或层粘连蛋白片段的载体投入细胞悬浮液中的情况下，可以通过离心分离等来回收已经回收载体后的细胞悬浮液中残留的细胞。在使用包被有层粘连蛋白或层粘连蛋白片段的中空纤维膜的情况下，可以回收通过了中空纤维膜的细胞悬浮液，并通过离心分离等回收未附着的细胞。
在本发明的制造方法中，在工序(3)后进行对工序(3)所回收的细胞进行培养的工序(4)的情况下，对培养方法没有特别限定，可以从公知的细胞培养方法中适当选择。优选为适合于心肌细胞的培养的培养方法。可以列举例如：使用工序(2)中所用的包被有层粘连蛋白或层粘连蛋白片段的培养器具进行培养的方法。可以在工序(3)中，在层粘连蛋白处理时间结束后，除去未附着的细胞而在板上留下附着细胞，添加新的培养基，由此进入工序(4)的培养。对培养时间没有特别限定，可以适当设定为可维持目标心肌细胞纯度的心肌细胞群的时间。
通过本发明的制造方法制造的心肌细胞群的心肌细胞的纯度(心肌细胞率)需要至少为10％以上，优选为30％以上。更优选为50％～90％，进一步优选为60％～80％。心肌细胞群的心肌细胞的纯度(心肌细胞率)例如可以使用流式细胞术等以心肌细胞群中的心肌型肌钙蛋白T阳性细胞的比率形式来确认。
对通过本发明的制造方法制造的心肌细胞群中的未分化细胞率没有特别限定。在本发明的制造方法中，通过在工序(1)和(2)之间进行除去未分化细胞的工序，从而与未进行除去未分化细胞的工序的情况相比可以使所得到的心肌细胞群中的未分化细胞减少，因此优选进行除去未分化细胞的工序。特别是，通过采用工序(A)及工序(B)作为除去未分化细胞的工序，可以在不损伤所得到的心肌细胞群的条件下除去未分化细胞。心肌细胞群的未分化细胞率例如可以使用流式细胞术等以心肌细胞群中的BC2LCN阳性细胞的比率形式来确认。
在本发明的制造方法中，由于采用了使由多能干细胞向心肌细胞分化诱导后的细胞群与层粘连蛋白或层粘连蛋白片段接触、并回收附着细胞的方法，因此与其它制造方法相比，在以下方面是优良的。第一，操作简便，且可以在非常短的时间内进行。以往的制造方法由于是利用心肌细胞与其它细胞、特别是仍维持了未分化性的细胞之间的代谢通路的差异来筛选心肌细胞，因此筛选操作需要长时间(至少数天)。该筛选操作给细胞带来较大负荷，所筛选的细胞的生存能力的降低不可避免。本发明的制造方法中，筛选所需要的时间短，为数分钟～数小时，筛选操作给细胞带来的负荷小。第二，由于通过由整联蛋白介导的细胞向基材的粘附来筛选目标细胞，从而不仅不会损害细胞的生存能力，反而可以期待提高生存能力。实际上，已知整联蛋白依赖性的细胞向层粘连蛋白的粘附在抑制细胞凋亡、维持细胞存活的同时，还使促进细胞增殖的细胞内信号转导通路活化(Gu J et al.TheJournal of Biological Chemistry 277:19922-19928,2002)。因此，本发明的制造方法与以往的方法不同，具有可以在维持高生存能力的状态下、且在短时间内筛选由多能干细胞分化诱导的心肌细胞群的显著优点。进而，在本发明的制造方法中，容易将工序(2)的操作连续重复进行、或者将工序(2)及工序(3)的操作连续重复进行，通过连续重复操作，从而容易提高所得到的心肌细胞群的心肌细胞的纯度。从而，通过本发明的制造方法制造的心肌细胞群是安全性非常高且生存能力高的细胞，因此作为移植用心肌细胞群是非常优良的。
本发明的制造方法的工序(2)中使用的层粘连蛋白211、层粘连蛋白221、层粘连蛋白111或层粘连蛋白α121不仅对心肌细胞、而且对骨骼肌细胞也具有结合特异性，因此通过将工序(1)变更为将多能干细胞向骨骼肌细胞分化诱导的工序，从而可以提供骨骼肌细胞的制造方法。
此外，通过按照细胞来区分使用用于本发明的制造方法的工序(2)的层粘连蛋白，从而能够使用包被有该层粘连蛋白的基材粘附依赖性地筛选由多能干细胞分化诱导的各种细胞。具体而言，报道了由人多能干细胞分化诱导的肝脏前体细胞依赖于整联蛋白α6β1而粘附于层粘连蛋白111(Takayama K.et al.Stem Cell Reports 1:322-335,2013)。据报道，层粘连蛋白111在再生肝中一过性地表达(Kikkawa Y et al.Experimental CellResearch 305:99-109,2005)。基于这些见解，能够使用包被有层粘连蛋白111的基材来筛选、纯化由人多能干细胞分化诱导的肝脏前体细胞。即，在本发明的制造方法中，通过将工序(1)变更为使多能干细胞向肝脏前体细胞分化诱导的工序、将工序(2)中使用的层粘连蛋白变更为层粘连蛋白111，从而可以提供肝脏前体细胞的制造方法。
〔心肌细胞的纯度提高方法〕
本发明提供一种提高由多能干细胞向心肌细胞分化诱导后的细胞群的心肌细胞的纯度的方法。本发明的心肌细胞的纯度提高方法包含以下的工序1及工序2即可：
工序1：使选自由层粘连蛋白α2β1γ1、层粘连蛋白α2β2γ1、层粘连蛋白α1β1γ1及层粘连蛋白α1β2γ1组成的组中的层粘连蛋白或该层粘连蛋白的具有整联蛋白结合活性的片段与上述细胞群接触的工序；
工序2：回收附着于上述层粘连蛋白或上述片段的细胞的工序。
工序1及工序2的内容与上述本发明的制造方法的工序(2)及工序(3)相同。本发明的心肌细胞的纯度提高方法可以与上述本发明的制造方法同样地实施。
实施例
以下通过实施例详细说明本发明，但本发明不受这些实施例限定。
〔实验材料及方法〕
(1)人层粘连蛋白E8
使用人层粘连蛋白511E8、人层粘连蛋白332E8、人层粘连蛋白311E8、人层粘连蛋白221E8及人层粘连蛋白211E8这5种人层粘连蛋白E8。以下，在实施例中分别简单记作511E8、332E8、311E8、221E8及211E8。
511E8使用购入的iMatrix-511(商品名、株式会社Nippi)。511E8以外的层粘连蛋白E8按照Ido等(Hiroyuki Ido et al.,The Journal of Biological Chemistry,282,11144-11154,2007)、Taniguchi等(Yukimasa Taniguchi et al.,The Journal ofBiological Chemistry,7820-7831,2009)中记载的方法来制作。即，分别制作人α3链E8片段(N末端侧含有6×His标签)表达载体、人α2链E8片段(N末端侧含有6×His标签)表达载体、人β3链E8片段(N末端侧含有HA标签)表达载体、人β2链E8片段(N末端侧含有HA标签)表达载体、人β1链E8片段(N末端侧含有HA标签)表达载体、人γ2链E8片段(N末端侧含有FLAG标签)表达载体及人γ1链E8片段(N末端侧含有FLAG标签)表达载体，选择α链、β链及γ链的组合，转染来自人肾脏的293细胞并进行72小时培养后，回收培养液，通过使用Ni-NTA琼脂糖和ANTI-FLAG M2亲和凝胶的亲和层析进行纯化。
(2)培养皿的层粘连蛋白E8包被
培养皿使用6孔或12孔多孔板(BD Falcon公司)。将层粘连蛋白E8用PBS稀释到期望的浓度，在每1孔中添加1ml(6孔)或0.4ml(12孔)。在37℃下静置2小时以上后，除去层粘连蛋白液，用PBS将板表面洗涤2次。培养皿的包被在即将使用前进行。实施例1～4及9中使用6孔多孔板，实施例5～8中使用12孔多孔板。
(3)人iPS细胞向心肌细胞的分化诱导
从理化学研究所购入并使用人iPS细胞株253G1。按照Matsuura等(Matsuura K etal.,Biochem Biophys Res Commun,2012Aug24；425(2):321-7,doi:10.1016/j.bbrc.2012.07.089.Epub 2012Jul 25)中记载的方法使用反应器进行心肌分化诱导。具体而言，将在Primate ES培养基(ReproCELL公司)中添加了5ng/ml的bFGF的培养基作为未分化维持培养基使用，在进行了丝裂霉素C处理的MEF上培养未分化253G1细胞。使用剥离液(ReproCELL公司)回收10个10cm培养皿的量的未分化253G1细胞，悬浮在添加了10μM的Y27632(ROCK抑制剂)的mTeSR培养基(STEMCELL Technologies)100ml中后，转移到容器(vessel)中，用生物反应器(ABLE公司)开始搅拌培养。1天后从培养基中除去Y27632。1～3天后将培养基置换为StemPro-34(Life Technologies)，3天～4天后添加0.5ng/ml的BMP4，4～7天后添加10ng/ml的BMP4、5ng/ml的bFGF和3ng/ml的激活素A，7～9天后添加4μM的IWR-1，第9天以后添加5ng/ml的VEGF和10ng/ml的bFGF并持续搅拌，16～18天后回收细胞。
(4)分化诱导后的细胞悬浮液的制备
使253G1细胞分化诱导成心肌细胞后，使用0.05％胰蛋白酶-EDTA液(LifeTechnologies)将细胞块分散，用70μm的筛网过滤器过滤而制备细胞悬浮液。以每分钟1500转离心分离5分钟。将沉淀用PBS悬浮，再次以每分钟1500转离心分离5分钟。将沉淀按照20万个细胞/毫升的浓度用培养基(含1％牛血清白蛋白的DMEM)悬浮。
(5)层粘连蛋白处理
在用层粘连蛋白E8包被的6孔多孔板中，在每1孔中接种3ml的细胞悬浮液(60万个细胞)。或者在用层粘连蛋白E8包被的12孔多孔板中，在每1孔中接种1.2ml的细胞悬浮液(24万个细胞)。经过一定的处理时间(接触时间)后，分别回收悬浮细胞及附着细胞。即，回收培养上清，用PBS洗涤培养面并回收洗涤液，再次用PBS洗涤培养面并回收洗涤液。将培养上清和2次洗涤液中所含的细胞作为悬浮细胞。另一方面，对用PBS洗涤2次后的培养面添加EDTA液，通过吹打而进行剥离并回收细胞。进而用PBS洗涤培养面并回收洗涤液。将用EDTA剥离的细胞和此后的洗涤液中的细胞作为附着细胞。
分别离心分离(每分钟1500转，5分钟)后除去上清。将沉淀用心肌型肌钙蛋白T(检测心肌细胞)或BC2LCN(检测未分化细胞)染色，使用流式细胞术或免疫染色进行评价。
〔实施例1：使用511E8、311E8、332E8除去悬浮细胞中的未分化细胞〕
使253G1细胞分化诱导成心肌细胞后，用511E8、311E8或332E8处理30分钟，分别回收悬浮细胞及附着细胞。层粘连蛋白E8的浓度设为0、1、2.5、5及10μg/ml(0、0.1、0.25、0.5及1μg/cm2)这5个等级。分别通过流式细胞术评价所回收的悬浮细胞及附着细胞中的BC2LCN阳性细胞率(未分化细胞率)。
将结果示于图1。上部为未分化细胞率，下部为细胞回收数。图中，LN511表示511E8，LN311表示311E8，LN332表示332E8。层粘连蛋白处理前的未分化细胞率为1.7％，与此相对，用任一层粘连蛋白E8处理的情况下，悬浮细胞中的未分化细胞率均浓度依赖性地降低。特别是在511E8的情况下，低浓度下也确认到未分化细胞率降低，包被浓度0.5μg/cm2时未分化细胞率降低到0.8％。用任一层粘连蛋白E8处理的情况下所回收的悬浮细胞数均浓度依赖性地减少。
〔实施例2：未分化细胞相对于511E8的特异性〕
使253G1细胞分化诱导成心肌细胞后，用包被浓度0.5μg/cm2的511E8或1μg/cm2的221E8处理30分钟，分别回收悬浮细胞及附着细胞。分别通过流式细胞术评价所回收的悬浮细胞及附着细胞中的BC2LCN阳性细胞率(未分化细胞率)。
将结果示于图2。图中，LN511表示511E8，LN221表示221E8。处理前，未分化细胞率为2.5％，与此相对，用0.5μg/cm2的511E8处理后的悬浮细胞中的未分化细胞率降低到1.6％。此外，附着细胞中的未分化细胞率上升到3.7％。另一方面，用1μg/cm2的层粘连蛋白221处理后的悬浮细胞及附着细胞中的未分化细胞率均为2.7％。
〔实施例3：使用221E8、211E8、511E8的心肌细胞分离获得及特异性〕
使253G1细胞分化诱导成心肌细胞后，用221E8、211E8或511E8处理30分钟，分别回收悬浮细胞及附着细胞。层粘连蛋白E8的包被浓度设为0、0.25、0.5、1及2μg/cm2这5个等级。分别通过流式细胞术评价所回收的悬浮细胞及附着细胞中的心肌型肌钙蛋白T阳性细胞率(心肌细胞率)。
将结果示于图3。上部为心肌型肌钙蛋白T阳性细胞率(心肌细胞率)，下部为细胞回收数。图中，LN221表示221E8，LN211表示211E8、LN511表示511E8。层粘连蛋白处理前的心肌细胞率为18.5％。用任一层粘连蛋白E8处理的情况下悬浮细胞中的心肌细胞率均与处理前的值几乎相等，与此相对，用221E8或211E8处理的附着细胞中的心肌细胞率均上升。另一方面，用511E8处理的情况下，附着细胞及悬浮细胞中的心肌细胞率未确认到较大差异。用任一层粘连蛋白E8处理的情况下回收的附着细胞数均浓度依赖性地上升。
〔实施例4：221E8处理所引起的附着细胞数及心肌细胞率的经时变化〕
使253G1细胞分化诱导成心肌细胞后，用包被浓度1μg/cm2的221E8进行处理，经时地回收附着细胞，通过流式细胞术评价其细胞数和心肌细胞率(心肌型肌钙蛋白T阳性细胞率)。
将结果示于图4A、B、C。A是221E8的处理时间为15、20、25及30分钟的附着细胞数，B是221E8的处理时间为0.5、1、8及24小时的附着细胞数(有别于A实验的实验的结果)，C是221E8的处理时间为15、20、25、30及60分钟的附着细胞数中的心肌细胞率。需要说明的是，接触时间为0的心肌细胞率是221E8处理前的心肌细胞率。附着细胞数在221E8的处理时间为15～30分钟期间经时地增加(图4A)，在1～8小时内逐渐增加后，到24小时为止有减少倾向(图4B)。221E8的处理前的心肌细胞率为16.1％。可以确认到如下倾向：在221E8处理后15分钟，心肌细胞率上升到35.9％，然后经时地减少(图4C)。
〔实施例5：使用511E8、211E8、221E8除去悬浮细胞中的未分化细胞〕
使253G1细胞分化诱导成心肌细胞后，用包被浓度1μg/cm2的511E8、211E8或221E8进行处理，在处理开始起15分钟、30分钟、60分钟、120分钟后回收悬浮细胞，通过流式细胞术评价所回收的悬浮细胞的细胞数和未分化细胞率(BC2LCN阳性细胞率)。未分化细胞率以相对于处理前的未分化细胞数的变化率、即处理后的BC2LCN阳性细胞数除以处理前的BC2LCN阳性细胞数而得的值来表示。
将结果示于图5A、B。A表示悬浮细胞中的未分化细胞率的经时变化，B表示各回收时间的悬浮细胞数。图中，LN511表示511E8，LN221表示221E8，LN211表示211E8。如图5A所示，用211E8或221E8进行处理时的未分化细胞率在任意的回收时间均几乎为1以上，用511E8进行处理的情况下，任意的回收时间均小于1。该结果显示出511E8处理对除去悬浮细胞中的未分化细胞是有效的。如图5B所示，显示出：回收的悬浮细胞数在任意的层粘连蛋白的情况下均接触时间依赖性地减少，在使用511E8的情况下，接触30分钟以上时悬浮细胞数显著减少。该结果提示：如果考虑未分化细胞率的经时变化和悬浮细胞数的经时变化，在作为除去未分化细胞的工序的工序(A)中，细胞与层粘连蛋白E8的接触时间优选为30分钟以下，更优选为15分钟以下。
〔实施例6：使用511E8、211E8、221E8的心肌细胞纯化：处理时间的研究〕
(1)处理时间(接触时间)所引起的心肌细胞率及附着细胞数的变化
使253G1细胞分化诱导成心肌细胞后，用包被浓度1μg/cm2的511E8、211E8或221E8进行处理，在处理开始起15分钟、30分钟、60分钟、120分钟后回收附着细胞，通过流式细胞术评价所回收的附着细胞的细胞数和心肌细胞率(心肌型肌钙蛋白T阳性细胞率)。心肌细胞率以相对于处理前的心肌细胞数的变化率、即处理后的心肌型肌钙蛋白T阳性细胞数除以处理前的心肌型肌钙蛋白T阳性细胞数而得到的值来表示。
将结果示于图6A、B。A表示附着细胞中的心肌细胞率的经时变化，B表示各回收时间的附着细胞数。图中，LN511表示511E8，LN221表示221E8，LN211表示211E8。如图6A所示，用511E8进行处理时，任意的回收时间下，心肌细胞率均为1左右，用211E8或221E8进行处理的情况下，在任意的回收时间下均超过1，通过用211E8或221E8处理并回收附着细胞可以提高心肌细胞的纯度。如图6B所示，用211E8或221E8进行处理时的附着细胞数在处理时间(接触时间)达到60分钟前均时间依赖性地增加。该结果提示：工序(2)中，细胞与层粘连蛋白E8的接触时间优选为约30分钟～约60分钟。
〔实施例7：使用511E8、211E8、221E8的心肌细胞纯化：层粘连蛋白E8包被浓度的研究〕
使253G1细胞分化诱导成心肌细胞后，以0.25、0.5、1及2μg/cm2的4等级包被浓度进行511E8、211E8或221E8处理，处理开始起30分钟后回收附着细胞，通过流式细胞术评价所回收的附着细胞的细胞数和心肌细胞率(心肌型肌钙蛋白T阳性细胞率)。心肌细胞率以相对于处理前的心肌细胞数的变化率、即处理后的心肌型肌钙蛋白T阳性细胞数除以处理前的心肌型肌钙蛋白T阳性细胞数而得的值来表示。
将结果示于图7A、B。A表示各包被浓度的附着细胞中的心肌细胞率，B表示各包被浓度中的附着细胞数。图中，LN511表示511E8，LN221表示221E8，LN211表示211E8。如图7A所示，用511E8进行处理时的心肌细胞率在任意的包被浓度下均为1左右，在用211E8或221E8进行处理的情况下，在任意的包被浓度下均超过1，通过用211E8或221E8处理并回收附着细胞可以提高心肌细胞的纯度。如图7B所示，就用211E8或221E8进行处理时的附着细胞数而言，在211E8的情况下直至0.5μg/cm2包被浓度依赖性地增加，在221E8的情况下直至2μg/cm2包被浓度依赖性地增加。该结果提示：工序(2)中，层粘连蛋白E8的包被浓度优选为约0.5～约2μg/cm2。
〔实施例8：221E8所带来的心肌细胞富集效果的确认〕
使253G1细胞分化诱导成心肌细胞后，以包被浓度1μg/cm2的511E8或221E8处理30分钟，回收附着细胞，通过流式细胞术测定心肌细胞率(心肌型肌钙蛋白T阳性细胞率)。此外，处理30分钟后除去悬浮细胞，在包被有1μg/cm2的511E8或221E8的板中培养附着细胞3天，对心肌型肌钙蛋白T阳性细胞进行免疫染色。作为对比染色，使用DAPI进行核染色。
将结果示于图8。上部为流式细胞术的图，中部为核染色的荧光显微镜图像，下部为心肌型肌钙蛋白T阳性细胞的荧光显微镜图像。如图8所示，处理前的心肌细胞率为43％，与此相对，用511E8处理后的粘附细胞中的心肌细胞率降低到26％。另一方面，用层粘连蛋白221E8处理后的附着细胞中的心肌细胞率增加到67％。培养用511E8或221E8处理后的粘附细胞，用221E8处理时的通过核染色检测到的细胞数比用511E8处理时的通过核染色检测到的细胞数少，但其几乎全是心肌型肌钙蛋白T阳性的细胞。另一方面，用511E8处理的细胞中，存在较多的除心肌型肌钙蛋白T阳性细胞以外的细胞。该结果显示出：通过用221E8处理，可以有效地富集心肌细胞。
〔实施例9：利用221E8处理及无糖培养基的心肌细胞纯化的比较〕
在使253G1细胞分化诱导成心肌细胞后，即实施上述〔实验材料及方法〕的(3)的方法16～18天后，将回收的细胞等分成2份，一份供于无糖培养基处理，另一份供于221E8处理。
无糖培养基处理按照Tohyama等的方法(Shugo Tohyama et al.,Cell StemCell,12,127-137,2013)进行。即，在分化诱导后不进行胰蛋白酶-EDTA处理，在胚状体的状态下，用无糖培养基、即不含葡萄糖的DMEM培养基(Life Technologies)中添加了4mM的乳酸(和光纯药)的培养基培养6天。作为对照，使用用常规培养基(含1％牛血清白蛋白的DMEM)代替上述无糖培养基进行培养的细胞。在3小时后及3天后进行培养基交换。6天后，用0.05％胰蛋白酶-EDTA将胚状体分散并回收细胞。
221E8处理组中，用0.05％胰蛋白酶-EDTA将胚状体分散后，在以1μg/cm2的浓度包被有221E8的板中进行处理。作为对照，使用在代替221E8而包被有胎牛血清的板上处理的细胞。处理开始起3小时后除去非附着细胞。在附着的细胞中加入新的培养基，在同一板、即以1μg/cm2的浓度包被有221E8的板或包被有胎牛血清的板中培养6天。3天后进行培养基交换，6天后用0.05％胰蛋白酶-EDTA进行处理并回收细胞。
对6天后回收的各组的细胞，通过流式细胞术评价心肌型肌钙蛋白T阳性细胞率(心肌细胞率)及BC2LCN阳性率(未分化细胞率)。
将结果示于图9A、B、C。A表示回收细胞数，B表示心肌细胞率，C表示未分化细胞率。图中，以涂黑来表示无糖培养基组(no-glu)，以斜线表示221E8处理组，以空心棒图表示各自的对照组。
如图9A所示，在以胚状体状态进行培养的无糖培养基组及其对照组中，回收细胞数为10万个左右，与此相对，在进行粘附培养的221E8处理组及其对照组中，回收细胞数为100万个以上，显著高，表明：与无糖培养基处理相比，221E8处理的细胞毒性低，并且对心肌细胞的维持也有效。
如图9B所示，处理前的心肌细胞率为42.1％(图9B的图上的横线)。无糖培养基对照组(通常的胚状体培养)的培养6天后的心肌细胞率为25.6％，与此相对，无糖培养基组的培养6天后的心肌细胞率上升到38.7％。此外，221E8处理对照组(常规粘附培养)的培养6天后的心肌细胞率为42.6％，与此相对，221E8处理组的培养6天后的心肌细胞率上升到57.2％。任意的处理与对照组相比心肌细胞率均上升，但221E8处理组的心肌细胞率显著高于处理前的心肌细胞率。
如图9C所示，无糖培养基对照组(常规的胚状体培养)的培养6天后的未分化细胞率为13.8％，与此相对，无糖培养基组的培养6天后的未分化细胞率为0.5％。此外，221E8处理对照组(常规粘附培养)的培养6天后的未分化细胞率为1.4％，与此相对，221E8处理组的培养6天后的未分化细胞率为0.4％。与对照组相比，无糖培养基处理的相对的未分化细胞除去率高于221E8处理的相对的未分化细胞除去率，但处理后的未分化细胞率均为0.4％～0.5％，从未分化细胞的残存率的观点考虑，两者几乎相等。
根据以上的结果，221E8处理与无糖培养基处理相比，回收细胞数绝对性多，并且心肌细胞率与处理前相比也显著增加，未分化细胞率与无糖培养基处理为相同程度，由此表明：221E8处理与无糖培养基处理相比，心肌细胞的纯化效率绝对性高。即表明：与使用无糖培养基的方法相比，本申请发明作为心肌细胞纯化法是极其优良的。
需要说明的是，本发明不受上述各实施方式及实施例限定，可以在权利要求书所示的范围内进行各种变更，将在不同实施方式中分别公开的技术特征适当组合而得到的实施方式也包含在本发明的技术范围内。此外，本说明书中记载的学术文献及专利文献全部以参考形式援引入本说明书中。

Claims (7)

1.一种移植治疗用心肌细胞群的制造方法，其特征在于，包含：
(1)将人多能干细胞向心肌细胞分化诱导的工序，
(2)使分化诱导后的细胞群与选自由层粘连蛋白α2β1γ1E8片段、层粘连蛋白α2β2γ1E8片段、层粘连蛋白α1β1γ1E8片段及层粘连蛋白α1β2γ1E8片段组成的组中的层粘连蛋白E8片段接触的工序，及
(3)回收附着于所述层粘连蛋白E8片段的细胞的工序，
在所述工序(2)中，通过下述方法使分化诱导后的细胞群与所述层粘连蛋白E8片段接触：在培养面以0.1μg/cm2～2μg/cm2的包被浓度包被有所述层粘连蛋白E8片段的培养器具中，添加所述工序(1)所得到的细胞群的细胞悬浮液并静置15分钟～180分钟；将包被有所述层粘连蛋白E8片段的载体投入所述工序(1)所得到的细胞群的细胞悬浮液中并静置15分钟～180分钟；或者，向内部包被有所述层粘连蛋白E8片段的中空纤维膜内，注入所述工序(1)所得到的细胞群的细胞悬浮液并花费15分钟～180分钟使其通过，
在所述工序(3)中，除去未附着于所述层粘连蛋白E8片段的细胞后，将附着的细胞剥离。
2.根据权利要求1所述的制造方法，其特征在于，在所述工序(1)和(2)之间进一步包含由分化诱导后的细胞群除去未分化细胞的工序，所述由分化诱导后的细胞群除去未分化细胞的工序包含：
(A)使分化诱导后的细胞群与选自由层粘连蛋白α5β1γ1E8片段、层粘连蛋白α5β2γ1E8片段、层粘连蛋白α3β1γ1E8片段、层粘连蛋白α3β2γ1E8片段及层粘连蛋白α3β3γ2E8片段组成的组中的层粘连蛋白E8片段接触的工序，及
(B)回收未附着于所述层粘连蛋白E8片段的细胞的工序，
在所述工序(A)中，通过下述方法使分化诱导后的细胞群与所述层粘连蛋白E8片段接触：在培养面以0.1μg/cm2～2μg/cm2的包被浓度包被有所述层粘连蛋白E8片段的培养器具中，添加所述工序(1)所得到的细胞群的细胞悬浮液并静置5分钟～30分钟；将包被有所述层粘连蛋白E8片段的载体投入所述工序(1)所得到的细胞群的细胞悬浮液中并静置5分钟～30分钟；或者，向内部包被有所述层粘连蛋白E8片段的中空纤维膜内，注入所述工序(1)所得到的细胞群的细胞悬浮液并花费5分钟～30分钟使其通过，
在所述工序(B)中，回收包含在所回收的培养基及洗涤包被表面而得的洗涤液中的细胞。
3.根据权利要求1或2所述的制造方法，其特征在于，在所述工序(3)之后，还包含(4)：对所述工序(3)所回收的细胞进行培养的工序，在所述工序(3)中除去未附着于所述层粘连蛋白E8片段的细胞，不剥离附着的细胞而继续进行培养。
4.根据权利要求1或2所述的制造方法，其中，心肌细胞群的心肌细胞的纯度为60％～80％。
5.一种提高由人多能干细胞向心肌细胞分化诱导后的细胞群的心肌细胞的纯度的方法，其特征在于，包含：
工序1：使选自由层粘连蛋白α2β1γ1E8片段、层粘连蛋白α2β2γ1E8片段、层粘连蛋白α1β1γ1E8片段及层粘连蛋白α1β2γ1E8片段组成的组中的层粘连蛋白E8片段与所述细胞群接触的工序、及
工序2：回收附着于所述层粘连蛋白E8片段的细胞的工序，
在所述工序1中，通过下述方法使所述细胞群与所述层粘连蛋白E8片段接触：在培养面以0.1μg/cm2～2μg/cm2的包被浓度包被有所述层粘连蛋白E8片段的培养器具中，添加所述细胞群的细胞悬浮液并静置15分钟～180分钟；将包被有所述层粘连蛋白E8片段的载体投入所述细胞群的细胞悬浮液中并静置15分钟～180分钟；或者，向内部包被有所述层粘连蛋白E8片段的中空纤维膜内，注入所述细胞群的细胞悬浮液并花费15分钟～180分钟使其通过，
在所述工序2中，除去未附着于所述层粘连蛋白E8片段的细胞后，将附着的细胞剥离。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在所述工序1之前，进一步包含由所述细胞群除去未分化细胞的工序，所述由所述细胞群除去未分化细胞的工序包含：
(A)使所述细胞群与选自由层粘连蛋白α5β1γ1E8片段、层粘连蛋白α5β2γ1E8片段、层粘连蛋白α3β1γ1E8片段、层粘连蛋白α3β2γ1E8片段及层粘连蛋白α3β3γ2E8片段组成的组中的层粘连蛋白E8片段接触的工序，及
(B)回收未附着于所述层粘连蛋白E8片段的细胞的工序，
在所述工序(A)中，通过下述方法使所述细胞群与所述层粘连蛋白E8片段接触：在培养面以0.1μg/cm2～2μg/cm2的包被浓度包被有所述层粘连蛋白E8片段的培养器具中，添加所述细胞群的细胞悬浮液并静置5分钟～30分钟；将包被有所述层粘连蛋白E8片段的载体投入所述细胞群的细胞悬浮液中并静置5分钟～30分钟；或者，向内部包被有所述层粘连蛋白E8片段的中空纤维膜内，注入所述细胞群的细胞悬浮液并花费5分钟～30分钟使其通过，
在所述工序(B)中，回收包含在所回收的培养基及洗涤包被表面而得的洗涤液中的细胞。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，在所述工序2之后，还包含工序3：对所述工序2所回收的细胞进行培养的工序，在所述工序2中除去未附着于所述层粘连蛋白E8片段的细胞，不剥离附着的细胞而继续进行培养。
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