WO2021161991A1 - 多能性幹細胞を脳毛細血管内皮様細胞へと分化誘導するためのコーティング剤およびその利用 - Google Patents

多能性幹細胞を脳毛細血管内皮様細胞へと分化誘導するためのコーティング剤およびその利用 Download PDF

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cell
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民秀 松永
真大 坡下
啓将 青木
美紗季 山下
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公立大学法人名古屋市立大学
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Definitions

  • the present disclosure relates to a coating agent for inducing differentiation of pluripotent stem cells into cerebral capillary endothelium-like cells.
  • BMECs Brain capillary endothelial cells
  • BBB blood-brain barrier
  • BMECs brain capillary endothelial cells
  • iBMECs cerebral capillary endothelium-like cells
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • Matrigel has a property of solidifying when the temperature rises, and it is difficult to maintain reproducibility because the coating requires a complicated operation.
  • Matrigel is produced from mouse granulomas, the differentiation efficiency of iBMECs fluctuates due to differences in Matrigel manufacturers and production lots. For this reason, the present inventors have invented a technique that enables a stable supply of iBMECs by advancing diligent research.
  • the present invention has been made to solve the above-mentioned problems, and can be realized as the following forms.
  • a coating agent for inducing differentiation of pluripotent stem cells into cerebral capillary endothelium-like cells contains at least one component of a laminin 221 fragment and an N-terminal vitronectin. According to this form of coating agent, it is possible to suppress a decrease in reproducibility when inducing differentiation of pluripotent stem cells into cerebral capillary endothelium-like cells, and it is possible to suppress fluctuations in differentiation efficiency, so that cerebral capillary endothelium can be suppressed. It can stably supply like cells.
  • the component may be contained in the coating agent in an amount of 0.01 nmol / L or more and 10 mmol / L or less. According to this form of coating agent, a decrease in differentiation efficiency can be further suppressed.
  • a differentiation induction kit comprises the above coating agent and cells.
  • pluripotent stem cells can be easily induced to differentiate into cerebral capillary endothelium-like cells.
  • the present invention can also be used as a coating agent for inducing differentiation of pluripotent stem cells into cerebral capillary endothelium-like cells, which contains at least one component of laminin 221 fragment and N-terminal vitronectin. realizable.
  • a culture dish containing a coating layer coated with a coating agent for inducing differentiation of pluripotent stem cells into cerebral capillary endothelium-like cells is provided.
  • the coding agent comprises at least one component of a laminin 221 fragment and an N-terminal vitronectin. According to this form of culture dish, it is possible to suppress a decrease in reproducibility when inducing differentiation of pluripotent stem cells into cerebral capillary endothelium-like cells, and it is possible to suppress fluctuations in differentiation efficiency, so that cerebral capillary endothelium can be suppressed. It can stably supply like cells.
  • the component may be contained in an amount of 1 ng or more and 1 mg or less per 1 cm 2 of the coat area of the coat layer. According to this form of coating agent, a decrease in differentiation efficiency can be further suppressed.
  • a method for producing cerebral capillary endothelium-like cells by inducing differentiation of pluripotent stem cells includes culturing the pluripotent stem cells using at least one component of a laminin 221 fragment and an N-terminal vitronectin. According to the method for producing cerebral capillary endothelium-like cells in this form, it is possible to suppress a decrease in reproducibility when inducing differentiation of pluripotent stem cells into cerebral capillary endothelial-like cells, and also suppress fluctuations in differentiation efficiency. Therefore, it is possible to stably supply cerebral capillary endothelium-like cells.
  • the pluripotent stem cells may be artificial pluripotent stem cells.
  • the induced pluripotent stem cell may be a human induced pluripotent stem cell.
  • the cell layer of the cerebral capillary endothelial-like cells obtained by the method for producing the cerebral capillary endothelial-like cells of the above-mentioned form is used to permeate the blood-brain barrier of the test substance.
  • a method of assessing sex is provided.
  • the method for evaluating the blood-brain barrier permeability of the test substance of the above-mentioned form may include the following steps (i) to (iii). (I) Step of preparing the cell layer; (Ii) A step of bringing the test substance into contact with the cell layer; (Iii) A step of evaluating the permeability of the test substance by quantifying the test substance that has permeated the cell layer.
  • the blood-brain barrier barrier of the test substance is used by using the cell layer of the cerebral capillary endothelial-like cells obtained by the method for producing the cerebral capillary endothelial-like cells of the above-mentioned form.
  • a method for assessing the impact on function is provided.
  • a method for inducing differentiation of pluripotent stem cells into cerebral capillary endothelium-like cells is to culture the pluripotent stem cell using at least one component of laminin 221 fragment and N-terminal vitronectin. Includes steps. According to the method of inducing differentiation of pluripotent stem cells into cerebral capillary endothelial-like cells in this form, it is possible to suppress a decrease in reproducibility when inducing differentiation of pluripotent stem cells into cerebral capillary endothelial-like cells. In addition, since fluctuations in differentiation efficiency can be suppressed, cerebral capillary endothelial-like cells can be stably supplied.
  • Explanatory drawing which shows the differentiation protocol of human iPS cells into iBMECs.
  • Explanatory drawing which shows the relative TEER value of iBMECs which induced differentiation on each coat layer.
  • Explanatory drawing which shows the time-dependent change of TEER value in Matrigel-iBMECs and LN221F-iBMECs derived from 610B1 strain.
  • Explanatory drawing which shows the time-dependent change of TEER value in Matrigel-iBMECs and LN221F-iBMECs derived from 648A1 strain.
  • Explanatory drawing which shows the result of the permeation test of FD4 in Matrigel-iBMECs and LN221F-iBMECs.
  • Explanatory drawing which shows the result of the permeation test of LY in Matrigel-iBMECs and LN221F-iBMECs.
  • Explanatory drawing which shows the analysis result of the expression level of each gene in Matrigel-iBMECs, LN221F-iBMECs, and hBMECs.
  • Explanatory drawing which shows the result of the protein expression analysis by the immunostaining method in Matrigel-iBMECs and LN221F-iBMECs.
  • Explanatory drawing which shows the result of the functional analysis of P-gp in Matrigel-iBMECs and LN221F-iBMECs.
  • Explanatory drawing which shows the result of the functional analysis of BCRP in Matrigel-iBMECs and LN221F-iBMECs.
  • the disclosure herein relates to a coating agent for inducing differentiation of pluripotent stem cells into cerebral capillary endothelium-like cells.
  • Cerebral capillary endothelial cells (hereinafter, also referred to as “BMECs”) are the main cells constituting the blood-brain barrier (hereinafter, also referred to as "BBB").
  • BBB blood-brain barrier
  • BMECs Cerebral capillary endothelial cells
  • BBB blood-brain barrier
  • BMECs blood-brain barrier
  • iBMECs brain capillary endothelium-like cells exhibiting the characteristics of BMECs
  • the iBMECs obtained by the method of the present disclosure are useful for constructing a BBB model, and are used, for example, for evaluating the intracerebral transferability (cerebral blood-brain barrier permeability) of a test substance (typically a drug).
  • “Popular stem cells” are the ability to differentiate into all the cells that make up the living body (pluripotency) and the ability to produce daughter cells that have the same differentiation potential as self through cell division (self-renewal ability). ) And a cell. Differentiation pluripotency can be evaluated by transplanting the cells to be evaluated into nude mice and testing for the presence or absence of teratomy including each of the three germ layers (ectoderm, mesoderm, endoderm).
  • pluripotent stem cells examples include embryonic stem cells (ES cells), embryonic germ cells (EG cells), induced pluripotent stem cells (iPS cells), etc., but cells having both differentiation pluripotency and self-renewal ability As long as it is, it is not limited to this.
  • ES cells or iPS cells are used. More preferably, iPS cells are used.
  • the pluripotent stem cells are preferably mammalian cells (eg, primates such as humans and chimpanzees, rodents such as mice and rats), and particularly preferably human cells. Therefore, in the most preferred embodiment of the present disclosure, human iPS cells are used as pluripotent stem cells.
  • ES cells can be established, for example, by culturing an early embryo before implantation, an inner cell mass constituting the early embryo, a single blastomere, etc. (Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1994); Thomson, J.A. et al., Science, 282, 1145-1147 (1998)).
  • an early embryo prepared by nuclear transfer of a somatic cell nucleus may be used (Wilmut et al. (Nature, 385, 810 (1997)), Cibelli et al. (Science, 280, 1256). (1998)), Akira Iriya et al.
  • fusion ES cells obtained by cell fusion of ES cells and somatic cells are also included in the embryonic stem cells in the present disclosure.
  • ES cells are available from storage institutions or are commercially available.
  • human ES cells can be obtained from the Institute for Frontier Medical Sciences, Kyoto University (for example, KhES-1, KhES-2 and KhES-3), WiCell Research Institute, ESI BIO and the like.
  • ES cells can be established by culturing primordial germ cells in the presence of LIF, bFGF, SCF, etc. (Matsui et al., Cell, 70, 841-847 (1992), Shamblott et al. ., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95 (23), 13726-13731 (1998), Turnpenny et al., Stem Cells, 21 (5), 598-609, (2003)).
  • IPS cells are pluripotent (pluripotent) and proliferative cells produced by reprogramming somatic cells by introducing reprogramming factors.
  • iPS cells exhibit properties similar to ES cells.
  • the somatic cells used for producing iPS cells are not particularly limited, and may be differentiated somatic cells or undifferentiated stem cells. Further, the origin thereof is not particularly limited, but somatic cells of mammals (for example, primates such as humans and chimpanzees, rodents such as mice and rats), particularly preferably human somatic cells are used.
  • iPS cells can be produced by various methods reported so far. In addition, it is naturally assumed that the iPS cell production method to be developed in the future will be applied.
  • the most basic method for producing iPS cells is to introduce four transcription factors, Oct3 / 4, Sox2, Klf4, and c-Myc, into cells using a virus (Takahashi K, Yamanaka S). : Cell 126 (4), 663-676, 2006; Takahashi, K, et al: Cell 131 (5), 861-72, 2007). It has been reported that human iPS cells were established by introducing four factors, Oct4, Sox2, Lin28 and Nonog (Yu J, et al: Science 318 (5858), 1917-1920, 2007). 3 factors excluding c-Myc (Nakagawa M, et al: Nat. Biotechnol.
  • the gene transfer method is also being studied, and in addition to retroviruses, lentivirus (Yu J, et al: Science 318 (5858), 1917-1920, 2007), adenovirus (Stadtfeld M, et al: Science 322 (5903)).
  • Cells that have undergone transformation into iPS cells, that is, reprogramming are of pluripotent stem cell markers (undifferentiated markers) such as Fbxo15, Nanog, Oct / 4, Fgf-4, Esg-1 and Cript. Expression and the like can be selected as an index.
  • the selected cells are collected as iPS cells.
  • the iPS cells can also be provided by, for example, the National University Corporation Kyoto University or the National Research and Development Corporation RIKEN BioResource Center.
  • inducing differentiation means working to differentiate along a specific cell lineage.
  • pluripotent stem cells into cerebral capillary endothelial-like cells (iBMECs), laminin 221 fragment (hereinafter, also referred to as “LN221F”) and N-terminal vitronectin (hereinafter, "VTN-N”)
  • LN221F laminin 221 fragment
  • VTN-N N-terminal vitronectin
  • ⁇ Coating agent> In general, cells may be cultured on a culture surface coated with a basement membrane component or adhesion molecule in order to improve the survival rate and proliferation rate of cells, promote differentiation induction, and select cells.
  • Matrigel which has been conventionally used as a coating agent, contains laminin 111 as a main component, collagen type IV, heparan sulfate proteoglycan, entactin / nidrogien, and various growth factors.
  • Laminine is a heterotrimeric molecule consisting of three subunit chains, ⁇ chain, ⁇ chain and ⁇ chain.
  • ⁇ chain has 5 types of ⁇ 1 to ⁇ 5, ⁇ chain has 3 types of ⁇ 1 to ⁇ 3, and ⁇ chain.
  • Laminin's Reference Sequence RNA includes NM_000426, NM_001079823 (Subunit alpha2), NM_002291 (Subunit beta1), NM_002292 (Subunit beta2), NM_000228 (Subunit beta3), NM_001318046, NM_001318047, Subunit 1), NM_005562, NM_018891 (Subunit gamma 2) are known.
  • Laminin 221 is a laminin molecule composed of subunit chains of ⁇ 2 chain, ⁇ 2 chain, and ⁇ 1 chain, and is known to be abundant in the heart.
  • the "laminin 221 fragment (LN221F)” means a fragment (E8 fragment) of laminin 221 corresponding to the integrin binding site.
  • the "laminin 221 fragment (LN221F)” in the present specification also includes a protein having high homology with LN221F.
  • the term "protein having high homology with LN221F” refers to a protein containing an amino acid sequence that is 80% or more consistent with the amino acid sequence of LN221F in the amino acid sequence constituting the protein. That is, the "protein having high homology with LN221F” includes a protein having a longer amino acid sequence than LN221F.
  • the homology of the protein having high homology with LN221F is preferably 80% or more, more preferably 90% or more, and further preferably 95% or more.
  • the molecular weight of the laminin 221 fragment (LN221F) is about 150 kDa to about 170 kDa. In the present specification, the molecular weight of the laminin 221 fragment (LN221F) is estimated to be 150 kDa.
  • N-terminal vitronectin means a protein in which the N-terminal of vitronectin is deleted and contains an RGD sequence.
  • the "N-terminal vitronectin (VTN-N)” in the present specification also includes a protein having high homology with VTN-N.
  • protein having high homology with VTN-N means a protein in which the amino acid sequence constituting the protein contains an amino acid sequence that matches 70% or more of the amino acid sequence of VTN-N, or an amino acid sequence. Those containing an RGD sequence in it.
  • Proteins highly homologous to VTN-N also include proteins with longer amino acid sequences than VTN-N.
  • the homology of the protein having high homology with VTN-N is preferably 80% or more, more preferably 90% or more, and further preferably 95% or more.
  • NM_000638 is known as a reference sequence RNA of vitronectin
  • NNP_000629 is known as a reference sequence protein of vitronectin.
  • the molecular weight of N-terminal vitronectin (VTN-N) is estimated to be 47.6 kDa.
  • the coating agent of the present disclosure may contain only one of LN221F and VTN-N, or may contain both LN221F and VTN-N. That is, the coating agent of the present disclosure contains at least one component of LN221F and VTN-N.
  • the coating agent of the present disclosure preferably contains LN221F.
  • the coating agent of the present disclosure may exclude Matrigel.
  • the above component may be contained in the coating agent in an amount of 0.01 nmol / L or more, or may be contained in an amount of 10 mmol / L or less.
  • the content of the above component is preferably 0.1 nmol / L or more, more preferably 1 nmol / L or more in the coating agent.
  • the content of the above components is preferably 1 mmol / L or less, more preferably 0.1 mmol / L or less in the coating agent.
  • the above component is contained in the coating agent in an amount of 0.01 nmol / L or more, the differentiation efficiency can be improved. Further, when the above component is contained in the coating agent in an amount of 1 mmol / L or less, an increase in the cost required for inducing differentiation can be suppressed.
  • a culture dish or the like on which a coat layer is formed can be obtained by diluting a coating agent containing the above components with a medium or the like, pouring it into a culture dish or a Transwell insert and allowing it to stand.
  • forming a coat layer is also referred to as "coating".
  • the above components may be contained in an amount of 1 ng or more or 1 mg or less per 1 cm 2 of the area of the culture dish, that is, the coat area of the coat layer.
  • the content of the above components is preferably 10 ng or more, more preferably 0.1 ⁇ g or more, per 1 cm 2 of the coat area.
  • the content of the above components is preferably 0.1 mg or less, more preferably 10 ⁇ g or less, per 1 cm 2 of the coat area.
  • the above component When the above component is contained in an amount of 1 ng or more per 1 cm 2 of the coat area of the coat layer, a decrease in differentiation efficiency can be further suppressed. Further, when the above component is contained in an amount of 1 mg or less per 1 cm 2 of the coat area of the coat layer, an increase in the cost required for inducing differentiation can be suppressed.
  • the coatings may be provided in the form of kits combined with cells to produce iBMECs. That is, according to another form of the present disclosure, a differentiation induction kit comprising the above-mentioned coating agent and cells is provided.
  • a differentiation induction kit comprising the above-mentioned coating agent and cells.
  • pluripotent stem cells as described above or intermediate cells in the differentiation process of pluripotent stem cells can be used.
  • pluripotent stem cells are preferably ES cells or iPS cells, and more preferably iPS cells.
  • mammalian cells for example, primates such as humans and chimpanzees, rodents such as mice and rats
  • human cells are preferably used. More preferred.
  • vascular endothelial progenitor cells are preferable. That is, it is particularly preferable that the cells in this kit are vascular endothelial progenitor cells induced to differentiate from human iPS cells.
  • the state of the cells in this kit may be, for example, a state stored at 37 ° C. or the like, a state stored frozen, or the like.
  • the cells in this kit are preferably frozen cells from the standpoint of transport and handling.
  • the user of the kit coats the cells on a culture dish or the like and then seeds and cultivates the cells, or seeds the coating agent and the cells on a culture dish or the like and cultivates the cells. Differentiation can be easily induced into iBMECs.
  • any form of culture dish such as a petri dish or a cell culture plate having a plurality of wells can be used.
  • LN221F and VTN-N do not have the property of solidifying due to temperature rise like Matrigel, so they are easier to handle than Matrigel, and the coating procedure is simple, so they can be reproduced in differentiation induction. It is possible to suppress the deterioration of sex.
  • LN221F and VTN-N are composed of a single component and have a small difference between lots, it is possible to suppress fluctuations in the differentiation efficiency of iBMECs due to differences in manufacturing companies and manufacturing lots. Therefore, according to the present disclosure, a stable supply of iBMECs is possible.
  • the method for producing iBMECs by inducing differentiation of pluripotent stem cells includes a step of culturing pluripotent stem cells using at least one component of LN221F and VTN-N. This step may be a step of seeding pluripotent stem cells in a culture dish or the like coated with at least one component of LN221F and VTN-N at the time of passage and culturing using a medium.
  • a basal medium such as DMEM Ham's F-12 (DMEM / F12) or Human Endothelial-SFM may be used.
  • DMEM / F12 DMEM Ham's F-12
  • Human Endothelial-SFM Human Endothelial-SFM
  • serum or serum substitute Knockout serum replacement (KSR), etc.
  • the serum is not limited to fetal bovine serum, and human serum, sheep serum and the like can also be used.
  • plasma-derived serum (PDS) may be used instead of normal serum.
  • the amount of serum or serum substitute added is, for example, 0.1% (v / v) to 10% (v / v).
  • FGF 2 fibroblast growth factor 2
  • human FGF2 for example, human recombinant FGF2
  • concentration of FGF2 added may be, for example, 1 ng / mL to 500 ng / mL. ..
  • the culture period for inducing differentiation may be, for example, 6 to 30 days, preferably 8 to 12 days. By setting the culture period, it is possible to suppress the deterioration of the efficiency of inducing differentiation into iBMECs, and it is possible to suppress the induction of unintended differentiation (differentiation into another cell).
  • Subculture may be performed during the induction of differentiation. For example, when the cells become confluent or subconfluent, a part of the cells may be collected and transferred to another culture vessel to continue the culture. At the time of cell recovery associated with medium exchange or subculture, cells are previously treated with a ROCK inhibitor (Rho-associated coiled-coil forming kinase / Rho-associated kinase) such as Y-27632 to suppress cell death. May be processed. Further, in order to enhance the selection effect of cells, cells may be seeded on a culture surface coated with fibronectin and collagen IV during the induction of differentiation.
  • ROCK inhibitor Rho-associated coiled-coil forming kinase / Rho-associated kinase
  • culture temperature, etc. may be conditions generally adopted in the culture of animal cells.
  • it may be cultured in an environment of 37 ° C. and 5% CO 2.
  • the method is not limited to the method of culturing cells two-dimensionally using a culture dish or the like, and three-dimensional culture may be carried out using a three-dimensional culture plate or the like containing a coat layer coated with the above coating agent.
  • the mode is not limited to the mode in which the coating agent is pre-coated on a culture instrument such as a culture dish, and a mode in which the use of the coating agent and seeding with cells are performed at the same time may be used.
  • IBMECs are produced from pluripotent stem cells by the above differentiation induction method.
  • a monolayer (cell layer) of iBMECs is formed by continuing culturing under culture conditions suitable for maintenance and proliferation of iBMECs.
  • a cell layer having an excellent barrier function can be obtained.
  • the barrier function of the cell layer obtained by the method of the present disclosure can be characterized by strong tight junctions and maintenance of tight junctions over a long period of time.
  • BMECs in the living body of a rat have a transendothelial electrical resistance value (TEER value), which is an index of tight junction, of about 1000 to 2000 ⁇ ⁇ cm 2 , and as a model of human BBB. It is also desirable to have a TEER value of 1000 ⁇ ⁇ cm 2 or more.
  • TEER value transendothelial electrical resistance value
  • a cell layer having a TEER value of 1000 ⁇ ⁇ cm 2 or more can be formed, and a TEER value of more than 1000 ⁇ ⁇ cm 2 can be set for a long period of time, for example, 9 days or more. Can be maintained.
  • the barrier function of the cell layer obtained by the method of the present disclosure can be further characterized by having the function of an important or characteristic drug transporter (for example, BCRP, P-gp, GLUT1) in BMEC.
  • an important or characteristic drug transporter for example, BCRP, P-gp, GLUT1
  • the function of iBMECs can be determined or evaluated by using the expression of tight junction markers (for example, Claudin5, Occludin, ZO-1) important or characteristic for BMEC as an index.
  • a cell layer of iBMECs can be formed on the semi-permeable membrane.
  • This aspect is particularly effective when the cell layer of iBMECs obtained by the production method of the present disclosure is used for various assays. For example, using a culture vessel equipped with a culture insert (having a culture surface made of a semi-permeable membrane) (for example, Transwell® provided by Corning), cells are cultured in the insert to obtain a cell layer. Can be formed.
  • Another embodiment of the present disclosure relates to the use of iBMECs produced by inducing differentiation by the above method.
  • a cell layer composed of iBMECs it is possible to obtain a cell layer composed of iBMECs, and the cell layer can be used as a BBB model.
  • an assay using the cell layer is useful for evaluating the BBB permeability of a test substance such as a drug or a drug candidate. Therefore, a method for evaluating the BBB permeability of a test substance using the cell layer of iBMECs obtained by the production method of the present disclosure (hereinafter, also referred to as "BBB permeability evaluation method of the present disclosure”) is provided. ..
  • Step of preparing a cell layer of iBMECs obtained by the production method of the present disclosure Step of contacting a test substance with the cell layer
  • Step of contacting a test substance with the cell layer Step of Quantifying the test substance that has permeated the cell layer.
  • step (i) the cell layer of iBMECs obtained by the production method of the present disclosure is prepared.
  • other cells pericytes, astrocytes, etc.
  • a culture vessel equipped with a culture insert to form a cell layer of iBMECs inside the culture insert (a cell layer is formed on the upper surface of the bottom of the culture insert), and adhered to the back surface of the bottom of the culture insert.
  • Perisite is cultivated in (perisite adhesive co-culture system), perisite is cultivated in the compartment between the culture insert and the well (perisite non-adhesive co-culture system), or adhered to the back surface of the bottom of the culture insert.
  • culturing perisite in the culture insert In addition to culturing perisite in the culture insert, culturing astrosite in the section between the culture insert and the well (perisite-adhered / astrosite non-adhesive co-culture system), or culturing the astrosite while adhering to the back surface of the bottom of the culture insert. It is possible to do (astrosite adhesion co-culture system).
  • the "contact” in step (ii) is typically performed by adding the test substance to the medium.
  • the timing of addition of the test substance is not particularly limited. Therefore, after culturing in a medium containing no test substance, the test substance may be added at a certain point in time, or the culture may be started in a medium containing the test substance in advance.
  • a drug or a drug candidate substance is used as a test substance.
  • the test substance is not particularly limited, and organic compounds or inorganic compounds having various molecular sizes can be used as the test substance.
  • organic compounds are nucleic acids, peptides, proteins, lipids (simple lipids, complex lipids (phosphoglycerides, sphingolipids, glycoglycerides, cerebrosides, etc.), prostaglandins, isoprenoids, terpenes, steroids, polyphenols, catechins, vitamins (B1,) B2, B3, B5, B6, B7, B9, B12, C, A, D, E, etc.) can be exemplified.
  • Plant extracts, cell extracts, culture supernatants, etc. may be used as test substances. 2 By adding more than one kind of test substance at the same time, the interaction, synergistic action, etc. between the test substances may be investigated.
  • the test substance may be derived from a natural product or synthetic. In the latter case, for example, a method of combinatorial synthesis can be used to construct an efficient assay system.
  • the period of contact with the test substance can be set arbitrarily.
  • the contact period is, for example, 10 minutes to 3 days, preferably 1 hour to 1 day.
  • the test substance that has permeated the cell layer is quantified.
  • the test substance that has permeated the culture insert that is, the upper container (culture insert) or the lower container via the cell layer.
  • the test substance that has moved into the (well) is quantified by a measurement method according to the test substance.
  • the measurement method include mass analysis, liquid chromatography, immunological method (for example, fluorescence immunoassay (FIA method: Fluorescent Immunoassay), enzyme-linked immunosorbent assay (EIA method: Enzyme Immunoassay)) and the like. Can be done.
  • the membrane permeability of the test substance is evaluated based on the quantification result (the amount of the test substance that has permeated the cell layer) and the amount of the test substance used (typically the amount added to the medium).
  • the effect on the barrier function can be evaluated by measuring the TEER value, permeation test using a non-absorbable marker, and the like.
  • the effect on the expression of the transporter can be evaluated by an immunological method, Western blotting, flow cytometry, etc., and the effect on the function can be evaluated by, for example, an activity test using a substrate.
  • the present disclosure is another use of the cell layer of iBMECs produced by the production method of the present disclosure, which is an evaluation method targeting or targeting BBB function, that is, a method for evaluating the effect of a test substance on BBB function. Also provide.
  • the evaluation method is useful as a means for searching for, for example, a substance that strengthens (improves) the barrier function, a substance that protects the barrier function, a substance that regulates the barrier function, and the like. It can also be used to evaluate toxicity to BBB.
  • a step of preparing the cell layer and a step of bringing the test substance into contact with the cell layer are performed, and then the influence on the barrier function of the cell layer is evaluated.
  • the method for evaluating the effect on the barrier function is as described above.
  • MEF mouse embryonic fibroblasts
  • FBS fetal bovine serum
  • L L-glutamine
  • DMEM fetal bovine serum
  • NEAA non-essential amino acid
  • EDTA trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid
  • Human iPS cells As human iPS cells, 610B1 strain and 648A1 strain (obtained from RIKEN, respectively) were used. Human iPS cells were seeded on MEF (6 ⁇ 10 5 cells / 100 mm dish) treated with mitomycin C and cultured at 37 ° C. in a CO 2 incubator under 5% CO 2 / 95% air conditions. Human iPS cells were passaged at a split ratio of 1: 2 to 1: 4 after culturing for 3 to 5 days.
  • Coating agent Matrigel GFR Crowth Factor Reduced
  • Fibronectin hereinafter also referred to as "FBN”
  • VTN-N N-terminal Vitronectin
  • LN221F Laminin 221 fragment
  • LN411F The Laminin 411 fragment
  • LN511F the Laminin 511 fragment
  • the Matrigel GFR is also simply referred to as "Matrigel".
  • the concentration of the coating agent containing LN221F was 175 ⁇ g / 0.35 mL, and the concentration of the coating agent containing VTN-N was 0.5 mg / mL.
  • a coat layer was formed by using each of the above coating agents.
  • Matrigel was diluted 30-fold with a maintenance medium of human iPS cells on ice, poured into a well plate, and allowed to stand at 37 ° C. for 30 minutes or longer to form a coat layer.
  • For FBN, VTN-N, LN221F, LN411F and LN511F dilute with PBS to 1 ⁇ g / cm 2 , pour into a well plate, and allow to stand at 37 ° C for 1 to 2 hours to form a coat layer. Formed.
  • the mixture of fibronectin and collagen type IV was diluted with PBS to 100 ⁇ g / mL and 400 ⁇ g / mL, respectively, poured into Transwell inserts, and allowed to stand at 37 ° C for 2 hours or longer. A coat layer was formed.
  • FIG. 1 is an explanatory diagram showing a protocol for differentiation of human iPS cells into iBMECs.
  • Matrigel and a single basement membrane component as described above were used as a coating agent from the 0th day to the 8th day of differentiation of iBMECs. And were used respectively.
  • Induction of differentiation was carried out by seeding in a culture dish coated with each of the above coating agents at the time of passage and culturing in StemSure hPSC medium containing 35 ng / mL FGF2, and the proportion of undifferentiated colonies became about 60-70%.
  • DMEM / F12 based medium supplemented with 20% KSR, 0.8% NEAA, 2 mmol / L L-Glu, 0.1 mmol / L 2-MeE to DMEM / F12 (6th day of differentiation).
  • the cells were cultured in a medium supplemented with mL FGF2 for 2 days.
  • TEER value of iBMECs (10th day of differentiation) derived from the 610B1 strain induced to differentiate on Matrigel or FBN, VTN-N, LN221F, LN411F, LN511F was measured. .. The number of samples was 3, and differentiation was induced on FBN, VTN-N, LN221F, LN411F, and LN511F based on the TEER value of iBMECs (hereinafter, also referred to as "Matrigel-iBMECs”) induced to differentiate on Matrigel. The relative TEER value of iBMECs was calculated.
  • LN221F-iBMECs Matrigel-iBMECs and iBMECs induced to differentiate on LN221F
  • LN221F-iBMECs were set on the first day after sowing (differentiation). Measurements were taken from 9th day) to 10th day after sowing (18th day of differentiation). The number of samples was 6, and the change over time in the TEER value was determined. The TEER value was measured using Millicell ERS-2 (chopstick type) according to the attached manual. The volume of the medium was 300 ⁇ L on the apical side and 800 ⁇ L on the basal side.
  • FD4 and LY Permeation test of Fluorescein isothiocyanate-dextran 4 kDa (FD4) and lucifer yellow (LY) Permeation test of FD4 and LY was performed on Matrigel-iBMECs and LN221F-iBMECs for 610B1 strain and 648A1 strain, respectively. I did. The number of samples was 6. On the 10th day of differentiation, the medium was replaced with transport buffer (HBSS containing 10 mM HEPES solution) and cultured at 37 ° C. for 20 minutes. Transport buffer containing 1 mg / mL FD4 or 300 ⁇ M LY was added to the apical side. After incubating at 37 ° C.
  • transport buffer HBSS containing 10 mM HEPES solution
  • FD4 or LY fluorescence intensities were measured with a Synergy HTX multimode plate reader and analyzed with Gen5 data analysis software.
  • RNA extraction Extraction was performed according to the attached manual of Agencourt (registered trademark) RNAdvance Tissue Kit.
  • RT-q PCR method Analysis of gene expression levels of Matrigel-iBMECs and LN221F-iBMECs (10th day of differentiation) derived from 610B1 strain and human-derived primary BMECs (hereinafter, also referred to as "hBMECs") is performed by RT-q. It was performed by PCR. The number of samples of Matrigel-iBMECs and LN221F-iBMECs was 3, and the number of samples of hBMECs was 1. RT-q PCR was performed using the KAPA SYBR Fast qPCR Kit, using cDNA as a template, according to the attached manual. The primer sequences used in RT-q PCR are shown in Table 2.
  • the results obtained were corrected using HPRT1 as an endogenous control.
  • the relative expression levels of mRNA in LN221F-iBMECs and hBMECs were determined based on the mRNA expression levels in Matrigel-iBMECs.
  • the sequence of the forward primer of CDH5 is shown in SEQ ID NO: 1
  • the sequence of the reverse primer of CDH5 is shown in SEQ ID NO: 2
  • the sequence of the forward primer of MDR1 is shown in SEQ ID NO: 3.
  • MDR1 reverse primer sequence is shown in SEQ ID NO: 4
  • BCRP forward primer sequence is shown in SEQ ID NO: 5
  • BCRP reverse primer sequence is shown in SEQ ID NO: 6
  • GLUT1 forward primer sequence is shown in SEQ ID NO: 7.
  • the sequence of the reverse primer of GLUT1 is shown in SEQ ID NO: 8
  • the sequence of the forward primer of Occludin is shown in SEQ ID NO: 9
  • the sequence of the reverse primer of Occludin is shown in SEQ ID NO: 10
  • the sequence of the forward primer of ZO-1 is shown in.
  • SEQ ID NO: 11 the sequence of the reverse primer of ZO-1 is shown in SEQ ID NO: 12
  • sequence of the forward primer of LAT1 is shown in SEQ ID NO: 13
  • sequence of the reverse primer of LAT1 is shown in SEQ ID NO: 14.
  • the sequence of the forward primer is shown in SEQ ID NO: 15, and the sequence of the reverse primer of HPRT1 is shown in SEQ ID NO: 16.
  • the primary antibody was reacted at room temperature for 2 hours. After washing 3 times with PBS, the secondary antibody was reacted at room temperature with a 200-fold dilution for 60 minutes. At this time, 1 ⁇ g / mL DAPI, which is a nuclear staining reagent, was also reacted at the same time. Then, it was washed with PBS three times and analyzed with an operetta high content imaging system.
  • Cadherin 5 claudin 5
  • P-glycoprotein P-gp
  • BCRP breast cancer resistant protein
  • the cells were washed 3 times with PBS containing 0.1 w / v% BSA, and the secondary antibody (Anti-Rabbit, Anti-Mouse) was reacted at room temperature with a 200-fold dilution for 60 minutes. Then, it was washed 3 times with PBS containing 0.1 w / v% BSA, and 1 ⁇ g / mL DAPI was reacted for 5 minutes. Then, it was reacted in 4 w / v% paraformaldehyde for 5 minutes. Subsequently, the cells were washed 3 times with PBS and analyzed with an operetta high content imaging system.
  • the secondary antibody Anti-Rabbit, Anti-Mouse
  • FIG. 2 is an explanatory diagram showing the relative TEER values of iBMECs induced to differentiate on each coat layer.
  • the vertical axis shows the relative TEER value when the TEER value of Matrigel-iBMECs is 1.0 as a reference
  • the horizontal axis shows the types of iBMECs. From the results shown in FIG. 2, it was found that the iBMECs induced to differentiate on LN221F and VTN-N showed higher TEER values than the iBMECs induced to differentiate on Matrigel.
  • LN221F-iBMECs showed a TEER value about twice as high as that of Matrigel-iBMECs. Therefore, it can be said that iBMECs induced to differentiate on LN221F and VTN-N have a higher barrier function than iBMECs induced to differentiate on Matrigel.
  • FIG. 3 is an explanatory diagram showing changes over time in TEER values in Matrigel-iBMECs and LN221F-iBMECs derived from the 610B1 strain.
  • FIG. 4 is an explanatory diagram showing changes over time in TEER values in Matrigel-iBMECs and LN221F-iBMECs derived from the 648A1 strain.
  • the vertical axis represents the TEER value ( ⁇ ⁇ cm 2 )
  • the horizontal axis represents the number of days elapsed after sowing. From the results shown in FIGS.
  • LN221F-iBMECs show a higher TEER value over a long period of time than Matrigel-iBMECs when both the 610B1 strain and the 648A1 strain are used as human iPS cells. all right. That is, it can be said that iBMECs induced to differentiate on LN221F have a long-term higher barrier function than iBMECs induced to differentiate on Matrigel.
  • LN221F-iBMECs showed a TEER value of 1000 ⁇ ⁇ cm 2 or more over a long period of time regardless of whether 610B1 strain or 648A1 strain was used as human iPS cells, which is useful as a model for human BBB. It turned out that there was.
  • FIG. 5 is an explanatory diagram showing the results of a permeation test of FD4 in Matrigel-iBMECs and LN221F-iBMECs.
  • FIG. 6 is an explanatory diagram showing the results of the LY permeation test in Matrigel-iBMECs and LN221F-iBMECs.
  • the vertical axis indicates the transmission coefficient (10 -6 cm / sec)
  • the horizontal axis indicates the type of iBMECs. From the results shown in FIGS.
  • LN221F-iBMECs have a higher barrier function than Matrigel-iBMECs. Therefore, LN221F-iBMECs were found to be useful as a model for human BBB.
  • FIG. 7 is an explanatory diagram showing the analysis results of the expression level of each gene in Matrigel-iBMECs, LN221F-iBMECs, and hBMECs.
  • the vertical axis shows the relative mRNA expression level when the mRNA expression level of each gene in Matrigel-iBMECs is 1.0 as a reference, and the horizontal axis shows the type of iBMECs or BMECs. .. From the results shown in FIG.
  • LN221F-iBMECs is almost the same as that of Matrigel-iBMECs when any of CDH5, MDR1, BCRP, ZO-1, Occludin, GLUT1 and LAT1 is used as the BMEC marker. I understand.
  • FIG. 8 is an explanatory diagram showing the results of protein expression analysis by immunostaining in Matrigel-iBMECs and LN221F-iBMECs.
  • a 50 ⁇ m scale bar is shown along with the images obtained by immunofluorescence staining.
  • the protein expression level of LN221F-iBMECs was almost the same as that of Matrigel-iBMECs when any of CDH5, P-gp, BCRP, ZO-1, Occludin and Claudin 5 was used as the BMEC marker. And localized.
  • LN221F-iBMECs have the same properties as BMECs as Matrigel-iBMECs. Therefore, LN221F-iBMECs were found to be useful as a model for human BBB.
  • FIG. 9 is an explanatory diagram showing the results of functional analysis of P-gp in Matrigel-iBMECs and LN221F-iBMECs.
  • FIG. 10 is an explanatory diagram showing the results of functional analysis of BCRP in Matrigel-iBMECs and LN221F-iBMECs.
  • the vertical axis shows the relative substrate accumulation amount when the substrate accumulation amount in the absence of the inhibitor for the excretion transporter is set to 1.0
  • the horizontal axis shows the excretion transporter. Indicates the presence or absence of an inhibitor against. From the results shown in FIGS.
  • LN221F-iBMECs like Matrigel-iBMECs, have a higher amount of substrate accumulated in the presence of an inhibitor for the efflux transporter than in the absence of such an inhibitor. It was confirmed that it would be. Therefore, it was found that LN221F-iBMECs have the functions of P-gp and BCRP as well as Matrigel-iBMECs.
  • iBMECs that enable the construction of a BBB model with a high barrier function can be stably induced to differentiate from pluripotent stem cells. Therefore, it is possible to provide a stable supply of iBMECs and contribute to the establishment of a supply system for iBMECs for pharmaceutical companies and research institutes.
  • the BBB model constructed using the present disclosure can be used, for example, in an evaluation system for the efficacy / safety of a drug.
  • SEQ ID NO: 1 Artificial sequence description: CDH5 forward primer SEQ ID NO: 2: Artificial sequence description: CDH5 reverse primer SEQ ID NO: 3: Artificial sequence description: MDR1 forward primer SEQ ID NO: 4: Artificial sequence description: MDR1 reverse primer SEQ ID NO: 5: Description of artificial sequence: BCRP forward primer SEQ ID NO: 6: Description of artificial sequence: BCRP reverse primer SEQ ID NO: 7: Description of artificial sequence: GLUT1 forward primer SEQ ID NO: 8: Description of artificial sequence: GLUT1 reverse primer SEQ ID NO: 9: Description of Artificial Sequence: Occludin Forward Primer SEQ ID NO: 10: Description of Artificial Sequence: Occludin Reverse Primer SEQ ID NO: 11: Description of Artificial Sequence: ZO-1 Forward Primer SEQ ID NO: 12: Description of Artificial Sequence: ZO-1 Reverse Primer SEQ ID NO: 13: Description of artificial sequence: LAT1 forward primer SEQ ID NO: 14: Description of artificial sequence: LAT1 reverse primer SEQ ID NO: 15: Description of

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Abstract

脳毛細血管内皮様細胞の安定供給を可能にする技術を提供する。多能性幹細胞から脳毛細血管内皮様細胞への分化誘導用コーティング剤は、ラミニン２２１断片と、Ｎ末端ビトロネクチンと、のうちの少なくとも一つの成分を含む。

Description

多能性幹細胞を脳毛細血管内皮様細胞へと分化誘導するためのコーティング剤およびその利用
　本開示は、多能性幹細胞から脳毛細血管内皮様細胞への分化誘導用コーティング剤に関する。本出願は、２０２０年２月１０日に出願された日本出願番号２０２０－０２１０３１号に基づくもので、ここにその記載内容を援用する。
　血液脳関門（Blood-Brain Barrier：BBB）の構成細胞の１つである脳毛細血管内皮細胞（Brain microvascular endothelial cells：BMECs）は、強力な細胞間接着と排出トランポーターの発現とによって、物質の脳実質への非特異的侵入を阻害する。創薬において、この強いバリア機能が医薬品候補薬の脳実質（神経）側への移行を阻害するため、薬物開発が中止になることがある。このため、ヒトBBBにおいて薬物動態を評価できるスクリーニングモデルが望まれており、多能性幹細胞を脳毛細血管内皮様細胞（iBMECs）へと分化誘導することが行われている（例えば、特許文献１）。
国際公開第２０１９／２０８７３６号
　特許文献１では、ヒト人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cells：iPS細胞）をiBMECsへと分化誘導する際に、マトリゲル（Matrigel）がコーティングされた培養皿を用いて培養を行なっている。しかしながら、マトリゲルは、温度が上昇すると固形化する性質を有し、また、コーティングに複雑な操作を要するため、再現性を保つことが困難であった。加えて、マトリゲルがマウスの肉芽腫から製造されることから、マトリゲルの製造会社や製造ロットの違いに起因してiBMECsの分化効率が変動する。このため、本発明者らは、鋭意研究を進めることにより、iBMECsの安定供給を可能にする技術を発明するに至った。
　本発明は、上述の課題を解決するためになされたものであり、以下の形態として実現することが可能である。
（１）本発明の一形態によれば、多能性幹細胞から脳毛細血管内皮様細胞への分化誘導用コーティング剤が提供される。この形態のコーティング剤は、ラミニン２２１断片と、Ｎ末端ビトロネクチンと、のうちの少なくとも一方の成分を含む。この形態のコーティング剤によれば、多能性幹細胞を脳毛細血管内皮様細胞へと分化誘導する際の再現性の低下を抑制でき、また、分化効率の変動を抑制できるので、脳毛細血管内皮様細胞を安定供給することができる。
（２）上記形態のコーティング剤において、前記成分は、前記コーティング剤において、０．０１ｎｍｏｌ／Ｌ以上１０ｍｍｏｌ／Ｌ以下含まれていてもよい。この形態のコーティング剤によれば、分化効率の低下をより抑制できる。
（３）本発明の他の形態によれば、分化誘導キットが提供される。この形態の分化誘導キットは、上記コーティング剤と、細胞と、を備える。この形態の分化誘導キットによれば、多能性幹細胞を脳毛細血管内皮様細胞へと容易に分化誘導できる。
（４）本発明は、ラミニン２２１断片と、Ｎ末端ビトロネクチンと、のうちの少なくとも一方の成分を含む、多能性幹細胞から脳毛細血管内皮様細胞への分化誘導用コーティング剤としての利用によっても実現できる。
（５）本発明の他の形態によれば、多能性幹細胞から脳毛細血管内皮様細胞への分化誘導用コーティング剤がコートされたコート層を含む培養皿が提供される。この形態の培養皿において、前記コーディング剤は、ラミニン２２１断片と、Ｎ末端ビトロネクチンと、のうちの少なくとも一方の成分を含む。この形態の培養皿によれば、多能性幹細胞を脳毛細血管内皮様細胞へと分化誘導する際の再現性の低下を抑制でき、また、分化効率の変動を抑制できるので、脳毛細血管内皮様細胞を安定供給することができる。
（６）上記形態の培養皿において、前記成分は、前記コート層のコート面積１ｃｍ２あたり、１ｎｇ以上１ｍｇ以下含まれていてもよい。この形態のコーティング剤によれば、分化効率の低下をより抑制できる。
（７）本発明の他の形態によれば、多能性幹細胞を分化誘導することにより脳毛細血管内皮様細胞を製造する方法が提供される。この形態の脳毛細血管内皮様細胞の製造方法は、ラミニン２２１断片と、Ｎ末端ビトロネクチンと、のうちの少なくとも一方の成分を用いて前記多能性幹細胞を培養する工程を含む。この形態の脳毛細血管内皮様細胞の製造方法によれば、多能性幹細胞を脳毛細血管内皮様細胞へと分化誘導する際の再現性の低下を抑制でき、また、分化効率の変動を抑制できるので、脳毛細血管内皮様細胞を安定供給することができる。
（８）上記形態の脳毛細血管内皮様細胞の製造方法において、前記多能性幹細胞は、人工多能性幹細胞であってもよい。
（９）上記形態の脳毛細血管内皮様細胞の製造方法において、前記人工多能性幹細胞は、ヒト人工多能性幹細胞であってもよい。
（１０）本発明の他の形態によれば、上記形態の脳毛細血管内皮様細胞の製造方法により得られた脳毛細血管内皮様細胞の細胞層を用いて、被検物質の脳血管関門透過性を評価する方法が提供される。
（１１）上記形態の被検物質の脳血管関門透過性を評価する方法は、以下の工程（ｉ）～（ｉｉｉ）を含んでいてもよい。
　（ｉ）前記細胞層を用意する工程；
　（ｉｉ）前記細胞層に前記被検物質を接触させる工程；
　（ｉｉｉ）前記細胞層を透過した前記被検物質を定量することにより、前記被検物質の透過性を評価する工程。
（１２）本発明の他の形態によれば、上記形態の脳毛細血管内皮様細胞の製造方法により得られた脳毛細血管内皮様細胞の細胞層を用いて、被検物質の脳血管関門バリア機能への影響を評価する方法が提供される。
（１３）本発明の他の形態によれば、多能性幹細胞を脳毛細血管内皮様細胞へと分化誘導する方法が提供される。この形態の多能性幹細胞を脳毛細血管内皮様細胞へと分化誘導する方法は、ラミニン２２１断片と、Ｎ末端ビトロネクチンと、のうちの少なくとも一方の成分を用いて前記多能性幹細胞を培養する工程を含む。この形態の多能性幹細胞を脳毛細血管内皮様細胞へと分化誘導する方法によれば、多能性幹細胞を脳毛細血管内皮様細胞へと分化誘導する際の再現性の低下を抑制でき、また、分化効率の変動を抑制できるので、脳毛細血管内皮様細胞を安定供給することができる。
ヒトiPS細胞のiBMECsへの分化プロトコールを示す説明図。 各コート層上にて分化誘導されたiBMECsの相対TEER値を示す説明図。 610B1株由来のMatrigel-iBMECsおよびLN221F-iBMECsにおけるTEER値の経時的変化を示す説明図。 648A1株由来のMatrigel-iBMECsおよびLN221F-iBMECsにおけるTEER値の経時的変化を示す説明図。 Matrigel-iBMECsおよびLN221F-iBMECsにおけるFD4の透過試験の結果を示す説明図。 Matrigel-iBMECsおよびLN221F-iBMECsにおける LY の透過試験の結果を示す説明図。 Matrigel-iBMECsおよびLN221F-iBMECs、並びに hBMECsにおける、各遺伝子の発現量の解析結果を示す説明図。 Matrigel-iBMECsおよびLN221F-iBMECsにおける、免疫染色法によるタンパク質発現解析の結果を示す説明図。 Matrigel-iBMECsおよびLN221F-iBMECsにおける、P-gpの機能解析の結果を示す説明図。 Matrigel-iBMECsおよびLN221F-iBMECsにおける、BCRPの機能解析の結果を示す説明図。
　本明細書の開示は、多能性幹細胞を脳毛細血管内皮様細胞へと分化誘導するためのコーティング剤に関する。脳毛細血管内皮細胞（以下、「BMECs」とも呼ぶ）は、血液脳関門（以下、「BBB」とも呼ぶ）を構成する主要な細胞である。BBBは、BMECsの周りを周皮細胞（ペリサイト）やアストロサイトが覆った構造を有する。本開示によれば、BMECsに類似した細胞、即ち、BMECsの特性を示す脳毛細血管内皮様細胞（以下、「iBMECs」とも呼ぶ）が得られる。本開示の方法によって得られるiBMECsは、BBBモデルの構築に有用であり、例えば、被検物質（典型的には薬物）の脳内移行性（脳血管関門透過性）評価に利用される。
　「多能性幹細胞」とは、生体を構成するすべての細胞に分化しうる能力（分化多能性）と、細胞分裂を経て自己と同一の分化能を有する娘細胞を生み出す能力（自己複製能）とを併せ持つ細胞をいう。分化多能性は、評価対象の細胞をヌードマウスに移植し、三胚葉（外胚葉、中胚葉、内胚葉）のそれぞれの細胞を含むテラトーマ形成の有無を試験することにより評価することができる。
　多能性幹細胞として胚性幹細胞（ES細胞）、胚性生殖細胞（EG細胞）、人工多能性幹細胞（iPS細胞）等を挙げることができるが、分化多能性及び自己複製能を併せ持つ細胞である限り、これに限定されない。好ましくは、ES細胞またはiPS細胞を用いる。更に好ましくはiPS細胞を用いる。多能性幹細胞は、好ましくは哺乳動物（例えば、ヒトやチンパンジーなどの霊長類、マウスやラットなどのげっ歯類等）の細胞、特に好ましくはヒトの細胞である。従って、本開示の最も好ましい態様では、多能性幹細胞として、ヒトiPS細胞が用いられる。
　ES細胞は、例えば、着床以前の初期胚、当該初期胚を構成する内部細胞塊、単一割球等を培養することによって樹立することができる（Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual， Second Edition， Cold Spring Harbor Laboratory Press（1994） ;Thomson，J. A. et al.，Science，282， 1145-1147（1998））。初期胚として、体細胞の核を核移植することによって作製された初期胚を用いてもよい（Wilmut et al.（Nature， 385， 810（1997））、Cibelli et al. （Science， 280， 1256（1998））、入谷明ら（蛋白質核酸酵素， 44， 892 （1999））、Baguisi et al. （Nature Biotechnology， 17， 456 （1999））、Wakayama et al. （Nature， 394， 369 （1998）; Nature Genetics， 22， 127 （1999）; Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 96， 14984 （1999））、Rideout III et al. （Nature Genetics， 24， 109 （2000）、Tachibana et al. （Human Embryonic Stem Cells Derived by Somatic Cell Nuclear Transfer, Cell （2013） in press）。初期胚として、単為発生胚を用いてもよい（Kim et al. （Science， 315， 482-486 （2007））、Nakajima et al. （Stem Cells， 25， 983-985 （2007））、Kim et al. （Cell Stem Cell， 1， 346-352 （2007））、Revazova et al. （Cloning Stem Cells， 9， 432-449 （2007））、Revazova et al.（Cloning Stem Cells， 10， 11-24 （2008））。上掲の論文の他、ES細胞の作製についてはStrelchenko N., et al. Reprod Biomed Online. 9: 623-629, 2004；Klimanskaya I., et al. Nature 444: 481-485, 2006；Chung Y., et al. Cell Stem Cell 2: 113-117, 2008；Zhang X., et al Stem Cells 24: 2669-2676, 2006；Wassarman, P.M. et al. Methods in Enzymology, Vol.365, 2003等が参考になる。なお、ES細胞と体細胞の細胞融合によって得られる融合ES細胞も、本開示における胚性幹細胞に含まれる。
　ES細胞の中には、保存機関から入手可能なもの、或いは市販されているものもある。例えば、ヒトES細胞については、京都大学再生医科学研究所（例えばKhES-1、KhES-2及びKhES-3）、WiCell Research Institute、ESI BIOなどから入手可能である。また、ES細胞は、始原生殖細胞を、LIF、bFGF、SCFの存在下で培養すること等により樹立することができる（Matsui et al.， Cell， 70， 841-847 （1992）、Shamblott et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 95 （23）, 13726-13731 （1998）、Turnpenny et al.， Stem Cells， 21（5）， 598-609，（2003））。
　iPS細胞は、初期化因子の導入などにより体細胞をリプログラミングすることによって作製される、多能性（多分化能）と増殖能を有する細胞である。iPS細胞は、ES細胞に近い性質を示す。iPS細胞の作製に使用する体細胞は、特に限定されず、分化した体細胞でもよいし、未分化の幹細胞でもよい。また、その由来も特に限定されないが、好ましくは哺乳動物（例えば、ヒトやチンパンジーなどの霊長類、マウスやラットなどのげっ歯類）の体細胞、特に好ましくはヒトの体細胞を用いる。iPS細胞は、これまでに報告された各種方法によって作製することができる。また、今後開発されるiPS細胞作製法を適用することも当然に想定される。
　iPS細胞作製法の最も基本的な手法は、転写因子であるOct3/4、Sox2、Klf4及びc-Mycの４因子を、ウイルスを利用して細胞へ導入する方法である（Takahashi K, Yamanaka S: Cell 126 (4), 663-676, 2006; Takahashi, K, et al: Cell 131 (5), 861-72, 2007）。ヒトiPS細胞についてはOct4、Sox2、Lin28及びNonogの４因子の導入による樹立の報告がある（Yu J, et al: Science 318(5858), 1917-1920, 2007）。c-Mycを除く３因子（Nakagawa M, et al: Nat. Biotechnol. 26 (1), 101-106, 2008）、Oct3/4及びKlf4の２因子（Kim J B, et al: Nature 454 (7204), 646-650, 2008）、或いはOct3/4のみ（Kim J B, et al: Cell 136 (3), 411-419, 2009）の導入によるiPS細胞の樹立も報告されている。また、遺伝子の発現産物であるタンパク質を細胞に導入する手法（Zhou H, Wu S, Joo JY, et al: Cell Stem Cell 4, 381-384, 2009; Kim D, Kim CH, Moon JI, et al: Cell Stem Cell 4, 472-476, 2009）も報告されている。一方、ヒストンメチル基転移酵素G9aに対する阻害剤BIX-01294やヒストン脱アセチル化酵素阻害剤バルプロ酸（VPA）或いはBayK8644等を使用することによって、作製効率の向上や導入する因子の低減などが可能であるとの報告もある（Huangfu D, et al: Nat. Biotechnol. 26 (7), 795-797, 2008; Huangfu D, et al: Nat. Biotechnol. 26 (11), 1269-1275, 2008; Silva J, et al: PLoS. Biol. 6 (10), e 253, 2008）。遺伝子導入法についても検討が進められ、レトロウイルスの他、レンチウイルス（Yu J, et al: Science 318(5858), 1917-1920, 2007）、アデノウイルス（Stadtfeld M, et al: Science 322 (5903), 945-949, 2008）、プラスミド（Okita K, et al: Science 322 (5903), 949-953, 2008）、トランスポゾンベクター（Woltjen K, Michael IP, Mohseni P, et al: Nature 458, 766-770, 2009; Kaji K, Norrby K, Pac a A, et al: Nature 458, 771-775, 2009; Yusa K, Rad R, Takeda J, et al: Nat Methods 6, 363-369, 2009）、或いはエピソーマルベクター（Yu J, Hu K, Smuga-Otto K, Tian S, et al: Science 324, 797-801, 2009）を遺伝子導入に利用した技術が開発されている。
　iPS細胞への形質転換、即ち初期化（リプログラミング）が生じた細胞は、Fbxo15、Nanog、Oct/4、Fgf-4、Esg-1及びCript等の多能性幹細胞マーカー（未分化マーカー）の発現などを指標として選択することができる。選択された細胞をiPS細胞として回収する。
　iPS細胞は、例えば、国立大学法人京都大学又は国立研究開発法人理化学研究所バイオリソースセンターから提供を受けることもできる。
　本明細書において「分化誘導する」とは、特定の細胞系譜に沿って分化するように働きかけることをいう。本開示では、多能性幹細胞を脳毛細血管内皮様細胞（iBMECs）へと分化誘導する際に、ラミニン２２１断片（以下、「LN221F」とも呼ぶ）とＮ末端ビトロネクチン（以下、「VTN-N」とも呼ぶ）とのうちの少なくとも一つの成分を含むコーティング剤を用いる。以下、コーティング剤の詳細を説明する。
＜コーティング剤＞
　一般に、細胞の生存率や増殖率の向上、分化誘導の促進、細胞のセレクション等のため、基底膜成分や接着分子などでコートした培養面上で細胞を培養することがある。従来からコーティング剤として用いられているマトリゲル（Matrigel）は、ラミニン１１１を主要構成成分とし、コラーゲンタイプＩＶ、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチン/ナイドロギェンおよび多様なグロースファクターを含んでいる。
　ラミニンは、α鎖、β鎖およびγ鎖の３本のサブユニット鎖からなるヘテロ３量体分子であり、α鎖はα1～α5の５種類、β鎖はβ1～β3の３種類、γ鎖はγ1～γ3の３種類が知られている。ラミニンのReference Sequence RNAとしては、NM_000426, NM_001079823 (Subunit alpha2), NM_002291 (Subunit beta1), NM_002292 (Subunit beta2), NM_000228 (Subunit beta3), NM_001318046, NM_001318047, NM_001318048, NM_007356 (Subunit beta4), NM_002293 (Subunit gamma 1), NM_005562, NM_018891 (Subunit gamma 2)が知られている。
　ラミニン２２１は、α2鎖、β2鎖、γ1鎖のサブユニット鎖からなるラミニン分子であり、心臓に多く存在することが知られている。
　本明細書において、「ラミニン２２１断片（LN221F）」とは、ラミニン２２１のうちインテグリン結合部位に相当する断片（Ｅ８断片)を意味している。また、本明細書における「ラミニン２２１断片（LN221F）」には、LN221Fと相同性が高いタンパク質も含まれるものとする。本明細書において、「LN221Fと相同性が高いタンパク質」とは、かかるタンパク質を構成するアミノ酸配列中に、LN221Fのアミノ酸配列と80％以上一致するアミノ酸配列を含むものをいう。すなわち、「LN221Fと相同性が高いタンパク質」には、LN221Fよりもアミノ酸配列が長いタンパク質も含まれる。バリア機能を高める観点から、LN221Fと相同性が高いタンパク質の相同性は、80％以上であることが好ましく、90％以上であることがより好ましく、95％以上であることがさらに好ましい。なお、一般に、ラミニン２２１断片（LN221F）の分子量は、約１５０ｋＤａ～約１７０ｋＤａである。本明細書においては、ラミニン２２１断片（LN221F）の分子量を１５０ｋＤａであるものと推定する。
　本明細書において、「Ｎ末端ビトロネクチン（VTN-N）」とは、ビトロネクチンのＮ末端が欠失しており、且つ、RGD配列を含むタンパク質を意味している。また、本明細書における「Ｎ末端ビトロネクチン（VTN-N）」には、VTN-Nと相同性が高いタンパク質も含まれるものとする。本明細書において、「VTN-Nと相同性が高いタンパク質」とは、かかるタンパク質を構成するアミノ酸配列中にVTN-Nのアミノ酸配列と70％以上一致するアミノ酸配列を含むもの、または、アミノ酸配列中にRGD配列を含むものをいう。「VTN-Nと相同性が高いタンパク質」には、VTN-Nよりもアミノ酸配列が長いタンパク質も含まれる。バリア機能を高める観点から、VTN-Nと相同性が高いタンパク質の相同性は、80％以上であることが好ましく、90％以上であることがより好ましく、95％以上であることがさらに好ましい。ビトロネクチンのReference Sequence RNAとしては、NM_000638が知られており、ビトロネクチンのReference Sequence proteinとしては、N NP_000629が知られている。なお、本明細書においては、Ｎ末端ビトロネクチン（VTN-N）の分子量を４７．６ｋＤａであるものと推定する。
　本開示のコーティング剤は、LN221FとVTN-Nとのうちのいずれか一方のみを含有していてもよく、LN221FとVTN-Nとを両方含有していてもよい。すなわち、本開示のコーティング剤は、LN221FとVTN-Nとのうちの少なくとも一方の成分を含んでいる。本開示のコーティング剤は、LN221Fを含むことが好ましい。なお、本開示のコーティング剤は、マトリゲルを除いてもよい。上記成分は、コーティング剤において、０．０１ｎｍｏｌ／Ｌ以上含まれていてもよく、１０ｍｍｏｌ／Ｌ以下含まれていてもよい。上記成分の含有量は、好ましくは、コーティング剤において、０．１ｎｍｏｌ／Ｌ以上であり、より好ましくは、１ｎｍｏｌ／Ｌ以上である。上記成分の含有量は、好ましくは、コーティング剤において、１ｍｍｏｌ／Ｌ以下であり、より好ましくは、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ以下である。上記成分がコーティング剤において０．０１ｎｍｏｌ／Ｌ以上含まれることにより、分化効率を向上させることができる。また、上記成分がコーティング剤において１ｍｍｏｌ／Ｌ以下含まれることにより、分化誘導に要するコストの増大を抑制できる。
　上記成分を含むコーティング剤を培地等で希釈し、培養皿やトランズウェルインサート等に注いで静置することによって、コート層が形成された培養皿等を得ることができる。以下、コート層を形成することを、「コーティングする」とも呼ぶ。上記成分は、培養皿の面積、すなわちコート層のコート面積１ｃｍ２あたり、１ｎｇ以上含まれていてもよく、１ｍｇ以下含まれていてもよい。上記成分の含有量は、好ましくはコート面積１ｃｍ２あたり、１０ｎｇ以上であり、より好ましくは０．１μｇ以上である。また、上記成分の含有量は、好ましくはコート面積１ｃｍ２あたり、０．１ｍｇ以下であり、より好ましくは１０μｇ以下である。上記成分がコート層のコート面積１ｃｍ２あたり１ｎｇ以上含まれることにより、分化効率の低下をより抑制できる。また、上記成分がコート層のコート面積１ｃｍ２あたり１ｍｇ以下含まれることにより、分化誘導に要するコストの増大を抑制できる。
＜分化誘導キット＞
　上記コーティング剤は、iBMECsを製造するために、細胞と組み合わされたキットの形態で提供されてもよい。すなわち、本開示の他の形態によれば、上記コーティング剤と細胞とを備える分化誘導キットが提供される。このキットにおける細胞としては、上述のような多能性幹細胞または多能性幹細胞の分化過程における中間細胞を用いることができる。このような多能性幹細胞は、ES細胞またはiPS細胞であることが好ましく、iPS細胞であることがより好ましい。また、このような多能性幹細胞としては、哺乳動物（例えば、ヒトやチンパンジーなどの霊長類、マウスやラットなどのげっ歯類等）の細胞を用いることが好ましく、ヒトの細胞を用いることがより好ましい。分化過程における中間細胞としては、血管内皮前駆細胞であることが好ましい。すなわち、このキットにおける細胞は、ヒトiPS細胞から分化誘導された血管内皮前駆細胞であることが特に好ましい。また、このキットにおける細胞の状態は、例えば、３７℃等で保存された状態や凍結保存された状態等であってもよい。このキットにおける細胞は、輸送および取り扱いの観点から、凍結細胞であることが好ましい。キットの利用者は、コーティング剤を培養皿等にコーティングしたうえで細胞を播種して培養したり、コーティング剤と細胞とを培養皿等に播種して細胞を培養したりすることによって、細胞をiBMECsへと容易に分化誘導できる。培養の際には、キットに含まれるコーティング剤および細胞に加えて他の材料を併用してもよく、適宜継代培養を行ってもよい。なお、培養皿としては、例えば、シャーレや、複数のウェルを有するセルカルチャープレート等、任意の形態の培養皿を用いることができる。
　LN221FやVTN-Nは、Matrigelのような温度上昇により固形化する性質を有さないため、Matrigelと比較して取り扱いが容易であり、また、コーティング手順が簡便であることから、分化誘導における再現性の低下を抑制できる。また、LN221FやVTN-Nは、単一成分により構成され、ロット間差が少ないことから、製造会社や製造ロットの違いに起因するiBMECsの分化効率の変動を抑制できる。したがって、本開示によれば、iBMECsの安定供給が可能となる。
＜多能性幹細胞を分化誘導することによりiBMECsを製造する方法＞
　本開示における、多能性幹細胞を分化誘導することによりiBMECsを製造する方法は、LN221FとVTN-Nとのうちの少なくとも一方の成分を用いて多能性幹細胞を培養する工程を含む。この工程は、継代時に、LN221FとVTN-Nとのうちの少なくとも一方の成分でコーティングされた培養皿等に多能性幹細胞を播種し、培地を用いて培養する工程であってもよい。
　分化誘導の際の用いる培地としては、例えば、DMEM Ham’s F-12（DMEM/F12）やHuman Endothelial-SFM等の基礎培地を採用してもよい。培地には、細胞の増殖率や維持等の観点から、血清又は血清代替物（Knockout serum replacement(KSR)等）を添加することが好ましい。血清は、ウシ胎仔血清に限られるものではなく、ヒト血清や羊血清等を用いることもできる。また、通常の血清ではなく、血漿由来血清（PDS）を用いることにしてよい。血清又は血清代替物の添加量は例えば0.1%(v/v)～10%(v/v)である。培地には、ヒトFGF2（例えばヒト組換えFGF2）等の線維芽細胞増殖因子（FGF）2を添加することが好ましく、FGF2の添加濃度は、例えば1ng/mL～500ng/mLであってもよい。
　分化誘導の培養期間は、例えば6日間～30日間であってもよく、好ましくは8日間～12日間である。当該培養期間とすることにより、iBMECsへの分化誘導効率の悪化を抑制でき、また、意図しない分化（別の細胞への分化）が引き起こされることを抑制できる。
　分化誘導の途中において、継代培養を行ってもよい。例えばコンフルエント又はサブコンフルエントになった際に細胞の一部を採取して別の培養容器に移し、培養を継続してもよい。培地交換や継代培養などに伴う、細胞の回収の際には、細胞死を抑制するためにY-27632等のROCK阻害剤（Rho-associated coiled-coil forming kinase/Rho結合キナーゼ）で予め細胞を処理しておいてもよい。また、細胞のセレクション効果を高めるために、分化誘導の途中において、フィブロネクチンとコラーゲンIVとがコーティングされた培養面に細胞を播種してもよい。
　その他の培養条件（培養温度など）は、動物細胞の培養において一般に採用されている条件とすればよい。例えば37℃、5%CO2の環境下で培養してもよい。また、培養皿等を用いて二次元的に細胞を培養する方法に限らず、上記コーティング剤がコートされたコート層を含む３次元培養プレート等を用いた３次元培養を実施してもよい。また、上記コーティング剤が培養皿等の培養器具に予めコーティングされている態様に限らず、上記コーティング剤の使用と細胞との播種とが同時に行われる態様であってもよい。
　上記のような分化誘導方法によって、多能性幹細胞からiBMECsが製造される。iBMECsの維持、増殖に適した培養条件で引き続き培養することにより、iBMECsの単層（細胞層）が形成される。本開示の方法によれば、バリア機能に優れた細胞層が得られる。本開示の方法で得られる細胞層のバリア機能は、強固なタイトジャンクションと、長期間に渡るタイトジャンクションの維持によって特徴付けることができる。
　ここで、一般に、ラットの生体内におけるBMECsは、タイトジャンクションの指標となる経内皮電気抵抗値（TEER値）が1000～2000Ω×cm2程度であることが知られており、ヒトBBBのモデルとしても、1000Ω×cm2以上のTEER値を有することが望ましい。
　本形態のiBMECsの製造方法によれば、TEER値が1000Ω×cm2以上の細胞層を形成させることができ、また、1000Ω×cm2を超えるTEER値を、例えば9日以上等の長期に亘って維持することができる。
　本開示の方法で得られる細胞層のバリア機能を、BMECにおいて重要な又は特徴的な薬物トランスポーター（例えばBCRP、P-gp、GLUT1）の機能を有していることによって更に特徴付けることもできる。また、BMECに重要な又は特徴的なタイトジャンクションマーカー（例えばClaudin5、Occludin、ZO-1）の発現等を指標にして、iBMECsの機能を判定ないし評価することができる。
　分化誘導の後期において、培養を半透過性膜（多孔性膜）の上で行うことにより、半透過性膜上にiBMECsの細胞層を形成させることができる。この態様は、本開示の製造方法により得られたiBMECsの細胞層を各種アッセイに利用する場合に特に有効である。例えば、カルチャーインサート（半透過性膜からなる培養面を有する）を備えた培養容器（例えば、コーニング社が提供するトランズウェル（登録商標））を使用し、インサート内で細胞培養し、細胞層を形成させることができる。
　本開示の他の実施形態は、上記の方法により分化誘導して製造されたiBMECsの利用に関する。上記の通り、本開示によれば、iBMECsで構成された細胞層を得ることが可能であり、当該細胞層をBBBモデルに利用できる。例えば、当該細胞層を用いたアッセイは、医薬品又は医薬品候補などの被検物質のBBB透過性の評価に有用である。そこで、本開示の製造方法により得られたiBMECsの細胞層を用いて、被検物質のBBB透過性を評価する方法（以下、「本開示のBBB透過性評価方法」とも呼ぶ）が提供される。本開示のBBB透過性評価方法では、以下の（ｉ）～（ｉｉｉ）の工程を行う。
　（ｉ）本開示の製造方法により得られたiBMECsの細胞層を用意する工程
　（ｉｉ）前記細胞層に被検物質を接触させる工程
　（ｉｉｉ）前記細胞層を透過した被検物質を定量することにより、被検物質の透過性を評価する工程
　工程（ｉ）では、本開示の製造方法により得られたiBMECsの細胞層を用意する。なお、iBMECsの細胞層に加え、他の細胞（ペリサイト、アストロサイト等）を併用することにしてもよい。例えば、カルチャーインサートを備えた培養容器を採用してiBMECsの細胞層をカルチャーインサート内に形成させることにし（カルチャーインサートの底部上面に細胞層が形成される）、カルチャーインサートの底部裏面に接着した状態でペリサイトを培養したり（ペリサイト接着共培養系）、カルチャーインサートとウェルの間の区画でペリサイトを培養したり（ペリサイト非接着共培養系）、カルチャーインサートの底部裏面に接着した状態でペリサイトを培養するとともにカルチャーインサートとウェルの間の区画でアストロサイトを培養したり（ペリサイト接着／アストロサイト非接着共培養系）、カルチャーインサートの底部裏面に接着した状態でアストロサイトを培養したり（アストロサイト接着共培養系）することが可能である。
　工程（ｉｉ）での「接触」は、典型的には、培地に被検物質を添加することによって行われる。被検物質の添加のタイミングは特に限定されない。従って、被検物質を含まない培地で培養を開始した後、ある時点で被検物質を添加することにしても、予め被検物質を含む培地で培養を開始することにしてもよい。
　典型的には、医薬品又は医薬品候補の物質が被検物質として用いられる。但し、被検物質は特に限定されるものではなく、様々な分子サイズの有機化合物又は無機化合物を被検物質として用いることができる。有機化合物の例として核酸、ペプチド、タンパク質、脂質（単純脂質、複合脂質（ホスホグリセリド、スフィンゴ脂質、グリコシルグリセリド、セレブロシド等）、プロスタグランジン、イソプレノイド、テルペン、ステロイド、ポリフェノール、カテキン、ビタミン（B1、B2、B3、B5、B6、B7、B9、B12、C、A、D、E等）を例示できる。植物抽出液、細胞抽出液、培養上清などを被検物質として用いてもよい。２種類以上の被検物質を同時に添加することにより、被検物質間の相互作用、相乗作用などを調べることにしてもよい。被検物質は天然物由来であっても、或いは合成によるものであってもよい。後者の場合には例えばコンビナトリアル合成の手法を利用して効率的なアッセイ系を構築することができる。
　被検物質を接触させる期間は任意に設定可能である。接触期間は例えば10分間～3日間、好ましくは1時間～1日間である。
　工程（ｉｉｉ）では、細胞層を透過した被検物質を定量する。例えば、トランズウェル（登録商標）のようなカルチャーインサートを備えた培養容器を使用した場合には、カルチャーインサートを透過した被検物質、即ち、細胞層を介して上部容器（カルチャーインサート）もしくは下部容器（ウェル）内に移動した被検物質を、被検物質に応じた測定方法で定量する。測定方法としては、質量分析、液体クロマトグラフィー、免疫学的手法（例えば蛍光免疫測定法（FIA法：Fluorescent Immunoassay）、酵素免疫測定法（EIA法：Enzyme Immunoassay））等の測定方法を例示することができる。定量結果（細胞層を透過した被検物質の量）と被検物質の使用量（典型的には培地への添加量）とに基づき、被検物質の膜透過性を評価する。膜透過性に加え、細胞層による吸収（吸収性）、細胞層への影響（例えばバリア機能への影響）、トランスポーター（例えばBCRPやP-gp）の発現又は機能への影響等を評価することにしてもよい。通常、吸収性は透過性と表裏の関係にあることから、透過性の場合と同様の方法で評価することができる。バリア機能への影響はTEER値の測定、非吸収性マーカーを用いた透過試験等によって評価することができる。また、トランスポーターの発現への影響は免疫学的手法、ウエスタンブロッティング法、フローサイトメトリー等によって、同機能への影響は例えば基質を用いた活性試験によってそれぞれ評価することができる。
　上記の説明からわかるように、iBMECsの細胞層を用いることにより、被検物質のBBB機能への影響（例えばBBB機能の向上、低下、破綻）も評価することができる。そこで本開示は、本開示の製造方法によって製造されたiBMECsの細胞層の別の用途として、BBB機能を標的ないし対象とした評価方法、即ち、被検物質のBBB機能への影響を評価する方法も提供する。当該評価方法は、例えば、バリア機能を強化（向上）する物質、バリア機能を保護する物質、バリア機能を調節する物質等の探索手段として有用である。また、BBBに対する毒性の評価にも利用可能である。当該評価方法では、上記のBBB透過性評価方法と同様、細胞層を用意する工程と細胞層に被検物質を接触させる工程を行い、その後、細胞層のバリア機能への影響を評価する。バリア機能への影響を評価する手法は、上述の通りである。
　以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。なお、以下の説明では、特に断らない限り、「%」は体積%（volume／volume %）を示しており、「w/v%」は質量体積%（weight／volume %）を示している。また、実施例において用いた材料は、表１に示す会社からそれぞれ入手した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
１．材料および方法
（１）培地
　フィーダー細胞としてのマウス胎児線維芽細胞（MEF：Mouse Embryonic Fibroblast）の培養には、10% ウシ胎仔血清（FBS：Fetal Bovine Serum）、2 mmol/L L-グルタミン（L-Glu）、1% 非必須アミノ酸（NEAA）、1×ペニシリン－ストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を用いた。MEFの剥離液には、0.05 w/v%トリプシン-エチレンジアミン四酢酸（EDTA）を、MEFの保存液にはセルバンカー1を用いた。ヒトiPS細胞の維持培養には、20% ノックアウト血清代替物（KSR：KnockOut Serum Replacement）、0.8% NEAA、2 mmol/L L-Glu、0.1 mmol/L 2-メルカプトエタノール（2-MeE）、5 ng/mL線維芽細胞増殖因子（FGF：fibroblast growth factor）2を含むDMEM Ham’s F-12（DMEM/F12）を用いた。ヒトiPS細胞の剥離液には、1 mg/mLコラゲナーゼIV、0.25 w/v%トリプシン、20% KSR、1 mmol/L塩化カルシウムを含むダルベッコリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) を用いた。ヒトiPS細胞の保存液には、セルリザーバーワンを用いた。
（２）ヒトiPS細胞の培養
　ヒトiPS細胞として、610B1株および648A1株（それぞれ理化学研究所より入手）を用いた。ヒトiPS細胞は、マイトマイシンC処理を施したMEF（6×105 cells/100 mm ディッシュ）上に播種し、5% CO2/95% air条件下、CO2インキュベーター中37℃にて培養した。ヒトiPS細胞の継代は、3～5日培養後、1:2～1:4のスプリット比で行なった。
（３）コーティング剤
　Matrigel GFR（Growth Factor Reduced）と、Fibronectin（以下「FBN」とも呼ぶ）と、N末端Vitronectin（以下「VTN-N」とも呼ぶ）と、Laminin 221断片（以下「LN221F」とも呼ぶ）と、Laminin 411断片（以下「LN411F」とも呼ぶ）と、Laminin 511断片（以下「LN511F」とも呼ぶ）とを、それぞれ分化誘導開始時におけるコーティング剤として用いた。また、FibronectinとCollagen type IVとの合剤を、分化誘導の途中の継代培養の際にコーティング剤として用いた。以下の説明では、Matrigel GFRを、単に「Matrigel」とも呼ぶ。なお、上記LN221Fを含むコーティング剤の濃度は、175μg/0.35 mLであり、上記VTN-Nを含むコーティング剤の濃度は、0.5 mg/mLであった。
（４）コート層の形成
　上記の各コーティング剤を用いて、コート層を形成した。Matrigelについては、氷上でヒトiPS細胞の維持培地で30倍希釈し、ウェルプレートに注ぎ、37℃で30分以上静置することによりコート層を形成した。FBN、VTN-N、LN221F、LN411FおよびLN511Fについては、1 μg/cm2となるようPBSで希釈し、ウェルプレートに注ぎ、37℃で1時間～2時間静置することにより、それぞれコート層を形成した。また、FibronectinとCollagen type IVとの合剤については、それぞれ100 μg/mLと400 μg/mLとなるようPBSで希釈し、トランズウェルインサートに注ぎ、37°Cで2時間以上静置することによりコート層を形成した。
（５）ヒトiPS細胞のiBMECsへの分化誘導
　図１は、ヒトiPS細胞のiBMECsへの分化プロトコールを示す説明図である。図１に示すように、ヒトiPS細胞をiBMECsへと分化誘導する際に、iBMECsの分化0日目から分化8日目までのコーティング剤として、Matrigelと、上述のような単一の基底膜成分とをそれぞれ用いた。分化誘導は、継代時に、上記各コーティング剤でコーティングした培養皿に播種し、35 ng/mL FGF2を含むStemSure hPSC培地にて培養し、未分化コロニーの占める割合が約60－70%になった状態で開始した（分化0日目）。DMEM/F12に20% KSR、0.8% NEAA、2 mmol/L L-Glu、0.1 mmol/L 2-MeEを加えたDMEM/F12 based mediumを用いて6日間培養した後（分化6日目）、Human Endothelial-SFM (HE-SFM) に1% platelet-poor plasma derived serum (PDS) および1×ペニシリン－ストレプトマイシンを加えたHE-SFM based mediumに10 μM all-trans retinoic acid (RA)、20 ng/mL FGF2を添加した培地で2日間培養した。その後（分化8日目）、Accutaseで剥離し、FibronectinおよびCollagen type IVでコートしたトランズウェルインサートまたは培養皿に3×105 cells/wellの細胞を播種した。10 μM RA、20 ng/mL FGF2を含むHE-SFM based mediumにて1日間培養し、その後（分化9日目）、HE-SFM based medium (RAおよびFGF2非添加) にて培養することでiBMECsへと分化誘導した。培地交換は、分化9日目以降は行わなかった。
（６）経内皮電気抵抗（TEER）値の測定
　MatrigelもしくはFBN、VTN-N、LN221F、LN411F、LN511F上にて分化誘導された610B1株由来のiBMECs（分化10日目）のTEER値を測定した。サンプル数は3とし、Matrigel上にて分化誘導されたiBMECs（以下、「Matrigel-iBMECs」とも呼ぶ）のTEER値を基準として、FBN、VTN-N、LN221F、LN411F、LN511F上にて分化誘導されたiBMECsの相対TEER値を求めた。また、610B1株および648A1株由来のそれぞれについて、Matrigel-iBMECsと、LN221F上にて分化誘導されたiBMECs（以下、「LN221F-iBMECs」とも呼ぶ）とのTEER値を、播種後1日目（分化9日目）から播種後10日目（分化18日目）までそれぞれ測定した。サンプル数は6とし、TEER値の経時的変化を求めた。TEER値は、Millicell ERS-2 (チョップスティック型) を使用し、添付マニュアルに従い測定した。培地の液量は、頂端側で300 μL、基底側で800 μLとした。
（７）Fluorescein isothiocyanate-dextran 4 kDa (FD4) およびlucifer yellow (LY) の透過試験
　FD4および LY の透過試験を、610B1株および648A1株由来のそれぞれについて、Matrigel-iBMECsと、LN221F-iBMECsに対して行なった。サンプル数は6とした。分化10日目に、培地をトランスポートバッファー（10 mM HEPES溶液を含むHBSS）に置き換え、37℃で20分間培養した。1 mg/mL FD4または300 μM LYを含有するトランスポートバッファーを頂端側に加えた。37℃で60分間インキュベートした後、100 μLの溶液を側底側から回収した。トランスポートバッファーの液量は、頂端側で300 μL、基底側で800 μLとした。FD4またはLYの蛍光強度を、Synergy HTXマルチモードプレートリーダーで測定し、Gen5データ分析ソフトウェアにて解析した。
（８）RNA 抽出
　Agencourt（登録商標） RNAdvance Tissue Kitの添付マニュアルに従い抽出した。
（９）逆転写反応
　相補的 DNA (cDNA)の合成は、ReverTra Ace（登録商標） qPCR RT Master Mixを使用し、添付マニュアルに従い行なった。
（１０）RT-q PCR法
　610B1株由来のMatrigel-iBMECsおよびLN221F-iBMECs（分化10日目)、ヒト由来プライマリーBMECs (以下、「hBMECs」とも呼ぶ)の遺伝子発現量の解析を、RT-q PCRにて行なった。Matrigel-iBMECsおよびLN221F-iBMECsのサンプル数は3とし、hBMECsのサンプル数は1とした。RT-q PCRは、KAPA SYBR Fast qPCR Kitを用い、cDNAを鋳型にして、添付マニュアルに従い行なった。RT-q PCRにおいて用いたプライマー配列を、表２に示す。得られた結果を、内在性コントロールとしてHPRT1を用いて補正した。Matrigel-iBMECsにおけるmRNAの発現量を基準として、LN221F-iBMECsおよびhBMECsにおけるmRNAの相対的発現量を求めた。なお、RT-q PCRにおいて用いたプライマーとして、ＣＤＨ５のフォワードプライマーの配列を配列番号１に示し、ＣＤＨ５のリバースプライマーの配列を配列番号２に示し、ＭＤＲ１のフォワードプライマーの配列を配列番号３に示し、ＭＤＲ１のリバースプライマーの配列を配列番号４に示し、ＢＣＲＰのフォワードプライマーの配列を配列番号５に示し、ＢＣＲＰのリバースプライマーの配列を配列番号６に示し、ＧＬＵＴ１のフォワードプライマーの配列を配列番号７に示し、ＧＬＵＴ１のリバースプライマーの配列を配列番号８に示し、Ｏｃｃｌｕｄｉｎのフォワードプライマーの配列を配列番号９に示し、Ｏｃｃｌｕｄｉｎのリバースプライマーの配列を配列番号１０に示し、ＺＯ－１のフォワードプライマーの配列を配列番号１１に示し、ＺＯ－１のリバースプライマーの配列を配列番号１２に示し、ＬＡＴ１のフォワードプライマーの配列を配列番号１３に示し、ＬＡＴ１のリバースプライマーの配列を配列番号１４に示し、ＨＰＲＴ１のフォワードプライマーの配列を配列番号１５に示し、ＨＰＲＴ１のリバースプライマーの配列を配列番号１６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
（１１）免疫染色法
　610B1株由来のMatrigel-iBMECsおよびLN221F-iBMECs（分化10日目)に対して、BMECマーカーのタンパク質発現量や局在を解析するために、免疫染色法による解析を行なった。免疫染色において用いた抗体を、表３に示す。Zonula occludens-1 (ZO-1) およびoccludinに関しては、96ウェルプレート上の細胞を室温において4 w/v%パラホルムアルデヒド中で15分間固定し、グリシン含有PBSで2回洗浄後、室温で25分間、0.1 w/v% Triton X-100含有PBSで透過処理した。5％ロバ血清を用いて室温で20分間ブロッキングした後、一次抗体を室温で2時間反応させた。PBSで3回洗浄した後、室温で二次抗体を200倍希釈で60分間反応させた。この時、核染色試薬である1 μg/mL DAPIも同時に反応させた。その後、3回PBSで洗浄し、オペレッタハイコンテンツイメージングシステムにて解析した。Cadherin 5 (CDH5), claudin 5, P-glycoprotein (P-gp), breast cancer resistant protein (BCRP) に関しては、96ウェルプレート上の細胞を0.1 w/v% BSA含有D-PBS (－) で３回洗浄後、4 w/v%パラホルムアルデヒド中で15分間固定し、再度0.1 w/v% BSA含有PBSで3回洗浄した後、0.1 w/v% Triton X-100含有PBSにて5分間透過処理を行った。続いて、0.1 w/v% BSA含有PBSで3回洗浄した後、一次抗体を4℃で1晩反応させた。その後、0.1 w/v% BSA含有PBSで3回洗浄し、室温で二次抗体（Anti-Rabbit、Anti-Mouse）を200倍希釈で60分間反応させた。その後、0.1 w/v% BSA含有PBSで3回洗浄し、1 μg/mL DAPIを5分間反応させた。その後、4 w/v% パラホルムアルデヒド中で5分間反応させた。続いて、PBSで3回洗浄し、オペレッタハイコンテンツイメージングシステムにて解析した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
（１２）P-gpおよびBCRPの機能解析
　610B1株由来のMatrigel-iBMECsおよびLN221F-iBMECs（分化10日目) に対して、排出トランスポーターとしてのP-gpとBCRPとの機能解析のために、基質取り込み試験を行なった。基質としては、rhodamine 123およびhoechst 33342を用いた。培地を除去し、96ウェルプレート上の細胞をトランスポートバッファー中にて37℃で15分間プレインキュベートした。なお、サンプル数は6とした。P-gpの阻害剤である10 μMシクロスポリンA  (CsA) またはBCRPの阻害剤である20 μM Ko 143の存在下または非存在下で、10 μM rhodamine 123または10 μM hoechst 33342を含有するトランスポートバッファー中にて37℃で60分間インキュベートした。その後、細胞をPBSで三回洗浄し、5 w/v% Triton X-100含有 PBSで溶解し、rhodamine 123およびhoechst 33342の蛍光強度を、Synergy HTXマルチモードプレートリーダーで測定し、Gen5データ分析ソフトウェアで解析した。
２．結果・考察
（１）Matrigel-iBMECsを基準とした相対TEER値
　図２は、各コート層上にて分化誘導されたiBMECsの相対TEER値を示す説明図である。図２において、縦軸は、Matrigel-iBMECsのTEER値を基準として1.0とした場合の相対TEER値を示しており、横軸は、iBMECsの種類を示している。図２の結果から、LN221FおよびVTN-N上で分化誘導したiBMECsは、Matrigel上で分化誘導したiBMECsよりも高いTEER値を示すことがわかった。特に、LN221F-iBMECsは、Matrigel-iBMECsよりも２倍程度高いTEER値を示した。したがって、LN221F上やVTN-N上で分化誘導したiBMECsは、Matrigel上で分化誘導したiBMECsよりも、高いバリア機能を有すると言える。
（２）TEER値の経時的変化
　図３は、610B1株由来のMatrigel-iBMECsおよびLN221F-iBMECsにおけるTEER値の経時的変化を示す説明図である。図４は、648A1株由来のMatrigel-iBMECsおよびLN221F-iBMECsにおけるTEER値の経時的変化を示す説明図である。図３および図４において、縦軸は、TEER値（Ω×cm2）を示しており、横軸は、播種後経過した日数を示している。図３および図４に示す結果から、ヒトiPS細胞として610B1株と648A1株とのいずれを用いた場合においても、LN221F-iBMECsは、Matrigel-iBMECsよりも長期に亘って高いTEER値を示すことがわかった。すなわち、LN221F上で分化誘導したiBMECsは、Matrigel上で分化誘導したiBMECsよりも、長期的に高いバリア機能を有すると言える。また、ヒトiPS細胞として610B1株と648A1株とのいずれを用いた場合においても、LN221F-iBMECsは、長期に亘って1000Ω×cm2以上のTEER値を示しており、ヒトBBBのモデルとして有用であることがわかった。
（３）透過性試験
　図５は、Matrigel-iBMECsおよびLN221F-iBMECsにおけるFD4の透過試験の結果を示す説明図である。図６は、Matrigel-iBMECsおよびLN221F-iBMECsにおける LY の透過試験の結果を示す説明図である。図５および図６において、縦軸は、透過係数（10-6 cm / sec）を示しており、横軸は、iBMECsの種類を示している。図５および図６に示す結果から、ヒトiPS細胞として610B1株と648A1株とのいずれを用いた場合においても、また、傍細胞経路による透過の指標となるFD4とLYとのいずれを透過対象とした場合においても、LN221F-iBMECsは、Matrigel-iBMECsよりも低い透過係数を示すことがわかった。長期に亘って高いTEER値を示すことがわかった。すなわち、LN221F上で分化誘導したiBMECsは、Matrigel上で分化誘導したiBMECsよりも、高いバリア機能を有すると言える。
　TEER値の測定結果と透過試験との結果から、LN221F-iBMECsは、Matrigel-iBMECsと比較して高いバリア機能を持つことが示唆された。したがって、LN221F-iBMECsは、ヒトBBBのモデルとして有用であることがわかった。
（４）RT-q PCR法による遺伝子発現量の解析
　図７は、Matrigel-iBMECsおよびLN221F-iBMECs、並びに hBMECsにおける、各遺伝子の発現量の解析結果を示す説明図である。図７において、縦軸は、Matrigel-iBMECsにおける各遺伝子のmRNAの発現量を基準として1.0とした場合のmRNA相対的発現量を示しており、横軸は、iBMECsまたはBMECsの種類を示している。図７に示す結果から、BMECマーカーとしてCDH5、MDR1、BCRP、ZO-1、Occludin、GLUT1およびLAT1のいずれを用いた場合においても、LN221F-iBMECsは、Matrigel-iBMECsとほぼ同等の発現量を示すことがわかった。
（５）免疫染色法によるタンパク質発現の確認試験
　図８は、Matrigel-iBMECsおよびLN221F-iBMECsにおける、免疫染色法によるタンパク質発現解析の結果を示す説明図である。図８では、免疫蛍光染色法によって得られた画像とともに、50μmのスケールバーが示されている。図８に示す結果から、BMECマーカーとしてCDH5、P-gp、BCRP、ZO-1、OccludinおよびClaudin 5のいずれを用いた場合においても、LN221F-iBMECsは、Matrigel-iBMECsとほぼ同等のタンパク質発現量と局在とを示すことがわかった。
　遺伝子発現およびタンパク質発現の確認試験の結果から、LN221F-iBMECsは、Matrigel-iBMECsと同様に、BMECsとしての性質を有することがわかった。したがって、LN221F-iBMECsは、ヒトBBBのモデルとして有用であることがわかった。
（６）基質取り込み試験
　図９は、Matrigel-iBMECsおよびLN221F-iBMECsにおける、P-gpの機能解析の結果を示す説明図である。図１０は、Matrigel-iBMECsおよびLN221F-iBMECsにおける、BCRPの機能解析の結果を示す説明図である。図９および図１０において、縦軸は、排出トランスポーターに対する阻害剤の非存在下における基質蓄積量を基準として1.0とした場合の相対的基質蓄積量を示しており、横軸は、排出トランスポーターに対する阻害剤の有無を示している。図９および図１０に示す結果から、LN221F-iBMECsは、Matrigel-iBMECsと同様に、排出トランスポーターに対する阻害剤の存在下において、かかる阻害剤の非存在下と比較して基質の蓄積量が多くなることが確認できた。このため、LN221F-iBMECsは、Matrigel-iBMECsと同様に、P-gpおよびBCRPの機能を有することがわかった。
３．まとめ
　以上の結果より、iBMECsの分化誘導時用コーティング剤としてLN221FやVTN-Nを用いることにより、Matrigelを用いた場合と比較して高いバリア機能を有するiBMECsを作製できることがわかった。
　本開示によれば、バリア機能が高いBBBモデルの構築を可能にするiBMECsを、多能性幹細胞から安定して分化誘導することが可能となる。したがって、iBMECsを安定供給することができ、製薬企業や研究機関に向けたiBMECsの供給体制の確立に寄与できる。また、本開示を利用して構築されたBBBモデルは、例えば、医薬品の有効性／安全性等の評価系に利用され得る。
　この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報等の内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
　配列番号１：人工配列の説明：ＣＤＨ５ フォワードプライマー
　配列番号２：人工配列の説明：ＣＤＨ５ リバースプライマー
　配列番号３：人工配列の説明：ＭＤＲ１ フォワードプライマー
　配列番号４：人工配列の説明：ＭＤＲ１ リバースプライマー
　配列番号５：人工配列の説明：ＢＣＲＰ フォワードプライマー
　配列番号６：人工配列の説明：ＢＣＲＰ リバースプライマー
　配列番号７：人工配列の説明：ＧＬＵＴ１ フォワードプライマー
　配列番号８：人工配列の説明：ＧＬＵＴ１ リバースプライマー
　配列番号９：人工配列の説明：Ｏｃｃｌｕｄｉｎ フォワードプライマー
　配列番号１０：人工配列の説明：Ｏｃｃｌｕｄｉｎ リバースプライマー
　配列番号１１：人工配列の説明：ＺＯ－１ フォワードプライマー
　配列番号１２：人工配列の説明：ＺＯ－１ リバースプライマー
　配列番号１３：人工配列の説明：ＬＡＴ１ フォワードプライマー
　配列番号１４：人工配列の説明：ＬＡＴ１ リバースプライマー
　配列番号１５：人工配列の説明：ＨＰＲＴ１ フォワードプライマー
　配列番号１６：人工配列の説明：ＨＰＲＴ１ リバースプライマー

Claims (13)

  1. 　多能性幹細胞から脳毛細血管内皮様細胞への分化誘導用コーティング剤であって、
    　ラミニン２２１断片と、Ｎ末端ビトロネクチンと、のうちの少なくとも一方の成分を含む、
    　コーティング剤。
  2. 　請求項１に記載のコーティング剤において、
    　前記成分は、前記コーティング剤において、０．０１ｎｍｏｌ／Ｌ以上１０ｍｍｏｌ／Ｌ以下含まれる、
    　コーティング剤。
  3. 　請求項１または請求項２に記載のコーティング剤と、細胞と、を備える、
    　分化誘導キット。
  4. 　ラミニン２２１断片と、Ｎ末端ビトロネクチンと、のうちの少なくとも一方の成分を含む、
    　多能性幹細胞から脳毛細血管内皮様細胞への分化誘導用コーティング剤としての利用。
  5. 　多能性幹細胞から脳毛細血管内皮様細胞への分化誘導用コーティング剤がコートされたコート層を含む培養皿であって、
    　前記コーディング剤は、ラミニン２２１断片と、Ｎ末端ビトロネクチンと、のうちの少なくとも一方の成分を含む、
    　培養皿。
  6. 　請求項５に記載の培養皿において、
    　前記成分は、前記コート層のコート面積１ｃｍ２あたり、１ｎｇ以上１ｍｇ以下含まれる、
    　培養皿。
  7. 　多能性幹細胞を分化誘導することにより脳毛細血管内皮様細胞を製造する方法であって、
    　ラミニン２２１断片と、Ｎ末端ビトロネクチンと、のうちの少なくとも一方の成分を用いて前記多能性幹細胞を培養する工程を含む、
    　脳毛細血管内皮様細胞の製造方法。
  8. 　請求項７に記載の脳毛細血管内皮様細胞の製造方法において、
    　前記多能性幹細胞は、人工多能性幹細胞である、
    　脳毛細血管内皮様細胞の製造方法。
  9. 　請求項８に記載の脳毛細血管内皮様細胞の製造方法において、
    　前記人工多能性幹細胞は、ヒト人工多能性幹細胞である、
    　脳毛細血管内皮様細胞の製造方法。
  10. 　請求項７から請求項９までのいずれか一項に記載の脳毛細血管内皮様細胞の製造方法により得られた脳毛細血管内皮様細胞の細胞層を用いて、被検物質の脳血管関門透過性を評価する方法。
  11. 　以下の工程（ｉ）～（ｉｉｉ）を含む、請求項１０に記載の方法：
    　（ｉ）前記細胞層を用意する工程；
    　（ｉｉ）前記細胞層に前記被検物質を接触させる工程；
    　（ｉｉｉ）前記細胞層を透過した前記被検物質を定量することにより、前記被検物質の透過性を評価する工程。
  12. 　請求項７から請求項９までのいずれか一項に記載の脳毛細血管内皮様細胞の製造方法により得られた脳毛細血管内皮様細胞の細胞層を用いて、被検物質の脳血管関門バリア機能への影響を評価する方法。
  13. 　多能性幹細胞を脳毛細血管内皮様細胞へと分化誘導する方法であって、
    　ラミニン２２１断片と、Ｎ末端ビトロネクチンと、のうちの少なくとも一方の成分を用いて前記多能性幹細胞を培養する工程を含む、
    　方法。
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