JPWO2016114354A1 - 骨格筋前駆細胞の選択方法 - Google Patents
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Abstract
Description
[1] miRNA応答性mRNAを細胞群に導入する工程を含む、骨格筋前駆細胞の選別方法であって、当該miRNA応答性mRNAが下記:
(i) 骨格筋前駆細胞で特異的に発現しているmiRNAによって特異的に認識される配列を有する核酸、および
(ii) マーカータンパク質をコードする配列を含む核酸
を含む配列からなり、
ここで、当該(ii)は、当該(i)の核酸に機能的に連結している、方法。
[2] 前記(i)および(ii)が、5'から3'の方向に連結されている、[1]に記載の方法。
[3] 前記(i)の骨格筋前駆細胞で特異的に発現しているmiRNAが、miR-1、miR-133およびmiR-206からなる群から選択される1またはそれ以上のmiRNAである、[1]または[2]に記載の方法。
[4] 前記(ii)のマーカータンパク質が、蛍光タンパク質、アポトーシス誘導タンパク質および自殺遺伝子にコードされるタンパク質からなる群から選択される1またはそれ以上の遺伝子である、[1]から[3]のいずれかに記載の方法。
[5] 前記(ii)のマーカータンパク質が、蛍光タンパク質であって、コントロールmRNAをさらに細胞群に導入する工程を含む、[4]に記載の方法。[6] 前記細胞群が、多能性幹細胞から骨格筋前駆細胞へと分化誘導させた細胞群である、[1]から[5]のいずれかに記載の方法。
[7] 前記多能性幹細胞から骨格筋前駆細胞への分化誘導が、下記の工程(1)から(5)を含む、[6]に記載の方法:
(1)多能性幹細胞をTGF-β阻害剤とGSK3β阻害剤を含む培養液中で培養する工程、
(2)(1)の工程で得られた細胞を、TGF-β阻害剤、GSK3β阻害剤、IGF1、HGFおよびbFGFを含む培養液中で培養する工程、
(3)(2)の工程で得られた細胞を、TGF-β阻害剤、GSK3β阻害剤およびIGF1を含む培養液中で培養する工程、
(4)(3)の工程で得られた細胞を、TGF-β阻害剤、IGF1およびHGFを含む培養液中で培養する工程、および
(5)(4)の工程で得られた細胞を、TGF-β阻害剤、IGF1および血清を含む培養液中で培養する工程。
[8] 前記工程(1)から(5)のTGF-β阻害剤がSB431542であり、前記工程(1)のGSK3β阻害剤がCHIR99021であり、前記工程(2)および(3)のGSK3β阻害剤がLiClである、[7]に記載の方法。
[9] 前記工程(5)の血清がウマ血清である、[7]または[8]に記載の方法。
[10] 下記の工程(1)から(3)を含む多能性幹細胞からの骨格筋前駆細胞の製造方法:
(1)多能性幹細胞から骨格筋前駆細胞を製造する工程、
(2)(1)の工程で得られた細胞へ、下記(i) および(ii)を含むmiRNA応答性mRNAを導入する工程:
(i) 骨格筋前駆細胞で特異的に発現しているmiRNAによって特異的に認識される配列を有する核酸、および
(ii)マーカータンパク質をコードする核酸
を含む配列からなり、ここで、当該(ii)は、当該(i)の核酸に機能的に連結している、ならびに、
(3)前記マーカータンパク質の翻訳量が少ないまたは検出できない細胞を選択する工程。
[11] 前記工程(1)が下記の工程(1-1)から(1-5)を含む、[10]に記載の方法:
(1-1)多能性幹細胞をTGF-β阻害剤とGSK3β阻害剤を含む培養液中で培養する工程、
(1-2)(1-1)の工程で得られた細胞を、TGF-β阻害剤、GSK3β阻害剤、IGF1、HGFおよびbFGFを含む培養液中で培養する工程、
(1-3)(1-2)の工程で得られた細胞を、TGF-β阻害剤、GSK3β阻害剤およびIGF1を含む培養液中で培養する工程、
(1-4)(1-3)の工程で得られた細胞を、TGF-β阻害剤、IGF1およびHGFを含む培養液中で培養する工程、および
(1-5)(1-4)の工程で得られた細胞を、TGF-β阻害剤、IGF1および血清を含む培養液中で培養する工程。
[12] 前記工程(1-1)から(1-5)のTGF-β阻害剤がSB431542であり、前記工程(1-1)のGSK3β阻害剤がCHIR99021であり、前記工程(1-2)および(1-3)のGSK3β阻害剤がLiClである、[11]に記載の方法。
[13] 前記工程(1-5)の血清がウマ血清である、[11]または[12]に記載の方法。
[14] 前記(i)および(ii)が、5'から3'の方向に連結されている、[10]から[13]のいずれかに記載の方法。
[15] 前記(i)の骨格筋前駆細胞で特異的に発現しているmiRNAが、miR-1、miR-133およびmiR-206からなる群から選択される1またはそれ以上のmiRNAである、[10]から[14]のいずれかに記載の方法。
[16] 前記(ii)のマーカータンパク質が、蛍光タンパク質、アポトーシス誘導タンパク質および自殺遺伝子にコードされるタンパク質からなる群から選択される1またはそれ以上の遺伝子である、[10]から[15]のいずれかに記載の方法。
[17] 前記(ii)のマーカータンパク質が、蛍光タンパク質であって、コントロールmRNAをさらに(1)の工程で得られた細胞へ導入する工程を含み、前記工程(3)が、さらに当該コントロールmRNAが導入された細胞を選択する工程である、[16]に記載の方法。
本発明において、miRNA応答性mRNAとは、(i) 骨格筋前駆細胞で特異的に発現しているmiRNAによって特異的に認識される配列(以下、miRNA標的配列という)を含む核酸、および(ii) マーカータンパク質をコードする配列を含む核酸を含み、当該(ii)のマーカータンパク質の翻訳が、当該(i)の核酸配列により制御されるよう機能的に連結されているmRNAである。
本発明の骨格筋前駆細胞の選別において、miRNA応答性mRNAを細胞群に導入する工程、および前記miRNA応答性mRNAに含まれるマーカータンパク質の翻訳量が少ないまたは検出できない細胞を選別する工程を含む。
本発明で使用可能な多能性幹細胞は、生体に存在するすべての細胞に分化可能である多能性を有し、かつ、増殖能をも併せもつ幹細胞であり、それには、以下のものに限定されないが、例えば、胚性幹(ES)細胞、精子幹(GS)細胞、胚性生殖(EG)細胞、人工多能性幹(iPS)細胞、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹(ntES)細胞、Muse細胞などが含まれる。好ましい多能性幹細胞は、ES細胞、iPS細胞およびntES細胞であり、筋原性疾患治療に用いるという観点から、より好ましくは、ヒトES細胞、ヒトiPS細胞であり、さらに好ましくは、ヒトiPS細胞である。
ES細胞は、ヒトやマウスなどの哺乳動物の初期胚(例えば胚盤胞)の内部細胞塊から樹立された、多能性と自己複製による増殖能を有する幹細胞である。
精子幹細胞は、精巣由来の多能性幹細胞であり、精子形成のための起源となる細胞である。この細胞は、ES細胞と同様に、種々の系列の細胞に分化誘導可能であり、例えばマウス胚盤胞に移植するとキメラマウスを作出できるなどの性質をもつ(M. Kanatsu-Shinohara et al. (2003) Biol. Reprod., 69:612-616; K. Shinohara et al. (2004), Cell, 119:1001-1012)。神経膠細胞系由来神経栄養因子(glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF))を含む培養液で自己複製可能であるし、またES細胞と同様の培養条件下で継代を繰り返すことによって、精子幹細胞を得ることができる(竹林正則ら(2008),実験医学,26巻,5号(増刊),41〜46頁,羊土社(東京、日本))。
胚性生殖細胞は、胎生期の始原生殖細胞から樹立される、ES細胞と同様な多能性をもつ細胞であり、LIF、bFGF、幹細胞因子(stem cell factor)などの物質の存在下で始原生殖細胞を培養することによって樹立しうる(Y. Matsui et al. (1992), Cell, 70:841-847; J.L. Resnick et al. (1992), Nature, 359:550-551)。
人工多能性幹(iPS)細胞は、特定の初期化因子を、DNAまたはタンパク質の形態で体細胞に導入することによって作製することができる、ES細胞とほぼ同等の特性、例えば分化多能性と自己複製による増殖能を有する体細胞由来の人工の幹細胞である(K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cell, 126:663-676; K. Takahashi et al. (2007), Cell, 131:861-872; J. Yu et al. (2007), Science, 318:1917-1920; Nakagawa, M.ら,Nat. Biotechnol. 26:101-106 (2008);国際公開WO 2007/069666)。初期化因子は、ES細胞に特異的に発現している遺伝子、その遺伝子産物もしくはnon-coding RNAまたはES細胞の未分化維持に重要な役割を果たす遺伝子、その遺伝子産物もしくはnon-coding RNA、あるいは低分子化合物によって構成されてもよい。初期化因子に含まれる遺伝子として、例えば、Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Klf4、Klf2、c-Myc、N-Myc、L-Myc、Nanog、Lin28、Fbx15、ERas、ECAT15-2、Tcl1、beta-catenin、Lin28b、Sall1、Sall4、Esrrb、Nr5a2、Tbx3等が例示され、これらの初期化因子は、単独で用いても良く、組み合わせて用いても良い。初期化因子の組み合わせとしては、WO2007/069666、WO2008/118820、WO2009/007852、WO2009/032194、WO2009/058413、WO2009/057831、WO2009/075119、WO2009/079007、WO2009/091659、WO2009/101084、WO2009/101407、WO2009/102983、WO2009/114949、WO2009/117439、WO2009/126250、WO2009/126251、WO2009/126655、WO2009/157593、WO2010/009015、WO2010/033906、WO2010/033920、WO2010/042800、WO2010/050626、WO2010/056831、WO2010/068955、WO2010/098419、WO2010/102267、WO2010/111409、WO 2010/111422、WO2010/115050、WO2010/124290、WO2010/147395、WO2010/147612、Huangfu D, et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26: 795-797、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 2: 525-528、Eminli S, et al. (2008), Stem Cells. 26:2467-2474、Huangfu D, et al. (2008), Nat Biotechnol. 26:1269-1275、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3, 568-574、Zhao Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3:475-479、Marson A, (2008), Cell Stem Cell, 3, 132-135、Feng B, et al. (2009), Nat Cell Biol. 11:197-203、R.L. Judson et al., (2009), Nat. Biotech., 27:459-461、Lyssiotis CA, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci U S A. 106:8912-8917、Kim JB, et al. (2009), Nature. 461:649-643、Ichida JK, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5:491-503、Heng JC, et al. (2010), Cell Stem Cell. 6:167-74、Han J, et al. (2010), Nature. 463:1096-100、Mali P, et al. (2010), Stem Cells. 28:713-720に記載の組み合わせが例示される。
一方、DNAの形態の場合、例えば、ウイルス、プラスミド、人工染色体などのベクター、リポフェクション、リポソーム、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入することができる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター(以上、Cell, 126, pp.663-676, 2006; Cell, 131, pp.861-872, 2007; Science, 318, pp.1917-1920, 2007)、アデノウイルスベクター(Science, 322, 945-949, 2008)、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクター(WO 2010/008054)などが例示される。また、人工染色体ベクターとしては、例えばヒト人工染色体(HAC)、酵母人工染色体(YAC)、細菌人工染色体(BAC、PAC)などが含まれる。プラスミドとしては、哺乳動物細胞用プラスミドを使用しうる(Science, 322:949-953, 2008)。ベクターには、核初期化物質が発現可能なように、プロモーター、エンハンサー、リボゾーム結合配列、ターミネーター、ポリアデニル化サイトなどの制御配列を含むことができるし、さらに、必要に応じて、薬剤耐性遺伝子(例えばカナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子など)、チミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリアトキシン遺伝子などの選択マーカー配列、緑色蛍光タンパク質(GFP)、βグルクロニダーゼ(GUS)、FLAGなどのレポーター遺伝子配列などを含むことができる。また、上記ベクターには、体細胞への導入後、初期化因子をコードする遺伝子もしくはプロモーターとそれに結合する初期化因子をコードする遺伝子を共に切除するために、それらの前後にLoxP配列を有してもよい。
この他にも、血清を含有しない培地を用いて培養する方法も例示される(Sun N, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci U S A. 106:15720-15725)。さらに、樹立効率を上げるため、低酸素条件(0.1%以上、15%以下の酸素濃度)によりiPS細胞を樹立しても良い(Yoshida Y, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5:237-241またはWO2010/013845)。
ntES細胞は、核移植技術によって作製されたクローン胚由来のES細胞であり、受精卵由来のES細胞とほぼ同じ特性を有している(T. Wakayama et al. (2001), Science, 292:740-743; S. Wakayama et al. (2005), Biol. Reprod., 72:932-936; J. Byrne et al. (2007), Nature, 450:497-502)。すなわち、未受精卵の核を体細胞の核と置換することによって得られたクローン胚由来の胚盤胞の内部細胞塊から樹立されたES細胞がntES(nuclear transfer ES)細胞である。ntES細胞の作製のためには、核移植技術(J.B. Cibelli et
al. (1998), Nature Biotechnol., 16:642-646)とES細胞作製技術(上記)との組み合わせが利用される(若山清香ら(2008),実験医学,26巻,5号(増刊), 47〜52頁)。核移植においては、哺乳動物の除核した未受精卵に、体細胞の核を注入し、数時間培養することで初期化することができる。
Muse細胞は、WO2011/007900に記載された方法にて製造された多能性幹細胞であり、詳細には、線維芽細胞または骨髄間質細胞を長時間トリプシン処理、好ましくは8時間または16時間トリプシン処理した後、浮遊培養することで得られる多能性を有した細胞であり、SSEA-3およびCD105が陽性である。
本発明によれば、多能性細胞から骨格筋前駆細胞を製造するにあたって、以下の工程を含む方法を用いることができる;
(1)多能性幹細胞をTGF-β阻害剤とGSK3β阻害剤を含む培養液中で培養する工程、
(2)(1)の工程で得られた細胞を、TGF-β阻害剤、GSK3β阻害剤、IGF1、HGFおよびbFGFを含む培養液中で培養する工程、
(3)(2)の工程で得られた細胞を、TGF-β阻害剤、GSK3β阻害剤およびIGF1を含む培養液中で培養する工程、
(4)(3)の工程で得られた細胞を、TGF-β阻害剤、IGF1およびHGFを含む培養液中で培養する工程、および
(5)(4)の工程で得られた細胞を、TGF-β阻害剤、IGF1および血清を含む培養液中で培養する工程。
本工程では、多能性幹細胞から骨格筋前駆細胞への分化誘導に先立って、多能性幹細胞を培養する工程を含み得る。ここでは、多能性幹細胞を任意の方法で分離し、浮遊培養により培養してもよく、あるいはコーティング処理された培養皿を用いて接着培養により培養してもよい。本工程では、好ましくは、接着培養が用いられる。ここで、多能性幹細胞の分離方法としては、例えば、力学的に分離する方法、プロテアーゼ活性とコラゲナーゼ活性を有する分離溶液(例えば、Accutase(TM)およびAccumax(TM)など)またはコラゲナーゼ活性のみを有する分離溶液を用いた分離方法、Trypsin/ EDTAを用いた解離方法などが挙げられる。好ましくは、Trypsin/ EDTAを用いて細胞を解離する方法が用いられる。
本工程(1)は、多能性幹細胞をTGF-β阻害剤とGSK3β阻害剤を含む培養液中で培養する工程である。本工程(1)において用いる培養液は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)培地、αMEM培地、Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM)培地、Ham's F12培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、StemPro34(invitrogen)、RPMI-base medium、およびこれらの混合培地などが包含される。本工程(1)において、好ましくは、IMDM培地およびHam's F12培地の混合培地である。
本工程(2)は、前記工程(1)で得られた細胞を、TGF-β阻害剤、GSK3β阻害剤、IGF1、HGFおよびbFGFを含む培養液中で培養する工程である。本工程(2)において用いる培養液は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)培地、αMEM培地、Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM)培地、Ham's F12培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、StemPro34(invitrogen)、RPMI-base medium、SF-O3培地(エーディア株式会社)およびこれらの混合培地などが包含される。本工程(2)において、好ましくは、SF-O3培地が用いられる。
本工程(3)は、前記工程(2)で得られた細胞を、TGF-β阻害剤、GSK3β阻害剤およびIGF1を含む培養液中で培養する工程である。本工程(3)において用いる培養液は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)培地、αMEM培地、Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM)培地、Ham's F12培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、StemPro34(invitrogen)、RPMI-base medium、SF-O3培地およびこれらの混合培地などが包含される。本工程(3)において、好ましくは、SF-O3培地が用いられる。
本工程(4)は、前記工程(3)で得られた細胞を、TGF-β阻害剤、IGF1およびHGFを含む培養液中で培養する工程である。本工程(4)において用いる培養液は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)培地、αMEM培地、Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM)培地、Ham's F12培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、StemPro34(invitrogen)、RPMI-base medium、SF-O3培地およびこれらの混合培地などが包含される。本工程(4)において、好ましくは、SF-O3培地が用いられる。
本工程(5)は、前記工程(4)で得られた細胞を、TGF-β阻害剤、IGF1および血清を含む培養液中で培養する工程である。本工程(5)において用いる培養液は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)培地、αMEM培地、Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM)培地、Ham's F12培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、StemPro34(invitrogen)、RPMI-base mediumおよびこれらの混合培地などが包含される。本工程(5)において、好ましくは、DMEM培地が用いられる。
本発明の一つの態様において、多能性幹細胞からの骨格筋前駆細胞の製造用キットを提供する。本キットには、上記したmiRNA応答性mRNAに加えて、骨格筋前駆細胞の誘導のための特定の因子を含む骨格筋前駆細胞誘導剤(例えば、凍結乾燥物、適当な緩衝液に溶解した凍結液剤など)、細胞、試薬および培養液を含み得る。本キットには、さらに分化誘導の手順を記載した書面や説明書を含んでもよい。
本発明は、前記方法により選別された骨格筋前駆細胞を含む筋原性疾患治療剤を提供する。
Dox依存的にMYOD1の強制発現が可能なヒトiPS細胞(以下、MYOD1-hiPSCsと言う。)はiPS細胞研究所櫻井英俊博士から分与を受けて用いた(PLoS One. 2013 Apr 23;8(4):e61540)。当該MYOD1-hiPSCsから骨格筋細胞へ分化誘導した。詳細には、マトリゲル(BD bioscience)でコートされた24 wellプレートにおいてbFGFを除いたiPS培地(霊長類ES細胞培地:Reprocell #RCHEMD001)で培養した。24時間後、1μg/mLのドキシサイクリン(LKT Laboratries)を培地に加えた。さらに24時間後、分化誘導培地-1(表4)に変えて分化9日目まで培養した。
ヒトiPS細胞(201B7)は、京都大学の山中教授より供与されたものを、従来の方法で培養した(Takahashi K, et al. Cell. 131:861-72, 2007)。当該201B7を常法に従ってBACコンストラクトを用いた相同組換えによりPax3遺伝子座の開始コドンの3’側へEGFP配列を連結させ、PAX3の発現と連携してEGFPを発現するiPS細胞株(PAX3-GFP iPSCs)を作製した。同様に、201B7を常法に従ってCRISPR/CAS9システムを用いた相同組換えにより、MYF5遺伝子座の開始コドンの5’側へtdTomato配列を連結させ、MYF5の発現と連携してtdTomatoを発現するiPS細胞株(MYF5-tdTomato C3 iPSCs)を作製した。どちらの細胞株も、片アレルのみに遺伝子組み換えが行われたことを確認している。
<疾患iPS細胞株>
顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー患者より同意を得て採取した皮膚を培養することによって得られた線維芽細胞へ、Epi5 Episomal iPSC Reprogramming Kit(Life Technologies)を用いて、Okita K et al., Nat Methods. 8:409-412, 2011に記載の方法に従って作製した(以下、疾患iPS細胞株という)。
iPS細胞(PAX3-GFP iPSCs、MYF5-tdTomato C3 iPSCs、201B7、または疾患iPS細胞株)から骨格筋細胞へ分化誘導した。詳細には、マトリゲル(BD bioscience)でコートされた6 wellプレート上で培養されたiPS細胞に対して10μM SB431542および5μM CHIR99021を添加したCDMi基本培地(1% Albumin from bovine serum (SIGMA)、1% Penicillin-Streptomycin Mixed Solution (26253-84 ナカライテスク)、1% CD Lipid Concentrate (Invitrogen)、1% Insulin-Trandferin-Selenium (Invitrogen)および0.5mM 1-Thioglycerol (SIGMA)を添加した1:1IMDM(Invitrogen)およびF12(Invitrogen)混合培地)(以下、分化培地Aと言う)を加えて培養した。以後、2日おきに培地交換を行った。7日後に継代し、マトリゲル(BD bioscience)でコートされた6 wellプレート上で培養された各iPS細胞に対して分化培地Aを加えて培養した。以後、2日おきに培地交換を行った。7日後に継代し、マトリゲル(BD bioscience)でコートされた6 wellプレートに分化培地Aを加えて培養した。24時間後に分化培地Aにて培地交換を行った。以後、2日おきに培地交換を行った。さらに6日後(誘導初日から14日後)、継代を行い、マトリゲル(BD bioscience)でコートされた6 wellプレートに分化培地Aを加えて培養した。24時間後に分化培地Aにて培地交換を行った。以後、2日おきに培地交換を行った。さらに6日後(分化誘導初日から21日後)、200μM 2-ME、5mM LiCl、10μM SB431542、10ng/ml IGF-1、10ng/ml HGFおよび10ng/ml bFGFを添加したSF-O3基本培地(0.2% BSA (Sigma)を添加したSF-O3 (三光純薬 SS1303))(以下、筋分化培地Aと言う)にて培地交換を行った。4日後(分化誘導初日から25日後)、200μM 2-ME、5mM LiCl、10μM SB431542および10ng/ml IGF-1を添加したSF-O3基本培地(以下、筋分化培地Bと言う)にて培地交換を行った。3日後(分化誘導初日から28日後)、200μM 2-ME、5mM LiCl、10μM SB431542、10ng/ml IGF-1および10ng/ml HGFを添加したSF-O3基本培地(以下、筋分化培地Cと言う)にて培地交換を行った。以後、週2回筋分化培地Cにて培地交換を行った。筋分化培地Cに変えてから14日後(分化誘導初日から42日後)、2% Horse Serum(HS)、5μM SB431542および10ng/ml IGF-1を添加したDMEM基本培地(1% Penicillin-Streptomycin Mixed Solution、1% L-gluthamine (ナカライテスク #16948-04)および200μM 2-MEを添加したDMEM (Invitrogen #11960069))(以下、筋分化培地Dと言う)にて培地交換を行った。以後、週2回筋分化培地Dにて培地交換を行った。筋分化培地D中での培養は、最長、分化誘導開始から95日まで行った。
蛍光タンパク質 (EGFP、tagBFPおよびtagRFP)をコードする遺伝子は、pEGFP-N1 (Clontech)、pTagBFP-Tubulin (evrogen)、またはpTAP-tagRFPを鋳型として、対応するプライマー(それぞれ、TAPEGFP_IVTfwd(配列番号11)およびTAP_IVTrev(配列番号14)、tagBFP fwd(配列番号12)およびTAP_IVTrev、またはtagRFP fwd(配列番号13)およびTAP_IVTrev)およびKOD-Plus-Neo(KOD-401,TOYOBO)を用いて、PCR(サイクル:94℃ 2分10秒、68℃ 30秒を20サイクル行い、15℃で保存)により得られた。PCR産物をMiniElute PCR purification Kit (QIAGEN)を用いて精製した。PCR産物をそれぞれ、蛍光タンパク質カセット(EGFPカセット(配列番号15)、tagBFPカセット(配列番号16)またはtagRFPカセット(配列番号17))と称す。
MEGAscript T7 kit (Ambion)と上記で作製されたDNA templateを用いてmRNA合成を行った。この反応において、ウリジン三リン酸及びシチジン三リン酸に替えて、シュードウリジン−5’ −三リン酸及びメチルシチジン-5’-三リン酸(TriLink BioTechnologies)をそれぞれ用いた。IVT(mRNA合成)反応の前に、グアニジン-5’-三リン酸は、Anti Reverse cap Analog (New England Biolabs)で5倍希釈した。反応混合液を37℃で5時間インキュベートして、TURBO DNase (Amibion)を加えた後、37℃でさらに30分インキュベートした。得られたmRNAは、FavorPrep Blood / Cultured Cells total RNA extraction column (Favorgen Biotech)で精製し、Antarctic phosphatase (New England Biolabs)を用いて37℃で30分インキュベートした。その後、RNeasy Mini Elute Cleanup Kit (QIAGEN)により、さらに精製した。得られたmRNAをそれぞれ、EGFP mRNA(配列番号42)、tagBFP mRNA(配列番号43)、tagRFP mRNA(配列番号44)、miR-206-EGFPスイッチ(配列番号45)、miR-1-tagBFPスイッチ(配列番号46)、miR-133-tagBFPスイッチ(配列番号47)、miR-206-tagBFPスイッチ(配列番号48)、miR-489-tagBFPスイッチ(配列番号49)、およびmiR-708-tagBFPスイッチ(配列番号50)と称す。
miRNAの発現に応答して蛍光タンパク質の翻訳を抑制するmRNA(以下、miRNAスイッチという)と共にmiRNA応答性のmRNAとは異なる蛍光タンパク質の遺伝子をコードしたmRNA(以下、トランスフェクションコントロールという)をそれぞれの細胞に導入した。細胞を播種せずmRNA導入を行う場合は、Stemfect RNA transfection kit(Stemgent)を用いて以下の方法で行った。1.5 mL tube内にStemfect Transfection Buffer と2種類のmRNAが12.5 μLになるように調製し、もう一方の1.5mL tubeに1μLのStemfect RNA Transfection ReagentとStemfect Transfection Bufferが12.5 μLになるように調製した。調製された上記の2種類の溶液を混合し、室温で15分間インキュベートした。混合液を全量、細胞が培養されているwell(24well plate)に加え37℃、5%CO2下で4 時間インキュベートした。その後、培地を除き、500 μLの培地(DMEM 2%HS)をwellに加えた。24時間後、fluorescence activated cell sorting(BD、以下FACS)を用いて解析を行った。細胞を播種してmRNA導入を行う場合は、24well plateで培養されている細胞に200 μLのAccumax(フナコシ)を加え、37℃、5%CO2下で10-15分インキュベートした後、500 μLの培地(DMEM 2%HS)を加え15 mL tubeに回収して4℃、2000 rpm、10分で遠心を行い、上清を取り除いた。500 μLの培地を加えピペッティングした後、cell countess(invitrogen)で細胞数を計測後、必要に応じて希釈した。24well plateにまき直す場合は 2×105 cell/well、6well plateにまき直す場合は1×106 cell/wellで細胞をまき直した。細胞をwellにまくと同時に調製された(上記の方法)mRNAを含む混合液をwellに加えた。37℃、5%CO2下で4 時間インキュベートした。その後、培地を除き、必要量の培地(DMEM 2%HS)をwellに加えた。24時間後、FACSを用いて解析を行った。
各解析対象の細胞に24 well plate、1 wellあたり200 μLのAccumax(フナコシ)を加え(6 well plateでは1mL)加え、37℃、5%CO2下で10-15分インキュベートした。その後500 μLの培地(DMEM 2%HS)を加え細胞を15 mL tubeに回収して4℃、2000 rpm、10分で遠心を行い、上清を取り除いた。1 well あたり200 μLの培地(DMEM 2%HS)またはHBSSを加えて、ピペッティングで懸濁しフィルターで通して解析に用いた。
逆転写反応にはReverTra Ace(TOYOBO)を用いて行った。PCRはPower SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems)を用いて行った。miRNAの発現量解析には、逆転写反応はTaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit(Applied Biosystems)を用いて行いPCRはTaqMan Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems)を用いて行った。用いたプライマーは表5に示す。
FACSでソーティングされた1×104個の細胞をサイトスピンを用いて、1000 rpm 2分で遠心を行いスライドガラスに接着させた。室温で30分ドライヤーで乾燥後、4%PFAを200μL滴下し室温で20分乾燥させ、固定した。ドライヤーで30分乾燥後、PBSで洗浄した。余分なPBSを取り除き、5% Blocking one(ナカライテスク)を200μLを滴下し、室温で1時間静置した。Can Get Signal Solution B(TOYOBO)にて必要量の抗体を調製し、100μL滴下し室温で1時間または4℃で一晩静置した。PBS-Tで洗浄後、Can Get Signal Solution B(TOYOBO)にて必要量の抗体とHoechstを調製し、室温で1時間静置した。PBS-Tで洗浄後、Permaflow(テルモ)を1〜2滴、滴下後カバーガラスを被せ、室温にて30分以上静置した。抗体については表6に示す。
FACSでソーティングされた3×104個の細胞をマトリゲル(BD bioscience)コートされた48 well plate に播種し、筋分化培地Aにて培養した。播種後、翌日筋分化培地Aにて培地交換を行い、以後4日に一度筋分化培地Aにて培地交換または、5日後に筋分化培地Dにて培地交換を行った。7日後、必要な抗体を用いて細胞の免疫染色を行った。抗体については表6に示す。
筋組織に特異的に発現しているという報告があるmiR-206(The Journal of Cell Biology, 174(5), 677-87, 2006)が、Dox-MYOD1強制発現による骨格筋細胞への分化過程において、どのように発現変動するかをqRT-PCRを用いて調べた(図1A)。その結果、Dox添加により骨格筋細胞へと分化誘導されるに従い、miR-206の発現量が上昇することが示された。Doxの培地への添加は、day 1からday 7の間におこなった。day9にてmiR-206の発現が減少することから、MyoD発現の減少に伴ってmiR-206の発現が抑制されることが示唆された(PLoS One. 2013 Apr 23;8(4):e61540)。
Claims (17)
- miRNA応答性mRNAを細胞群に導入する工程を含む、骨格筋前駆細胞の選別方法であって、当該miRNA応答性mRNAが下記:
(i) 骨格筋前駆細胞で特異的に発現しているmiRNAによって特異的に認識される配列を含む核酸、および
(ii) マーカータンパク質をコードする配列を含む核酸
を含む配列からなり、
ここで、当該(ii)は、当該(i)の核酸に機能的に連結している、方法。 - 前記(i)および(ii)が、5'から3'の方向に連結されている、請求項1に記載の方法。
- 前記(i)の骨格筋前駆細胞で特異的に発現しているmiRNAが、miR-1、miR-133およびmiR-206からなる群から選択される1またはそれ以上のmiRNAである、請求項1または2に記載の方法。
- 前記(ii)のマーカータンパク質が、蛍光タンパク質、アポトーシス誘導タンパク質および自殺遺伝子にコードされるタンパク質からなる群から選択される1またはそれ以上の遺伝子である、請求項1から3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記(ii)のマーカータンパク質が、蛍光タンパク質であって、コントロールmRNAをさらに細胞群に導入する工程を含む、請求項4に記載の方法。
- 前記細胞群が、多能性幹細胞から骨格筋前駆細胞へと分化誘導させた細胞群である、請求項1から5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記多能性幹細胞から骨格筋前駆細胞への分化誘導が、下記の工程(1)から(5)を含む、請求項6に記載の方法:
(1)多能性幹細胞をTGF-β阻害剤とGSK3β阻害剤を含む培養液中で培養する工程、
(2)(1)の工程で得られた細胞を、TGF-β阻害剤、GSK3β阻害剤、IGF1、HGFおよびbFGFを含む培養液中で培養する工程、
(3)(2)の工程で得られた細胞を、TGF-β阻害剤、GSK3β阻害剤およびIGF1を含む培養液中で培養する工程、
(4)(3)の工程で得られた細胞を、TGF-β阻害剤、IGF1およびHGFを含む培養液中で培養する工程、および
(5)(4)の工程で得られた細胞を、TGF-β阻害剤、IGF1および血清を含む培養液中で培養する工程。 - 前記工程(1)から(5)のTGF-β阻害剤がSB431542であり、前記工程(1)のGSK3β阻害剤がCHIR99021であり、前記工程(2)および(3)のGSK3β阻害剤がLiClである、請求項7に記載の方法。
- 前記工程(5)の血清がウマ血清である、請求項7または8に記載の方法。
- 下記の工程(1)から(3)を含む多能性幹細胞からの骨格筋前駆細胞の製造方法:
(1)多能性幹細胞から骨格筋前駆細胞を製造する工程、
(2)(1)の工程で得られた細胞へ、下記(i) および(ii)を含むmiRNA応答性mRNAを導入する工程:
(i) 骨格筋前駆細胞で特異的に発現しているmiRNAによって特異的に認識される配列を有する核酸、および
(ii)マーカータンパク質をコードする核酸
を含む配列からなり、ここで、当該(ii)は、当該(i)の核酸に機能的に連結している、ならびに、
(3)前記マーカータンパク質の翻訳量が少ないまたは検出できない細胞を選択する工程。 - 前記工程(1)が下記の工程(1-1)から(1-5)を含む、請求項10に記載の方法:
(1-1)多能性幹細胞をTGF-β阻害剤とGSK3β阻害剤を含む培養液中で培養する工程、
(1-2)(1-1)の工程で得られた細胞を、TGF-β阻害剤、GSK3β阻害剤、IGF1、HGFおよびbFGFを含む培養液中で培養する工程、
(1-3)(1-2)の工程で得られた細胞を、TGF-β阻害剤、GSK3β阻害剤およびIGF1を含む培養液中で培養する工程、
(1-4)(1-3)の工程で得られた細胞を、TGF-β阻害剤、IGF1およびHGFを含む培養液中で培養する工程、および
(1-5)(1-4)の工程で得られた細胞を、TGF-β阻害剤、IGF1および血清を含む培養液中で培養する工程、 - 前記工程(1-1)から(1-5)のTGF-β阻害剤がSB431542であり、前記工程(1-1)のGSK3β阻害剤がCHIR99021であり、前記工程(1-2)および(1-3)のGSK3β阻害剤がLiClである、請求項11に記載の方法。
- 前記工程(1-5)の血清がウマ血清である、請求項11または12に記載の方法。
- 前記(i)および(ii)が、5'から3'の方向に連結されている、請求項10から13のいずれか1項に記載の方法。
- 前記(i)の骨格筋前駆細胞で特異的に発現しているmiRNAが、miR-1、miR-133およびmiR-206からなる群から選択される1またはそれ以上のmiRNAである、請求項10から14のいずれか1項に記載の方法。
- 前記(ii)のマーカータンパク質が、蛍光タンパク質、アポトーシス誘導タンパク質および自殺遺伝子にコードされるタンパク質からなる群から選択される1またはそれ以上の遺伝子である、請求項10から15のいずれか1項に記載の方法。
- 前記(ii)のマーカータンパク質が、蛍光タンパク質であって、コントロールmRNAをさらに(1)の工程で得られた細胞へ導入する工程を含み、前記工程(3)が、さらに当該コントロールmRNAが導入された細胞を選択する工程である、請求項16に記載の方法。
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