CN106916850B - 一种诱导多能性干细胞的重编程方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种更有利于临床前研究的人诱导多能干细胞的重编程的方法，主要是采用仙台病毒介导的人诱导多能干细胞感染及重编程的方法。本发明的重编程方法具有重编程效率高，得到的人诱导多能干细胞低免疫原性，安全性较高等特点。此外，与慢病毒介导的人诱导多能干细胞的重编程的方法相比，采用本发明方法获取的人诱导多能干细胞没有外源基因的整合，具备更高的安全性。

Description

一种诱导多能性干细胞的重编程方法
技术领域
本发明涉及细胞领域，特别涉及成体干细胞向诱导多能性干细胞(iPSC)的重编程方法。
背景技术
脊椎动物早期胚胎囊胚期的内细胞团具有多能性，其可以分化为机体除胎盘之外三胚层的所有类型细胞，这些已经终端分化的细胞在体内一般是不会改变命运的。一些研究表明，通过核移植，细胞融合和多能性细胞提取物共培养的方法可以实现终端分化的细胞重新逆分化为多能性的状态(Yamanaka S,Blau HM,2010,Nuclear reprogramming to apluripotent state by three approaches.Nature 465:704-712)。但这些方法都依赖于卵母细胞这种稀缺的材料，因此在应用上受到一定的限制。
2006年，Yamanaka利用逆转录病毒载体，将外源性的oct4、sox2、c-myc和klf4四种转录因子在小鼠成纤维细胞中过表达，得到了诱导多能性干细胞(iPSC，InducedPluripotent Stem Cells)，其与小鼠胚胎干细胞(ESCs，Embryonic Stem Cells)在形态、基因表达及分化潜能性等方面均很相似，且可以发育成完整的个体(Takahashi K,Yamanaka S,2006,Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic andadult fibroblast cultures by defined factors.Cell 126:663-676)。
iPSC技术是干细胞研究领域的重大突破。在药物筛选方面，将病人表皮细胞诱导为iPSC，再将iPSC诱导为所需要的病体细胞，该病体细胞可用于药物筛选，进而用筛选得到的药物来治疗这种疾病。在细胞模型方面，iPSC技术可以为一些难以获得组织的疾病如神经相关疾病提供病体细胞(Egawa N et al,2012,drug screening for ALS usingpatient-specific induced pluripotent stem cells.science translationalmedicine 4)。在细胞治疗方面，iPSC由自体的细胞诱导而来，用于自身的治疗可以减小免疫排斥效应，同时规避了ESCs的伦理问题(Wernig M et al,2008,Neurons derived fromreprogrammed fibroblasts functionally integrate into the fetal brain andimprove symptoms of rats with Parkinson's disease.Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America 105:5856-5861；Xu D et al,2009,Phenotypic correction of murine hemophilia A using an iPSC cell-basedtherapy.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United Statesof America 106:808-813)。iPSC用于疾病治疗的另一个优点是可以通过基因打靶的方法修复细胞的基因组，用于治疗一些遗传病。如Hanna等利 用模型小鼠的尾尖成纤维细胞诱导为iPSC，通过基因打靶的方法将突变的基因校正，进而将其分化为造血祖细胞后注回小鼠体内，产生了正常的血细胞并成功治愈了小鼠。Raya等也将Fanconi贫血病患者的细胞诱导为iPSC，对其进行基因校正后进一步分化为造血祖细胞，为该疾病的iPSC治疗进行了初探(Raya A,2009,Disease-corrected haematopoietic progenitors from Fanconianaemia induced pluripotent stem cells.Nature 460:53-59.)。
iPSC可作为临床治疗种子细胞的前提是其具有较低的免疫原性，但是Zhao等用逆转录病毒诱导小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)重编程得到的iPSC在同基因型的小鼠体内无法形成或者形成了难以检测的畸胎瘤，表明以该方法获得的iPSC具有较高的免疫原性(Zhao Tet al,2011,Immunogenicity of induced pluripotent stem cells.Nature 474:212-215)，iPSC的免疫原性始终是目前阻碍其进一步进入临床应用的主要障碍，但是目前对于其具有免疫原性的机理尚不可知。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种更有利于临床前研究的人诱导多能干细胞的重编程的方法，包括如下步骤：
1、取人脐带间充质干细胞(UCMSC)培养，再以表达Oct4，Sox2，c-Myc和Klf4四种转录因子的仙台病毒感染细胞；
2、以增殖培养基培养；
3、再以诱导培养基培养，在无饲养层体系中进行重编程，待充分重编程后，挑取单克隆；
4、继续扩大培养并筛选，筛选得到经AP染色为阳性、且表达多能性蛋白Nanog、SSEA-4，Tra-1-60与Tra-1-81的单克隆，即得到目的iPSC。
优选的，所述人诱导多能干细胞的重编程的方法，包括如下步骤：
1、取人脐带间充质干细胞(UCMSC)培养，待细胞长满后，将细胞接种于六孔板中。
2、细胞生长48h后，以表达Klf4、Oct4、Sox2的KOS仙台病毒，表达c-Myc和表达Klf4的仙台病毒感染细胞，各病毒的感染复数比例是KOS:c-Myc：Klf4＝5:5:3；
3、24h后更换新鲜的增殖培养基，继续培养6天，每2天换液；
4、将细胞消化，接种于VTN-N包被的六孔板中，用增殖培养基培养；
5、接种24h后换为诱导培养基培养，此后每天换新鲜的诱导培养基，在无饲养层体系上进行重编程；
6、待充分重编程后，挑取单克隆，继续扩大培养并筛选，经AP染色为阳性，且表达多能性蛋白Nanog、SSEA-4、Tra-1-60与Tra-1-81的即为目的iPSC。
优选的，步骤1中的细胞接种密度在4～8万/孔。
优选的，步骤2中所述KOS为同一载体上等比例串连Klf4，Oct4和Sox2序列。
优选的，步骤4中的iPSC在无饲养层的体系上进行重编程。
优选的，步骤6中克隆挑取的时间为感染仙台病毒后21～25天。
更优选的，上述所述方法中的人脐带间充质干细胞(UCMSC)由如下方法分离和培养得到，包括如下步骤：
(a)取新鲜脐带，PBS洗涤后，用酒精浸泡，再用PBS洗涤；
(b)去除脐动脉和静脉；
(c)取华通氏胶(Wharton’s jelly)，剪碎加增殖培养基培养，传代纯化并冻存即得到所需的UCMSC。
优选的，上述步骤(a)中，用酒精浸泡后，更有利于华通氏胶(Wharton’s jelly)的剥离。
优选的，纯化的具体方法是消化2分钟后即将消化下来的细胞转移至新的皿中继续培养。
优选的，所述增殖培养基为含有10％(v/v)FBS、100U/mL的青霉素、100μg/mL的链霉素，或者含有10％(v/v)FBS、10ng/mL bFGF、50μg/mL Vc、100U/mL的青霉素、100μg/mL的链霉素的DMEM/F12培养基。更优选的，所述增殖培养基为含有10％(v/v)FBS、10ng/mLbFGF、50μg/mL Vc、100U/mL的青霉素、100μg/mL的链霉素的DMEM/F12培养基。
采用上述培养方法得到的UCMSC具有更高的增殖活性，能更好的维持间充质干细胞的分子表达特性；细胞具有更高的纯度；同时更有利于重编程的发生。
本发明诱导重编程方法重编程效率高，得到的iPSC具有低免疫原性，同时可完消除外源性基因的随机整合带来的安全性问题。
附图说明
图1：M1增殖培养基中培养的UCMSC(M1 UCMSC)与M2增殖培养基中培养的UCMSC(M2UCMSC)的连续传代：本图第一行从左到右依次为M1增殖培养基中第1、3和8代的UCMSC，第二行从左到右依次为M2增殖培养基中第1、3、8和15代的UCMSC。
图2：第3代与第10代M2增殖培养基中培养的M2 UCMSC的增殖曲线，其中横轴为天数值。
图3：M1与M2 UCMSC的CD29、CD44与CD105平均荧光强度的比较。
图4：iPSC的AP染色。
图5：iPSC的免疫荧光染色。
图6：iPSC的体外分化检测,A图指仙台病毒iPSC形成EB后向三胚层分化的PCR检测，B 图指慢病毒iPSC形成EB后向三胚层分化的PCR检测。
图7：UCMSC的重编程效率检测：其中，S-Free-M1指仙台病毒感染M1 UCMSC在无饲养层体系上的重编程体系，S-Free-M2指仙台病毒感染M2 UCMSC在无饲养层体系上的重编程。
图8：iPSC的外源性基因检测：图A为仙台病毒iPSC的外源性基因残留检测，其中以仙台病毒感染后5天的UCMSC为阳性对照，水为阴性对照；图B为慢病毒iPSC的外源性基因残留检测，其中以质粒为阳性对照，水为阴性对照。
图9：iPSC的HLA-I的表达水平检测。
图10：IFNγ处理前后iPSC的HLA-II表达水平检测。
图11：刺激淋巴细胞增殖能力检测。
图12：小鼠体内免疫，接种5天后组织切片HE染色图。
图13：小鼠体内免疫，接种48小时后组织切片HE染色图。
具体实施方式
实施例1：UCMSC的原代分离与培养、鉴定
1、UCMSC的原代分离与培养
取新鲜脐带，用加100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的PBS冲去脐带外围血块，将其清理干净。脐带两头剪去1厘米左右并弃去，并把血管里的血挤出来，PBS洗涤3遍。将组织块用75％的酒精浸泡1min，再用PBS洗涤3遍。将脐带从中间剪成长约2cm的小段，此时若还有血块，也挤出洗净；纵向剖开，用齿镊将2条脐动脉和1条脐静脉钝性分离去除。用一支镊子固定脐带，再用手术刀刮取华通氏胶(Wharton’s jelly)，直到只剩下接近透明的羊膜。PBS充分冲洗后，将其置于6cm皿中，添加少量的增殖培养基，用剪刀将其充分剪碎至1mm3大小组织块。将组织块均匀的铺至10cm皿中，向其中添加1～2mL的增殖培养基，37度培养箱中正置培养4h，轻柔缓慢地补加增殖培养基至8mL。6天后首次半量换增殖培养基，以后每3天换一次增殖培养基至生长至80％-90％的汇合度。利用0.25％胰酶进行细胞传代，将2-3分钟内消化下来的细胞转移至新的培养皿中，未消化下来的则弃去，如此传2～3代。
上述实验分别用两种增殖培养基同时进行,具体成分分别如下：
M1增殖培养基：含有10％(v/v)FBS、100U/mL的青霉素、100μg/mL的链霉素的DMEM/F12培养基；
M2增殖培养基：含有10％(v/v)FBS、10ng/mL bFGF、50μg/mL Vc、100U/mL的青霉素、100μg/mL的链霉素的DMEM/F12培养基。
2、UCMSC的鉴定
2.1增殖活性检测：连续传代M1 UCMSC(M1增殖培养基中培养的UCMSC)和M2 UCMSC(M2增殖培养基中培养的UCMSC),分别在第1、3、8和15代时拍照记录细胞的状态(实验结果如附图1所示)。对于M2 UCMSC，分别对第3代和第10代的细胞绘制生长曲线(实验结果如附图2所示)。
2.2表面分子检测：利用流式细胞术检测其CD29，CD44，CD105，CD34与CD45的表达情况，分别检测其阳性率和平均荧光强度指标(实验结果如附图3、表1所示)。表1为流式检测M1与M2 UCMSC表面分子的表达情况：表中所示为M1 UCMSC、M2 UCMSC的CD29、CD44、CD105、CD34和CD45细胞的阳性率。
3.鉴定结果：
从图1可以看出M1 UCMSC连续传8代，细胞即衰老，表现为有较多形态不规则的细胞，如细胞质过大且铺开，立体感较弱，停止生长；M2 UCMSC连续传15代以上依然无明显的衰老；在第3代时，M1 UCMSC在4天内仅可扩增9倍，而M2 UCMSC在4天内可扩增15倍，且传至第10代依然具有很高的增殖速度(图2)，因此M2 UCMSC具有更高的增殖活性。
流式细胞术结果显示M1与M2 UCMSC均高表达CD29，CD44和CD105(>99％),不表达CD34和CD45(<0.5％),因此具有很高的纯度(表1)，但M2 UCMSC CD29、CD105和CD44表达水平更高(图3)，说明M2培养基能更好的维持间充质干细胞的分子表达特性。
表1：流式检测M1 UCMSC与M2 UCMSC表面分子的表达情况
Figure BDA0000890507690000051
实施例2：慢病毒诱导UCMSC重编程
1.方法：
1.1病毒包装：将目的质粒(Oct4，Sox2，c-Myc和Klf4)分别与Pvsvg和pCMV-dR8.91(来自于上海斯丹赛生物技术有限公司)载体共转染293T细胞，48小时后包装产生表达分别Oct4，Sox2，c-Myc和Klf4四种转录子的病毒，收集各病毒留用。
1.2待实施例1中UCMSC传至第3代，利用包装好的Oct4，Sox2，c-Myc和Klf4四种转录子的慢病毒，分别以感染复数为5的比例感染10万M1或M2增殖培养基培养的UCMSC,并接种于CF-1饲养层上；
1.3 24小时后，将M1或M2增殖培养基更换为iPSC诱导培养基(含有20％(v/v)FBS,1％(v/v)NEAA，1％(v/v)Glutamax-1,100μMβ-巯基乙醇和4ng/mL的bFGF，2μg/mL DOX的DMEM/F12培养基)，分别添加50μg/mL维生素C(Vc)和1mM的丙戊酸(VPA)诱导7天。
1.4 7天后，撤除VPA继续诱导5天，诱导25天后撤出DOX，继续诱导5天后进行AP染色，并挑取AP染色阳性单克隆。
2.结果：感染10万细胞，M1 UCMSC无法得到iPSC克隆，而M2 UCMSC可得到5-10个AP阳性的克隆(阳性克隆率0.005％-0.01％)，并将其中两个细胞株(分别命名为L-11与L-13)用于后期进一步的检测工作。
实施例3：仙台病毒诱导UCMSC重编程
1.方法:
1.1复苏实施例1中UCMSC，待细胞长满后，将细胞接种于六孔板的1孔中，接种密度在4～8万/孔。
1.2 48小时后，以表达Klf4、Oct4、Sox2的KOS仙台病毒，表达c-Myc和表达Klf4的仙台病毒感染细胞，各病毒的感染复数比例是KOS:c-Myc：Klf4＝5:5:3(其中KOS为同一载体上等比例串连Klf4，Oct4和Sox2序列)。
1.3 24h后更换新鲜的增殖培养基(M1或M2)，继续培养6天，每2天换液。
1.4将细胞消化，接种于VTN-N(购自Lifetechnologies)包被六孔板中，用相应的增殖培养基培养，使其贴壁。
1.5 24h后换为E8培养基(购自Lifetechnologies)培养，此后每天换液，即在无饲养层体系上进行重编程。
2.结果：在无饲养层的体系上，重编程21天后，挑取形态类似于人胚胎干细胞的克隆至新的培养皿中，将其中两个细胞株AP阳性的iPSC(分别命名为S-15与S-32)用于后期进一步的检测工作。
实施例4 iPSC鉴定
1.方法：
1.1 iPSC的AP染色：各iPSC接种于新的培养皿中生长3～5天后，利用碱性磷酸酶(AP)试剂盒对其进行染色并拍照(实验结果如附图4所示)。
1.2免疫荧光染色：待各iPSC生长3天后，4％多聚甲醛室温固定放置30min；用PBS洗涤1遍后，用抗体稀释液(0.2％(v/v)BSA和0.1％(v/v)Triton X-100溶于PBS)洗涤两次；加封闭液(含1％(v/v)BSA+4％(v/v)正常血清+0.4％(v/v)Triton X-100的PBS溶液)室温封闭细胞1h后添加一抗，室温孵育2h；再用含0.1％(v/v)Triton X-100的PBS洗涤细胞3次,将二抗加到细胞样品上，室温放置1h；PBS洗涤三次后，在终浓度为1μg/mL的DAPI溶液中DAPI(1mg/ml in PBS)母液以1:1000用PBS稀释室温放置5min；用PBS洗涤两次；镜下观察(实验结果如附图5所示)。
1.3 iPSC的体外分化检测：将各iPSC消化成小团块，接种于分化培养基(含有20％(v/v)KSR、1％(v/v)NEAA、1％(v/v)Glutamax-1、100uMβ-巯基乙醇的DMEM/F12培养基)中分化20天，提取总RNA并反转录，以GAPDH为内参基因，以PCR的方法检测三胚层的分化标记(内胚层：AMYLASE和AFP；中胚层：BRACHYURY、MSX1、CK7和NPPA；外胚层：PAX6、MAP2和NEUROD1，实验结果如附图6所示)
1.4 iPSC的克隆形成效率检测：以M1和M2 UCMSC为源头细胞，参考实施例3中的方法在无饲养层的体系上对其进行重编程，21天后进行AP染色，统计其AP阳性克隆的形成率(实验结果如附图7所示)。
2.结果：
分别对细胞株L-11、L-13和细胞株S-15、S-32进行AP染色，结果显示均为阳性(图4)；该4株iPS也表达了多能性蛋白Nanog、SSEA-4，Tra-1-60与Tra-1-81(图5)；体外可形成拟胚体(EB)，并可向三胚层分化(图6)，说明其符合iPSC的鉴定标准。
分别以M1 UCMSC和M2 UCMSC为源头细胞进行重编程，结果显示M2 UCMSC(0.55％)的AP阳性克隆形成率显著高于M1 UCMSC(0.28％，图7)，说明本发明中得到的以M2 UCMSC为源头细胞更有利于重编程的发生。
实施例5 iPSC的外源性基因整合情况
1.实验方法：分别提取各iPSC的总RNA并反转录为cDNA，对于仙台病毒系统得到的iPSC，分别设计外源性基因的引物Sev，KOS，c-Myc和Klf4；对于慢病毒系统得到的iPSC，分别设计外源性基因的引物Oct4，Sox2，c-Myc和Klf4；以各iPSC的cDNA为模板进行PCR，并电泳检测外源性基因的残留表达情况(实验结果如附图8所示)。
2.实验结果：对于仙台病毒系统的iPSC，PCR结果显示其不表达外源性的基因Sev(仙台病毒载体的骨架结构)，c-Myc，Klf4和KOS(图8-A)；对于慢病毒系统的iPSC，两株iPSC均残留表达Oct4和c-Myc，不表达Klf4，L-11iPSC表达Sox2，而L-13iPSC不表达Sox2(图8-B)。说明慢病毒系统残留外源性的基因于细胞基因组中，而仙台病毒系统得到的iPSC在完成重编程后可除去外源性基因，因而具有更高的安全性。
实施例6 iPSC的免疫学特性
1.实验方法
1.1 HLA的表达水平检测
将四株iPSC(L-11,L-13，S-15与S-32)分别传代至较纯的状态，其中每株细胞各取1份用50U/mL的IFNγ处理7天，用ETDA分别消化各细胞并计数，对于未用IFNγ处理的细胞分别取3x106细胞，分别用HLA-Ⅰ和HLA-Ⅱ抗体标记；对于IFNγ处理的细胞仅用HLA-Ⅱ抗体处理，避光孵育20min。用DPBS重悬洗涤2遍后，流式检测其表达情况(实验结果如图9和图10所示)。
1.2刺激淋巴细胞增殖能力检测
培养iPSC(S-15,、S-32、L-11和L-13)至较满的状态，以1:1.5的比例传至六孔板的3孔中，24h后用10ug/mL的MMC处理3h，PBS洗涤3-4遍后用EDTA消化至单细胞，待用。提前一天复苏PBMC，计数，24h后以iPSC:PBMC＝1:10的比例，取2万iPS细胞与20万PBMC共孵育96h，同时检测了8个PBMC细胞株，每个细胞株4个重复，用含10％(v/v)FBS的1640培养基培养，CCK8检测PBMC的增殖情况(实验结果如图11所示)。
1.3体内免疫原性检测
传代各iPSC(L-11，L-13，S-15和S-32)至较纯的状态，充分消化至单细胞，将各细胞密度调至1×107个/mL。小鼠后腿肌肉注射100uL的细胞悬液，每只100万细胞；于接种后的第5天取小鼠组织并冰冻切片，用hNA抗体进行免疫荧光染色，检测细胞的存活情况(实验结果如图12所示)。在接种后48h取组织固定，石蜡包埋并切片进行HE染色，观察白细胞浸润情况(实验结果如图13所示)。其中冰冻切片的染色步骤为切片自然晾干(15-30min左右)，置PBS中浸泡10分钟，以去除OCT。通透液室温Triton X-100透膜10min，再用PBS洗涤一遍。吸干PBS，添加封闭液封闭1h，血清封闭后添加一抗，避免中间有干片出现。 加入50uL一抗4度过夜。室温复温15分钟后，PBS洗涤3次。添加二抗，室温孵育1h(注意避光)后，PBS洗涤3次。添加DAPI孵育5min，PBS洗3次。
2.实验结果
2.1对于HLA-Ⅰ，流式检测结果显示源头细胞UCMSC高表达HLA-I(99.8％)，但重编程之后，L-11(26.9％)、L-13(24.2％)，S-15(34％)与S-32(41.3％)的HLAI的表达水平明显下降；对于HLA-II，UCMSC低表达HLA-II(图10)，在IFNγ处理前，各iPSC均低表达HLA-II，处理后依然维持着低表达水平(图10)，预示着各iPSC具有较低的免疫原性。
2.2与iPSC共孵育96小时后，与各iPSC细胞株的PBMC仅有着轻微的增殖，预示着其较低的免疫原性(图11)
2.3细胞注射入小鼠体内5天后，各iPSC细胞株均可检测到存活的细胞株(图12)。而48h后检测白细胞的结果显示各组均无明显的白细胞浸润情况(图13)。由此可见，通过本专利方法制备的iPSC细胞株均具有较低的免疫原性。

Claims (7)

1.一种诱导多能干细胞的重编程的方法，
包括如下步骤：
步骤1)取人脐带间充质干细胞培养，待细胞长满后，将细胞接种于六孔板中；
步骤2)细胞生长48小时后，以表达Klf4、Oct4、Sox2的KOS仙台病毒，表达c-Myc和表达Klf4的仙台病毒感染细胞，各病毒的感染复数的比例是KOS:c-Myc：Klf4＝5:5:3；
步骤3)24小时后更换新鲜的增殖培养基，继续培养6天，每2天换液；
步骤4)将细胞消化，接种于VTN-N包被的六孔板中，用增殖培养基培养；所述增殖培养基为含有10％(v/v)FBS、100U/mL的青霉素、100μg/mL的链霉素，或者含有10％(v/v)FBS、10ng/mL bFGF、50μg/mL Vc、100U/mL的青霉素、100μg/mL的链霉素的DMEM/F12培养基。
步骤5)接种24小时后换为诱导培养基培养，此后每天换新鲜的诱导培养基，在无饲养层体系上进行重编程；所述诱导培养基是E8培养基；
步骤6)待充分重编程后，挑取单克隆，继续扩大培养并筛选，经AP染色为阳性，且表达多能性蛋白Nanog、SSEA-4、Tra-1-60与Tra-1-81的即为目的iPSC。
2.如权利要求1所述的重编程的方法，其特征在于：步骤1中的细胞接种密度在4～8万/孔。
3.如权利要求1所述的重编程的方法，其特征在于：步骤2中所述KOS为同一载体上等比例串连Klf4，Oct4和Sox2序列。
4.如权利要求1所述的重编程的方法，其特征在于：步骤4中的iPSC在无饲养层的体系上进行重编程。
5.如权利要求1所述的重编程的方法，其特征在于：步骤6中克隆挑取的时间为感染仙台病毒后21-25天。
6.如权利要求1所述的重编程的方法，其特征在于：所述人脐带间充质干细胞由如下方法分离和培养得到，包括如下步骤：
(a)取新鲜脐带，PBS洗涤后，用酒精浸泡，再用PBS洗涤；
(b)去除脐动脉和静脉；
(c)取华通氏胶，剪碎加增殖培养基培养，胰酶传代、纯化并冻存即得到所需的人脐带间充质干细胞。
7.如权利要求6所述的重编程的方法，其特征在于：纯化的是消化2分钟后即将消化下来的细胞转移至新的皿中继续培养。
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