WO2021015086A1 - 骨格筋幹細胞から成熟筋管細胞を製造する方法 - Google Patents

骨格筋幹細胞から成熟筋管細胞を製造する方法 Download PDF

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skeletal muscle
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cell
muscle stem
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英俊 櫻井
慧 藤原
優江 佐藤
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    • G01—MEASURING; TESTING
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    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing mature myotube cells from skeletal muscle stem cells.
  • X-linked myotubular myopathy is a congenital myopathy with severe muscle weakness caused by a mutation in the MTM1 gene and is known to be associated with T-tubule misalignment.
  • Patent Document 1 The present inventors have succeeded in inducing skeletal muscle stem cells from human iPS cells.
  • Patent Document 1 In the latest study, alignment of sarcomere structure was observed in myotube cells obtained by inducing differentiation from human iPS cells, but no alignment of triplet structure and T-tube was observed. It has not yet been reported that myotube cells having a T-tubule structure aligned from pluripotent stem cells were produced.
  • Non-Patent Document 1 describes that in order to induce differentiation of mouse primary myoblasts and obtain mature myoblasts, a differentiation medium in which Matrigel was layered on mouse primary myoblasts and agrin was added was used. Has been done.
  • An object of the present invention is to provide a method for producing sufficiently mature myotube cells from skeletal muscle stem cells.
  • the present invention includes the following inventions in order to solve the above problems.
  • a method for producing mature myotube cells from skeletal muscle stem cells (1) A step of seeding skeletal muscle stem cells in a cell culture vessel and culturing them using a growth medium. (2) The step of exchanging the medium with a differentiation medium and culturing until some cells exhibit a spindle-shaped morphology, and (3) overlaying a gel containing extracellular matrix components on the cells and culturing using the differentiation medium.
  • a method comprising: [2] The method according to [1] above, wherein the differentiation medium is a medium containing less than 2% serum or serum-free supplement. [3] The method according to [2] above, wherein the differentiation medium in step (3) is a medium containing agrin.
  • the skeletal muscle stem cell is a skeletal muscle stem cell obtained by inducing differentiation from a pluripotent stem cell.
  • the skeletal muscle stem cells are skeletal muscle stem cells obtained by inducing differentiation from skeletal muscle stem cells derived from an individual with hereditary muscle disease or pluripotent stem cells derived from an individual with hereditary muscle disease.
  • a screening method that includes the step of selecting a substance.
  • the mature myotube cell produced by the production method of the present invention is a myotube cell having an aligned T-tube structure and a triplet structure formed by a sarcoplasmic reticulum and a T-tube.
  • mature myotube cells produced from skeletal muscle stem cells derived from an individual with a hereditary muscle disease can be suitably used for pathological research of the hereditary muscle disease and drug discovery screening.
  • (B) is anti-MYH4 antibody
  • (C) is anti-MYH2 antibody
  • (D) is anti-MYH7 antibody
  • (E) is anti-MYH3 antibody
  • (F) is the result of immunostaining with anti-MYH8 antibody. .. It is a figure which shows the result of having measured the mRNA of the sarcoplasmic reticulum-related gene of each group of cells by quantitative PCR over time from the day (D0) to the 42nd day (D42) of skeletal muscle stem cell seeding, (A). Is the result of Casq1 and (B) is the result of Atp2a1.
  • Example 1 Cells in which differentiation was induced in the same procedure as in the TMGC / Agrin group of Example 1 (42 days after seeding of skeletal muscle stem cells (D42)) were immunostained with antimyosin heavy chain antibody, and the results observed with a fluorescent microscope were obtained.
  • (A) is the same combination of growth medium and differentiation medium as in Example 1 (“StemFit AK02N with 50 mU / L penicillin-50 ⁇ g / L streptomycin added” and “DMEM Low glucose with 1% N2 supplement”.
  • B is the result of the same growth medium and differentiation medium as in Non-Patent Document 1 (“IMDM containing 20% FBS and 1% Chick Embryo Extract” and “2% horse serum”.
  • the present invention provides a method for producing mature myotube cells from skeletal muscle stem cells, which comprises the following steps (hereinafter, referred to as “the production method of the present invention”).
  • the production method of the present invention comprises the following steps (hereinafter, referred to as “the production method of the present invention”).
  • (1) A step of seeding skeletal muscle stem cells in a cell culture vessel and culturing them using a growth medium.
  • the production method of the present invention may further include (4) confirming the aligned T-tube structure and / or the triad structure formed by the sarcoplasmic reticulum and the T-tube.
  • myotube cell means a cell in which mononuclear myoblasts are fused to become multinucleated.
  • mature myotube cells and “fully mature myotube cells” are synonymous, and at least one of an aligned T-tubule structure and a triplet structure formed by a sarcoplasmic reticulum and a T-tubule is confirmed.
  • skeletal muscle cell is a broad concept that includes cells of all skeletal muscle lineages, including skeletal muscle stem cells, myoblasts, myoblasts, mature myotube cells, and fully mature myotube cells. Including all of.
  • Skeletal muscle stem cells mean cells that have the ability to selectively differentiate into skeletal muscle cells and have both self-renewal ability and proliferative differentiation ability. Skeletal muscle stem cells in vivo usually reside between the basement membrane and plasma membrane of muscle fibers. Skeletal muscle stem cells can be identified by using the expression of a specific gene as an index. Marker genes for identifying skeletal muscle stem cells include Pax7, Hesr1, Hesr3, Myf5, CalcR, NGFR, ERBB3, CD56, CD82 and the like. Skeletal muscle stem cells include satellite cells.
  • the skeletal muscle stem cells used in the production method of the present invention may be skeletal muscle stem cells isolated from a living body, or may be skeletal muscle stem cells obtained by inducing differentiation from pluripotent stem cells. Further, the skeletal muscle stem cells used in the production method of the present invention may be human skeletal muscle stem cells or skeletal muscle stem cells of a non-human organism. Organisms other than humans are not particularly limited and may be, for example, mammals. Examples of mammals include monkeys, chimpanzees, dogs, cats, cows, horses, pigs, rabbits, mice, rats and the like. The method for isolating skeletal muscle stem cells (satellite cells) from a living body can be appropriately selected from known methods.
  • the method described in Hicks et al. (Nat Cell Biol. 2018 Jan; 20 (1): 46-57.) Can be mentioned.
  • the method for inducing differentiation of pluripotent stem cells to obtain skeletal muscle stem cells can be appropriately selected from known methods.
  • the method described in Patent Document 1 the method described in Hicks et al., And the like can be mentioned.
  • the skeletal muscle stem cells isolated from the living body may be skeletal muscle stem cells obtained by cryopreserving the skeletal muscle stem cells isolated from the living body, or may be skeletal muscle stem cells deposited in a depository institution such as a cell bank.
  • the skeletal muscle stem cells used in the production method of the present invention may be skeletal muscle stem cells derived from hereditary muscle disease or skeletal muscle stem cells obtained by inducing differentiation from pluripotent stem cells derived from individuals with hereditary muscle disease. ..
  • the skeletal muscle stem cells derived from hereditary muscle disease may be skeletal muscle stem cells obtained by cryopreserving skeletal muscle stem cells collected from an individual with hereditary muscle disease, or are skeletal muscle stem cells deposited in a depositary institution such as a cell bank. You may.
  • the individual with hereditary muscle disease may be a human, a non-human organism, or a non-human mammal.
  • Mature myotube cells produced from skeletal muscle stem cells derived from an individual with hereditary muscle disease exhibit a phenotype characteristic of the hereditary muscle disease, and are therefore suitable for pathological research of the hereditary muscle disease and drug discovery screening. Can be used for.
  • hereditary muscle diseases include muscular dystrophy, congenital myopathy, congenital myasthesis syndrome, myofibrillar myopathy, bordered vacuolar myopathy, and metabolic myopathy.
  • the pluripotent stem cells that can be used to obtain skeletal muscle stem cells may be stem cells that have pluripotency that can differentiate into all cells existing in the living body and also have proliferative ability.
  • stem cells that have pluripotency that can differentiate into all cells existing in the living body and also have proliferative ability.
  • embryonic stem (ES) cells embryonic stem (ntES) cells derived from cloned embryos obtained by nuclear transplantation
  • GS embryonic stem
  • EG embryonic reproductive
  • iPS induced pluripotent stem
  • Preferred pluripotent stem cells are ES cells, ntES cells, and iPS cells.
  • Embryonic stem cells ES cells are pluripotent and self-replicating stem cells established from the inner cell mass of early embryos (eg, blastocysts) of mammals such as humans and mice.
  • ES cells are embryo-derived stem cells derived from the inner cell mass of the blastocyst, which is the embryo after the morula at the 8-cell stage of the fertilized egg, and have the ability to differentiate into all the cells that make up the adult, so-called multi-differentiation. It has the ability and the ability to multiply by self-replication. ES cells were discovered in mice in 1981 (MJ Evans and MH Kaufman (1981), Nature 292: 154-156), and ES cell lines were subsequently established in primates such as humans and monkeys (JA Thomson et). al. (1998), Science 282: 1145-1147; JA Thomson et al. (1995), Proc. Natl. Acad. Sci.
  • ES cells can be established by removing the inner cell mass from the blastocyst of the fertilized egg of the target animal and culturing the inner cell mass on a fibroblast feeder.
  • a culture medium to which substances such as leukemia inhibitory factor (LIF) and basic fibroblast growth factor (bFGF) have been added. It can be carried out.
  • LIF leukemia inhibitory factor
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • DMEM / F supplemented with, for example, 0.1 mM 2-mercaptoethanol, 0.1 mM non-essential amino acid, 2 mM L-glutamic acid, 20% KSR (KnockOut Serum Replacement, Invitrogen) and 4 ng / ml bFGF as culture medium for ES cell production.
  • -12 Cultures can be used to maintain human ES cells in a moist atmosphere of 37 ° C, 2% CO 2 / 98% air (O. Fumitaka et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26). : 215-224).
  • ES cells should be passaged every 3-4 days, where passages are, for example, 0.25% trypsin and 0.1 mg / ml collagenase IV in PBS containing 1 mM CaCl 2 and 20% KSR. Can be done using.
  • ES cells can generally be selected by the Real-Time PCR method using the expression of gene markers such as alkaline phosphatase, Oct-3 / 4, and Nanog as an index.
  • gene markers such as alkaline phosphatase, Oct-3 / 4, and Nanog as an index.
  • the expression of genetic markers such as OCT-3 / 4, NANOG, and ECAD can be used as an index (E. Kroon et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26: 443. -452).
  • Human ES cell lines for example, WA01 (H1) and WA09 (H9), are obtained from the WiCell Research Institute, and KhES-1, KhES-2, and KhES-3 are obtained from the Institute for Frontier Medical Sciences, Kyoto University (Kyoto, Japan). It is possible.
  • sperm stem cells are testis-derived pluripotent stem cells, which are the origin cells for spermatogenesis. Similar to ES cells, these cells can induce differentiation into cells of various lineages, and have properties such as the ability to produce chimeric mice when transplanted into mouse blastocysts (M. Kanatsu-Shinohara et al. (M. Kanatsu-Shinohara et al.). 2003) Biol. Reprod., 69: 612-616; K. Shinohara et al. (2004), Cell, 119: 1001-1012).
  • GDNF glial cell line-derived neurotrophic factor
  • Embryonic germ cells are cells that are established from primordial germ cells in the embryonic period and have pluripotency similar to ES cells, such as LIF, bFGF, and stem cell factor. It can be established by culturing primordial germ cells in the presence of the substance of (Y. Matsui et al. (1992), Cell, 70: 841-847; JL Resnick et al. (1992), Nature, 359: 550. -551).
  • Induced pluripotent stem cells are almost equivalent to ES cells, which can be produced by introducing specific reprogramming factors into somatic cells in the form of DNA or protein. It is an artificial stem cell derived from a somatic cell having the characteristics of, for example, pluripotency for differentiation and proliferation ability by self-renewal (K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cell, 126: 663-676; K. Takahashi et al. (2007), Cell, 131: 861-872; J. Yu et al. (2007), Science, 318: 1917-1920; Nakagawa, M. et al., Nat. Biotechnol.
  • Reprogramming factors are genes that are specifically expressed in ES cells, their gene products or non-cording RNAs, or genes that play an important role in maintaining undifferentiated ES cells, their gene products or non-cording RNAs, or It may be composed of low molecular weight compounds. Genes contained in reprogramming factors include, for example, Oct3 / 4, Sox2, Sox1, Sox3, Sox15, Sox17, Klf4, Klf2, c-Myc, N-Myc, L-Myc, Nanog, Lin28, Fbx15, ERas, ECAT15.
  • Tcl1, beta-catenin, Lin28b, Sall1, Sall4, Esrrb, Nr5a2, Tbx3, Glis1, etc. are exemplified, and these reprogramming factors may be used alone or in combination.
  • the combinations of reprogramming factors include WO2007 / 069666, WO2008 / 118820, WO2009 / 007852, WO2009 / 032194, WO2009 / 058413, WO2009 / 057831, WO2009 / 075119, WO2009 / 079007, WO2009 / 091659, WO2009 / 101084, WO2009 / 101407, WO2009 / 102983, WO2009 / 114949, WO2009 / 117439, WO2009 / 126250, WO2009 / 126251, WO2009 / 126655, WO2009 / 157593, WO2010 / 009015, WO2010 / 033906, WO2010 / 033920, WO2010 / 042800, WO2010 / 050626, WO 2010/056831, WO2010 / 068955, WO2010 / 098419, WO2010/102267,
  • the reprogramming factors include histone deacetylase (HDAC) inhibitors [eg, small molecule inhibitors such as valproic acid (VPA), tricostatin A, sodium butyrate, MC 1293, M344, siRNA and shRNA for HDAC (eg).
  • HDAC histone deacetylase
  • HDAC1 siRNA Smartpool (Millipore), HuSH 29mer shRNA Constructs against HDAC1 (OriGene), etc.
  • MEK inhibitors eg PD184352, PD98059, U0126, SL327 and PD0325901
  • Glycogen synthesis kinase- 3 Against small molecule inhibitors such as Bio and CHIR99021, DNA methyltransferase inhibitors (eg 5-azacytidine), histone methyltransferase inhibitors (eg BIX-01294), Suv39hl, Suv39h2, SetDBl and G9a Nucleic acid expression inhibitors such as siRNA and shRNA), L-channel calcium agonist (eg Bayk8644), butyric acid, TGF ⁇ inhibitor or ALK5 inhibitor (eg LY364947, SB431542, 616453 and A-83-01), p53 inhibition Agents (eg siRNA and shRNA for p53), ARID3A inhibitors (eg siRNA
  • the reprogramming factor may be introduced into somatic cells by a method such as lipofection, fusion with a cell membrane penetrating peptide (for example, HIV-derived TAT and polyarginine), or microinjection.
  • a cell membrane penetrating peptide for example, HIV-derived TAT and polyarginine
  • DNA morphology in the case of DNA morphology, it can be introduced into somatic cells by methods such as viruses, plasmids, vectors such as artificial chromosomes, lipofection, liposomes, and microinjection.
  • Viral vectors include retroviral vectors and lentiviral vectors (above, Cell, 126, pp.663-676, 2006; Cell, 131, pp.861-872, 2007; Science, 318, pp.1917-1920, 2007. ), Adenovirus vector (Science, 322, 945-949, 2008), adeno-associated virus vector, Sendai virus vector (WO2010 / 008054) and the like.
  • the artificial chromosome vector for example, a human artificial chromosome (HAC), a yeast artificial chromosome (YAC), a bacterial artificial chromosome (BAC, PAC) and the like are included.
  • a plasmid a plasmid for mammalian cells can be used (Science, 322: 949-953, 2008).
  • the vector can contain regulatory sequences such as promoters, enhancers, ribosome binding sequences, terminators, polyadenylation sites, etc.
  • nuclear reprogramming substances can be expressed, and, if desired, drug resistance genes (for example, canamycin resistance gene, ampicillin resistance gene, puromycin resistance gene, etc.), thymidin kinase gene, diphtheriatoxin gene, and other selectable marker sequences, green fluorescent protein (GFP), ⁇ -glucuronidase (GUS), FLAG, and other reporter gene sequences.
  • drug resistance genes For example, canamycin resistance gene, ampicillin resistance gene, puromycin resistance gene, etc.
  • thymidin kinase gene diphtheriatoxin gene, and other selectable marker sequences
  • green fluorescent protein (GFP), ⁇ -glucuronidase (GUS), FLAG, and other reporter gene sequences can include.
  • the above vector has LoxP sequences before and after the gene encoding the reprogramming factor or the promoter and the gene encoding the reprogramming factor that binds to the promoter after introduction into somatic cells. You may.
  • RNA form it may be introduced into somatic cells by a method such as lipofection or microinjection, and in order to suppress degradation, RNA incorporating 5-methylcytidine and pseudouridine (TriLink Biotechnologies) is used. It may be (Warren L, (2010) Cell Stem Cell. 7: 618-630).
  • Cultures for iPS cell induction include, for example, DMEM, DMEM / F12 or DME cultures containing 10-15% FBS (these cultures also include LIF, penicillin / streptomycin, puromycin, L-glutamine). , Non-essential amino acids, ⁇ -mercaptoethanol, etc. can be appropriately contained.) Or mouse ES cell culture medium (TX-WES culture medium, Thrombo X), primate ES cell culture medium (primates) Commercial culture solutions such as ES / iPS cell culture medium, Reprocell), serum-free pluripotent stem cell maintenance medium (for example, mTeSR (Stemcell Technology), Essential 8 (Life Technologies), StemFit AK03 (AJINOMOTO)) Illustrated.
  • mTeSR StemTeSR
  • Essential 8 Life Technologies
  • StemFit AK03 AJINOMOTO
  • the somatic cells are brought into contact with the reprogramming factor on DMEM or DMEM / F12 culture medium containing 10% FBS and cultured for about 4 to 7 days. Then, the cells are re-seeded on feeder cells (for example, mitomycin C-treated STO cells, SNL cells, etc.), and about 10 days after contact between the somatic cells and the reprogramming factor, the cells are used in a culture medium for bFGF-containing primate ES cell culture. It can be cultured to give rise to iPS-like colonies about 30-about 45 days or more after the contact.
  • feeder cells for example, mitomycin C-treated STO cells, SNL cells, etc.
  • DMEM culture medium containing 10% FBS on feeder cells eg, mitomycin C-treated STO cells, SNL cells, etc.
  • feeder cells eg, mitomycin C-treated STO cells, SNL cells, etc.
  • LIF penicillin / streptomycin, etc.
  • ES-like colonies can be generated after about 25 to about 30 days or more.
  • feeder cells eg, mitomycin C-treated STO cells, SNL cells, etc.
  • the reprogrammed somatic cells themselves are used (Takahashi K, et al. (2009), PLoS One. 4: e8067 or WO2010 / 137746), or extracellular matrix (eg, Laminin-). 5 (WO2009 / 123349) and Matrigel (BD)) are exemplified.
  • iPS cells may be established under hypoxic conditions (oxygen concentration of 0.1% or more and 15% or less) (Yoshida Y, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5: 237. -241 or WO2010 / 013845).
  • somatic cells used for nuclear reprogramming is not limited, but ranges from about 5 ⁇ 10 3 to about 5 ⁇ 10 6 cells per 100 cm 2 culture dish.
  • the iPS cells can be selected according to the shape of the formed colonies.
  • a drug resistance gene expressed in conjunction with a gene expressed when somatic cells are reprogrammed for example, Oct3 / 4, Nanog
  • a culture medium containing the corresponding drug selection.
  • Established iPS cells can be selected by culturing in (culture solution).
  • iPS cells are selected by observing with a fluorescence microscope when the marker gene is a fluorescent protein gene, by adding a luminescent substrate when it is a luciferase gene, and by adding a chromogenic substrate when it is a luciferase gene. can do.
  • somatic cell refers to any animal cell (preferably a mammalian cell, including human) except germline cells such as eggs, oocytes, ES cells or totipotent cells.
  • Somatic cells include, but are not limited to, fetal (pup) somatic cells, neonatal (pup) somatic cells, and mature healthy or diseased somatic cells, as well as primary cultured cells. , Passed cells, and established cells are all included.
  • somatic cells include, for example, (1) tissue stem cells (somatic stem cells) such as nerve stem cells, hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, and dental pulp stem cells, (2) tissue precursor cells, (3) lymphocytes, and epithelium.
  • Endothelial cells muscle cells, fibroblasts (skin cells, etc.), hair cells, hepatocytes, gastric mucosal cells, intestinal cells, splenocytes, pancreatic cells (pancreatic exocrine cells, etc.), brain cells, lung cells, renal cells And differentiated cells such as fat cells are exemplified.
  • somatic cells having the same or substantially the same HLA genotype of the transplanted individual from the viewpoint of not causing rejection.
  • substantially the same means that the transplanted cells have the same HLA genotype to the extent that the immunosuppressant can suppress the immune response.
  • HLA-A and HLA-B It is a somatic cell having an HLA type in which 3 loci of HLA-DR or 4 loci plus HLA-C are matched.
  • ntES cells are cloned embryo-derived ES cells produced by nuclear transplantation technology and have almost the same characteristics as fertilized egg-derived ES cells.
  • ES cells established from the inner cell mass of blastocysts derived from cloned embryos obtained by replacing the nuclei of unfertilized eggs with the nuclei of somatic cells are ntES (nuclear transfer ES) cells.
  • ntES nuclear transfer ES
  • a combination of nuclear transplantation technology (JB Cibelli et al. (1998), Nature Biotechnol., 16: 642-646) and ES cell production technology (above) is used (Seika Wakayama). Et al. (2008), Experimental Medicine, Vol. 26, No. 5 (Special Edition), pp. 47-52).
  • somatic cell nuclei can be injected into unfertilized eggs of mammals and cultured for several hours to reprogram them.
  • Muse cells are pluripotent stem cells produced by the method described in WO 2011/007900, specifically, fibroblasts or bone marrow stromal cells treated with long-term trypsin, preferably 8 or 16 hours of trypsin. It is a pluripotent cell obtained by suspension culture after treatment, and is positive for SSEA-3 and CD105.
  • the cell culture vessel used in step (1) is not particularly limited as long as it is a culture vessel capable of adhesive culture of cultured cells.
  • a culture vessel capable of adhesive culture of cultured cells For example, flasks, tissue culture flasks, dishes, petri dishes, tissue culture dishes, multi-dish, microplates, microwell plates, multi-plates, multi-well plates, chamber slides, culture slides, petri dishes and the like can be mentioned.
  • a culture vessel having a surface treatment suitable for cell adhesion may be used.
  • the culture area of the cell culture vessel to be used is also not particularly limited, and for example, a 6-well plate, a 12-well plate, a 24-well plate, a 48-well plate, a 96-well plate, a 384-well plate, or the like can be used.
  • a cell culture vessel having a narrow culture space (96-well plate, 384-well plate, etc.) is used.
  • the cell culture container used in the step (1) may be a cell culture container having a surface treatment suitable for cell adhesion, or a cell culture container coated with an extracellular matrix component.
  • the extracellular matrix component include polylysine, polyornithin, collagen, proteoglycan, fibronectin, hyaluronic acid, tenascin, entactin, elastin, fibrillin, laminin, and fragments having cell adhesion activity thereof.
  • the extracellular matrix component may be a natural product or an artificial product (recombinant).
  • the extracellular matrix component may be a single component or a combination of a plurality of components.
  • the extracellular matrix component used for coating the cell culture vessel in the step (1) may be a component different from the extracellular matrix component layered on the cells in the step (3) described later, or may be the same component. Often, the components may be partially overlapping.
  • the coating concentration of the extracellular matrix component is not particularly limited as long as it does not adversely affect the proliferation of skeletal muscle stem cells.
  • it may be 0.1 ⁇ g / cm 2 to 100 ⁇ g / cm 2 , 0.5 ⁇ g / cm 2 to 50 ⁇ g / cm 2 , or 1 ⁇ g / cm 2 to 25 ⁇ g / cm 2 .
  • Commercially available cell culture vessels precoated with extracellular matrix components may be used.
  • the medium used in step (1) is not particularly limited as long as it is a medium suitable for the growth of skeletal muscle stem cells.
  • a known medium used for the proliferation of iPS cells and ES cells can be preferably used. Specifically, for example, StemFit (trade name) series (Ajinomoto) and the like can be mentioned.
  • the number of seeded cells of skeletal muscle stem cells is not particularly limited, and may be the number of seeded cells expected to be 100% confluent about 3 to 7 days after seeding, and 4 to 6 days after seeding. It may be the number of seeded cells expected to be 100% confluent. For example, when sowing in a 96-well plate, it may be 1 ⁇ 10 3 to 1 ⁇ 10 4 pieces / well, or 5 ⁇ 10 3 to 1 ⁇ 10 4 pieces / well.
  • the period of process (1) is not particularly limited. It may be a period until the cell confluence state reaches 70% or more, a period until it reaches 80% or more, a period until it reaches 90% or more, a period until it reaches 95% or more, 100. It may be a period until it reaches%.
  • the period of step (1) may be 10 days or less, 9 days or less, 8 days or less, 7 days or less, or 6 days or less. Further, the period of the step (1) may be 2 days or more, 3 days or more, 4 days or more, or 5 days or more.
  • the period of step (1) can be appropriately determined according to the combination of the number of seeded cells of skeletal muscle stem cells and the growth medium used.
  • step (2) the medium of skeletal muscle stem cells grown in step (1) is replaced with a differentiation medium.
  • the differentiation medium used in the step (2) can be selected from known media that can be used to induce differentiation of stem cells into skeletal muscle cells. For example, DMEM Low glucose, DMEM high glucose, IMEM, MEM, ⁇ MEM, GMEM, DMEM / Hams F-12, Hams F-12, RPMI-1640 and the like can be mentioned.
  • the differentiation medium used in step (2) preferably has a low serum content, and preferably has a serum content of less than 2%.
  • the serum content of the differentiation medium may be 1.5% or less, 1% or less, or 0.5% or less.
  • the differentiation medium used in step (2) may be a serum-free medium.
  • the serum-free differentiation medium may be a medium containing a serum-free supplement.
  • As the serum-free supplement a commercially available serum-free supplement or a known serum-free supplement can be preferably used. Specific examples thereof include N-2 supplements, B27 supplements, and KSR (KnockOut Serum Replacement). Preferably, it is an N-2 supplement.
  • the period of step (2) is until some cells exhibit a spindle-shaped morphology.
  • skeletal myoblasts are cultured in a differentiation medium, mononuclear myoblasts fuse into multinucleated myoblasts, but the myoblasts change from a round morphology to a spindle-shaped morphology and cell fusion begins.
  • culturing may be performed until the morphology of some cells changes to a spindle shape.
  • the appearance of spindle-shaped cells can be confirmed by microscopic observation.
  • the cells exhibiting a spindle-shaped morphology may be a very small number of cells, 5% or more of the total cells, 10% or more of the total cells, 20% or more of the total cells, or 30% of the total.
  • the above cells may be used, 40% or more of the cells may be used, or 50% or more of the cells may be used.
  • cell-fused polynuclear myotube cells may appear.
  • the period of step (2) may be 2 days or more, 3 days or more, 4 days or more, or 5 days or more.
  • the period of step (2) may be 10 days or less, 9 days or less, 8 days or less, 7 days or less, or 6 days or less.
  • step (3) a gel containing an extracellular matrix component is layered on cells, and culture is performed using a differentiation medium.
  • the extracellular matrix component layered on the cell may be a component different from the extracellular matrix component coated on the cell culture vessel in step (1), may be the same component, or may be a partially overlapping component. There may be.
  • the extracellular matrix component may include laminin or a laminin fragment.
  • Laminin is a heterotrimeric molecule consisting of three subunit chains, ⁇ chain, ⁇ chain and ⁇ chain. Five types of ⁇ chains are known, ⁇ 1 to ⁇ 5, three types of ⁇ chains are ⁇ 1 to ⁇ 3, and three types of ⁇ chains are ⁇ 1 to ⁇ 3. There are at least 12 types of isoforms in combination thereof.
  • the laminin contained in the extracellular matrix component layered on the cell in the step (3) may be laminin ⁇ 1 ⁇ 1 ⁇ 1 (hereinafter referred to as “laminin 111”), laminin 211, or laminin 411. It may be laminin 421, laminin 511, or laminin 521.
  • the laminin fragment may be a laminin E8 fragment.
  • the extracellular matrix component may contain collagen.
  • Collagen may be type IV collagen.
  • the extracellular matrix component may include laminin or laminin fragment and type IV collagen.
  • the extracellular matrix component may include laminin or laminin fragment, type IV collagen, and other basement membrane components. Other basement membrane components include entactin, heparan sulfate proteoglycan, and the like.
  • the extracellular matrix component may contain growth factors. Examples of growth factors include EGF, bFGF, NGF, PDGF, IGF-1, TGF- ⁇ and the like.
  • the extracellular matrix component may be an extract of Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma or Matrigel (trade name).
  • the extracellular matrix component is dispersed or dissolved in the base on which the gel is formed at the culture temperature and is layered on the cells.
  • the concentration of the extracellular matrix component may be 1 to 12 mg / mL, 1 to 10 mg / mL, or 1 to 9 mg / mL as the protein concentration in the gel containing the extracellular matrix component. It may be 1 to 8 mg / mL, 1 to 7 mg / mL, 1 to 6 mg / mL, 1 to 5 mg / mL, 1.5 to It may be 4 mg / mL.
  • Matrigel (trade name) is used as an extracellular matrix component
  • cryopreserved Matrigel (trade name) is thawed on ice or at 4 ° C.
  • the differentiation medium used in step (2) is used for about 2 to 5 times. Dilute to and layer on the cells from which the medium has been removed. Then, it may be incubated at 37 ° C. to gelate, and the differentiation medium may be added thereto.
  • the differentiation medium used in the step (3) may be the same medium as the differentiation medium used in the step (2) or a different medium, but a differentiation medium containing agrin is preferable.
  • a differentiation medium different from the differentiation medium used in the step (2) it is preferable to use a differentiation medium having a low serum content, which is the same as the differentiation medium in the step (2).
  • the serum content of the above or the serum-free supplement to be added is the same as that of the differentiation medium of the step (2).
  • Agrin is a type of proteoglycan heparan sulfate, which is a component of the basement membrane.
  • the agrin added to the differentiation medium in the step (3) may be a human agrin or an agrin of a non-human organism.
  • Organisms other than humans may be mammals. Examples of mammals include monkeys, chimpanzees, dogs, cats, cows, horses, pigs, rabbits, mice, rats and the like.
  • the amount of agrin added is not particularly limited, and may be added so that the final concentration is 1 to 1000 ng / mL, 10 to 750 ng / mL, or 20 to 500 ng / mL. It may be added so as to be 30 to 400 ng / mL, it may be added so as to be 40 to 300 ng / mL, and it may be added so as to be 50 to 200 ng / mL. You may.
  • step (3) it is preferable to exchange the medium at a frequency that keeps the concentration of the added agrin constant.
  • the medium may be changed once every three days, once every two days, or daily.
  • the period of step (3) is not particularly limited, but may be 1 month or longer, 2 months or longer, or 3 months or longer.
  • the present inventors have confirmed that long-term culture of 3 months or more is possible under the conditions of the examples described later.
  • step (4) it is confirmed that the mature myotube cells obtained in step (3) have an aligned T-tube structure and / or a triad structure formed by sarcoplasmic reticulum and T-tube. .. Confirmation of these structures can be performed by electron microscopy and / or immunostaining (immunofluorescence staining) (see Examples, FIGS. 2 and 7). Both electron microscopic observation and immunostaining (immunofluorescence staining) can be performed by known methods. Further, in step (4), it is preferable to confirm that the mature myotube cells obtained in step (3) have an aligned sarcomere structure. The aligned sarcomere structure can be performed by electron microscopy (Example, see FIG. 2).
  • the obtained myotube cell is recognized as a sufficiently mature myotube cell. Both structures are preferably observed, and more preferably aligned sarcomere structures are observed.
  • the present invention includes mature myotube cells obtained by the above-mentioned production method of the present invention.
  • the present invention provides a method for screening a candidate substance for a therapeutic agent for muscle disease using myotube cells produced from skeletal muscle stem cells derived from an individual with hereditary muscle disease.
  • the screening method of the present invention may include the following steps (1) to (3). (1) A step of producing mature myotube cells from skeletal muscle stem cells derived from an individual with a hereditary muscle disease by the production method of the present invention. (2) A test in which the test substance is brought into contact with the mature myotube cells produced in step (1), and (3) a test in which the pathological condition of the mature myotube cells is alleviated as compared with the case where the test substance is not contacted. The process of selecting a substance
  • step (1) mature myotube cells are produced from skeletal muscle stem cells derived from an individual with hereditary muscle disease by the production method of the present invention. Step (1) can be carried out according to the above description of the production method of the present invention.
  • test substance is brought into contact with the mature myotube cells produced in step (1).
  • the test substance is not particularly limited, and for example, natural compounds, organic compounds, inorganic compounds, nucleic acid oligos, proteins, polypeptides, peptides, cell extracts, cell culture supernatants, fermented microbial products, marine organism extracts, plant extracts. , Proto-nuclear cell extract, eukaryotic single cell extract, animal cell extract and the like. Further, the expression products of the compound library, the nucleic acid oligo library, the polypeptide library, and the gene library may be used as the test substance.
  • the test substance can be labeled and used as needed. Examples of the label include a radial label, a fluorescent label and the like.
  • the method of contacting the mature myotube cells with the test substance is not particularly limited, and examples thereof include a method of adding the test substance to the medium of the mature myotube cells produced in step (1).
  • the contact period between the mature myotube cells and the test substance and the subsequent culture period are not particularly limited, and can be appropriately set according to the evaluation criteria for selecting the target test substance.
  • step (3) a test substance that alleviates the pathological condition of myotube cells is selected as compared with the case where the test substance is not brought into contact with the test substance.
  • the mature myotubular cells derived from the disease are larger in size than the mature myotubular cells derived from healthy subjects. Due to its small size, a test substance that has the effect of increasing the size of mature myotubular cells when in contact with the test substance is selected.
  • the size of mature myotube cells can be evaluated by microscopic observation or the like.
  • the mature myotube cells derived from the disease may have a phenotype of delayed membrane repair, so they were brought into contact with the test substance. Occasionally, a test substance that has the effect of improving the delay in membrane repair may be selected.
  • membrane fragility may be observed in the mature myotube cells derived from the disease, and therefore, when contacted with a test substance, A test substance that has the effect of improving the brittleness of the membrane can be selected.
  • mature myotube cells derived from the disease may have pathological conditions such as mitochondrial damage due to excessive influx of calcium ions into the cytoplasm, increased oxidative stress, and increased inflammatory cytokines. At that time, a test substance having an action of improving these pathological conditions can be selected.
  • the mature myotube cells derived from the disease are more than the mature myotube cells derived from healthy subjects. Since the maturation rate can be slowed down, a test substance having the effect of improving the maturation rate of myotube cells when contacted with the test substance can be selected. The improvement in the maturation of myotube cells can be evaluated by measuring the expression level of a marker that reflects the maturation stage.
  • pathological conditions such as lysosomal dysfunction and mitochondrial disorders can be observed in the mature myotube cells derived from the disease.
  • a test substance having an action of improving these pathological conditions can be selected.
  • the mature myotube cells derived from the disease include DUX4 expression-dependent cell death. Since the pathological condition of the above can be observed, a test substance having an action of suppressing DUX4 expression-dependent cell death when contacted with the test substance can be selected.
  • maturation disorders due to splicing abnormalities can be observed in the mature myotube cells derived from the disease.
  • a test substance that has the effect of improving maturation disorders due to splicing abnormalities can be selected.
  • a test substance having an action of improving these pathological conditions can be selected when contacted with the test substances.
  • test substance having an action of improving these pathological conditions when contacted with the test substance can be selected.
  • morphological abnormalities of the nucleus may be observed in the mature myotube cells derived from the disease, and therefore, when contacted with the test substance, the nuclei A test substance having an action of improving morphological abnormality can be selected.
  • pathological conditions such as accumulation of nemarine bodies and lysosomal dysfunction can be observed in the mature myotube cells derived from the disease.
  • a test substance having an action of improving these pathological conditions can be selected.
  • the mature myotube cells derived from the disease have pathological conditions such as abnormal sugar chain modification of ⁇ -dystroglycan and maturation disorder. Therefore, a test substance having an action of improving these pathological conditions when contacted with the test substance can be selected.
  • the process from the undifferentiated state to the mature myotube cells can be reproduced in vitro. Therefore, even for hereditary myopathies other than the above, markers at each maturation stage can be reproduced.
  • the screening method of the present invention can be applied using the above as an index.
  • Example 1 Production of mature myotube cells from human iPS cell-derived skeletal muscle stem cells
  • 1. Experimental Materials and Methods
  • Pluripotent Stem Cells Human iPS cells (201B7) were donated by Professor Yamanaka of Kyoto University and cultured by conventional methods (Takahashi K, et al. Cell. 131: 861- 72, 2007).
  • Pax7-venus iPSCs was prepared.
  • iPS cells Prior to differentiation induction into skeletal muscle progenitor cells, human iPS cells (Pax7-venus iPSCs) were subjected to low-density culture on a culture vessel coated with Matrigel (100-fold dilution). Specifically, feeder-free cultured human Pax7-venus iPS cells were washed twice with PBS and then incubated at 37 ° C. for 10 minutes using 500 ⁇ L of cutase. Subsequently, 1.5 mL of medium was added and dissociated into single cells by pipetting, and the cells were collected in a 15 mL tube.
  • the succession was carried out by the following method. After aspirating the medium and washing twice with PBS, 500 ⁇ L accutase was added and incubated at 37 ° C. for 5 minutes. Subsequently, 2.5 mL of CDMi basal medium was added and pipetting was performed to dissociate the cells into single cells. After centrifugation at 900 rpm for 5 minutes at 4 ° C., the supernatant was removed and resuspended in CDMi basal medium. Then, the number of cells was counted.
  • CDMi basal medium supplemented with 10 ⁇ M SB431542, 5 ⁇ M CHIR99021 and 10 ⁇ M Y-27632 (Nacalai Tesque), and 4 ⁇ 10 5 cells per well were seeded on a 6-well plate coated with Matrigel.
  • Medium exchange was performed on CDMi basal medium supplemented with 10 ⁇ M SB431542 and 5 ⁇ M CHIR99021 on the 8th day (Day8), 10th day (Day10), and 12th day (Day12).
  • TMGC / agrin group 100 ⁇ L / well of medium containing agrin (final concentration 100 ng / mL) was added.
  • TMGC group a group in which Matrigel was layered and 100 ⁇ L / well of agrin-free medium was added
  • control group a group in which Matrigel was not layered and 100 ⁇ L / well of agrin-free medium was added.
  • Medium was changed every other day. When changing the medium, the medium was changed by 50 ⁇ L, and in the TMGC / agrin group, the agrin concentration was maintained during the culture period.
  • MYH3 F gcagattgagctggaaagg (SEQ ID NO: 1) MYH3 R; tcagctgctcgatctcttca (SEQ ID NO: 2) MYH4 F; tgcaatgaagactctggctttc (SEQ ID NO: 3) MYH4 R; tttttgccacctttcttttcca (SEQ ID NO: 4) MYH8 F; atttccaccaagaaccca (SEQ ID NO: 5) MYH8 R; aaggattctgcctctgg (SEQ ID NO: 6) Casq1 F; atggcgagttttctgctgac (SEQ ID NO: 7) Casq1 R; ctgcagctctcgttcacctt (SEQ ID NO: 8) Atp2a1 F; ctgtgtggc
  • Primary antibodies include anti-myosin heavy chain (MHC) antibody (MF20, R & D Systems, 1: 800), anti-DHPR ⁇ (dihydropyridine receptor ⁇ ) antibody (MA3-920, Thermofisher scientific, 1: 200), anti-MYH1 / 2 ( FAST) antibody (abcam ab51263 1: 100), anti-MYH4 (FAST) antibody (DSHB BF-F3 1: 100), anti-MYH2 (FAST) antibody (Millipore MABT840 1: 100), anti-MYH7 (SLOW) antibody (Santacruz sc) -53089 1:200), anti-MYH3 (embryonic) antibody (Sigma HPA021808), anti-MYH8 (neonatal) antibody (Novus NBP2-41309) were used.
  • MHC myosin heavy chain
  • MA3-920 anti-920, Thermofisher scientific, 1: 200
  • the primary antibody reaction the primary antibody diluted with a diluent (10% Blocking One in PBS-T) was reacted overnight. After the primary antibody reaction, 10 minutes of washing with PBS-T was performed 3 times, and the secondary antibody reaction was carried out at room temperature for 1 hour. Alexa Fluor 488-labeled anti-mouse IgG (1: 500) was used as the secondary antibody. Washing was performed twice with PBS-T for 5 minutes, and then nuclear staining was performed with DAPI. Observation and photography were performed with the Olympus FLUOVIEW FV1000.
  • Optical micrograph observation Figure 1 shows typical optical micrographs of cells in each group in D30.
  • (A) is a control group
  • (B) is a TMGC group
  • (C) is a TMGC / agrin group.
  • the scale bar is 200 ⁇ m.
  • TMGC / Agrin group and the TMGC group extremely thick myotube cells were scattered as compared with the control group, and it was observed that the myotube cells themselves were fused.
  • FIG. (3-2) Immunostaining of myosin heavy chain subtype D42 cells of the TMGC / agrin group were subjected to immunostaining and observed with a fluorescence microscope. The results are shown in FIG. (A) is an anti-MYH1 / 2 antibody, (B) is an anti-MYH4 antibody, (C) is an anti-MYH2 antibody, (D) is an anti-MYH7 antibody, (E) is an anti-MYH3 antibody, and (F) is an anti-MYH8 antibody. This is the result of immunostaining. It was shown that all markers of fetal type (MYH3), neonatal type (MYH8), slow muscle type (MYH7), and fast muscle type (MYH1 / 2, MYH4, MYH2) were expressed.
  • MYH3 fetal type
  • MYH8 slow muscle type
  • the sarcoplasmic reticulum is one of the components of the triad structure, and there are various channels related to calcium homeostasis.
  • the mRNA expression over time of Casq1 which senses calcium potential and Atp2a1 which is responsible for calcium release from sarcoplasmic reticulum was analyzed by quantitative PCR.
  • the results are shown in FIG. (A) is the result of Casq1 and (B) is the result of Atp2a1.
  • the expression of both Casq1 and Atp2a1 was increased over time, but the TMGC group and TMGC / agrin group showed a remarkable increase in expression as compared with the control group. From this result, it was shown that the TMGC group and the TMGC / agrin group were more mature than the control group.
  • T-tubule-related genes Muscle cells existing in the living body contract under the command of nerves. For this purpose, the existence of a T-tubule that transmits commands from nerves is necessary. It is known that DHPR ⁇ , DHPR ⁇ , and DHPR ⁇ are present in the channels expressed in the T-tubule. Therefore, the mRNA expression of these genes over time was analyzed by quantitative PCR. The results are shown in FIG. (A) is the result of DHPR ⁇ , (B) is the result of DHPR ⁇ , and (C) is the result of DHPR ⁇ .
  • T-tubes are aligned in the most mature form of myotube cells found in adults, and such "aligned T-tubes" are myotube cells produced by the production method of the present invention. But I verified whether it was accepted. Since the production method of the present invention enables long-term culture for 3 months or longer, D75 cells were subjected to immunostaining with an anti-DHPR ⁇ antibody and observed with a fluorescence microscope. The results are shown in FIG. The two lines in the figure indicate that the T-tubule structures that conduct contractile stimuli are arranged side by side in the myotube cells. The scale bar is 50 ⁇ m. From this result, it became clear that the cells of D75 are fully mature myotube cells with aligned T-tubules. Furthermore, the present inventors have confirmed that cells around D30 spontaneously contract without electrical stimulation, and have taken a moving image.
  • Non-Patent Document 1 discloses that a medium supplemented with a layer of Matrigel and agrin is used in order to mature myotube cells induced to differentiate from mouse myoblasts, but Non-Patent Document 1 discloses. Unlike the medium used in Example 1 above, IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Media, glucose content: 4.5 g / L) containing 20% FBS and 1% Chick Embryo Extract was used as the growth medium, and 2% horses were used as the differentiation medium. I am using IMDM containing serum. Therefore, it was examined whether the same result as in Example 1 could be obtained when the medium used in Non-Patent Document 1 was applied to the production method of the present invention.
  • IMDM Iscove's Modified Dulbecco's Media, glucose content: 4.5 g / L
  • Example 1 1. Experimental Materials and Methods Differentiation was induced using the Matrigel layer and Agrin-added medium by the methods described in "Experimental Materials and Methods" (1) to (5) of Example 1 (TMGC / Agrin group).
  • the medium used in (4) and (5) the case where the same medium combination as in Example 1 was used and the case where the same medium combination as in Non-Patent Document 1 was used were compared.
  • the same medium combinations as in Example 1 include (4) "StemFit AK02N with 50 mU / L penicillin-50 ⁇ g / L streptomycin” and (5) "DMEM Low glucose with 1% N2 supplement”.
  • the combination of the same medium as that of Non-Patent Document 1 is (4) "IMDM containing 20% FBS and 1% Chick Embryo Extract” and (5) "IMDM containing 2% horse serum”. is there.
  • Example 1 The day when the skeletal muscle stem cells of (4) of “Experimental Materials and Methods” of Example 1 were seeded was set to D0, and the cells of D42 were subjected to immunostaining and observed with a fluorescence microscope.
  • An anti-myosin heavy chain (MHC) antibody (MF20, R & D Systems, 1: 800) was used as the primary antibody, and immunostaining was performed in the same manner as in (6) and (6-4) of "Experimental Materials and Methods" of Example 1. Was done.
  • MHC myosin heavy chain
  • Example 3 Production of mature myotube cells from different human iPS cell-derived skeletal muscle stem cells
  • human iPS cells the strain Ff-WJ14-s01 established by the iPS cell stock for regenerative medicine was used, and the base sequence of venus to the 5'side of the start codon of the Pax7 locus of human iPS cells was the same as in Example 1.
  • iPS cell line Ff-WJ14-s01-Pax7-venus
  • Skeletal muscle stem cells were induced to differentiate from human iPS cells in the same manner as in Example 1 except that the Ff-WJ14-s01-Pax7-venus strain was used as human iPS cells, and the obtained skeletal muscle stem cells became myotube cells. Differentiation was induced.
  • FIG. 1 A typical electron micrograph of the TMGC / agrin group in D30 is shown in FIG. In both (A) and (B), a structure recognized as a triad structure was observed. Even when skeletal muscle stem cells derived from different human iPS cells were used, the morphology of mature myotube cells was confirmed at D30, indicating that the production method of the present invention is highly reproducible.

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Abstract

（１）細胞培養容器に骨格筋幹細胞を播種し、増殖培地を用いて培養する工程、（２）培地を分化培地に交換し、一部の細胞が紡錘状の形態を呈するまで培養する工程、および（３）細胞に細胞外マトリックス成分を含むゲルを重層し、分化培地を用いて培養を行う工程を含むことを特徴とする、骨格筋幹細胞から成熟筋管細胞を製造する方法。

Description

骨格筋幹細胞から成熟筋管細胞を製造する方法
　本発明は、骨格筋幹細胞から成熟筋管細胞を製造する方法に関するものである。
　成熟した筋管細胞では、整列したサルコメア構造、整列したＴ管構造、筋小胞体とＴ管により形成される３つ組構造が観察されることが知られている。一方、筋疾患の中には、先天的に３つ組構造の形成不全を起こす筋疾患や、Ｔ管の整列不全を起こす疾患が存在する。例えば、Ｘ連鎖性ミオチュブラーミオパチーは、ＭＴＭ１遺伝子の変異が原因の、重度の筋力低下を伴う先天性ミオパチーであり、Ｔ管の整列不全を伴うことが知られている。３つ組構造や整列したＴ管構造の異常の有無は、これらの構造が形成される過程にある未熟な筋管細胞では判断することが難しく、十分に成熟した筋管細胞において、構造異常の有無を観察する必要がある。したがって、十分に成熟した筋管細胞を製造することができれば、３つ組構造や整列したＴ管構造の異常を有する疾患の病態評価や、創薬スクリーニングを行うことができるようになると考えられる。
　本発明者らは、これまでに、ヒトｉＰＳ細胞から骨格筋幹細胞を誘導することに成功している（特許文献１）。また、直近の研究では、ヒトｉＰＳ細胞から分化誘導して得られた筋管細胞においてサルコメア構造の整列は観察されたが、３つ組構造およびＴ管の整列は認められなかった。多能性幹細胞から整列したＴ管構造を有する筋管細胞を作製したことは、未だ報告されていない。
　非特許文献１には、マウス初代筋芽細胞を分化誘導して成熟した筋管細胞を得るために、マウス初代筋芽細胞にマトリゲルを重層し、アグリンを添加した分化培地を使用したことが記載されている。
国際公開WO2016/108288 A1
EMBO Molecular Medicine (2014)　6,　1455-1475
　本発明は、十分成熟した筋管細胞を、骨格筋幹細胞から製造する方法を提供することを課題とする。
　本発明は、上記の課題を解決するために以下の各発明を包含する。
［１］骨格筋幹細胞から成熟筋管細胞を製造する方法であって、
（１）細胞培養容器に骨格筋幹細胞を播種し、増殖培地を用いて培養する工程、
（２）培地を分化培地に交換し、一部の細胞が紡錘状の形態を呈するまで培養する工程、および
（３）細胞に細胞外マトリックス成分を含むゲルを重層し、分化培地を用いて培養を行う工程、を含むことを特徴とする方法。
［２］分化培地が、２％未満の血清または無血清サプリメントを含有する培地である、前記［１］に記載の方法。
［３］工程（３）の分化培地が、アグリンを含有する培地である、前記［２］に記載の方法。
［４］分化培地中のアグリン濃度が１０～１０００ｎｇ／ｍＬである、前記［３］に記載の方法。
［５］工程（１）において、細胞培養容器が、細胞外マトリックス成分をコーティングした細胞培養容器である、前記［１］～［４］のいずれかに記載の方法。
［６］工程（１）において、細胞が８０％以上コンフルエントの状態になるまで増殖させる、前記［１］～［５］のいずれかに記載の方法。
［７］工程（３）において、細胞に重層する細胞外マトリックス成分を含むゲルのタンパク質濃度が１～１２ｍｇ／ｍＬである、前記［１］～［６］のいずれかに記載の方法。
［８］細胞外マトリックス成分がラミニンを含む、前記［１］～［７］のいずれかに記載の方法。
［９］細胞外マトリックス成分がコラーゲンを含む、前記［１］～［８］のいずれかに記載の方法。
［１０］工程（３）の培養期間が２か月以上である、前記［１］～［９］のいずれかに記載の方法。
［１１］さらに、（４）整列したＴ管構造、および／または、筋小胞体とＴ管により形成される３つ組構造を確認する工程を含む、前記［１］～［１０］のいずれかに記載の方法。
［１２］骨格筋幹細胞が、多能性幹細胞から分化誘導して得られた骨格筋幹細胞である、前記［１］～［１１］のいずれかに記載の方法。
［１３］骨格筋幹細胞が、遺伝性筋疾患個体由来の骨格筋幹細胞または遺伝性筋疾患個体由来の多能性幹細胞から分化誘導して得られた骨格筋幹細胞である、前記［１］～［１１］のいずれかに記載の方法。
［１４］前記［１］～［１３］のいずれかに記載の方法により得られた成熟筋管細胞。
［１５］筋疾患治療薬の候補物質をスクリーニングする方法であって、
（１）前記［１３］に記載の方法により成熟筋管細胞を製造する工程、
（２）工程（１）で製造された成熟筋管細胞に被験物質を接触させる工程、および
（３）被験物質を接触させなかった場合と比較して、成熟筋管細胞の病態を緩和する被験物質を選択する工程
を含むスクリーニング方法。
　本発明の製造方法により、骨格筋幹細胞から出発して、十分成熟した筋管細胞を効率よく製造することができる。本発明の製造方法により製造された成熟筋管細胞は、整列したＴ管構造および筋小胞体とＴ管により形成される３つ組構造を有する筋管細胞である。本発明の製造方法により、遺伝性筋疾患個体由来の骨格筋幹細胞から製造された成熟筋管細胞は、当該遺伝性筋疾患の病態研究や、創薬スクリーニングに好適に使用することができる。
骨格筋幹細胞の播種から30日目（D30）における各群の細胞を光学顕微鏡で観察した結果を示す図であり、（Ａ）がコントロール群、（Ｂ）がTMGC（thick matrigel coating）群、（Ｃ）がTMGC/アグリン群である。スケールバーは200μmである。 骨格筋幹細胞の播種から30日目（D30）におけるTMGC/アグリン群の細胞を電子顕微鏡で観察した結果を示す図であり、（Ａ）は整列したサルコメア構造を示し、（Ｂ）は筋小胞体とＴ管により形成される３つ組構造を示す。 骨格筋幹細胞の播種した日（D0）から42日目（D42）まで、経時的に各群の細胞のミオシン重鎖サブタイプのmRNAを定量PCRで測定した結果を示す図であり、（Ａ）がMYH3、（Ｂ）がMYH8、（Ｃ）がMYH4、（Ｄ）がMYH7の結果である。 骨格筋幹細胞の播種から42日目（D42）におけるTMGC/アグリン群の細胞を免疫染色し、ミオシン重鎖サブタイプの発現を蛍光顕微鏡で観察した結果を示す図であり、（Ａ）は抗MYH1/2抗体、（Ｂ）は抗MYH4抗体、（Ｃ）は抗MYH2抗体、（Ｄ）は抗MYH7抗体、（Ｅ）は抗MYH3抗体、（Ｆ）は抗MYH8抗体で免疫染色した結果である。 骨格筋幹細胞の播種した日（D0）から42日目（D42）まで、経時的に各群の細胞の筋小胞体関連遺伝子のmRNAを定量PCRで測定した結果を示す図であり、（Ａ）がCasq1、（Ｂ）がAtp2a1の結果である。 骨格筋幹細胞の播種した日（D0）から42日目（D42）まで、経時的に各群の細胞のＴ管関連遺伝子のmRNAを定量PCRで測定した結果を示す図であり、（Ａ）がDHPRα、（Ｂ）がDHPRβ、（Ｃ）がDHPRγの結果である。 骨格筋幹細胞の播種から30日目（D30）におけるTMGC/アグリン群の細胞を抗DHPRα抗体で免疫染色し、蛍光顕微鏡で観察した結果を示す図である。スケールバーは50μmである。 実施例１のTMGC/アグリン群と同じ手順で分化誘導を行った細胞（骨格筋幹細胞の播種から42日目（D42））を抗ミオシン重鎖抗体で免疫染色し、蛍光顕微鏡で観察した結果を示す図であり、（Ａ）が実施例１と同じ増殖培地および分化培地の組み合わせ（「StemFit AK02Nに50mU/L ペニシリン-50μg/L ストレプトマイシンを加えた培地」と「DMEM Low glucoseに1％ N2サプリメントを添加した培地」）の結果であり、（Ｂ）が非特許文献１と同じ増殖培地および分化培地の組み合わせ（「20％FBSおよび1％Chick Embryo Extractを含むIMDM」と「2％馬血清を含有するIMDM」）の結果である。 ヒトiPS細胞Ff-WJ14-s01-Pax7-venus株由来骨格筋幹細胞の播種から30日目（D30）におけるTMGC/アグリン群の細胞を電子顕微鏡で観察した結果を示す図であり、（Ａ）および（Ｂ）ともに、筋小胞体とＴ管により形成される３つ組構造を示す。
〔成熟筋管細胞の製造方法〕
　本発明は、次の工程を含む骨格筋幹細胞から成熟筋管細胞を製造する方法（以下、「本発明の製造方法」と記す）を提供する。
（１）細胞培養容器に骨格筋幹細胞を播種し、増殖培地を用いて培養する工程、
（２）培地を分化培地に交換し、一部の細胞が紡錘状の形態を呈するまで培養する工程、および
（３）細胞に細胞外マトリックス成分を含むゲルを重層し、分化培地を用いて培養を行う工程。
　本発明の製造方法は、さらに（４）整列したＴ管構造、および／または、筋小胞体とＴ管により形成される３つ組構造を確認する工程を含むものであってもよい。
　本明細書において、「筋管細胞」は単核の筋芽細胞が細胞融合して多核になった細胞を意味する。本明細書において、「成熟筋管細胞」と「十分成熟した筋管細胞」は同義であり、整列したＴ管構造および筋小胞体とＴ管により形成される３つ組構造の少なくとも1つが確認された筋管細胞を意味する。本明細書において、「骨格筋細胞」は、全ての骨格筋系譜の細胞を含む広義の概念であり、骨格筋幹細胞、筋芽細胞、筋管細胞、成熟筋管細胞、十分成熟した筋管細胞の全てを含む。
　骨格筋幹細胞は、骨格筋細胞へ選択的に分化し得る能力を有し、自己複製能と増殖分化能を併せ持つ細胞を意味する。生体内の骨格筋幹細胞は、通常、筋線維の基底膜と形質膜の間に存在する。骨格筋幹細胞は、特定の遺伝子の発現を指標に特定することができる。骨格筋幹細胞を特定するためのマーカー遺伝子として、Pax7、Hesr1、Hesr3、Myf5、CalcR、NGFR、ERBB3、CD56、CD82などが挙げられる。骨格筋幹細胞には、サテライト細胞が含まれる。
　本発明の製造方法で使用する骨格筋幹細胞は、生体から単離した骨格筋幹細胞であってもよく、多能性幹細胞から分化誘導して取得した骨格筋幹細胞であってもよい。また、本発明の製造方法で使用する骨格筋幹細胞は、ヒトの骨格筋幹細胞でもよく、ヒト以外の生物の骨格筋幹細胞でもよい。ヒト以外の生物は特に限定されず、例えば、哺乳動物であってもよい。哺乳動物としては、例えば、サル、チンパンジー、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、ウサギ、マウス、ラット等が挙げられる。生体から骨格筋幹細胞（サテライト細胞）を単離する方法は、公知の方法から適宜選択することができる。例えば、Hicksら（Nat Cell Biol. 2018 Jan;20(1):46-57.）に記載の方法などが挙げられる。多能性幹細胞を分化誘導して骨格筋幹細胞を取得する方法は、公知の方法から適宜選択することができる。例えば、特許文献１に記載の方法、上記Hicksらに記載の方法などが挙げられる。生体から単離した骨格筋幹細胞は、生体から単離した骨格筋幹細胞を凍結保存した骨格筋幹細胞であってもよく、細胞バンク等の寄託機関に寄託された骨格筋幹細胞であってもよい。
　本発明の製造方法で使用する骨格筋幹細胞は、遺伝性筋疾患由来の骨格筋幹細胞または遺伝性筋疾患個体由来の多能性幹細胞から分化誘導して得られた骨格筋幹細胞であってもよい。遺伝性筋疾患由来の骨格筋幹細胞は、遺伝性筋疾患個体から採取した骨格筋幹細胞を凍結保存した骨格筋幹細胞であってもよく、細胞バンク等の寄託機関に寄託された骨格筋幹細胞であってもよい。遺伝性筋疾患個体はヒトであってよく、ヒト以外の生物であってもよく、ヒト以外の哺乳動物であってもよい。遺伝性筋疾患個体由来の骨格筋幹細胞から作製される成熟筋管細胞は、当該遺伝性筋疾患に特徴的な表現型を示すので、当該遺伝性筋疾患の病態研究や、創薬スクリーニングに好適に使用することができる。
　遺伝性筋疾患としては、例えば、筋ジストロフィー、先天性ミオパチー、先天性筋無力症候群、筋原線維性ミオパチー、縁取り空胞性ミオパチー、代謝性ミオパチーなどが挙げられる。
　骨格筋幹細胞を取得するために使用可能な多能性幹細胞は、生体に存在するすべての細胞に分化可能である多能性を有し、かつ、増殖能をも併せもつ幹細胞であればよく、特に限定されない。例えば胚性幹(ES)細胞、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹(ntES)細胞、精子幹(GS)細胞、胚性生殖(EG)細胞、人工多能性幹(iPS)細胞、培養線維芽細胞や骨髄幹細胞由来の多能性細胞（Muse細胞）などが含まれる。好ましい多能性幹細胞は、ES細胞、ntES細胞、およびiPS細胞である。
(A) 胚性幹細胞
　ES細胞は、ヒトやマウスなどの哺乳動物の初期胚（例えば胚盤胞）の内部細胞塊から樹立された、多能性と自己複製による増殖能を有する幹細胞である。
　ES細胞は、受精卵の8細胞期、桑実胚後の胚である胚盤胞の内部細胞塊に由来する胚由来の幹細胞であり、成体を構成するあらゆる細胞に分化する能力、いわゆる分化多能性と、自己複製による増殖能とを有している。ES細胞は、マウスで1981年に発見され (M.J. Evans and M.H. Kaufman (1981), Nature 292:154-156)、その後、ヒト、サルなどの霊長類でもES細胞株が樹立された (J.A. Thomson et al. (1998), Science 282:1145-1147; J.A. Thomson et al. (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:7844-7848;J.A. Thomson et al. (1996), Biol. Reprod., 55:254-259; J.A. Thomson and V.S. Marshall (1998), Curr. Top. Dev. Biol., 38:133-165)。
　ES細胞は、対象動物の受精卵の胚盤胞から内部細胞塊を取出し、内部細胞塊を線維芽細胞のフィーダー上で培養することによって樹立することができる。また、継代培養による細胞の維持は、白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor (LIF))、塩基性線維芽細胞成長因子(basic fibroblast growth factor (bFGF))などの物質を添加した培養液を用いて行うことができる。ヒトおよびサルのES細胞の樹立と維持の方法については、例えばUSP5,843,780; Thomson JA, et al. (1995), Proc Natl. Acad. Sci. U S A. 92:7844-7848； Thomson JA, et al. (1998), Science. 282:1145-1147； H. Suemori et al. (2006), Biochem. Biophys. Res. Commun., 345:926-932； M. Ueno et al. (2006), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:9554-9559； H. Suemori et al. (2001), Dev. Dyn., 222:273-279;H. Kawasaki et al. (2002), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:1580-1585；Klimanskaya I, et al. (2006), Nature. 444:481-485などに記載されている。
　ES細胞作製のための培養液として、例えば0.1mM 2-メルカプトエタノール、0.1mM 非必須アミノ酸、2mM L-グルタミン酸、20% KSR（KnockOut Serum Replacement, Invitrogen）および4ng/ml bFGFを補充したDMEM/F-12培養液を使用し、37℃、2% CO2/98% 空気の湿潤雰囲気下でヒトES細胞を維持することができる(O. Fumitaka et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26:215-224)。また、ES細胞は、3～4日おきに継代する必要があり、このとき、継代は、例えば1mM CaCl2および20% KSRを含有するPBS中の0.25% トリプシンおよび0.1mg/mlコラゲナーゼIVを用いて行うことができる。
　ES細胞の選択は、一般に、アルカリホスファターゼ、Oct-3/4、Nanogなどの遺伝子マーカーの発現を指標にしてReal-Time PCR法で行うことができる。特に、ヒトES細胞の選択では、OCT-3/4、NANOG、ECADなどの遺伝子マーカーの発現を指標とすることができる(E. Kroon et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26:443-452)。
　ヒトES細胞株は、例えばWA01(H1)およびWA09(H9)は、WiCell Reserch Instituteから、KhES-1、KhES-2およびKhES-3は、京都大学再生医科学研究所(京都、日本)から入手可能である。
(B) 精子幹細胞
　精子幹細胞は、精巣由来の多能性幹細胞であり、精子形成のための起源となる細胞である。この細胞は、ES細胞と同様に、種々の系列の細胞に分化誘導可能であり、例えばマウス胚盤胞に移植するとキメラマウスを作出できるなどの性質をもつ(M. Kanatsu-Shinohara et al. (2003) Biol. Reprod., 69:612-616; K. Shinohara et al. (2004), Cell, 119:1001-1012)。神経膠細胞系由来神経栄養因子(glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF))を含む培養液で自己複製可能であるし、またES細胞と同様の培養条件下で継代を繰り返すことによって、精子幹細胞を得ることができる(竹林正則ら(2008),実験医学,26巻,5号(増刊),41～46頁,羊土社(東京、日本))。
(C) 胚性生殖細胞
　胚性生殖細胞は、胎生期の始原生殖細胞から樹立される、ES細胞と同様な多能性をもつ細胞であり、LIF、bFGF、幹細胞因子(stem cell factor)などの物質の存在下で始原生殖細胞を培養することによって樹立しうる(Y. Matsui et al. (1992), Cell, 70:841-847; J.L. Resnick et al. (1992), Nature, 359:550-551)。
(D) 人工多能性幹細胞
　人工多能性幹(iPS)細胞は、特定の初期化因子を、DNAまたはタンパク質の形態で体細胞に導入することによって作製することができる、ES細胞とほぼ同等の特性、例えば分化多能性と自己複製による増殖能、を有する体細胞由来の人工の幹細胞である（K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cell, 126:663-676; K. Takahashi et al. (2007), Cell, 131:861-872; J. Yu et al. (2007), Science, 318:1917-1920; Nakagawa, M.ら,Nat. Biotechnol. 26:101-106 (2008)；国際公開WO 2007/069666）。初期化因子は、ES細胞に特異的に発現している遺伝子、その遺伝子産物もしくはnon-cording RNAまたはES細胞の未分化維持に重要な役割を果たす遺伝子、その遺伝子産物もしくはnon-cording RNA、あるいは低分子化合物によって構成されてもよい。初期化因子に含まれる遺伝子として、例えば、Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Klf4、Klf2、c-Myc、N-Myc、L-Myc、Nanog、Lin28、Fbx15、ERas、ECAT15-2、Tcl1、beta-catenin、Lin28b、Sall1、Sall4、Esrrb、Nr5a2、Tbx3またはGlis1等が例示され、これらの初期化因子は、単独で用いても良く、組み合わせて用いても良い。初期化因子の組み合わせとしては、WO2007/069666、WO2008/118820、WO2009/007852、WO2009/032194、WO2009/058413、WO2009/057831、WO2009/075119、WO2009/079007、WO2009/091659、WO2009/101084、WO2009/101407、WO2009/102983、WO2009/114949、WO2009/117439、WO2009/126250、WO2009/126251、WO2009/126655、WO2009/157593、WO2010/009015、WO2010/033906、WO2010/033920、WO2010/042800、WO2010/050626、WO 2010/056831、WO2010/068955、WO2010/098419、WO2010/102267、WO 2010/111409、WO 2010/111422、WO2010/115050、WO2010/124290、WO2010/147395、WO2010/147612、Huangfu D, et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26: 795-797、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 2: 525-528、Eminli S, et al. (2008), Stem Cells. 26:2467-2474、Huangfu D, et al. (2008), Nat Biotechnol. 26:1269-1275、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3, 568-574、Zhao Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3:475-479、Marson A, (2008), Cell Stem Cell, 3, 132-135、Feng B, et al. (2009), Nat Cell Biol. 11:197-203、R.L. Judson et al., (2009), Nat. Biotech., 27:459-461、Lyssiotis CA, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci U S A. 106:8912-8917、Kim JB, et al. (2009), Nature. 461:649-643、Ichida JK, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5:491-503、Heng JC, et al. (2010), Cell Stem Cell. 6:167-74、Han J, et al. (2010), Nature. 463:1096-100、Mali P, et al. (2010), Stem Cells. 28:713-720、Maekawa M, et al. (2011), Nature. 474:225-9.に記載の組み合わせが例示される。
　上記初期化因子には、ヒストンデアセチラーゼ（HDAC）阻害剤［例えば、バルプロ酸 (VPA)、トリコスタチンA、酪酸ナトリウム、MC 1293、M344等の低分子阻害剤、HDACに対するsiRNAおよびshRNA（例、HDAC1 siRNA Smartpool (Millipore)、HuSH 29mer shRNA Constructs against HDAC1 (OriGene)等）等の核酸性発現阻害剤など］、MEK阻害剤（例えば、PD184352、PD98059、U0126、SL327およびPD0325901）、Glycogen synthase kinase-3阻害剤（例えば、BioおよびCHIR99021）、DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、5-azacytidine）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、BIX-01294 等の低分子阻害剤、Suv39hl、Suv39h2、SetDBlおよびG9aに対するsiRNAおよびshRNA等の核酸性発現阻害剤など）、L-channel calcium agonist (例えばBayk8644)、酪酸、TGFβ阻害剤またはALK5阻害剤（例えば、LY364947、SB431542、616453およびA-83-01）、p53阻害剤（例えばp53に対するsiRNAおよびshRNA）、ARID3A阻害剤（例えば、ARID3Aに対するsiRNAおよびshRNA）、miR-291-3p、miR-294、miR-295およびmir-302などのmiRNA、Wnt Signaling（例えばsoluble Wnt3a）、神経ペプチドY、プロスタグランジン類（例えば、プロスタグランジンE2およびプロスタグランジンJ2）、hTERT、SV40LT、UTF1、IRX6、GLISl、PITX2、DMRTBl等の樹立効率を高めることを目的として用いられる因子も含まれており、本明細書においては、これらの樹立効率の改善目的にて用いられた因子についても初期化因子と別段の区別をしないものとする。
　初期化因子は、タンパク質の形態の場合、例えばリポフェクション、細胞膜透過性ペプチド（例えば、HIV由来のTATおよびポリアルギニン）との融合、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入してもよい。
　一方、DNAの形態の場合、例えば、ウイルス、プラスミド、人工染色体などのベクター、リポフェクション、リポソーム、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入することができる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター（以上、Cell, 126, pp.663-676, 2006; Cell, 131, pp.861-872, 2007; Science, 318, pp.1917-1920, 2007）、アデノウイルスベクター（Science, 322, 945-949, 2008）、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクター（WO 2010/008054）などが例示される。また、人工染色体ベクターとしては、例えばヒト人工染色体（HAC）、酵母人工染色体（YAC）、細菌人工染色体（BAC、PAC）などが含まれる。プラスミドとしては、哺乳動物細胞用プラスミドを使用しうる（Science, 322:949-953, 2008）。ベクターには、核初期化物質が発現可能なように、プロモーター、エンハンサー、リボゾーム結合配列、ターミネーター、ポリアデニル化サイトなどの制御配列を含むことができるし、さらに、必要に応じて、薬剤耐性遺伝子（例えばカナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子など）、チミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリアトキシン遺伝子などの選択マーカー配列、緑色蛍光タンパク質（GFP）、βグルクロニダーゼ（GUS）、FLAGなどのレポーター遺伝子配列などを含むことができる。また、上記ベクターには、体細胞への導入後、初期化因子をコードする遺伝子もしくはプロモーターとそれに結合する初期化因子をコードする遺伝子を共に切除するために、それらの前後にLoxP配列を有してもよい。
　また、RNAの形態の場合、例えばリポフェクション、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入しても良く、分解を抑制するため、5-メチルシチジンおよびpseudouridine（TriLink Biotechnologies）を取り込ませたRNAを用いても良い（Warren L, (2010) Cell Stem Cell. 7:618-630）。
　iPS細胞誘導のための培養液としては、例えば、10～15％FBSを含有するDMEM、DMEM/F12またはDME培養液（これらの培養液にはさらに、LIF、penicillin/streptomycin、puromycin、L-グルタミン、非必須アミノ酸類、β-メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）またはマウスES細胞培養用培養液（TX-WES培養液、トロンボＸ社）、霊長類ES細胞培養用培養液（霊長類ES/iPS細胞用培養液、リプロセル社）、無血清多能性幹細胞維持培地（例えば、mTeSR（Stemcell Technology社）、Essential 8（Life Technologies）、StemFit AK03（AJINOMOTO））などの市販の培養液が例示される。
　培養法の例としては、例えば、37℃、5％CO2存在下にて、10％FBS含有DMEMまたはDMEM/F12培養液上で体細胞と初期化因子とを接触させ約4～7日間培養し、その後、細胞をフィーダー細胞（たとえば、マイトマイシンC処理STO細胞、SNL細胞等）上に播きなおし、体細胞と初期化因子の接触から約10日後からbFGF含有霊長類ES細胞培養用培養液で培養し、該接触から約30～約45日またはそれ以上ののちにiPS様コロニーを生じさせることができる。
　あるいは、37℃、5% CO2存在下にて、フィーダー細胞（たとえば、マイトマイシンC処理STO細胞、SNL細胞等）上で10％FBS含有DMEM培養液（これにはさらに、LIF、ペニシリン/ストレプトマイシン、ピューロマイシン、L-グルタミン、非必須アミノ酸類、β-メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）で培養し、約25日～約30日またはそれ以上後にES様コロニーを生じさせることができる。望ましくは、フィーダー細胞の代わりに、初期化される体細胞そのものを用いる（Takahashi K, et al. (2009), PLoS One. 4:e8067またはWO2010/137746）、もしくは細胞外マトリックス（例えば、Laminin-5（WO2009/123349）およびマトリゲル（BD社））を用いる方法が例示される。
　この他にも、血清を含有しない培地を用いて培養する方法も例示される（Sun N, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci U S A. 106:15720-15725）。さらに、樹立効率を上げるため、低酸素条件（0.1％以上、15％以下の酸素濃度）によりiPS細胞を樹立しても良い（Yoshida Y, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5:237-241またはWO2010/013845）。
　上記培養の間には、培養開始2日目以降から毎日1回新鮮な培養液と培養液交換を行う。また、核初期化に使用する体細胞の細胞数は、限定されないが、培養ディッシュ100cm2あたり約5×103～約5×106細胞の範囲である。
　iPS細胞は、形成したコロニーの形状により選択することが可能である。一方、体細胞が初期化された場合に発現する遺伝子（例えば、Oct3/4、Nanog）と連動して発現する薬剤耐性遺伝子をマーカー遺伝子として導入した場合は、対応する薬剤を含む培養液（選択培養液）で培養を行うことにより樹立したiPS細胞を選択することができる。また、マーカー遺伝子が蛍光タンパク質遺伝子の場合は蛍光顕微鏡で観察することによって、発光酵素遺伝子の場合は発光基質を加えることによって、また発色酵素遺伝子の場合は発色基質を加えることによって、iPS細胞を選択することができる。
　本明細書中で使用する「体細胞」なる用語は、卵子、卵母細胞、ES細胞などの生殖系列細胞または分化全能性細胞を除くあらゆる動物細胞（好ましくは、ヒトを含む哺乳動物細胞）をいう。体細胞には、非限定的に、胎児(仔)の体細胞、新生児(仔)の体細胞、および成熟した健全なもしくは疾患性の体細胞のいずれも包含されるし、また、初代培養細胞、継代細胞、および株化細胞のいずれも包含される。具体的には、体細胞は、例えば（1）神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）、（2）組織前駆細胞、（3）リンパ球、上皮細胞、内皮細胞、筋肉細胞、線維芽細胞（皮膚細胞等）、毛細胞、肝細胞、胃粘膜細胞、腸細胞、脾細胞、膵細胞(膵外分泌細胞等)、脳細胞、肺細胞、腎細胞および脂肪細胞等の分化した細胞などが例示される。
　また、iPS細胞を移植用細胞の材料として用いる場合、拒絶反応が起こらないという観点から、移植先の個体のHLA遺伝子型が同一もしくは実質的に同一である体細胞を用いることが望ましい。ここで、「実質的に同一」とは、移植した細胞に対して免疫抑制剤により免疫反応が抑制できる程度にHLA遺伝子型が一致していることであり、例えば、HLA-A、HLA-BおよびHLA-DRの3遺伝子座あるいはHLA-Cを加えた4遺伝子座が一致するHLA型を有する体細胞である。
(E) 核移植により得られたクローン胚由来のES細胞
　ntES細胞は、核移植技術によって作製されたクローン胚由来のES細胞であり、受精卵由来のES細胞とほぼ同じ特性を有している（T. Wakayama et al. (2001), Science, 292:740-743; S. Wakayama et al. (2005), Biol. Reprod., 72:932-936; J. Byrne et al. (2007), Nature, 450:497-502）。すなわち、未受精卵の核を体細胞の核と置換することによって得られたクローン胚由来の胚盤胞の内部細胞塊から樹立されたES細胞がntES(nuclear transfer ES)細胞である。ntES細胞の作製のためには、核移植技術（J.B. Cibelli et al. (1998), Nature Biotechnol., 16:642-646）とES細胞作製技術(上記)との組み合わせが利用される(若山清香ら(2008),実験医学,26巻,5号(増刊), 47～52頁)。核移植においては、哺乳動物の除核した未受精卵に、体細胞の核を注入し、数時間培養することで初期化することができる。
(F) Multilineage-differentiating Stress Enduring cells（Muse細胞）
　Muse細胞は、WO2011/007900に記載された方法にて製造された多能性幹細胞であり、詳細には、線維芽細胞または骨髄間質細胞を長時間トリプシン処理、好ましくは8時間または16時間トリプシン処理した後、浮遊培養することで得られる多能性を有した細胞であり、SSEA-3およびCD105が陽性である。
　工程（１）で使用する細胞培養容器は、培養細胞の接着培養が可能な培養容器であれば特に限定されない。例えば、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリディッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マルチプレート、マルチウェルプレート、チャンバースライド、カルチャースライド、シャーレなどが挙げられる。細胞接着に適した表面加工を施した培養容器を用いてもよい。使用する細胞培養容器の培養面積も特に限定されず、例えば、6ウェルプレート、12ウェルプレート、24ウェルプレート、48ウェルプレート、96ウェルプレート、384ウェルプレートなどを使用することができる。好ましくは、培養空間が狭い細胞培養容器（96ウェルプレート、384ウェルプレートなど）を用いる。
　工程（１）で使用する細胞培養容器は、細胞接着に適した表面加工を施した細胞培養容器であってもよく、細胞外マトリックス成分をコーティングした細胞培養容器であってもよい。細胞外マトリックス成分としては、例えば、ポリリジン、ポリオルニチン、コラーゲン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、ヒアルロン酸、テネイシン、エンタクチン、エラスチン、フィブリリン、ラミニン、およびこれらの細胞接着活性を有する断片が挙げられる。細胞外マトリックス成分は、天然物であってもよく、人工物（組換え体）であってもよい。細胞外マトリックス成分は、単一の成分でもよく、複数成分の組み合わせでもよい。
　工程（１）で細胞培養容器のコーティングに使用する細胞外マトリックス成分は、後述の工程（３）で細胞に重層する細胞外マトリックス成分と異なる成分であってもよく、同一の成分であってもよく、一部が重複する成分であってもよい。
　細胞外マトリックス成分のコーティング濃度は、骨格筋幹細胞の増殖に悪影響を及ぼさない濃度であればよく、特に限定されない。例えば、0.1μg/cm2～100μg/cm2であってもよく、0.5μg/cm2～50μg/cm2であってもよく、1μg/cm2～25μg/cm2であってもよい。細胞外マトリックス成分がプレコーティングされた市販の細胞培養容器を使用してもよい。
　工程（１）で使用する培地は、骨格筋幹細胞の増殖に適した培地であれば特に限定されない。iPS細胞やES細胞の増殖に使用される公知の培地を好適に使用することができる。具体的には、例えば、StemFit（商品名）シリーズ（Ajinomoto）などが挙げられる。
　工程（１）において、骨格筋幹細胞の播種細胞数は特に限定されず、播種後3～7日程度で100％コンフルエントになると予想される播種細胞数であってもよく、播種後4～6日程度で100％コンフルエントになると予想される播種細胞数であってもよい。例えば、96ウェルプレートに播種する場合、1×103～1×104個/ウェルであってもよく、5×103～1×104個/ウェルであってもよい。
　工程（１）の期間は特に限定されない。細胞のコンフルエント状態が70％以上になるまでの期間でもよく、80％以上になるまでの期間でもよく、90％以上になるまでの期間でもよく、95％以上になるまでの期間でもよく、100％になるまでの期間でもよい。工程（１）の期間は、10日間以下でもよく、9日間以下でもよく、8日間以下でもよく、7日間以下でもよく、6日間以下でもよい。また、工程（１）の期間は、2日間以上でもよく、3日間以上でもよく、4日間以上でもよく、5日間以上でもよい。工程（１）の期間は、骨格筋幹細胞の播種細胞数と使用する増殖培地の組み合わせに応じて、適宜決定することができる。
　工程（２）では、工程（１）で増殖させた骨格筋幹細胞の培地を分化培地に交換する。工程（２）で使用する分化培地としては、幹細胞から骨格筋細胞への分化誘導に使用できる公知の培地から選択することができる。例えば、DMEM Low glucose、DMEM high glucose、IMEM、MEM、αMEM、GMEM、DMEM/Hams F-12、Hams F-12、RPMI-1640などが挙げられる。
　工程（２）で使用する分化培地は、血清の含有量が少ないことが好ましく、血清の含有量が2％未満であることが好ましい。分化培地の血清含有量は、1.5％以下であってもよく、1％以下であってもよく、0.5％以下であってもよい。工程（２）で使用する分化培地は、血清を含まない培地であってもよい。血清を含まない分化培地は、無血清サプリメントを含有する培地であってもよい。無血清サプリメントとしては、市販の無血清サプリメントや公知の無血清サプリメントを好適に用いることができる。具体的には、例えば、N-2サプリメント、B27サプリメント、KSR（KnockOut Serum Replacement）などが挙げられる。好ましくは、N-2サプリメントである。
　工程（２）の期間は、一部の細胞が紡錘状の形態を呈するまでである。骨格筋幹細胞を分化培地で培養すると、単核の筋芽細胞が細胞融合して多核の筋管細胞になるが、筋芽細胞は丸い形態から紡錘状の形態に変化して細胞融合が開始される。工程（２）では、一部の細胞の形態が紡錘状に変化した時期まで培養を行えばよい。紡錘状の形態の細胞の出現は、顕微鏡観察により確認することができる。紡錘状の形態を呈する細胞は、極少数の細胞でもよく、全体の5％以上の細胞でもよく、全体の10％以上の細胞でもよく、全体の20％以上の細胞でもよく、全体の30％以上の細胞でもよく、全体の40％以上の細胞でもよく、全体の50％以上の細胞でもよい。一部の細胞が紡錘状の形態を呈する時期には、細胞融合した多核の筋管細胞が出現していてもよい。工程（２）の期間は、2日間以上でもよく、3日間以上でもよく、4日間以上でもよく、5日間以上でもよい。工程（２）の期間は、10日間以下でもよく、9日間以下でもよく、8日間以下でもよく、7日間以下でもよく、6日間以下でもよい。
　工程（３）では、細胞に細胞外マトリックス成分を含むゲルを重層し、分化培地を用いて培養を行う。細胞に重層する細胞外マトリックス成分は、工程（１）で細胞培養容器にコーティングした細胞外マトリックス成分と異なる成分であってもよく、同一の成分であってもよく、一部が重複する成分であってもよい。
　細胞外マトリックス成分としては、工程（１）の説明において例示したものを好適に使用することができる。細胞外マトリックス成分はラミニンまたはラミニンフラグメントを含むものであってもよい。ラミニンは、α鎖、β鎖およびγ鎖の3本のサブユニット鎖からなるヘテロ3量体分子である。α鎖はα1～α5の5種類、β鎖はβ1～β3の3種類、γ鎖はγ1～γ3の3種類が知られており、それらの組み合わせで少なくとも12種類以上のアイソフォームが存在する。工程（３）で細胞に重層する細胞外マトリックス成分に含まれるラミニンは、ラミニンα1β1γ1（以下「ラミニン111」のように表記する）であってもよく、ラミニン211であってもよく、ラミニン411であってもよく、ラミニン421であってもよく、ラミニン511であってもよく、ラミニン521であってもよい。ラミニンフラグメントはラミニンE8フラグメントであってもよい。
　細胞外マトリックス成分は、コラーゲンを含むものであってもよい。コラーゲンは、IV型コラーゲンであってもよい。細胞外マトリックス成分は、ラミニンまたはラミニンフラグメントと、IV型コラーゲンを含むものであってもよい。細胞外マトリックス成分は、ラミニンまたはラミニンフラグメントと、IV型コラーゲンと、さらに他の基底膜成分を含むものであってもよい。他の基底膜成分として、エンタクチン、ヘパラン硫酸プロテオグリカンなどが挙げられる。細胞外マトリックス成分には、増殖因子が含まれていてもよい。増殖因子としては、EGF、bFGF、NGF、PDGF、IGF-1、TGF-βなどが挙げられる。細胞外マトリックス成分は、Engelbreth-Holm-Swarm（EHS）マウス肉腫の抽出物であってもよく、マトリゲル（商品名）であってもよい。
　細胞外マトリックス成分は、培養温度でゲルが形成される基剤に分散または溶解して細胞に重層する。細胞外マトリックス成分の濃度は、細胞外マトリックス成分を含むゲル中のタンパク質濃度として、1～12mg/mLであってもよく、1～10mg/mLであってもよく、1～9mg/mLであってもよく、1～8mg/mLであってもよく、1～7mg/mLであってもよく、1～6mg/mLであってもよく、1～5mg/mLであってもよく、1.5～4mg/mLであってもよい。
　例えば、細胞外マトリックス成分としてマトリゲル（商品名）を用いる場合、凍結保存したマトリゲル（商品名）を氷上または4℃で溶解し、工程（２）で使用した分化培地を用いて2～5倍程度に希釈して、培地を除去した細胞に重層する。その後37℃でインキュベートしてゲル化させ、その上から分化培地を添加すればよい。
　工程（３）で使用する分化培地は、工程（２）で使用した分化培地と同じ培地であってもよく、異なる培地であってもよいが、アグリンを含有する分化培地であることが好ましい。なお、工程（２）で使用した分化培地と異なる分化培地を用いる場合、血清の含有量が少ない分化培地を用いることが好ましいことは、工程（２）の分化培地と同様であり、分化培地中の血清含有量または添加する無血清サプリメントも、工程（２）の分化培地と同様である。
　アグリンは、基底膜成分であるヘパラン硫酸プロテオグリカンの１種である。工程（３）で分化培地に添加するアグリンは、ヒトのアグリンでもよく、ヒト以外の生物のアグリンでもよい。ヒト以外の生物は、哺乳動物であってもよい。哺乳動物としては、例えば、サル、チンパンジー、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、ウサギ、マウス、ラット等が挙げられる。アグリンの添加量は特に限定されず、例えば、終濃度が1～1000ng/mLになるように添加してもよく、10～750ng/mLになるように添加してもよく、20～500ng/mLになるように添加してもよく、30～400ng/mLになるように添加してもよく、40～300ng/mLになるように添加してもよく、50～200ng/mLになるように添加してもよい。
　工程（３）において、培地交換は、添加したアグリンの濃度が一定に維持される頻度で行うことが好ましい。培地交換は、3日に1回であってもよく、2日に1回であってもよく、毎日行ってもよい。
　工程（３）の期間は特に限定されないが、1か月以上であってもよく、2か月以上であってもよく、3か月以上であってもよい。本発明者らは、後述の実施例の条件で、3か月以上の長期培養が可能であることを確認している。
　工程（４）では、工程（３）により得られた成熟筋管細胞が、整列したＴ管構造、および／または、筋小胞体とＴ管により形成される３つ組構造を有することを確認する。これらの構造の確認は、電子顕微鏡観察および／または免疫染色（免疫蛍光染色）により行うことができる（実施例、図2、図7参照）。電子顕微鏡観察および免疫染色（免疫蛍光染色）は、いずれも公知の方法で行うことができる。さらに、工程（４）では、工程（３）により得られた成熟筋管細胞が、整列したサルコメア構造を有することを確認することが好ましい。整列したサルコメア構造は、電子顕微鏡観察により行うことができる（実施例、図2参照）。
　整列したＴ管構造および筋小胞体とＴ管により形成される３つ組構造の少なくとも1つが確認できれば、得られた筋管細胞は、十分成熟した筋管細胞であると認められる。両方の構造が観察されることが好ましく、さらに、整列したサルコメア構造が観察されることがより好ましい。
　本発明には、上記本発明の製造方法より得られた成熟筋管細胞が含まれる。
〔スクリーニング方法〕
　本発明は、遺伝性筋疾患個体由来の骨格筋幹細胞から製造した筋管細胞を用いて筋疾患治療薬の候補物質をスクリーニングする方法を提供する。本発明のスクリーニング方法は、以下の工程（１）～（３）を含むものであればよい。
（１）上記本発明の製造方法により遺伝性筋疾患個体由来の骨格筋幹細胞から成熟筋管細胞を製造する工程、
（２）工程（１）で製造された成熟筋管細胞に被験物質を接触させる工程、および
（３）被験物質を接触させなかった場合と比較して、成熟筋管細胞の病態を緩和する被験物質を選択する工程
　工程（１）では、上記本発明の製造方法により遺伝性筋疾患個体由来の骨格筋幹細胞から成熟筋管細胞を製造する。工程（１）は、上記本発明の製造方法の説明に従って実施することができる。
　工程（２）では、工程（１）で製造された成熟筋管細胞に被験物質を接触させる。被験物質は特に限定されず、例えば天然化合物、有機化合物、無機化合物、核酸オリゴ、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、原核細胞抽出物、真核単細胞抽出物、動物細胞抽出物等を挙げることができる。また、化合物ライブラリー、核酸オリゴライブラリー、ポリペプチドライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物を被験物質としてしてもよい。被験物質は必要に応じて標識して用いることができる。標識としては、例えば、放射標識、蛍光標識等を挙げることができる。
　成熟筋管細胞と被験物質を接触させる方法は特に限定されず、例えば、工程（１）で製造された成熟筋管細胞の培地に被験物質を添加する方法などが挙げられる。成熟筋管細胞と被験物質との接触期間およびその後の培養期間は特に限定されず、目的の被験物質を選択するための評価基準に応じて、適宜設定することができる。
　工程（３）では、被験物質を接触させなかった場合と比較して、筋管細胞の病態を緩和する被験物質を選択する。
　例えば、MTM1遺伝子変異X連鎖性ミオチュブラーミオパチー患者由来の骨格筋幹細胞から製造した成熟筋管細胞を用いる場合、当該疾患由来の成熟筋管細胞は、健常者由来の成熟筋管細胞よりサイズが小さいため、被験物質と接触させたときに、成熟筋管細胞のサイズを大きくする作用を有する被験物質を選択する。成熟筋管細胞のサイズは、顕微鏡観察等により評価することができる。
　例えば、三好型筋ジストロフィー患者由来の骨格筋幹細胞から製造した成熟筋管細胞を用いる場合、当該疾患由来の成熟筋管細胞では膜修復の遅延という表現型が認められ得るため、被験物質と接触させたときに、膜修復の遅延を改善する作用を有する被験物質が選択され得る。
　例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィー患者由来の骨格筋幹細胞から製造した成熟筋管細胞を用いる場合、当該疾患由来の成熟筋管細胞では膜の脆弱性が認められ得るため、被験物質と接触させたときに、膜の脆弱性を改善する作用を有する被験物質が選択され得る。また、当該疾患由来の成熟筋管細胞では、細胞質へのカルシウムイオンの過剰流入に起因するミトコンドリア障害、酸化ストレスの増大、炎症性サイトカインの増加等の病態が認められ得るため、被験物質と接触させたときに、これらの病態を改善する作用を有する被験物質が選択され得る。
　例えば、先天性ミオパチーの１つである還元小体型ミオパチー患者由来の骨格筋幹細胞から製造した成熟筋管細胞を用いる場合、当該疾患由来の成熟筋管細胞は、健常者由来の成熟筋管細胞より成熟化速度が遅くなり得るため、被験物質と接触させたときに、筋管細胞の成熟化速度を改善する作用を有する被験物質が選択され得る。筋管細胞の成熟化の改善は、成熟化段階を反映するマーカーの発現量を測定すること等により評価することができる。
　例えば、Pompe病患者由来の骨格筋幹細胞から製造した成熟筋管細胞を用いる場合、当該疾患由来の成熟筋管細胞では、ライソゾーム機能異常、ミトコンドリア障害等の病態が認められ得るため、被験物質と接触させたときに、これらの病態を改善する作用を有する被験物質が選択され得る。
　例えば、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（FSHD: facioscapulohumeral muscular dystrophy）患者由来の骨格筋幹細胞から製造した成熟筋管細胞を用いる場合、当該疾患由来の成熟筋管細胞では、DUX4発現依存的な細胞死等の病態が認められ得るため、被験物質と接触させたときに、DUX4発現依存的な細胞死を抑制する作用を有する被験物質が選択され得る。
　例えば、筋強直性ジストロフィー患者由来の骨格筋幹細胞から製造した成熟筋管細胞を用いる場合、当該疾患由来の成熟筋管細胞では、スプライシング異常に起因する成熟化障害が認められ得るため、被験物質と接触させたときに、スプライシング異常に起因する成熟化障害を改善する作用を有する被験物質が選択され得る。
　例えば、GNEミオパチー（縁取り空胞を伴う遠位型ミオパチー）患者由来の骨格筋幹細胞から製造した成熟筋管細胞を用いる場合、当該疾患由来の成熟筋管細胞では、シアル酸欠乏、ライソゾーム機能異常等の病態が認められ得るため、被験物質と接触させたときに、これらの病態を改善する作用を有する被験物質が選択され得る。
　例えば、眼咽頭遠位型筋ジストロフィー患者由来の骨格筋幹細胞から製造した成熟筋管細胞を用いる場合、当該疾患由来の成熟筋管細胞では、不良タンパクの蓄積、ライソゾーム機能異常等の病態が認められ得るため、被験物質と接触させたときに、これらの病態を改善する作用を有する被験物質が選択され得る。
　例えば、ラミノパチー患者由来の骨格筋幹細胞から製造した成熟筋管細胞を用いる場合、当該疾患由来の成熟筋管細胞では核の形態異常が認められ得るため、被験物質と接触させたときに、核の形態異常を改善する作用を有する被験物質が選択され得る。
　例えば、ネマリンミオパチー患者由来の骨格筋幹細胞から製造した成熟筋管細胞を用いる場合、当該疾患由来の成熟筋管細胞では、ネマリン小体の蓄積、ライソゾーム機能異常等の病態が認められ得るため、被験物質と接触させたときに、これらの病態を改善する作用を有する被験物質が選択され得る。
　例えば、福山型先天性筋ジストロフィー患者由来の骨格筋幹細胞から製造した成熟筋管細胞を用いる場合、当該疾患由来の成熟筋管細胞では、αジストログリカンの糖鎖修飾異常、成熟化障害等の病態が認められ得るため、被験物質と接触させたときに、これらの病態を改善する作用を有する被験物質が選択され得る。
　本発明の成熟筋管細胞の製造方法を用いれば、未分化状態から成熟筋管細胞に至るまでの過程をin vitroで再現できるので、上記以外の遺伝性筋疾患についても、各成熟段階におけるマーカー等を指標に、本発明のスクリーニング方法を適用することができる。
　以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
〔実施例１：ヒトiPS細胞由来骨格筋幹細胞からの成熟筋管細胞の製造〕
１．実験材料および方法
（１）多能性幹細胞
　ヒトiPS細胞（201B7）は、京都大学の山中教授より供与されたものを、従来の方法で培養した（Takahashi K, et al. Cell. 131:861-72, 2007）。常法に従って、相同組換えによりヒトiPS細胞（201B7）のPax7遺伝子座の開始コドンの5'側へvenusの塩基配列を連結させ、Pax7の発現と連携してvenus蛍光を発現するiPS細胞株（Pax7-venus iPSCs）を作製した。
（２）分化誘導前準備
　骨格筋前駆細胞への分化誘導前に、ヒトiPS細胞（Pax7-venus iPSCs）を、マトリゲル（100倍希釈）でコーティングした培養容器上で低密度培養を行った。具体的には、フィーダーフリーで培養したヒトPax7-venus iPS細胞を、PBSで2回洗浄した後、500μLのaccutaseを用いて、37℃で10分間インキュベートした。続いて、1.5mLの培地を加えてピペッティングにより単一細胞に解離し、15mLチューブに細胞を回収した。900rpmで5分間遠心分離した後、上清を除去し、10μM Y-27632（ナカライテスク）を添加した1mlのStemfit (AK02N)（Ajinomoto）で再懸濁して細胞数をカウントした。マトリゲル（100倍希釈）で一昼夜コーティングした6ウェルプレートに、1ウェルあたり1×104個の細胞を播種した。各培養容器をよく揺らして、細胞が均一に拡散するようにし、37℃で培養を開始した（Day-3）。2日目（Day-2）に培地をStemfit (AK02N)で交換し、引き続き4日目（Day0）まで培養を行った。
（３）骨格筋幹細胞への分化誘導
（3-1）Day0～20
　培地を、10μM SB431542および10μM CHIR99021を添加したCDMi基本培地（1% Albumin from bovine serum (SIGMA)、1% Penicillin-Streptomycin Mixed Solution (ナカライテスク)、1% CD Lipid Concentrate (Invitrogen)、1% Insulin-Transferrin-Selenium (Invitrogen)、450μM 1-Thioglycerol (SIGMA)を添加したIMDM(1X) Iscove's Medified Dullbecco's Medium (+)L-Glutamine (+)25mM HEPES (Invitorogen)とF-12(1X)Nutrient Mixture(Ham) (+)L-Glutamine (Invitrogen)を１：１で混合した培地）に2mL/wellで交換した。その後、2日目（Day2）および5日目（Day5）に培地交換を行った。
　7日目（Day7）に次の方法で継代を行った。培地を吸引し、PBSで2回洗浄した後、500μL accutaseを添加して、37℃で5分間インキュベートした。続いて、2.5mLのCDMi基本培地を加えてピペッティングし、細胞を単一細胞に解離した。900rpm、4℃で5分間遠心分離した後、上清を除去し、CDMi基本培地で再懸濁した。その後、細胞数をカウントした。10μM SB431542、5μM CHIR99021および10μM Y-27632（ナカライテスク）を添加したCDMi基本培地で細胞を懸濁し、マトリゲルでコーティングした6ウェルプレートに、1ウェルあたり4×105個を播種した。8日目（Day8）、10日目（Day10）および12日目（Day12）に10μM SB431542および5μM CHIR99021を添加したCDMi基本培地で培地交換を行った。
　14日目（Day14）に7日目と同様の方法で継代を行った。ただし、6ウェルプレートへの播種細胞数は、1ウェルあたり6×105個とした。15日目（Day15）、17日目（Day17）および19日目（Day19）に、10μM SB431542および5μM CHIR99021を添加したCDMi基本培地で培地交換を行った。
（3-2）Day21～41
　21日目（Day21）に、培地を0.2％ BSA、200μM 2-ME（2-Mercaptoethanol）、10μM SB431542、10ng/mL IGF-1（Peprotech）、10ng/mL HGF（Peprotech）および10ng/mL bFGF（オリエンタル酵母）を添加したSF-O3（三光純薬）に交換し、培養を継続した。以降41日目まで同培地の交換を週2回のペースで継続した。
（3-3）Day42～80
　42日目（Day42）に、培地を2% Horse Serum(HS)、5μM SB431542および10ng/mL IGF-1を添加したDMEM基本培地に交換した。以後週2回培地交換を行った。80日目（Day80）に、フローサイトメーターでPax7陽性（venus蛍光発現）細胞を単離した。
（４）ヒトiPS細胞由来骨格筋幹細胞の播種、増殖
　骨格筋幹細胞を播種する前日に、マトリゲル（100倍希釈）で96ウェルプレートをコーティングした。上記（3-3）で単離したPax7陽性（venus蛍光発現）細胞を、マトリゲルコーティング96ウェルプレートに、1ウェルあたり5×103個播種した（D0）。増殖用の培地にはStemFit AK02N（Ajinomoto）500mLに50mU/L ペニシリン-50μg/L ストレプトマイシン（Invitrogen）を加えた培地を使用した。播種当日はROCK阻害薬Y-27632（ナカライテスク）を添加した培地、翌日以降はY-27632を含有しない培地を使用した。細胞がコンフルエントになるまで毎日培地交換を行った。
（５）ヒトiPS細胞由来骨格筋幹細胞の筋管細胞への分化
（5-1）分化培地への変更
　骨格筋幹細胞がコンフルエントになった状態で分化培地に変更した（D5）。分化培地には、DMEM Low glucose（Thermo Fisher Scientific）に1％ N2サプリメント（Gibco）を添加したものを使用した。
（5-2）マトリゲル重層とアグリン添加
　分化培地に変更後5日目（D10）に、細胞が筋管細胞に特徴的な紡錘形の形態を示すようになったため、マトリゲル重層とアグリン添加を行った。具体的には、マトリゲルをDMEM Low glucoseで3倍希釈（1：2）して氷上に準備した。分化培地を除去後、1ウェルあたり60μLのマトリゲル希釈液を細胞に重層し、37℃で40分インキュベートしてゲル化させた（thick matrigel coating: TMGC）。重層したマトリゲルの上に、アグリン（終濃度100ng/mL）を含む培地100μL/wellを加えた（TMGC/アグリン群）。別途、マトリゲルを重層してアグリンを含まない培地100μL/wellを加えた群（TMGC群）およびマトリゲルを重層せずアグリンを含まない培地100μL/wellを加えた群（コントロール群）を設けた。1日おきに培地交換を行った。培地交換の際は50μLずつ培地を交換し、TMGC/アグリン群では、培養期間中アグリン濃度を維持した。
（６）分化誘導後の細胞の評価
（6-1）光学顕微鏡による観察
　分化誘導中の細胞は、毎日光学顕微鏡で形態観察を行った。
（6-2）電子顕微鏡観察
　D30の細胞を電子顕微鏡観察に供した。電子顕微鏡標本の作製および電子顕微鏡写真の撮影は、株式会社東海電子顕微鏡解析に委託した。
（6-3）定量PCR
　D0、D5、D7、D14、D21、D28、D35およびD42に、ReliaPrep RNA Cell Miniprep system（Promega）を用いて細胞からRNAを抽出し、ReverTra Ace qPCR RT Kit（TOYOBO）を用いてcDNA合成した。定量PCRは、Power SYBR Green Master Mix（Thermo fisher scientific）およびStep One PlusリアルタイムPCRシステム（ABI）を使用して行った。使用したプライマーは以下のとおりである。
MYH3 F; gcagattgagctggaaaagg（配列番号1）
MYH3 R; tcagctgctcgatctcttca（配列番号2）
MYH4 F; tgcaatgaagactctggctttc（配列番号3）
MYH4 R; tttttgccacctttctttcca（配列番号4）
MYH8 F; atttccaccaagaaccca（配列番号5）
MYH8 R; aaaggattctgcctctgg（配列番号6）
Casq1 F; atggcgagttttctgctgac（配列番号7）
Casq1 R; ctgcagctctcgttcacctt（配列番号8）
Atp2a1 F; ctgtgtggctgtctggctta（配列番号9）
Atp2a1 R; caggaagaccttcggggatg（配列番号10）
DHPRα F; aggagcagggagagactgag（配列番号11）
DHPRα R; aatgtagcacctcagtgggc（配列番号12）
DHPRβ F; cattgagcgctccaacacac（配列番号13）
DHPRβ R; atggtgtcagcatccagagc（配列番号14）
DHPRγ F; gagggactatctgctgcgac（配列番号15）
DHPRγ R; caatcatgcgcttcaccgac（配列番号16）
（6-4）免疫染色
　2％PFAにて10分間、4℃で細胞を固定した。PBSで10分間の洗浄を2回行った。メタノールと過酸化水素水の混合液（MtOH：H2O2＝100：1）に浸漬した後、2％PFAにて15分間、4℃で再固定した。PBSで5分間の洗浄を3回行った。ブロッキング液（Blocking One ナカライテスク）で4℃、30分～1時間ブロッキングを行った。一次抗体には、抗ミオシン重鎖（MHC）抗体（MF20、R&D Systems、1:800）、抗DHPRα（dihydropyridine receptor α）抗体（MA3-920、Thermofisher scientific、1:200）、抗MYH1/2 (FAST) 抗体（abcam ab51263 1:100）、抗MYH4 (FAST)抗体（DSHB BF-F3 1:100）、抗MYH2 (FAST)抗体 （Millipore MABT840 1:100）、抗MYH7(SLOW)抗体（Santacruz sc-53089 1:200）、抗MYH3 (embryonic) 抗体（Sigma HPA021808）、抗MYH8 (neonatal) 抗体（Novus NBP2-41309）を使用した。一次抗体反応は、希釈液（10%Blocking One in PBS-T）で希釈した一次抗体を一夜反応させた。一次抗体反応後、PBS-Tで10分間の洗浄を3回の洗浄を行い、室温で1時間の二次抗体反応を行った。二次抗体には、Alexa Fluor 488標識抗マウスIgG（1:500）を使用した。PBS-Tで5分間の洗浄を2回行い、その後DAPIにて核染色を行った。観察および撮影はOlympus FLUOVIEW FV1000にて行った。
２．結果
（１）光学顕微鏡観察
　D30における各群の細胞の代表的な光学顕微鏡写真を図１に示した。（Ａ）がコントロール群、（Ｂ）がTMGC群、（Ｃ）がTMGC/アグリン群である。スケールバーは200μmである。TMGC/アグリン群およびTMGC群では、コントロール群と比較して極めて太い筋管細胞が散見され、筋管細胞自体が融合していることが観察された。
（２）電子顕微鏡観察
　D30におけるTMGC/アグリン群の代表的な電子顕微鏡写真を図２に示した。（Ａ）には整列したサルコメア構造が観察されており、（Ｂ）には３つ組構造と認められる構造が観察されている。示していないが、TMGC群の電子顕微鏡写真にも、整列したサルコメア構造および３つ組構造と認められる構造が観察された。したがって、D30の時点で成熟した筋管細胞の形態になっていると考えられた。
（３）ミオシン重鎖サブタイプの発現解析
（3-1）mRNAの発現解析
　生体内の骨格筋には速筋と遅筋の2種類が存在し、速筋および遅筋のいずれも胎児期にはMYH3が、幼児期にはMYH8が優勢的に発現しており、MYH3、MYH8とも成長して大人になるにつれて発現が減少していく。その代わりに、速筋ではMYH4等が発現上昇してくることが知られている。そこで、本発明の製造方法により得られた筋管細胞の成熟度を確認するために、ミオシン重鎖の各サブタイプのmRNAを定量PCRで解析した。
　結果を図３に示した。いずれの群の細胞も、MYH3およびMYH8は強く発現しており、MYH3では成熟化に従ってその発現が低下した。さらにD35以降において速筋型のMYH4の発現上昇が認められた。また、MYH3、MYH8およびMYH4のいずれも、TMGC群およびTMGC/アグリン群のほうがコントロール群より高発現していることが示された。この結果からD42の筋管細胞は、十分成熟しているものと考えられた。
（3-2）ミオシン重鎖サブタイプの免疫染色
　TMGC/アグリン群のD42の細胞を免疫染色に供し、蛍光顕微鏡で観察した。結果を図４に示した。（Ａ）は抗MYH1/2抗体、（Ｂ）は抗MYH4抗体、（Ｃ）は抗MYH2抗体、（Ｄ）は抗MYH7抗体、（Ｅ）は抗MYH3抗体、（Ｆ）は抗MYH8抗体で免疫染色した結果である。胎児型（MYH3）、新生児型（MYH8）、遅筋型（MYH7）、速筋型（MYH1/2、MYH4、MYH2）いずれのマーカーも発現していることが示された。
（４）筋小胞体関連遺伝子の発現解析
　筋小胞体は３つ組構造の構成物の１つであり、カルシウムのホメオスタシスに関する様々なチャネルが存在する。その中でもカルシウム電位をセンサーするCasq1、および筋小胞体からのカルシウム放出を担うAtp2a1の経時的なmRNA発現を、定量PCRで解析した。
　結果を図５に示した。（Ａ）がCasq1、（Ｂ）がAtp2a1の結果である。いずれの群でもCasq1、Atp2a1とも経時的に発現の上昇が認められたが、TMGC群およびTMGC/アグリン群ではコントロール群と比較して顕著な発現上昇が認められた。この結果から、TMGC群およびTMGC/アグリン群は、コントロール群より成熟度が高いことが示された。
（５）Ｔ管関連遺伝子の発現解析
　生体に存在する筋細胞は神経の指令下により収縮を行う。このためには、神経からの指令を伝えるＴ管の存在が必要である。Ｔ管に発現しているチャネルにはDHPRα、DHPRβ、DHPRγが存在することが知られている。そこで、これらの遺伝子の経時的なmRNA発現を、定量PCRで解析した。
　結果を図６に示した。（Ａ）がDHPRα、（Ｂ）がDHPRβ、（Ｃ）がDHPRγの結果である。いずれの群でDHPRα、DHPRβおよびDHPRγの発現の上昇が認められたが、TMGC群およびTMGC/アグリン群ではコントロール群と比較して顕著な発現上昇が認められた。この結果から、TMGC群およびTMGC/アグリン群は、コントロール群より成熟度が高いことが示された。
（６）Ｔ管の整列
　成体で見られる最も成熟した形態の筋管細胞ではＴ管が整列しており、このような「整列したＴ管」が、本発明の製造方法で製造した筋管細胞でも認められるかについて検証した。本発明の製造方法では３か月以上の長期培養が可能であるため、D75の細胞を抗DHPRα抗体による免疫染色に供し、蛍光顕微鏡で観察した。
　結果を図７に示した。図中の2本の線は、筋管細胞内に収縮刺激を伝導するT管構造が並んで配列していることを示している。スケールバーは50μmである。この結果から、D75の細胞は整列したＴ管を持つ十分に成熟した筋管細胞であることが明らかになった。
　さらに、本発明者らは、D30前後の細胞が電気刺激なしに自発収縮を行うことを確認し、動画撮影している。
〔実施例２：培地の検討〕
　非特許文献１には、マウスの筋芽細胞から分化誘導した筋管細胞を成熟させるために、マトリゲルの重層とアグリンを添加した培地を用いることが開示されているが、非特許文献１では、上記実施例１で使用した培地と異なり、増殖培地に20％FBSおよび1％Chick Embryo Extractを含むIMDM（Iscove’s Modified Dulbecco’s Media、グルコース含量：4.5g/L）を使用し、分化培地に2％馬血清を含有するIMDMを使用している。そこで、非特許文献１で使用された培地を本発明の製造方法に適用したときに実施例１と同様の結果が得られるかどうかを検討した。
１．実験材料および方法
　実施例１の「実験材料および方法」（１）～（５）に記載の方法で、マトリゲル重層およびアグリン添加培地を使用して分化誘導を行った（TMGC/アグリン群）。（４）および（５）で使用する培地として、実施例１と同じ培地の組み合わせを使用した場合と、非特許文献１と同じ培地の組み合わせを使用した場合を比較した。具体的には、実施例１と同じ培地の組み合わせは、（４）「StemFit AK02Nに50mU/L ペニシリン-50μg/L ストレプトマイシンを加えた培地」および（５）「DMEM Low glucoseに1％ N2サプリメントを添加した培地」であり、非特許文献１と同じ培地の組み合わせは、（４）「20％FBSおよび1％Chick Embryo Extractを含むIMDM」と（５）「2％馬血清を含有するIMDM」である。
　実施例１の「実験材料および方法」の（４）の骨格筋幹細胞を播種した日をD0とし、D42の細胞を免疫染色に供し、蛍光顕微鏡で観察した。一次抗体に抗ミオシン重鎖（MHC）抗体（MF20、R&D Systems、1:800）を使用し、実施例１の「実験材料および方法」の（６）（6-4）と同じ方法で免疫染色を行った。
２．結果
　結果を図８に示した。（Ａ）が実施例１と同じ培地の組み合わせ、（Ｂ）が非特許文献１と同じ培地の組み合わせの結果である。図８から明らかなように、（Ｂ）より（Ａ）のほうが、分化効率が優れていることが明らかになった。
〔実施例３：異なるヒトiPS細胞由来骨格筋幹細胞からの成熟筋管細胞の製造〕
　ヒトiPS細胞として、再生医療用iPS細胞ストックにより樹立された株Ff-WJ14-s01を用い、実施例１と同様に、ヒトiPS細胞のPax7遺伝子座の開始コドンの5'側へvenusの塩基配列を連結させ、Pax7の発現と連携してvenus蛍光を発現するiPS細胞株（Ff-WJ14-s01-Pax7-venus）を作製した。ヒトiPS細胞としてFf-WJ14-s01-Pax7-venus株を用いた以外は実施例１と同じ方法で、ヒトiPS細胞から骨格筋幹細胞を分化誘導し、得られた骨格筋幹細胞から筋管細胞へ分化誘導を行った。
　D30におけるTMGC/アグリン群の代表的な電子顕微鏡写真を図９に示した。（Ａ）および（Ｂ）の両方に、３つ組構造と認められる構造が観察された。異なるヒトiPS細胞由来の骨格筋幹細胞を用いても、D30の時点で成熟した筋管細胞の形態が確認されたことから、本発明の製造方法は再現性が高いことが示された。
　なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。

Claims (15)

  1. 　骨格筋幹細胞から成熟筋管細胞を製造する方法であって、
    （１）細胞培養容器に骨格筋幹細胞を播種し、増殖培地を用いて培養する工程、
    （２）培地を分化培地に交換し、一部の細胞が紡錘状の形態を呈するまで培養する工程、および
    （３）細胞に細胞外マトリックス成分を含むゲルを重層し、分化培地を用いて培養を行う工程、を含むことを特徴とする方法。
  2. 　分化培地が、２％未満の血清または無血清サプリメントを含有する培地である、請求項１に記載の方法。
  3. 　工程（３）の分化培地が、アグリンを含有する培地である、請求項２に記載の方法。
  4. 　分化培地中のアグリン濃度が１０～１０００ｎｇ／ｍＬである、請求項３に記載の方法。
  5. 　工程（１）において、細胞培養容器が、細胞外マトリックス成分をコーティングした細胞培養容器である、請求項１～４のいずれかに記載の方法。
  6. 　工程（１）において、細胞が８０％以上コンフルエントの状態になるまで増殖させる、請求項１～５のいずれかに記載の方法。
  7. 　工程（３）において、細胞に重層する細胞外マトリックス成分を含むゲルのタンパク質濃度が１～１２ｍｇ／ｍＬである、請求項１～６のいずれかに記載の方法。
  8. 　細胞外マトリックス成分がラミニンを含む、請求項１～７のいずれかに記載の方法。
  9. 　細胞外マトリックス成分がコラーゲンを含む、請求項１～８のいずれかに記載の方法。
  10. 　工程（３）の培養期間が２か月以上である、請求項１～９のいずれかに記載の方法。
  11. 　さらに、（４）整列したＴ管構造、および／または、筋小胞体とＴ管により形成される３つ組構造を確認する工程を含む、請求項１～１０のいずれかに記載の方法。
  12. 　骨格筋幹細胞が、多能性幹細胞から分化誘導して得られた骨格筋幹細胞である、請求項１～１１のいずれかに記載の方法。
  13. 　骨格筋幹細胞が、遺伝性筋疾患個体由来の骨格筋幹細胞または遺伝性筋疾患個体由来の多能性幹細胞から分化誘導して得られた骨格筋幹細胞である、請求項１～１１のいずれかに記載の方法。
  14. 　請求項１～１３のいずれかに記載の方法により得られた成熟筋管細胞。
  15. 　筋疾患治療薬の候補物質をスクリーニングする方法であって、
    （１）請求項１３に記載の方法により成熟筋管細胞を製造する工程、
    （２）工程（１）で製造された成熟筋管細胞に被験物質を接触させる工程、および
    （３）被験物質を接触させなかった場合と比較して、成熟筋管細胞の病態を緩和する被験物質を選択する工程
    を含むスクリーニング方法。
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FALCONE, S. ET AL.: "N-WASP is required for Amphiphysin-2/BIN1-dependent nuclear positioning and triad organization in skeletal muscle and is involved in the pathophysiology of centronuclear myopathy", EMBO MOLECULAR MEDICINE, vol. 6, no. 11, 2014, pages 1455 - 1475, XP055786098, ISSN: 1757-4676 *

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