JP2021151269A - 多能性幹細胞スフェロイドの製造方法、多能性幹細胞マーカーを発現させる方法、および多能性幹細胞スフェロイド - Google Patents

Abstract

【課題】多能性幹細胞スフェロイドの製造方法及び多能性幹細胞スフェロイドを提供する。【解決手段】分化した線維芽細胞をセリンプロテアーゼ処理して個々に分離された前記線維芽細胞を、１×１０６個／ｍｌ〜２×１０７個／ｍｌ、又は１×１０５個／ｃｍ２〜７×１０６個／ｃｍ２の高い細胞密度で、ホルモン、増殖因子、多能性誘導タンパク質、及び多能性細胞誘導因子からなる群から選択されるいずれか１種以上の刺激因子を使用せず、細胞非接着性細胞培養容器中、グルコース及びウシ胎児血清を含有するＤ−ＭＥＭ培地又はその等価培地において、ＣＯ２を供給しつつ、３０〜４０℃で静置培養してスフェロイドを形成させ、前記スフェロイドを構成する細胞の９５％以上に、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＰＡＲ４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、及びＡＬＰを発現する、多能性幹細胞スフェロイドの製造方法である。【選択図】図１

Description

本発明は、多能性幹細胞様スフェロイドの製造方法および多能性幹細胞様スフェロイドに関する。

近年、再生医学では種々の臓器で、幹細胞の移植により組織や臓器を修復する技術の臨床応用が検討されている。例えば、心筋細胞への分化能に優れる多能性幹細胞の調製方法がある（特許文献１）。幹細胞として心臓組織由来の心筋幹細胞や骨髄由来の造血幹細胞や間葉系幹細胞が知られているが、心筋細胞への分化度が低ければ心臓組織再生などの臨床応用に使用することはできない。特許文献１は心臓組織由来の細胞懸濁液を調製し、密度勾配法により幹細胞を含む細胞群を分取するものである。分取した細胞群を繊維芽細胞成長因子および上皮細胞増殖因子を含有する培地で、培養開始時の細胞濃度が１×１０^４〜２×１０^４個／ｍｌで浮遊培養し、浮遊状のスフェアーを形成している細胞を選択し分離して多能性幹細胞を得る。この多能性幹細胞は、心筋細胞や平滑筋細胞などに分化する能力を有するという。なお、前記浮遊状のスフェアーは、多能性幹細胞が細胞分裂を繰り返して形成したものである（特許文献１、段落「００３４」）。単一細胞から増殖した幹細胞が選択分離されたため幹細胞自体の均一性が高く、臨床上の有用性が高いという（特許文献１、段落「００１５」）。

また、幹細胞を大脳皮質前駆細胞に効率的に分化誘導する方法もある（特許文献２）。無血清培地中で均一な幹細胞の凝集塊を形成させる工程を含む幹細胞の分化培養法であり、Ｎｏｄａｌシグナル促進剤、Ｗｎｔシグナル促進剤、ＦＧＦシグナル促進剤、ＢＭＰシグナル促進剤、レチノイン酸等の増殖因子並びにインシュリン類を実質的に含有しない無血清培地で多能性幹細胞を浮遊凝集体として培養することで分化誘導し、培養物から視床下部ニューロンの前駆細胞を単離することができるという（特許文献２、段落「００２０」）。脳の中には多種類の神経細胞が存在するため、治癒を目的とする疾病に関連する神経細胞を正確かつ効率的に試験管内分化させるものである。実施例では、マウスＥＳ細胞を使用して分化培養し、培養開始後１０日の凝集塊の細胞のうち約７割の細胞に大脳特異的マーカーＢｆ１が発現することを観察している。

更に、ヒト皮膚線維芽細胞由来の多能性幹細胞を選別し、または増殖する方法もある（特許文献３）。無処理のヒト骨髄間葉系細胞画分から極めて低い頻度で特徴的な細胞塊が形成されること、およびストレス刺激により低眠状態の組織幹細胞が活性化されることから（特許文献３、段落「００２４」）、骨髄間葉系細胞画分や皮膚線維芽細胞画分等の間葉系細胞又は中胚葉系細胞を培養している際に種々の方法でストレス刺激を与え、生存している細胞を集めるというものである。ＳＳＥＡ−３の発現を指標に幹細胞を分離し、メチルセルロース含有培地中で浮遊培養すると、最大直径１５０μｍの胚様体様細胞塊を得ることができるという。この幹細胞は、ＳＳＥＡ−３陽性及びＣＤ１０５陽性、セルフリニューアル能等を特徴とする多能性幹細胞であり、Ｍｕｓｅ細胞と名付けられている。Ｍｕｓｅ細胞は、生体の中胚葉系組織または間葉系組織などに存在する。これら組織に存在している細胞または細胞画分を分離し（特許文献３、段落「００４０」）、ストレス刺激により非幹細胞を除去し、残存する幹細胞を富化するものである（特許文献３、段落「０１６７」）。Ｍｕｓｅ細胞は、生体や組織から直接得ることができる点でｉＰＳ細胞やＥＳ細胞と相違する。また、リプログラミングまたは脱分化の誘導を必要とせずに得られるという特徴を有する（特許文献３、段落「００３６」）。実施例では、間葉系細胞としてヒト皮膚線維芽細胞画分を使用し、ストレス刺激としてトリプシン中（０．２５％トリプシン−ＨＢＳＳ）で１６時間インキュベーション処理を行い、生細胞を回収してメチルセルロース含有培地で８，０００個／ｍｌの密度で７日間培養している（特許文献３、段落「０１３８」）。前記する１６時間のトリプシンによるインキュベーション処理を行ったヒト線維芽細胞画分から形成した細胞集団を「富Ｍｕｓｅ細胞画分」とし、該集団から得た単一細胞を浮遊培養すると、富Ｍｕｓｅ細胞画分の９〜１０％で細胞塊の形成が認められるため、富Ｍｕｓｅ細胞画分には約９〜１０％のＭｕｓｅ細胞が含まれている（特許文献３、段落「０１３９」）。

前記特許文献１〜特許文献３が、生体組織に含まれる幹細胞を選択し増殖させる技術であるのに対し、分化した細胞からリプログラミングにより多能性細胞を生成する方もある（特許文献４）。体細胞に低ｐＨ曝露などのストレスを供すると、外来遺伝子、転写物、タンパク質、核成分もしくは細胞質、外来リプログラミング因子の導入なしに、または細胞融合なしに多能性細胞を形成するという。実施例では、Ｏｃｔ４−ＧＦＰマウス由来のＣＤ４５陽性リンパ球を使用し、低ｐＨ溶液に曝露すると暴露３日以内に球状コロニーが観察され、胚性幹細胞のマーカーが発現するという（特許文献４、段落「０１４９」）。また、成熟細胞が、Ｏｃｔ４発現細胞へ変化するために有効なストレスを評価したところ、ｐＨ５．４〜５．６の酸性溶液への暴露が効率的であるという（特許文献４、段落「０１５５」）。Ｏｃｔ４−ＧＦＰ（ＧＯＦ）マウスの脾臓から回収してＣＤ４５陽性細胞を低ｐＨへ暴露し、ＧＦＰ発現細胞を分取しＢ２７−ＬＩＦ培地で培養すると、５日以内にＧＦＰ発現球状コロニーが観察され、７日間に亘って直径７０μｍに成長したという。この培養細胞を解離して培養し、ＣＤ４５陽性細胞の表現型変化を単一細胞レベルで観察すると、１日目では細胞の大部分がＣＤ４５を発現するがＯｃｔ４は発現せず、３日目ではＣＤ４５陰性細胞またはＣＤ４５陰性／Ｏｃｔ４陽性細胞を示し、７日目にはＣＤ４５発現が消滅し、Ｏｃｔ４発現細胞が観察されたという（特許文献４、段落「０１５８」）。リプログラミングを確認するため、７日目の細胞の初期胚発生マーカーの出現を評価すると、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２などの多能性細胞マーカーが発現し、外部刺激によってリプログラミングされたことが実証されたという（特許文献４、段落「０１５９」）。

さらに、細胞を多能性幹細胞様状態にする導入タンパク質もある（非特許文献１）。リプロティン（Ｒｅｐｒｏｔｉｎ）と称され、線維芽細胞が短時間のうちに上皮間葉転移状態を経てスフェロイドを形成し、リプログラミング・初期化が著明に亢進されるという。このリプロティン（Ｒｅｐｒｏｔｉｎ）を用いて線維芽細胞を初期化すると、約１〜３日の工程、１０％以上の効率で、多能性幹細胞コロニー様スフェロイドを作成することができるという。スフェロイドは、アルカリフォスファターゼ染色で強陽性を示し、多能性マーカーであるＳＳＥＡ−３、ＴＲＡ−１−８１も同時に陽性となり、スフェロイドを構成する細胞は多能性状態に変化したと考えられるという。ただし、リプロティン（Ｒｅｐｒｏｔｉｎ）の構造は不明である。なお、作成した多能性様幹細胞のコロニーをゲラチン上で培養すると、神経幹細胞マーカーであるＮｅｓｔｉｎが陽性となり、線維芽細胞から多能性幹細胞及び神経幹細胞を簡単に作成することができるという。

特許第４７８３９０９号公報 特開２０１６−５４６５号公報 特許第５１８５４４３号公報 特表２０１５−５１６８１２号公報

Reprotech（遺伝子フリー多能性幹細胞作成技術）と神経幹細胞マーカー、林仲信、Ｇｅｎｅ Ｔｒｙ， Ｉｎｃ， Ｒｅｐｒｏｔｅｃｈのホームページ、http://reprotech.jimdo.com/reprotech%E3%81%A8%E3%81%AF/、２０１６年８月２９日検索

しかしながら、上記特許文献１は、心臓組織から、心筋細胞等への分化能に優れる多能性幹細胞を選択分取する方法である。得られる細胞は、心筋細胞への分化能に優れる多能性幹細胞に限定される。また、心臓組織由来の細胞懸濁液を原料とし、密度勾配法によって目的の幹細胞を含む細胞集団を分離し、分離した細胞集団を線維芽細胞成長因子および上皮細胞増殖因子を含有する浮遊培地で培養し、培養物に含まれる細胞群から浮遊状の多能性幹細胞のスフェアーを選択分離するという工程が必要となり、操作が煩雑である。一方、上記特許文献２記載の方法は、無血清培地中で幹細胞を凝集させる事により、質的に均一な幹細胞群を形成させ、無血清培地中で該凝集幹細胞を浮遊培養させ、大脳皮質神経ネットワークを試験管内で形成するものである。本方法は幹細胞を作成する技法ではなく、既存の幹細胞群を同一の性質に同調させる方法である。特許文献１と特許文献２はいずれも予め僅かながら存在する幹細胞を培養するものであり、分化した成熟細胞から多能性幹細胞を調製する技術ではない。

特許文献３記載のＭｕｓｅ細胞も、特許文献１等と同様に予め存在する幹細胞を培養するものである。ヒト皮膚線維芽細胞に含まれる極めて稀な多能性幹細胞をＳＳＥＡ−３マーカーを指標として選別分取し、増殖させる。入手が容易なヒト皮膚線維芽細胞を原料とできる点で優れるが、ストレスの過剰負荷により大部分の細胞を死滅させ、生き残った細胞中のＭｕｓｅ細胞を選択するものであり、Ｍｕｓｅ細胞の回収率は極めて低い。また、目的細胞を分離するために高価な機器を用いる必要があり、特殊な技法を用いるため操作も複雑である。更に、特許文献３では、Ｍｕｓｅ細胞を、Ｍｕｓｅ細胞由来胚様体細胞塊、クローン増殖の一連のサイクルにより増殖させ、これにより間葉系細胞集団から大量のＭｕｓｅ細胞を得ることができると記載されている（特許文献３、段落「０１４２」）。しかしながら、細胞塊のサイズは最大直径が約１５０μｍである（特許文献３、段落「０１４０」）。特許文献３では、Ｍｕｓｅ細胞は爆発的増殖を防ぐための多重のセキュリティーシステムを有し、異常増殖を回避できるとするが（特許文献３、段落「０１６７」）、より簡便な操作で大型の幹細胞のスフェロイドを大量調製できれば増殖操作を行うことなく幹細胞研究、再生医療、治療等に使用でき、汎用性に優れる。

一方、特許文献４は、低ｐＨ溶液の暴露により分化した細胞から多能性細胞を生成するものである。しかしながら、Ｏｃｔ４−ＧＦＰ（ＧＯＦ）マウスの脾臓から回収したＣＤ４５陽性細胞をｐＨ５．４〜５．６の酸性溶液に暴露し、ＧＦＰ発現細胞を分取してＢ２７−ＬＩＦ培地で培養すると、最初の培養７日目で死細胞の数が増加するという。特許文献４では、ストレス処理および特定の培養により細胞の特徴を徐々に変化させ、Ｏｃｔ４を発現する首尾よく変化した細胞を選択できたと記載するが（特許文献４、段落「０１５８」）、７日間に亘る成長によって直径７０μｍの細胞塊を得るに過ぎない。したがって、サイズの大きな多能性幹細胞からなるスフェロイドを製造する方法や、用いた全ての体細胞を幹細胞化させる製造技術の開発が希求される。

また、非特許文献１は、リプロティン（Ｒｅｐｒｏｔｉｎ）と称される導入タンパク質を用いて培養し、多能性様幹細胞を調製するものである。遺伝子導入の操作が不要であるが、リプロティン（Ｒｅｐｒｏｔｉｎ）の構造は明らかでなく、再生医療や幹細胞治療等に使用するには安全性等が不十分である。したがって、細胞外化合物を添加することなく多能性幹細胞を調製できる方法の開発が望まれる。

上記現状に鑑み本発明は、簡便な方法で、分化した体細胞から多能性幹細胞マーカーを発現する多能性幹細胞様スフェロイドを製造する方法を提供することを目的とする。

また本発明は、直径０．１〜４ｍｍ、多クローン性の多能性幹細胞様スフェロイドを提供することを目的とする。

本発明者は、分化した線維芽細胞を酵素処理して個々に分離・浮遊させた球状化線維芽細胞を含む細胞懸濁液を調製し、この球状化細胞を細胞非接着性の細胞培養容器を用いて、高密度もしくは密着させた状態で静置培養すると細胞が凝集しはじめ、培養の経過時間に伴って凝集体が大型化してスフェロイドを形成すること、およびスフェロイドを構成する細胞は、Ｏｃｔ３／４、ＳＳＥＡ−３などの多能性幹細胞に特徴的なタンパク質を発現することを見出し、本発明を完成させた。この多能性幹細胞は、人工化合物やベクター/遺伝子の導入、強ストレス環境（低ｐＨや３７度より低いもしくは高い培養温度、低酸素状況等など）への曝露が不要である他、ホルモン、増殖因子、多能性誘導タンパク質、その他の多能性細胞誘導因子などの刺激因子も使用せずに、成熟した体細胞から多能性幹細胞の性質を示すスフェロイドを製造することができる。本発明者はこの多能性幹細胞をｎａｔｕｒａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌと名付けた。

すなわち、本発明は、分化した線維芽細胞をセリンプロテアーゼ処理して個々に分離された前記線維芽細胞を、１×１０^６個／ｍｌ〜２×１０^７個／ｍｌ、または１×１０^５個／ｃｍ^２〜７×１０^６個／ｃｍ^２の高い細胞密度で、ホルモン、増殖因子、多能性誘導タンパク質、および多能性細胞誘導因子からなる群から選択されるいずれか１種以上の刺激因子を使用せず、細胞非接着性細胞培養容器中、グルコース及びウシ胎児血清を含有するＤ−ＭＥＭ培地又はその等価培地において、ＣＯ_２を供給しつつ、３０〜４０℃で静置培養してスフェロイドを形成させ、
前記スフェロイドを構成する細胞の９５％以上に、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＰＡＲ４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、およびＡＬＰの多能性幹細胞マーカーを発現させることを特徴とする、多能性幹細胞スフェロイドの製造方法を提供するものである。

また、本発明は、前記スフェロイドの直径が０．５〜３ｍｍであることを特徴とする、前記多能性幹細胞スフェロイドの製造方法を提供するものである。

また、本発明は、分化した線維芽細胞をセリンプロテアーゼ処理して個々に分離された前記線維芽細胞を、１×１０^６個／ｍｌ〜２×１０^７個／ｍｌ、または１×１０^５個／ｃｍ^２〜７×１０^６個／ｃｍ^２の高い細胞密度で、ホルモン、増殖因子、多能性誘導タンパク質、および多能性細胞誘導因子からなる群から選択されるいずれか１種以上の刺激因子を使用せず、細胞非接着性細胞培養容器中、グルコース及びウシ胎児血清を含有するＤ−ＭＥＭ培地又はその等価培地において、ＣＯ_２を供給しつつ、３０〜４０℃で静置培養してスフェロイドを形成させることを特徴とする、
前記スフェロイドを構成する細胞の９５％以上に、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＰＡＲ４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、およびＡＬＰの多能性幹細胞マーカーを発現させる方法を提供するものである。

また、本発明は、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＰＡＲ４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、およびＡＬＰの多能性幹細胞マーカーを発現する細胞で構成される、線維芽細胞由来の多クローン性の多能性幹細胞スフェロイドを提供するものである。

本発明によれば、個々に分離して球状化させた生体細胞を高密度状態で細胞非接着性細胞培養容器中で静置培養することで、多能性幹細胞マーカーを発現する細胞で構成されるスフェロイドを形成することができる。

実施例１の結果を示す図であり、培養０時間、培養５時間後、培養１４時間後および培養２６時間後の微分干渉顕微鏡像である。 実施例２の結果を示す図であり、多能性幹細胞マーカーであるＡＬＰの発現の結果を示す図である。 実施例２の結果を示す図であり、多能性幹細胞マーカーであるＮＡＮＯＧの発現の結果を示す図である。 実施例２の結果を示す図であり、多能性幹細胞マーカーであるＯＣＴ３／４の発現の結果を示す図である。 実施例２の結果を示す図であり、多能性幹細胞マーカーであるＰＡＲ４の発現の結果を示す図である。 実施例２の結果を示す図であり、多能性幹細胞マーカーであるＳＳＥＡ−３の発現の結果を示す図である。 実施例２の結果を示す図であり、多能性幹細胞マーカーであるＳＳＥＡ−４の発現の結果を示す図である。 実施例２の結果を示す図であり、多能性幹細胞マーカーであるＳＯＸ２の発現の結果を示す図である。 実施例２の結果を示す図であり、多能性幹細胞マーカーであるＴＲＡ−１−６０の発現の結果を示す図である。 実施例２の結果を示す図であり、多能性幹細胞マーカーであるＴＲＡ−１−８１の発現の結果を示す図である。 実施例３の（４）の結果を示す図である。接着型細胞培養容器上に接着生存している通常形態のヒト皮膚線維芽細胞に、実施例３の工程（１）で得たスフェロイドを落下接着させて共培養した。スフェロイドは、通常形態のヒト皮膚線維芽細胞に移行（形質転換）した。図は、共培養開始時、共培養２時間後、共培養４時間後および共培養２６時間後の微分干渉顕微鏡像である。 実施例３の（５）の結果を示す図である。実施例３の工程（１）において６時間静置培養して得たスフェロイドを、接着系細胞用細胞培養容器を使用し、通常形態の接着型ヒト皮膚線維芽細胞を添加せずに培養した際の微分干渉顕微鏡像である。 実施例４の結果を示す図であり、酵素処理した球状化生体細胞の細胞懸濁溶液(３０μl、６０μl、１２５μl)を遠沈管に移行し、遠心操作により遠沈管底部に集積させた生体細胞の実体顕微鏡である。左は、培養開始時の遠沈管底に沈んでいる無数の球状化生体細胞培を示し、右は、培養により形成されたスフェロイドを示す。 実施例４の結果を示す図であり、酵素処理により分離し、球状化させた細胞を異なる量(２５０μl、５００μl)で遠沈管に移行させ、および培養した際の遠沈管底部の顕微鏡像である。左は、培養開始前の遠沈管底に沈んでいる無数の球状化生体細胞培を示し、右は、培養により形成されたスフェロイドを示す。 実施例５の結果を示す図であり、８μｌ、１０μｌの各液滴内の球状化生体細胞の培養開始時、１５時、２４時における細胞の複数の液滴および１液滴の実体顕微鏡像である。１液滴の画像は、同じ液滴を継時的に観察した結果である。 実施例５の結果を示す図であり、各液滴内の球状化生体細胞の培養開始時、１５時、２４時における細胞の複数の液滴および１液滴の実体顕微鏡像である。１液滴の画像は、同じ液滴を継時的に観察した結果である。なお、１〜５μｌの液滴の図面は、下から上に向かって１μｌ、２μｌ、３μｌ、５μｌの液滴を静置培養した図であり、１液滴の画像は、５μｌの液滴の結果である。 実施例６の結果を示す図である。 実施例７の結果を示す図であり、直径約０．１〜０．３ｍｍのスフェロイドの実体顕微鏡像である。 実施例７の結果を示す図であり、得られたスフェロイドのＤＮＡ染色像と多能性幹細胞マーカーであるＴＲＡ−１−８１、ＯＣＴ３／４およびＮＡＮＯＧの発現の結果を示す図である。蛍光顕微鏡像である。 比較例１の結果を示す図であり、接着系細胞用細胞培養容器を用いて低細胞密度状態で通常培養したヒト皮膚線維芽細胞の光学顕微鏡像である。 比較例２の結果を示す図であり、接着系細胞用細胞培養容器を用いた低細胞密度状態で培養したヒト皮膚線維芽細胞の培養開始および１９時間後の微分干渉顕微鏡像である。

本発明の第一は、分化した生体細胞を酵素処理して前記生体細胞を個々に分離し、個々に分離された前記生体細胞を、３×１０^５個／ｍｌ〜７×１０^８個／ｍｌの細胞密度で細胞非接着性細胞培養容器中で静置培養することを特徴とする、多能性幹細胞様スフェロイドの製造方法である。以下、本発明を詳細に説明する。

本明細書で使用する「生体細胞」とは、哺乳類の組織や臓器を構成する細胞を広く対象とすることができる。このような哺乳類として、例えば、ヒトやサルなどの霊長目、マウス、ラットなどのげっ歯目、ウサギなどの兎目、ウシなどの偶蹄目、ウマなどのウマ目、ブタなどの鯨偶蹄目、イヌ、ネコなどの食肉類を例示することができる。

本明細書で使用する生体細胞は、分化したものに限定される。「分化した生体細胞」とは、当該生体の発生時より専門化された細胞を意味し、最終分化した細胞と最終分化に至る前であるが発生時より専門化された細胞の双方を含むものとする。組織幹細胞は、最終組織細胞に分化することができるため、分化した生体細胞に含まれる。一方、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や胚性生殖幹細胞（ＥＧ細胞）は、「分化した生体細胞」に含まれない。本明細書における「分化した生体細胞」には、筋肉系組織、結合組織、循環系組織、排泄系組織、生殖系組織、骨、軟骨、脂肪、血液、骨髄、骨格筋、真皮、靭帯、腱、心臓などを構成する細胞があり、好ましくは、皮膚線維芽細胞、諸臓器に存在する線維芽細胞である。前記分化した生体細胞は、市販品でもよく、生体組織を物理的または化学的処理により構成する個々の細胞に分離し、密度勾配法などによって目的とする細胞を含む細胞を分取し、培地中で保存されたものであってもよい。

分化した生体細胞は、通常、その細胞にもっとも適した培地や培養容器で培養される。このような培地として、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ １０６６培地、グラスゴーＭＥＭ培地、ＩＭＤＭ培地、メディウム１９９培地、イーグルＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、Ｄ−ＭＥＭ培地、ハム培地、ＲＰＭＩ １６４０培地、フィッシャー培地などがある。また、接着系細胞用の培養容器としては、コラーゲン各種、フィブロネクチン、ラミニン、ゼラチン、エラスチン、プロテオグリカン、ビトロネクチン、各種ポリ-リシンなどの細胞外基質をコーティングしたプラスチック製またはガラス製の培養容器がある。また、細胞非接着性細胞培養容器としては、細胞接着性の細胞外基質がコーティングされていないプラスチック製またはガラス製の培養容器がある。使用する生体細胞に応じて適宜選択することができる。

本方法では、前記分化した生体細胞を、酵素処理により個々に分離させる。分離した生体細胞は培養液中で球状化し浮遊する。例えば、線維芽細胞は接着系細胞であり、培養時に培養容器に接着し、または細胞同士が接着する。このような培養容器や細胞間の接着を回避するため、酵素処理により個々の細胞に分離する。したがって、本明細書における「酵素処理」とは、生体細胞が個別に分離された細胞浮遊液を得る操作である。使用する酵素としては、トリプシン、キモトリプシンなどのセリンプロテアーゼ、ペプシンなどのアスパラギン酸プロテアーゼ、パパイン、キモパパインなどのシステインプロテアーゼ、サーモリシンなどの金属プロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、Ｎ−末端スレオニンプロテアーゼ、コラゲナーゼ、デスパーゼなどのプロテアーゼがある。本方法では、トリプシンが好適である。

酵素処理の条件は、接着細胞を扱う際に培養容器に接着した生体細胞をはがすために用いられる濃度であり、トリプシンであれば、０．１〜１質量％、より好ましくは０．１〜０．３質量％である。温度は、３０〜４０℃、より好ましくは３３〜３８℃である。処理時間は１〜６０分、好ましくは１〜３０分、より好ましくは２〜５分である。また、コラゲナーゼを使用する場合は、０．１〜０．６質量％、好ましくは０．２〜０．４質量％である。温度は、２５〜４０℃、より好ましくは３０〜４０℃である。また、処理時間は、３０分から２４時間である。いずれの酵素を使用する場合でも、酵素処理によって生体細胞が個々に分離した細胞浮遊液ができればよい。なお、使用する酵素の種類や処理方法によっては、生体細胞にストレスを負荷する場合がある。本方法における酵素処理の目的は、生体細胞を個々に分離させるものであり、ストレスを負荷するものではない。ストレス負荷の例として、前記特許文献３には、トリプシン中（０．２５％トリプシン−ＨＢＳＳ）で１６時間インキュベーション処理することは、ストレス刺激となる旨が記載されている。

なお、「分化した生体細胞」の培養培地や保存培地等に、上記酵素処理で使用する酵素の阻害剤が含まれる場合がある。その場合には、上記酵素処理に先立ち、細胞を酵素阻害剤が含まれない培養液やＰＢＳその他の緩衝液などで洗浄する事で阻害剤を取り除き、その後に酵素処理を行う。

細胞浮遊液に含まれる個々に分離された生体細胞は、球状である。この球状化した生体細胞を回収するには、遠心分離が好適である。通常、５００〜１，５００ｒｐｍで２〜５分間遠心し、上清を除去して沈殿する細胞を回収する。

ついで、前記回収した球状化した生体細胞を、細胞密度が、３×１０^５個／ｍｌ〜７×１０^８個／ｍｌ、好ましくは４×１０^５個／ｍｌ〜７×１０^７個／ｍｌ、より好ましくは５×１０^５個／ｍｌ〜３×１０^７個／ｍｌ、特に好ましくは１×１０^６個／ｍｌ〜２×１０^７個／ｍｌで静置培養する。一般に細胞は、接着培養系細胞と浮遊培養系細胞とに大別される。通常の細胞培養においては、接着培養系細胞は、ポリ−Ｌ−リシン等の接着物質がコーティングされた培養容器に播種し、容器に付着している状態で培養・増殖させる。一方、浮遊培養系細胞は、細胞非接着性細胞培養容器内で浮遊させた状態で培養させる。本方法では、分化した生体細胞が接着培養系であるか浮遊培養系であるかを問わず、静置培養を行う。なお、「静置培養」とは、培養液を撹拌しまたは旋回することなく培養することを意味する。

個々に分離された生体細胞は、線維芽細胞のように接着系細胞であっても溶液中で球状化し、浮遊する。一般に浮遊細胞は、培養容器に接着して成育・増殖しないため、ポリ−Ｌ−リシン等の接着物質のコーティングがない、細胞非接着性細胞培養容器が使用される。本方法では、個々に分離された生体細胞を静置培養する際に、前記生体細胞が接着系細胞である場合でも、球状化した生体細胞が容器へ接着するのを抑止するため、細胞非接着性細胞培養容器を使用する。例えば、ポリ−Ｄ−リシン、ポリ−Ｌ−リシン、２−メタクリロイルオキシエチルフォフフォリルコリン(2-Methacryloyloxyethyl Phosphoryl Choline)や、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（Poly(2-hydroxyethyl methacrylate))、コラーゲンなどがコーティングされていない、いわゆるノンコーティング容器が好適である。したがって、フィーダー細胞は不要である。

静置培養の際の容器の形状も制限はなく、例えば、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリディッシュ、細胞培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マルチプレート、マルチウェルプレート、チャンバースライド、シャーレ、試験管、遠沈管、トレイ、培養バッグ、ローラーボトル、プラスチック板、プラスチック製マイクロチューブなどを使用することができる。例えば、個々に分離された線維芽細胞を静置培養する場合は、平底の浮遊細胞培養用フラスコを使用してもよく、試験管や遠沈管などの容器底面が湾曲している深型容器で静置培養してもよい。平底で培養する際の好ましい細胞密度は、培地面積当たり１×１０^５個／ｃｍ^２〜７×１０^６個／ｃｍ^２程度が好ましい。深型容器の場合の培地面積当たりの細胞密度は、これより高濃度となるが、細胞密度が３×１０^５個／ｍｌ〜７×１０^８個／ｍｌで静置培養するのであれば、培地面積当たりの細胞数に限定はない。

個々に分離した細胞を上記細胞密度で静置培養すると、時間の経過に伴い細胞は培養液中を自然落下し、容器底に落下した細胞の上に他の細胞が積み重なって重層化する。上記した細胞密度条件下では、容器底に沈んだ最下層の細胞の上に積み重なる幾層もの細胞層ができあがり、培養溶液内で細胞同士が接触・接着する場合がある。

本方法の特徴は、個々に分離した生体細胞を静置培養する際、３×１０^５個／ｍｌ〜７×１０^８個／ｍｌの細胞密度に調整して培養を開始する点にある。哺乳動物細胞の基本的性質として、細胞培養容器に満杯つまりコンフルエントの状態が続くと、接着細胞は自然剥離し死を迎え、浮遊細胞もアポトーシスによる細胞死を迎える。細胞培養を行う際、培養容器や栄養原等の培養環境が整っていても、細胞同士が密着している高密度状態が継続すると、細胞は長期間生存することができない。正常細胞、各細胞株、ガン細胞を含む一般的な細胞高密度状態とは、培養容器の面積に対して、８×１０^３〜２×１０^４個／ｃｍ^２である。通常の細胞培養はこれよりも低い細胞密度状態で行うため、細胞同士が殆ど接触することなく、細胞の増殖能力の低下や細胞死への危険性等々が回避でき、細胞の恒常性や、用いた細胞種特有の細胞形態や性質を保持することができる。本方法では、高密度で静置培養するものであり、細胞密度は、平底容器の場合、１×１０^５個／ｃｍ^２〜７×１０^６個／ｃｍ^２であり、または溶液あたりの細胞密度は３×１０^５個／ｍｌ〜７×１０^８個／ｍｌである。通常、上記した細胞密度では、播種された細胞数が多すぎて細胞間の距離が近くもしくは密着状態となり、短期間でコンフルエント状態になる。このため、増殖能力の低下や細胞特異的形態の不全、細胞死への危険性が生ずる場合がある。しかしながら、個々に分離した球状化の生体細胞を細胞非接着性細胞培養容器を用いて、上記細胞密度で静置培養させると、培養液中で浮遊した細胞が経時的に自然落下して容器底で細胞同士が接触し、５〜８時間でスフェロイドを形成することが判明した。しかも驚いたことに、このスフェロイドを構成する細胞は、胚性幹細胞および多能性幹細胞のマーカーを発現するのである。なお、後記する実施例に示すように、細胞密度が３×１０^５個／ｍｌ未満の場合は、細胞非接着性細胞培養容器や接着系細胞用培養容器で静置培養しても、スフェロイドを形成しない。したがって、本方法は、分化した生体細胞からスフェロイドを形成させる方法、および分化した生体細胞由来のスフェロイドに、多能性幹細胞マーカーを発現させる方法といえる。

多能性幹細胞マーカーには、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、Ｏｃｔ−３／４、Ｋｌｆ４、Ｌｉｎ２８、ＴＲＡ−１−６０、ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−４、ｃ−Ｍｙｃ、ＰＡＲ４、ＴＲＡ−１−８１、ＳＳＥＡ−３、ＡＬＰなどがある。ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、Ｏｃｔ−３／４は、多能性幹細胞に必須のマーカーである。上記により形成されるスフェロイドは、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２およびＮＡＮＯＧからなる群から選択される少なくとも１種の多能性幹細胞マーカーと、ＰＡＲ４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４およびＡＬＰからなる群から選択される少なくとも１種の多能性幹細胞マーカーとを発現する。後記する実施例では、上記操作によって形成されたスフェロイドは、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２およびＯｃｔ−４を発現し、および、ＰＡＲ４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４およびＡＬＰを発現するものであった。多能性幹細胞マーカーを発現したことは、当該細胞が多能性状態に変化したことを示すものである。本明細書において、「多能性幹細胞様スフェロイド」とは、細胞の凝集体であり、前記凝集体を構成する細胞がＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２およびＮＡＮＯＧからなる群から選択される少なくとも１種の多能性幹細胞マーカーと、ＰＡＲ４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４およびＡＬＰからなる群から選択される少なくとも１種の多能性幹細胞マーカーとを発現するものとする。

多能性幹細胞は、その分化の経過に伴い異なる細胞種のマーカーを発現し、例えば、肝細胞に分化する場合には、アルブミンが発現されるようになる。最終的に分化した肝細胞は、アルブミンを発現し、多能性幹細胞マーカーの発現は消失する。異なる細胞種のマーカーの発現の程度や、多能性幹細胞マーカーの消失の程度は分化の程度などに応じて異なるが、胚性幹細胞および多能性幹細胞マーカーの発現は、いずれにも分化していない初期化状態にあることを意味する。上記により調製されたスフェロイドは、胚性幹細胞および多能性幹細胞マーカーを発現するため、初期化状態にある多能性幹細胞スフェロイドである。したがって、本方法は、分化した生体細胞を初期化する方法といえる。

本方法の多能性幹細胞様スフェロイドの製造方法は、長時間の酵素処理によるストレス負荷がなく、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ−Ｍｙｃなどの人工核酸やリプロティン（Ｒｅｐｒｏｔｉｎ）（非特許文献１参照）などの導入タンパク質を使用する必要がない。線維芽細胞で例示すれば、酵素処理によって個々に分離した球状化した線維芽細胞を３×１０^５個／ｍｌ〜７×１０^８個／ｍｌに調整し、１０％ウシ胎児血清を含有するＤ−ＭＥＭ培地を使用し、温度３０〜４０℃、より好ましくは３３〜３８℃、ＣＯ_２を供給しつつ、３時間から３０日間、より好ましくは５時間から１０日間、より好ましくは５時間〜７日間、細胞非接着性細胞培養容器中で静置培養すればよい。個々に分離し球状化した生体細胞を上記条件で培養すると、近傍の細胞同士が相互に凝集し、継時的に凝集体が増大し、ほぼ全ての生細胞が凝集したスフェロイドを形成する。

本方法の多能性幹細胞様スフェロイドを構成する細胞のうち、前記多能性幹細胞マーカーを発現する細胞の割合は、９５〜１００％である。また、操作工程でストレス負荷が無いため、死細胞がほとんど観察されない。静置培養する際の死細胞数は０〜５％と極めて低値である。これは、分化した生体細胞から９０〜１００％、より好ましくは９５〜９８％の変換率で、多能性幹細胞マーカーを発現する細胞へ変換できたことを意味する。

分化した生体細胞から多能性幹細胞マーカーを発現する細胞への変換率が高いため、静置培養する際に、細胞数を調製することで細胞数に対応してスフェロイドの直径を調整することができる。特に、試験管や遠沈管などを培養容器として静置培養すると経時的に細胞が一カ所に集合する。線維芽細胞であれば、細胞密度１．２５×１０^７個の細胞浮遊液の３０μｌを培養して直径約１ｍｍのスフェロイドを形成することができ、５００μｌを培養して直径約４ｍｍのスフェロイドを形成することができる。このように、異なる細胞数を静置培養することで、培養細胞数に応じて、直径０．１〜４ｍｍの多能性幹細胞様スフェロイドを製造することができる。このため、多能性幹細胞の抗体を用いた濃縮操作や、単一細胞に分離した後に浮遊培養してスフェロイドを増加させ、もしくは大型化させるなどの工程が不要である。この点、細胞塊の最大直径が約１５０μｍであるＭｕｓｅ細胞と相違する。

本方法で形成されたスフェロイドは、静置培養の際に近傍の細胞同士が凝集して形成されたものであり、１つの細胞が増殖して形成されたものではない。したがって、異なる細胞、すなわち異なるクローンが集合してなる「多クローン」といえる。しかも、前記細胞凝集は経時的かつ例外なく起こり、スフェロイドのサイズは凝集の経過とともに増大する。後記する実施例では、６時間という短時間で多能性幹細胞様スフェロイドを調製している。すなわち、球状化した線維芽細胞を調製すれば、静置培養という１ステップで多能性幹細胞様スフェロイドを短時間に、極めて大量に調製することができる。これに対し、特許文献３記載のＭｕｓｅ細胞は、ヒト皮膚線維芽細胞に１６時間のトリプシンによるインキュベーション処理というストレス刺激を与えて培養・選別し、得られた単一細胞を浮遊培養してなる富Ｍｕｓｅ細胞画分で形成される細胞塊である。培養により増殖しているため「単クローン」といえる。しかも、富Ｍｕｓｅ細胞画分の調製は容易ではなく、この画分から得た単一細胞を複数回の浮遊培養および接着培養を行うことで、Ｍｕｓｅ細胞の数を増やすというものである。多段階からなる細胞増殖操作が必要で、目的細胞数を獲得するのに長時間を要する。

本方法によれば、短時間で大量の多能性幹細胞様スフェロイドを調製することができる。しかも、例えば直径０．５ｍｍのスフェロイドは目視でき、かつ自重で沈降するため高価な遠心装置などを必要とせずに回収することができる。研究や治療で必要な時に必要な量だけ簡便に調製することができ、時間と経費を節約することができる。操作が簡便であるため、細胞へのストレスが少なく、不要の操作ミスを回避することができる。

本方法により調製した多能性幹細胞様スフェロイドは、再生医療に応用することができる。近年、特定の臓器を作ることのできないブタの胚盤胞に、被験者由来のｉＰＳ細胞を注入し、前記ｉＰＳ細胞由来の細胞からなる臓器をブタに再生させる技術が開発されている。ｉＰＳ細胞に代えて、被験者の分化した生体細胞から本方法で調製した多能性幹細胞様スフェロイドを使用すれば、癌化等の問題を回避して、臓器を再生させることができる。なお、被験者由来の幹細胞として自己の骨髄、胎盤、臍帯血、へその緒、羊膜などから得られる幹細胞があり、これを液体窒素などで超低温保存する「幹細胞バンク」もある。しかしながら、本方法によれば、被験者の線維芽細胞などの生体細胞から、多能性幹細胞様スフェロイドを調製できるため、凍結保存の必要がなく、かつ溶解時の生細胞数の低下などを問題とする必要もない。

本発明の第二は、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２およびＮＡＮＯＧからなる群から選択される少なくとも１種の多能性幹細胞マーカーと、ＰＡＲ４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４およびＡＬＰからなる群から選択される少なくとも１種の多能性幹細胞マーカーとを発現する細胞で構成される、直径０．１〜４ｍｍ、多クローン性の多能性幹細胞様スフェロイドである。この多能性幹細胞様スフェロイドは、分化した生体細胞を原料として本発明の第一によって製造できるが、これに限定されるものではない。従来、幹細胞を増殖してなる単クローン性のスフェロイドは存在し、例えばＭｕｓｅ細胞の場合は直径約１５０μｍであった。Ｍｕｓｅ細胞は、爆発的増殖を防ぐための多重のセキュリティーシステムを有する。このため大型のスフェロイドを調製することは容易でない。これに対し、本発明の多能性幹細胞様スフェロイドは、直径約０．１〜４ｍｍ、より好ましくは０．５〜３ｍｍである。従来のスフェロイドと比較して大型であるため細胞増殖により大型化する必要がない。

本発明の多能性幹細胞様スフェロイドは、多能性幹細胞マーカーを発現し、多能性幹細胞として機能し、あらゆる組織・細胞種へと分化し得る。再生医療等に用いることができる。本発明の多能性幹細胞様スフェロイドは、スフェロイドを移植などに使用することもでき、多能性幹細胞様スフェロイドの細胞浮遊液を調製し、組織に付着させ増殖させ、様々な臓器細胞種へ利用できる。例えば、移植組織として皮膚、脳脊髄、肝臓、筋肉等がある。本発明の多能性幹細胞様スフェロイドを損傷あるいは障害を受けた組織、器官等に直接あるいは近傍に投与することにより、多能性幹細胞マーカーを発現する細胞がその組織、器官内に侵入し、その組織特有の細胞に分化し、組織や器官を再生し得る。

投与は、皮下注入、静脈や動脈への注入、筋肉注入、腹腔内注入、損傷もしくは欠損した臓器内組織への直接注入等の非経口投与、胚への子宮内注入等により行うことができる。投与量は、再生しようとする臓器内器官や組織の種類・希望する大きさ、再生する程度により適宜決定することができる。

また、本発明の多能性幹細胞様スフェロイドを予め分化誘導し、分化した細胞を再生医療に用いることもできる。後記する実施例６に示すように、スフェロイド培養後のサイズを経時的に評価したところ、培養後６７時間時に最大となり、その後培養９４時間時まで形質転換時のサイズを維持していた。本発明の多能性幹細胞様スフェロイドは、腫瘍化遺伝子などを導入して調製したものでなく、かつ培養後にサイズ増加で推察される腫瘍化が観察されないことから、予め分化誘導したものを再生医療に使用しても癌化の可能性が極めて低い。

本発明の多能性幹細胞様スフェロイドは、疾病のメカニズム解明等の基礎的研究、治療薬開発、薬剤の効果や毒性に関するスクリーニング、薬剤評価などに使用することができる。例えば、多能性幹細胞様スフェロイドからできた胚様体様細胞塊、多能性幹細胞様スフェロイドや前記胚様体様細胞塊から分化させて得られた細胞、組織や器官を薬剤評価や薬剤スクリーニングの材料として用いることができる。例えば、本発明の多能性幹細胞様スフェロイドは、分化誘導因子として、塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）およびイソプロテレノール、または繊維芽細胞成長因子４（ＦＧＦ４）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）等を培地に添加して培養することで分化誘導して目的の細胞を得ることができる。一方、本発明の多能性幹細胞様スフェロイドに各種の因子を添加して分化の有無を評価し、分化誘導因子の同定に使用することができる。本発明の多能性幹細胞様スフェロイドを使用することで、各細胞種への分化誘導や運命決定因子の研究を促進させることができる。

本発明によれば、外来遺伝子の導入、転写物、タンパク質、核成分、細胞質、その他の外来リプログラミング因子の使用なしに、分化した生体細胞から多能性幹細胞マーカーを発現するスフェロイドを得ることができる。しかしながら、多能性幹細胞マーカーを発現する理由は不明である。この現象をリプログラミングとすれば、従来の細胞培養との相違は、細胞の培養条件において、高密度もしくは接触状態で培養する点のみである。高密度・接触培養が、一種のストレス負荷と考えることもできるが、生体内の細胞はそもそも接触生存しているためストレスとは考えにくく、実施例においても培養中の死細胞数もほとんどない。上記現象をリプログラミングと解しても、現時点で本発明の多能性幹細胞様スフェロイドにおけるリプログラミング発現機構は不明である。

次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は何ら本発明を制限するものではない。

（実施例１）
（１）接着系細胞用細胞培養シャーレ（住友ベークライト株式会社、商品名「細胞培養用シャーレ９０φ（深型）」）を使用し、１．５×１０^６個のヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ、クラボウ社より購入）を、Ｄ−ＭＥＭ培地（Ｈｉｇｈ Ｇｌｕｃｏｓｅ、和光純薬工業株式会社、１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン含有）１０ｍｌ、３７℃、５％ＣＯ_２の条件で８０％コンフルエントになるまで４８時間培養した。
（２）前記シャーレ内の同Ｄ−ＭＥＭ培地をアスピレーターで除去し、０.０１Ｍのリン酸緩衝液（ＰＢＳ）を１５ｍｌ入れて撹拌し、残存するウシ胎児血清成分を含むＤ−ＭＥＭ培地を取り除き、接着するヒト皮膚線維芽細胞の洗浄を行った。
（３）同ＰＢＳ洗浄細胞にトリプシンを５００μｌ加え、３７℃、３分処理し、接着していた細胞を剥がし個々に分離した。次いで、同Ｄ−ＭＥＭ培地を５ｍｌ加えトリプシン反応を停止させた後、１５ｍｌ遠沈管に移して１，０００ｒｐｍで５分間遠心し、沈殿した３．９×１０^６個の個々に分離したヒト皮膚線維芽細胞を得た。
（４）遠沈して得られた個々に分離したヒト皮膚線維芽細胞に同Ｄ−ＭＥＤ培地３ｍｌを加え、その１．５ｍｌ（２×１０^６個）の細胞懸濁液を、ガラスボトムディッシュ（株式会社ＦＰＩ社製、ノンコーティング、ホール径１．４ｍｍ、培養面積９．６ｃｍ^２）に移し、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で静置培養した。なお、培養面積当たりの細胞密度は、２．１×１０^５／ｃｍ^２である。培養開始後２４時間において殆ど全ての前記ヒト皮膚線維芽細胞から直径約０．１ｍｍのスフェロイドが無数に形成された。結果を図１に示す。図１は、培養開始時、培養５時間後、培養１４時間後、および培養２６時間後の微分干渉顕微鏡像である。死細胞はほとんど観察されなかった。

（実施例２）
（１）接着系細胞用細胞培養シャーレ（住友ベークライト株式会社、商品名「細胞培養用シャーレ９０φ（深型）」）２枚と接着系細胞用細胞培養シャーレ（住友ベークライト株式会社、商品名「細胞培養用シャーレ６０φ」）１枚とを使用し、それぞれ２×１０^６個と０．６×１０^６個のヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ、クラボウ社より購入）をＤ−ＭＥＭ培地（Ｈｉｇｈ Ｇｌｕｃｏｓｅ、和光純薬工業株式会社、１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン含有）１０ｍｌと３ｍｌを用いて、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で４８時間培養した。実施例１の工程（２）および（３）に準じて細胞の洗浄とトリプシン処理を行い、これを合一して、１．８７×１０^７個の個々に分離されたヒト皮膚線維芽細胞を得た。
（２）遠心操作（１，０００ｒｐｍ、５分間）にて得られたヒト皮膚線維芽細胞沈渣に同Ｄ−ＭＥＭ培地５ｍｌを加えて細胞懸濁液を調製し、その１．５ｍｌを９６ウェルプレート用の蓋部（ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ−ｏｎｅ社製、商品名「ＬＩＤ ＦＯＲ ＭＩＣＲＯＰＬＡＴＥ、ノンコーティング」、蓋部面積４．８４ｃｍ^２）に同細胞懸濁液を乗せた。これを、３７℃、５％ＣＯ_２の条件で２４時間、静置培養した。細胞密度は、３．７×１０^６個／ｍｌ、約１．２×１０^６個/ｃｍ^２であった。上記蓋上部におけるヒト皮膚線維芽細胞の殆ど全てから多数のスフェロイドが形成された。
（３）スフェロイドを含む浮遊液を０．５ｍｌのマイクロチューブ９本に１５０μｌづつ分注し、多能性幹細胞のマーカータンパク質に特異的な抗体を用いた免疫細胞化学染色法にて、ＯＣＴ３／４、ＰＡＲ４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、ＡＬＰ、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ等のタンパク質の発現を確認した。その結果、全ての細胞においてＯＣＴ３／４、ＰＡＲ４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、ＡＬＰ、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧの全てが陽性であることが判明した。結果を図２〜図１０に示す。なお、各幹細胞マーカーを検出した図において、左上は微分干渉顕微鏡像（ＤＩＣ像）、左下は４’，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅで染色し、蛍光顕微鏡で観察した像（ＤＡＰＩ像）、右下は各多能性幹細胞のマーカータンパク質を蛍光色素（Ａｌｅｘａ４８８）にて染色し、蛍光顕微鏡で観察した像（蛍光色素像）、右上はＤＡＰＩ像と蛍光色素像を重ね合わせた像である。

なお、スフェロイドを形成していない通常形態のヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ、クラボウ社より購入）について上記と同様に免疫細胞化学染色法にて、ＯＣＴ３／４、ＰＡＲ４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、ＡＬＰ、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ等のタンパク質の発現を評価した。しかしながら、何れの多能性幹細胞マーカーも発現していなかった。

（実施例３）
（１）４枚の接着系細胞用細胞培養シャーレ（住友ベークライト株式会社製、商品名「細胞培養用シャーレ９０φ（深型）」）を用いて、実施例１の（１）〜（３）と同様に操作して１．１×１０^７個の個々に分離されたヒト皮膚線維芽細胞を得た。得られたヒト皮膚線維芽細胞にＤ−ＭＥＭ培地（Ｈｉｇｈ Ｇｌｕｃｏｓｅ、和光純薬工業株式会社、１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン含有）１０ｍｌを加えて細胞懸濁液を調製し、その５００μｌ（５．５×１０^５個）を浮遊培養用マルチプレート（住友ベークライト株式会社製、商品名「浮遊培養用プレート１２Ｆ（独立ウェル）フタ付」、ノンコーティング、平底、１ウェル底面積：３．６ｃｍ^２）に移し、３７℃、５％ＣＯ_２で９時間、静置培養した。細胞密度は、１．１×１０^６個／ｍｌ、１．５×１０^５個/ｃｍ^２である。培養により、ヒト皮膚線維芽細胞からスフェロイドが形成された。
（２）工程（１）で調製した細胞懸濁液２００μｌを、チャンバースライド（ＡＧＣテクノグラス社ＩＷＡＫＩ製、商品名「チャンバースライドＩＩ」、コラーゲンコーチィング、１ウェル底面積：９ｃｍ^２）に移し、同Ｄ−ＭＥＭ培地を１ｍｌ加えて３７℃、５％ＣＯ_２で９時間、静置培養した。細胞密度は、１．８×１０^５個/ｍｌ、２．４×１０^４個/ｃｍ^２である。培養されたヒト皮膚線維芽細胞は、スライドグラスに接着した通常のヒト皮膚線維芽細胞の形態をとった。
（３）実施例３の工程（１）で得たスフェロイドを１．５ｍｌマイクロチューブに回収し、６，２００ｒｐｍで１０秒間遠心し、スフェロイドのペレットを得た。
（４）実施例３の工程（２）で得た通常のヒト皮膚線維芽細胞に、実施例３の工程（３）で回収したスフェロイドのペレットを加えて、２６時間共培養した。共培養により、通常形態のヒト皮膚線維芽細胞と接したスフェロイドは、経時的に通常のヒト皮膚線維芽細胞に変化した。結果を図１１に示す。図１１は、共培養開始時、２時間後、４時間後、２６時間後の微分干渉顕微鏡像である。

（５）実施例３の工程（１）において６時間静置培養してスフェロイドを調製した。このスフェロイドを回収し、チャンバースライド（ＡＧＣテクノグラス社ＩＷＡＫＩ製、商品名「チャンバースライドＩＩ」、コラーゲンコーチィング、１ウェル）にてＤ−ＭＥＭ培地（Ｈｉｇｈ Ｇｌｕｃｏｓｅ、和光純薬工業株式会社、１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン含有）を用いて、通常形態のヒト皮膚線維芽細胞を含まない環境で培養した。その結果、スフェロイドは細胞凝集塊の形状を維持した。この結果を図１２に示す。図１２は、接着細胞用培養器による培養開始時、培養開始後２時間、培養開始後４時間、および培養開始後２３時間の微分干渉顕微鏡像である。接着系細胞用細胞培養容器を使用し、２３時間培養した後でも、スフェロイドは線維芽細胞に戻らなかった。

（実施例４）
（１）実施例２と同様に操作して、１．２５×１０^７個の個々に分離したヒト皮膚線維芽細胞を得た。これを１ｍｌのＤ−ＭＥＭ培地に懸濁した。
（２）懸濁液を１．５ｍｌの遠沈管に、３０μｌ（３．８×１０^５個）、６０μｌ（７．５×１０^５個）、１２５μｌ（１．６×１０^６個）、２５０μｌ（３．１×１０^６個）、５００μｌ（６．３×１０^６個）移して、１，０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を除去した。最終容量が９０μｌとなるようにＤ−ＭＥＭ培地を各試験管に添加し、３７℃、５％ＣＯ_２の条件で１５時間静置培養した。いずれの試験管でも１個のスフェロイドが形成され、その直径は、それぞれ１ｍｍ、１．４ｍｍ、１．８ｍｍ、２．８ｍｍ、４ｍｍであった。結果を図１３、図１４に示す。

（実施例５）
（１）実施例１と同様に操作して、３×１０^６個の個々に分離したヒト皮膚線維芽細胞を得た。これを１ｍｌのＤ−ＭＥＭ培地に懸濁し細胞懸濁液を調製した。
（２）９６ウェルプレート用の蓋部（ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ−ｏｎｅ社製、商品名「Ｌ ＩＤ ＦＯＲ ＭＩＣＲＯＰＬＡＴＥ、ノンコーティング」に、同細胞懸濁液を、１μｌ、２μｌ、３μｌ、５μｌ（１．５×１０^４個）、８μｌ（２．４×１０^４個）、１０μｌ（３×１０^４個）滴下し、３７℃、５％ＣＯ_２の条件で液滴状で静置培養を行った。結果を図１５、図１６に示す。図１５および図１６は、各液滴の培養開始時、培養後１５時間後、培養後２４時間後の細胞の各液滴、およびある１液滴の実体顕微鏡像である。１液滴の画像は、同じ液滴を継時的に観察した結果である。なお、図１６の１〜５μｌの各ウェルプレートの図面は、下から上に向かって１μｌ、２μｌ、３μｌ、５μｌの液滴を静置培養した図であり、１液滴の画像は、５μｌの液滴の結果である。

（実施例６）
実施例１と同様に操作して、７．５×１０^６個の個々に分離したヒト皮膚線維芽細胞の細胞懸濁液を得た。これにＤ−ＭＥＭ培地（Ｈｉｇｈ Ｇｌｕｃｏｓｅ、和光純薬工業株式会社、１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン含有）１５ｍｌを添加して５×１０^５個／ｍｌの細胞懸濁液を得た。その２５μｌを、浮遊細胞培養用９６ウェルプレート（住友ベークライト株式会社製、商品名「マルチプレート９６Ｕフタ付」、ウェル容量０．３ｍｌ）の１ウェル内に播種し、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で１７時間、３６時間、６７時間、９４時間静置培養した。同一ウェル画像の結果を図１７に示す。培養開始から経時的に複数個のスフィアが形成され、６７時間後には融合した大型のスフェロイドが形成されていた。ただし、９４時間後のスフェロイドのサイズは、６７時間時のものと同等であった。

（実施例７）
ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ、クラボウ社より購入）に代えてヒト正常皮膚繊維芽細胞（ＣＣＤ−１０７９ＳＫ）を使用した以外は、実施例１と同様に操作した。９時間の培養で、スフェロイドの形成が確認された。結果を図１８に示す。図１８は、最大直径約０．１〜０．３ｍｍのスフェロイドの実体顕微鏡像である。

また、実施例２の工程（３）と同様に操作して、多能性幹細胞のマーカータンパク質に特異的な抗体を用いた免疫細胞化学染色法にて、ＯＣＴ３／４、ＴＲＡ−１−８１およびＮＡＮＯＧのタンパク質の発現を確認した。結果を図１９に示す。ヒト正常皮膚繊維芽細胞（ＣＣＤ−１０７９ＳＫ）から得たスフェロイドも、ＯＣＴ３／４、ＴＲＡ−１−８１およびＮＡＮＯＧを発現し、多能性幹細胞様スフェロイドと考えられた。

(比較例１)
実施例１の工程（３）で得た個々に分離したヒト皮膚線維芽細胞３．７×１０^６個にＤ−ＭＥＭ培地（Ｈｉｇｈ Ｇｌｕｃｏｓｅ、和光純薬工業株式会社、１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン含有）１５ｍｌを加えて細胞密度を２．５×１０^５／ｍｌとし、その１．１ｍｌをスライドチャンバー（ＡＧＣテクノグラス社製、タイプＩコラーゲンコーティング、１ウェルの面積８．３６ｃｍ^２）に入れ、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で静置培養した。培養面積当たりの細胞密度は、３．３×１０^４／ｃｍ^２である。１５時間の培養でも、スフェロイドは形成されなかった。結果を図２０に示す。図２０は光学顕微鏡像である。

(比較例２)
実施例１の工程（３）で得た個々に分離したヒト皮膚線維芽細胞１．２×１０^７個にＤ−ＭＥＭ培地（Ｈｉｇｈ Ｇｌｕｃｏｓｅ、和光純薬工業株式会社、１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン含有）１０ｍｌを加えて細胞密度を１．２×１０^６／ｍｌとし、その２０μｌと前記Ｄ−ＭＥＤ培地１ｍｌとをガラスボトムディッシュ（株式会社ＦＰＩ社製、ノンコーティング、ホール径１．４ｍｍ、培養面積９．６ｃｍ^２）に入れ、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で静置培養した。培養面積当たりの細胞密度は、２．５×１０^３／ｃｍ^２である。１９時間の培養を行うと微弱ながら接着生存するが、スフェロイドは形成しなかった。培養開始および１９時間後の微分干渉顕微鏡像を図２１に示す。

（結果）
（１）実施例１、図１に示すように、個々に単離されたヒト皮膚線維芽細胞を高密度、浮遊状態で静置培養すると、経時的に近傍にある細胞が凝集してスフェロイドを形成した。形成されたスフェロイドは、１つの細胞が増殖する事より形成されるものではなく、近位細胞同士の凝集により派生するものであった。したがって、複数の細胞が集合して形成される多クローン性のスフェロイドである。なお、実施例７に示すように、同細胞種他細胞株のヒト正常皮膚繊維芽細胞でも同様にスフェロイドが形成された。
（２）実施例２、図２〜図１０に示すように、スフェロイドを構成する細胞は、多能性幹細胞マーカーを発現した。しかも、スフェロイドを構成する細胞の約１００％が多能性幹細胞マーカーを発現するものであり、極めて高率に、生体細胞が多能性様細胞へ変化するものであった。
（３）実施例３に示すように、多能性幹細胞様スフェロイドを通常のヒト皮膚線維芽細胞と共培養すると通常のヒト皮膚線維芽細胞に変化するが、ヒト皮膚線維芽細胞が存在しないと接着細胞用培養器を用いて培養しても、通常の線維芽細胞に形質転換することなく、そのままスフェロイドの形態を維持した。ヒト皮膚線維芽細胞の分泌成分や細胞間相互作用による刺激が、多能性幹細胞から分化細胞へ誘導する可能性が示唆された。
（４）実施例６から、本発明の多能性幹細胞様スフェロイドは細胞増殖性が無いことが示された。このことは、本発明の多能性幹細胞様スフェロイドは癌化作用が無いことを示すものといえる。癌化細胞であれば、倍加時間は約２４時間であるため２４時間培養後に２倍になり、４日間の培養で１６倍になる。なお、４日間の培養によっても癌化細胞にみられる増殖性並びに癌化細胞は検出されていない。
（５）実施例５に示すように、同じ細胞密度の細胞懸濁液を使用し、液滴量を変えて浮遊状態で静置培養すると、図１５、図１６に示されるように、液滴量、すなわち細胞量に対応してスフェロイド量が増大した。細胞数を増大させることで多数のスフェロイドを調製できることが示された。また、培養開始後２４時間の全ての液滴においてスフィロイドが形成されている事より、その再現性が確認された。
（６）実施例４に示すように、浮遊状態で静置培養する際に、遠沈管などの細胞が集合しやすい形状の培養容器を使用することで直径の大きなスフェロイドが形成されることが判明した。実施例５と総合すれば、培養細胞数および培養容器の形状を選択することで、スフェロイドの数やサイズを調整することができる。
（７）比較例１、比較例２に示すように、細胞密度２．５×１０^５／ｍｌを下回るとスフェロイドの形成はない。この際の培地面積当たりの細胞密度は、３．３×１０^４個／ｃｍ^２であるから、３．３×１０^４個／ｃｍ^２を下回ると、スフェロイドの形成はないといえる。なお、２×１０^６個／ｍｌの細胞密度、培地面積当たりの細胞密度２．１×１０^５個／ｃｍ^２ という細胞密度で培養する実施例１と比較すると、本発明は、３×１０^５個／ｍｌ〜７×１０^８個／ｍｌの細胞密度、または１×１０^５個／ｃｍ^２〜７×１０^６個／ｃｍ^２の細胞密度で浮遊状態で静置培養するという簡便な方法で多能性幹細胞様スフェロイドを形成できる方法といえる。

本発明は２０１６年３月４日に出願された日本国特許出願２０１６−０４２１２６号に基づく。本明細書中に日本国特許出願２０１６−０４２１２６号の明細書、特許請求の範囲、図面全体を参照として取り込むものとする。

［付記］
［付記１］
分化した生体細胞を酵素処理して前記生体細胞を個々に分離し、
個々に分離された前記生体細胞を、３×１０^５個／ｍｌ〜７×１０^８個／ｍｌの細胞密度で細胞非接着性細胞培養容器中で静置培養することを特徴とする、多能性幹細胞様スフェロイドの製造方法。

［付記２］
前記酵素処理は、前記分化した生体細胞をトリプシン濃度０．１〜１％の溶液で１〜６０分処理するものである、付記１記載の多能性幹細胞様スフェロイドの製造方法。

［付記３］
前記分化した生体細胞は、線維芽細胞である、付記１または２のいずれかに記載の多能性幹細胞様スフェロイドの製造方法。

［付記４］
前記多能性幹細胞様スフェロイドは、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２およびＮＡＮＯＧからなる群から選択される少なくとも１種の多能性幹細胞マーカーと、ＰＡＲ４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、およびＡＬＰからなる群から選択される少なくとも１種の多能性幹細胞マーカーとを発現することを特徴とする、付記１〜３のいずれかに記載の多能性幹細胞様スフェロイドの製造方法。

［付記５］
前記分離した生体細胞を、３×１０^５個／ｍｌ〜７×１０^８個／ｍｌの細胞密度で細胞非接着性細胞培養容器中で静置培養し、前記細胞数に対応する直径０．１〜４ｍｍのスフェロイドを形成することを特徴とする、付記１〜４のいずれかに記載の多能性幹細胞様スフェロイドの製造方法。

［付記６］
ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２およびＮＡＮＯＧからなる群から選択される少なくとも１種の多能性幹細胞マーカーと、ＰＡＲ４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４およびＡＬＰからなる群から選択される少なくとも１種の多能性幹細胞マーカーとを発現する細胞で構成される、直径０．１〜４ｍｍ、多クローン性の多能性幹細胞様スフェロイド。

［付記７］
分化した生体細胞を酵素処理して前記生体細胞を個々に分離し、
個々に分離された前記生体細胞を、培地面積当たり１×１０^５個／ｃｍ^２〜７×１０^６個／ｃｍ^２の細胞密度で平底の細胞非接着性細胞培養容器中で静置培養することを特徴とする、多能性幹細胞様スフェロイドの製造方法。

［付記８］
分化した生体細胞を酵素処理して前記生体細胞を個々に分離し、
個々に分離された前記生体細胞を、３×１０^５個／ｍｌ〜７×１０^８個／ｍｌの細胞密度で細胞非接着性細胞培養容器中で静置培養してスフェロイドを形成させることを特徴とする、多能性幹細胞マーカーの発現方法。

Claims (4)

1. 分化した線維芽細胞をセリンプロテアーゼ処理して個々に分離された前記線維芽細胞を、１×１０^６個／ｍｌ〜２×１０^７個／ｍｌ、または１×１０^５個／ｃｍ^２〜７×１０^６個／ｃｍ^２の高い細胞密度で、ホルモン、増殖因子、多能性誘導タンパク質、および多能性細胞誘導因子からなる群から選択されるいずれか１種以上の刺激因子を使用せず、細胞非接着性細胞培養容器中、グルコース及びウシ胎児血清を含有するＤ−ＭＥＭ培地又はその等価培地において、ＣＯ_２を供給しつつ、３０〜４０℃で静置培養してスフェロイドを形成させ、
   前記スフェロイドを構成する細胞の９５％以上に、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＰＡＲ４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、およびＡＬＰの多能性幹細胞マーカーを発現させることを特徴とする、多能性幹細胞スフェロイドの製造方法。
2. 前記スフェロイドの直径が０．５〜３ｍｍであることを特徴とする、請求項１に記載の多能性幹細胞スフェロイドの製造方法。
3. 分化した線維芽細胞をセリンプロテアーゼ処理して個々に分離された前記線維芽細胞を、１×１０^６個／ｍｌ〜２×１０^７個／ｍｌ、または１×１０^５個／ｃｍ^２〜７×１０^６個／ｃｍ^２の高い細胞密度で、ホルモン、増殖因子、多能性誘導タンパク質、および多能性細胞誘導因子からなる群から選択されるいずれか１種以上の刺激因子を使用せず、細胞非接着性細胞培養容器中、グルコース及びウシ胎児血清を含有するＤ−ＭＥＭ培地又はその等価培地において、ＣＯ_２を供給しつつ、３０〜４０℃で静置培養してスフェロイドを形成させることを特徴とする、
   前記スフェロイドを構成する細胞の９５％以上に、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＰＡＲ４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、およびＡＬＰの多能性幹細胞マーカーを発現させる方法。
4. ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＰＡＲ４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、およびＡＬＰの多能性幹細胞マーカーを発現する細胞で構成される、線維芽細胞由来の多クローン性の多能性幹細胞スフェロイド。

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