JP2003339373A - 細胞の分別法 - Google Patents
細胞の分別法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】足場依存性細胞の培養及び分別回収を、細胞に
対するダメージを与えることなく、細胞の各器官の特異
的機能維持したまま、しかも簡便な操作で行いうる手段
を提供する。 【解決手段】 光照射により物性が変化する光応答性材
料を足場依存性細胞の接着性表面として用い、該細胞接
着性表面の細胞の位置に光を照射することにより、該位
置の細胞のみを選択的にしかも細胞外マトリクスや膜タ
ンパク質を保持したまま、剥離させて分別回収する。
対するダメージを与えることなく、細胞の各器官の特異
的機能維持したまま、しかも簡便な操作で行いうる手段
を提供する。 【解決手段】 光照射により物性が変化する光応答性材
料を足場依存性細胞の接着性表面として用い、該細胞接
着性表面の細胞の位置に光を照射することにより、該位
置の細胞のみを選択的にしかも細胞外マトリクスや膜タ
ンパク質を保持したまま、剥離させて分別回収する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、光照射によって細
胞との接着性が変化する細胞接着性表面の形成用材料、
該細胞接着性表面を有する細胞培養装置、該装置を使用
した細胞の培養・分別方法及び細胞の培養・分別装置に
関する。
胞との接着性が変化する細胞接着性表面の形成用材料、
該細胞接着性表面を有する細胞培養装置、該装置を使用
した細胞の培養・分別方法及び細胞の培養・分別装置に
関する。
【０００２】
【従来の技術】従来の細胞分別技術としては、フローサ
イトメトリー（FACS）や磁気細胞分離システム（MACS）
があり、これらは既に実用化されている。一方、培養さ
れた足場依存性細胞の回収に関する従来技術としては、
細胞接着物質や膜タンパクを分解せず、その器官特異的
機能を維持したまま細胞をシート状態で剥離・回収する
手法が報告されている（A.Kikuchi, M.Okuhara, F.Kari
kusa, Y.Sakurai and T.Okano, J. Biomater.S ci., Po
lym. Edn., 9,1331 (1998)）。一方、電子線リソグラフ
ィー等の微細加工の手法を用いて、培養容器に接着基質
をパターニングして、生理活性物質や人工化合物を接着
基質に導入し、細胞の接着条件と生理活性への影響を解
析した例も報告されている（伊藤嘉浩, タンパク質 核
酸 酵素, 45, 727 (2000)）。
イトメトリー（FACS）や磁気細胞分離システム（MACS）
があり、これらは既に実用化されている。一方、培養さ
れた足場依存性細胞の回収に関する従来技術としては、
細胞接着物質や膜タンパクを分解せず、その器官特異的
機能を維持したまま細胞をシート状態で剥離・回収する
手法が報告されている（A.Kikuchi, M.Okuhara, F.Kari
kusa, Y.Sakurai and T.Okano, J. Biomater.S ci., Po
lym. Edn., 9,1331 (1998)）。一方、電子線リソグラフ
ィー等の微細加工の手法を用いて、培養容器に接着基質
をパターニングして、生理活性物質や人工化合物を接着
基質に導入し、細胞の接着条件と生理活性への影響を解
析した例も報告されている（伊藤嘉浩, タンパク質 核
酸 酵素, 45, 727 (2000)）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】フローサイトメトリー
あるいは磁気細胞分離システムは、白血球あるいはリン
パ球等の浮遊細胞の分別回収によく用いられているもの
であって、これら手段を足場依存性細胞の分別回収に適
用する場合においては、基質に接着した足場依存性細胞
を浮遊状態にする必要があり、この際、トリプシン等の
酵素処理によって細胞接着物質とともに細胞機能を担う
膜タンパクも分解される点が、回収細胞を利用する際の
問題となっていた。特に、フローサイトメトリーでは、
細胞を超音波ノズルで物理的に分離するプロセスにおい
て、細胞の受けるダメージが相当に大きい。一方、培養
した足場依存性細胞をシート状態で剥離・回収する技術
では、温度変化によって接着制御を行うため、培養容器
中の種々の細胞あるいは細胞群のうちから、特定の細胞
あるいは細胞群（コロニー）のみを回収しようとする場
合において、個々の細胞あるいは細胞群毎にその脱着を
制御することは極めて困難であった。そのため、培養さ
れた足場依存性細胞を分別回収する技術として、細胞の
精密分離と分離された細胞の器官特異的機能の維持を両
立させるものはこれまで実現されていなかった。また、
上記接着基質のパターニングに関する例においては、細
胞の接着性に変化が見られているが、これは生理活性物
質等の導入によるもので、これらの物質の使用なしに細
胞の接着性を自在に制御することはできなかった。そこ
で、本発明の課題は、特に足場依存性細胞の培養及び分
別回収を、細胞に対するダメージを与えることなく、細
胞の各器官の特異的機能維持したまま、しかも簡便な操
作で行いうる手段を提供しようとするものである。
あるいは磁気細胞分離システムは、白血球あるいはリン
パ球等の浮遊細胞の分別回収によく用いられているもの
であって、これら手段を足場依存性細胞の分別回収に適
用する場合においては、基質に接着した足場依存性細胞
を浮遊状態にする必要があり、この際、トリプシン等の
酵素処理によって細胞接着物質とともに細胞機能を担う
膜タンパクも分解される点が、回収細胞を利用する際の
問題となっていた。特に、フローサイトメトリーでは、
細胞を超音波ノズルで物理的に分離するプロセスにおい
て、細胞の受けるダメージが相当に大きい。一方、培養
した足場依存性細胞をシート状態で剥離・回収する技術
では、温度変化によって接着制御を行うため、培養容器
中の種々の細胞あるいは細胞群のうちから、特定の細胞
あるいは細胞群（コロニー）のみを回収しようとする場
合において、個々の細胞あるいは細胞群毎にその脱着を
制御することは極めて困難であった。そのため、培養さ
れた足場依存性細胞を分別回収する技術として、細胞の
精密分離と分離された細胞の器官特異的機能の維持を両
立させるものはこれまで実現されていなかった。また、
上記接着基質のパターニングに関する例においては、細
胞の接着性に変化が見られているが、これは生理活性物
質等の導入によるもので、これらの物質の使用なしに細
胞の接着性を自在に制御することはできなかった。そこ
で、本発明の課題は、特に足場依存性細胞の培養及び分
別回収を、細胞に対するダメージを与えることなく、細
胞の各器官の特異的機能維持したまま、しかも簡便な操
作で行いうる手段を提供しようとするものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を達成するために鋭意研究を重ねた結果、光照射により
物性が変化する光応答性材料を足場依存性細胞の接着性
表面として用いることにより、細胞の器官特異的機能を
維持したまま、細胞あるいは細胞群の単位で培養細胞の
脱着を容易に制御しうることを見いだし、本発明をなす
に至った。
を達成するために鋭意研究を重ねた結果、光照射により
物性が変化する光応答性材料を足場依存性細胞の接着性
表面として用いることにより、細胞の器官特異的機能を
維持したまま、細胞あるいは細胞群の単位で培養細胞の
脱着を容易に制御しうることを見いだし、本発明をなす
に至った。
【０００５】すなわち、本発明の上記課題の解決手段は
以下の（１）〜（１０）からなるものである。 （１）光照射によってその物性が変化する光応答性材料
からなることを特徴とする細胞接着性表面の形成用材
料。 （２）物性変化が可逆的であることを特徴とする上記
（１）に記載の材料。 （３）物性変化が少なくとも細胞の接着性の低下を含む
ことを特徴とする上記（１）又は（２）のいずれかに記
載の材料。 （４）上記（１）〜（３）のいずれかに記載の細胞接着
性表面を有することを特徴とする細胞培養装置。 （５）細胞培養装置がキュベットの形態であることを特
徴とする上記（４）に記載の装置。 （６）上記（４）または（５）に記載の細胞培養装置の
細胞接着性表面に光照射することにより、細胞接着性表
面に接着した細胞を該表面から剥離させ、回収すること
を特徴とする細胞の回収方法。 （７）上記（４）または（５）に記載の細胞培養装置の
細胞接着性表面に光を照射し、細胞を該表面から剥離さ
せるに際し、光照射領域を選択することにより、該光照
射領域に位置する細胞のみを細胞接着性表面から剥離さ
せ、細胞を分別することを特徴とする細胞の分別方法。 （８）細胞を細胞接着性表面から剥離する際、さらに物
理的刺激手段及び／または溶離液を用いることを特徴と
する上記（６）または（７）に記載の方法。 （９）光照射により細胞との接着性が変化する細胞接着
性表面を有する細胞培養キュベット、該キュベットに培
養液を供給する手段、該キュベットの細胞接着性表面の
任意の位置に光を照射する手段、該細胞接着性表面上の
細胞の位置を検出する手段、及び光照射により細胞接着
性表面から剥離された細胞を分別する手段を設けたこと
を特徴とする細胞の培養及び分別装置。 （１０）細胞培養キュベットに、物理的刺激手段及び／
または溶離液を供給する手段がさらに設けられているこ
とを特徴とする、上記（９）に記載の装置。
以下の（１）〜（１０）からなるものである。 （１）光照射によってその物性が変化する光応答性材料
からなることを特徴とする細胞接着性表面の形成用材
料。 （２）物性変化が可逆的であることを特徴とする上記
（１）に記載の材料。 （３）物性変化が少なくとも細胞の接着性の低下を含む
ことを特徴とする上記（１）又は（２）のいずれかに記
載の材料。 （４）上記（１）〜（３）のいずれかに記載の細胞接着
性表面を有することを特徴とする細胞培養装置。 （５）細胞培養装置がキュベットの形態であることを特
徴とする上記（４）に記載の装置。 （６）上記（４）または（５）に記載の細胞培養装置の
細胞接着性表面に光照射することにより、細胞接着性表
面に接着した細胞を該表面から剥離させ、回収すること
を特徴とする細胞の回収方法。 （７）上記（４）または（５）に記載の細胞培養装置の
細胞接着性表面に光を照射し、細胞を該表面から剥離さ
せるに際し、光照射領域を選択することにより、該光照
射領域に位置する細胞のみを細胞接着性表面から剥離さ
せ、細胞を分別することを特徴とする細胞の分別方法。 （８）細胞を細胞接着性表面から剥離する際、さらに物
理的刺激手段及び／または溶離液を用いることを特徴と
する上記（６）または（７）に記載の方法。 （９）光照射により細胞との接着性が変化する細胞接着
性表面を有する細胞培養キュベット、該キュベットに培
養液を供給する手段、該キュベットの細胞接着性表面の
任意の位置に光を照射する手段、該細胞接着性表面上の
細胞の位置を検出する手段、及び光照射により細胞接着
性表面から剥離された細胞を分別する手段を設けたこと
を特徴とする細胞の培養及び分別装置。 （１０）細胞培養キュベットに、物理的刺激手段及び／
または溶離液を供給する手段がさらに設けられているこ
とを特徴とする、上記（９）に記載の装置。
【０００６】
【発明の実施の形態】本発明の細胞接着性表面とは、上
記足場依存性細胞増殖の足場となる、細胞が接着する表
面を意味する。該表面の形成材料は、光照射によりその
物性が変化する光応答性材料からなり、光照射により細
胞に対する接着性が変化するものである。該細胞接着性
表面の形成材料としては、例えばａ）光エネルギーを熱
に転換し、その結果もたらされる局所的な温度上昇によ
って表面の特性を変化させるもの、ｂ）光照射により、
表面の酸化状態が変化するもの、あるいはｃ）光照射に
より構造が異性化し、その分極率、親水−疎水性が変化
するもの等が挙げられ、これらの物性変化は可逆的であ
ることが好ましい。さらに具体的には、上記ａ）に属す
る細胞接着性表面の形成用材料とは、例えば、光を熱に
変換する色素分子や顔料（色素や顔料は一般的に光を熱
に変換する性質を有する）を、温度変化によって親水−
疎水性が変化するポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミ
ド）やポリビニルエーテル等の感温性ポリマー等に結合
せしめたもの等が挙げられる。この場合、培養装置の基
材表面で重合する方法が適用できる。上記ｂ）に属する
細胞接着性表面の形成用材料としては、例えば酸化チタ
ン等の光触媒材料が挙げられ、これらは、例えば焼結法
等により、培養装置の基材表面に光触媒層を形成する。
上記ｃ）に属する細胞接着性表面の形成用材料として
は、アゾベンゼン、ジアリールエテン、スピロピラン、
スピロオキサジン、フルギド、ロイコ色素といった有機
化合物の誘導体等の光応答性分子自体、これら光応答性
分子自体を結合したモノマー、およびこれらモノマーを
重合せしめたポリマー等が挙げられる。上記光応答性分
子自体を使用する場合には、これら光応答性分子を、培
養装置の基材表面に例えばシランカップリング剤等を用
いて化学的に、あるいは疎水性相互作用等を利用して物
理的に結合させる。上記モノマーを用いる場合には、培
養装置の基材表面で重合する方法が適用できる。また、
上記ポリマーを使用する場合には、該ポリマーを適当な
溶剤に溶解し、培養装置の基材表面に塗布すればよい。
記足場依存性細胞増殖の足場となる、細胞が接着する表
面を意味する。該表面の形成材料は、光照射によりその
物性が変化する光応答性材料からなり、光照射により細
胞に対する接着性が変化するものである。該細胞接着性
表面の形成材料としては、例えばａ）光エネルギーを熱
に転換し、その結果もたらされる局所的な温度上昇によ
って表面の特性を変化させるもの、ｂ）光照射により、
表面の酸化状態が変化するもの、あるいはｃ）光照射に
より構造が異性化し、その分極率、親水−疎水性が変化
するもの等が挙げられ、これらの物性変化は可逆的であ
ることが好ましい。さらに具体的には、上記ａ）に属す
る細胞接着性表面の形成用材料とは、例えば、光を熱に
変換する色素分子や顔料（色素や顔料は一般的に光を熱
に変換する性質を有する）を、温度変化によって親水−
疎水性が変化するポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミ
ド）やポリビニルエーテル等の感温性ポリマー等に結合
せしめたもの等が挙げられる。この場合、培養装置の基
材表面で重合する方法が適用できる。上記ｂ）に属する
細胞接着性表面の形成用材料としては、例えば酸化チタ
ン等の光触媒材料が挙げられ、これらは、例えば焼結法
等により、培養装置の基材表面に光触媒層を形成する。
上記ｃ）に属する細胞接着性表面の形成用材料として
は、アゾベンゼン、ジアリールエテン、スピロピラン、
スピロオキサジン、フルギド、ロイコ色素といった有機
化合物の誘導体等の光応答性分子自体、これら光応答性
分子自体を結合したモノマー、およびこれらモノマーを
重合せしめたポリマー等が挙げられる。上記光応答性分
子自体を使用する場合には、これら光応答性分子を、培
養装置の基材表面に例えばシランカップリング剤等を用
いて化学的に、あるいは疎水性相互作用等を利用して物
理的に結合させる。上記モノマーを用いる場合には、培
養装置の基材表面で重合する方法が適用できる。また、
上記ポリマーを使用する場合には、該ポリマーを適当な
溶剤に溶解し、培養装置の基材表面に塗布すればよい。
【０００７】本発明の上記した光応答性材料から形成さ
れる細胞接着性表面は、光照射により、細胞を剥離する
機能を有するが、そうでなくとも表面の接着性が低下し
ており、タンパク質分解酵素の希薄溶液や塩溶液等の溶
離液の添加あるいは振動等の物理的刺激により、簡単に
細胞を剥離することができる。また、本発明によれば、
特に、トリプシン等の酵素を全く、あるいは十分量使用
しないため、細胞接着物質であり、細胞機能の発現や保
持に重要な働きをするＥＣＭ（細胞外マトリックス）や
膜タンパク質を伴ったまま剥離可能である点が極めて重
要な利点である。本発明における培養装置としては、培
養ディッシュ、細胞培養キュベット等が挙げられ、上記
光応答性材料からなる細胞接着性表面は、これら細胞培
養装置の細胞収容側の基材表面に形成される。
れる細胞接着性表面は、光照射により、細胞を剥離する
機能を有するが、そうでなくとも表面の接着性が低下し
ており、タンパク質分解酵素の希薄溶液や塩溶液等の溶
離液の添加あるいは振動等の物理的刺激により、簡単に
細胞を剥離することができる。また、本発明によれば、
特に、トリプシン等の酵素を全く、あるいは十分量使用
しないため、細胞接着物質であり、細胞機能の発現や保
持に重要な働きをするＥＣＭ（細胞外マトリックス）や
膜タンパク質を伴ったまま剥離可能である点が極めて重
要な利点である。本発明における培養装置としては、培
養ディッシュ、細胞培養キュベット等が挙げられ、上記
光応答性材料からなる細胞接着性表面は、これら細胞培
養装置の細胞収容側の基材表面に形成される。
【０００８】これらの培養装置を用いた細胞の培養、分
別方法について図面に基づき以下説明する。第１図は、
本発明における細胞の培養、分別方法の概略を示す工程
図である。本発明においては、上記細胞培養装置に培養
液を入れ、例えば、異なる細胞を含有する試料を播種・
培養・増殖させる（１、２）。細胞は上記細胞培養装置
の光応答性材料からなる細胞接着性表面に接着し、これ
を足場として増殖する。これに、例えば、蛍光色素等で
標識した各細胞に対するポリクローナル又はモノクロー
ナル抗体を加え、細胞と結合させる。この際、抗体は一
つの細胞に対応するものでもいいし、各細胞に対応する
複数種の抗体を用い、各抗体に標識する蛍光色素をそれ
ぞれ異なるように用いてもよい。これにより、分別しよ
うとする細胞あるいはコロニーの位置情報が検出可能と
なる（３）。この後細胞培養装置内の分別しようとする
細胞あるいはコロニーを顕微鏡あるいはカラーＣＣＤカ
メラ等により検出し、該位置情報をパソコン（ＰＣ）に
取り込み（４）、この位置情報に基づいて、目的とする
細胞あるいはコロニーの位置に光照射する。この光照射
により、細胞あるいはコロニーが位置する細胞接着性表
面は変質し、接着性が低下し、上記細胞接着性表面か
ら、目的とする細胞あるいはコロニーのみを分別して剥
離させ、これを回収することが可能となる（５）。
別方法について図面に基づき以下説明する。第１図は、
本発明における細胞の培養、分別方法の概略を示す工程
図である。本発明においては、上記細胞培養装置に培養
液を入れ、例えば、異なる細胞を含有する試料を播種・
培養・増殖させる（１、２）。細胞は上記細胞培養装置
の光応答性材料からなる細胞接着性表面に接着し、これ
を足場として増殖する。これに、例えば、蛍光色素等で
標識した各細胞に対するポリクローナル又はモノクロー
ナル抗体を加え、細胞と結合させる。この際、抗体は一
つの細胞に対応するものでもいいし、各細胞に対応する
複数種の抗体を用い、各抗体に標識する蛍光色素をそれ
ぞれ異なるように用いてもよい。これにより、分別しよ
うとする細胞あるいはコロニーの位置情報が検出可能と
なる（３）。この後細胞培養装置内の分別しようとする
細胞あるいはコロニーを顕微鏡あるいはカラーＣＣＤカ
メラ等により検出し、該位置情報をパソコン（ＰＣ）に
取り込み（４）、この位置情報に基づいて、目的とする
細胞あるいはコロニーの位置に光照射する。この光照射
により、細胞あるいはコロニーが位置する細胞接着性表
面は変質し、接着性が低下し、上記細胞接着性表面か
ら、目的とする細胞あるいはコロニーのみを分別して剥
離させ、これを回収することが可能となる（５）。
【０００９】第２図は、複数種の細胞をその種類毎に分
別回収する場合の工程概略図である。複数種の細胞をそ
の種類毎に分別回収するには、例えば、各細胞に対応さ
せて、各々異なる蛍光色素等で標識した複数の抗体を用
いて、上記細胞接着製表面上の各細胞に結合させ
（１）、蛍光色素の蛍光の相違に基づき各細胞の種類毎
にその位置情報を得た後、特定の蛍光を発する細胞の位
置に局所的光照射を行い、その位置にある細胞あるいは
コロニーを剥離させ回収する（２）。 次いで光照射の
領域を変え、次に回収する細胞あるいはコロニーの位置
する位置に光照射し、上記とは別の種類の細胞を剥離回
収する（３）。この工程を順次行うことにより、細胞の
種類毎に分別して回収することが可能となる。上記説明
では、異なる細胞を各々分別する場合を示したが、本発
明においては、特にこれに限定されない。例えば、光照
射を細胞接着表面全域に照射して、細胞接着製表面に接
着した全ての細胞を剥離して回収することもできる。こ
の方法は、単一の細胞を大量に培養回収しようとする場
合に有効である。
別回収する場合の工程概略図である。複数種の細胞をそ
の種類毎に分別回収するには、例えば、各細胞に対応さ
せて、各々異なる蛍光色素等で標識した複数の抗体を用
いて、上記細胞接着製表面上の各細胞に結合させ
（１）、蛍光色素の蛍光の相違に基づき各細胞の種類毎
にその位置情報を得た後、特定の蛍光を発する細胞の位
置に局所的光照射を行い、その位置にある細胞あるいは
コロニーを剥離させ回収する（２）。 次いで光照射の
領域を変え、次に回収する細胞あるいはコロニーの位置
する位置に光照射し、上記とは別の種類の細胞を剥離回
収する（３）。この工程を順次行うことにより、細胞の
種類毎に分別して回収することが可能となる。上記説明
では、異なる細胞を各々分別する場合を示したが、本発
明においては、特にこれに限定されない。例えば、光照
射を細胞接着表面全域に照射して、細胞接着製表面に接
着した全ての細胞を剥離して回収することもできる。こ
の方法は、単一の細胞を大量に培養回収しようとする場
合に有効である。
【００１０】また、本発明においては、上記のように蛍
光標識抗体を用いる手法のみでなく、種々の蛍光標識法
を採用できる。これには、例えば、ルシフェラーゼ等の
発光系を構成する酵素の遺伝子を細胞に導入する方法等
が挙げられる。さらに、例えば、形態の違う細胞の分別
においては、特に蛍光標識を行わなくとも顕微鏡観察
下、光照射して、目的とする細胞のみを分別して回収す
ることができる。
光標識抗体を用いる手法のみでなく、種々の蛍光標識法
を採用できる。これには、例えば、ルシフェラーゼ等の
発光系を構成する酵素の遺伝子を細胞に導入する方法等
が挙げられる。さらに、例えば、形態の違う細胞の分別
においては、特に蛍光標識を行わなくとも顕微鏡観察
下、光照射して、目的とする細胞のみを分別して回収す
ることができる。
【００１１】次に、上記培養、分別方法の応用例を第３
図に基づき説明する。第３図中（Ｉ）は、特定の細胞の
みを純粋培養する場合の工程概略図である。特定の細胞
のみを純粋に培養するには、例えば、上記培養ディッシ
ュに本発明の細胞接着性表面を形成し、特定の細胞を培
養する（１）。培養塗中で他の細胞が混入してきた場合
には、逐次該混入細胞の位置する位置に光照射して、該
細胞を剥離除去して（２）、特定の細胞のみを細胞接着
表面上に残し培養を続ける（３）。混入細胞の識別は、
上記純粋培養しようとする特定細胞を蛍光標識すること
により、蛍光標識されていない混入細胞とを識別するこ
とができる。また、上記したように形態上区別できる場
合にあっては、特に蛍光標識をしなくとも上記顕微鏡で
の観察下、光照射により、混入細胞を剥離除去できる。
図に基づき説明する。第３図中（Ｉ）は、特定の細胞の
みを純粋培養する場合の工程概略図である。特定の細胞
のみを純粋に培養するには、例えば、上記培養ディッシ
ュに本発明の細胞接着性表面を形成し、特定の細胞を培
養する（１）。培養塗中で他の細胞が混入してきた場合
には、逐次該混入細胞の位置する位置に光照射して、該
細胞を剥離除去して（２）、特定の細胞のみを細胞接着
表面上に残し培養を続ける（３）。混入細胞の識別は、
上記純粋培養しようとする特定細胞を蛍光標識すること
により、蛍光標識されていない混入細胞とを識別するこ
とができる。また、上記したように形態上区別できる場
合にあっては、特に蛍光標識をしなくとも上記顕微鏡で
の観察下、光照射により、混入細胞を剥離除去できる。
【００１２】第３図中（ＩＩ）は、細胞のパターニング
と複数種の細胞をパターニングして共培養する場合工程
概略図である。細胞のパターニングは、例えば、ある細
胞を細胞接着性表面上に広がるまで培養増殖させ
（１）、計画されたパターンに基づき、該パターンにお
いて残すべき細胞区画以外の領域に光を照射し、この領
域に位置する細胞を剥離除去する。残存する細胞は、上
記計画されたパターンを形成する（２）。さらに、この
細胞が剥離除去された位置に他の細胞を播種させ、共培
養すれば、複数種の細胞が区別されてパターニングされ
ることになる（３）。一方、これらのパターンニングに
おいて、所定の領域に対して定期的に光を照射しながら
細胞培養を行うことによっても、その領域への細胞の接
着が阻害されるので、培養細胞の自由なレイアウトも可
能となる。これらの方法は、例えば、細胞の情報伝達を
解析したり、複数種の細胞の共存下で産生される生理活
性物質を細胞を用いて生産したりする際に、有効な方法
である。
と複数種の細胞をパターニングして共培養する場合工程
概略図である。細胞のパターニングは、例えば、ある細
胞を細胞接着性表面上に広がるまで培養増殖させ
（１）、計画されたパターンに基づき、該パターンにお
いて残すべき細胞区画以外の領域に光を照射し、この領
域に位置する細胞を剥離除去する。残存する細胞は、上
記計画されたパターンを形成する（２）。さらに、この
細胞が剥離除去された位置に他の細胞を播種させ、共培
養すれば、複数種の細胞が区別されてパターニングされ
ることになる（３）。一方、これらのパターンニングに
おいて、所定の領域に対して定期的に光を照射しながら
細胞培養を行うことによっても、その領域への細胞の接
着が阻害されるので、培養細胞の自由なレイアウトも可
能となる。これらの方法は、例えば、細胞の情報伝達を
解析したり、複数種の細胞の共存下で産生される生理活
性物質を細胞を用いて生産したりする際に、有効な方法
である。
【００１３】一方、本発明の細胞の培養及び分別装置
は、光照射により細胞との接着性が変化する細胞接着性
表面を有する細胞培養キュベット、該キュベットに培養
液を供給する手段、該キュベットの細胞接着性表面の任
意の位置に光を照射する手段、該細胞接性表面上の細胞
の位置を検出する手段、及び光照射により細胞接着性表
面から剥離された細胞を分別する手段を有し、さらに必
要に応じて溶離液供給手段が付加されて構成されている
ものである。 本発明の細胞の培養及び分別装置につい
て、第４、５図に基づき、さらに具体的に説明する。第
４図は、本発明の細胞の培養及び分別装置の１例を示す
全体構成図であり、第５図は該装置の細胞培養キュベッ
トにおける細胞の選択剥離の態様を示す要部図である。
は、光照射により細胞との接着性が変化する細胞接着性
表面を有する細胞培養キュベット、該キュベットに培養
液を供給する手段、該キュベットの細胞接着性表面の任
意の位置に光を照射する手段、該細胞接性表面上の細胞
の位置を検出する手段、及び光照射により細胞接着性表
面から剥離された細胞を分別する手段を有し、さらに必
要に応じて溶離液供給手段が付加されて構成されている
ものである。 本発明の細胞の培養及び分別装置につい
て、第４、５図に基づき、さらに具体的に説明する。第
４図は、本発明の細胞の培養及び分別装置の１例を示す
全体構成図であり、第５図は該装置の細胞培養キュベッ
トにおける細胞の選択剥離の態様を示す要部図である。
【００１４】該装置は、細胞接着表面（８）を有する細
胞培養キュベット（１）、該キュベットに培養液を供給
する培地リザーバ（２）、該キュベットの細胞接着性表
面の任意の位置に光を照射する微小２次元パターン照射
光学系としてのプロジェクタ手段（３）、該細胞接性表
面上の細胞の位置を検出し、該位置情報信号を制御部に
送出するカラーＣＣＤカメラ（４）、及び光照射により
細胞接着性表面から剥離された細胞を分別するためのも
のであって、回収容器が切り替え可能に設けられた分別
回収手段（５）、培地リザーバ（２）と細胞培養キュベ
ット（１）を接続する管路及び細胞培養キュベットと分
別回収手段（５）を接続する管路の各々に設けられた開
閉手段（６）、（６’）、およびこれら各手段全体の動
作を制御する制御手段（７）から構成されるが、さら
に、必要に応じて細胞培養キュベット（１）に溶離液を
供給するための溶離液供給手段（図示せず）設けられて
いてもよい。
胞培養キュベット（１）、該キュベットに培養液を供給
する培地リザーバ（２）、該キュベットの細胞接着性表
面の任意の位置に光を照射する微小２次元パターン照射
光学系としてのプロジェクタ手段（３）、該細胞接性表
面上の細胞の位置を検出し、該位置情報信号を制御部に
送出するカラーＣＣＤカメラ（４）、及び光照射により
細胞接着性表面から剥離された細胞を分別するためのも
のであって、回収容器が切り替え可能に設けられた分別
回収手段（５）、培地リザーバ（２）と細胞培養キュベ
ット（１）を接続する管路及び細胞培養キュベットと分
別回収手段（５）を接続する管路の各々に設けられた開
閉手段（６）、（６’）、およびこれら各手段全体の動
作を制御する制御手段（７）から構成されるが、さら
に、必要に応じて細胞培養キュベット（１）に溶離液を
供給するための溶離液供給手段（図示せず）設けられて
いてもよい。
【００１５】該装置の動作について説明すると、まず、
開閉手段６の開閉により、培地リザーバ（２）から細胞
培養キュベット（１）に培養液を一定量供給し、細胞を
播種し培養する。この際、目的とする細胞（１０）は予
め蛍光標識されているかあるいは培養後蛍光抗体を用い
て標識してもよい。細胞培養キュベット（１）は、その
基板（９）上に光応答性材料からなる細胞接着性表面が
形成されており、該細胞接着性表面上細胞の位置はカラ
ーＣＣＤカメラ（４）で検出し、その位置情報信号は制
御部（７）に入力され、これにより蛍光標識により分別
する目的細胞（１０）を識別し、該目的細胞（１０）が
存在する位置に、プロジェクタ手段の光照射位置を合わ
せ光照射する。光照射位置の制御は、制御部による自動
制御、あるいはモニタ画面を見ながら手動操作により行
う。この操作信号は、プロジェクタ手段（３）の光照射
位置合わせ手段（３’）を作動させて、目的とする細胞
（１０）の位置に光照射の標準を合わせる。光照射によ
り細胞接着表面は局所的に変質して目的細胞（１０）の
接着性が低下し、細胞（１０）のみ剥離し、培養液中を
浮遊する。仮に剥離しなくとも細胞接着性表面の接着性
は低下しており、溶離液供給手段からの開閉手段を開く
ことにより、培養キュベット（１）に溶離液を供給する
ことにより細胞（１０）は選択的に剥離される。また、
溶離液供給手段に代え、振動等の物理的刺激手段を併用
してもよい。これらの手段により剥離された細胞はＥＣ
Ｍ（細胞外マトリクス）や膜タンパク質を保持してい
る。ついで、開閉手段６、６’を開き、培地リザーバ
（２）から培養液を細胞培養キュベットに供給し、剥離
した細胞（１０）を、分別回収手段５の回収容器５’中
に回収する。この操作を繰り返して、細胞（１１）及び
（１２）を順次分別回収する。
開閉手段６の開閉により、培地リザーバ（２）から細胞
培養キュベット（１）に培養液を一定量供給し、細胞を
播種し培養する。この際、目的とする細胞（１０）は予
め蛍光標識されているかあるいは培養後蛍光抗体を用い
て標識してもよい。細胞培養キュベット（１）は、その
基板（９）上に光応答性材料からなる細胞接着性表面が
形成されており、該細胞接着性表面上細胞の位置はカラ
ーＣＣＤカメラ（４）で検出し、その位置情報信号は制
御部（７）に入力され、これにより蛍光標識により分別
する目的細胞（１０）を識別し、該目的細胞（１０）が
存在する位置に、プロジェクタ手段の光照射位置を合わ
せ光照射する。光照射位置の制御は、制御部による自動
制御、あるいはモニタ画面を見ながら手動操作により行
う。この操作信号は、プロジェクタ手段（３）の光照射
位置合わせ手段（３’）を作動させて、目的とする細胞
（１０）の位置に光照射の標準を合わせる。光照射によ
り細胞接着表面は局所的に変質して目的細胞（１０）の
接着性が低下し、細胞（１０）のみ剥離し、培養液中を
浮遊する。仮に剥離しなくとも細胞接着性表面の接着性
は低下しており、溶離液供給手段からの開閉手段を開く
ことにより、培養キュベット（１）に溶離液を供給する
ことにより細胞（１０）は選択的に剥離される。また、
溶離液供給手段に代え、振動等の物理的刺激手段を併用
してもよい。これらの手段により剥離された細胞はＥＣ
Ｍ（細胞外マトリクス）や膜タンパク質を保持してい
る。ついで、開閉手段６、６’を開き、培地リザーバ
（２）から培養液を細胞培養キュベットに供給し、剥離
した細胞（１０）を、分別回収手段５の回収容器５’中
に回収する。この操作を繰り返して、細胞（１１）及び
（１２）を順次分別回収する。
【００１６】本発明の細胞の培養及び分別装置の各構成
部材として、上記細胞培養キュベットは、細胞接着性表
面を外部から光照射することができ、該表面上に接着し
た細胞をモニタできる構造のものを使用する。一方、微
小２次元パターン照射光学系としては、個々の細胞ある
いは細胞群の空間スケールで、細胞培養キュベットの光
応答性材料からなる細胞接着性表面上の任意の領域を照
射できるものを用いる。モニタとしては、個々の細胞あ
るいは細胞群を識別するに十分な解像度、光学倍率、感
度を備えるものを使用することが好ましい。また、細胞
種を識別するため、複数の抗体担持蛍光色素を用いる場
合には、色を識別できることが望ましい。制御系は、モ
ニタによる培養細胞の位置情報の取り込み、それに基づ
く微小２次元パターン照射光学系からの光照射、剥離細
胞回収のためのキュベットへの培地の送出を制御するも
のを用いることが望ましい。以上においては、主に細胞
培養キュベット等の培養装置中で細胞を播種・培養・増
殖を通じたプロセスについて説明したが、本発明におい
ては、単にキュベットに導入し接着させ、これを分別回
収するというプロセスにも適用できる。このプロセス
は、例えば複数種の細胞を含む組織等において、各細胞
種毎に分離するために有効である。
部材として、上記細胞培養キュベットは、細胞接着性表
面を外部から光照射することができ、該表面上に接着し
た細胞をモニタできる構造のものを使用する。一方、微
小２次元パターン照射光学系としては、個々の細胞ある
いは細胞群の空間スケールで、細胞培養キュベットの光
応答性材料からなる細胞接着性表面上の任意の領域を照
射できるものを用いる。モニタとしては、個々の細胞あ
るいは細胞群を識別するに十分な解像度、光学倍率、感
度を備えるものを使用することが好ましい。また、細胞
種を識別するため、複数の抗体担持蛍光色素を用いる場
合には、色を識別できることが望ましい。制御系は、モ
ニタによる培養細胞の位置情報の取り込み、それに基づ
く微小２次元パターン照射光学系からの光照射、剥離細
胞回収のためのキュベットへの培地の送出を制御するも
のを用いることが望ましい。以上においては、主に細胞
培養キュベット等の培養装置中で細胞を播種・培養・増
殖を通じたプロセスについて説明したが、本発明におい
ては、単にキュベットに導入し接着させ、これを分別回
収するというプロセスにも適用できる。このプロセス
は、例えば複数種の細胞を含む組織等において、各細胞
種毎に分離するために有効である。
【００１７】
【実施例】光照射による構造の異性化に伴い吸収スペク
トルが変化するジアリールエテン誘導体 cis-1,2-Dicya
no-1,2-bis(2,4,5-trimethyl-3-thienyl) ethane を、
スピンコート法によってガラス基板に均一に塗布し、光
応答性表面を得た。これを、微小２次元パターン照射光
学系、モニタおよびこれらを制御する制御系で構成され
るシステムに実装し、400-440nmの波長域の青色光（強
度 180mW/cm2）および500-600nmの波長域の黄色光（強
度 160mW/cm2）を用いて、光応答性表面の特性を光照射
で可逆的に制御する実験を行った。その結果、モニタで
観察される光応答性表面上の任意の位置で、光応答性表
面の着色状態を分解能30μｍの精度をもって、５秒程度
のタイムスケールで可逆的に変化させられることを確認
した。
トルが変化するジアリールエテン誘導体 cis-1,2-Dicya
no-1,2-bis(2,4,5-trimethyl-3-thienyl) ethane を、
スピンコート法によってガラス基板に均一に塗布し、光
応答性表面を得た。これを、微小２次元パターン照射光
学系、モニタおよびこれらを制御する制御系で構成され
るシステムに実装し、400-440nmの波長域の青色光（強
度 180mW/cm2）および500-600nmの波長域の黄色光（強
度 160mW/cm2）を用いて、光応答性表面の特性を光照射
で可逆的に制御する実験を行った。その結果、モニタで
観察される光応答性表面上の任意の位置で、光応答性表
面の着色状態を分解能30μｍの精度をもって、５秒程度
のタイムスケールで可逆的に変化させられることを確認
した。
【００１８】
【発明の効果】本発明によって、従来技術では両立でき
なかった細胞の精密分離に加え、該分離において細胞に
ＥＣＭや膜タンパク質の機能を保持させることが可能と
なったことにより細胞の器官特異的機能の維持を同時に
実現することが可能となった。したがって、足場依存性
細胞の極めて有利な細胞の培養・分離回収システムが提
供できた。また、表面特性の変化が可逆的であるような
光応答性材料からなる細胞接着性表面を用いることで、
光照射による脱着操作と他種細胞の播種を繰り返し行
い、該表面上の培養細胞の種類、位置、配列を任意かつ
高精度に操作することも可能となった。
なかった細胞の精密分離に加え、該分離において細胞に
ＥＣＭや膜タンパク質の機能を保持させることが可能と
なったことにより細胞の器官特異的機能の維持を同時に
実現することが可能となった。したがって、足場依存性
細胞の極めて有利な細胞の培養・分離回収システムが提
供できた。また、表面特性の変化が可逆的であるような
光応答性材料からなる細胞接着性表面を用いることで、
光照射による脱着操作と他種細胞の播種を繰り返し行
い、該表面上の培養細胞の種類、位置、配列を任意かつ
高精度に操作することも可能となった。
【図１】本発明の細胞の培養、分別方法の概略を示す工
程図である。
程図である。
【図２】本発明において、複数種の細胞をその種類毎に
分別回収する場合の工程概略図である。
分別回収する場合の工程概略図である。
【図３】本発明の培養、分別方法の応用例を示す概略図
である。
である。
【図４】本発明の細胞及び分別装置の１例を示す全体構
成図である。
成図である。
【図５】本発明の細胞及び分別装置における培養キュベ
ットの細胞選択剥離の態様を示す要部図である。
ットの細胞選択剥離の態様を示す要部図である。
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ１２Ｎ 1/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｅ
(72)発明者 新保 外志夫
茨城県つくば市東１−１−１ 独立行政法
人産業技術総合研究所つくばセンター内
Ｆターム(参考） 4B029 AA08 AA21 BB11 CC02 CC08
GA02 GA08 GB09
4B065 AA90X AC20 BA30 BC45
BC48 BC50 CA60
Claims (10)
- 【請求項１】光照射によってその物性が変化する光応答
性材料からなることを特徴とする細胞接着性表面の形成
用材料。 - 【請求項２】物性変化が可逆的であることを特徴とする
請求項１に記載の材料。 - 【請求項３】物性変化が少なくとも細胞の接着性の低下
を含むことを特徴とする請求項１又は２のいずれかに記
載の材料。 - 【請求項４】請求項１〜３のいずれかに記載の細胞接着
性表面を有することを特徴とする細胞培養装置。 - 【請求項５】細胞培養装置がキュベットの形態であるこ
とを特徴とする請求項４に記載の装置。 - 【請求項６】請求項４または５に記載の細胞培養装置の
細胞接着性表面に光照射することにより、細胞接着性表
面に接着した細胞を該表面から剥離させ、回収すること
を特徴とする細胞の回収方法。 - 【請求項７】請求項４または５に記載の細胞培養装置の
細胞接着性表面に光を照射し、細胞を該表面から剥離さ
せるに際し、光照射領域を選択することにより、該光照
射領域に位置する細胞のみを細胞接着性表面から剥離さ
せ、細胞を分別することを特徴とする細胞の分別方法。 - 【請求項８】細胞を細胞接着性表面から剥離する際、さ
らに物理的刺激手段及び／または溶離液を用いることを
特徴とする請求項６又は７に記載の方法。 - 【請求項９】光照射により細胞との接着性が変化する細
胞接着性表面を有する細胞培養キュベット、該キュベッ
トに培養液を供給する手段、該キュベットの細胞接着性
表面の任意の位置に光を照射する手段、該細胞接性表面
上の細胞の位置を検出する手段、及び光照射により細胞
接着性表面から剥離された細胞を分別する手段を設けた
ことを特徴とする細胞の培養及び分別装置。 - 【請求項１０】細胞培養キュベットに、物理的刺激手段
及び／または溶離液を供給する手段がさらに設けられて
いることを特徴とする、請求項９に記載の装置。
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