JPH0949830A - 刺激応答型分離材料および分離精製方法 - Google Patents
刺激応答型分離材料および分離精製方法Info
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- JPH0949830A JPH0949830A JP7203378A JP20337895A JPH0949830A JP H0949830 A JPH0949830 A JP H0949830A JP 7203378 A JP7203378 A JP 7203378A JP 20337895 A JP20337895 A JP 20337895A JP H0949830 A JPH0949830 A JP H0949830A
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- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
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- Separation Using Semi-Permeable Membranes (AREA)
- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】標的物質に対する高い特異性を有し、標的物質
を簡便に回収できる分離材料及び分離システムを提供す
ることを目的とする。 【解決手段】標的物質に対して親和性を有する領域と刺
激応答性高分子鎖よりなる領域とを基材表面に有する。
を簡便に回収できる分離材料及び分離システムを提供す
ることを目的とする。 【解決手段】標的物質に対して親和性を有する領域と刺
激応答性高分子鎖よりなる領域とを基材表面に有する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、標的物質に対して
特異的親和性を有する物質と刺激応答性高分子とを利用
した新規な分離材料、その製造方法及び分離方法に関す
る。
特異的親和性を有する物質と刺激応答性高分子とを利用
した新規な分離材料、その製造方法及び分離方法に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】近年、細胞工学や遺伝子工学等の発展に
伴い、細胞や遺伝子を利用した細胞治療や遺伝子治療の
研究が盛んとなっており、目的とした細胞や生体物質を
損傷させることなく分離する技術が重要となっている。
また、バイオテクノロジーの発展により、生物工学的手
法によるペプチド、蛋白質、糖蛋白質といった生理活性
分子の生産が行われるようになってきており、細胞やバ
イオプロダクツの簡便で損傷の少ない分離精製技術が望
まれている。
伴い、細胞や遺伝子を利用した細胞治療や遺伝子治療の
研究が盛んとなっており、目的とした細胞や生体物質を
損傷させることなく分離する技術が重要となっている。
また、バイオテクノロジーの発展により、生物工学的手
法によるペプチド、蛋白質、糖蛋白質といった生理活性
分子の生産が行われるようになってきており、細胞やバ
イオプロダクツの簡便で損傷の少ない分離精製技術が望
まれている。
【０００３】従来より化学工業分野で使用されている吸
着・分配・蒸留・析出といった分離・精製の単位操作で
は、熱や有機溶媒の添加等により、被精製物質に対して
大幅な環境変化を強いるため、前述の細胞やバイオプロ
ダクツの分離には適していないことが多い。
着・分配・蒸留・析出といった分離・精製の単位操作で
は、熱や有機溶媒の添加等により、被精製物質に対して
大幅な環境変化を強いるため、前述の細胞やバイオプロ
ダクツの分離には適していないことが多い。
【０００４】細胞やバイオプロダクツの分離方法とし
て、体積（分子量）や密度による方法（沈降速度法、密
度勾配遠心法、ゲル濾過法等）、電場中での移動度の差
による方法（電気泳動等）、等電点による方法（焦点電
気泳動など）、２液相間への分配による方法（２層分配
法、分配クロマトグラフィー）、固相への吸着性の差に
よる方法（吸着クロマトグラフィー、アフィニティーク
ロマトグラフィー）等が知られている。
て、体積（分子量）や密度による方法（沈降速度法、密
度勾配遠心法、ゲル濾過法等）、電場中での移動度の差
による方法（電気泳動等）、等電点による方法（焦点電
気泳動など）、２液相間への分配による方法（２層分配
法、分配クロマトグラフィー）、固相への吸着性の差に
よる方法（吸着クロマトグラフィー、アフィニティーク
ロマトグラフィー）等が知られている。
【０００５】これらの分離方法の多くは、物理化学的性
状が大きく異なる細胞成分の分離には適用できるもの
の、物理化学的性状が良く似た成分や細胞、例えばリン
パ球亜集団の分離などには適用が困難であった。この中
で標的物質に対する選択性の高い方法は、アフィニティ
ークロマトグラフィーであり、近年広く利用されるよう
になってきている。細胞を対象とするアフィニティーク
ロマトグラフィーとしては、標的細胞の表層に存在する
膜蛋白質等に対するモノクローナル抗体を結合したビー
ズやシャーレを用いた分離方法が報告されており、本方
法による各種リンパ球の亜集団分離も報告されている
（例えば、ジャーナル・オブ・イミュノロジカル・メソ
ッド、第５４号、２５１ページ、１９８３年に記載され
ているブラウンらの研究報告）。この抗体を用いた方法
は、特異性が極めて高いことが利点であるが、欠点とし
て、吸着した細胞の脱着が困難なこと、抗体が細胞表層
の抗原に結合するための時間（接触時間）を長くする必
要があること、その結果、非特異的な吸着が増加するこ
と、等があった。
状が大きく異なる細胞成分の分離には適用できるもの
の、物理化学的性状が良く似た成分や細胞、例えばリン
パ球亜集団の分離などには適用が困難であった。この中
で標的物質に対する選択性の高い方法は、アフィニティ
ークロマトグラフィーであり、近年広く利用されるよう
になってきている。細胞を対象とするアフィニティーク
ロマトグラフィーとしては、標的細胞の表層に存在する
膜蛋白質等に対するモノクローナル抗体を結合したビー
ズやシャーレを用いた分離方法が報告されており、本方
法による各種リンパ球の亜集団分離も報告されている
（例えば、ジャーナル・オブ・イミュノロジカル・メソ
ッド、第５４号、２５１ページ、１９８３年に記載され
ているブラウンらの研究報告）。この抗体を用いた方法
は、特異性が極めて高いことが利点であるが、欠点とし
て、吸着した細胞の脱着が困難なこと、抗体が細胞表層
の抗原に結合するための時間（接触時間）を長くする必
要があること、その結果、非特異的な吸着が増加するこ
と、等があった。
【０００６】前述の欠点を改良した方法としては、アビ
ジン−ビオチンのような親和性の高い結合を利用して、
短時間で分離材料に吸着させる方法がＷＯ９１／１６１
１６で提案されている。すなわち、ビオチンで標識した
抗体を予め時間をかけて標的細胞に結合させた後、アビ
ジンを結合した分離材料に吸着させることにより、短時
間で効率良く標的細胞を分離できることとなる。しかし
ながら、この方法では、物理的振動を用いて抗体と標的
細胞の結合やアビジンとビオチンとの結合を解離するこ
とにより標的細胞の回収が行われているため、ビーズ同
士の衝突等による細胞の損傷や機能低下が免れない。
ジン−ビオチンのような親和性の高い結合を利用して、
短時間で分離材料に吸着させる方法がＷＯ９１／１６１
１６で提案されている。すなわち、ビオチンで標識した
抗体を予め時間をかけて標的細胞に結合させた後、アビ
ジンを結合した分離材料に吸着させることにより、短時
間で効率良く標的細胞を分離できることとなる。しかし
ながら、この方法では、物理的振動を用いて抗体と標的
細胞の結合やアビジンとビオチンとの結合を解離するこ
とにより標的細胞の回収が行われているため、ビーズ同
士の衝突等による細胞の損傷や機能低下が免れない。
【０００７】細胞機能を損なわないように回収する方法
としては、特開平２−２１１８６５号に記載された水に
対する上限または下限臨界溶解温度が０〜８０℃にある
ポリマーもしくはコポリマーで表面を被覆した細胞培養
基材が報告されている。この方法は、温度により疎水性
−親水性と相転移する温度応答性高分子を利用したもの
であり、温度応答性高分子が疎水性で収縮した状態の時
に細胞を吸着させた後、温度を変化させ、親水性となっ
て膨潤する時に吸着した細胞を脱着させる方法である。
この方法の欠点は、細胞に対する特異性が低いため、種
々の細胞が存在する液体から特定の細胞を回収すること
ができないことである。特に、マクロファージ、白血
球、リンパ球等の多くは、曲率の小さい表面に吸着する
ことが知られており、フィルターや不織布形状に加工し
たこの分離材料を用いて、特定のリンパ球などを選択的
に回収することは不可能であった。
としては、特開平２−２１１８６５号に記載された水に
対する上限または下限臨界溶解温度が０〜８０℃にある
ポリマーもしくはコポリマーで表面を被覆した細胞培養
基材が報告されている。この方法は、温度により疎水性
−親水性と相転移する温度応答性高分子を利用したもの
であり、温度応答性高分子が疎水性で収縮した状態の時
に細胞を吸着させた後、温度を変化させ、親水性となっ
て膨潤する時に吸着した細胞を脱着させる方法である。
この方法の欠点は、細胞に対する特異性が低いため、種
々の細胞が存在する液体から特定の細胞を回収すること
ができないことである。特に、マクロファージ、白血
球、リンパ球等の多くは、曲率の小さい表面に吸着する
ことが知られており、フィルターや不織布形状に加工し
たこの分離材料を用いて、特定のリンパ球などを選択的
に回収することは不可能であった。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明は、標
的物質に対する高い特異性を有し、標的物質を簡便に回
収できる分離材料及び分離システムを提供することを目
的とする。
的物質に対する高い特異性を有し、標的物質を簡便に回
収できる分離材料及び分離システムを提供することを目
的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】上記発明の目的は以下の
刺激応答型分離材料及びその製造方法によって達成され
る。 （１）刺激応答性高分子鎖よりなる領域と標的物質に対
して親和性を有する領域とを基材表面に有することを特
徴とする刺激応答型分離材料。 （２）刺激応答性領域よりなる分子鎖と標的物質に対し
て親和性を有する分子鎖とを有する共重合体を基材表面
に有することを特徴とする（１）に記載の刺激応答型分
離材料。 （３）刺激応答性高分子鎖よりなる領域と標的物質に対
して親和性を有する領域とを基材表面に有する刺激応答
型分離材料において、前記基材が多孔質体からなること
を特徴とする刺激応答型分離材料。 （４）刺激応答性高分子鎖よりなる領域と標的物質に対
して親和性を有する領域とを基材表面に有する刺激応答
型分離材料を用いて、標的物質を該分離材料に吸着させ
た後、該刺激応答性高分子鎖の高次構造を変化させるこ
とにより、標的物質を該分離材料より脱離させることを
特徴とする物質の分離精製方法。
刺激応答型分離材料及びその製造方法によって達成され
る。 （１）刺激応答性高分子鎖よりなる領域と標的物質に対
して親和性を有する領域とを基材表面に有することを特
徴とする刺激応答型分離材料。 （２）刺激応答性領域よりなる分子鎖と標的物質に対し
て親和性を有する分子鎖とを有する共重合体を基材表面
に有することを特徴とする（１）に記載の刺激応答型分
離材料。 （３）刺激応答性高分子鎖よりなる領域と標的物質に対
して親和性を有する領域とを基材表面に有する刺激応答
型分離材料において、前記基材が多孔質体からなること
を特徴とする刺激応答型分離材料。 （４）刺激応答性高分子鎖よりなる領域と標的物質に対
して親和性を有する領域とを基材表面に有する刺激応答
型分離材料を用いて、標的物質を該分離材料に吸着させ
た後、該刺激応答性高分子鎖の高次構造を変化させるこ
とにより、標的物質を該分離材料より脱離させることを
特徴とする物質の分離精製方法。
【００１０】
【発明の実施の形態】本発明においては、標的物質は特
に限定されず、蛋白質、糖蛋白質、核酸、細胞、人工細
胞、合成高分子化合物等を例示できる。本発明の分離材
料は、刺激応答性高分子鎖と標的物質に対して親和性を
有する領域よりなる領域とを基材表面に有する材料であ
り、特に表面状態は限定されないが、基材表面が相分離
していることが好ましい。この時、標的物質に対して親
和性を有する分子（リガンド）が、相分離構造に従って
ミクロ的に不均一に存在するが、その際、標的物質の大
きさが該標的物質に対して親和性を有する領域の大きさ
より小さいことが好ましい。相分離構造を基材表面に形
成させる方法としては、刺激応答性高分子にブロック共
重合体を用いる方法が好ましい。一般に、高分子間では
相溶性を示すものもあるが、多くの高分子は相分離を起
こすことが知られている。特に、ブロック共重合体は、
海島状、縞状、ラメラ状に規則的なミクロ相分離構造を
発現することが知られており、このような構造が本発明
の分離材料として好ましい。
に限定されず、蛋白質、糖蛋白質、核酸、細胞、人工細
胞、合成高分子化合物等を例示できる。本発明の分離材
料は、刺激応答性高分子鎖と標的物質に対して親和性を
有する領域よりなる領域とを基材表面に有する材料であ
り、特に表面状態は限定されないが、基材表面が相分離
していることが好ましい。この時、標的物質に対して親
和性を有する分子（リガンド）が、相分離構造に従って
ミクロ的に不均一に存在するが、その際、標的物質の大
きさが該標的物質に対して親和性を有する領域の大きさ
より小さいことが好ましい。相分離構造を基材表面に形
成させる方法としては、刺激応答性高分子にブロック共
重合体を用いる方法が好ましい。一般に、高分子間では
相溶性を示すものもあるが、多くの高分子は相分離を起
こすことが知られている。特に、ブロック共重合体は、
海島状、縞状、ラメラ状に規則的なミクロ相分離構造を
発現することが知られており、このような構造が本発明
の分離材料として好ましい。
【００１１】また、刺激応答性高分子の構造としては、
グラフト共重合体、交互共重合体もしくはランダム共重
合体でもかまわない。これらの共重合体は、分離する標
的細胞の性質と共重合体の刺激応答による構造変化の大
きさを考慮して選択するのが好ましい。基材表面におけ
る標的物質の親和性領域の比率は、外部環境により異な
るため明確に規定できないが、標的物質を吸着する時
に、１０〜９０％、好ましくは、２０〜８０％である。
グラフト共重合体、交互共重合体もしくはランダム共重
合体でもかまわない。これらの共重合体は、分離する標
的細胞の性質と共重合体の刺激応答による構造変化の大
きさを考慮して選択するのが好ましい。基材表面におけ
る標的物質の親和性領域の比率は、外部環境により異な
るため明確に規定できないが、標的物質を吸着する時
に、１０〜９０％、好ましくは、２０〜８０％である。
【００１２】標的物質としては、細胞を好適に例示でき
る。ここで、基材表面が相分離している場合、リガンド
が、相分離構造に従ってミクロ的に不均一に存在してい
るため、細胞が分離材料表面に吸着されるときにしばし
ば観察されるキャッピング現象が回避されソフトに吸着
することとなる。そのため、細胞の損傷が少なくなり、
吸着した細胞の機能を発現させる場合や分離精製（回
収）する場合に、優れた性能を発現することとなる。ま
た、標的とする細胞は限定されず、例えば、上皮系細
胞、肝実質細胞、膵ラ島細胞、マクロファージ、単核
球、クッパー細胞、ラ島細胞、ＮＫ細胞（ＣＤ５
６+）、血小板、血液幹細胞等の未分化細胞（ＣＤ３
４+）、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、及びそのサブセット
（ＣＤ４+、ＣＤ８+、ＣＤ１９+、ＣＤ７１+、ＩＬ２Ｒ
+等）、各種の腫瘍細胞や機能細胞等より、目的に応じ
て選定される。
る。ここで、基材表面が相分離している場合、リガンド
が、相分離構造に従ってミクロ的に不均一に存在してい
るため、細胞が分離材料表面に吸着されるときにしばし
ば観察されるキャッピング現象が回避されソフトに吸着
することとなる。そのため、細胞の損傷が少なくなり、
吸着した細胞の機能を発現させる場合や分離精製（回
収）する場合に、優れた性能を発現することとなる。ま
た、標的とする細胞は限定されず、例えば、上皮系細
胞、肝実質細胞、膵ラ島細胞、マクロファージ、単核
球、クッパー細胞、ラ島細胞、ＮＫ細胞（ＣＤ５
６+）、血小板、血液幹細胞等の未分化細胞（ＣＤ３
４+）、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、及びそのサブセット
（ＣＤ４+、ＣＤ８+、ＣＤ１９+、ＣＤ７１+、ＩＬ２Ｒ
+等）、各種の腫瘍細胞や機能細胞等より、目的に応じ
て選定される。
【００１３】刺激応答性高分子としては、熱、ｐＨ、電
位、光等により高次構造が変化して、水溶液中で膨潤し
たり収縮する高分子であればよい。例えば、水に対する
上限臨界温度または下限臨界温度を有し、温度変化に応
答して、膨潤−収縮する高分子を好適に例示できる。そ
のような高分子としては、Ｎ−イソプロピルアクリルア
ミドやＮ,Ｎ−ジエチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロ
ピルメタアクリルアミドなどのアクリルアミドやメタア
クリルアミドの誘導体類をはじめ、ビニルメチルエーテ
ルなどのビニルエーテル類等のポリマーやコポリマーを
例示できる。
位、光等により高次構造が変化して、水溶液中で膨潤し
たり収縮する高分子であればよい。例えば、水に対する
上限臨界温度または下限臨界温度を有し、温度変化に応
答して、膨潤−収縮する高分子を好適に例示できる。そ
のような高分子としては、Ｎ−イソプロピルアクリルア
ミドやＮ,Ｎ−ジエチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロ
ピルメタアクリルアミドなどのアクリルアミドやメタア
クリルアミドの誘導体類をはじめ、ビニルメチルエーテ
ルなどのビニルエーテル類等のポリマーやコポリマーを
例示できる。
【００１４】また、光により構造変化させる場合は、例
えば、アゾベンゼン基を有する吸水性高分子のように光
異性化を起こす高分子、トリフェニルメタンロイコハイ
ドロオキシドのビニル誘導体とアクリルアミド系単量体
との共重合体のように光イオン解離する感応基を有する
光応答性高分子、スピロベンゾピランを含むＮ−イソプ
ロピルアクリルアミドゲルのように疎水性相互作用を光
制御することにより一定温度領域で光により相転移を生
じる光応答性高分子等を用いることができる。
えば、アゾベンゼン基を有する吸水性高分子のように光
異性化を起こす高分子、トリフェニルメタンロイコハイ
ドロオキシドのビニル誘導体とアクリルアミド系単量体
との共重合体のように光イオン解離する感応基を有する
光応答性高分子、スピロベンゾピランを含むＮ−イソプ
ロピルアクリルアミドゲルのように疎水性相互作用を光
制御することにより一定温度領域で光により相転移を生
じる光応答性高分子等を用いることができる。
【００１５】電気化学的に構造変化を生じさせるには、
ビニルフェロセンとＮ−イソプロピルアクリルアミドと
の共重合体のようにフェロセニル基を側鎖に有する電気
応答性高分子を例示することができる。フェロセニル基
は、還元状態では疎水性の官能基であるが、酸化される
と親水性が高まるため、一定の温度領域で電気化学的に
膨潤〜収縮を制御することができる。
ビニルフェロセンとＮ−イソプロピルアクリルアミドと
の共重合体のようにフェロセニル基を側鎖に有する電気
応答性高分子を例示することができる。フェロセニル基
は、還元状態では疎水性の官能基であるが、酸化される
と親水性が高まるため、一定の温度領域で電気化学的に
膨潤〜収縮を制御することができる。
【００１６】電気や光により制御できる温度領域は、前
記したアルキルアクリルアミドのような温度応答性高分
子を形成するモノマーに親水性モノマーや疎水性モノマ
ーを少量共重合させることにより、任意に制御すること
が可能である。例えば、疎水性モノマーを共重合させる
と相転移温度は低くなり、親水性モノマーを共重合させ
ると相転移温度は高くなる。
記したアルキルアクリルアミドのような温度応答性高分
子を形成するモノマーに親水性モノマーや疎水性モノマ
ーを少量共重合させることにより、任意に制御すること
が可能である。例えば、疎水性モノマーを共重合させる
と相転移温度は低くなり、親水性モノマーを共重合させ
ると相転移温度は高くなる。
【００１７】イオンにより構造変化を誘導したり加速す
るためには、イオン解離する官能基を有するモノマーを
共重合したり、イオンを捕捉する分子を側鎖に導入させ
てやればよい。例えば、ナトリウムやカリウムを認識す
るクラウンエーテル（ベンゾ[１８]クラウン−６など）
を側鎖に導入したポリＮ−イソプロピルアクリルアミド
は、ナトリウムイオンやカリウムイオンにより相転移が
引き起こされる。
るためには、イオン解離する官能基を有するモノマーを
共重合したり、イオンを捕捉する分子を側鎖に導入させ
てやればよい。例えば、ナトリウムやカリウムを認識す
るクラウンエーテル（ベンゾ[１８]クラウン−６など）
を側鎖に導入したポリＮ−イソプロピルアクリルアミド
は、ナトリウムイオンやカリウムイオンにより相転移が
引き起こされる。
【００１８】ｐＨやイオン強度等の環境による高分子構
造の変化も、細胞機能の損傷が激しくならない条件で使
用することができる。ｐＨやイオン強度による構造制御
は、カルボキシル基を有するポリアクリル酸やポリメタ
クリル酸、スルホン酸基を有するポリビニル硫酸やポリ
スチレンスルホン酸、アミノ基を有するポリビニルアミ
ンやポリビニルアリルアミンといったイオン解離基を有
する高分子化合物について適用できる。この場合、静電
相互作用による非特異的吸着が起こりやすいので注意し
なければならない。
造の変化も、細胞機能の損傷が激しくならない条件で使
用することができる。ｐＨやイオン強度による構造制御
は、カルボキシル基を有するポリアクリル酸やポリメタ
クリル酸、スルホン酸基を有するポリビニル硫酸やポリ
スチレンスルホン酸、アミノ基を有するポリビニルアミ
ンやポリビニルアリルアミンといったイオン解離基を有
する高分子化合物について適用できる。この場合、静電
相互作用による非特異的吸着が起こりやすいので注意し
なければならない。
【００１９】尚、上記技術を組み合わせることにより、
複数の環境変化に応答する高分子を有する刺激応答型分
離材料を作製することもできる。
複数の環境変化に応答する高分子を有する刺激応答型分
離材料を作製することもできる。
【００２０】標的物質に対して親和性を有する領域に
は、抗原−抗体、酵素−基質（阻害剤）、各種の生理活
性物質とそのレセプターとの反応等の生体の制御機構で
見られる特異的親和性により標的物質を吸着するリガン
ドや、静電相互作用、疎水性相互作用、水素結合、ファ
ンデルワールス相互作用等によって標的物質に対して親
和性を示す合成化合物やそれらの相互作用を効果的に発
現できるよう人工的に設計された分子認識素子等が存在
する。
は、抗原−抗体、酵素−基質（阻害剤）、各種の生理活
性物質とそのレセプターとの反応等の生体の制御機構で
見られる特異的親和性により標的物質を吸着するリガン
ドや、静電相互作用、疎水性相互作用、水素結合、ファ
ンデルワールス相互作用等によって標的物質に対して親
和性を示す合成化合物やそれらの相互作用を効果的に発
現できるよう人工的に設計された分子認識素子等が存在
する。
【００２１】標的物質に対して親和性を有する領域は、
刺激応答性高分子鎖と必ずしも化学的に結合していなく
てもよく、ブレンド法や積層法を利用して相分離構造を
形成させ、表面に結合されていればよい。また、金属、
セラミック、あるいは有機物よりなる直径５μｍ以下、
好ましくは２μｍ以下の微粉体などを利用して不均一構
造を形成させ、該微粉体上に標的物質に対して親和性を
有する物質を結合させることも可能である。
刺激応答性高分子鎖と必ずしも化学的に結合していなく
てもよく、ブレンド法や積層法を利用して相分離構造を
形成させ、表面に結合されていればよい。また、金属、
セラミック、あるいは有機物よりなる直径５μｍ以下、
好ましくは２μｍ以下の微粉体などを利用して不均一構
造を形成させ、該微粉体上に標的物質に対して親和性を
有する物質を結合させることも可能である。
【００２２】標的物質に対して、親和性を有する領域と
刺激応答性高分子鎖を化学的に結合させる方法として
は、刺激応答性高分子鎖中に導入された反応性官能基を
用いる方法が好ましい。この結合方法は、公知の化学反
応を用いた方法で達成できるが、両者の結合の間に、ス
ペーサーや２種以上の化合物よりなる結合が存在してい
てもよい。結合様式としては、生理的条件で容易に脱離
しないことが望ましいが、必ずしも共有結合である必要
はなく、イオンコンプレックスや電荷移動錯体等を利用
した結合でもかまわない。また、生理的条件で高い親和
性を有するビオチン−アビジン、ビオチン−ストレプト
アビジン、リボフラビン−リボフラビン結合蛋白、プロ
テインＡ−ＩｇＧ、プロテインＧ−ＩｇＧ等の生化学的
親和性を利用した結合であってもよい。ビオチン−アビ
ジンの組み合わせは、ビオチン標識抗体等が市販されて
おり容易に入手できるため、標的物質に対する抗体をア
ビジンを介して反応性官能基に固定化することができ
る。
刺激応答性高分子鎖を化学的に結合させる方法として
は、刺激応答性高分子鎖中に導入された反応性官能基を
用いる方法が好ましい。この結合方法は、公知の化学反
応を用いた方法で達成できるが、両者の結合の間に、ス
ペーサーや２種以上の化合物よりなる結合が存在してい
てもよい。結合様式としては、生理的条件で容易に脱離
しないことが望ましいが、必ずしも共有結合である必要
はなく、イオンコンプレックスや電荷移動錯体等を利用
した結合でもかまわない。また、生理的条件で高い親和
性を有するビオチン−アビジン、ビオチン−ストレプト
アビジン、リボフラビン−リボフラビン結合蛋白、プロ
テインＡ−ＩｇＧ、プロテインＧ−ＩｇＧ等の生化学的
親和性を利用した結合であってもよい。ビオチン−アビ
ジンの組み合わせは、ビオチン標識抗体等が市販されて
おり容易に入手できるため、標的物質に対する抗体をア
ビジンを介して反応性官能基に固定化することができ
る。
【００２３】反応性官能基とは、標的物質に対して親和
性を有するリガンドを結合できる官能基であれば良く、
カルボキシル基、アルデヒド基、アミノ基、イミノ基、
スルホン酸基、エポキシ基、イソシアネート基、酸クロ
リド基、ヒドロキシ基、チオール基、ジスルフィド基等
の官能基を例示できる。また、カルボニルジイミダゾー
ル、トシル、トレシル等で活性化されていてもかまわな
い。これらの官能基を利用して、直接あるいは縮合剤や
架橋剤を用いて、標的物質に対するリガンドを結合する
ことが可能である。反応性官能基がエポキシ基のよう
に、直接アミノ基やカルボキシル基と反応するタイプで
あると反応操作が簡略化できるため好ましい。ヒドロキ
シ基のように反応性の低い官能基の場合、両末端に反応
性の高い官能基を有する架橋剤、例えばポリイソシアネ
ート化合物、ポリエポキシ化合物、ジアルデヒド化合物
などを利用してリガンドを固定化することも可能であ
る。
性を有するリガンドを結合できる官能基であれば良く、
カルボキシル基、アルデヒド基、アミノ基、イミノ基、
スルホン酸基、エポキシ基、イソシアネート基、酸クロ
リド基、ヒドロキシ基、チオール基、ジスルフィド基等
の官能基を例示できる。また、カルボニルジイミダゾー
ル、トシル、トレシル等で活性化されていてもかまわな
い。これらの官能基を利用して、直接あるいは縮合剤や
架橋剤を用いて、標的物質に対するリガンドを結合する
ことが可能である。反応性官能基がエポキシ基のよう
に、直接アミノ基やカルボキシル基と反応するタイプで
あると反応操作が簡略化できるため好ましい。ヒドロキ
シ基のように反応性の低い官能基の場合、両末端に反応
性の高い官能基を有する架橋剤、例えばポリイソシアネ
ート化合物、ポリエポキシ化合物、ジアルデヒド化合物
などを利用してリガンドを固定化することも可能であ
る。
【００２４】反応性官能基を有する分子鎖を形成させる
方法は、公知の方法でかまわない。例えば、反応性官能
基を有する単量体を単独重合したり、他の単量体と共重
合することにより反応性官能基を有する分子鎖を形成さ
せる方法や、すでに形成された分子鎖を化学修飾するこ
とにより反応性の高い官能基を導入する方法などを例示
できる。
方法は、公知の方法でかまわない。例えば、反応性官能
基を有する単量体を単独重合したり、他の単量体と共重
合することにより反応性官能基を有する分子鎖を形成さ
せる方法や、すでに形成された分子鎖を化学修飾するこ
とにより反応性の高い官能基を導入する方法などを例示
できる。
【００２５】分離材料の基材は、特に限定されないが、
多孔質膜、多孔質フィルター等の多孔質体が好ましく、
無孔質体でもかまわない。さらに、その形状も特に限定
されず、プレート状、シャーレ状、繊維状、不織布状、
ビーズ状等を例示でき、それぞれの形状にあったカラム
なりモジュールなどに収納されて使用されてもかまわな
い。
多孔質膜、多孔質フィルター等の多孔質体が好ましく、
無孔質体でもかまわない。さらに、その形状も特に限定
されず、プレート状、シャーレ状、繊維状、不織布状、
ビーズ状等を例示でき、それぞれの形状にあったカラム
なりモジュールなどに収納されて使用されてもかまわな
い。
【００２６】また、その基材となる材質についても水に
対して非溶解性であれば特に限定されず、ポリオレフィ
ン、ハロゲン化ポリオレフィン、ポリウレタン、ポリア
ミド、ポリエステル、綿、ポリスチレン、及びそれらの
変性物や共重合体等、既存の材料を例示することができ
る。
対して非溶解性であれば特に限定されず、ポリオレフィ
ン、ハロゲン化ポリオレフィン、ポリウレタン、ポリア
ミド、ポリエステル、綿、ポリスチレン、及びそれらの
変性物や共重合体等、既存の材料を例示することができ
る。
【００２７】本発明の刺激応答性分離材料の製造方法
は、限定されず、 基材表面に刺激応答性領域よりなる分子鎖と反応性官
能基を有する分子鎖とを有するブロック共重合体、グラ
フト共重合体、交互共重合体もしくはランダム共重合体
を主成分とする基材表面を形成させた後、標的物質に対
して親和性を有する物質を該共重合体の反応性官能基に
固定化させる方法、 刺激応答性領域よりなる分子鎖と反応性官能基を有す
る分子鎖とを有するブロック共重合体、グラフト共重合
体、交互共重合体もしくはランダム共重合体に、標的物
質に対して親和性を有する物質を該共重合体の反応性官
能基に結合させた後、基材表面上に保持させる方法、 刺激応答性領域よりなる分子鎖と反応性官能基を有す
る分子鎖とを有するブロック共重合体、グラフト共重合
体、交互共重合体もしくはランダム共重合体と、標的物
質に対して親和性を有する物質とを含む溶液を基材表面
上に塗布した後、お互いを反応させる方法、等が挙げら
れる。
は、限定されず、 基材表面に刺激応答性領域よりなる分子鎖と反応性官
能基を有する分子鎖とを有するブロック共重合体、グラ
フト共重合体、交互共重合体もしくはランダム共重合体
を主成分とする基材表面を形成させた後、標的物質に対
して親和性を有する物質を該共重合体の反応性官能基に
固定化させる方法、 刺激応答性領域よりなる分子鎖と反応性官能基を有す
る分子鎖とを有するブロック共重合体、グラフト共重合
体、交互共重合体もしくはランダム共重合体に、標的物
質に対して親和性を有する物質を該共重合体の反応性官
能基に結合させた後、基材表面上に保持させる方法、 刺激応答性領域よりなる分子鎖と反応性官能基を有す
る分子鎖とを有するブロック共重合体、グラフト共重合
体、交互共重合体もしくはランダム共重合体と、標的物
質に対して親和性を有する物質とを含む溶液を基材表面
上に塗布した後、お互いを反応させる方法、等が挙げら
れる。
【００２８】〜の場合において、該共重合体もしく
は親和性を有する物質の基材表面への導入方法は限定さ
れず、基材の反応性官能基と化学結合させても、基材表
面に含浸させるだけでもよい。さらに、グラフト共重合
体の場合においては基材表面上に直接、刺激応答性モノ
マーと反応性官能基を有するモノマーをグラフト共重合
してもよい。
は親和性を有する物質の基材表面への導入方法は限定さ
れず、基材の反応性官能基と化学結合させても、基材表
面に含浸させるだけでもよい。さらに、グラフト共重合
体の場合においては基材表面上に直接、刺激応答性モノ
マーと反応性官能基を有するモノマーをグラフト共重合
してもよい。
【００２９】また、基材への刺激応答性領域よりなる高
分子鎖と反応性官能基を有する分子鎖とを有するブロッ
ク共重合体、グラフト共重合体、交互共重合体もしくは
ランダム共重合体の保持において、基材表面にあらかじ
め反応性官能基を有するモノマーをグラフト重合させて
おいてもよい。さらに、基材への前記共重合体の保持に
おいて刺激応答性領域を有さないポリマーを第三成分と
して添加してもよい。この第三成分のポリマーとして
は、リガンドを結合でき、または反応性官能基を有する
分子鎖同士を結合できる官能基を持ったポリマーであれ
ば特に限定されない。
分子鎖と反応性官能基を有する分子鎖とを有するブロッ
ク共重合体、グラフト共重合体、交互共重合体もしくは
ランダム共重合体の保持において、基材表面にあらかじ
め反応性官能基を有するモノマーをグラフト重合させて
おいてもよい。さらに、基材への前記共重合体の保持に
おいて刺激応答性領域を有さないポリマーを第三成分と
して添加してもよい。この第三成分のポリマーとして
は、リガンドを結合でき、または反応性官能基を有する
分子鎖同士を結合できる官能基を持ったポリマーであれ
ば特に限定されない。
【００３０】分離材料に吸着した標的物質の回収は、温
度、光、電気等の刺激により刺激応答性高分子の高次構
造を急速に変化せしめることにより行う。例えば、刺激
応答性領域が収縮した条件下でリガンドが表面に存在す
る分離材料の場合、この状態で標的物質を吸着させた
後、外部刺激により刺激応答性領域を膨潤させることに
より、その急激な環境変化を利用して標的物質が材料表
面より脱着することとなる。さらに、この回収方法にプ
ロテアーゼ処理等の従来技術を併用しても、相乗効果に
より短時間での細胞回収が容易になる。
度、光、電気等の刺激により刺激応答性高分子の高次構
造を急速に変化せしめることにより行う。例えば、刺激
応答性領域が収縮した条件下でリガンドが表面に存在す
る分離材料の場合、この状態で標的物質を吸着させた
後、外部刺激により刺激応答性領域を膨潤させることに
より、その急激な環境変化を利用して標的物質が材料表
面より脱着することとなる。さらに、この回収方法にプ
ロテアーゼ処理等の従来技術を併用しても、相乗効果に
より短時間での細胞回収が容易になる。
【００３１】脱着させた場合の回収率は、固定化したリ
ガンドの種類や状態、刺激応答領域と吸着領域の構造や
組成比により異なり、使用条件に応じた条件設定が必要
となるが、５０％以上、好ましくは８０％以上である。
ガンドの種類や状態、刺激応答領域と吸着領域の構造や
組成比により異なり、使用条件に応じた条件設定が必要
となるが、５０％以上、好ましくは８０％以上である。
【００３２】標的物質と刺激応答性高分子の間に弱い結
合が存在する場合、その結合を解離することによって標
的物質を脱離させてもかまわない。回収率の向上などを
目的として、必要に応じて物理的な方法や化学的な方法
を併用してもかまわない。物理的な方法としては、撹拌
等が挙げられ、化学的な方法としては加熱／冷却変化、
ｐＨ変動、イオン強度変化等が挙げられる。
合が存在する場合、その結合を解離することによって標
的物質を脱離させてもかまわない。回収率の向上などを
目的として、必要に応じて物理的な方法や化学的な方法
を併用してもかまわない。物理的な方法としては、撹拌
等が挙げられ、化学的な方法としては加熱／冷却変化、
ｐＨ変動、イオン強度変化等が挙げられる。
【００３３】ここで、基材が多孔質膜の場合、平均孔径
が０.０１μｍ〜１μｍである微多孔質膜であるのが好
ましく、さらには平均孔径が０.０２μｍ〜０.８μｍの
ものであるのが好ましい。平均孔径は、パームポロメー
ターにより測定された平均孔径であり、原理はＡＳＴＭ
−３１６に記載されている。細胞の大きさは一般に約数
μｍ〜数十μｍのため、前記平均孔径の時、該微多孔質
膜を通過することができず、多くの細胞は膜の表面もし
くは表層部に捕捉されることとなる。平均孔径が１μｍ
を越える場合や０.０１μｍより小さい場合は、細胞と
基材表面との接触面積が大きくなり、該微多孔質膜を用
いる効果が低くなる。さらに、該微多孔質膜を用いる
時、その膜厚は、５μｍ〜５０００μｍ程度が好まし
く、さらに好ましくは２０μｍ〜４００μｍである。こ
こで、５μｍ以下だと膜強度が弱くなり、５０００μｍ
を越えると体積が増加しモジュールが大きくなり過ぎ
る。また、その形状は、平膜状であっても中空糸・チュ
ーブ状であっても良い。
が０.０１μｍ〜１μｍである微多孔質膜であるのが好
ましく、さらには平均孔径が０.０２μｍ〜０.８μｍの
ものであるのが好ましい。平均孔径は、パームポロメー
ターにより測定された平均孔径であり、原理はＡＳＴＭ
−３１６に記載されている。細胞の大きさは一般に約数
μｍ〜数十μｍのため、前記平均孔径の時、該微多孔質
膜を通過することができず、多くの細胞は膜の表面もし
くは表層部に捕捉されることとなる。平均孔径が１μｍ
を越える場合や０.０１μｍより小さい場合は、細胞と
基材表面との接触面積が大きくなり、該微多孔質膜を用
いる効果が低くなる。さらに、該微多孔質膜を用いる
時、その膜厚は、５μｍ〜５０００μｍ程度が好まし
く、さらに好ましくは２０μｍ〜４００μｍである。こ
こで、５μｍ以下だと膜強度が弱くなり、５０００μｍ
を越えると体積が増加しモジュールが大きくなり過ぎ
る。また、その形状は、平膜状であっても中空糸・チュ
ーブ状であっても良い。
【００３４】該微多孔質膜が非対象膜構造の場合、最表
面の平均孔径が細胞より大きくなり、細胞を捕捉する活
性層が膜内部に形成されることもありうる。好ましく
は、膜の最表面で細胞を捕捉できる膜である。すなわ
ち、白血球が貧食細胞により曲率の大きい繊維の表面に
吸着している状態ではなく、微細孔を有する平面上に吸
着されていることが望ましい。従って、該微多孔質膜
は、網目状、スポンジ状、微粒子状、延伸法により多孔
質化されたミクロフィブリル状の膜構造、微細繊維の集
合体状を有することが好ましい。そのような多孔質膜の
製造方法は、公知の相分離法により溶液や溶融状態から
製膜された。
面の平均孔径が細胞より大きくなり、細胞を捕捉する活
性層が膜内部に形成されることもありうる。好ましく
は、膜の最表面で細胞を捕捉できる膜である。すなわ
ち、白血球が貧食細胞により曲率の大きい繊維の表面に
吸着している状態ではなく、微細孔を有する平面上に吸
着されていることが望ましい。従って、該微多孔質膜
は、網目状、スポンジ状、微粒子状、延伸法により多孔
質化されたミクロフィブリル状の膜構造、微細繊維の集
合体状を有することが好ましい。そのような多孔質膜の
製造方法は、公知の相分離法により溶液や溶融状態から
製膜された。
【００３５】さらに、前記のような微多孔質膜の場合
は、必ずしも刺激応答性高分子は必要でない。それは、
該微多孔質膜の平均孔径が細胞より小さいため、細胞表
面は、膜の実質部位と空孔部位とのミクロ的に不均一な
表面上に捕捉されていることとなる。すなわち、細胞
は、膜表面に結合されたリガンドとミクロ的に不均一に
結合しているため、細胞が表面に吸着するときにしばし
ば観察されるキャッピング現象が回避され、ソフトに吸
着することとなる。そのため、細胞の損傷が少なくな
り、吸着した細胞の機能が良好に維持されることとな
る。細胞吸着部位における実質部位と空孔部位との比率
は、空孔部位が２０〜９５％、好ましくは、４０〜９０
％である。
は、必ずしも刺激応答性高分子は必要でない。それは、
該微多孔質膜の平均孔径が細胞より小さいため、細胞表
面は、膜の実質部位と空孔部位とのミクロ的に不均一な
表面上に捕捉されていることとなる。すなわち、細胞
は、膜表面に結合されたリガンドとミクロ的に不均一に
結合しているため、細胞が表面に吸着するときにしばし
ば観察されるキャッピング現象が回避され、ソフトに吸
着することとなる。そのため、細胞の損傷が少なくな
り、吸着した細胞の機能が良好に維持されることとな
る。細胞吸着部位における実質部位と空孔部位との比率
は、空孔部位が２０〜９５％、好ましくは、４０〜９０
％である。
【００３６】前記微多孔質膜を基材とした場合の細胞回
収方法は、該微多孔質膜の一方の側より被処理液を流し
て標的細胞を吸着せしめた後、細胞回収液を反対側の面
より流し、標的細胞を回収する。該微多孔質膜は、平均
孔径が細胞の大きさより小さいため、該微多孔質膜を通
過せず膜の表層部にトラップされている。そのため、細
胞が脱着しやすい方向に圧力をかけることにより、効率
良く細胞を回収することが可能となる。プロテアーゼ処
理により基材表面から細胞を剥離させる場合、該微多孔
質膜は、細胞培養用フラスコのような非多孔性表面と比
較して、基材表面との接着部位が少ないため基材表面か
ら細胞を容易に剥離させることが可能である。ここで、
該微多孔質膜を用いた場合の標的物質は細胞に限定され
ない。
収方法は、該微多孔質膜の一方の側より被処理液を流し
て標的細胞を吸着せしめた後、細胞回収液を反対側の面
より流し、標的細胞を回収する。該微多孔質膜は、平均
孔径が細胞の大きさより小さいため、該微多孔質膜を通
過せず膜の表層部にトラップされている。そのため、細
胞が脱着しやすい方向に圧力をかけることにより、効率
良く細胞を回収することが可能となる。プロテアーゼ処
理により基材表面から細胞を剥離させる場合、該微多孔
質膜は、細胞培養用フラスコのような非多孔性表面と比
較して、基材表面との接着部位が少ないため基材表面か
ら細胞を容易に剥離させることが可能である。ここで、
該微多孔質膜を用いた場合の標的物質は細胞に限定され
ない。
【００３７】また、前記微多孔質膜は、市販のフィルタ
ーホルダーや公知の形態のモジュールに組み込んで使用
することが可能である。
ーホルダーや公知の形態のモジュールに組み込んで使用
することが可能である。
【００３８】
（実施例１）標的物質としてＣＤ４+細胞（ＭＴ−４）
を設定し、標的物質に対して特異的親和性を有する物質
として抗ＣＤ４抗体（Ｌｅｕ−３ａ）、刺激応答性高分
子としてポリ（Ｎ,Ｎ−ジエチルアクリルアミド）を用
いて刺激応答性分離材料を作製し、ＣＤ４+細胞の分離
を検討した。
を設定し、標的物質に対して特異的親和性を有する物質
として抗ＣＤ４抗体（Ｌｅｕ−３ａ）、刺激応答性高分
子としてポリ（Ｎ,Ｎ−ジエチルアクリルアミド）を用
いて刺激応答性分離材料を作製し、ＣＤ４+細胞の分離
を検討した。
【００３９】主鎖にアゾ基を有するポリ（グリシジルメ
タクリレート）を重合開始剤として、Ｎ,Ｎ−ジエチル
アクリルアミドをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中
で８０℃、１６時間重合し、石油エーテル中で再沈殿さ
せた後、ポリマーを減圧乾燥させることにより、刺激応
答性ドメインとしてポリ（Ｎ,Ｎ−ジエチルアクリルア
ミド）、反応性ドメインとしてポリ（グリシジルメタク
リレート）を有するブロック共重合体（モル組成比３：
１）を得た。
タクリレート）を重合開始剤として、Ｎ,Ｎ−ジエチル
アクリルアミドをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中
で８０℃、１６時間重合し、石油エーテル中で再沈殿さ
せた後、ポリマーを減圧乾燥させることにより、刺激応
答性ドメインとしてポリ（Ｎ,Ｎ−ジエチルアクリルア
ミド）、反応性ドメインとしてポリ（グリシジルメタク
リレート）を有するブロック共重合体（モル組成比３：
１）を得た。
【００４０】このブロック共重合体の３wt％ジオキサン
溶液を、厚さ１００μｍのポリウレタンシートにコーテ
ィングした。続いて、０.０１wt％のポリエチレンイミ
ン（平均分子量１２００）を含む抗ＣＤ４抗体の５ｍｇ
／ｍｌ溶液をコーティングした後、３８℃で１６時間反
応させることにより、刺激応答型分離材料を得た。
溶液を、厚さ１００μｍのポリウレタンシートにコーテ
ィングした。続いて、０.０１wt％のポリエチレンイミ
ン（平均分子量１２００）を含む抗ＣＤ４抗体の５ｍｇ
／ｍｌ溶液をコーティングした後、３８℃で１６時間反
応させることにより、刺激応答型分離材料を得た。
【００４１】この材料に、人新鮮血バフィーコートより
１％アルブミン添加リン酸バッファー（ＰＢＳ）で洗浄
して調整した白血球液（１×１０6／ｍｌ）を３７℃で
接触させることにより、ＣＤ４+細胞を吸着させた。位
相差顕微鏡を用いて、吸着細胞の脱着を観察したとこ
ろ、１％アルブミンを添加したＰＢＳで２５℃でリンス
することにより脱着できることを確認した。
１％アルブミン添加リン酸バッファー（ＰＢＳ）で洗浄
して調整した白血球液（１×１０6／ｍｌ）を３７℃で
接触させることにより、ＣＤ４+細胞を吸着させた。位
相差顕微鏡を用いて、吸着細胞の脱着を観察したとこ
ろ、１％アルブミンを添加したＰＢＳで２５℃でリンス
することにより脱着できることを確認した。
【００４２】（実施例２）１.０wt％のポリメタクリル
酸を溶解させたＤＭＳＯ溶液と、実施例１で作製したブ
ロック共重合体の４wt％ＤＭＳＯ溶液を１：１で混合し
た後、ポリメタクリル酸を表面グラフト重合したポリエ
チレンシートにコ−ティングした後、６０℃、４０時間
反応させた。続いて、５ｍｇ／ｍｌの１−エチル−３−
（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（シグマ社
製）溶液２０ｍｌ（ｐＨ５.５）をシャーレに注入し、
５分間室温で浸漬させた。続いて、抗ＣＤ４抗体（Ｌｅ
ｕ−３ａ）の５ｍｇ／ｍｌ溶液と接触させて室温で１時
間時々撹拌しながら反応させた後、グリシンを最終濃度
で０.２モルとなるように添加して１時間放置した後、
ＰＢＳでリンスすることにより刺激応答型分離材料を作
製した。
酸を溶解させたＤＭＳＯ溶液と、実施例１で作製したブ
ロック共重合体の４wt％ＤＭＳＯ溶液を１：１で混合し
た後、ポリメタクリル酸を表面グラフト重合したポリエ
チレンシートにコ−ティングした後、６０℃、４０時間
反応させた。続いて、５ｍｇ／ｍｌの１−エチル−３−
（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（シグマ社
製）溶液２０ｍｌ（ｐＨ５.５）をシャーレに注入し、
５分間室温で浸漬させた。続いて、抗ＣＤ４抗体（Ｌｅ
ｕ−３ａ）の５ｍｇ／ｍｌ溶液と接触させて室温で１時
間時々撹拌しながら反応させた後、グリシンを最終濃度
で０.２モルとなるように添加して１時間放置した後、
ＰＢＳでリンスすることにより刺激応答型分離材料を作
製した。
【００４３】この材料に、人新鮮血バフィーコートより
１％アルブミン添加ＰＢＳで洗浄して調整した白血球液
（１×１０6／ｍｌ）を３７℃で接触させることによ
り、ＣＤ４+細胞（ＭＴ−４）を吸着させた。位相差顕
微鏡を用いて、吸着細胞の脱着を観察したところ、１％
アルブミンを添加したＰＢＳで２５℃でリンスすること
により脱着できることを確認した。
１％アルブミン添加ＰＢＳで洗浄して調整した白血球液
（１×１０6／ｍｌ）を３７℃で接触させることによ
り、ＣＤ４+細胞（ＭＴ−４）を吸着させた。位相差顕
微鏡を用いて、吸着細胞の脱着を観察したところ、１％
アルブミンを添加したＰＢＳで２５℃でリンスすること
により脱着できることを確認した。
【００４４】（実施例３）主鎖にパーオキサイド基を有
するグリシジルメタクリレートとメチルアクリレートと
の共重合体（モル組成比１：１）を重合開始剤として、
Ｎ−イソプロピルアクリルアミドをＤＭＳＯ中で８０
℃、１６時間重合して、刺激応答性ドメインとしてポリ
（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、反応性ドメイン
としてポリ（グリシジルメタクリレート−メチルアクリ
レート共重合体）を有するブロック共重合体（モル組成
比４.８：１）を得た。
するグリシジルメタクリレートとメチルアクリレートと
の共重合体（モル組成比１：１）を重合開始剤として、
Ｎ−イソプロピルアクリルアミドをＤＭＳＯ中で８０
℃、１６時間重合して、刺激応答性ドメインとしてポリ
（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、反応性ドメイン
としてポリ（グリシジルメタクリレート−メチルアクリ
レート共重合体）を有するブロック共重合体（モル組成
比４.８：１）を得た。
【００４５】０.５wt％の抗ＣＤ４抗体（Ｌｅｕ−３
ａ）を含む２０％ＤＭＳＯ溶液に上記ブロック共重合体
２wt％を含む６０％ＤＭＳＯ溶液を１：１で混合した
後、ポリメタクリル酸を表面グラフト重合したポリエチ
レンシートにコーティングし、６０℃、４０時間反応さ
せた。
ａ）を含む２０％ＤＭＳＯ溶液に上記ブロック共重合体
２wt％を含む６０％ＤＭＳＯ溶液を１：１で混合した
後、ポリメタクリル酸を表面グラフト重合したポリエチ
レンシートにコーティングし、６０℃、４０時間反応さ
せた。
【００４６】この材料に、人新鮮血バフィーコートより
１％アルブミン添加ＰＢＳで洗浄して調整した白血球液
（１×１０6／ｍｌ）を３７℃で接触させることによ
り、ＣＤ４+細胞（ＭＴ−４）を吸着させた。位相差顕
微鏡を用いて、吸着細胞の脱着を観察したところ、１％
アルブミンを添加したＰＢＳで２５℃でリンスすること
により脱着できることを確認した。
１％アルブミン添加ＰＢＳで洗浄して調整した白血球液
（１×１０6／ｍｌ）を３７℃で接触させることによ
り、ＣＤ４+細胞（ＭＴ−４）を吸着させた。位相差顕
微鏡を用いて、吸着細胞の脱着を観察したところ、１％
アルブミンを添加したＰＢＳで２５℃でリンスすること
により脱着できることを確認した。
【００４７】（実施例４，比較例１）標的細胞としてＣ
Ｄ４+細胞（ＭＴ−４）、標的細胞に対して特異的親和
性を有する物質として坑ＣＤ４抗体（Ｌｅｕ−３ａ）、
微多孔質膜としてポリプロピレンを主成分とする微多孔
質膜（平均孔径０.１４μｍ、膜厚８０μｍ、表面網目
状）を用いて実験を行った。又、比較例１として、未延
伸ポリプロピレンフィルム（膜厚６０μｍ）を用いて同
様に実験を行った。
Ｄ４+細胞（ＭＴ−４）、標的細胞に対して特異的親和
性を有する物質として坑ＣＤ４抗体（Ｌｅｕ−３ａ）、
微多孔質膜としてポリプロピレンを主成分とする微多孔
質膜（平均孔径０.１４μｍ、膜厚８０μｍ、表面網目
状）を用いて実験を行った。又、比較例１として、未延
伸ポリプロピレンフィルム（膜厚６０μｍ）を用いて同
様に実験を行った。
【００４８】主鎖にアゾ基を有するポリ（グリシジルメ
タクリレート）を重合開始剤として、メトキシエチルア
クリレ−トをＤＭＳＯ中で８０℃、１６時間重合し、イ
ソプロピルエーテル中で再沈殿させた後、ポリマーを減
圧乾燥させることにより、メトキシエチルアクリレート
とグリシジルメタクリレートのブロック共重合体（モル
組成比４.５：１）を得た。
タクリレート）を重合開始剤として、メトキシエチルア
クリレ−トをＤＭＳＯ中で８０℃、１６時間重合し、イ
ソプロピルエーテル中で再沈殿させた後、ポリマーを減
圧乾燥させることにより、メトキシエチルアクリレート
とグリシジルメタクリレートのブロック共重合体（モル
組成比４.５：１）を得た。
【００４９】このブロック共重合体の２wt％テトラヒド
ロフラン溶液を、ポリプロピレン製微多孔質膜にコーテ
ィングした。続いて、０.５wt％のポリエチレンイミン
（平均分子量１２００）のメタノール／水（１：１）溶
液をコーティングした後、６０℃で１６時間反応させる
ことにより、基材表面にポリエチレンイミンを結合した
微多孔質膜を得た。 続いて、２０ｍｇ／ｍｌの１−エ
チル−３−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド
（シグマ社製）溶液２０ｍｌ（ｐＨ４.５）をシャーレ
に注入し、３時間室温で浸漬させた。続いて、抗ＣＤ４
抗体の５０μｇ／ｍｌ溶液と接触させて４℃で１６時間
時々撹拌しながら反応させた後、ＰＢＳで洗浄した。
ロフラン溶液を、ポリプロピレン製微多孔質膜にコーテ
ィングした。続いて、０.５wt％のポリエチレンイミン
（平均分子量１２００）のメタノール／水（１：１）溶
液をコーティングした後、６０℃で１６時間反応させる
ことにより、基材表面にポリエチレンイミンを結合した
微多孔質膜を得た。 続いて、２０ｍｇ／ｍｌの１−エ
チル−３−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド
（シグマ社製）溶液２０ｍｌ（ｐＨ４.５）をシャーレ
に注入し、３時間室温で浸漬させた。続いて、抗ＣＤ４
抗体の５０μｇ／ｍｌ溶液と接触させて４℃で１６時間
時々撹拌しながら反応させた後、ＰＢＳで洗浄した。
【００５０】本材料及び比較例１のフィルムに、人新鮮
血バフィーコートより１％アルブミン添加ＰＢＳで洗浄
して調整した白血球液（１×１０6／ｍｌ）を３７℃で
接触させて、ＣＤ４+細胞を吸着させた。細胞の脱着
は、ＥＤＴＡ/トリプシン溶液を加えた後、位相差顕微
鏡で観察した。微多孔質膜のほうがフィルムと比較し
て、細胞の脱着が速かった。
血バフィーコートより１％アルブミン添加ＰＢＳで洗浄
して調整した白血球液（１×１０6／ｍｌ）を３７℃で
接触させて、ＣＤ４+細胞を吸着させた。細胞の脱着
は、ＥＤＴＡ/トリプシン溶液を加えた後、位相差顕微
鏡で観察した。微多孔質膜のほうがフィルムと比較し
て、細胞の脱着が速かった。
【００５１】（実施例５，比較例２）標的細胞としてＣ
Ｄ４+細胞（ＭＴ−４）、標的細胞に対して特異的親和
性を有する物質として抗ＣＤ４抗体（Ｌｅｕ−３ａ）、
微多孔質膜としてポリビニリデンフルオライドを主成分
とする微多孔質膜（平均孔径０.４７μｍ、膜厚８０μ
ｍ、表面スポンジ状）を用いて実験を行った。又、比較
例２として、ポリビニリデンフルオライドフィルム（膜
厚６０μｍ）を用いて同様に実験を行った。
Ｄ４+細胞（ＭＴ−４）、標的細胞に対して特異的親和
性を有する物質として抗ＣＤ４抗体（Ｌｅｕ−３ａ）、
微多孔質膜としてポリビニリデンフルオライドを主成分
とする微多孔質膜（平均孔径０.４７μｍ、膜厚８０μ
ｍ、表面スポンジ状）を用いて実験を行った。又、比較
例２として、ポリビニリデンフルオライドフィルム（膜
厚６０μｍ）を用いて同様に実験を行った。
【００５２】主鎖にパーオキサイド基を有するポリ（グ
リシジルメタクリレート）を重合開始剤として、Ｎ−イ
ソプロピルアクリルアミドをＤＭＳＯ中で８０℃、１６
時間重合し、イソプロピルエーテル中で再沈殿させた
後、ポリマーを減圧乾燥させることにより、刺激応答性
ドメインとしてポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミ
ド）、反応性ドメインとしてポリ（グリシジルメタクリ
レート）を有するブロック共重合体（モル組成比３.
２：１）を得た。
リシジルメタクリレート）を重合開始剤として、Ｎ−イ
ソプロピルアクリルアミドをＤＭＳＯ中で８０℃、１６
時間重合し、イソプロピルエーテル中で再沈殿させた
後、ポリマーを減圧乾燥させることにより、刺激応答性
ドメインとしてポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミ
ド）、反応性ドメインとしてポリ（グリシジルメタクリ
レート）を有するブロック共重合体（モル組成比３.
２：１）を得た。
【００５３】このブロック共重合体の２wt％テトラヒド
ロフラン溶液を、ポリビニリデンフルオライド製微多孔
質膜にコーティングした。続いて、０.５wt％のポリエ
チレンイミン（平均分子量１２００）のメタノール／水
（１：１）溶液をコーティングした後、６０℃で１６時
間反応させることにより、表面にポリエチレンイミンを
結合した刺激応答型分離材料を得た。続いて、２０ｍｇ
／ｍｌの１−エチル−３−（ジメチルアミノプロピル）
カルボジイミド（シグマ社製）溶液を２０ｍｌ（ｐＨ
５.５）シャーレに注入し、４時間室温で浸漬させた。
続いて、抗ＣＤ４抗体の５０μｇ／ｍｌ溶液と接触させ
て４℃で１６時間時々撹拌しながら反応させた後、ＰＢ
Ｓでリンスした。
ロフラン溶液を、ポリビニリデンフルオライド製微多孔
質膜にコーティングした。続いて、０.５wt％のポリエ
チレンイミン（平均分子量１２００）のメタノール／水
（１：１）溶液をコーティングした後、６０℃で１６時
間反応させることにより、表面にポリエチレンイミンを
結合した刺激応答型分離材料を得た。続いて、２０ｍｇ
／ｍｌの１−エチル−３−（ジメチルアミノプロピル）
カルボジイミド（シグマ社製）溶液を２０ｍｌ（ｐＨ
５.５）シャーレに注入し、４時間室温で浸漬させた。
続いて、抗ＣＤ４抗体の５０μｇ／ｍｌ溶液と接触させ
て４℃で１６時間時々撹拌しながら反応させた後、ＰＢ
Ｓでリンスした。
【００５４】ＣＤ４+細胞をＰＲＭＩ１６４０培地で１
×１０6／ｍｌに調製した後、３７℃で試料と接触させ
ることにより、ＣＤ４+細胞を吸着させた。４℃に冷却
したＰＢＳを添加した後、位相差顕微鏡で観察したとこ
ろ、微多孔質膜では吸着細胞が脱着していたが、フィル
ムでは部分的に脱着していない細胞が観察された。
×１０6／ｍｌに調製した後、３７℃で試料と接触させ
ることにより、ＣＤ４+細胞を吸着させた。４℃に冷却
したＰＢＳを添加した後、位相差顕微鏡で観察したとこ
ろ、微多孔質膜では吸着細胞が脱着していたが、フィル
ムでは部分的に脱着していない細胞が観察された。
【００５５】（実施例６，比較例３）基材として、ポリ
ウレタン製フィルター（膜厚１５０μｍ、平均孔径０.
６μｍおよび１.４μｍ，表面スポンジ状）を用いて、
標的細胞としてＣＤ４+細胞（ＭＴ−４）、標的細胞に
対して特異的親和性を有する物質として抗ＣＤ４抗体
（Ｌｅｕ−３ａ）を用いて、実施例５と同様に実験を行
った。また、比較例３として無孔性のポリウレタンフィ
ルムを用いて同様に実験を行った。
ウレタン製フィルター（膜厚１５０μｍ、平均孔径０.
６μｍおよび１.４μｍ，表面スポンジ状）を用いて、
標的細胞としてＣＤ４+細胞（ＭＴ−４）、標的細胞に
対して特異的親和性を有する物質として抗ＣＤ４抗体
（Ｌｅｕ−３ａ）を用いて、実施例５と同様に実験を行
った。また、比較例３として無孔性のポリウレタンフィ
ルムを用いて同様に実験を行った。
【００５６】脱離回収した細胞数を比較したところ、平
均孔径が０.６μｍのウレタンフィルターが51000個、平
均孔径が１.４μｍのウレタンフィルターが26000個、ウ
レタンフィルムでは22000個であり、微多孔質膜の優位
性が確認された。
均孔径が０.６μｍのウレタンフィルターが51000個、平
均孔径が１.４μｍのウレタンフィルターが26000個、ウ
レタンフィルムでは22000個であり、微多孔質膜の優位
性が確認された。
【００５７】（実施例７）実施例５の膜を、平膜用モジ
ュール（有効膜面積２４ｃｍ2)を用いて評価した。該モ
ジュールは、膜で隔たれた２つの空間を有し、一方の空
間に液体流入口と液体流出口があり、もう一方の空間に
回収液の流入口がある。
ュール（有効膜面積２４ｃｍ2)を用いて評価した。該モ
ジュールは、膜で隔たれた２つの空間を有し、一方の空
間に液体流入口と液体流出口があり、もう一方の空間に
回収液の流入口がある。
【００５８】ＣＤ４+細胞をPRMI1640培地で１×１０5/
ｍｌに調製した後、３７℃で２ｍｌ／ｍｉｎの流速で１
００ｍｌ、液体流入口から液体流出口へ流した。細胞の
回収は、モジュールを４℃に冷却後、４℃に冷却したＰ
ＢＳを膜の細胞吸着面と反対側より２ｍｌ／ｍｉｎの流
速で２０ｍｌ流し、液体流出口から収集した。細胞回収
率は、６３％であった。
ｍｌに調製した後、３７℃で２ｍｌ／ｍｉｎの流速で１
００ｍｌ、液体流入口から液体流出口へ流した。細胞の
回収は、モジュールを４℃に冷却後、４℃に冷却したＰ
ＢＳを膜の細胞吸着面と反対側より２ｍｌ／ｍｉｎの流
速で２０ｍｌ流し、液体流出口から収集した。細胞回収
率は、６３％であった。
【００５９】
【発明の効果】本発明の分離材料は、刺激応答性領域と
標的物質に対する親和性領域とが存在する。従って、刺
激応答性領域における体積変化が大きくなり吸着物質の
脱着が起こりやすくなる。また、基材表面に相分離構造
を形成させることにより、標的細胞が吸着した場合のキ
ャッピング現象を抑制することができるため、機能損傷
の少ない高品質の細胞を回収できることとなる。
標的物質に対する親和性領域とが存在する。従って、刺
激応答性領域における体積変化が大きくなり吸着物質の
脱着が起こりやすくなる。また、基材表面に相分離構造
を形成させることにより、標的細胞が吸着した場合のキ
ャッピング現象を抑制することができるため、機能損傷
の少ない高品質の細胞を回収できることとなる。
【００６０】さらに、本発明の刺激応答型分離材料の基
材の平均孔径を限定した微多孔質膜で平均孔径が標的物
質より小さい時、標的物質は微多孔質膜の実質部位と空
孔部位とのミクロ的に不均一な表面上に捕捉されている
こととなり、キャッピング現象が回避され、ソフトに吸
着することとなる。そのため、細胞の損傷が少なくな
り、吸着した細胞の機能が良好に維持されることとな
る。さらには、非多孔性表面と比較して基材との接着部
位が少ないため、基材から細胞を脱着することが容易と
なる。
材の平均孔径を限定した微多孔質膜で平均孔径が標的物
質より小さい時、標的物質は微多孔質膜の実質部位と空
孔部位とのミクロ的に不均一な表面上に捕捉されている
こととなり、キャッピング現象が回避され、ソフトに吸
着することとなる。そのため、細胞の損傷が少なくな
り、吸着した細胞の機能が良好に維持されることとな
る。さらには、非多孔性表面と比較して基材との接着部
位が少ないため、基材から細胞を脱着することが容易と
なる。
【００６１】また、微多孔質膜の時の細胞回収方法は、
膜の一方の側より被処理液を流して標的細胞を吸着せし
めた後、細胞回収液を反対側の面より流すことにより標
的細胞が、微多孔質膜を通過せず、膜の表層部にトラッ
プされているため、細胞が脱着しやすい方向に圧力がか
かることにより、効率よく細胞を回収することが可能に
なる。
膜の一方の側より被処理液を流して標的細胞を吸着せし
めた後、細胞回収液を反対側の面より流すことにより標
的細胞が、微多孔質膜を通過せず、膜の表層部にトラッ
プされているため、細胞が脱着しやすい方向に圧力がか
かることにより、効率よく細胞を回収することが可能に
なる。
【００６２】その結果、従来困難であった血球系細胞や
機能細胞の分離精製が簡便にできるようになり、本発明
の分離材料や技術は、標的細胞の分離、増殖、機能変換
等を利用したバイオプロダクツの生産や細胞治療、遺伝
子治療、診断等に効果を発揮することとなる。また、本
発明は、医療分野のみならず各種の産業分野において新
しい分離技術として効果を発現することとなる。
機能細胞の分離精製が簡便にできるようになり、本発明
の分離材料や技術は、標的細胞の分離、増殖、機能変換
等を利用したバイオプロダクツの生産や細胞治療、遺伝
子治療、診断等に効果を発揮することとなる。また、本
発明は、医療分野のみならず各種の産業分野において新
しい分離技術として効果を発現することとなる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｂ０１Ｄ 61/14 ５００ Ｂ０１Ｄ 61/14 ５００ Ｃ１２Ｍ 1/00 Ｃ１２Ｍ 1/00 Ａ
Claims (4)
- 【請求項１】刺激応答性高分子鎖よりなる領域と標的物
質に対して親和性を有する領域とを基材表面に有するこ
とを特徴とする刺激応答型分離材料。 - 【請求項２】刺激応答性領域よりなる分子鎖と標的物質
に対して親和性を有する分子鎖とを有する共重合体を基
材表面に有することを特徴とする請求項１に記載の刺激
応答型分離材料。 - 【請求項３】刺激応答性高分子鎖よりなる領域と標的物
質に対して親和性を有する領域とを基材表面に有する刺
激応答型分離材料において、前記基材が多孔質体からな
ることを特徴とする刺激応答型分離材料。 - 【請求項４】刺激応答性高分子鎖よりなる領域と標的物
質に対して親和性を有する領域とを基材表面に有する刺
激応答型分離材料を用いて、標的物質を該分離材料に吸
着させた後、該刺激応答性高分子鎖の高次構造を変化さ
せることにより、標的物質を該分離材料より脱離させる
ことを特徴とする物質の分離精製方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20337895A JP3641301B2 (ja) | 1995-08-09 | 1995-08-09 | 刺激応答型分離材料および分離精製方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20337895A JP3641301B2 (ja) | 1995-08-09 | 1995-08-09 | 刺激応答型分離材料および分離精製方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0949830A true JPH0949830A (ja) | 1997-02-18 |
| JP3641301B2 JP3641301B2 (ja) | 2005-04-20 |
Family
ID=16473049
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP20337895A Expired - Fee Related JP3641301B2 (ja) | 1995-08-09 | 1995-08-09 | 刺激応答型分離材料および分離精製方法 |
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| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3641301B2 (ja) |
Cited By (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999061904A1 (fr) * | 1998-05-22 | 1999-12-02 | Amersham Pharmacia Biotech K. K. | Remplissage pour chromatographie ayant une nouvelle caracteristique et procede d'isolation d'une substance utilisant ledit remplissage |
| WO2000067901A1 (en) * | 1999-05-11 | 2000-11-16 | Japan Chemical Innovation Institute | Affinity-controlling material with the use of stimulus-responsive polymer and separation/purification method with the use of the material |
| WO2001009141A1 (fr) * | 1999-07-29 | 2001-02-08 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | Derives de biotine polymerisables, polymere de la biotine et polymere reagissant a la stimulation de l'avidine |
| WO2001074482A1 (fr) * | 2000-04-05 | 2001-10-11 | Japan Chemical Innovation Institute | Nouveau materiau utilise pour la separation et procede de separation |
| JP2002066276A (ja) * | 2000-08-29 | 2002-03-05 | Asahi Kasei Corp | 有機汚染耐性膜 |
| WO2002030564A1 (en) * | 2000-10-13 | 2002-04-18 | Amersham Biosciences K.K. | Stimulus responsive affinity chromatographic material and separation/purification method |
| JP2002528093A (ja) * | 1998-10-23 | 2002-09-03 | キアゲン ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 表面における核酸の単離及び精製のための方法並びに手段 |
| WO2003087826A1 (fr) * | 2002-04-16 | 2003-10-23 | Nano Solution, Inc. | Procede d'analyse de molecule et analyseur de molecule |
| JP2003339373A (ja) * | 2002-05-24 | 2003-12-02 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 細胞の分別法 |
| WO2004090529A1 (ja) * | 2003-04-08 | 2004-10-21 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | 光応答型分子識別材料 |
| JP2005082538A (ja) * | 2003-09-09 | 2005-03-31 | Chisso Corp | 刺激応答性ポリマー固定化磁性微粒子及びこれを用いた吸着材 |
| JP2005103534A (ja) * | 2003-09-09 | 2005-04-21 | Tokyo Denki Univ | 光および熱応答性吸着材料、可溶性物質の回収方法 |
| JP2006006214A (ja) * | 2004-06-25 | 2006-01-12 | Institute Of Physical & Chemical Research | 細胞を固定化した基板の作製方法および基板 |
| JP2006158305A (ja) * | 2004-12-08 | 2006-06-22 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 細胞分離用吸着材、細胞分離用吸着材モジュール及び細胞分離方法 |
| JP2006520910A (ja) * | 2003-03-20 | 2006-09-14 | ジーイー・ヘルスケア・バイオサイエンス・アクチボラグ | ｐＨ応答性高分子の使用 |
| JP2006523840A (ja) * | 2003-04-07 | 2006-10-19 | レイヤーラボ・アクテイエボラーグ | 表面に固定された小胞の多層構造 |
| JP2007071832A (ja) * | 2005-09-09 | 2007-03-22 | Shiseido Co Ltd | 修飾金粒子 |
| US8741577B2 (en) | 2003-04-07 | 2014-06-03 | Bio-Rad Laboratories Inc. | Surface immobilised multilayer structure of vesicles |
| EP2949743A1 (en) | 2014-05-30 | 2015-12-02 | Hitachi Ltd. | Stimulation-responsive material and cell culture container made thereof |
| WO2017006694A1 (ja) * | 2015-07-06 | 2017-01-12 | 株式会社日立製作所 | 細胞培養容器、装置、及び分離回収方法 |
| WO2024029557A1 (ja) * | 2022-08-02 | 2024-02-08 | テルモ株式会社 | 分離装置及び分離方法 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9598668B2 (en) | 2008-10-14 | 2017-03-21 | Cellseed Inc. | Temperature-responsive cell culture substrate and method for producing the same |
-
1995
- 1995-08-09 JP JP20337895A patent/JP3641301B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (29)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999061904A1 (fr) * | 1998-05-22 | 1999-12-02 | Amersham Pharmacia Biotech K. K. | Remplissage pour chromatographie ayant une nouvelle caracteristique et procede d'isolation d'une substance utilisant ledit remplissage |
| JP4532736B2 (ja) * | 1998-05-22 | 2010-08-25 | 株式会社セルシード | 新規な特性を有するクロマトグラフィー用充填剤およびそれを用いた物質の分離方法 |
| US6706187B1 (en) | 1998-05-22 | 2004-03-16 | Teruo Okano | Packing material for chromatography having novel characteristic and method for isolation of substance using the same |
| JP2002528093A (ja) * | 1998-10-23 | 2002-09-03 | キアゲン ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 表面における核酸の単離及び精製のための方法並びに手段 |
| JP2003524680A (ja) * | 1999-05-11 | 2003-08-19 | 財団法人化学技術戦略推進機構 | 刺激応答性高分子を用いた親和力制御型材料および該材料を用いた分離精製方法 |
| WO2000067901A1 (en) * | 1999-05-11 | 2000-11-16 | Japan Chemical Innovation Institute | Affinity-controlling material with the use of stimulus-responsive polymer and separation/purification method with the use of the material |
| WO2001009141A1 (fr) * | 1999-07-29 | 2001-02-08 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | Derives de biotine polymerisables, polymere de la biotine et polymere reagissant a la stimulation de l'avidine |
| US7052917B1 (en) | 1999-07-29 | 2006-05-30 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | Polymerizable biotin derivatives, biotin polymer, and polymer responsive to avidin stimulation |
| WO2001074482A1 (fr) * | 2000-04-05 | 2001-10-11 | Japan Chemical Innovation Institute | Nouveau materiau utilise pour la separation et procede de separation |
| EP1281436A4 (en) * | 2000-04-05 | 2003-07-09 | Japan Chemical Innovation Inst | NOVEL MATERIAL USED FOR SEPARATION AND SEPARATION METHOD |
| JP2002066276A (ja) * | 2000-08-29 | 2002-03-05 | Asahi Kasei Corp | 有機汚染耐性膜 |
| US7355020B2 (en) | 2000-10-13 | 2008-04-08 | Ge Healthcare Bio-Sciences Kk | Stimulus responsive affinity chromatographic material and separation/purification method |
| WO2002030564A1 (en) * | 2000-10-13 | 2002-04-18 | Amersham Biosciences K.K. | Stimulus responsive affinity chromatographic material and separation/purification method |
| US7012136B2 (en) | 2000-10-13 | 2006-03-14 | Amersham Biosciences Kk | Stimulus responsive affinity chromatographic material and separation/purification method |
| WO2003087826A1 (fr) * | 2002-04-16 | 2003-10-23 | Nano Solution, Inc. | Procede d'analyse de molecule et analyseur de molecule |
| JP2003339373A (ja) * | 2002-05-24 | 2003-12-02 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 細胞の分別法 |
| JP2006520910A (ja) * | 2003-03-20 | 2006-09-14 | ジーイー・ヘルスケア・バイオサイエンス・アクチボラグ | ｐＨ応答性高分子の使用 |
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