JP5784132B2 - リガンド固定化用基材及びその製造方法、特異的細胞分離材並びに血液処理器 - Google Patents
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Description
本発明は、リガンド固定化用基材及びその製造方法、アフィニティーリガンドを固定化した特異的細胞分離材、並びに血液処理器に関する。
血液から特定成分を分離する目的で、該特定成分に対して親和性のある物質、すなわち、リガンドを水不溶性担体に共有結合によって固定した分離材が臨床的に広く利用されている。これら分離材は、患者血液を一旦体外に取り出し、血液そのもの、又は血漿分離器で分離した血漿を分離材に流して処理した後、患者に返血するという形で使用される。
このため分離材からリガンドが溶離すると、リガンドが直接患者体内に入り、種々の生理作用を引き起こす危険性がある。よって、リガンドの溶離量が多い分離材は、安全性の点から臨床で利用できない。また医薬製造等のプロセスで使用される分離材においても、リガンドの溶離は、精製される医薬活性物質の品質を損なう重要な汚染物質を一様にもたらし、不十分に精製された医薬品が患者に望ましくない副作用を誘発する危険もある。すなわち、これら分離材を実用化するに当たっては、水不溶性担体とリガンドとの結合を強固にし、溶離するリガンド量を最小限にすることが最も重要な技術課題である。
また分離対象を含む溶液等との接触に伴う分離対象以外の成分との非特異的吸着は、特異的分離性能の低下に繋がる。選択的分離材においては、特定成分を選択的に分離するために、基材そのものに分離対象以外の成分の非特異的吸着が生じにくい特性が望まれている。
非特異的吸着が抑制された基材を形成する材料として、例えば、低汚損、かつ低吸着性の双生イオン性基（ベタイン）を有する材料が提案されており、タンパク質の付着に対して抵抗性のある光透過性ポリマー材料として、双生イオン性基を有する重合性モノマーを用いたポリマーが開示されている（特許文献１）。また、スルホベタイン及びカルボキシベタインの単分子層を含む低汚損性表面を有する基材が開示されている（特許文献２）。さらに、材料の表面と生体成分との相互作用が少なく、タンパク質非吸着性で性能劣化が起こりにくく、生体適合性に優れた材料として、双性イオンを有するビニル重合性単量体と、他のビニル重合性単量体との共重合体が開示されている（特許文献３）。
細胞を分離する目的においては、基材に選択的な細胞吸着性能を付与する方法として、基材表面にカチオン性官能基（例えば、１級アミノ基、２級アミノ基、３級アミノ基、及び４級アンモニウム基）及びアニオン性官能基（例えば、硫酸エステル基、スルホン酸基、カルボキシル基、及びリン酸エステル基）をバランスよく固定化して細胞の選択吸着を行う技術が従来から知られているが、このような方法では目標とする高い細胞選択性を発現させることが困難な場合が多い。
これに対し、高い細胞選択分離性を得るために目的細胞の細胞表面に存在するタンパク質又は糖鎖に特異的な親和性を有するアフィニティーリガンドを用いる方法は効果的である。特に細胞表面のタンパク質又は糖鎖に強い親和性のあるアミノ酸配列を有した抗体、抗体の抗原結合部位を含む抗体断片（Ｆ（ａｂ）’、Ｆａｂ、Ｆａｂ’等）、さらにそのようなアミノ酸配列を有する合成ペプチド、又はそれらの修飾ペプチドが効果的であり、これらを基材に共有結合にて固定化する方法が効果的であると考えられる。
本発明は、タンパク質及び細胞などとの非特異的相互作用が少ないとの優れた性能を有し、かつ、リガンドを共有結合により強固に結合することのできるリガンド固定化用基材及びその製造方法を提供することを目的とする。本発明はまた、タンパク質及び細胞などとの非特異的相互作用が少ないとの優れた性能を有し、かつ、リガンドを共有結合により強固に結合し、固定化したリガンドとの特異的相互作用に基づく高い吸着性能を発揮し得る特異的細胞分離材を提供することを目的とする。
本発明者らは、優れた非特異吸着抑制能を有し、リガンドと共有結合により強固に結合させることができ、リガンドが溶出するリスクが少なく、かつ固定化したリガンドの性能を十分に発揮させ得る基材について鋭意研究を進めた結果、水不溶性担体の表面に重合性スルホベタインモノマーと求電子官能基を有する重合性モノマーとの共重合体が結合してなるリガンド固定化用基材が上記の課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明によれば以下の発明が提供される。
［１］
水不溶性担体と、該水不溶性担体の少なくとも表面に結合した下記一般式（１）で表される共重合体と、を備える、リガンド固定化用基材。
［一般式（１）中、ｎ及びｍは正の整数を示し、ｍ／（ｎ＋ｍ）の値は０．０５以上０．５０以下である。また、一般式（１）中、Ｒ１はＨ又はＣＨ３、Ｒ２は求電子官能基を有する有機基、Ｒ３は下記一般式（２）で表される基を示す。
一般式（２）中、ＹはＯ又はＮＨ、ｐは１又は２、ｑは２又は３を示す。］
［２］
前記共重合体が、下記一般式（３）で表されるモノマーと下記一般式（４）で表されるモノマーとの共重合体である、［１］に記載のリガンド固定化用基材。
［一般式（３）中、ＹはＯ又はＮＨ、ｐは１又は２、ｑは２又は３を示す。］
［一般式（４）中、Ｒ１はＨ又はＣＨ３、Ｒ２は求電子官能基を有する有機基を示す。］
［３］
前記共重合体が、エポキシ基を含む、［１］又は［２］に記載のリガンド固定化用基材。
［４］
前記共重合体による前記水不溶性担体の表面の被覆率が２５％以上である、［１］〜［３］のいずれかに記載のリガンド固定化用基材。
［５］
前記水不溶性担体が、多孔膜又は粒子である、［１］〜［４］のいずれかに記載のリガンド固定化用基材。
［６］
前記水不溶性担体が、繊維からなる多孔膜であり、かつ平均繊維径が２μｍ以上２０μｍ以下である、［１］〜［５］のいずれかに記載のリガンド固定化用基材。
［７］
リガンド固定化用基材の製造における、下記一般式（１）で表される共重合体の使用。
［一般式（１）中、ｎ及びｍは正の整数を示し、ｍ／（ｎ＋ｍ）の値は０．０５以上０．５０以下である。また、一般式（１）中、Ｒ１はＨ又はＣＨ３、Ｒ２は求電子官能基を有する有機基、Ｒ３は下記一般式（２）で表される基を示す。
一般式（２）中、ＹはＯ又はＮＨ、ｐは１又は２、ｑは２又は３を示す。］
［８］
前記共重合体が、エポキシ基を含む、［７］に記載の使用。
［９］
（ｉ）水不溶性担体に電離性放射線を照射する工程と、
（ｉｉ）下記一般式（３）で表されるモノマー及び下記一般式（４）で表されるモノマーを含む溶液に、工程（ｉ）で得られた水不溶性担体を浸漬してグラフト重合させる工程と、を含む、リガンド固定化用基材の製造方法。
［一般式（３）中、ＹはＯ又はＮＨ、ｐは１又は２、ｑは２又は３を示す。］
［一般式（４）中、Ｒ１はＨ又はＣＨ３、Ｒ２は求電子官能基を有する有機基を示す。］
［１０］
前記一般式（４）で表されるモノマーが、エポキシ基を有する、［９］に記載の製造方法。
［１１］
前記水不溶性担体が、多孔膜又は粒子である、［９］又は［１０］に記載の製造方法。
［１２］
前記水不溶性担体が、繊維からなる多孔膜であり、かつ平均繊維径が２μｍ以上２０μｍ以下である、［９］〜［１１］のいずれかに記載の製造方法。
［１３］
［１］〜［６］のいずれかに記載のリガンド固定化用基材に、抗体、タンパク質、ペプチド及び低分子化合物からなる群より選択される１種以上のリガンドが結合した特異的細胞分離材。
［１４］
血液の導入口及び導出口を有する容器の内部に、［１３］に記載の特異的細胞分離材が充填された血液処理器。
［１］
水不溶性担体と、該水不溶性担体の少なくとも表面に結合した下記一般式（１）で表される共重合体と、を備える、リガンド固定化用基材。
［２］
前記共重合体が、下記一般式（３）で表されるモノマーと下記一般式（４）で表されるモノマーとの共重合体である、［１］に記載のリガンド固定化用基材。
［３］
前記共重合体が、エポキシ基を含む、［１］又は［２］に記載のリガンド固定化用基材。
［４］
前記共重合体による前記水不溶性担体の表面の被覆率が２５％以上である、［１］〜［３］のいずれかに記載のリガンド固定化用基材。
［５］
前記水不溶性担体が、多孔膜又は粒子である、［１］〜［４］のいずれかに記載のリガンド固定化用基材。
［６］
前記水不溶性担体が、繊維からなる多孔膜であり、かつ平均繊維径が２μｍ以上２０μｍ以下である、［１］〜［５］のいずれかに記載のリガンド固定化用基材。
［７］
リガンド固定化用基材の製造における、下記一般式（１）で表される共重合体の使用。
［８］
前記共重合体が、エポキシ基を含む、［７］に記載の使用。
［９］
（ｉ）水不溶性担体に電離性放射線を照射する工程と、
（ｉｉ）下記一般式（３）で表されるモノマー及び下記一般式（４）で表されるモノマーを含む溶液に、工程（ｉ）で得られた水不溶性担体を浸漬してグラフト重合させる工程と、を含む、リガンド固定化用基材の製造方法。
［１０］
前記一般式（４）で表されるモノマーが、エポキシ基を有する、［９］に記載の製造方法。
［１１］
前記水不溶性担体が、多孔膜又は粒子である、［９］又は［１０］に記載の製造方法。
［１２］
前記水不溶性担体が、繊維からなる多孔膜であり、かつ平均繊維径が２μｍ以上２０μｍ以下である、［９］〜［１１］のいずれかに記載の製造方法。
［１３］
［１］〜［６］のいずれかに記載のリガンド固定化用基材に、抗体、タンパク質、ペプチド及び低分子化合物からなる群より選択される１種以上のリガンドが結合した特異的細胞分離材。
［１４］
血液の導入口及び導出口を有する容器の内部に、［１３］に記載の特異的細胞分離材が充填された血液処理器。
本発明によれば、タンパク質及び細胞などとの非特異的相互作用が少ないとの優れた性能を有し、かつ、リガンドを共有結合により強固に結合することのできるリガンド固定化用基材及びその製造方法が提供される。また、本発明によれば、タンパク質及び細胞などとの非特異的相互作用が少ないとの優れた性能を有し、かつ、リガンドを共有結合により強固に結合し、固定化したリガンドとの特異的相互作用に基づく高い吸着性能を発揮し得る特異的細胞分離材が提供される。
以下、本発明を実施形態に基づいて詳細に説明するが、本発明はこれらの実施形態に限定されるものではない。
〔リガンド固定化用基材〕
本実施形態に係るリガンド固定化用基材は、水不溶性担体と、該水不溶性担体の少なくとも表面に結合した下記一般式（１）で表される共重合体とを備える。
ここで、一般式（１）中、ｎ及びｍは正の整数を示し、ｍ／（ｎ＋ｍ）の値は０．０５以上０．５０以下である。
また、一般式（１）中、Ｒ１はＨ又はＣＨ３、Ｒ２は求電子官能基を有する有機基、Ｒ３は下記一般式（２）で表される基を示す。
一般式（２）中、ＹはＯ又はＮＨ、ｐは１又は２、ｑは２又は３を示す。
本実施形態に係るリガンド固定化用基材は、水不溶性担体と、該水不溶性担体の少なくとも表面に結合した下記一般式（１）で表される共重合体とを備える。
また、一般式（１）中、Ｒ１はＨ又はＣＨ３、Ｒ２は求電子官能基を有する有機基、Ｒ３は下記一般式（２）で表される基を示す。
一般式（１）で表される共重合体は、繰り返し数がｍの繰り返し単位と、繰り返し数がｎの繰り返し単位とのランダム共重合体、交互共重合体、周期的共重合体及びブロック共重合体のいずれであってもよい。
一般式（１）で表される共重合体は、例えば、一般式（３）で表される重合性スルホベタインモノマーと、一般式（４）で表される求電子性官能基を有する重合性モノマーとを共重合させることによって得ることができる。
ここで、一般式（３）中、ＹはＯ又はＮＨ、ｐは１又は２、ｑは２又は３を示す。
ここで、一般式（４）中、Ｒ１はＨ又はＣＨ３、Ｒ２は求電子官能基を有する有機基を示す。
この場合、一般式（１）中、繰り返し数がｍの繰り返し単位は一般式（３）で表されるモノマーに由来する構造単位であり、繰り返し数がｎの繰り返し単位は一般式（４）で表されるモノマーに由来する構造単位である。
一般式（３）で表される重合性スルホベタインモノマーは、アニオン性基としてスルホン酸基、カチオン性基として４級アンモニウム基を同一単量体単位中に有する単量体（モノマー）である。一般式（３）で表される重合性スルホベタインモノマーの具体例としては、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−（３−アクリルアミドプロピル）−Ｎ−（３−スルホプロピル）アンモニウム内部塩、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−（３−アクリルアミドプロピル）−Ｎ−（２−スルホエチル）アンモニウム内部塩、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−（３−メタクリルアミドプロピル）−Ｎ−（３−スルホプロピル）アンモニウム内部塩、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−（３−メタクリルアミドプロピル）−Ｎ−（２−スルホエチル）アンモニウム内部塩、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−（２−アクリロイルオキシエチル）−Ｎ−（３−スルホプロピル）アンモニウム内部塩、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−（２−アクリロイルオキシエチル）−Ｎ−（２−スルホエチル）アンモニウム内部塩、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−（２−メタクリロイルオキシエチル）−Ｎ−（３−スルホプロピル）アンモニウム内部塩、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−（２−メタクリロイルオキシエチル）−Ｎ−（２−スルホエチル）アンモニウム内部塩が挙げられる。
本明細書において、「求電子官能基」とは求電子的に反応する官能基を意味し、一般式（４）で表される求電子性官能基を有する重合性モノマーの具体例としては、エポキシ基、イソシアネート基又はアルデヒド基等の求電子官能基を分子内（一般式（１）中のＲ２、及び一般式（４）中のＲ５）に有するモノマーが挙げられる。
上記のエポキシ基を分子内に有する重合性モノマーとしては、特に限定されないが、グリシジルアクリレート、グリシジルメタクリレート、グリシジルアクリルアミド、アリルグリシジルエーテル、メタクリルグリシジルエーテル、グリシジルソルベート、グリシジルメタイタコナート、エチルグリシジルマレアート及びグリシジルビニルスルホナート等を例示でき、イソシアネート基を分子内に有する重合性モノマーとしては、アクリロイルオキシエチルイソシアネート、アクリロイルオキシメチルイソシアネート、アクリロイルイソシアネート、メタクリロイルイソシアネート及びメタクリロイルエチルイソシアネート等を例示でき、さらに、アルデヒド基を分子内に有する重合性モノマーとしては、シンナムアルデヒド、クロトンアルデヒド、アクロレイン及びメタクロレイン等を例示できるが、この中でも入手の容易さ、コスト、取り扱いの容易さから、エポキシ基を分子内に有する重合性モノマーが好ましく、その中でも特にグリシジルメタクリレートが好ましい。
水不溶性担体の少なくとも表面に共重合体がどのような様式で結合しているかは特に限定されず、共有結合、イオン結合及び物理吸着等のいずれの結合様式であってもよい。結合方法としては、グラフト法及び不溶化沈殿法等、あらゆる公知の方法を用いることができる。したがって、高分子化合物又はそのモノマーの少なくとも一方を放射線又はプラズマ等を用いてグラフト重合する、共有結合するなどの公知の方法により表面改質を施す方法（特開平１−２４９０６３号公報、特開平３−５０２０９４号公報）を好適に用いることができる。
放射線照射グラフト重合法を用いる場合、種々の公知の方法を利用することができる。例えば、水不溶性担体上に活性点を導入するための電離性放射線は、α線、β線、γ線、加速電子線、Ｘ線及び紫外線などが挙げられ、実用的であるとの観点から加速電子線又はγ線が好ましい。加速電子線又はγ線の照射量は水不溶性担体の性質、用いるモノマーの性質、及び共重合体の固定化量などにより任意に変えることができるが、１０ｋＧｙから２００ｋＧｙが好ましい。水不溶性担体とモノマーをグラフト重合させる方法としては、水不溶性担体とモノマーの共存下で電離性放射線を照射する同時照射法と、水不溶性担体のみに予め電離性放射線を照射した後、モノマーと水不溶性担体とを接触させる前照射法のいずれも使用可能であるが、前照射法が、グラフト重合以外の副反応を生成しにくいため好ましい。水不溶性担体とモノマーとの接触は、例えば、水不溶性担体とモノマーを含む溶液とを接触させることにより行うことができる。モノマーを含む溶液中のモノマー濃度は通常１質量％以上２０質量％以下とすることができるが、この範囲に限定されるものではなく、適宜設定すればよい。また、モノマーと水不溶性担体との反応は、反応温度は５℃以上４０℃以下の範囲で行うことができるが、この範囲に限定されるものではなく、適宜設定すればよい。反応の際の溶媒は、モノマーを含む溶液の溶媒と同じであってもよく、例えば、無溶媒若しくは水、メタノール、エタノール、その他アルコール、アセトン等の溶媒又はそれらの混合溶媒で、モノマーが溶解又は分散するものであれば用いることができる。
放射線照射グラフト重合法を用いる場合、担体へのグラフト率（Ｇ）は５％以上３００％以下が好ましく、２０％以上２００％以下がより好ましく、５０％以上１５０％以下が更に好ましい。グラフト率が５％未満であると、担体表面のグラフト鎖による被覆が不十分となりやすく、表面の改質が不十分となるおそれ、及びリガンドの固定化量が不十分となるおそれがある。またグラフト率が３００％を超えると、水不溶性担体自体の物理特性が失われるおそれがあり、リガンド固定化用基材の設計上好ましくない。
なお、ここにいうグラフト率（Ｇ）は、下記式（４）で表される値である。
Ｇ（％）＝［（グラフト後担体重量−グラフト前担体重量）／（グラフト前担体重量）］×１００ （４）
Ｇ（％）＝［（グラフト後担体重量−グラフト前担体重量）／（グラフト前担体重量）］×１００ （４）
重合反応後は、過剰のモノマー、及び連鎖移動反応によって生成したグラフトされていないポリマーを適当な溶剤にて十分洗浄除去すればよい。
本実施形態に係る共重合体における重合性スルホベタインモノマーのモル組成比は、全モノマーに対して、０．０５以上０．５０以下であることが好ましい。重合性スルホベタインモノマーのモル組成比が０．０５未満であると、生体適合性の性質が発揮されなくなる。また重合性スルホベタインモノマーのモル組成比が０．５０を超えると、生体適合性の性質は十分に発揮されるが、必然的に求電子官能基の含有量が低くなり、リガンドの固定化が十分に行われないため好ましくない。共重合体を形成する反応時の各モノマーの混合量は、選択する溶媒等に依存するので、適宜選択すればよい。
共重合体による水不溶性担体の被覆率は２５％以上が好ましい。表面における存在率が２５％未満であると、担体の表面性質が残存しており、非特異的吸着が増加するとともに、リガンドの固定化が十分に行われない。被覆率の上限に特に制限はなく、例えば、１００％であってもよい。
本実施形態に係る水不溶性担体を形成する素材としては、天然高分子、合成高分子及び再生高分子等の有機高分子化合物、ガラス及び金属に代表される無機化合物、並びに有機／無機ハイブリッド化合物などが挙げられるが特に限定されない。
加工性の面からは、有機高分子素材が特に好ましく、例えば、ポリアルキレンテレフタレート類、ポリカーボネート類、ポリウレタン類、ポリ（メタ）アクリル酸エステル類、ポリアクリロニトリル、ポリビニルアルコール、エチレン／ビニルアルコール共重合体（エバール）、エチレン／ビニルアセテート共重合体、ポリビニルアセタール、ポリスチレン、ポリスルホン類、セルロース及びセルロース誘導体類、ポリフェニレンエーテル類、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフッ化ビニル、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン等、及びこれらを構成するモノマーの共重合体が挙げられる。さらに、上記高分子の２種以上のアロイ及びブレンド等が挙げられる。
水不溶性担体としては、医療用吸着材（又は分離材）の担体として周知のもの全てを使用できるが、多孔膜又は粒子が好ましく、多孔質粒子、不織布又は中空糸膜が体外循環時の体液の流通性より最も好ましく、細胞吸着を目的とする場合は不織布又は粒子が好ましい。
多孔膜としては、例えば、これらの素材から得られる繊維状物（中実繊維及び中空繊維）を用いて製造される不織布、織布、編布及びメッシュが挙げられる。また、有機高分子素材又は無機高分子素材を熱溶融した状態、溶媒によって溶解した溶液状態、又は可塑剤を用いて可塑化した状態等から、発泡法、相分離法（熱誘起相分離法及び湿式相分離法）、延伸法及び焼結法等によって得ることができるシート状膜（平膜）及び空糸膜も使用できる。
多孔膜においては、連通孔を有し、連通孔の少なくとも表面部分に存在するアフィニティーリガンドとの接触によって目的成分が吸着されるのであればどのような構造であっても構わず特に限定されない。連通孔とは、支持多孔膜の一方の膜面から反対側の膜面にかけて連通した孔のことであって、その連通孔を通して液体が通過することができるのであれば、その孔の膜表面の形状、及び膜内部の構造はどのようなものであってもよい。
特に、分離対象成分が細胞である場合に好ましいものとしては、細胞浮遊液の透過性、及び細胞捕捉性の観点から、各種繊維状物から製造される不織布、織布、編布及びメッシュ等が挙げられ、特に不織布は好ましく用いられる多孔膜である。
不織布形状の場合、その平均繊維径（平均繊維直径）は、例えば、０．１μｍ〜５０μｍとすることができるが、リガンドを結合した場合に分離対象成分をより特異的に吸着することができるため、２μｍ〜２０μｍであることが好ましい。平均繊維径は３μｍ〜１２μｍであることがより好ましく、４μｍ〜７μｍであることが更に好ましい。平均繊維径が０．１μｍ未満であると、機械的強度が低下しやすい。また繊維径が太くなるにつれ、単位体積当たりの表面積が小さくなり、大きな分離材体積が必要となることから、５０μｍ以下が適当である。
本実施形態に係る粒子は分離対象成分によって、無孔質又は多孔質を選択すればよく、また多孔質においては、分離対象成分によって、その孔径を選択すればよい。平均粒径は、２５μｍ以上２５００μｍ以下のものを利用できるが、その比表面積（吸着材としての吸着能力）と体液の流通性を考慮すると、５０μｍ以上１５００μｍ以下のものが好ましい。
図１は、一実施形態に係るリガンド固定化用基材の模式断面図である。リガンド固定化用基材１００は、水不溶性担体１と、水不溶性担体１の少なくとも表面に結合した上記一般式（１）で表される共重合体２と、を備える。共重合体２は、結合部分１０で水不溶性担体１と結合し、リガンド固定化用基材１００の表面にＲ３基２０及びＲ２基３０を有している。ここでＲ３基２０及びＲ２基３０は、上記一般式（１）中のＲ３基及びＲ２基と同義である。
〔リガンド固定化用基材の製造方法〕
上記リガンド固定化用基材は、例えば、以下の工程を有する製造方法により製造することができる。
（ｉ）水不溶性担体に電離性放射線を照射する工程。
（ｉｉ）上記一般式（３）で表されるモノマー及び上記一般式（４）で表されるモノマーを含む溶液に、工程（ｉ）で得られた水不溶性担体を浸漬してグラフト重合させる工程。
水不溶性担体、電離性放射線、溶液、及びグラフト重合等については、上記で説明したとおりである。
上記リガンド固定化用基材は、例えば、以下の工程を有する製造方法により製造することができる。
（ｉ）水不溶性担体に電離性放射線を照射する工程。
（ｉｉ）上記一般式（３）で表されるモノマー及び上記一般式（４）で表されるモノマーを含む溶液に、工程（ｉ）で得られた水不溶性担体を浸漬してグラフト重合させる工程。
水不溶性担体、電離性放射線、溶液、及びグラフト重合等については、上記で説明したとおりである。
〔特異的細胞分離材〕
本実施形態に係る特異的細胞分離材は、上記リガンド固定化用基材にリガンドが結合してなるものである。リガンド固定化用基材とリガンドは、リガンド固定化用基材中の求電子官能基とリガンドの有する官能基との間で、共有結合、配位結合、イオン結合及び水素結合等の化学結合することで結合している。また、共有結合により結合することが好ましい。リガンドとしては、アフィニティーリガンドが好ましく、例えば、抗体、タンパク質、ペプチド及び低分子化合物からなる群より選択されるものとすることができる。
本実施形態に係る特異的細胞分離材は、上記リガンド固定化用基材にリガンドが結合してなるものである。リガンド固定化用基材とリガンドは、リガンド固定化用基材中の求電子官能基とリガンドの有する官能基との間で、共有結合、配位結合、イオン結合及び水素結合等の化学結合することで結合している。また、共有結合により結合することが好ましい。リガンドとしては、アフィニティーリガンドが好ましく、例えば、抗体、タンパク質、ペプチド及び低分子化合物からなる群より選択されるものとすることができる。
特異的細胞分離材に固定化されるアフィニティーリガンドは、特定の細胞に対して選択的アフィニティーを有するもので、求電子官能基と化学結合するものであれば特に制限されず、例えば分子量が５００Ｄａ以下程度の低分子化合物、タンパク質、また優れた吸着能を発現させるのであれば、ターゲット成分に極めて高いアフィニティーを有する抗体及びキメラ抗体、抗体が有する重鎖又は軽鎖の可変領域の相補性決定領域を形成しうるアミノ酸配列を有するＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、並びにその他ペプチド又はその修飾ペプチド型のリガンドの使用が好ましい。
図２は、一実施形態に係る特異的細胞分離材の模式断面図である。特異的細胞分離材１１０は、リガンド固定化用基材１００のＲ２基３０と、リガンド４０とが化学結合してなるものである。リガンド４０としては上述したものを用いることができる。
〔血液処理器〕
本実施形態に係る血液処理器は、内部に血液を導入するための入口（導入口）と、内部の血液を外部に排出するための出口（導出口）とを有する容器の内部に、上記特異的細胞分離材が充填されたものである。上記特異的細胞分離材が選択的に分離対象成分を吸着することができるため、例えば、血液から特定の成分を除去する目的に好ましく利用することができる。具体的には、直接血液灌流用の血液成分吸着器及び特異的細胞吸着器等が挙げられる。
本実施形態に係る血液処理器は、内部に血液を導入するための入口（導入口）と、内部の血液を外部に排出するための出口（導出口）とを有する容器の内部に、上記特異的細胞分離材が充填されたものである。上記特異的細胞分離材が選択的に分離対象成分を吸着することができるため、例えば、血液から特定の成分を除去する目的に好ましく利用することができる。具体的には、直接血液灌流用の血液成分吸着器及び特異的細胞吸着器等が挙げられる。
図３は、一実施形態に係る血液処理器の模式断面図である。血液処理器２００は、容器５０と、容器５０の内部に充填された複数の特異的細胞分離材１１０とを有する。容器５０の両端部には、ヘッダーキャップ６０ａ、６０ｂが設けられている。ヘッダーキャップ６０ａは内部に血液を導入するための入口（導入口）となり、ヘッダーキャップ６０ｂは血液を外部に排出するための出口（導出口）となる。ヘッダーキャップ６０ａの導入口より矢印Ｆの方向から血液処理器２００の内部に流入した血液が、特異的細胞分離材１１０と接することにより、リガンド４０と相互作用する血液中の成分が吸着する。これにより、ヘッダーキャップ６０ｂの導出口から流出した際には血液中から上記成分が除去されている。
以下、実施例及び比較例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
［実施例１］
（Ａ）方法
（１）γ線照射
担体としてポリプロピレンからなる不織布（平均繊維径３．８μｍ 目付８０ｇ／ｍ２）０．１０８ｍ２を脱酸素剤とともに酸素低透過性袋に封入し十分に酸素を除いた後、−７８℃にて２５ｋＧｙのγ線を照射した。
（Ａ）方法
（１）γ線照射
担体としてポリプロピレンからなる不織布（平均繊維径３．８μｍ 目付８０ｇ／ｍ２）０．１０８ｍ２を脱酸素剤とともに酸素低透過性袋に封入し十分に酸素を除いた後、−７８℃にて２５ｋＧｙのγ線を照射した。
（２）グラフト反応
Ｎ−（３−スルホプロピル）−Ｎ−（メタクリルオキシエチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムベタイン（以下、「ＳＰＢ」という。）６．５ｇ、及びグリシジルメタクリレート（以下、「ＧＭＡ」という。）２６．３ｍＬを５００ｍＬのメタノールに溶解し、反応液を得た。この反応液に４０℃にて６０分間窒素を通気した。
耐圧ガラス容器に上記の不織布をすばやく入れ、減圧後、上記反応液を引き込み４０℃にて１時間反応させた。反応後、取り出した不織布をジメチルホルムアミド及びメタノールにより洗浄し、４０℃にて真空乾燥することでリガンド固定化用基材を得た。
Ｎ−（３−スルホプロピル）−Ｎ−（メタクリルオキシエチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムベタイン（以下、「ＳＰＢ」という。）６．５ｇ、及びグリシジルメタクリレート（以下、「ＧＭＡ」という。）２６．３ｍＬを５００ｍＬのメタノールに溶解し、反応液を得た。この反応液に４０℃にて６０分間窒素を通気した。
耐圧ガラス容器に上記の不織布をすばやく入れ、減圧後、上記反応液を引き込み４０℃にて１時間反応させた。反応後、取り出した不織布をジメチルホルムアミド及びメタノールにより洗浄し、４０℃にて真空乾燥することでリガンド固定化用基材を得た。
（３）細胞吸着フィルター（特異的細胞分離材）の作製
上記で得られたリガンド固定化用基材を直径０．６８ｃｍの円形に切断した（以下「円形不織布状基材」という）。次に、抗ヒトＣＤ４モノクローナル抗体溶液（１６μｇ）及び硫酸アンモニウム（２６ｍｇ）を溶解したカルシウム及びマグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩液（以下、「ＰＢＳ（−）」という。）４００μＬに、得られた円形不織布状基材４枚を３７℃にて１６時間浸し、該モノクローナル抗体を円形不織布状基材に固定した。その後、このモノクローナル抗体を固定化した円形不織布状基材（以下、「抗体固定化円形不織布」という。）をＰＢＳ（−）２ｍｌで洗浄した。次に、０．２％ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート／ＰＢＳ（−）溶液（以下、「Ｔｗｅｅｎ２０溶液」という。）に該抗体固定化円形不織布を常温で２．５時間浸し、ブロッキングを行った。その後、該抗体固定化円形不織布をＰＢＳ（−）２ｍｌで洗浄することで、細胞吸着フィルターを作製した。
上記で得られたリガンド固定化用基材を直径０．６８ｃｍの円形に切断した（以下「円形不織布状基材」という）。次に、抗ヒトＣＤ４モノクローナル抗体溶液（１６μｇ）及び硫酸アンモニウム（２６ｍｇ）を溶解したカルシウム及びマグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩液（以下、「ＰＢＳ（−）」という。）４００μＬに、得られた円形不織布状基材４枚を３７℃にて１６時間浸し、該モノクローナル抗体を円形不織布状基材に固定した。その後、このモノクローナル抗体を固定化した円形不織布状基材（以下、「抗体固定化円形不織布」という。）をＰＢＳ（−）２ｍｌで洗浄した。次に、０．２％ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート／ＰＢＳ（−）溶液（以下、「Ｔｗｅｅｎ２０溶液」という。）に該抗体固定化円形不織布を常温で２．５時間浸し、ブロッキングを行った。その後、該抗体固定化円形不織布をＰＢＳ（−）２ｍｌで洗浄することで、細胞吸着フィルターを作製した。
（４）物理吸着量測定用の細胞吸着フィルターの洗浄
２％ドデシル硫酸ナトリウム／ＰＢＳ（−）（以下、「ＳＤＳ溶液」という。）により細胞吸着フィルター４枚を９５℃で１０分間浸し、細胞吸着フィルターへ物理的に固定されている抗ヒトＣＤ４モノクローナル抗体を洗浄剥離させた。これを３回繰り返した後、該細胞吸着フィルターをＰＢＳ（−）２ｍｌで洗浄した。
２％ドデシル硫酸ナトリウム／ＰＢＳ（−）（以下、「ＳＤＳ溶液」という。）により細胞吸着フィルター４枚を９５℃で１０分間浸し、細胞吸着フィルターへ物理的に固定されている抗ヒトＣＤ４モノクローナル抗体を洗浄剥離させた。これを３回繰り返した後、該細胞吸着フィルターをＰＢＳ（−）２ｍｌで洗浄した。
（５）細胞吸着器の作製
入口と出口を有する容量１ｍｌの容器に、細胞吸着フィルター４枚と充填液としてＰＢＳ（−）溶液とを充填し、細胞吸着器を作成した。
入口と出口を有する容量１ｍｌの容器に、細胞吸着フィルター４枚と充填液としてＰＢＳ（−）溶液とを充填し、細胞吸着器を作成した。
（６）細胞吸着器の細胞吸着性
細胞吸着器の入口から、ＡＣＤ−Ａ添加ヒト新鮮血液８ｍｌ（血液：ＡＣＤ−Ａ＝８：１）をシリンジポンプにて流速０．２ｍｌ／分で送液した。細胞吸着器の出口から回収される細胞吸着後溶液のうち、前半４ｍＬ分をフラクション１（以下、「Ｆ１」という。）、後半４ｍＬ分をフラクション２（以下、「Ｆ２」という。）となるよう分取した。その後、細胞吸着器の出口から細胞吸着後の溶液を回収した。
細胞吸着器の入口から、ＡＣＤ−Ａ添加ヒト新鮮血液８ｍｌ（血液：ＡＣＤ−Ａ＝８：１）をシリンジポンプにて流速０．２ｍｌ／分で送液した。細胞吸着器の出口から回収される細胞吸着後溶液のうち、前半４ｍＬ分をフラクション１（以下、「Ｆ１」という。）、後半４ｍＬ分をフラクション２（以下、「Ｆ２」という。）となるよう分取した。その後、細胞吸着器の出口から細胞吸着後の溶液を回収した。
（Ｂ）結果
（１）Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）による表面解析
上記で得られたリガンド固定化用基材の表面をＸ線光電子分光法（ＸＰＳ ＥＳＣＡ）により解析した。ＸＰＳより得られる炭素、酸素及び窒素の各相対元素濃度をそれぞれＣ１、Ｃ２及びＣ３とすると、基材表面に存在するＳＰＢ相対モル濃度（Ｘ）、ＧＭＡ相対モル濃度（Ｙ）、担体構成ポリマー相対モル濃度（Ｚ）はそれぞれ次式（５）から（７）で表される。
Ｘ＝ｘ／（ｘ＋ｙ＋ｚ） （５）
Ｙ＝ｙ／（ｘ＋ｙ＋ｚ） （６）
Ｚ＝ｚ／（ｘ＋ｙ＋ｚ） （７）
ただし、ｘ＝Ｃ３、ｙ＝（Ｃ２−４ｘ）／３、ｚ＝｛Ｃ１−（１０ｘ＋７ｙ）｝／Ａであって、Ａは担体構成ポリマーの単位炭素組成であり、ポリエチレンの場合Ａ＝２、ポリプロピレンの場合Ａ＝３である。
上記で得られる相対モル濃度より共重合ポリマー中のＳＰＢのモル組成比Ｒは次式（８）で表される。
Ｒ＝ｍ／（ｎ＋ｍ）＝Ｘ／（Ｘ＋Ｙ） （８）
また、ＳＰＢポリマーの単位分子量ＭＸ、ＧＭＡポリマー単位分子量ＭＹ、担体構成ポリマー単位分子量ＭＺとすると、被覆率Ｓ（％）は次式（９）で表される。
Ｓ＝１００｛１−ＺＭＺ／（ＸＭＸ＋ＹＭＹ＋ＺＭＺ）｝ （９）
これらの計算式に基づき、ＳＰＢモル組成比Ｒ及び被覆率Ｓを算出した結果、ＳＰＢのモル組成比Ｒは０．０５、被覆率Ｓは８５％であった。
（１）Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）による表面解析
上記で得られたリガンド固定化用基材の表面をＸ線光電子分光法（ＸＰＳ ＥＳＣＡ）により解析した。ＸＰＳより得られる炭素、酸素及び窒素の各相対元素濃度をそれぞれＣ１、Ｃ２及びＣ３とすると、基材表面に存在するＳＰＢ相対モル濃度（Ｘ）、ＧＭＡ相対モル濃度（Ｙ）、担体構成ポリマー相対モル濃度（Ｚ）はそれぞれ次式（５）から（７）で表される。
Ｘ＝ｘ／（ｘ＋ｙ＋ｚ） （５）
Ｙ＝ｙ／（ｘ＋ｙ＋ｚ） （６）
Ｚ＝ｚ／（ｘ＋ｙ＋ｚ） （７）
ただし、ｘ＝Ｃ３、ｙ＝（Ｃ２−４ｘ）／３、ｚ＝｛Ｃ１−（１０ｘ＋７ｙ）｝／Ａであって、Ａは担体構成ポリマーの単位炭素組成であり、ポリエチレンの場合Ａ＝２、ポリプロピレンの場合Ａ＝３である。
上記で得られる相対モル濃度より共重合ポリマー中のＳＰＢのモル組成比Ｒは次式（８）で表される。
Ｒ＝ｍ／（ｎ＋ｍ）＝Ｘ／（Ｘ＋Ｙ） （８）
また、ＳＰＢポリマーの単位分子量ＭＸ、ＧＭＡポリマー単位分子量ＭＹ、担体構成ポリマー単位分子量ＭＺとすると、被覆率Ｓ（％）は次式（９）で表される。
Ｓ＝１００｛１−ＺＭＺ／（ＸＭＸ＋ＹＭＹ＋ＺＭＺ）｝ （９）
これらの計算式に基づき、ＳＰＢモル組成比Ｒ及び被覆率Ｓを算出した結果、ＳＰＢのモル組成比Ｒは０．０５、被覆率Ｓは８５％であった。
（２）比表面積測定
上記で得られたリガンド固定化用基材の比表面積を、自動比表面積／細孔分布測定装置（ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製 ＭＩＣＲＩＭＥＲＩＴＩＣＳ ＴＲＩＳＴＡＲ ３０００）を用いてＢＥＴ法による多点法比表面積を測定することにより求めた。その結果、比表面積は、０．５４ｍ２／ｇであった。
上記で得られたリガンド固定化用基材の比表面積を、自動比表面積／細孔分布測定装置（ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製 ＭＩＣＲＩＭＥＲＩＴＩＣＳ ＴＲＩＳＴＡＲ ３０００）を用いてＢＥＴ法による多点法比表面積を測定することにより求めた。その結果、比表面積は、０．５４ｍ２／ｇであった。
（３）抗体固定化量の定量
上記で得られた細胞吸着フィルターにおける抗ヒトＣＤ４モノクローナル抗体の固定化量はＢＣＡタンパク質定量試薬（ＰＩＥＲＣＥ社製 Ｍｉｃｒｏ ＢＣＡ（登録商標） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ２３２３５）を用い、マイクロプレート分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製 ＳＰＥＣＴＲＡ ＭＡＸ３４０ＰＣ、解析ソフトＳＯＦＴ ｍａｘ ＰＲＯ）によって吸光度測定を行い、定量した。その結果、洗浄前の細胞吸着フィルター（４枚）には１０．３μｇ、ＳＤＳ洗浄後の細胞吸着フィルターには９．８μｇの抗体が固定化されていた。
上記で得られた細胞吸着フィルターにおける抗ヒトＣＤ４モノクローナル抗体の固定化量はＢＣＡタンパク質定量試薬（ＰＩＥＲＣＥ社製 Ｍｉｃｒｏ ＢＣＡ（登録商標） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ２３２３５）を用い、マイクロプレート分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製 ＳＰＥＣＴＲＡ ＭＡＸ３４０ＰＣ、解析ソフトＳＯＦＴ ｍａｘ ＰＲＯ）によって吸光度測定を行い、定量した。その結果、洗浄前の細胞吸着フィルター（４枚）には１０．３μｇ、ＳＤＳ洗浄後の細胞吸着フィルターには９．８μｇの抗体が固定化されていた。
（４）ＣＤ４陽性細胞及び血小板の吸着率
フローサイトメーター（ＢＥＣＴＯＮ ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ社製 ＦＡＣＳＣＡＬＩＢＵＲ）を用いたフローサイトメトリー法によって、細胞吸着前のＡＣＤ−Ａ添加ヒト新鮮血液及び細胞吸着後の溶液（Ｆ１及びＦ２）中のＣＤ４陽性細胞数を測定し、細胞吸着器への細胞の吸着率を計算した。その結果、ＣＤ４陽性細胞の吸着率は９２．３％（Ｆ１）及び５９．３％（Ｆ２）であった。また、血小板の吸着率は３８．７％（８ｍＬ平均）であった。
フローサイトメーター（ＢＥＣＴＯＮ ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ社製 ＦＡＣＳＣＡＬＩＢＵＲ）を用いたフローサイトメトリー法によって、細胞吸着前のＡＣＤ−Ａ添加ヒト新鮮血液及び細胞吸着後の溶液（Ｆ１及びＦ２）中のＣＤ４陽性細胞数を測定し、細胞吸着器への細胞の吸着率を計算した。その結果、ＣＤ４陽性細胞の吸着率は９２．３％（Ｆ１）及び５９．３％（Ｆ２）であった。また、血小板の吸着率は３８．７％（８ｍＬ平均）であった。
［実施例２］
グラフト反応に用いる反応液を、ＳＰＢ１４．０ｇ、及びＧＭＡ２６．３ｍＬを５００ｍＬのメタノールに溶解して得た反応液に代えたこと以外は実施例１と同様の方法で、リガンド固定化用基材を作製した。
ＸＰＳによるリガンド固定化用基材の表面解析の結果、ＳＰＢのモル組成比Ｒは０．１２、被覆率Ｓは８７％であった。また比表面積を測定したところ０．５６ｍ２／ｇであった。
該リガンド固定化用基材から、実施例１と同様の方法で、細胞吸着フィルターを作製し、実施例１と表面積が同じになるように不織布量を調整した。その抗体固定化量を測定した結果、洗浄前の細胞吸着フィルターには１０．８μｇ、ＳＤＳ洗浄後の細胞吸着フィルターには８．９μｇの抗体が固定化されていた。該細胞吸着フィルターから、実施例１と同様の方法で、細胞吸着器を作製し、細胞の吸着率を測定した結果、ＣＤ４陽性細胞の吸着率は９４．１％（Ｆ１）及び６５．３％（Ｆ２）であった。また、血小板の吸着率は３４．０％（８ｍＬ平均）であった。
グラフト反応に用いる反応液を、ＳＰＢ１４．０ｇ、及びＧＭＡ２６．３ｍＬを５００ｍＬのメタノールに溶解して得た反応液に代えたこと以外は実施例１と同様の方法で、リガンド固定化用基材を作製した。
ＸＰＳによるリガンド固定化用基材の表面解析の結果、ＳＰＢのモル組成比Ｒは０．１２、被覆率Ｓは８７％であった。また比表面積を測定したところ０．５６ｍ２／ｇであった。
該リガンド固定化用基材から、実施例１と同様の方法で、細胞吸着フィルターを作製し、実施例１と表面積が同じになるように不織布量を調整した。その抗体固定化量を測定した結果、洗浄前の細胞吸着フィルターには１０．８μｇ、ＳＤＳ洗浄後の細胞吸着フィルターには８．９μｇの抗体が固定化されていた。該細胞吸着フィルターから、実施例１と同様の方法で、細胞吸着器を作製し、細胞の吸着率を測定した結果、ＣＤ４陽性細胞の吸着率は９４．１％（Ｆ１）及び６５．３％（Ｆ２）であった。また、血小板の吸着率は３４．０％（８ｍＬ平均）であった。
［実施例３］
グラフト反応に用いる反応液を、ＳＰＢ２７．９ｇ、及びＧＭＡ２６．３ｍＬを５００ｍＬのメタノールに溶解して得た反応液に代えたこと以外は実施例１と同様の方法で、リガンド固定化用基材を作製した。
ＸＰＳによるリガンド固定化用基材の表面解析の結果、ＳＰＢのモル組成比Ｒは０．２４、被覆率Ｓは８３％であった。また比表面積を測定したところ０．５１ｍ２／ｇであった。
該リガンド固定化用基材から、実施例１と同様の方法で、細胞吸着フィルターを作製し、実施例１と表面積が同じになるように不織布量を調整した。その抗体固定化量を測定した結果、洗浄前の細胞吸着フィルターには１１．２μｇ、ＳＤＳ洗浄後の細胞吸着フィルターには１０．３μｇの抗体が固定化されていた。該細胞吸着フィルターから、実施例１と同様の方法で、細胞吸着器を作製し、細胞の吸着率を測定した結果、ＣＤ４陽性細胞の吸着率は９８．２％（Ｆ１）及び８７．２％（Ｆ２）であった。また、血小板の吸着率は２３．１％（８ｍＬ平均）であった。
グラフト反応に用いる反応液を、ＳＰＢ２７．９ｇ、及びＧＭＡ２６．３ｍＬを５００ｍＬのメタノールに溶解して得た反応液に代えたこと以外は実施例１と同様の方法で、リガンド固定化用基材を作製した。
ＸＰＳによるリガンド固定化用基材の表面解析の結果、ＳＰＢのモル組成比Ｒは０．２４、被覆率Ｓは８３％であった。また比表面積を測定したところ０．５１ｍ２／ｇであった。
該リガンド固定化用基材から、実施例１と同様の方法で、細胞吸着フィルターを作製し、実施例１と表面積が同じになるように不織布量を調整した。その抗体固定化量を測定した結果、洗浄前の細胞吸着フィルターには１１．２μｇ、ＳＤＳ洗浄後の細胞吸着フィルターには１０．３μｇの抗体が固定化されていた。該細胞吸着フィルターから、実施例１と同様の方法で、細胞吸着器を作製し、細胞の吸着率を測定した結果、ＣＤ４陽性細胞の吸着率は９８．２％（Ｆ１）及び８７．２％（Ｆ２）であった。また、血小板の吸着率は２３．１％（８ｍＬ平均）であった。
［実施例４］
グラフト反応に用いる反応液を、ＳＰＢ５５．９ｇ、及びＧＭＡ２６．３ｍＬを５００ｍＬのメタノールに溶解して得た反応液に代えたこと以外は実施例１と同様の方法で、リガンド固定化用基材を作製した。
ＸＰＳによるリガンド固定化用基材の表面解析の結果、ＳＰＢのモル組成比Ｒは０．３８、被覆率Ｓは８４％であった。また比表面積を測定したところ０．５０ｍ２／ｇであった。
該リガンド固定化用基材から、実施例１と同様の方法で、細胞吸着フィルターを作製し、実施例１と表面積が同じになるように不織布量を調整した。その抗体固定化量を測定した結果、洗浄前の細胞吸着フィルターには９．８μｇ、ＳＤＳ洗浄後の細胞吸着フィルターには８．９μｇの抗体が固定化されていた。該細胞吸着フィルターから、実施例１と同様の方法で、細胞吸着器を作製し、細胞の吸着率を測定した結果、ＣＤ４陽性細胞の吸着率は９７．１％（Ｆ１）及び８７．３％（Ｆ２）であった。また、血小板の吸着率は１７．５％（８ｍＬ平均）であった。
グラフト反応に用いる反応液を、ＳＰＢ５５．９ｇ、及びＧＭＡ２６．３ｍＬを５００ｍＬのメタノールに溶解して得た反応液に代えたこと以外は実施例１と同様の方法で、リガンド固定化用基材を作製した。
ＸＰＳによるリガンド固定化用基材の表面解析の結果、ＳＰＢのモル組成比Ｒは０．３８、被覆率Ｓは８４％であった。また比表面積を測定したところ０．５０ｍ２／ｇであった。
該リガンド固定化用基材から、実施例１と同様の方法で、細胞吸着フィルターを作製し、実施例１と表面積が同じになるように不織布量を調整した。その抗体固定化量を測定した結果、洗浄前の細胞吸着フィルターには９．８μｇ、ＳＤＳ洗浄後の細胞吸着フィルターには８．９μｇの抗体が固定化されていた。該細胞吸着フィルターから、実施例１と同様の方法で、細胞吸着器を作製し、細胞の吸着率を測定した結果、ＣＤ４陽性細胞の吸着率は９７．１％（Ｆ１）及び８７．３％（Ｆ２）であった。また、血小板の吸着率は１７．５％（８ｍＬ平均）であった。
［実施例５］
グラフト反応に用いる反応液を、ＳＰＢ８９．４ｇ、及びＧＭＡ２１．１ｍＬを４００ｍＬのメタノールに溶解して得た反応液に代えたこと以外は実施例１と同様の方法で、リガンド固定化用基材を作製した。
ＸＰＳによるリガンド固定化用基材の表面解析の結果、ＳＰＢのモル組成比Ｒは０．５０、被覆率Ｓは７９％であった。また比表面積を測定したところ０．４８ｍ２／ｇであった。
該リガンド固定化用基材から、実施例１と同様の方法で、細胞吸着フィルターを作製し、実施例１と表面積が同じになるように不織布量を調整した。その抗体固定化量を測定した結果、洗浄前の細胞吸着フィルターには９．４μｇ、ＳＤＳ洗浄後の細胞吸着フィルターには８．０μｇの抗体が固定化されていた。該細胞吸着フィルターから、実施例１と同様の方法で、細胞吸着器を作製し、細胞の吸着率を測定した結果、ＣＤ４陽性細胞の吸着率は９２．７％（Ｆ１）及び５２．６％（Ｆ２）であった。また、血小板の吸着率は５．８％（８ｍＬ平均）であった。
グラフト反応に用いる反応液を、ＳＰＢ８９．４ｇ、及びＧＭＡ２１．１ｍＬを４００ｍＬのメタノールに溶解して得た反応液に代えたこと以外は実施例１と同様の方法で、リガンド固定化用基材を作製した。
ＸＰＳによるリガンド固定化用基材の表面解析の結果、ＳＰＢのモル組成比Ｒは０．５０、被覆率Ｓは７９％であった。また比表面積を測定したところ０．４８ｍ２／ｇであった。
該リガンド固定化用基材から、実施例１と同様の方法で、細胞吸着フィルターを作製し、実施例１と表面積が同じになるように不織布量を調整した。その抗体固定化量を測定した結果、洗浄前の細胞吸着フィルターには９．４μｇ、ＳＤＳ洗浄後の細胞吸着フィルターには８．０μｇの抗体が固定化されていた。該細胞吸着フィルターから、実施例１と同様の方法で、細胞吸着器を作製し、細胞の吸着率を測定した結果、ＣＤ４陽性細胞の吸着率は９２．７％（Ｆ１）及び５２．６％（Ｆ２）であった。また、血小板の吸着率は５．８％（８ｍＬ平均）であった。
［実施例６］
グラフト反応に用いる反応液を、ＳＰＢ１４．０ｇ、及びＧＭＡ１３．２ｍＬを５００ｍＬのメタノールに溶解して得た反応液に代えたこと以外は実施例１と同様の方法で、リガンド固定化用基材を作製した。
ＸＰＳによるリガンド固定化用基材の表面解析の結果、ＳＰＢのモル組成比Ｒは０．２５、被覆率Ｓは２５％であった。また比表面積を測定したところ０．４６ｍ２／ｇであった。
該リガンド固定化用基材から、実施例１と同様の方法で、細胞吸着フィルターを作製し、実施例１と表面積が同じになるように不織布量を調整した。その抗体固定化量を測定した結果、洗浄前の細胞吸着フィルターには１０．９μｇ、ＳＤＳ洗浄後の細胞吸着フィルターには９．６μｇの抗体が固定化されていた。該細胞吸着フィルターから、実施例１と同様の方法で、細胞吸着器を作製し、細胞の吸着率を測定した結果、ＣＤ４陽性細胞の吸着率は９７．５％（Ｆ１）及び８１．３％（Ｆ２）であった。また、血小板の吸着率は２５．２％（８ｍＬ平均）であった。
グラフト反応に用いる反応液を、ＳＰＢ１４．０ｇ、及びＧＭＡ１３．２ｍＬを５００ｍＬのメタノールに溶解して得た反応液に代えたこと以外は実施例１と同様の方法で、リガンド固定化用基材を作製した。
ＸＰＳによるリガンド固定化用基材の表面解析の結果、ＳＰＢのモル組成比Ｒは０．２５、被覆率Ｓは２５％であった。また比表面積を測定したところ０．４６ｍ２／ｇであった。
該リガンド固定化用基材から、実施例１と同様の方法で、細胞吸着フィルターを作製し、実施例１と表面積が同じになるように不織布量を調整した。その抗体固定化量を測定した結果、洗浄前の細胞吸着フィルターには１０．９μｇ、ＳＤＳ洗浄後の細胞吸着フィルターには９．６μｇの抗体が固定化されていた。該細胞吸着フィルターから、実施例１と同様の方法で、細胞吸着器を作製し、細胞の吸着率を測定した結果、ＣＤ４陽性細胞の吸着率は９７．５％（Ｆ１）及び８１．３％（Ｆ２）であった。また、血小板の吸着率は２５．２％（８ｍＬ平均）であった。
［比較例１］
グラフト反応に用いる反応液を、ＧＭＡ２６．３ｍＬを５００ｍＬのメタノールに溶解して得た反応液に代えたこと以外は実施例１と同様の方法で、リガンド固定化用基材を作製した。
ＸＰＳによるリガンド固定化用基材の表面解析の結果、ＳＰＢのモル組成比Ｒは０、被覆率Ｓは７５％であった。また比表面積を測定したところ０．５１ｍ２／ｇであった。
該リガンド固定化用基材から、実施例１と同様の方法で、細胞吸着フィルターを作製し、実施例１と表面積が同じになるように不織布量を調整した。その抗体固定化量を測定した結果、洗浄前の細胞吸着フィルターには１０．３μｇ、ＳＤＳ洗浄後の細胞吸着フィルターには９．４μｇの抗体が固定化されていた。該細胞吸着フィルターから、実施例１と同様の方法で、細胞吸着器を作製し、細胞の吸着率を測定した結果、ＣＤ４陽性細胞の吸着率は９０．２％（Ｆ１）及び３７．３％（Ｆ２）であった。また、血小板の吸着率は８０．３％（８ｍＬ平均）であった。
グラフト反応に用いる反応液を、ＧＭＡ２６．３ｍＬを５００ｍＬのメタノールに溶解して得た反応液に代えたこと以外は実施例１と同様の方法で、リガンド固定化用基材を作製した。
ＸＰＳによるリガンド固定化用基材の表面解析の結果、ＳＰＢのモル組成比Ｒは０、被覆率Ｓは７５％であった。また比表面積を測定したところ０．５１ｍ２／ｇであった。
該リガンド固定化用基材から、実施例１と同様の方法で、細胞吸着フィルターを作製し、実施例１と表面積が同じになるように不織布量を調整した。その抗体固定化量を測定した結果、洗浄前の細胞吸着フィルターには１０．３μｇ、ＳＤＳ洗浄後の細胞吸着フィルターには９．４μｇの抗体が固定化されていた。該細胞吸着フィルターから、実施例１と同様の方法で、細胞吸着器を作製し、細胞の吸着率を測定した結果、ＣＤ４陽性細胞の吸着率は９０．２％（Ｆ１）及び３７．３％（Ｆ２）であった。また、血小板の吸着率は８０．３％（８ｍＬ平均）であった。
［比較例２］
グラフト反応に用いる反応液を、ＳＰＢ１３４．１ｇ、及びＧＭＡ１５．８ｍＬを３５０ｍＬのメタノールに溶解して得た反応液に代えたこと以外は実施例１と同様の方法で、リガンド固定化用基材を作製した。
ＸＰＳによるリガンド固定化用基材の表面解析の結果、ＳＰＢのモル組成比Ｒは０．５９、被覆率Ｓは８０％であった。また比表面積を測定したところ０．４７ｍ２／ｇであった。
該リガンド固定化用基材から、実施例１と同様の方法で、細胞吸着フィルターを作製し、実施例１と表面積が同じになるように不織布量を調整した。その抗体固定化量を測定した結果、洗浄前の細胞吸着フィルターには０．７μｇ、ＳＤＳ洗浄後の細胞吸着フィルターには０．２μｇの抗体が固定化されていた。該細胞吸着フィルターから、実施例１と同様の方法で、細胞吸着器を作製し、細胞の吸着率を測定した結果、ＣＤ４陽性細胞の吸着率は２１．７％（Ｆ１）及び５．２％（Ｆ２）であった。また、血小板の吸着率は５．３％（８ｍＬ平均）であった。
グラフト反応に用いる反応液を、ＳＰＢ１３４．１ｇ、及びＧＭＡ１５．８ｍＬを３５０ｍＬのメタノールに溶解して得た反応液に代えたこと以外は実施例１と同様の方法で、リガンド固定化用基材を作製した。
ＸＰＳによるリガンド固定化用基材の表面解析の結果、ＳＰＢのモル組成比Ｒは０．５９、被覆率Ｓは８０％であった。また比表面積を測定したところ０．４７ｍ２／ｇであった。
該リガンド固定化用基材から、実施例１と同様の方法で、細胞吸着フィルターを作製し、実施例１と表面積が同じになるように不織布量を調整した。その抗体固定化量を測定した結果、洗浄前の細胞吸着フィルターには０．７μｇ、ＳＤＳ洗浄後の細胞吸着フィルターには０．２μｇの抗体が固定化されていた。該細胞吸着フィルターから、実施例１と同様の方法で、細胞吸着器を作製し、細胞の吸着率を測定した結果、ＣＤ４陽性細胞の吸着率は２１．７％（Ｆ１）及び５．２％（Ｆ２）であった。また、血小板の吸着率は５．３％（８ｍＬ平均）であった。
［実施例７］
担体をポリプロピレンからなる不織布（平均繊維径２．９μｍ 目付８０ｇ／ｍ２）に代えたこと以外は実施例３と同様の方法で、リガンド固定化用基材を作製した。
ＸＰＳによるリガンド固定化用基材の表面解析の結果、ＳＰＢのモル組成比Ｒは０．２３、被覆率Ｓは８７％であった。また比表面積を測定したところ０．７２ｍ２／ｇであった。
該リガンド固定化用基材から、実施例１と同様の方法で、細胞吸着フィルターを作製し、実施例１と表面積が同じになるように不織布量を調整した。その抗体固定化量を測定した結果、洗浄前の細胞吸着フィルターには１０．３μｇ、ＳＤＳ洗浄後の細胞吸着フィルターには８．６μｇの抗体が固定化されていた。該細胞吸着フィルターから、実施例１と同様の方法で、細胞吸着器を作製し、細胞の吸着率を測定した結果、ＣＤ４陽性細胞の吸着率は９９．９％（Ｆ１）及び９２．１％（Ｆ２）であった。また、血小板の吸着率は２３．３％（８ｍＬ平均）であった。
担体をポリプロピレンからなる不織布（平均繊維径２．９μｍ 目付８０ｇ／ｍ２）に代えたこと以外は実施例３と同様の方法で、リガンド固定化用基材を作製した。
ＸＰＳによるリガンド固定化用基材の表面解析の結果、ＳＰＢのモル組成比Ｒは０．２３、被覆率Ｓは８７％であった。また比表面積を測定したところ０．７２ｍ２／ｇであった。
該リガンド固定化用基材から、実施例１と同様の方法で、細胞吸着フィルターを作製し、実施例１と表面積が同じになるように不織布量を調整した。その抗体固定化量を測定した結果、洗浄前の細胞吸着フィルターには１０．３μｇ、ＳＤＳ洗浄後の細胞吸着フィルターには８．６μｇの抗体が固定化されていた。該細胞吸着フィルターから、実施例１と同様の方法で、細胞吸着器を作製し、細胞の吸着率を測定した結果、ＣＤ４陽性細胞の吸着率は９９．９％（Ｆ１）及び９２．１％（Ｆ２）であった。また、血小板の吸着率は２３．３％（８ｍＬ平均）であった。
［実施例８］
担体をポリプロピレンからなる不織布（平均繊維径２０．９μｍ 目付８０ｇ／ｍ２）に代えたこと以外は実施例３と同様の方法で、リガンド固定化用基材を作製した。
ＸＰＳによるリガンド固定化用基材の表面解析の結果、ＳＰＢのモル組成比Ｒは０．２５、被覆率Ｓは８４％であった。また比表面積を測定したところ０．２２ｍ２／ｇであった。
該リガンド固定化用基材から、実施例１と同様の方法で、細胞吸着フィルターを作製し、実施例１と表面積が同じになるように不織布量を調整した。その抗体固定化量を測定した結果、洗浄前の細胞吸着フィルターには１０．６μｇ、ＳＤＳ洗浄後の細胞吸着フィルターには８．１μｇの抗体が固定化されていた。該細胞吸着フィルターから、実施例１と同様の方法で、細胞吸着器を作製し、細胞の吸着率を測定した結果、ＣＤ４陽性細胞の吸着率は８２．１％（Ｆ１）及び７０．９％（Ｆ２）であった。また、血小板の吸着率は５．４％（８ｍＬ平均）であった。
担体をポリプロピレンからなる不織布（平均繊維径２０．９μｍ 目付８０ｇ／ｍ２）に代えたこと以外は実施例３と同様の方法で、リガンド固定化用基材を作製した。
ＸＰＳによるリガンド固定化用基材の表面解析の結果、ＳＰＢのモル組成比Ｒは０．２５、被覆率Ｓは８４％であった。また比表面積を測定したところ０．２２ｍ２／ｇであった。
該リガンド固定化用基材から、実施例１と同様の方法で、細胞吸着フィルターを作製し、実施例１と表面積が同じになるように不織布量を調整した。その抗体固定化量を測定した結果、洗浄前の細胞吸着フィルターには１０．６μｇ、ＳＤＳ洗浄後の細胞吸着フィルターには８．１μｇの抗体が固定化されていた。該細胞吸着フィルターから、実施例１と同様の方法で、細胞吸着器を作製し、細胞の吸着率を測定した結果、ＣＤ４陽性細胞の吸着率は８２．１％（Ｆ１）及び７０．９％（Ｆ２）であった。また、血小板の吸着率は５．４％（８ｍＬ平均）であった。
［実施例９］
担体をポリエチレンからなる平均粒径３２０μｍの粒子に代えたこと、及びグラフト反応に用いる反応液を、ＳＰＢ２７．９ｇ、及びＧＭＡ２６．３ｍＬを５００ｍＬのメタノールに溶解して得た反応液に代えたこと以外は実施例１と同様の方法で、リガンド固定化用基材（リガンド固定化用粒子）を作製した。
ＸＰＳによるリガンド固定化用粒子の表面解析の結果、ＳＰＢのモル組成比Ｒは０．２８、被覆率Ｓは６７％であった。また比表面積を測定したところ０．０３ｍ２／ｇであった。
該リガンド固定化用粒子３６０μＬから、実施例１と同様の方法で、細胞吸着粒子（吸着材）を作製し、実施例１と表面積が同じになるように粒子量を調整した。その抗体固定化量を測定した結果、洗浄前の細胞吸着粒子には１０．８μｇ、ＳＤＳ洗浄後の細胞吸着粒子には１０．２μｇの抗体が固定化されていた。該細胞吸着粒子から、実施例１と同様の方法で、細胞吸着器を作製し、細胞の吸着率を測定した結果、ＣＤ４陽性細胞の吸着率は８３．７％（Ｆ１）及び７４．１％（Ｆ２）であった。また、血小板の吸着率は４．８％（８ｍＬ平均）であった。
担体をポリエチレンからなる平均粒径３２０μｍの粒子に代えたこと、及びグラフト反応に用いる反応液を、ＳＰＢ２７．９ｇ、及びＧＭＡ２６．３ｍＬを５００ｍＬのメタノールに溶解して得た反応液に代えたこと以外は実施例１と同様の方法で、リガンド固定化用基材（リガンド固定化用粒子）を作製した。
ＸＰＳによるリガンド固定化用粒子の表面解析の結果、ＳＰＢのモル組成比Ｒは０．２８、被覆率Ｓは６７％であった。また比表面積を測定したところ０．０３ｍ２／ｇであった。
該リガンド固定化用粒子３６０μＬから、実施例１と同様の方法で、細胞吸着粒子（吸着材）を作製し、実施例１と表面積が同じになるように粒子量を調整した。その抗体固定化量を測定した結果、洗浄前の細胞吸着粒子には１０．８μｇ、ＳＤＳ洗浄後の細胞吸着粒子には１０．２μｇの抗体が固定化されていた。該細胞吸着粒子から、実施例１と同様の方法で、細胞吸着器を作製し、細胞の吸着率を測定した結果、ＣＤ４陽性細胞の吸着率は８３．７％（Ｆ１）及び７４．１％（Ｆ２）であった。また、血小板の吸着率は４．８％（８ｍＬ平均）であった。
［実施例１０］
抗体を抗ヒトＫＬＲＧ１抗体に代えたこと以外は実施例１と同様の方法で、細胞吸着フィルターを作製し、実施例１と表面積が同じになるように不織布量を調整した。その抗体固定化量を測定した結果、洗浄前の細胞吸着フィルターには１１．０μｇ、ＳＤＳ洗浄後の細胞吸着フィルターには９．１μｇの抗体が固定化されていた。該細胞吸着フィルターから、実施例１と同様の方法で、細胞吸着器を作成し、細胞の吸着率を測定した結果、ＫＬＲＧ１陽性細胞の吸着率は９０．１％（Ｆ１）及び７７．６％（Ｆ２）であった。また、血小板の吸着率は２６．１％（８ｍＬ平均）であった。
抗体を抗ヒトＫＬＲＧ１抗体に代えたこと以外は実施例１と同様の方法で、細胞吸着フィルターを作製し、実施例１と表面積が同じになるように不織布量を調整した。その抗体固定化量を測定した結果、洗浄前の細胞吸着フィルターには１１．０μｇ、ＳＤＳ洗浄後の細胞吸着フィルターには９．１μｇの抗体が固定化されていた。該細胞吸着フィルターから、実施例１と同様の方法で、細胞吸着器を作成し、細胞の吸着率を測定した結果、ＫＬＲＧ１陽性細胞の吸着率は９０．１％（Ｆ１）及び７７．６％（Ｆ２）であった。また、血小板の吸着率は２６．１％（８ｍＬ平均）であった。
［実施例１１］
抗体を抗ヒトＫＬＲＧ１抗体に代えたこと以外は実施例５と同様の方法で、細胞吸着フィルターを作製し、実施例１と表面積が同じになるように不織布量を調整した。その抗体固定化量を測定した結果、洗浄前の細胞吸着フィルターには１０．１μｇ、ＳＤＳ洗浄後の細胞吸着フィルターには８．２μｇの抗体が固定化されていた。該細胞吸着フィルターから、実施例１と同様の方法で、細胞吸着器を作成し、細胞の吸着率を測定した結果、ＫＬＲＧ１陽性細胞の吸着率は９４．６％（Ｆ１）及び８４．４％（Ｆ２）であった。また、血小板の吸着率は１２．５％（８ｍＬ平均）であった。
抗体を抗ヒトＫＬＲＧ１抗体に代えたこと以外は実施例５と同様の方法で、細胞吸着フィルターを作製し、実施例１と表面積が同じになるように不織布量を調整した。その抗体固定化量を測定した結果、洗浄前の細胞吸着フィルターには１０．１μｇ、ＳＤＳ洗浄後の細胞吸着フィルターには８．２μｇの抗体が固定化されていた。該細胞吸着フィルターから、実施例１と同様の方法で、細胞吸着器を作成し、細胞の吸着率を測定した結果、ＫＬＲＧ１陽性細胞の吸着率は９４．６％（Ｆ１）及び８４．４％（Ｆ２）であった。また、血小板の吸着率は１２．５％（８ｍＬ平均）であった。
［実施例１２］
グラフト反応を下記方法により行ったこと、ＸＰＳによる表面解析を下記方法により行ったこと以外は実施例１と同様の方法で、リガンド固定用基材の作製及び評価を行った。
（グラフト反応）
ＳＰＢ２７．９ｇ、及び２−［（３，５−ジメチルピラゾリル）カルボキシアミノ］エチルメタクリレート（カレンズＭＯＩ−ＢＰ、昭和電工）４４．３ｍＬを５００ｍＬのメタノールに溶解して反応液を得た。この反応液に４０℃にて６０分間窒素を通気した。
耐圧ガラス容器に担体（実施例１に記載の不織布）をすばやく入れ、減圧後、上記反応液を引き込み４０℃にて１時間反応させた。反応後、取り出した不織布をジメチルホルムアミド及びメタノールにより洗浄し、１２０℃にて真空乾燥することでイソシアネート基を脱保護し、リガンド固定化用基材を得た。
（ＸＰＳによる表面解析）
重合されたＳＰＢとメタクリロイルオキシエチルイソシアネートのモル組成比及び被覆率を求めるためイソシアネート基の硫黄標識化を行った。
２−メルカプトエタノール２ｍＬの無水ＴＨＦ溶液５０ｍＬにリガンド固定化用基材２ｇを十分に浸漬し、窒素雰囲気下、室温にて３時間反応後、無水ＴＨＦで洗浄し、４０℃にて真空乾燥を行った。上記で得られた硫黄標識化不織布の表面をＸ線光電子分光法（ＸＰＳ ＥＳＣＡ）により解析した。ＸＰＳより得られる炭素、窒素及び硫黄の各相対元素濃度をそれぞれＣ１、Ｃ２及びＣ３とすると、基材表面に存在するＳＰＢ相対モル濃度（Ｘ）、メタクリロイルオキシエチル（２−ヒドロキシエチル）チオカルバメートの相対モル濃度（Ｙ）、及び担体構成ポリマー相対モル濃度（Ｚ）はそれぞれ次式（１０）から（１２）で表される。
Ｘ＝ｘ／（ｘ＋ｙ＋ｚ） （１０）
Ｙ＝ｙ／（ｘ＋ｙ＋ｚ） （１１）
Ｚ＝ｚ／（ｘ＋ｙ＋ｚ） （１２）
ただし、ｘ＝（Ｃ２−ｙ）、ｙ＝Ｃ３、ｚ＝｛Ｃ１−（１０ｘ＋９ｙ）｝／Ａであって、Ａは担体構成ポリマーの単位炭素組成であり、ポリエチレンの場合Ａ＝２、ポリプロピレンの場合Ａ＝３である。
上記で得られる相対モル濃度より共重合ポリマー中のＳＰＢのモル組成比Ｒは次式（１３）で表される。
Ｒ＝ｍ／（ｎ＋ｍ）＝Ｘ／（Ｘ＋Ｙ） （１３）
また、ＳＰＢポリマーの単位分子量ＭＸ、メタクリロイルオキシエチル（２−ヒドロキシエチル）チオカルバメートポリマーの単位分子量ＭＹ、担体構成ポリマーの単位分子量ＭＺとすると、被覆率Ｓ（％）は次式（１４）で表される。
Ｓ＝１００｛１−ＺＭＺ／（ＸＭＸ＋ＹＭＹ＋ＺＭＺ）｝ （１４）
これらの計算式に基づき、ＳＰＢモル組成比Ｒ及び被覆率Ｓを算出した結果、ＳＰＢのモル組成比Ｒは０．１９、被覆率Ｓは８２％であった。
またリガンド固定化用基材の比表面積を測定したところ０．４８ｍ２／ｇであった。
該リガンド固定化用基材から、実施例１と同様の方法で、細胞吸着フィルターを作製し、実施例１と表面積が同じになるように不織布量を調整した。その抗体固定化量を測定した結果、洗浄前の細胞吸着フィルターには１０．７μｇ、ＳＤＳ洗浄後の細胞吸着フィルターには９．３μｇの抗体が固定化されていた。該細胞吸着フィルターから、実施例１と同様の方法で、細胞吸着器を作製し、細胞の吸着率を測定した結果、ＣＤ４陽性細胞の吸着率は９７．０％（Ｆ１）及び７２．６％（Ｆ２）であった。また、血小板の吸着率は２４．８％（８ｍＬ平均）であった。
グラフト反応を下記方法により行ったこと、ＸＰＳによる表面解析を下記方法により行ったこと以外は実施例１と同様の方法で、リガンド固定用基材の作製及び評価を行った。
（グラフト反応）
ＳＰＢ２７．９ｇ、及び２−［（３，５−ジメチルピラゾリル）カルボキシアミノ］エチルメタクリレート（カレンズＭＯＩ−ＢＰ、昭和電工）４４．３ｍＬを５００ｍＬのメタノールに溶解して反応液を得た。この反応液に４０℃にて６０分間窒素を通気した。
耐圧ガラス容器に担体（実施例１に記載の不織布）をすばやく入れ、減圧後、上記反応液を引き込み４０℃にて１時間反応させた。反応後、取り出した不織布をジメチルホルムアミド及びメタノールにより洗浄し、１２０℃にて真空乾燥することでイソシアネート基を脱保護し、リガンド固定化用基材を得た。
（ＸＰＳによる表面解析）
重合されたＳＰＢとメタクリロイルオキシエチルイソシアネートのモル組成比及び被覆率を求めるためイソシアネート基の硫黄標識化を行った。
２−メルカプトエタノール２ｍＬの無水ＴＨＦ溶液５０ｍＬにリガンド固定化用基材２ｇを十分に浸漬し、窒素雰囲気下、室温にて３時間反応後、無水ＴＨＦで洗浄し、４０℃にて真空乾燥を行った。上記で得られた硫黄標識化不織布の表面をＸ線光電子分光法（ＸＰＳ ＥＳＣＡ）により解析した。ＸＰＳより得られる炭素、窒素及び硫黄の各相対元素濃度をそれぞれＣ１、Ｃ２及びＣ３とすると、基材表面に存在するＳＰＢ相対モル濃度（Ｘ）、メタクリロイルオキシエチル（２−ヒドロキシエチル）チオカルバメートの相対モル濃度（Ｙ）、及び担体構成ポリマー相対モル濃度（Ｚ）はそれぞれ次式（１０）から（１２）で表される。
Ｘ＝ｘ／（ｘ＋ｙ＋ｚ） （１０）
Ｙ＝ｙ／（ｘ＋ｙ＋ｚ） （１１）
Ｚ＝ｚ／（ｘ＋ｙ＋ｚ） （１２）
ただし、ｘ＝（Ｃ２−ｙ）、ｙ＝Ｃ３、ｚ＝｛Ｃ１−（１０ｘ＋９ｙ）｝／Ａであって、Ａは担体構成ポリマーの単位炭素組成であり、ポリエチレンの場合Ａ＝２、ポリプロピレンの場合Ａ＝３である。
上記で得られる相対モル濃度より共重合ポリマー中のＳＰＢのモル組成比Ｒは次式（１３）で表される。
Ｒ＝ｍ／（ｎ＋ｍ）＝Ｘ／（Ｘ＋Ｙ） （１３）
また、ＳＰＢポリマーの単位分子量ＭＸ、メタクリロイルオキシエチル（２−ヒドロキシエチル）チオカルバメートポリマーの単位分子量ＭＹ、担体構成ポリマーの単位分子量ＭＺとすると、被覆率Ｓ（％）は次式（１４）で表される。
Ｓ＝１００｛１−ＺＭＺ／（ＸＭＸ＋ＹＭＹ＋ＺＭＺ）｝ （１４）
これらの計算式に基づき、ＳＰＢモル組成比Ｒ及び被覆率Ｓを算出した結果、ＳＰＢのモル組成比Ｒは０．１９、被覆率Ｓは８２％であった。
またリガンド固定化用基材の比表面積を測定したところ０．４８ｍ２／ｇであった。
該リガンド固定化用基材から、実施例１と同様の方法で、細胞吸着フィルターを作製し、実施例１と表面積が同じになるように不織布量を調整した。その抗体固定化量を測定した結果、洗浄前の細胞吸着フィルターには１０．７μｇ、ＳＤＳ洗浄後の細胞吸着フィルターには９．３μｇの抗体が固定化されていた。該細胞吸着フィルターから、実施例１と同様の方法で、細胞吸着器を作製し、細胞の吸着率を測定した結果、ＣＤ４陽性細胞の吸着率は９７．０％（Ｆ１）及び７２．６％（Ｆ２）であった。また、血小板の吸着率は２４．８％（８ｍＬ平均）であった。
実施例１〜１２及び比較例１〜２の結果を、表１及び表２にまとめた。
１…水不溶性担体、２…共重合体、１０…結合部分、２０…Ｒ３基、３０…Ｒ２基（求電子官能基）、４０…リガンド、５０…容器、６０ａ、６０ｂ…ヘッダーキャップ、Ｆ…血液の流れ方向、１００…リガンド固定化用基材、１１０…特異的細胞分離材、２００…血液処理器。
Claims (14)
- 水不溶性担体と、該水不溶性担体の少なくとも表面に結合した下記一般式（１）で表される共重合体と、を備える、リガンド固定化用基材。
- 前記共重合体が、下記一般式（３）で表されるモノマーと下記一般式（４）で表されるモノマーとの共重合体である、請求項１に記載のリガンド固定化用基材。
- 前記共重合体が、エポキシ基を含む、請求項１又は２に記載のリガンド固定化用基材。
- 前記共重合体による前記水不溶性担体の表面の被覆率が２５％以上である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のリガンド固定化用基材。
- 前記水不溶性担体が、多孔膜又は粒子である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のリガンド固定化用基材。
- 前記水不溶性担体が、繊維からなる多孔膜であり、かつ平均繊維径が２μｍ以上２０μｍ以下である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のリガンド固定化用基材。
- リガンド固定化用基材の製造における、下記一般式（１）で表される共重合体の使用。
- 前記共重合体が、エポキシ基を含む、請求項７に記載の使用。
- （ｉ）水不溶性担体に電離性放射線を照射する工程と、
（ｉｉ）下記一般式（３）で表されるモノマー及び下記一般式（４）で表されるモノマーを含む溶液に、工程（ｉ）で得られた水不溶性担体を浸漬してグラフト重合させる工程と、を含む、リガンド固定化用基材の製造方法。
- 前記一般式（４）で表されるモノマーが、エポキシ基を有する、請求項９に記載の製造方法。
- 前記水不溶性担体が、多孔膜又は粒子である、請求項９又は１０に記載の製造方法。
- 前記水不溶性担体が、繊維からなる多孔膜であり、かつ平均繊維径が２μｍ以上２０μｍ以下である、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の製造方法。
- 請求項１〜６のいずれか一項に記載のリガンド固定化用基材に、抗体、タンパク質、ペプチド及び低分子化合物からなる群より選択される１種以上のリガンドが結合した特異的細胞分離材。
- 血液の導入口及び導出口を有する容器の内部に、請求項１３に記載の特異的細胞分離材が充填された血液処理器。
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