JP5784008B2

JP5784008B2 - リガンド固定化用基材及びその製造方法

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Description

本発明はアフィニティーリガンドを固定化するためのリガンド固定化用基材及びその製造方法に関する。

血液から特定成分を除去する目的で、該特定成分に対して親和性のある物質、すなわち、リガンドを水不溶性担体に共有結合によって固定した吸着材が臨床的に広く利用されている。これら吸着材は、患者血液を一旦体外に取り出し、その血液あるいは血漿分離器で分離した血漿を吸着材に流して処理した後、患者に返血するという形で使用される。

このため吸着材からリガンドが溶出すると、直接患者体内に入り、種々の生理作用を引き起こす危険性がある。よって、リガンドの溶離量が多い吸着材は、安全性の点より臨床で利用できない。すなわち、これら吸着材を実用化するに当たっては、水不溶性担体とリガンドとの結合を強固にし、溶離するリガンド量を減らせるかが最も重要な技術課題である。

また、血液との接触に伴うタンパク質や細胞（白血球や血小板など）、その他血中成分の表面吸着が起きにくいといった吸着材の血液適合性も重要である。特に、選択的吸着材においては、特定成分を選択的に吸着させるために、基材そのものに目的成分以外のものの非特異的な吸着が起きない基材が望まれている。

従来、臨床で使用されているポリエチレン、ポリプロピレン、ポリウレタン、ナイロン、ポリ塩化ビニルなどの医療用材料は、単に工業用樹脂材料を医療用に転用したものであり、血液適合性が十分であるとはいえない。そこで、医療用材料表面の親水性及び疎水性を改善するために、該医療用材料表面に、放射線、紫外線等を照射したり、アーク、直流グロー、高周波、マイクロ波、コロナ放電等によりプラズマ処理したり、ＵＶ−オゾン処理する等の方法において発生させたラジカルを開始点として、これにラジカル重合性モノマーを作用させて表面にグラフト重合層を形成させる方法が広く用いられている。例えば、非特許文献１には、放射線を用いたグラフト重合が、また非特許文献２には、ポリ酢酸ビニル水溶液を用いたメチルメタクリレート又はアクリル酸を、ポリプロピレン表面上あるいはポリエチレン表面上でグラフト重合させる方法等が提案されている。

一方、重合性を有するベタイン化合物として、リン脂質の極性基であるホスホリルコリンを高分子鎖の側鎖に有するポリ２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（以下、ＭＰＣという。）が広く知られている（例えば、特許文献１及び２）。ＭＰＣポリマーは、生体膜と同じ両性型のリン脂質を有することから、生体適合性に優れ、その表面に血漿タンパク質が吸着せず、血小板の粘着や活性化などを誘発しないという利点があると解されているが、ＭＰＣポリマーを構成している２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンは、その調製のために煩雑な操作を必要とし、しかもその純度を高めることが困難であるとともに、生成した結晶が短時間で潮解するという欠点があるため、その取り扱いが不便であることなどが影響して、合成高分子化合物としては比較的高価である。

これに対し、比較的安価でかつ容易に大量に調製することができる化合物として、グリシン型の両性基を持つＮ−メタクリロイルオキシエチル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウム−α−Ｎ−メチルカルボキシベタイン（以下、ＣＭＢという。）が提案されている（例えば、特許文献３、４及び５）。ＣＭＢ及び重合性モノマーとの共重合ポリマーはタンパク質や血球などの生体成分との相互作用が小さいなどの優れた生体適合性を有しているとの報告がある（特許文献６）が、ＣＭＢとリガンド固定化用官能基を有するモノマーとの共重合体を基材表面に有するリガンド固定化用基材は知られていない。

特開昭５４−６３０２５号公報特開２０００−２７９５１２号公報特開平９−９５４７４号公報特開平９−９５５８６号公報特開平１１−２２２４７０号公報特開２００７−１３０１９４号公報

Ａ．Ｈｅｎｇｌｅｉｎ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，７０、４６１（１９５５）Ｙ．Ｏｇｉｗａｒａ，ｅｔ．ａｌ．，Ｐｏｙｍ．Ｓｃｉ．，ＰｏｌｙｍＬｅｔｔｅｒＥｄ．，１９、４５７（１９８１）

細胞を吸着する目的においては、吸着基材に選択的な細胞吸着性能を付与する方法として、基材表面にカチオン性官能基（例えば、１級アミノ基、２級アミノ基、３級アミノ基、４級アンモニウム基）やアニオン性官能基（例えば、硫酸エステル基、スルホン酸基、カルボキシル基、リン酸エステル基）をバランスよく固定化して細胞の選択吸着を行う技術が従来から知られているが、このような方法では目標とする高い細胞選択性を発現させることが困難な場合が多い。

これに対し、高い細胞選択吸着性を得るために目的細胞の細胞表面に存在するタンパク質や糖鎖に特異的な親和性を有するアフィニティーリガンドを用いる方法は効果的である。特に細胞表面の蛋白質や糖鎖に強い親和性のあるアミノ酸配列を有した抗体や、抗体の抗原結合部位を含む抗体断片（Ｆ（ａｂ）’、Ｆａｂ、Ｆａｂ’等）、さらにそのようなアミノ酸配列を有する合成ペプチド、又はそれらの修飾ペプチドが効果的であり、これらを吸着基材に共有結合にて固定化する方法が効果的であると考えられる。

さらに細胞吸着材に限らず、血液中から選択的に目的物質を除去又は回収する選択吸着材を製造する場合には、吸着材からのリガンドの漏出が極めて少ないといった安全性も重要である。つまり、非特異吸着の起きにくい吸着材へのリガンドの固定化を共有結合でほぼ達成し、リガンドの物理的な非共有結合を十分に低減させておく必要がある。

本発明は、上記実情に鑑みてなされたものであり、蛋白質や血球などの生体成分との非特異的相互作用が少ないなどの優れた生体適合性を有し、リガンドを強固に結合し、固定化したリガンドとの特異的相互作用に基づく高い吸着性能を発揮し得るリガンド固定化用基材、及びその製造方法を提供することを解決すべき課題とする。

本発明者らは、優れた生体適合性を有し、リガンドと強固に結合してリガンドが溶出するリスクが少なく、固定化したリガンドの性能を十分に発揮させ得る基材について鋭意研究を進めた結果、水不溶性担体の表面にＣＭＢと求電子官能基を有する重合性モノマーとの共重合体が結合してなるリガンド固定化用基材が上記の課題を解決することを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明によれば以下の発明が提供される。
［１］水不溶性担体の少なくとも表面に下記一般式（１）で表される共重合体が結合してなる、リガンド固定化用基材。

［一般式（１）中、ｎ及びｍは正の整数を示し、ｍ／（ｎ＋ｍ）の値は０．１以上０．４５以下である。また、式（１）中、Ｒ^１はＨ又はＣＨ_３、Ｒ^２は求電子官能基を有する有機基、Ｒ^３は

を示す。］
［２］水不溶性担体の少なくとも表面に、下記式（２）で表されるＮ−メタクリロイルオキシエチル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウム−α−Ｎ−メチルカルボキシベタインと下記一般式（３）で表される重合性モノマーとの共重合体が結合しており、該共重合体におけるＮ−メタクリロイルオキシエチル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウム−α−Ｎ−メチルカルボキシベタインのモル組成比が０．１以上０．４５以下である、リガンド固定化用基材。

［一般式（３）中、Ｒ^１はＨ又はＣＨ_３、Ｒ^２は求電子官能基を有する有機基を示す。］
［３］前記共重合体がエポキシ基を含む、［１］又は［２］に記載のリガンド固定化用基材。
［４］前記共重合体による前記水不溶性担体表面の被覆率が２７％以上である、［１］から［３］のいずれかに記載のリガンド固定化用基材。
［５］前記水不溶性担体が多孔膜又は粒子である、［１］から［４］のいずれかに記載のリガンド固定化用基材。
［６］リガンド固定化用基材を製造するための下記一般式（１）で表される共重合体の使用。

［一般式（１）中、ｎ及びｍは正の整数を示し、ｍ／（ｎ＋ｍ）の値は０．１以上０．４５以下である。また、一般式（１）中、Ｒ^１はＨ又はＣＨ_３、Ｒ^２は求電子官能基を有する有機基、Ｒ^３は

を示す。］
［７］前記共重合体がエポキシ基を含む、［６］に記載の共重合体の使用。
［８］（ｉ）水不溶性担体に放射線を照射する工程と、（ｉｉ）下記式（２）で表されるＮ−メタクリロイルオキシエチル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウム−α−Ｎ−メチルカルボキシベタインと下記一般式（３）で表される重合性モノマーとを含む溶液に、工程（ｉ）で得られた水不溶性担体を浸漬してグラフト重合させる工程と、
を含むことを特徴とするリガンド固定化用基材の製造方法。

［一般式（３）中、Ｒ^１はＨ又はＣＨ_３、Ｒ^２は求電子官能基を有する有機基を示す。］
［９］前記重合性モノマーが、エポキシ基を有する、［８］に記載のリガンド固定化用基材の製造方法。
［１０］前記水不溶性担体が多孔膜又は粒子である、［８］又は［９］に記載のリガンド固定化用基材の製造方法。
［１１］［１］から［５］のいずれかに記載されたリガンド固定化用基材に、抗体、蛋白質、ペプチド及び低分子化合物からなる群より選択されるリガンドが結合した吸着材。
［１２］内部に血液を導入するための入口と、該血液を外部に排出するための出口と、を備えた容器の内部に、［１１］に記載の吸着材が充填された血液処理器。

本発明によれば、蛋白質や血球などの生体成分との非特異的相互作用が少ないなどの優れた生体適合性を有し、リガンドを強固に結合し、固定化したリガンドとの特異的相互作用に基づく高い吸着性能を発揮し得るリガンド固定化用基材、及びその製造方法が提供される。

一実施形態に係るリガンド固定化用基材の模式断面図である。一実施形態に係る吸着材の模式断面図である。一実施形態に係る血液処理器の模式断面図である。

以下、本発明を詳細に説明する。以下に説明する実施の形態は、本発明を限定するものではない。

本発明のリガンド固定化用基材は、水不溶性担体の少なくとも表面に下記一般式（１）で表される共重合体が結合していることを特徴とする。

ここで、一般式（１）中、ｎ及びｍは正の整数を示し、ｍ／（ｎ＋ｍ）の値は０．１以上０．４５以下である。また、一般式（１）中、Ｒ^１はＨ又はＣＨ_３、Ｒ^２は求電子官能基を有する有機基、Ｒ^３は

を示す。
一般式（１）で表される共重合体は、繰り返し数がｍの繰り返し単位と、繰り返し数がｎの繰り返し単位とのランダム共重合体、交互共重合体、周期的共重合体、ブロック共重合体のいずれであってもよい。

一般式（１）で表される共重合体は、式（２）で表されるＮ−メタクリロイルオキシエチル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウム−α−Ｎ−メチルカルボキシベタイン（ＣＭＢ）と、一般式（３）で表される求電子官能基を有する重合性モノマーとを共重合させることによって得ることができる。

一般式（３）中、Ｒ^１はＨ又はＣＨ_３、Ｒ^２は求電子官能基を有する有機基を示す。
なお、上記共重合体は、式（２）で表される化合物と一般式（３）で表される化合物との、ランダム共重合体、交互共重合体、周期的共重合体、ブロック共重合体のいずれであってもよい。

また、一般式（１）で、繰り返し数がｍの繰り返し単位はＣＭＢ由来の残基（以下、ベタイン基という）であり、繰り返し数がｎの繰り返し単位は求電子官能基を有する重合性モノマー由来の残基である。

式（２）で表されるＣＭＢは、例えば、特開平９−９５４７４号公報、特開平９−９５５８６号公報、特開平１１−２２２４７０号公報などに記載されている方法により、容易に高純度で調製することができる。

本明細書において、「求電子官能基」とは求電子的に反応する官能基を意味し、一般式（３）で表される求電子官能基を有する重合性モノマーの具体例としては、エポキシ基、イソシアネート基若しくはアルデヒド基等を分子内（一般式（１）及び一般式（３）中、Ｒ^２）に有する重合性モノマーが挙げられる。

上記のエポキシ基を分子内に有する重合性モノマーとしては、特に限定されないが、グリシジルアクリレート、グリシジルメタクリレート、グリシジルアクリルアミド、アリルグリシジルエーテル、メタクリルグリシジルエーテル、グリシジルソルベート、グリシジルメタイタコナート、エチルグリシジルマレアート、グリシジルビニルスルホナート等を例示でき、イソシアネート基を分子内に有する重合性モノマーとしては、アクリロイルオキシエチルイソシアネート、アクリロイルオキシメチルイソシアネート、アクリロイルイソシアネート、メタクリロイルイソシアネート、メタクリロイルエチルイソシアネート等を例示でき、さらに、アルデヒド基を分子内に有する重合性モノマーとしては、シンナムアルデヒド、クロトンアルデヒド、アクロレイン、メタクロレイン等を例示できるが、この中でも入手の容易さ、コスト、取り扱いの容易さから、エポキシ基を分子内に有する重合性モノマーが好ましく、その中でも特にグリシジルメタクリレートが好ましい。

水不溶性担体の少なくとも表面に共重合体がどのような様式で結合しているかは特に限定されず、共有結合、イオン結合、物理吸着等のいずれの結合様式であっても良い。結合方法としては、グラフト法、不溶化沈殿法等、あらゆる公知の方法を用いることができる。したがって、高分子化合物やそのモノマーを放射線あるいはプラズマ等を用いてグラフト重合する、共有結合するなどの公知の方法により表面改質を施す方法（特開平１−２４９０６３号公報、特開平３−５０２０９４号公報）は本発明に好適に用いられる。

放射線照射グラフト重合法を用いる場合、種々の公知の方法を利用することができる。例えば、担体上に活性点を導入するための電離性放射線は、α線、β線、γ線、加速電子線、Ｘ線、紫外線などが挙げられるが、実用的には加速電子線又はγ線が好ましい。加速電子線又はγ線の照射量は担体の性質、重合性モノマーの性質、固定化量などにより任意に変えることができるが、１０ｋＧｙから２００ｋＧｙが好ましい。本発明に従って、担体と重合性モノマーをグラフト重合させる方法としては、担体と重合性モノマーの共存下で放射線を照射する同時照射法と、担体のみに予め放射線を照射した後、重合性モノマーと担体とを接触させる前照射法のいずれも使用可能であるが、前照射法が、グラフト重合以外の副反応を生成しにくいため好ましい。重合性モノマー濃度は通常１質量％以上２０質量％以下、反応温度は５℃以上４０℃以下の範囲で、重合性モノマーと担体との反応を行うことができるが、この範囲に限定されるものではなく、適宜設定してよい。重合性モノマーと担体との反応の際の溶媒は、無溶媒若しくは水、メタノール、エタノール、その他アルコール、アセトン等の溶媒又はそれらの混合溶媒で、重合性モノマーが溶解、分散するものであれば用いることができる。また、放射線照射グラフト重合法を用いる場合、担体への共重合体のグラフト率（Ｇ）は５％以上３００％以下が好ましく、２０％以上２００％以下がさらに好ましく、５０％以上１５０％以下が特に好ましい。グラフト率が５％未満であると、担体表面のグラフト鎖による被覆が不十分となりやすく、担体表面の改質が不十分となるおそれや、リガンドの固定化量が不十分となるおそれがある。またグラフト率が３００％を超えると、担体自体の物理特性が失われるおそれがあり、吸着材の設計上好ましくない。

なお、ここにいうグラフト率（Ｇ）は、下記式（４）で表される値である。
Ｇ（％）＝［（グラフト後担体重量−グラフト前担体重量）／（グラフト前担体重量）］×１００（４）

重合反応後は、過剰のモノマーや連鎖移動反応によって生成したグラフトされていないポリマーを適当な溶剤にて十分洗浄除去すればよい。

本発明の共重合体におけるＮ−メタクリロイルオキシエチル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウム−α−Ｎ−メチルカルボキシベタイン（ＣＭＢ）のモル組成比は、０．１以上０．４５以下であることが好ましい。ベタイン基のモル組成比が０．１未満であると、生体適合性の性質が発揮されなくなる。またベタイン基のモル組成比が０．４５を超えると、生体適合性の性質は十分に発揮されるが、必然的に求電子官能基の含有量が低くなり、リガンドの固定化が十分に行われないため好ましくない。前記共重合体を形成する反応時の各重合性モノマーの混合量は、選択する溶媒等に依存するので、適宜選択すればよい。

共重合体による水不溶性担体表面の被覆率は２７％以上が好ましく、より好ましくは２７％以上７５％以下である。担体表面の被覆率が２７％未満であると、担体の表面性質が残存しやすい傾向にあり、非特異的吸着が増加するおそれや、リガンドの固定化が十分に行われないおそれがある。

本発明に用いる不溶性担体を形成する素材としては、天然高分子、合成高分子、再生高分子等の有機高分子化合物、ガラスや金属に代表される無機化合物、さらに有機／無機ハイブリッド化合物などが挙げられるが特に限定されない。

加工性の面からは、有機高分子素材が特に好ましく、例えばポリアルキレンテレフタレート類、ポリカーボネート類、ポリウレタン類、ポリ（メタ）アクリル酸エステル類、ポリアクリロニトリル、ポリビニルアルコール、エチレン／ビニルアルコール共重合体（エバール）、エチレン／ビニルアセテート共重合体、ポリビニルアセタール、ポリスチレン、ポリスルホン類、セルロース及びセルロース誘導体類、ポリフェニレンエーテル類、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフッ化ビニル、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン等、及びこれらを構成するモノマーの共重合体、更には上記高分子の１種又は２種以上のアロイ、ブレンド等が挙げられる。

水不溶性担体としては、医療用吸着材の担体として周知のもの全てを使用できるが、多孔膜や粒子が好ましく、多孔質粒子、不織布、中空糸膜が体外循環時の体液の流通性より最も好ましく、細胞吸着を目的とする場合は不織布又は粒子が好ましい。

多孔膜としては、これらの素材から得られる繊維状物（中実繊維や中空繊維）を用いて製造される不織布、織布、編布、メッシュ等が挙げられる。また、有機高分子素材や無機高分子素材を熱溶融した状態、溶媒によって溶解した溶液状態、可塑剤を用いて可塑化した状態等から、発泡法、相分離法（熱誘起相分離法や湿式相分離法）、延伸法、焼結法等によって得ることができるシート状膜（平膜）や空糸膜も使用できる。

多孔膜においては、連通孔を有し、連通孔の少なくとも表面部分に存在するアフィニティーリガンドとの接触によって目的成分が吸着されるのであればどのような構造であっても構わず特に限定されない。連通孔とは、支持多孔膜の一方の膜面から反対側の膜面にかけて連通した孔のことであって、その連通孔を通して液体が通過するとこができるのであれば、その孔の膜表面の形状や膜内部の構造はどのようなものであってもよい。

特に、目的吸着成分が細胞である場合に好ましいものとしては、細胞浮遊液の透過性、及び細胞捕捉性の観点から、各種繊維状物から製造される不織布、織布、編布、メッシュ等が挙げられ、特に不織布は好ましく用いられる多孔膜である。不織布形状の場合、その平均繊維径（平均繊維直径）は０．１μｍ〜５０μｍが好ましい。さらに平均繊維径は０．５μｍ〜４０μｍであることが好ましく、１μｍ〜３０μｍであることがより好ましく、１μｍ〜２０μｍであることが特に好ましく、２μｍ〜１０μｍであることが最も好ましい。平均繊維径が０．１μｍ未満であると、リガンド固定化用基材や細胞選択吸着材の機械的強度が低下しやすい。また５０μｍを超えると細胞選択吸着材とした場合の吸着表面積が小さくなり細胞捕捉性が低下しやすい。

本発明に用いる粒子は目的吸着成分によって、無孔質、多孔質、また多孔質においてはその孔径を選択すればよい。平均粒径は、２５μｍ以上２５００μｍ以下のものを利用できるが、その比表面積（吸着材としての吸着能力）と体液の流通性を考慮すると、５０μｍ以上１５００μｍ以下のものが好ましい。

図１は、一実施形態に係るリガンド固定化用基材の模式断面図である。リガンド固定化用基材１００は、水不溶性担体１と、水不溶性担体１の少なくとも表面に結合した上記一般式（１）で表される共重合体２と、を備える。共重合体２は、結合部分１０で水不溶性担体１と結合し、リガンド固定化用基材１００の表面にＲ^３基２０及びＲ^２基３０を有している。ここでＲ^３基２０及びＲ^２基３０は、上記一般式（１）中のＲ^３基及びＲ^２基と同義である。すなわち、Ｒ^３基２０は、

を示し、Ｒ^２基３０は求電子官能基を示す。なお、結合部分１０は、主に共重合体２の主鎖に相当する部分である。

本発明の吸着材において、リガンド固定化用基材に固定化されるリガンドは、特定の血液成分に対して選択的アフィニティーを有するアフィニティーリガンドとすることができる。アフィニティーリガンドは、求電子官能基と化学結合するものであれば特に制限されないが、分子量が５００Ｄａ以下程度の低分子化合物、蛋白質、また優れた吸着能を発現させるのであれば、ターゲット成分に極めて高いアフィニティーを有する抗体やキメラ抗体、抗体が有する重鎖又は軽鎖の可変領域の相補性決定領域を形成しうるアミノ酸配列を有するＦ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びその他ペプチド又はその修飾ペプチド型のリガンドの使用が好ましい。

図２は、一実施形態に係る吸着材の模式断面図である。吸着材１１０は、リガンド固定化用基材１００のＲ^２基３０と、リガンド４０とが化学結合してなるものである。リガンド４０としては上述したものを用いることができる。

本発明の血液処理器は、内部に血液を導入するための入口と、内部の血液を外部に排出するための出口とを備えた容器の内部に、上記吸着材が充填されたものである。上記吸着材が選択的にターゲット成分を吸着することができるため、例えば、血液から特定の成分を除去する目的に好ましく利用することができる。具体的には、直接血液灌流用の血液成分吸着器や特異的細胞吸着器等が挙げられる。

図３は、一実施形態に係る血液処理器の模式断面図である。血液処理器２００は、容器５０と、容器５０の内部に充填された複数の吸着材１１０とを有する。容器５０の両端部には、ヘッダーキャップ６０ａ、６０ｂが設けられている。ヘッダーキャップ６０ａは内部に血液を導入するための入口（導入口）となり、ヘッダーキャップ６０ｂは血液を外部に排出するための出口（導出口）となる。ヘッダーキャップ６０ａの導入口より矢印Ｆの方向から血液処理器２００の内部に流入した血液が、吸着材１１０と接することにより、リガンド４０と相互作用する血液中の成分が吸着する。これにより、ヘッダーキャップ６０ｂの導出口から流出した際には血液中から上記成分が除去されている。

本発明に係る水不溶性担体の少なくとも表面に上記一般式（１）で表される共重合体が結合してなる基材は、血液から特定成分（リガンドと特異的に結合する成分）を除去するための吸着材又は血液処理器に用いられるリガンドを固定化するために使用することができる。

以下、実施例により、本発明の構成及び効果を具体的に述べるが、いずれも本発明を限定するものではない。

［実施例１］
（Ａ）方法
（１）γ線照射
担体としてポリプロピレンからなる不織布（平均繊維径３．８μｍ目付８０ｇ／ｍ^２）０．１０８ｍ^２を脱酸素剤とともに酸素低透過性袋に封入し十分に酸素を除いた後、−７８℃にて２５ｋＧｙのγ線を照射した。
（２）グラフト反応
Ｎ−メタクリロイルオキシエチル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウム−α−Ｎ−メチルカルボキシベタイン１０．８ｇ、及びグリシジルメタクリレート（ＧＭＡ）２６．３ｍＬを５００ｍＬのメタノールに溶解し、４０℃にて６０分間窒素を通気した。
耐圧ガラス容器に上記の不織布をすばやく入れ、減圧後、上記の溶液を引き込み４０℃にて１時間反応させた。反応後、取り出した不織布をジメチルホルムアミド及びメタノールにより洗浄し、４０℃にて真空乾燥することでリガンド固定化用不織布（リガンド固定化用基材）を得た。
（３）細胞吸着フィルター（吸着材）の作製
上記で得られたリガンド固定化用不織布を直径０．６８ｃｍの円形に切断した（以下、「円形不織布状基材」という。）。次に、抗ヒトＣＤ４モノクローナル抗体（１６μｇ）及び硫酸アンモニウム（２６ｍｇ）を溶解したカルシウム及びマグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩液（以下、「ＰＢＳ（−）」という。）４００μＬに、得られた円形不織布状基材４枚を３７℃にて１６時間浸し、該モノクローナル抗体を円形不織布状基材に固定した。その後、このモノクローナル抗体を固定化した円形不織布状基材（以下、「抗体固定化円形不織布」という。）をＰＢＳ（−）２ｍｌで洗浄した。次に、０．２％ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート／ＰＢＳ（−）溶液（以下、「Ｔｗｅｅｎ２０溶液」という。）に該抗体固定化円形不織布を常温で２．５時間浸し、ブロッキングを行った。その後、該抗体固定化円形不織布をＰＢＳ（−）２ｍｌで洗浄することで、細胞吸着フィルターを作製した。
（４）細胞吸着フィルターの洗浄
２％ドデシル硫酸ナトリウム／ＰＢＳ（−）（以下、「ＳＤＳ溶液」という。）により細胞吸着フィルター４枚を９５℃で１０分間浸した。これを３回繰り返した後、該細胞吸着フィルターをＰＢＳ（−）２ｍｌで洗浄した。
（５）細胞吸着器（血液処理器）の作製
入口と出口を有する容量１ｍｌの容器に、上記で得られた細胞吸着フィルター４枚と充填液としてＰＢＳ（−）溶液とを充填し、細胞吸着器を作成した。
（６）細胞吸着器の細胞吸着性
上記で得られた細胞吸着器の入口から、ＡＣＤ−Ａ添加ヒト新鮮血液８ｍｌ（血液：ＡＣＤ−Ａ＝８：１）をシリンジポンプにて流速０．２ｍｌ／分で送液した。細胞吸着器の出口から回収される細胞吸着後溶液のうち、前半４ｍＬ分をフラクション１（以下、「Ｆ１」という。）、後半４ｍＬ分をフラクション２（以下、「Ｆ２」という。）となるよう分取した。その後、細胞吸着器の出口から細胞吸着後の溶液を回収した。

（Ｂ）結果
（１）Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）による表面解析
上記で得られたリガンド固定化用不織布の表面をＸ線光電子分光法（ＸＰＳＥＳＣＡ）により解析した。ＸＰＳより得られる炭素、酸素、窒素の各相対元素濃度をそれぞれＣ_１、Ｃ_２、Ｃ_３とすると、基材表面に存在するＣＭＢ相対モル濃度（Ｘ）、ＧＭＡ相対モル濃度（Ｙ）、担体構成ポリマー相対モル濃度（Ｚ）はそれぞれ下記式（５）から（７）で表される。
Ｘ＝ｘ／（ｘ＋ｙ＋ｚ）（５）
Ｙ＝ｙ／（ｘ＋ｙ＋ｚ）（６）
Ｚ＝ｚ／（ｘ＋ｙ＋ｚ）（７）
ただし、ｘ＝Ｃ_３、ｙ＝（Ｃ_２−４ｘ）／３、ｚ＝｛Ｃ_１−（１０ｘ＋７ｙ）｝／Ａであって、Ａは担体構成ポリマーの単位炭素組成であり、例えば、ポリエチレンの場合Ａ＝２、ポリプロピレンの場合Ａ＝３である。
上記で得られる相対モル濃度より共重合ポリマー中のＣＭＢのモル組成比Ｒは次式（８）で表される。
Ｒ＝ｍ／（ｎ＋ｍ）＝Ｘ／（Ｘ＋Ｙ）（８）
また、ＣＭＢポリマーの単位分子量Ｍ_Ｘ、ＧＭＡポリマー単位分子量Ｍ_Ｙ、担体構成ポリマー単位分子量Ｍ_Ｚとすると、被覆率Ｓ（％）は下記式（９）で表される。
Ｓ＝１００｛１−ＺＭ_Ｚ／（ＸＭ_Ｘ＋ＹＭ_Ｙ＋ＺＭ_Ｚ）｝（９）
これらの計算式に基づき、ＣＭＢモル組成比Ｒ及び被覆率Ｓを算出した結果、ＣＭＢのモル組成比Ｒは０．１、被覆率Ｓは７５％であった。
（２）比表面積測定
上記で得られたリガンド固定化用不織布の比表面積は自動比表面積／細孔分布測定装置（ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製ＭＩＣＲＩＭＥＲＩＴＩＣＳＴＲＩＳＴＡＲ３０００）を用いてＢＥＴ法による多点法比表面積を測定した。その結果、比表面積は０．６０ｍ^２／ｇであった。
（３）抗体固定化量の定量
上記で得られた細胞吸着フィルターにおける抗ヒトＣＤ４モノクローナル抗体の固定化量はＢＣＡタンパク質定量試薬（ＰＩＥＲＣＥ社製ＭｉｃｒｏＢＣＡ（登録商標）ＰｒｏｔｅｉｎＡｓｓａｙＲｅａｇｅｎｔＫｉｔ２３２３５）を用い、マイクロプレート分光光度計（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ社製ＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ３４０ＰＣ、解析ソフトＳＯＦＴｍａｘＰＲＯ）によって吸光度測定を行い、定量した。その結果、洗浄前の細胞吸着フィルター（４枚）には１０．０ｍｇ、ＳＤＳ洗浄後の細胞吸着フィルターには８．０ｍｇの抗体が固定化されていた。
（４）ＣＤ４陽性細胞及び血小板の吸着率
フローサイトメーター（ＢＥＣＴＯＮＤＩＣＫＩＮＳＯＮ社製ＦＡＣＳＣＡＬＩＢＵＲ）を用いたフローサイトメトリー法によって、細胞吸着前のＡＣＤ−Ａ添加ヒト新鮮血液及び細胞吸着後の溶液（Ｆ１及びＦ２）中のＣＤ４陽性細胞数を測定し、細胞吸着器への細胞の吸着率を計算した。その結果、ＣＤ４陽性細胞の吸着率は９３．２％（Ｆ１）及び６０．１％（Ｆ２）であった。また血小板の吸着率は３５．６％（８ｍＬ平均）であった。

［実施例２］
実施例１と同様の方法でＮ−メタクリロイルオキシエチル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウム−α−Ｎ−メチルカルボキシベタイン２１．５ｇ、及びグリシジルメタクリレート２６．３ｍＬを５００ｍＬのメタノールに溶解したものを反応液としグラフト反応を行い、リガンド固定化用不織布を得た。ＸＰＳによる表面解析の結果、ＣＭＢのモル組成比Ｒは０．２６、被覆率Ｓは５４％であった。また比表面積を測定したところ０．５０ｍ^２／ｇであった。該不織布から細胞吸着フィルターを作成し、その抗体固定化量を測定した結果、洗浄前の細胞吸着フィルターには１１．６ｍｇ、ＳＤＳ洗浄後の細胞吸着フィルターには８．４ｍｇの抗体が固定化されていた。該細胞吸着フィルターから細胞吸着器を作成し、細胞の吸着率を測定した結果、ＣＤ４陽性細胞の吸着率は９９．７％（Ｆ１）及び８９．０％（Ｆ２）であった。また血小板の吸着率は２１．４％（８ｍＬ平均）であった。

［実施例３］
実施例１と同様の方法でＮ−メタクリロイルオキシエチル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウム−α−Ｎ−メチルカルボキシベタイン４３．１ｇ、及びグリシジルメタクリレート２６．３ｍＬを５００ｍＬのメタノールに溶解したものを反応液としグラフト反応を行い、リガンド固定化用不織布を得た。ＸＰＳによる表面解析の結果、ＣＭＢのモル組成比Ｒは０．３２、被覆率Ｓは５４％であった。また比表面積を測定したところ０．５１ｍ^２／ｇであった。該不織布から細胞吸着フィルターを作成し、その抗体固定化量を測定した結果、洗浄前の細胞吸着フィルターには９．６ｍｇ、ＳＤＳ洗浄後の細胞吸着フィルターには８．８ｍｇの抗体が固定化されていた。該細胞吸着フィルターから細胞吸着器を作成し、細胞の吸着率を測定した結果、ＣＤ４陽性細胞の吸着率は９５．１％（Ｆ１）及び８６．０％（Ｆ２）であった。また血小板の吸着率は１２．４％（８ｍＬ平均）であった。

［実施例４］
実施例１と同様の方法でＮ−メタクリロイルオキシエチル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウム−α−Ｎ−メチルカルボキシベタイン６８．９ｇ、及びグリシジルメタクリレート２１．１ｍＬを４００ｍＬのメタノールに溶解したものを反応液としグラフト反応を行い、リガンド固定化用不織布を得た。ＸＰＳによる表面解析の結果、ＣＭＢのモル組成比Ｒは０．４５、被覆率Ｓは５５％であった。また比表面積を測定したところ０．３７ｍ^２／ｇであった。該不織布から細胞吸着フィルターを作成し、その抗体固定化量を測定した結果、洗浄前の細胞吸着フィルターには９．２ｍｇ、ＳＤＳ洗浄後の細胞吸着フィルターには７．８ｍｇの抗体が固定化されていた。該細胞吸着フィルターから細胞吸着器を作成し、細胞の吸着率を測定した結果、ＣＤ４陽性細胞の吸着率は９２．５％（Ｆ１）及び５２．４％（Ｆ２）であった。また血小板の吸着率は４．６％（８ｍＬ平均）であった。

［実施例５］
ポリエチレンからなる平均粒径３２０μｍの粒子を脱酸素剤とともに酸素低透過性袋に封入し十分に酸素を除いた後、−７８℃にて２５ｋＧｙのγ線を照射した。
実施例１と同様の方法でＮ−メタクリロイルオキシエチル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウム−α−Ｎ−メチルカルボキシベタイン２１．５ｇ、及びグリシジルメタクリレート２６．３ｍＬを５００ｍＬのメタノールに溶解したものを反応液としグラフト反応を行い、リガンド固定化用粒子（リガンド固定化用基材）を得た。ＸＰＳによる表面解析の結果、ＣＭＢのモル組成比Ｒは０．２５、被覆率Ｓは４４％であった。また比表面積を測定したところ、０．０２７ｍ^２／ｇであった。該リガンド固定化用粒子３６０μＬから細胞吸着フィルターを作成し、その抗体固定化量を測定した結果、洗浄前の細胞吸着フィルターには１５．２ｍｇ、ＳＤＳ洗浄後の細胞吸着フィルターには１０．１ｍｇの抗体が固定化されていた。また該細胞吸着フィルターから細胞吸着器を作成し、細胞の吸着率を測定した結果、ＣＤ４陽性細胞の吸着率は８４．８％（Ｆ１）及び７３．５％（Ｆ２）であった。また血小板の吸着率は２．０％（８ｍＬ平均）であった。

［実施例６］
実施例１と同様の方法でＮ−メタクリロイルオキシエチル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウム−α−Ｎ−メチルカルボキシベタイン１０．８ｇ、及びグリシジルメタクリレート１３．２ｍＬを５００ｍＬのメタノールに溶解したものを反応液としグラフト反応を行い、リガンド固定化用不織布を得た。ＸＰＳによる表面解析の結果、ＣＭＢのモル組成比Ｒは０．２７、被覆率Ｓは２７％であった。また比表面積を測定したところ０．５６ｍ^２／ｇであった。該不織布から細胞吸着フィルターを作成し、その抗体固定化量を測定した結果、洗浄前の細胞吸着フィルターには１１．０ｍｇ、ＳＤＳ洗浄後の細胞吸着フィルターには８．２ｍｇの抗体が固定化されていた。該細胞吸着フィルターから細胞吸着器を作成し、細胞の吸着率を測定した結果、ＣＤ４陽性細胞の吸着率は９９．３％（Ｆ１）及び８７．１％（Ｆ２）であった。また血小板の吸着率は２１．０％（８ｍＬ平均）であった。

［比較例１］
実施例１と同様の方法でグリシジルメタクリレート２６．３ｍＬを５００ｍＬのメタノールに溶解したものを反応液としグラフト反応を行い、リガンド固定化用不織布を得た。ＸＰＳによる表面解析の結果、ＣＭＢのモル組成比Ｒは０、被覆率Ｓは６４％であった。また比表面積を測定したところ０．５１ｍ^２／ｇであった。該不織布から細胞吸着フィルターを作成し、その抗体固定化量を測定した結果、洗浄前の細胞吸着フィルターには１０．６ｍｇ、ＳＤＳ洗浄後の細胞吸着フィルターには７．５ｍｇの抗体が固定化されていた。該細胞吸着フィルターから細胞吸着器を作成し、細胞の吸着率を測定した結果、ＣＤ４陽性細胞の吸着率は９１．９％（Ｆ１）及び３４．４％（Ｆ２）であった。また血小板の吸着率は８１．２％（８ｍＬ平均）であった。

［比較例２］
実施例１と同様の方法でＮ−メタクリロイルオキシエチル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウム−α−Ｎ−メチルカルボキシベタイン１０３．３ｇ、及びグリシジルメタクリレート１５．８ｍＬを３５０ｍＬのメタノールに溶解したものを反応液としグラフト反応を行い、リガンド固定化用不織布を得た。ＸＰＳによる表面解析の結果、ＣＭＢのモル組成比Ｒは０．５６、被覆率Ｓは５６％であった。また比表面積を測定したところ０．３６ｍ^２／ｇであった。該不織布から細胞吸着フィルターを作成し、その抗体固定化量を測定した結果、洗浄前の細胞吸着フィルターには０．５ｍｇ、ＳＤＳ洗浄後の細胞吸着フィルターには０．１ｍｇの抗体が固定化されていた。該細胞吸着フィルターから細胞吸着器を作成し、細胞の吸着率を測定した結果、ＣＤ４陽性細胞の吸着率は２３．２％（Ｆ１）及び０．２％（Ｆ２）であった。また血小板の吸着率は５．９％（８ｍＬ平均）であった。

以上の結果を表１及び表２にまとめた。

１…水不溶性担体、２…共重合体、１０…結合部分、２０…Ｒ^３基、３０…Ｒ^２基（求電子官能基）、４０…リガンド、５０…容器、６０ａ、６０ｂ…ヘッダーキャップ、Ｆ…血液の流れ方向、１００…リガンド固定化用基材、１１０…吸着材、２００…血液処理器。

Claims

水不溶性担体の少なくとも表面に下記一般式（１）で表される共重合体が結合してなる、リガンド固定化用基材。

［一般式（１）中、ｎ及びｍは正の整数を示し、ｍ／（ｎ＋ｍ）の値は０．１以上０．４５以下である。また、式（１）中、Ｒ^１はＨ又はＣＨ_３、Ｒ^２は求電子官能基を有する有機基、Ｒ^３は

を示す。］
水不溶性担体の少なくとも表面に、下記式（２）で表されるＮ−メタクリロイルオキシエチル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウム−α−Ｎ−メチルカルボキシベタインと下記一般式（３）で表される重合性モノマーとの共重合体が結合しており、該共重合体における前記Ｎ−メタクリロイルオキシエチル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウム−α−Ｎ−メチルカルボキシベタインのモル組成比が０．１以上０．４５以下である、リガンド固定化用基材。

［一般式（３）中、Ｒ^１はＨ又はＣＨ_３、Ｒ^２は求電子官能基を有する有機基を示す。］
前記共重合体がエポキシ基を含む、請求項１又は２に記載のリガンド固定化用基材。
前記共重合体による前記水不溶性担体表面の被覆率が２７％以上である、請求項１から３のいずれか一項に記載のリガンド固定化用基材。
前記水不溶性担体が多孔膜又は粒子である、請求項１から４のいずれか一項に記載のリガンド固定化用基材。
リガンド固定化用基材を製造するための下記一般式（１）で表される共重合体の使用。

［一般式（１）中、ｎ及びｍは正の整数を示し、ｍ／（ｎ＋ｍ）の値は０．１以上０．４５以下である。また、一般式（１）中、Ｒ^１はＨ又はＣＨ_３、Ｒ^２は求電子官能基を有する有機基、Ｒ^３は

を示す。］
前記共重合体がエポキシ基を含む、請求項６に記載の共重合体の使用。
（ｉ）水不溶性担体に放射線を照射する工程と、
（ｉｉ）下記式（２）で表されるＮ−メタクリロイルオキシエチル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウム−α−Ｎ−メチルカルボキシベタインと下記一般式（３）で表される重合性モノマーとを含む溶液に、工程（ｉ）で得られた水不溶性担体を浸漬してグラフト重合させる工程と、
を含むことを特徴とするリガンド固定化用基材の製造方法。

［一般式（３）中、Ｒ^１はＨ又はＣＨ_３、Ｒ^２は求電子官能基を有する有機基を示す。］
前記重合性モノマーが、エポキシ基を有する、請求項８に記載のリガンド固定化用基材の製造方法。
前記水不溶性担体が多孔膜又は粒子である、請求項８又は９に記載のリガンド固定化用基材の製造方法。
請求項１から５のいずれか一項に記載されたリガンド固定化用基材に、抗体、蛋白質、ペプチド及び低分子化合物からなる群より選択されるリガンドが結合した吸着材。
内部に血液を導入するための入口と、該血液を外部に排出するための出口と、を備えた容器の内部に、請求項１１に記載の吸着材が充填された血液処理器。