WO2019073992A1 - 抗体修飾フィルター - Google Patents

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WO2019073992A1
WO2019073992A1 PCT/JP2018/037667 JP2018037667W WO2019073992A1 WO 2019073992 A1 WO2019073992 A1 WO 2019073992A1 JP 2018037667 W JP2018037667 W JP 2018037667W WO 2019073992 A1 WO2019073992 A1 WO 2019073992A1
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WO
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assembly
antibody
compound
substrate
forming polymer
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PCT/JP2018/037667
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English (en)
French (fr)
Inventor
木村　俊作
浩樹 福冨
安武　幹智
Original Assignee
国立大学法人京都大学
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61M—DEVICES FOR INTRODUCING MEDIA INTO, OR ONTO, THE BODY; DEVICES FOR TRANSDUCING BODY MEDIA OR FOR TAKING MEDIA FROM THE BODY; DEVICES FOR PRODUCING OR ENDING SLEEP OR STUPOR
    • A61M1/00—Suction or pumping devices for medical purposes; Devices for carrying-off, for treatment of, or for carrying-over, body-liquids; Drainage systems
    • A61M1/36—Other treatment of blood in a by-pass of the natural circulatory system, e.g. temperature adaptation, irradiation ; Extra-corporeal blood circuits
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/22—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising organic material
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
    • C07K17/02—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier
    • C07K17/08—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/26—Inoculator or sampler

Definitions

  • the present invention relates to an antibody modified filter, its material and the like.
  • apheresis is active in the medical field.
  • Apheresis is a treatment that removes certain cells and proteins that cause disease during the process of circulating the patient's blood extracorporeally.
  • a non-woven filter for apheresis can be highly selective by using an antibody, but in the existing antibody-immobilized non-woven fabric, the variable region which is the antigen binding site of the antibody is directed from the non-woven fiber surface outward. It is difficult to efficiently remove target cells and proteins since immobilization with orientation is not possible. Furthermore, nonspecific adsorption of cells and proteins to fiber surfaces (usually hydrophobic) can not be completely suppressed.
  • Patent Document 1 discloses a technology using an assembly formed by forming two types of polymer units into stereo complexes. According to this technique, the surface can be modified with various molecules. However, it has not been clarified how to obtain an antibody-modified filter that can be efficiently modified with an antibody and that can specifically adsorb or remove a target substance.
  • An object of the present invention is to provide an antibody modified filter capable of specifically adsorbing or removing an object, and a material used for the filter.
  • a substrate binding polymer having a reaction unit and an assembly forming polymer unit 1 and a surface forming polymer having a boronyl group containing unit and an assembly forming polymer unit 2 It has been found that the above problem can be solved by using an assembly including. More specifically, it has been found that a target can be specifically adsorbed or removed by using a substrate in which antibodies are immobilized on the assembly and the surface of which is modified as a filter.
  • the present invention includes the following aspects: Item 1. An assembly comprising a substrate binding polymer having a reaction unit and an assembly forming polymer unit 1 and a surface forming polymer having a boronyl group containing unit and an assembly forming polymer unit 2.
  • Item 2 The assembly according to Item 1, wherein the assembly-forming polymer unit 1 and the assembly-forming polymer unit 2 together form a stereocomplex.
  • Item 3. The assembly according to item 1 or 2, which is in the form of a sheet.
  • Item 4. A surface-modified substrate, wherein the assembly according to any one of Items 1 to 3 is bonded to the surface of the substrate.
  • Item 5 The surface modified substrate according to Item 4, wherein the substrate is a fibrous material.
  • Item 6. The surface-modified substrate according to Item 4 or 5, wherein the hydrophobic substrate is polypropylene.
  • Item 7. An antibody-bound surface-modified substrate, wherein the surface-modified substrate according to any one of items 4 to 6 is bound to an antibody.
  • Item 8 The antibody-bound surface-modified substrate according to Item 7, wherein the antibody is an anti-regulatory T cell antibody.
  • Item 9. An antibody-modified filter, comprising the antibody-bound surface-modified substrate according to item 7 or 8.
  • Item 10 The antibody modified filter according to item 9, which is for regulatory T cell adsorption.
  • Item 11 A method for producing an assembly, comprising the steps of mixing a substrate binding polymer having a reaction unit and an assembly forming polymer unit 1, and a surface forming polymer having a boronyl group-containing unit and an assembly forming polymer unit 2.
  • a surface modification comprising the steps of mixing a substrate-bound polymer having a reaction unit and an assembly-forming polymer unit 1, a surface-forming polymer having a boronyl group-containing unit and an assembly-forming polymer unit 2, and a substrate and irradiating light.
  • a controllable T-cell removing device comprising: a blood pump; a column provided with the antibody modified filter according to item 10; and a flow path connecting the blood pump and the column.
  • an assembly capable of efficiently immobilizing an antibody, a surface-modified substrate comprising the assembly bound to the surface, an antibody-binding surface comprising the surface-modified substrate and an antibody bound to each other Modified substrates can be provided.
  • an antibody-bound surface-modified substrate as a filter, an antibody-modified filter capable of specifically adsorbing or removing an object can be provided.
  • the transmission electron microscope (TEM) image of the molecular assembly (test example 1.1) which compound FS / compound DS forms is shown.
  • the transmission electron microscope (TEM) image of the molecular assembly (Test example 1.1) which compound FS / compound GS / compound DS forms is shown.
  • the case where milliQ water is used as the dispersion solvent at the time of preparation of the dispersion assembly is shown in (a)
  • the case where a 5% ethanol aqueous solution is used is shown in (b)
  • the case where 10% ethanol is used is shown in (c) .
  • the fluorescence-microscope image of a sheet-like aggregate light-immobilized PP non-woven fabric (Test Example 1.2) is shown.
  • the figure on the left side is a schematic view of the cross-sectional structure (cross-sectional structure in the direction perpendicular to the main surface) of the sheet-like assembly in water.
  • the figure on the left is a schematic view showing how the structure of the sheet-like assembly collapses in DMF.
  • the lowermost bar indicates a substrate, and connected to the bar is a substrate binding polymer, which is in contact with the helical structure (aggregate forming polymer unit 1) of the substrate binding polymer Shows a surface forming polymer (a helical structure is an assembly forming polymer unit 2).
  • FIG. 7 is a graph showing the results of Test Example 3;
  • the vertical axis indicates the coverage of the sheet-like aggregate, and the horizontal axis indicates the number of times of light fixation of the sheet-like aggregate.
  • Each column is color-coded according to the difference in dispersion solvent at the time of producing the sheet-like assembly.
  • It is an atomic force microscope (AFM) image of the polypropylene (PP) nonwoven fabric observed by Experiment 2.
  • FIG. The left side shows the PP fiber surface in the case of the sheet-like aggregate unmodified, and the right side shows the PP fiber surface on which the sheet-like aggregate is light-fixed.
  • the numerical value is the root mean square roughness (Rq) calculated for the cross section of the straight portion.
  • FIG. a, d, g in the case of unmodified sheet-like assembly, b, e, h; when the sheet-like assembly is light-fixed once, c, f, I; light-immobilize the sheet-like assembly three times if you did this Molecular assembly formed by Compound MS / Compound DS (Test Example 3.1), Molecular assembly formed by Compound BS / Compound DS (Test Example 3.1), and Molecular assembly formed by Compound GS / Compound DS (Test Example 3.1) 6 shows a transmission electron microscope (TEM) image of.
  • TEM transmission electron microscope
  • the amount of antibodies in the antibody-immobilized PP non-woven fabric is shown (Test Example 3.3).
  • the vertical axis shows the amount of antibody, and the horizontal axis shows the number of times of light immobilization of the sheet-like assembly. Each column is color-coded according to the type of assembly-forming polymer unit used.
  • the removal performance of Treg or CD3 + T cells by the column containing the antibody immobilized PP non-woven fabric is shown (Test Example 4).
  • the vertical axis indicates the removal rate, and the horizontal axis indicates the type of assembly forming polymer unit used.
  • the removal performance of Treg or CD3 + T cells by the column containing the antibody immobilized PP non-woven fabric is shown (Test Example 4).
  • the vertical axis shows the removal rate, and the horizontal axis shows the number of antibody-immobilized PP non-woven fabrics in the column.
  • SEM scanning electron microscope
  • a substrate binding polymer having a reaction unit (B) and an assembly forming polymer unit 1 (S A 1 ), and a boronyl group containing unit (M d ) and an assembly forming polymer unit
  • An assembly (herein also referred to as "the assembly of the present invention") comprising a surface-forming polymer having 2 (S A 2 ). It will be described below.
  • the substrate-bound polymer assembly-forming polymer unit 1 (S A 1 ) for example, a peptide containing a sequence that forms a stereo complex with the assembly-forming polymer unit 2 (S A 2 ) can be used.
  • “to form a stereocomplex” refers to electrostatic interaction, hydrogen bonding, hydrophobicity between the assembly forming polymer unit 1 (S A 1 ) and the assembly forming polymer unit 2 (S A 2 ).
  • the intermolecular interaction such as interaction limits the behavior of the molecules, which means that they are in the state of forming a complex.
  • stereocomplexes include interactions between right-handed 3-10 helices and left-handed 3-10 helices, and interactions between poly-L-lactic acid (PLLA) and poly-D-lactic acid (PDLA)
  • PLLA poly-L-lactic acid
  • PDLA poly-D-lactic acid
  • S A 1 The assembly-forming polymer unit 1 is not particularly limited as long as it is a peptide containing a sequence known to form a stereocomplex.
  • assembly-forming polymer unit 1 is preferably a peptide containing leucine (Leu) - ⁇ -amino-isobutanoic acid (Aib) as a repetitive sequence.
  • leucine can be partially replaced with alanine (Ala).
  • the number of repeats of the Leu-Aib sequence is usually 2 or more, preferably 3 to 8, and more preferably 5 to 7.
  • the leucine in the repeating sequence may be either L-form or D-form. It is preferable that all leucines in the repeating sequence of assembly-forming polymer unit 1 (S A 1 ) be L-form or all D-form, since they can form a right-handed helix and a left-handed helix, respectively.
  • the said reaction unit (B) contains the group (it couple
  • the reaction unit (B) is not particularly limited as long as it is a group capable of binding to the substrate.
  • a substituent having diazirine forms a carbene by irradiation with light (preferably ultraviolet light, more preferably ultraviolet light with a wavelength of 340 to 400 nm), and thus forms a chemical bond with a hydrocarbon group or the like in the substrate.
  • the irradiation time of the light is not particularly limited, and is usually 1 to 10 minutes.
  • the reaction unit (B) has the following structural formula:
  • the substrate binding polymer may have another structure other than the aggregate-forming polymer unit 1 (S A 1 ) and the reaction unit (B).
  • a linker unit 1 (L 1 ) is further included between the assembly-forming polymer unit 1 (S A 1 ) and the reaction unit (B).
  • the linker unit 1 (L 1 ) is not particularly limited, and it is preferable to include a hydrophilic linker from the viewpoint of imparting water solubility.
  • hydrophilic peptides polyalkylene glycols (eg, polyethylene glycol) and the like can be mentioned as hydrophilic linkers.
  • the hydrophilic linker a hydrophilic peptide is preferable, and repeating N-alkylglycine such as N-methylglycine (sarcosine) and N-ethylglycine (preferably 5 to 50 repetitions, more preferably Particular preference is given to hydrophilic peptides consisting of 20 to 30 repeats.
  • linker units 1 (L 1) from the standpoint of ease of manufacture of the substrate binding polymer preferably includes a triazole ring which can be readily formed by reaction of the azo group and acetylene group.
  • the substrate binding polymer has the following general formula (1):
  • R 1 and R 2 each represent an alkylene group, R 3 represents a group: -N (alkyl) -CH 2 CO-, q represents an integer of 5 to 50, and S A 1 represents the above-mentioned aggregate) Forming polymer unit 1 and B being said reaction unit B)) It is a compound represented by
  • alkylene group represented by R 1 and R 2 examples include alkylene groups having 1 to 6 carbon atoms (preferably 2 to 4 carbon atoms). Specifically, methylene, ethylene, propylene, trimethylene and the like can be mentioned.
  • R 3 is a glycyl group having an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms on a nitrogen atom. Specifically, N-methylglycyl, N-ethylglycyl and the like can be mentioned.
  • S A 1 is the above-mentioned assembly-forming polymer unit 1, and those exemplified above can be suitably used. Specifically, S A 1 has the following structural formula:
  • n is an integer of 2 or more, * represents an asymmetric carbon, and Me represents a methyl group
  • n is preferably 3 to 8, more preferably 5 to 7.
  • B is a reaction unit described above, and those exemplified above can be suitably used. More specifically, for example, B has the following structural formula:
  • the compound represented by the general formula (1) comprises a compound of the following formula (3) having a reaction unit (B) and a compound of the following formula (4) having an aggregation forming polymer unit 1 (S A 1 ) as follows: Since it can manufacture by making it react according to a type
  • reaction can be carried out in a suitable solvent in the presence of a copper catalyst such as copper (I) acetate.
  • a copper catalyst such as copper (I) acetate.
  • the compounds of the formula (3) and the compounds of the formula (4) are known compounds or compounds which can be easily prepared from known compounds.
  • the compound of formula (4) can be produced, for example, by a conventional method in peptide synthesis.
  • the surface-forming polymer assembly-forming polymer unit 2 (S A 2 ) a peptide containing a sequence that forms a stereo complex with the assembly-forming polymer unit 1 (S A 1 ) can be used.
  • the assembly-forming polymer unit 2 (S A 2 ) is not particularly limited as long as it is a peptide containing a sequence known to form a stereocomplex.
  • the assembly-forming polymer unit 2 (S A 2 ) those exemplified for the assembly-forming polymer unit 1 (S A 1 ) can be suitably used. More specifically, it is preferable that it is an optical isomer of the assembly-forming polymer unit 1 (S A 1 ). That is, when L-shaped leucine is contained in the assembly-forming polymer unit 1 (S A 1 ), it is preferable that leucine in the assembly-forming polymer unit 2 (S A 2 ) be a D-form, If leucine in S A 1 is D-form, leucine in S A 2 is preferably L-form.
  • the boronyl group-containing unit (M d ) is not particularly limited as long as it has a boronyl group (-B (OH) 2 ).
  • a boronyl group (-B (OH) 2 ) As the boronyl group-containing unit, for example, general formula (7):
  • R 5 represents a ring or a hydrocarbon chain
  • the ring is not particularly limited, and examples thereof include hetero atoms (eg, S, etc.) of a monocyclic or polycyclic (eg, bicyclic, tricyclic, etc.) (preferably monocyclic, more preferably monocyclic having 5 to 7 ring members).
  • a ring preferably an aromatic ring which may contain N, O and the like) is mentioned.
  • aromatic ring examples include benzene, thiophene, furan, pyrrole, pyrazole, imidazole, pyridine, thiazole, pyridazine, pyrimidine, pyrazine, cycloalkane and the like, preferably benzene and thiophene, and more preferably Is benzene.
  • the hydrocarbon chain is not particularly limited, and is, for example, a linear or branched (preferably linear) C1-8, preferably 2-6, more preferably 2-4 alkylene group or alkenyl group. Groups are mentioned. As such an alkenyl group which may be substituted, a methylene group, ethylene group, a propylene group, vinylene group, propenylene group etc. are mentioned, for example.
  • R 5 is preferably a ring.
  • boronyl group-containing unit (M d ) examples include groups in which one hydrogen is removed from the ring or hydrocarbon chain of a boronic acid such as phenylboronic acid, 2-thiopheneboronic acid, methylboronic acid and the like, More preferable examples include a group in which one hydrogen is removed from the benzene ring of phenylboronic acid, and more preferable examples include the following formula (8):
  • the surface-forming polymer can have a structure other than the assembly-forming polymer unit 2 (S A 2 ) and the boronyl group-containing unit (M d ).
  • a linker unit 2 (L 2 ) is further provided between the assembly forming polymer unit 2 (S A 2 ) and the surface modification unit (M d ).
  • the linker unit 2 (L 2 ) is not particularly limited, and it is preferable to include a hydrophilic linker from the viewpoint of imparting water solubility.
  • hydrophilic peptides, polyethylene glycol and the like can be mentioned as the hydrophilic linker.
  • the hydrophilic linker is preferably a hydrophilic peptide, and N-alkylglycines such as N-methylglycine (sarcosine) and N-ethylglycine are preferably repeated (preferably 5 to 50 repeats, more preferably 20 to 50). Particular preference is given to hydrophilic peptides consisting of 30 repeats.
  • the linker unit 2 (L 2 ) may contain a triazole ring which can be easily formed by the reaction of an azo group and an acetylene group, from the viewpoint of facilitating the production of the surface-forming polymer.
  • the surface-forming polymer has the general formula (2):
  • R 4 represents a group: —N (alkyl) —CH 2 CO—, t represents an integer of 5 to 50.
  • S A 2 represents an assembly forming polymer unit 2 and M d represents a boronyl group (Containing unit) It is a compound represented by
  • S A 2 in the general formula (2) is the above-mentioned assembly-forming polymer unit 2, and those exemplified above can be suitably used.
  • S A 2 has the following structural formula:
  • n is an integer of 2 or more and * represents an asymmetric carbon. Me is the same as above.
  • the compound represented by the general formula (2) is a compound of the following formula (5) having a boronyl group-containing unit (M d ) and a compound of the following formula (6) having an aggregation forming polymer unit 2 (S A 2 )
  • M d boronyl group-containing unit
  • S A 2 aggregation forming polymer unit 2
  • the compounds of the formula (5) and the compounds of the formula (6) are known compounds or compounds which can be easily prepared from known compounds.
  • the compound of the formula (6) can be produced, for example, by a conventional method in peptide synthesis.
  • assembly forming polymer unit 1 (S A 1 ) is organized together with assembly forming polymer unit 2 (S A 2 ) in the surface forming polymer.
  • assembly-forming polymer unit 1 and assembly-forming polymer unit 2 form a stereocomplex and are organized.
  • an assembly including the assembly forming polymer unit 1 and the assembly forming polymer unit 2 is in the form of a sheet.
  • the shape of the aggregate is preferably square from the viewpoint of uniformly covering the surface of the substrate, and in this case, the length of one piece is, for example, 100 nm to 8 ⁇ m, preferably 200 nm to 4 ⁇ m, more preferably 300 nm to 2 ⁇ m, More preferably, it is 400 nm to 1.6 ⁇ m.
  • the area in the case of a sheet is not particularly limited, and is, for example, 0.01 to 50 ⁇ m 2 , preferably 0.03 to 10 ⁇ m 2 , more preferably 0.1 to 3 ⁇ m 2 , and still more preferably 0.2 to 2.5 ⁇ m 2 .
  • the assembly of the present invention can be produced by mixing a substrate binding polymer and a surface forming polymer in a solvent containing water.
  • the ratio of the number of moles of the surface-forming polymer to the number of moles of the substrate-bound polymer is, for example, 0.5 to 2, preferably 0.8 to 1.2, and more preferably 0.9 to 1.1.
  • the solvent contains a solvent other than water
  • examples of the solvent other than water include water-soluble organic solvents such as alcohol (ethanol, propanol etc.), dioxane, tetrahydrofuran, acetone, N, N-dimethylformamide, dimethylsulfoxide etc. .
  • a solvent other than water When a solvent other than water is included, its concentration may vary depending on its type, but it is, for example, 1 to 18%, preferably 3 to 15%, more preferably 6 to 12%, still more preferably 8 to 12%. is there.
  • the substrate binding polymer and the surface forming polymer are mixed in a solvent other than water, and the obtained mixed solution is added to a solvent containing water (preferably a solvent in a stirring state) (preferably added at once) It is preferable to carry out by (not gradual addition such as dropping).
  • the temperature at the time of mixing is preferably 0 to 10 ° C., and the mixing time is, for example, 10 to 60 minutes.
  • the present invention in one aspect thereof, is a surface-modified substrate (herein referred to as "the surface-modified substrate of the present invention") in which the assembly of the present invention is bound to the surface of the substrate. Sometimes). It will be described below.
  • the base material is a fibrous material
  • the fiber surface can be modified, and therefore, known fibrous materials can be widely used as the base material of the present invention.
  • fibrous materials such as non-woven fabric, woven fabric, and braid can be used.
  • non-woven fabrics are preferable from the viewpoint of being suitable as a filter.
  • the fiber average fiber diameter is preferably 0.8 ⁇ m or more and less than 50 ⁇ m.
  • the fiber diameter increases, it is difficult to secure the surface area of the substrate, which is not preferable.
  • the fiber diameter is small, the risk of occurrence of clogging increases, which is not preferable.
  • the more preferable average fiber diameter is 1.0 ⁇ m or more and less than 30 ⁇ m, and most preferably 1.5 ⁇ m or more and less than 25 ⁇ m.
  • the material of the substrate is not particularly limited as long as it has a site that chemically reacts with the reaction unit (B) in the substrate binding polymer.
  • a material containing an aliphatic hydrocarbon group is preferable in that it can form a bond with the above-described diazirine by ultraviolet irradiation.
  • polypropylene, polyethylene terephthalate and the like can be mentioned.
  • the substrate binding polymer can be bound (preferably bound by a chemical bond) to the fiber surface by the reaction unit (B) reacting with the substrate surface. Thereby, the substrate binding polymer plays a role of anchoring the fiber surface and the surface forming polymer.
  • the surface-forming polymer has an aggregation-forming polymer unit 2 (S A 2 ), and is indirectly tethered on the substrate by organizing with the aggregation-forming polymer unit 1 (S A 1 ) of the substrate-bound polymer It is stopped.
  • the surface modified substrate of the present invention can be produced by reacting the reaction unit (B) with the substrate in a state where the solution or dispersion containing the assembly of the present invention and the substrate are in contact with each other.
  • the solution or dispersion As a method of bringing a solution or dispersion containing the assembly of the present invention into contact with a substrate, for example, the solution or dispersion is applied to the substrate, and the substrate is dipped or impregnated in the solution or dispersion. It is possible to use a method such as, for example, the latter method. In the case of immersion or impregnation, if necessary (for example, when the substrate is a fibrous material), degassing can be performed to more efficiently contact the substrate and the aggregate of the present invention .
  • the reaction of the reaction unit (B) with the substrate can adopt an appropriate method depending on the type of reaction unit.
  • the reaction unit (B) contains diazirine
  • the mixture of the substrate and the aggregate may be irradiated with light.
  • the wavelength of the light to be irradiated is usually 340 to 400 nm, and the irradiation time is usually 1 to 10 minutes.
  • the operation of irradiating a solution or dispersion containing the above aggregate and a substrate with each other and irradiating the resulting mixture with ultraviolet light can be repeated several times. By repeating the said operation several times, the introduction amount of the aggregate
  • the present invention in one aspect thereof, comprises an antibody-conjugated surface-modified substrate (herein “antibody-conjugated surface of the present invention,“ the antibody-conjugated surface of the present invention. (Also referred to as "modified substrate”). It will be described below.
  • the antibody is not particularly limited as long as it is an antibody in which a sugar chain is bound to the Fc region.
  • the hydroxyl group of the sugar in the sugar chain with the boronyl group in the aggregation forming polymer 2 (S A 2 ), both can be bound.
  • the antibody binding amount per BET specific surface area of the substrate of the present invention in the antibody-bound surface-modified substrate of the present invention is, for example, 1 to 10 mg / m 2 , preferably 2 to 7 mg / m 2 , more preferably 3 ⁇ is 5 mg / m 2.
  • the antibody-bound surface-modified substrate of the present invention is produced, for example, by reacting the surface-modified substrate of the present invention with an antibody under conditions in which the sugar of the antibody Fc region and the hydroxyl group of the boronyl group undergo an esterification reaction.
  • an antibody under conditions in which the sugar of the antibody Fc region and the hydroxyl group of the boronyl group undergo an esterification reaction.
  • known ester reaction conditions can be adopted.
  • the antibody-bound surface-modified substrate of the present invention is obtained by reacting the assembly of the present invention with the antibody as described above, and combining the assembly of the present invention with the antibody to form an antibody-modified assembly. Once obtained, it can be produced in the same manner as the method of producing a surface-modified substrate of the present invention described above except that the antibody-modified assembly is used instead of the assembly of the present invention.
  • the use in particular of the antibody binding surface modification base material of this invention is not restrict
  • a filter antibody modification filter
  • the variable region which is the antigen-binding site of the antibody, is considered to be oriented in the direction outward from the substrate surface.
  • substances capable of binding to the antibody eg, biomolecules such as cells, proteins, nucleic acids, etc.
  • the presence of the hydrophilic linker in the surface-forming polymer allows the substrate surface to be hydrophilized to further reduce nonspecific adsorption to hydrophobic sites. Therefore, by using the antibody modified filter of the present invention, specific cells or substances in a sample (for example, a body fluid such as blood) can be adsorbed or removed.
  • a sample for example, a body fluid such as blood
  • the antibody-bound surface-modified substrate of the present invention can be used as an antibody modification filter for regulatory T cell adsorption.
  • Treg-specific antibodies include antibodies to CD25, CCR4 and the like.
  • the antibody modification filter for regulatory T cell adsorption for example, a blood pump, a column provided with the antibody modification filter for regulatory T cell adsorption, and a flow path connecting the blood pump and the column And the form used as a regulatory T cell removal apparatus.
  • the components and the specific structure of the device are not particularly limited, and can take the same form as, for example, a component separation device used for apheresis therapy.
  • the device may be used either connected or not connected to the animal's body.
  • the number of antibody modifying filters for regulatory T cell adsorption provided in the column is, for example, 1 to 20, and preferably 4 to 10.
  • the compound D-1 (DS) synthesized in Synthesis Example 20 is a base material-bound polymer having a reaction unit and the aggregation forming polymer unit 1
  • the compound L-3 (BS) synthesized in Synthesis Example 23 is a boronyl group It is a surface forming polymer having a containing unit and an assembly forming polymer unit 2.
  • the compound L-1 (FS) synthesized in Synthesis Example 21, the compound L-2 (MS) synthesized in Synthesis Example 22, and the compound L-4 (GS) synthesized in Synthesis Example 24 were boronyl group-containing units. With the same structure as Compound L-3 except that it has another unit instead of
  • the solution was washed 3 times each with 4 wt% of aqueous KHSO 4 solution and saturated aqueous NaHCO 3 solution.
  • the organic phase was dried over brine, dried over anhydrous MgSO 4, filtered and evaporated.
  • the residue was purified on a LH-20 gel column and MeOH was selected as solvent. A white pure powder was obtained.
  • the ratio of the compound to which fluorescein is bound was 94% in the total of the obtained compounds.
  • Test Example 1 Optical Fixation of Sheet-like Assemblies to Non-Woven Fabrics
  • Optical Fixation of Polypropylene (PP) Non-woven Sheets The conditions for light-immobilization of sheet-like assemblages were investigated. In order to observe the state of a sheet-like aggregate adhered to a PP non-woven fabric with a fluorescence microscope, a sheet-like aggregate is produced using a compound FS containing a fluorescent agent and a compound DS, and a state of light fixation on the non-woven fabric surface I observed it.
  • the molecular assembly was prepared using the ethanol solution and MilliQ water.
  • aqueous ethanol solution is considered to be more hydrophobic than water and is more likely to penetrate into a PP non-woven fabric, so a molecular assembly was prepared using an aqueous ethanol solution as a dispersion solvent, and the shape was observed.
  • TEM images are shown in FIGS. 2 (b) and (c).
  • Test Example 1.2 Confirmation of Sheet-like Assembly Light Fixation on PP Nonwoven Fiber Surface
  • the state of light fixation on a PP non-woven fabric was confirmed using the molecular assembly sheet-like aggregate prepared in Example 1.1. Specifically, light fixation was performed as follows.
  • the fiber diameter etc. of the PP non-woven fabric are shown in the following table.
  • the PP non-woven fabric was punched out to a diameter of 6.8 mm and then treated for 8 minutes in a UV / O 3 hydrophilization treatment apparatus.
  • the pressure was reduced with a vacuum pump while stirring, and degassing was performed for about 30 minutes until generation of bubbles could not be confirmed.
  • Test Example 1.3 Coverage of sheet-like aggregate on PP non-woven fabric An experiment was conducted to determine the sheet-like aggregate light-immobilized on PP non-woven fabric. As shown in FIG. 4, stable sheet-like aggregates in water also elute in DMF, which is an aprotic polar solvent. Since the molecule (compound FS) eluted in this way contains fluorescein, quantification of the sheet-like aggregate immobilized on the surface of the PP non-woven fabric was carried out by performing fluorescence spectrometry of the eluate. Specifically, it carried out as follows.
  • Test Example 2 Observation of fiber surface by atomic force microscope (AFM) From the experiment of Test Example 1, it has been confirmed that the fiber surface can be covered with a sheet-like aggregate. Therefore, in order to observe the appearance of the surface in more detail, the PP fiber surface after photoimmobilization of the sheet-like assembly (using a 10% aqueous ethanol solution as a dispersion medium) described in Test Example 1 on the PP non-woven fabric was AFM ( It observed by imaging by Peak Force Tapping mode which can measure topology and physical property simultaneously using Multimode made from Bruker.
  • the sample preparation method and imaging conditions are as follows.
  • the left column in Fig. 7 is an image of Peakforce error emphasizing the place where there is a change in surface height, but (a) PP fiber surface with only UV / O 3 hydrophilization treatment, (b) one-time sheet-like assembly It can be seen that the appearance of the surface is greatly changed by comparing the surface of the PP fiber on which the body is light-fixed. Further, when paying attention to the suction force (Adhesion), (d) UV / O 3 as compared to PP fiber surface hydrophilic treatment only (e) adsorption force towards one sheet aggregate light immobilized PP fiber surface Is large, it can be confirmed that the physical properties of the surface are changing. Similarly, in the case of DMT-Modulus, it can be confirmed that the physical properties of the fiber surface are changed by the coating of the sheet-like assembly. Note that a to i are images of the same part.
  • Test Example 3 Since it was confirmed that the sheet-like aggregate can be light-fixed on the fiber surface of the PP non-woven fabric from the results of the antibody immobilization test example 2 using the sheet-like aggregate as a scaffold, subsequently, the sheet-like aggregate is used as a scaffold Immobilization of anti-mouse CD25 antibody was attempted.
  • As a constituent molecule of the sheet-like assembly to be a scaffold instead of compound FS which is a molecule containing fluorescein, a compound MS having maleimide at the end of hydrophilic chain and a compound BS having phenylboronic acid at the end of hydrophilic chain are used. . Maleimide and phenylboronic acid are functional groups for forming a bond with an antibody.
  • TEM transmission electron microscope
  • Test Example 3.2 Immobilization of Antibody Having Molecular Assembly as Scaffold
  • the sheet-like assembly was light-immobilized on a PP non-woven fabric using the sheet-like assembly prepared in Example 3.1, and then the anti-CD25 antibody was immobilized.
  • a sheet-like assembly containing Compound MS having maleimide was used as a scaffold
  • the disulfide bond at the Fc site of the antibody was reduced in order to secure the reaction point with maleimide.
  • an esterification reaction of a sugar chain present in the Fc site and the boronic acid was used. Specifically, it carried out as follows.
  • Affymetrix Anti-mouse CD25 (Clone: PC61.5, Isotype: Rat IgG 1 , purified)
  • the sample preparation method and imaging conditions are as follows.
  • Test Example 3.3 Quantitative determination of the amount of immobilized antibody
  • the amount of immobilized antibody in Example 3.2 is quantified by indirect ELISA method, and the amount of immobilized antibody when the number of times of light immobilization of the sheet-like aggregate of BS / DS and MS / DS is changed is compared. did.
  • As a negative control a sheet-like assembly of GS / DS to which no antibody was immobilized was immobilized was immobilized. Specifically, it carried out as follows.
  • a Peroxidase-labeled secondary antibody that recognizes the F (ab ') 2 site was used.
  • An indirect method of determining the amount of immobilized antibody from ultraviolet absorption intensity was used by reacting using OPD as a substrate.
  • HRP-labeled secondary antibody was "diluted" using HRP-labeled secondary antibody made from the same clone. The protocol is shown below.
  • ⁇ ELISA protocol> 1 0.3 ⁇ L of HRP-labeled secondary antibody, 70.32 ⁇ L of unlabeled secondary antibody, and 46.68 ⁇ L of Citrate Phosphate Buffer (CPB) were mixed to obtain a secondary antibody solution. (At this time, concentration adjustment was performed with the intention of adding 10 ⁇ g of secondary antibody per non-woven fabric. (Storage with ice cooling) 2) One non-woven fabric sample was put in a 96-well plate, 90 ⁇ L of CPB was added, 10 ⁇ L of the secondary antibody solution prepared in 1 was added thereto, and reacted for 30 minutes at room temperature. 3) Remove extra attached BSA with 0.02 wt% triton / PBS.
  • CPB Citrate Phosphate Buffer
  • the vertical axis is the product of the antibody fixed amount and the valence number, ie, the fixed antigen It is considered to be proportional to the number of recognition sites. From the results, first, when the antibody is immobilized with the sheet-like assembly of compound BS / compound DS as a scaffold, the antibody can be immobilized at a very high density of 4 ⁇ g / sheet (3.92 mg / m 2 from the BET multipoint method) Was confirmed.
  • Test Example 4 Selective removal of regulatory T cells (Treg) by antibody immobilized to PP non-woven fabric Using antibody non-woven PP non-woven fabric different in sheet-like assembly as scaffold prepared in Example 3, evaluation of difference in Treg removal ability was evaluated went. At the time of evaluation, it was investigated whether or not Tregs were specifically removed from the splenocytes by flowing mouse splenocytes on antibody-immobilized PP non-woven fabric. Specifically, it carried out as follows.
  • Treg is present in about 10% of all cells.
  • the nonspecific adhesion of the antibody-immobilized PP non-woven fabric was evaluated by confirming the adsorption of lymphocytes other than Tregs.
  • the lymphocyte was judged by CD3 and Treg was judged by CD3 + CD4 + CD25 + Foxp3 +.
  • BD LSRFORTESSA X-20 manufactured by BD Biosences.
  • the cell suspension was passed through the column using a 5 mL syringe pump at a flow rate of 12 mL / h. The spilled suspension was recovered. 10) After completion of the flow, the volume of the eluate and cell density were measured, and the number of cells which had flowed out was calculated. 11) The cells after flow were centrifuged at 300 ° C., 300 G for 5 minutes, and replaced with FACS Buffer. 12) The suspension after flow and the suspension before flow were added to 1 ⁇ 10 6 cells, and centrifuged at 300 ° C. for 5 minutes at 4 ° C.
  • Treg and lymphocytes remain at a low removal rate. It is considered that non-specific adhesion of cells is suppressed by covering the highly hydrophobic PP non-woven surface with a sheet-like assembly having a hydrophilic sarcosine polymer brush of very high density on the surface.
  • Test Example 5 Observation of PP non-woven fabric after removal of Treg The PP non-woven fabric after removal of Treg was observed with a scanning electron microscope (SEM). The results are shown in FIG.

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Abstract

目的物を特異的に吸着又は除去できる抗体修飾フィルター、及び該フィルターに用いる材料を提供すること。 反応ユニット及び集合体形成ポリマーユニット1を有する基材結合ポリマー、並びにボロニル基含有ユニット及び集合体形成ポリマーユニット2を有する表面形成ポリマーを含む、集合体が基材の表面に結合しており、且つ抗体が結合してなる、抗体結合表面修飾基材。

Description

抗体修飾フィルター
　本発明は、抗体修飾フィルター、その材料等に関する。
　アフェレシス療法という治療法が医療現場で活躍している。アフェレシス療法は、患者の血液を体外循環させる過程で病気の原因となる特定の細胞やタンパクなどを除去する治療法である。アフェレシス用の不織布フィルタには抗体を用いることで高い選択性を持たせることができるが、既存の抗体固定化不織布では抗体の抗原結合部位である可変領域を不織布繊維表面から外へ向かう方向へと配向させての固定化はできていないため、効率的な目的細胞やタンパクの除去が困難である。さらに繊維表面（通常は疎水性）への細胞やタンパクの非特異吸着も完全には抑制できていない。
　一方、不織布等の基材の表面修飾技術として、特許文献１では、2種のポリマーユニットがステレオコンプレックスを形成してなる集合体を用いる技術が開示されている。この技術によれば、表面を様々な分子で修飾することができる。しかしながら、どのようにすれば効率的に抗体で修飾することができ、また目的物を特異的に吸着又は除去できる抗体修飾フィルターが得られるかについては、明らかになっていなかった。
特開2016－183434号公報
　本発明は、目的物を特異的に吸着又は除去できる抗体修飾フィルター、及び該フィルターに用いる材料を提供することを課題とする。
　本発明者は、上記課題に鑑みて鋭意研究を行った結果、反応ユニット及び集合体形成ポリマーユニット1を有する基材結合ポリマー、並びにボロニル基含有ユニット及び集合体形成ポリマーユニット2を有する表面形成ポリマーを含む集合体を用いることにより、上記課題を解決できることを見出した。より具体的には、該集合体に抗体が固定化されたもので表面修飾された基材をフィルターとして用いることにより、目的物を特異的に吸着又は除去できることを見出した。
　即ち、本発明は、下記の態様を包含する：
　項１．　反応ユニット及び集合体形成ポリマーユニット1を有する基材結合ポリマー、並びにボロニル基含有ユニット及び集合体形成ポリマーユニット2を有する表面形成ポリマーを含む、集合体。
　項２．　前記集合体形成ポリマーユニット1及び前記集合体形成ポリマーユニット2が共にステレオコンプレックスを形成している、項１に記載の集合体。
　項３．　シート状である、項１又は２に記載の集合体。
　項４．　項１～３のいずれかに記載の集合体が基材の表面に結合してなる、表面修飾基材。
　項５．　前記基材が繊維質材料である、項４に記載の表面修飾基材。
　項６．　前記疎水性基材がポリプロピレンである、項４又は５に記載の表面修飾基材。
　項７．　項４～６のいずれかに記載の表面修飾基材と抗体とが結合してなる、抗体結合表面修飾基材。
　項８．　前記抗体が抗制御性T細胞抗体である、項７に記載の抗体結合表面修飾基材。
　項９．　項７又は８に記載の抗体結合表面修飾基材を含む、抗体修飾フィルター。
　項１０．　制御性T細胞吸着用である、項９に記載の抗体修飾フィルター。
　項１１．　反応ユニット及び集合体形成ポリマーユニット1を有する基材結合ポリマー、並びにボロニル基含有ユニット及び集合体形成ポリマーユニット2を有する表面形成ポリマーを混合する工程を含む、集合体の製造方法。
　項１２．　反応ユニット及び集合体形成ポリマーユニット1を有する基材結合ポリマー、ボロニル基含有ユニット及び集合体形成ポリマーユニット2を有する表面形成ポリマー、並びに基材を混合し、光を照射する工程を含む、表面修飾基材の製造方法。
　項１３．　血液ポンプと、項１０に記載の抗体修飾フィルターを備えるカラムと、前記血液ポンプと前記カラムとを接続する流路とを含む制御性Ｔ細胞除去装置。
　本発明によれば、抗体を効率的に固定することができる集合体、該集合体が表面に結合してなる表面修飾基材、該表面修飾基材と抗体とが結合してなる抗体結合表面修飾基材を提供することができる。抗体結合表面修飾基材をフィルターとして用いることにより、目的物を特異的に吸着又は除去できる抗体修飾フィルターを提供することができる。
化合物FS/化合物DSが形成する分子集合体（試験例1.1）の透過型電子顕微鏡（TEM）画像を示す。 化合物FS/化合物GS/化合物DSが形成する分子集合体（試験例1.1）の透過型電子顕微鏡（TEM）画像を示す。分散集合体の作製時の分散溶媒として、milliQ水を使用した場合を（a）に、5％エタノール水溶液を使用した場合を（b）に、10％エタノールを使用した場合を（c）に示す。 シート状集合体光固定化PP不織布（試験例1.2）の蛍光顕微鏡画像を示す。 左側の図は水中でのシート状集合体の断面構造（主面に対する垂直方向の断面構造）の模式図である。左側の図はDMF中でシート状集合体の構造が崩壊する様子を表す模式図である。各図中、最下方のバーは基材を示し、バーに連結しているのが基材結合ポリマーであり、基材結合ポリマーのらせん構造部（集合体形成ポリマーユニット1）に接触しているのが表面形成ポリマー（らせん構造部は集合体形成ポリマーユニット2）を示す。 試験例3の結果を示すグラフである。縦軸はシート状集合体の被覆率を示し、横軸はシート状集合体の光固定化の回数を示す。各カラムは、シート状集合体作製時の分散溶媒の違いで色分けされている。 試験例2で観察された、ポリプロピレン（PP）不織布繊維の原子間力顕微鏡(AFM)画像である。左側は、シート状集合体未修飾の場合のPP繊維表面示し、右側は、シート状集合体を光固定化したPP繊維表面を示す。数値は、直線部分の断面について算出された二乗平均平方根粗さ(Rq)である。 試験例2で観察された、ポリプロピレン（PP）不織布繊維の原子間力顕微鏡(AFM)画像である。a, d, g; シート状集合体未修飾の場合、b, e, h; シート状集合体を1回光固定化した場合、c, f, I; シート状集合体を3回光固定化した場合 化合物MS/化合物DSが形成する分子集合体（試験例3.1）、化合物BS/化合物DSが形成する分子集合体（試験例3.1）、及び化合物GS/化合物DSが形成する分子集合体（試験例3.1）の透過型電子顕微鏡（TEM）画像を示す。a, b, c; 化合物 MS/化合物DS、d, e, f; 化合物BS/化合物DS、g,h,I; 化合物GS/化合物DS。a, d, g; 分散溶媒が水の場合、b, e, h; 分散溶媒が5％エタノールの場合、 c, f, i; 分散溶媒が10％エタノールの場合 左側は、抗体固定化PP不織布のAFM画像を示す（試験例3.2）。右側のグラフは、AFM画像の直線部の断面の凹凸を表す。縦軸は高さを示し、横軸は直線部の位置を示す。 抗体固定化PP不織布中の抗体量を示す（試験例3.3）。縦軸は抗体量を示し、横軸は、シート状集合体の光固定化の回数を示す。各カラムは、使用した集合体形成ポリマーユニットの種類に応じて色分けされている。 抗体固定化PP不織布を含むカラムによるTreg又はCD3+T細胞の除去性能を示す（試験例4）。縦軸は除去率を示し、横軸は使用した集合体形成ポリマーユニットの種類を示す。 抗体固定化PP不織布を含むカラムによるTreg又はCD3+T細胞の除去性能を示す（試験例4）。縦軸は除去率を示し、横軸はカラム中の抗体固定化PP不織布の枚数を示す。 試験例4においてTregを除去した後のPP不織布の走査型電子顕微鏡（SEM）画像を示す。
　本明細書中において、「含有」及び「含む」なる表現については、「含有」、「含む」、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を含む。
　1．集合体
　本発明は、その一態様において、反応ユニット（B）及び集合体形成ポリマーユニット1（SA 1）を有する基材結合ポリマー、並びにボロニル基含有ユニット（Md）及び集合体形成ポリマーユニット2（SA 2）を有する表面形成ポリマーを含む、集合体（本明細書において、「本発明の集合体」と示すこともある。）に関する。以下に説明する。
　1-1．基材結合ポリマー
　集合体形成ポリマーユニット1（SA 1）としては、例えば、集合体形成ポリマーユニット2（SA 2）とステレオコンプレックスを形成する配列を含んだペプチドを用いることができる。本発明において、「ステレオコンプレックスを形成する」とは、集合体形成ポリマーユニット1（SA 1）と集合体形成ポリマーユニット2（SA 2）とが、静電相互作用や水素結合、疎水性相互作用などの分子間相互作用により分子同士の挙動が制限され、複合体を形成した状態にあることをいう。ステレオコンプレックスの例としては、右巻きの3～10へリックスと左巻きの3～10ヘリックスとの相互作用によるものやポリ－L－乳酸（PLLA）とポリ－D－乳酸（PDLA）との相互作用によるものが挙げられる。集合体形成ポリマーユニット1（SA 1）としては、ステレオコンプレックスを形成することが知られている配列を含むペプチドであれば、特に限定されない。
　具体的には、集合体形成ポリマーユニット1（SA 1）は、繰り返し配列としてロイシン（Leu）－α－アミノ－イソブタン酸（Aib）を含むペプチドが好ましい。ここでロイシンは一部アラニン（Ala）と置き換えることができる。Leu－Aib配列の繰り返しの数としては、通常、2以上であり、好ましくは3～8であり、より好ましくは5～7である。繰り返し配列中のロイシンはL－体又はD－体のいずれも用いることができる。集合体形成ポリマーユニット1（SA 1）の繰り返し配列中のロイシンは全てL－体であるか、又は全てD－体であると、それぞれ右巻きヘリックス及び左巻きヘリックスを形成でき好ましい。
　前記反応ユニット（B）は、後述の基材上に結合する（好ましくは化学結合をもって結合する）基を含む。基材上に結合することが可能な基であれば、反応ユニット（B）は特に限定されない。例えば、ジアジリンを有する置換基は、光（好ましくは紫外線、より好ましくは波長：340～400nmの紫外線）を照射することによって、カルベンを生じるため、基材中の炭化水素基等と化学結合を形成する。光の照射時間は特に限定されず、通常、1～10分である。
　合成が容易な点で、反応ユニット（B）は下記構造式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
を含むことが好ましい。
　基材結合ポリマーは、前記集合体形成ポリマーユニット1（SA 1）及び反応ユニット（B）以外の他の構造を有することができる。好ましくは、例えば、集合体形成ポリマーユニット1（SA 1）と反応ユニット（B）との間にリンカーユニット1（L1）をさらに有する。
　リンカーユニット1（L1）は特に限定されず、水溶性を付与する観点より、親水性のリンカーを含むことが好ましい。具体的には、親水性ペプチド、ポリアルキレングリコール（例えば、ポリエチレングリコール）等を親水性リンカーとして挙げることができる。組織化の観点から、親水性リンカーとしては、親水性ペプチドが好ましく、N－メチルグリシン（サルコシン）、N－エチルグリシン等のN－アルキルグリシンの繰り返し（好ましくは5～50の繰り返し、より好ましくは20～30の繰り返し）からなる親水性ペプチドが特に好ましい。また、リンカーユニット1（L1）は、基材結合ポリマーの製造を容易にする観点より、アゾ基とアセチレン基との反応により容易に形成することが可能なトリアゾール環を含むことが好ましい。
　本発明の好ましい態様として、前記基材結合ポリマーは下記一般式（1）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
（式中、R1及びR2はアルキレン基を示し、R3は基：－N（アルキル）－CH2CO－を示す。qは5～50の整数を示す。SA 1は前記集合体形成ポリマーユニット1であり、Bは前記反応ユニットBである。）
で表わされる化合物である。
　R1及びR2で示されるアルキレン基としては、炭素数1～6（好ましくは炭素数2～4）のアルキレン基を挙げることができる。具体的には、メチレン、エチレン、プロピレン、トリメチレン等を挙げることができる。
　R3で示される－N（アルキル）－CH2CO－は、炭素数1～6のアルキル基を窒素原子上に有するグリシル基である。具体的には、N－メチルグリシル、N－エチルグリシル等を挙げることができる。
　SA 1は、上述の集合体形成ポリマーユニット1であり、既に例示したものを好適に用いることができる。具体的には、SA 1は下記構造式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
（式中、nは2以上の整数であり、＊は不斉炭素を示す。Meはメチル基を示す。）
を含む（より好ましくは当該構造式から成る）ことが好ましい。より好ましくは、式中の不斉炭素は全て同一の光学不斉体である（すなわち、当該構造式中のロイシンは全てL－体であるか、又は全てD－体である）。nは3～8であることが好ましく、5～7であることがより好ましい。
　Bは、上述の反応ユニットであり、既に例示したものを好適に用いることができる。より具体的には、例えば、Bは下記構造式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
である。
　一般式（1）で表わされる化合物は、反応ユニット（B）を有する下記式（3）の化合物と集合体形成ポリマーユニット1（SA 1）を有する下記式（4）の化合物とを下記反応式に従って反応させることにより製造することができるため、簡便な手法により製造可能である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
（式中、R1、R2、R3、q、SA 1及びBは前記に同じ。）
　当該反応は、適当な溶媒中、酢酸銅（I）等の銅触媒の存在下に行うことができる。
　式（3）の化合物及び式（4）の化合物は、公知の化合物であるか、公知の化合物から容易に製造できる化合物である。式（4）の化合物は、例えば、ペプチド合成における常法により製造することが可能である。
　1-2．表面形成ポリマー
　集合体形成ポリマーユニット2（SA 2）としては、集合体形成ポリマーユニット1（SA 1）とステレオコンプレックスを形成する配列を含んだペプチドを用いることができる。集合体形成ポリマーユニット2（SA 2）としては、ステレオコンプレックスを形成することが知られている配列を含むペプチドであれば、特に限定されない。
　具体的には、集合体形成ポリマーユニット2（SA 2）は、集合体形成ポリマーユニット1（SA 1）に例示したものが好適に使用できる。より具体的には集合体形成ポリマーユニット1（SA 1）の光学異性体であることが好ましい。すなわち、前記集合体形成ポリマーユニット1（SA 1）中にL－体のロイシンが含まれる場合、集合体形成ポリマーユニット2（SA 2）中のロイシンはD－体であることが好ましく、SA 1中のロイシンがD－体であれば、SA 2中のロイシンはL－体であることが好ましい。
　ボロニル基含有ユニット（Md）は、ボロニル基（－B(OH)2）を有する限りにおいて特に制限されない。ボロニル基含有ユニットとしては、例えば一般式（7）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
（式中、R5は環又は炭化水素鎖を示す。）
　環としては、特に制限されないが、例えば単環又は多環（例えば二環、三環等）（好ましくは単環、より好ましくは環員数5～7の単環）のヘテロ原子（例えば、S、N、O等）を含んでいてもよい環（好ましくは芳香環）が挙げられる。芳香環として、具体的には、例えばベンゼン、チオフェン、フラン、ピロール、ピラゾール、イミダゾール、ピリジン、チアゾール、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、シクロアルカン等が挙げられ、好ましくはベンゼン、チオフェンが挙げられ、より好ましくはベンゼンが挙げられる。
　炭化水素鎖としては、特に制限されないが、例えば直鎖状又は分岐鎖状（好ましくは直鎖状）の炭素数1～8、好ましくは2～6、より好ましくは2～4のアルキレン基又はアルケニレン基が挙げられる。このような置換されていてもよいアルケニル基としては、例えば、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、ビニレン基、プロペニレン基、等が挙げられる。
　R5は好ましくは環である。
　ボロニル基含有ユニット（Md）の具体例としては、フェニルボロン酸、2－チオフェンボロン酸、メチルボロン酸等のボロン酸の環又は炭化水素鎖から1つの水素が除かれてなる基が挙げられ、より好ましい具体例としてはフェニルボロン酸のベンゼン環から1つの水素が除かれてなる基が挙げられ、さらに好ましい具体例としては下記式（8）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
で表される基が挙げられる。
　表面形成ポリマーは、集合体形成ポリマーユニット2（SA 2）及びボロニル基含有ユニット（Md）以外の構造を有することができる。好ましくは、例えば、集合体形成ポリマーユニット2（SA 2）と表面修飾ユニット（Md）との間にリンカーユニット2（L2）をさらに有する。
　リンカーユニット2（L2）は特に限定されず、水溶性を付与する観点より、親水性のリンカーを含むことが好ましい。具体的には、親水性ペプチド、ポリエチレングリコール等を親水性リンカーとして挙げることができる。組織化の観点から、親水性リンカーは親水性ペプチドが好ましく、N－メチルグリシン（サルコシン）、N－エチルグリシン等のN－アルキルグリシンの繰り返し（好ましくは5～50の繰り返し、より好ましくは20～30の繰り返し）からなる親水性ペプチドが特に好ましい。また、リンカーユニット2（L2）は、表面形成ポリマーの製造を容易にする観点より、アゾ基とアセチレン基との反応により容易に形成することが可能なトリアゾール環を含んでいてもよい。
　本発明の好ましい態様として、表面形成ポリマーは一般式（2）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
（式中、R4は基：－N（アルキル）－CH2CO－を示す。tは5～50の整数を示す。SA 2は集合体形成ポリマーユニット2であり、Mdはボロニル基含有ユニットである。）
で表わされる化合物である。
　－N（アルキル）－CH2CO－は、前記一般式（1）において例示したとおりである。
　一般式（2）におけるSA 2は、上述の集合体形成ポリマーユニット2であり、既に例示したものを好適に用いることができる。好ましくは、SA 2は下記構造式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
（式中、nは2以上の整数であり、＊は不斉炭素を示す。Meは前記に同じ。）
を含む（より好ましくは当該構造式から成る）ことが好ましい。より好ましくは、式中の不斉炭素は全て同一の光学異性体であり（すなわち、当該構造式中のロイシンは全てL－体であるか、又は全てD－体であり）、かつSA 1における光学不斉とは異なることが好ましい。nは3～8であることが好ましく、5～7であることがより好ましい。
　一般式（2）で表わされる化合物は、ボロニル基含有ユニット（Md）を有する下記式（5）の化合物と集合体形成ポリマーユニット2（SA 2）を有する下記式（6）の化合物とを下記反応式に従って反応させることにより製造することができ、簡便な手法により表面形成ポリマーを製造することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
（式中、R4、t、SA 2及びMdは前記に同じ。）
　当該反応は、適当な溶媒中、エチル（ヒドロキシイミノ）シアノアセタート（Oxyma）、(1-シアノ-2-エトキシ-2-オキソエチリデンアミノオキシ)ジメチルアミノ-モルホリノ-カルベニウムヘキサフルオロリン酸塩（COMU）等の縮合剤、及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン等の有機塩基の存在下に行うことができる。
　式（5）の化合物及び式（6）の化合物は、公知の化合物であるか、公知の化合物から容易に製造できる化合物である。式（6）の化合物は、例えば、ペプチド合成における常法により製造することが可能である。
　1-3．集合体
　本発明の集合体において、集合体形成ポリマーユニット1（SA 1）は、表面形成ポリマー中の集合体形成ポリマーユニット2（SA 2）と共に組織化している。好ましくは、集合体形成ポリマーユニット1及び集合体形成ポリマーユニット2はステレオコンプレックスを形成して、組織化している。また、好ましくは、集合体形成ポリマーユニット1及び集合体形成ポリマーユニット2を含む集合体は、シート状である。
　シート状の場合、その構造は、例えば図４の左側の断面構造に示されるように、基材結合ポリマーと表面形成ポリマーが逆向きに並び、両者が集合体形成ポリマーユニット1と集合体形成ポリマーユニット2との連結により組織化されている構造であると考えられる。
　集合体の形状は、基材の表面を均一に被覆する観点からは正方形状が好ましく、この場合、一片の長さは、例えば100nm～8μm、好ましくは200nm～4μm、より好ましくは300nm～2μm、さらに好ましくは400nm～1.6μmである。
　シート状の場合の面積は、特に制限されないが、例えば0.01～50μm2、好ましくは0.03～10μm2、より好ましくは0.1～3μm2、さらに好ましくは0.2～2.5μm2である。
　1-4．集合体の製造方法
　本発明の集合体は、基材結合ポリマーと表面形成ポリマーとを水を含む溶媒中で混合することにより製造することができる。
　基材結合ポリマーのモル数に対する表面形成ポリマーのモル数との比は、例えば0.5～2、好ましくは0.8～1.2、より好ましくは0.9～1.1である。
　溶媒が水以外の溶媒を含む場合、水以外の溶媒としては、例えばアルコール（エタノール、プロパノール等）、ジオキサン、テトラヒドロフラン、アセトン、N,N-ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等の水溶性有機溶媒が挙げられる。
　水以外の溶媒を含む場合、その濃度は、その種類に応じて異なり得るが、例えば1～18％、好ましくは3～15％、より好ましくは6～12％、さらに好ましくは8～12％である。
　混合は、好ましくは基材結合ポリマーと表面形成ポリマーを水以外の溶媒中で混合しておき、得られた混合液を水を含む溶媒（好ましくは撹拌状態の溶媒）に添加（好ましくは一気に添加（滴下等の緩やかな添加ではない））することにより行うことが好ましい。
　混合時の温度は、好ましくは0～10℃であり、混合時間は、例えば10～60分間である。
　2．表面修飾基材
　本発明は、その一態様において、本発明の集合体が基材の表面に結合してなる、表面修飾基材（本明細書において、「本発明の表面修飾基材」と示すこともある。）に関する。以下に説明する。
　本発明では、基材が繊維質材料であってもその繊維表面を修飾することができるため、本発明の基材としては、公知の繊維質材料を広く用いることができる。具体的には、本発明の基材には、不織布、織物、組物等の繊維質材料を用いることができる。これらの中でも、フィルターとして適しているという観点から、不織布が好ましい。
　基材が繊維質材料である場合、繊維平均繊維直径は0.8μm以上50μm未満であることが好ましい。繊維径が大きくなると基材の表面積確保が困難となり、好ましくない。一方、繊維径が小さくなると目詰まりの発生リスクが高まるため好ましくない。以上の観点より、更に好ましい平均繊維直径は1.0μm以上30μm未満、最も好ましくは、1.5μm以上25μm未満である。
　基材の材質としては、基材結合ポリマー中の反応ユニット（B）と化学的に反応する部位を有するものである限り特に限定されない。例えば、上述のジアジリンと紫外線照射により結合を形成することができる点で、脂肪族炭化水素基を含む材質が好ましい。具体的には、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート等を挙げることができる。
　基材結合ポリマーは、その反応ユニット（B）が基材表面と反応することで繊維表面に結合する（好ましくは化学結合により結合する）ことができる。これにより、基材結合ポリマーは繊維表面と表面形成ポリマーとを繋ぎ止める役割を果たす。
　表面形成ポリマーは集合体形成ポリマーユニット2（SA 2）を有し、基材結合ポリマーの集合体形成ポリマーユニット1（SA 1）と共に組織化することで、基材上に間接的に繋ぎ止められる。
　本発明の表面修飾基材は、本発明の集合体を含む溶液又は分散液と基材とを触れ合わせた状態で反応ユニット（B）と基材とを反応させることにより製造することができる。
　本発明の集合体を含む溶液又は分散液と基材とを触れ合わせる手法としては、例えば、当該溶液又は分散液を前記基材に塗布する、当該溶液又は分散液に前記基材を浸漬又は含浸させる等の手法を用いることができ、好ましくは後者の手法を用いることができる。浸漬又は含浸させる場合、必要に応じて（例えば基材が繊維質材料である場合等は）脱気処理を行うことにより、より効率的に基材と本発明の集合体を接触させることができる。
　反応ユニット（B）と基材との反応は、反応ユニットの種類によって、適切な手法を採用することができる。例えば、反応ユニット（B）がジアジリンを含む場合、基材と集合体の混合物に光を照射すればよい。照射する光の波長は、通常340～400nmであり、照射時間は、通常1～10分である。
　前記集合体を含む溶液又は分散液と基材とを触れ合わせ、得られた混合物に紫外線を照射する操作は、複数回繰り返し行うことができる。当該操作を複数回繰り返し行うことにより、基材表面への集合体の導入量を向上させることができる。
　3．抗体結合表面修飾基材
　本発明は、その一態様において、本発明の表面修飾基材と抗体とが結合してなる、抗体結合表面修飾基材（本明細書において、「本発明の抗体結合表面修飾基材」と示すこともある。）に関する。以下に説明する。
　抗体は、Fc領域に糖鎖が結合している抗体である限り特に制限されない。この糖鎖中の糖の水酸基と集合体形成ポリマー2（SA 2）中のボロニル基とが反応することにより、両者が結合することができる。
　本発明の抗体結合表面修飾基材における、本発明の基材のBET比表面積当たりの抗体結合量は、例えば1～10 mg/m2、好ましくは2～7 mg/m2、より好ましくは3～5 mg/m2である。
　本発明の抗体結合表面修飾基材は、例えば本発明の表面修飾基材と抗体とを、抗体Fc領域の糖とボロニル基の水酸基とがエステル化反応する条件下で反応させることにより製造することができる。該条件としては、公知のエステル反応条件を採用することができる。
　別の例として、本発明の抗体結合表面修飾基材は、本発明の集合体と抗体とを上記のように反応させ、本発明の集合体と抗体とが結合してなる抗体修飾集合体を得てから、本発明の集合体に代えて該抗体修飾集合体を用いる以外は上述の本発明の表面修飾基材の製造方法と同様にして、製造することができる。
　本発明の抗体結合表面修飾基材の用途は特に制限されないが、例えばフィルター（抗体修飾フィルター）として利用することができる。本発明の抗体結合表面修飾基材は、比較的多くの抗体が固定化されており、また抗体の抗原結合部位である可変領域が基材表面から外へ向かう方向へと配向していると考えられる。これにより、非特異的吸着をより低減した状態で、抗体に結合可能な物質（例えば細胞、タンパク質、核酸等の生体分子）を特異的に吸着することができる。また、、好ましい態様においては表面形成ポリマー中の親水性リンカーが存在しているが故に、基材表面が親水化されており、疎水性部位への非特異的吸着をより低減することができる。よって、本発明の抗体修飾フィルターを用いることにより、サンプル（例えば血液等の体液）中の特定の細胞又は物質を吸着又は除去することができる。
　例えば、抗体として抗制御性T細胞（Treg）抗体を用いることにより、本発明の抗体結合表面修飾基材を制御性T細胞吸着用抗体修飾フィルターとして使用することができる。
　Treg特異的抗体としては、例えばCD25、CCR4等に対する抗体等が挙げられる。
　制御性T細胞吸着用抗体修飾フィルターの具体的な使用形態としては、例えば血液ポンプと、制御性T細胞吸着用抗体修飾フィルターを備えるカラムと、前記血液ポンプと前記カラムとを接続する流路とを含む、制御性Ｔ細胞除去装置として使用する形態が挙げられる。該装置の各部品と具体的な構造は、特に制限されないが、例えばアフェレシス療法に使用される成分分離装置と同様の形態を採ることができる。該装置は、動物の体に連結された状態及び連結されない状態のいずれの状態で使用されてもよい。前記カラムが備える制御性T細胞吸着用抗体修飾フィルターの枚数は、例えば1～20枚、好ましくは4～10枚である。
　以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
　試薬及び方法
　CH3CN、CH2Cl2、DMF、Et2O及びMeOHの無水溶媒は和光純薬工業から購入した。ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル及び石油エーテルは、ナカライテスクから購入した。ピリジンは、使用前にKOHで一晩乾燥した。ラクツロースは、東京化成工業から入手した。和光純薬工業から購入したDowex 50W-X8（H +型）は、MeOHで数回洗浄し、減圧乾燥した。1-アジド-3,6,9-トリオキサウンデカン-11-オールは、参考文献（Chem. Lett., 40, 438-439 (2011).）に従ってを合成した。他の化学物質は、さらに精製することなく使用した。分析用TLCは、シリカゲル60F254（Merck）で被覆したアルミニウムプレート上で行った。シリカゲルカラムクロマトグラフィーは、Teledyne Isco Rf-75 var系で行った。1H NMR及び13C NMRスペクトルは、Bruker DPX400分光計で記録した。高分解能ESIマススペクトルはJeol JMS-T100CS分光計で得た。旋光度は、Jasco p-1010偏光計で測定した。
　合成例
　各化合物を以下のスキームに従って合成した。合成例20で合成した化合物D-1（DS）が、反応ユニット及び集合体形成ポリマーユニット1を有する基材結合ポリマーであり、合成例23で合成した化合物L-3（BS）が、ボロニル基含有ユニット及び集合体形成ポリマーユニット2を有する表面形成ポリマーである。なお、合成例21で合成した化合物L-1（FS）、合成例22で合成した化合物L-2（MS）、及び合成例24で合成した化合物L-4（GS）は、ボロニル基含有ユニットに代えて他のユニットを有する以外は、化合物L-3と同様の構造である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
　合成例1．HCl・H-Aib-OMe (化合物D-3, L-6)
　MeOH（360mL）及びSOCl2（90.0mL）の混合溶液に0℃でH-Aib-OH（36.2g、350mmol）を加え、反応混合物を室温で18時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、残渣をジイソプロピルエーテル及びヘキサンでそれぞれ3回洗浄し、減圧下で乾燥させた。
収量: 54.1 g, 352 mmol (quant.)
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ(ppm) 8.99 (s, 3H, NH2, HCl ), 3.83 (s, 3H, OMe), 1.74 (s, 6H, AibCH3)。
　合成例2．Boc-Leu-Aib-OMe (化合物D-5, L-8)
　最小量の脱水DMFに化合物D-3又はL-6（10.0g、65.1mmol）、及びBoc-Leu-OH（D-4又はL-7）（18.6g、78.1mmol）を溶解した。最小量の脱水DMFに溶解したDCC（20.1g、97.7mmol）とHOBt（13.2g、97.7mmol）との混合溶液をこの順に0℃で添加した。次いで、0℃でTEA（20.0mL、143mmol）を溶液に滴下した。室温で12時間撹拌した後、溶媒を減圧下で除去した。冷却した酢酸エチルを残渣に加え、不溶性化合物を濾過により除去した。この溶液を4重量％のKHSO4水溶液及び飽和NaHCO3水溶液でそれぞれ3回洗浄した。有機相を塩水で脱水し、無水Mg2SO4で乾燥させ、濾過した。溶媒を蒸発させた。残渣をジエチルエーテルで洗浄した。白色粉末が得られた。
収量: 16.3 g, 49.3 mmol (85%)
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ(ppm) 6.62 (s, 1H, AibNH), 4.81 (s, 1H, urethane), 4.03 (s, 1H, LeuCαH), 3.73 (s, 3H, OMe), 1.54-1.24 (m, 18H, tert-butyl, LeuCH2, LeuCH, AibCH3), 0.93 (m, 6H, LeuCH3) 。
　合成例3．HCl・H-Leu-Aib-OMe (化合物D-7, L-9)
　0℃で化合物D-5又はL-8（6.39g、19.3mol）に4N HCl / 1,4-ジオキサン（108mL）を加え、反応混合物を室温で1時間撹拌した。溶媒を留去した後、残渣をジイソプロピルエーテルで洗浄し、減圧乾燥した。白色粉末が得られた。
収量: 4.70 g, 21.4 mmol (91%)
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ(ppm) 8.37 (s, 1H, AibNH), 8.25 (s, 2H, NH2, HCl), 4.32 (s, 1H, LeuCαH), 3.71 (s, 3H, OMe), 1.82 (s, LeuCH2, LeuCH), 1.54 (s, 6H, AibCH3), 1.02-0.98 (m, 6H, AibCH3) 。
　合成例4．Boc-Leu-Aib-OH (化合物D-8, L-10)
　化合物D-5又はL-6（8.01g、24.2mmol）をMeOH（100mL）及び1,4-ジオキサン（100mL）の混合溶液に溶解した。この混合溶液に1N NaOH 水溶液（96.0mL）を0℃で滴下し、反応混合物を7時間撹拌した。1N HCl水溶液を加えて溶液のpHを5に調整した後、溶媒を減圧下で除去した。残渣をCHCl3に溶解し、溶液を4重量％のKHSO4水溶液で3回、塩水で1回洗浄した。有機相を無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発乾固させた。白色の純粋な粉末が得られた。
収量: 6.67 g, 21.1 mmol (87%).
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ(ppm) 6.92 (s, 1H, AibNH), 4.96 (s, 1H, urethane), 4.14 (s, 1H, LeuCαH ), 1.67-1.65 (m, 3H, LeuCH2, LeuCH), 1.58-1.57 (d, 6H, AibCH3), 1.44 (s, 9H, tert-butyl), 0.95-0.93(t, 6H, LeuCH3) 。
　合成例5．Boc-(Leu-Aib) 2 -OMe (化合物D-9, L-11)
　最小量の脱水DMF（30mL）に化合物D-7又はL-9（5.16g、19.3mmol）、及び化合物D-8又はL-10（5.10g、16.1mmol）を溶解した。この混合溶液に、最小量のDMFに溶解したDCC（4.99g、24.2mmol）及びHOBt（3.27g、24.18mmol）を添加した。その後、TEA（4.8mL）を0℃で滴下した。反応混合物を室温で一晩撹拌し、溶媒を減圧下で除去した。残渣を氷冷酢酸エチルに溶解し、不溶物を濾別した。この溶液を4重量％のKHSO4水溶液及び飽和NaHCO3水溶液でそれぞれ3回洗浄した。有機相を塩水で脱水し、無水MgSO4で乾燥させ、濾過し、蒸発させた。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：クロロホルム= 4：1、溶出液）で精製した。白色の純粋な粉末が得られた。
収量: 7.09 g, 13.7 mmol (85%)
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ(ppm) 7.31, 6.99, 6.71 (s, 3H, LeuNH, AibNH), 4.85 (2, 1H, urethane), 4.43 (m, H, LeuCαH), 3.86 (m, H, LeuCH), 3.70 (s, 3H, OMe), 1.55-1.23 (m, 27H, BocCH3, LeuCH2, LeuCH, AibCH3), 0.99-0.87 (m, 12H, LeuCH3) 。
　合成例6．HCl・H-(Leu-Aib) 2 -OMe (化合物D-10, L-12)
　0℃で4N HCl / 1,4-ジオキサン（50mL）を化合物D-9又はL-11（3.12g、6.03mol）に加え、反応混合物を室温で2時間撹拌した。溶媒を留去した後、残渣をジイソプロピルエーテルで洗浄し、減圧乾燥した。白色粉末が得られた。
収量: 2.47 g, 5.31 mmol (90%)
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ(ppm) 8.45 (s, 1H, AibNH), 8.23 (s, 2H, NH2), 4.31 (s, 1H, LeuCαH), 3.71 (s, 3H, OMe), 1.82 (s, LeuCH2, LeuCH), 1.54 (s, 6H, AibCH3), 1.01 (m, 6H, AibCH3) 。
　合成例7．Boc-(Leu-Aib) 2 -OH (化合物D-11, L-13)
　化合物D-9又はL-11（3.25g、6.15mmol）をMeOH（50mL）及び1,4-ジオキサン（50mL）の混合溶液に溶解した。1N NaOH水溶液（48.0mL）を0℃で滴下し、反応混合物を6時間撹拌した。1N HCl水溶液を加えて溶液のpHを5に調整した後、溶媒を減圧下で除去した。残渣をCHCl3に溶解し、溶液を4重量％のKHSO4水溶液で3回、及び塩水で1回洗浄した。有機相を無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発乾固させた。白色の純粋な粉末が得られた。
収量: 2.91 g, 5.65 mmol (92%).
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ(ppm) 7.13 (s, 1H, AibNH), 5.21 (m, 1H, urethane), 4.21 (m, 1H, LeuCαH ), 1.56-1.42 (m, 18H, BocCH3, LeuCH2, LeuCH, AibCH3), 0.93-0.90 (m, 6H, LeuCH3) 。
　合成例8．Boc-(Leu-Aib) 4 -OMe (化合物D-12, L-14)
　最小量の脱水DMF（15mL）に化合物D-10又はL-12（2.47g、5.31mmol）、及び化合物D-11又はL-13（2.91g、5.65mmol）を溶解した。この混合溶液に、最小量のDMFに溶解したCOMU（3.63g、8.48mmol）及びOxyma（1.21g、8.48mmol）を添加した。DIEA（4.8mL）を0℃で滴下した。反応混合物を室温で一晩撹拌し、溶媒を減圧下で除去した。この溶液を4重量％のKHSO4水溶液及び飽和NaHCO3水溶液でそれぞれ3回洗浄した。有機相をブラインで脱水し、無水MgSO4で乾燥させ、濾過し、蒸発させた。残渣を酢酸エチルで洗浄した。白色の純粋な粉末が得られた。
収量: 5.04 g, 5.54 mmol (79%)
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ(ppm) 7.80-6.98 (7H, LeuNH, AibNH), 4.98 (s, 1H, urethane), 4.70, 3.86 (m, 4H, LeuCαH), 3.67 (s, 3H, OMe), 1.88-1.43 (m, 36H, BocCH3, LeuCH2, LeuCH, AibCH3), 1.01-0.84 (m, 24H, LeuCH3) 。
　合成例9．HCl・H-(Leu-Aib) 4 -OMe (化合物D-13, L-15)
　0℃で化合物D-12又はL-14（1.92g、2.12mol）に4N HCl / 1,4-ジオキサン（39mL）を加え、反応混合物を室温で4時間撹拌した。溶媒を留去した後、残渣をジイソプロピルエーテルで洗浄し、減圧乾燥した。白色粉末が得られた。
収量: 1.66 g, 1.96 mmol (92%)
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ(ppm) 8.45 (s, 1H, AibNH), 8.23 (s, 3H, NH2, HCl), 4.31 (s, 1H, LeuCαH), 3.71 (s, 3H, OMe), 1.82 (s, LeuCH2, LeuCH), 1.54 (s, 6H, AibCH3), 1.01 (m, 6H, AibCH3) 。
　合成例10．Boc-(Leu-Aib) 6 -OMe (化合物D-14, L-16)
　最小量の脱水DMF（8mL）に化合物D-13又はL-15（1.42g、1.42mmol）、及び化合物D-11又はL-13（880mg、1.89mmol）を溶解した。この混合溶液に、最小量のDMFに溶解したCOMU（1.01g、2.36mmol）及びOxyma（336mg、2.36mmol）を加えた。DIEA（769μL）を0℃で滴下した。反応混合物を室温で一晩撹拌し、溶媒を減圧下で除去した。この溶液を4重量％のKHSO4水溶液及び飽和NaHCO3水溶液でそれぞれ3回洗浄した。有機相を塩水で脱水し、無水MgSO4で乾燥させ、濾過し、蒸発させた。残留物をLH-20ゲルカラムで精製し、MeOHを溶媒として選択した。白色の純粋な粉末が得られた。
収量: 1.55 g, 1.19 mmol (75%)
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ(ppm) 7.81-7.66 (5H, LeuNH, AibNH), 5.37 (s, 1H, urethane), 4.30-3.87 (m, 6H, LeuCαH), 3.68 (s, 3H, OMe), 1.88~1.28 (m, 54H, BocCH3,
 LeuCH2, LeuCH, AibCH3), 1.05~0.87 (m, 36H, LeuCH3) 。
　合成例11．Moc-Sarcosine-OH (化合物9)
　化合物8（100g、1.12mol）を、1250mLの水及び200gのNaOHを含む溶液に0℃で溶解した。氷浴中で激しく攪拌されている溶液中に、メチルクロロホルメート（200mL）を、滴下速度を制御しながら1時間以上かけて滴下した。混合物を16時間激しく撹拌した。分離した溶液をジエチルエーテルで数回洗浄して、メチルクロロホルムを除去した。水相のpHを2N HCl水溶液で2に調整した。目的化合物をジエチルエーテルで抽出した。溶媒を減圧下で除去した。白色の純粋な化合物が得られた。
収量: 127 g, 0.864 mol (77%)。
　合成例12．Sarcosine-NCA (化合物10)
　化合物9（10g、68.0mmol）をSOCl2（24mL、342mmol）に溶解し、室温で15分間撹拌した。混合物を脱水石油エーテルに加え、残渣を濾過により得た。少し黄色の粉末が得られた。
収量: 1.86 g (23%)。
　合成例13．2,2,2-trifluoro-1-(p-tolyl)ethan-1-one (化合物3)
　化合物2（5.56g、4.0mL、32.5mmol）を脱水ジエチルエーテル（150mL）に溶解した。-40℃のAr雰囲気下で1.6Mのn-BuLi（22mL、35.2mmol）を混合溶液に加えた。 溶液を0℃で3時間撹拌した。1-フルオロアセチルピペリジン（4.24mL、29.2mmol）を-60℃で溶液に滴下した。混合溶液を-60℃で3時間撹拌した。飽和NH4Cl水溶液をクエンチのために溶液に添加し、温度を徐々に室温に調節した。溶液を飽和NH4Cl水溶液及び水でそれぞれ3回で洗浄した。有機相をNa2SO4で乾燥させ、濾過し、溶媒を減圧下で除去した。得られた黄色固体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：ヘキサン= 1：4）で精製した。
収量: 5.47 g, 29.1 mmol (quant.)
1H NMR (400 MHz, CDCl3): 7.97-7.95 (d, 2H, aromatic(m-)), 7.34-7.32 (d, 2H, aromatic(o-)), 2.45 (s, 3H, methyl) 。
　合成例14．(Z)-2,2,2-trifluoro-1-(p-tolyl)ethan-1-one oxime (化合物4)
　化合物3（3.75g、19.93mmol）を脱水エタノール（80mL）に溶解した。NH2OH・HCl（4.15g、59.8mmol）を溶液に加え、Ar雰囲気下、100℃で23時間還流した。溶媒を減圧下で除去した。残渣をCHCl3に溶解し、0.2N HCl水溶液で洗浄して、溶媒を蒸発させた。化合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。クロロホルムを溶離剤として使用した。
収量: 3.55 g, 14.5 mmol (60%)
1H NMR (400 MHz, CDCl3): 10.72, 10.43 (d, 1H, OH), 7.42-7.35 (m, 2H, aromatic(o-)), 7.25-7.17 (m, 2H, aromatic(m-)), 2.36-2.35 (d, 3H, methyl) 。
　合成例15．(Z)-2,2,2-trifluoro-1-(p-tolyl)ethan-1-one O-tosyl oxime (化合物5)
　化合物4（3.55g、14.5mmol）を乾燥ピリジン（65mL）に溶解し、溶液を120℃で15時間還流した。溶媒を減圧下で除去した。残渣をCHCl3に溶解し、1N HCl水溶液で3回液体分離した。疎水性相をMgSO4で乾燥し、蒸発させた。残渣をシリカカラムクロマトグラフィー（CHCl3を溶出液として使用）で精製した。白色の純粋な粉末が得られた。
収量:7.54g (quant.)
1H NMR (400 MHz, CDCl3): 7.90-7.26 (m, 8H, aromatic), 2.48-2.41 (d, 6H, methyl) 。
　合成例16．3-(p-tolyl)-3-(trifluoromethyl)diaziridine (化合物6)
　-78℃で化合物5（2.3g、6.44mmol）を耐圧チューブ内の脱水ジエチルエーテルに溶解した。液体NH3（5mL）を容器に添加した。混合溶液を室温で15時間撹拌した。次いで、NH3を室温（キャップを開けた状態）で静置して除去した。ろ過により白色残渣を除去し、ろ液を蒸発させた。残渣を乾式シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液;クロロホルム：メタノール= 10：1）で精製した。白色固体の純粋な化合物が得られた。
収量:456 mg,  (35%)
1H NMR (400 MHz, CDCl3): 7.83-7.81 (d, 2H, aromatic), 7.33-7.31 (d, 2H, aromatic), 4.78 (s, 2H, NH), 2.44 (s, 3H, methyl) 
19F NMR (400 MHz, CDCl3): 76.12 (s, 3F, CF3) 。
　合成例17．4-(3-(trifluoromethyl)-3H-diazirin-3-yl)benzoic acid (化合物7)
　化合物6（123mg、608μmol）を、密閉反応管（それぞれ3.5mL）中のピリジンと水の混合物に溶解した。KMnO4（385mg、2.43mmol）を溶液に添加し、50℃で24時間撹拌した。溶液のpHを2N H2SO4で2に調整した。色が移植されるまでNa2SO3を溶液に添加した。目的化合物をジエチルエーテルで抽出した。有機相を0.1N NaOHで洗浄して化合物を再抽出し、溶液のpHを2に調整し、化合物を再びジエチルエーテルで再抽出した。溶媒を減圧下で除去した。白色の純粋な化合物が得られた。
収量:74 mg,  (53%)
1H NMR (400 MHz, MeOH-d4): 8.11-8.09 (d, 2H, aromatic), 7.36-7.34 (d, 2H, aromatic)
19F NMR (400 MHz, MeOH-d4): 67.2 (s, 3F, CF3) 。
　合成例18．N-(4-azidobutyl)-4-(3-(trifluoromethyl)-3H-diazirin-3-yl)benzamide (化合物1)
　化合物9（74.0mg、322mmol）を最少量の脱水DMFに溶解した。この混合溶液に、最小量のDMFに溶解したCOMU（804mg、344μmol）及びOxyma（64.4mg、344μmol）を添加した。その後、DIEA（196μL）を0℃で滴下した。反応混合物を室温で一晩撹拌し、溶媒を減圧下で除去した。残渣を含む溶液を1N HCl水溶液及び飽和NaHCO3水溶液でそれぞれ3回洗浄した。有機相を塩水で脱水し、無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、蒸発させた。
収量:65 mg,  (65%)
1H NMR (400 MHz, CDCl3): 7.80-7.78 (d, 2H, aromatic), 7.26-7.24 (d, 2H, aromatic), 6.45 (s, 1H, amide NH), 3.58-3.54 (m, 2H, NHCH2CH2CH2N3), 3.49-3.44 (m, 2H, NHCH2CH2CH2N3), 1.94-1.89 (m, 2H, NHCH2CH2CH2N3) 。
　合成例19．pentynoic acid-Sar 27 -(Leu-Aib) 6 -OMe (化合物D-15)
　化合物D-14（120mg）をTFA（3mL）及びアニソール（300μL）の混合物に溶解した。混合物を室温で2時間撹拌した。溶媒を蒸発させた。残渣をジイソプロピルエーテルで洗浄し、CHCl3に溶解し、飽和NaHCO3水溶液で洗浄した。溶媒を蒸発させ、減圧下で乾燥させた。残留物を脱水ジクロロメタン（2mL）及びDMF（2.5mL）の混合物に溶解した。この溶液に、サルコシンNCA（10）（283mg、μmol）をDMF（1.5mL）に溶解して注入した。Ar雰囲気下で10時間撹拌した後、4-ペンチン酸（69mg、μmol）、COMU（301mg）、Oxyma（100mg）及びDIEA（123μL）を添加した。12時間撹拌した後、溶媒を蒸発させた。残渣をLH-20ゲルカラムクロマトグラフィー（DMF、MeOH）及び透析（30kD）で精製した。重合度は1H NMRにより決定した。白色粉末の純粋な化合物が得られた。サルコシンの重合度はNMRにより測定した。
収量:179 mg,  (%)
1H NMR (400 MHz, MeOH-d4): 7.53-7.00 (m, 12H, amide NH), 4.25-4.01 (m, 60H, Sarcosine N(CH3)CH2CO, LeuCαH), 3.67 (s, 3H, OMe), 3.05-2.95 (m, 81H, Sarcosine N(CH3)CH2CO), 2.62 (s, 2H, CHCCH2CH2CO) 2.51 (s, 2H, CHCCH2CH2CO) ,1.88-1.26 (m, 54H, BocCH3, LeuCH2, LeuCH, AibCH3), 0.94-0.84 (m, 36H, LeuCH3)
IR (Ge-ATR): 2120 cm-1 (alkyne’s peak) 。
　合成例20．Diazirine- Sar 27 -(D-Leu-Aib) 6 -OMe (化合物D-1又はDS)
　化合物D-15（60mg、19.2μmol）及び化合物1（11.9mg、38.1μmol）を2mLのMeOHに溶解した。CuOAc（2.34mg、19.1μmol）を溶液に加え、溶液を24時間撹拌した。化合物をLH-20ゲルカラムクロマトグラフィー（MeOH）で精製した。精製後、三重結合ピーク（約2100cm -1）の消失を調べた。サルコシンの重合度はNMRにより測定した。
収量:64.5 mg, 19.1 μmol (99%)
1H NMR (400 MHz, MeOH-d4): 8.01-7.71 (m, 12H, amide NH), 7.87-7.85 (d, 2H, aromatic), 7.32-7.30 (d, 2H, aromatic), 4.37-4.01 (m, 60H, Sarcosine N(CH3)CH2CO, LeuCαH), 3.62 (s, 3H, OMe), 3.02-2.90 (m, 81H, Sarcosine N(CH3)CH2CO), 2.62 (s, 2H, CHCCH2CH2CO) 2.51 (s, 2H, CHCCH2CH2CO) , 1.88-1.26 (m, 54H, BocCH3, LeuCH2, LeuCH, AibCH3), 0.94-0.84 (m, 36H, LeuCH3)
1F NMR (400 MHz, MeOH-d4): 65.28 (s, 3F, CF3) 。
　合成例21．Fluorescein- Sar 25 -(L-Leu-Aib) 6 -OMe (化合物L-1又はFS)
　化合物L-16（50mg、37.9μmol）をTFA（2mL）及びアニソール（200μL）の混合物に溶解した。混合物を室温で2時間撹拌した。溶媒を蒸発させた。残渣をジイソプロピルエーテルで洗浄し、CHCl3に溶解し、飽和NaHCO3水溶液で洗浄した。溶媒を蒸発させ、減圧下で乾燥させた（46.0mg、37.7μmol、99％）。残渣を脱水ジクロロメタン（1.0mL）及びDMF（1.0mL）の混合物に溶解した。この溶液に、サルコシンNCA（10）（118mg、1.03mmol）をDMF（1.5mL）に溶解して注入した。Ar雰囲気下で10時間撹拌した後、フルオレセインイソチオシアナートを添加した。12時間撹拌した後、溶媒を蒸発させた。残渣をLH-20（MeOH）で精製した。重合度は1H NMRにより決定し、純度はHPLCで分析した。
収量:179 mg, 5.07 μmol。
　また、得られた化合物全体の中で、フルオレセインが結合しているもの（化合物FS）の割合は94％であった。
　合成例22．Maleimide- Sar 25 -(L-Leu-Aib) 6 -OMe (化合物L-2又はMS)
　化合物L-16（50mg、37.9μmol）をTFA（2mL）及びアニソール（200μL）の混合物に溶解した。混合物を室温で2時間撹拌した。溶媒を蒸発させた。残渣をジイソプロピルエーテルで洗浄し、CHCl3に溶解し、飽和NaHCO3水溶液で洗浄した。溶媒を蒸発させ、減圧下で乾燥させた（46.0mg、37.7μmol、99％）。残渣を脱水ジクロロメタン（1.0mL）及びDMF（1.0mL）の混合物に溶解した。この溶液に、サルコシン-NCA（10）（118mg、1.03mmol）をDMF（1.5mL）に溶解して注入した。Ar雰囲気下で10時間撹拌した後、EMCSを添加した。12時間撹拌した後、溶媒を蒸発させた。残渣をLH-20（MeOH）で精製した。重合度は1H NMRにより決定し、純度はHPLCで分析した。
収量:179 mg。
　合成例23．Phenyl Boronic Acid- Sar 25 -(L-Leu-Aib) 6 -OMe (化合物L-3又はBS)
　化合物L-16（50mg、37.9μmol）をTFA（2mL）及びアニソール（200μL）の混合物に溶解した。混合物を室温で2時間撹拌した。溶媒を蒸発させた。残渣をジイソプロピルエーテルで洗浄し、CHCl3に溶解し、飽和NaHCO3水溶液で洗浄した。溶媒を蒸発させ、減圧下で乾燥させた（46.0mg、37.7μmol、99％）。残渣を脱水ジクロロメタン（1.0mL）及びDMF（1.0mL）の混合物に溶解した。この溶液に、サルコシン-NCA（10）（118mg、1.03mmol）をDMF（1.5mL）に溶解して注入した。Ar雰囲気下で10時間撹拌した後、4-カルボキシフェニルボロン酸、COMU、Oxyma及びDIEAを添加した。12時間撹拌した後、溶媒を蒸発させた。残渣をS-X1（DMF）で精製した。重合度は1H NMRにより決定し、純度はHPLCで分析した。白色粉末の純粋な化合物が得られた。
　合成例24．Glycolic acid- Sar 25 -(L-Leu-Aib) 6 -OMe (化合物L-4又はGS)
　化合物L-16（50mg、37.9μmol）をTFA（2mL）及びアニソール（200μL）の混合物に溶解した。混合物を室温で2時間撹拌した。溶媒を蒸発させた。残渣をジイソプロピルエーテルで洗浄し、CHCl3に溶解し、飽和NaHCO3水溶液で洗浄した。溶媒を蒸発させ、減圧下で乾燥させた（46.0mg、37.7μmol、99％）。残渣を脱水ジクロロメタン（1.0mL）及びDMF（1.0mL）の混合物に溶解した。この溶液に、サルコシン-NCA（10）（118mg、1.03mmol）をDMF（1.5mL）に溶解して注入した。Ar雰囲気下で10時間撹拌した後、グリコール酸を添加した。12時間撹拌した後、溶媒を蒸発させた。残渣をS-X1（DMF）で精製した。重合度は1H NMRにより決定し、純度はHPLCで分析した。純粋な化合物は白色粉末であった。
　試験例1．不織布へのシート状集合体の光固定
　ポリプロピレン（PP）不織布へのシート状集合体の光固定化条件について検討を行った。PP不織布に接着したシート状集合体の様子を蛍光顕微鏡で観察するために、蛍光剤を含む化合物FSと化合物DSを用いてシート状集合体を作製し、不織布表面への光固定化の様子を観察した。
　試験例1.1．FS+DS分子集合体の形状確認
　化合物FS＋化合物DSが形成する分子集合体が、目的とするナノシート状となっているのかどうかを確認するため、化合物FS/化合物DS = 1/1 (mol/mol)としたエタノール溶液とMilliQ水を用いて分子集合体を調製した。
　具体的には次の通りである。化合物FS及び化合物DSを、それぞれ1 mg/20 μLの濃度でエタノールに完全に溶解した。化合物FS及び化合物DSの溶液は予め、その全量が20 μLになるように、尚且つ疎水部のLeuのキラリティーがL体のものとD体のものが等モルになるように混合した。こうして作製した化合物のエタノール溶液混合物20 μLを、4 ℃下で撹拌下2 mLのMilliQ水に一気に注入し、その後4 ℃で30分間撹拌したものを分子集合体分散液として使用した。得られた分子集合体について、透過型電子顕微鏡（TEM）により形状観察を行った。結果を図１に示す。
　図１からわかるように、ベシクル状の分子集合体が観察された。
　過去の研究から末端がフルオレセインではなくグリコール酸の場合にはシート状の分子集合体が得られることがわかっているので、構成分子である化合物FSの一部をGSに置換することでナノシート構造の形成を試みた。具体的には、化合物FS/化合物GS/化合物DS = 15/35/50 (mol比)としたエタノール溶液をMilliQ水にインジェクションすることで分子集合体を作製した。得られた分子集合体のTEM像を図２（a）に示す。
　図２（a）から分かるように、FS/GS/DS=15/35/50の分子集合体は水を分散溶媒としたときにシート状の分子集合体を形成することが確認できた。
　エタノール水溶液は水に比べて疎水性が高く、PP不織布に浸透しやすいと考えたため、分散溶媒にエタノール水溶液を用いた場合の分子集合体を作製し、その形状を観察した。TEM像を図２（b）及び（c）に示す。
　図２（b）及び（c）から確認できるようにシート状構造を形成することが確認できた。またエタノール濃度20%以上になると分子集合体を形成しないことも確認した。
　試験例1.2．PP不織布繊維表面へのシート状集合体光固定化の確認
　試験例1.1で作成した分子集合体シート状集合体を用いてPP不織布への光固定化の様子の確認を行った。具体的には以下のようにして光固定化を行った。
　PP不織布の繊維径などを下記表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
PP不織布は、直径6.8 mmに打ち抜いた後、UV/O3親水化処理装置にて8分間処理したものを使用した。
1)  0.5 mg/mLの濃度で調製したシート状集合体分散液を1.5 mLのガラス製バイアル管に入れ、更にそこへ上記特性をもつPP不織布(circle, φ=6.8 mm)を3枚とスターラーチップを入れた。
2)  撹拌下真空ポンプで減圧を行い、気泡の発生が確認できなくなるまで30分ほどの脱気処理を行った。
3)  脱気完了後、室温常圧、撹拌下でキセノンランプ光源により紫外光を10分間照射した。この際の溶液温度は45℃程度であった。
4)  20分間静置し、溶液を室温まで冷却した。
5)  Mobitec社製モビコールカラムに3枚の不織布を同時にセットし、10 mLのMilliQ水を15分間かけてペリスタポンプにより流した。
6)  1-5の操作を必要なだけ繰り返し、シート状集合体をPP不織布に頻回固定化した（1-3回）。
7)  不織布を取り出し3枚まとめて0.02 wt% NaN3水溶液1.5 mLと共に封入し、4 ℃で保存、24 時間以内に測定用サンプルとして使用した。
　得られたシート状集合体光固定化PP不織布の繊維の様子を見るために、蛍光顕微鏡による観察を行った。結果を図３に示す。
　図３から分かるように、シート状集合体が繊維表面に存在することが確認された。
　試験例1.3．PP不織布へのシート状集合体の被覆率
　PP不織布に光固定化したシート状集合体を定量するための実験を行った。図４に示されるように、水中では安定なシート状集合体も非プロトン性極性溶媒であるDMF中では溶出する。こうして溶出した分子（化合物FS）にはフルオレセインが含まれているため、溶出液の蛍光分光測定を行うことでPP不織布表面に固定されたシート状集合体の定量を行った。具体的には以下のようにして行った。
1)  シート状集合体を光固定化したPP不織布を、1.5 mLガラス製バイアル瓶に1枚入れ、そこへDMFを1.000 mL添加し、緩やかに30分間撹拌した。
2)  5.0 mgの化合物FSを500 μLのDMFに溶解し、これを1.0*10-8M前後の任意の割合に希釈して蛍光分光測定を行い、蛍光強度のピークトップで検量線を作成した。
3)  1で調製したDMF溶液を200 μL秤取し、ここにDMFを加えて5倍に希釈し、蛍光分光測定を行い、蛍光強度のピークトップと先程の検量線から溶出したフルオレセインの量を定量した。
4)  合成例21より化合物FSとして用いた分子全体のうちフルオレセインが結合しているものの割合は94%であるので、3で定量したフルオレセインの量を0.94で除することで、溶出したFSの量を定量した。
5)  シート状集合体中に化合物FSは15%含まれていることから、PP不織布全体に光固定化されている分子数を4の値を0.15で除することによって求めた。
6)  シート状集合体中で化合物FS, 化合物GS, 化合物DS一分子が占有する面積は1.96 nm2程度であることから、5の値にこの値を掛けることでシート状集合体が専有する面積を算出した。
7)  表１に示されるPP不織布のデータからφ=6.8 mmの不織布の繊維総表面積を算出し、6で得られた値をこの値で除することでPP不織布表面に対するシート状集合体の被覆率を算出した。なお比表面積については、SEM撮像法によって得られたデータを用いた。
　結果を図５に示す。図５に示されるように、シート状集合体の分散溶媒にエタノール濃度が濃いほどPP不織布表面に対するシート状集合体の被覆率が高く、また、頻回光固定化により被覆率が上昇していることがわかる。被覆率が100%を超えていることについては、シート状集合体の重層が起きていると考えられる。
　この結果から、以下の試験例において、シート状集合体を作製する際の分散溶媒として、エタノール水溶液(10%)を用いることとした。
　試験例2．原子間力顕微鏡(AFM)による繊維表面の観察
　試験例1の実験から繊維表面をシート状集合体で被覆できていることについては確認できた。そこでより詳細な表面の様子を観察するために、PP不織布に試験例1で述べたシート状集合体(10%エタノール水溶液を分散媒に使用)を光固定化した後のPP繊維表面をAFM（Bruker製のMultimodeを使用し、トポロジーと物性の同時測定が可能なPeak Force Tappingモードにて撮像）により観察した。サンプル調製方法や撮像の条件は以下の通りである。
　＜大気中で測定する条件＞
1)  試験例1.2の手順に従ってPP不織布にシート状集合体を光固定化した。このとき、シート状集合体の分散溶液にはエタノール水溶液(10%)を用いた。
2)  精密ピンセットを用いて不織布の様々な場所からできるだけ小さい束になった繊維を取り出した。
3)  サンプルプレートに取り出した繊維を両面テープを用いて固定した。
4)  TipにはBruker製Scanasyst Air -HRを使用し、繊維直上へアプローチした。
5)  スキャン方向は繊維軸方向から90°傾いた方向とし、スキャン周波数は0.3~1.0 Hz、tapping rateは2.0 kHzとした。またサンプル解像度は256*256 pixelとした。
　結果を図６に示す。図６よりシート状集合体未修飾（左）とシート状集合体を光固定化したPP繊維表面（右）で表面の凹凸の様子が異なることがわかる。図６中に赤で示した部分の断面について、二乗平均平方根粗さ(Rq)を算出した。計算結果は図６中に示しているが、それぞれRqの平均値は、シート状集合体未修飾のPP繊維表面では1.2 nm、シート状集合体を1回修飾した表面では0.36 nmであった。このことからシート状集合体の光固定化により表面が滑らかになっていることがわかる。
　続いてシート状集合体を光固定化する前後でのPP不織布繊維の表面の物性を測定した。結果を図７に示す。
　図７の左カラムは表面の高さの変化がある場所を強調するPeakforce errorの画像であるが、(a)UV/O3親水化処理のみのPP繊維表面、(b)1回シート状集合体を光固定化したPP繊維表面の両者を比較すると表面の様子が大きく変化している様子が見て取れる。また吸着力(Adhesion)に着目すると、(d)UV/O3親水化処理のみのPP繊維表面に比べて(e)1回シート状集合体を光固定化したPP繊維表面の方が吸着力は大きく、表面の物性が変化している様子が確認できる。同様にDMT-Modulusについても、シート状集合体の被覆により繊維表面の物性が変化していることが確認できる。なお、a～iはそれぞれ同一箇所を撮像したものである。
　これらの観察からPP不織布の繊維表面がシート状集合体によって被覆され、表面の物性が変化していることが確認できた。
　試験例3．シート状集合体を足場とした抗体固定化
　試験例2までの結果からPP不織布の繊維表面にシート状集合体を光固定化できることが確認できたため、続いてそのシート状集合体を足場に用いて抗マウスCD25抗体の固定化を試みた。足場とするシート状集合体の構成分子には、フルオレセインを含有する分子である化合物FSの代わりに、マレイミドを親水鎖末端に持つ化合物MSおよびフェニルボロン酸を親水鎖末端にもつ化合物BSを用いた。マレイミドとフェニルボロン酸は抗体と結合を作るための官能基である。
　試験例3.1．MS+DS、BS+DSから成る分子集合体の形状確認
　化合物MSと化合物DS、又は化合物BSと化合物DSからなる分子集合体がそれぞれシート構造を形成するかどうかの確認を行った。化合物MS/化合物DS = 1/1 (mol/mol)、および化合物BS/化合物DS = 1/1 (mol/mol)の条件で、試験例1.1の方法に則り、分散溶媒を水、及びエタノール水溶液で分子集合体を調製し、透過型電子顕微鏡（TEM）により形状観察を
行った。結果を図８に示す。
　図８の結果から、化合物MS/化合物DS = 1/1 (mol/mol)と化合物BS/化合物DS = 1/1 (mol/mol)はMilliQ水中、5%エタノール水溶液中、10%エタノール水溶液中のいずれでもシート構造の分子集合体を形成していることが確認できた。
　試験例3.2．分子集合体を足場とした抗体の固定
　試験例3.1で調製したシート状集合体を用いてシート状集合体をPP不織布に光固定化し、その後、抗CD25抗体の固定化を行った。マレイミドをもつ化合物MSを含有するシート状集合体を足場とする際にはマレイミドとの反応点を確保するために、抗体のFc部位のジスルフィド結合を還元した。ボロン酸を官能基としてもつ化合物BSを含有する化合物BSを含有するシート状集合体を足場とする際には、Fc部位に存在する糖鎖とボロン酸とのエステル化反応を使用した。具体的には以下のようにして行った。
　[使用抗体] Affymetrix製 Anti-mouse CD25 (Clone:PC61.5, Isotype: Rat IgG1, purified)
　[使用緩衝液] 20 mM HEPES buffered solution with 0.02 wt% NaN3 (pH=8.2, adjusted by NaOH)。
　＜化合物MS/化合物DSのシート状集合体を足場として抗体を固定する手法＞
1)  試験例3.1の方法を用いてエタノール水溶液(10%)中に分散させた化合物MS/化合物DS = 1:1(mol/mol)のシート状集合体をPP不織布に固定した。光固定化回数は2回とした。
2)  1.5 mLのバイアル瓶に500 μLのHEPES緩衝液、42 μLのTris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride sodium (TCEP)溶液(0.5 M, pH = 7.0)、 0.5 mg/mLの抗マウスCD25抗体を60 μL 混合し、37 ℃で90分間反応させて、ジスルフィド結合を還元した。
3)  2の溶液に1で調製した不織布サンプルを3枚浸漬し、室温で90分間穏やかに撹拌しながら脱気した。
4)  Mobitec社製モビコールカラムに3枚の不織布を同時にセットし、2 mLのMilliQ水を3分間かけてペリスタポンプにより流し、固定されていない抗体や緩衝液の除去を行った。5)  96穴プレートに300 μLの2% BSA/PBS溶液を入れ、そこに4で洗浄した不織布サンプルを1枚ずつ入れ、30分間室温で振盪した。
6)  0.02 wt% triton/PBSで余分に接着したBSAを除去した。
7)  1.5 mLのスクリューチューブに1.5 mLの20 mM HEPES緩衝液を入れ、4 ℃で保存し、24時間以内に測定を行った。
　＜化合物BS/化合物DSのシート状集合体を足場として抗体を固定する手法＞
1)  試験例3.1の方法を用いてエタノール水溶液(10%)中に分散させた化合物BS/化合物DS = 1:1(mol/mol)のシート状集合体をPP不織布に固定した。光固定化回数は2回とした。
2)  1.5 mLのバイアル瓶に502 μLのHEPES緩衝液、 0.5 mg/mLの抗マウスCD25抗体を60 μL 混合し、ここへ1で調製した不織布サンプルを3枚浸漬し、4 ℃で12時間静かに撹拌した。
3)  Mobitec社製モビコールカラムに3枚の不織布を同時にセットし、2 mLのMilliQ水を3分間かけてペリスタポンプにより流し、固定されていない抗体や緩衝液の除去を行った。4)  96穴プレートに300 μLの2% BSA/PBS溶液を入れ、そこに4で洗浄した不織布サンプルを1枚ずつ入れ、30分間室温で振盪した。
5)  0.02 wt% triton/PBSで余分に接着したBSAを除去した。
6)  1.5 mLのスクリューチューブに1.5 mLの20 mM HEPES緩衝液を入れ、4 ℃で保存し、24時間以内に測定を行った。
　化合物BS/化合物DSのシート状集合体を光固定化した後と、その後抗体を固定化した後のPP繊維表面の様子を、MilliQ水中でAFM（Bruker製のMultimodeを使用し、トポロジーと物性の同時測定が可能なPeak Force Tappingモードにて撮像）により観察した。サンプル調製方法や撮像の条件は以下の通りである。
　＜水中で測定する条件＞
1)  試験例1.2の条件に従ってPP不織布にシート状集合体を光固定化した。この時シート状集合体の分散溶液にはエタノール水溶液(10%)を用いた。
2)  精密ピンセットを用いて不織布の様々な場所からできるだけ小さい束になった繊維を取り出した。
3)  サンプルプレートに二液混合系エポキシ接着剤（5分硬化型）をできるだけ薄く塗布し、塗布から3分後に抜き出した繊維を固定した。
4)  TipにはBruker製ScanAsyst Fluidを使用し、繊維直上へアプローチした。
5)  液中測定モジュールを利用し、MilliQ水中で測定を行った。スキャン方向は繊維軸方向から90°傾いた方向とし、スキャン周波数は0.3~1.0 Hz、tapping rateは1.0 kHzとした。またサンプル解像度は256*256 pixelとした。
　結果を図９に示す。図９の結果から、抗体の修飾によって表面の凹凸が変化していることが分かった。
　試験例3.3．固定した抗体量の定量
　試験例3.2で固定した抗体量を間接ELISA法により定量し、BS/DS、MS/DSのシート状集合体の光固定化回数を変化させたときの抗体固定量を比較した。またネガティブコントロールとして、抗体を固定していないGS/DSのシート状集合体を固定化した。具体的には以下
のようにして行った。
　ELISA法にはF(ab’)2部位を認識するPeroxidase標識の二次抗体を用いた。OPDを基質として用いて反応させることにより、紫外吸収強度から抗体固定量を求める間接法を用いた。
　不織布に固定されている抗体の量が非常に多いため、一般的に使われる二次抗体の濃度ではHRPによる反応が高速すぎ、測定できなかった。その為同じクローンから作られたHRP標識なしの二次抗体を用いて、HRP標識された二次抗体を“希釈”した。以下にプロトコルを示す。
　[使用抗体]
(a)  岩井化学薬品株式会社製　Anti-Rat IgG F(ab’)2 Fragment Specific Antibody HRP conjugated (1.0 mg/mL) (212-035-106)
(b)  岩井化学薬品株式会社製　Anti-Rat IgG F(ab’)2 Fragment Specific Antibody (1.7 mg/mL)。
　＜ELISAプロトコル＞
1)  HRP標識ありの二次抗体を0.3 μL、標識なしの二次抗体を70.32 μL、Citrate Phosphate Buffer (CPB)を46.68 μL混合し、二次抗体溶液とした。（このとき不織布1枚あたり10 μgの二次抗体が添加するつもりで濃度調製を行った。(氷冷で保管)
2)  96穴プレートに不織布サンプルを1枚ずつ入れ、CPBを90 μL加え、そこに1で調製した二次抗体溶液を10 μL添加し、室温で30 min反応させた。
3)  0.02 wt% triton/PBSで余分に接着したBSAを除去した。
4)  別の容器にOPD 42.0 mgをCPB 14.0 mLに溶解して、ここにH2O2 (35%)を21 μL添加し撹拌した。
5)  96穴プレートに1で作製した溶液を2, 4, 8,…1024倍にCPBを用いて希釈した溶液を50 μLずつ作製した。
6)  1.5 mLのガラス製バイアルに不織布サンプルを1枚入れ、そこに4で作製した溶液を1.0 mL加え、室温で25分間静かに撹拌した。同時に5で作製した濃度の異なる抗体溶液それぞれに、4の溶液を50 μLずつ添加し25分間室温で振盪した。
7)  2NのH2SO4を1.5 mLバイアル瓶には0.5 mL、96穴プレートには50 μLそれぞれ加えた。
8)  7の後即座にプレートリーダーで492 nmの吸光度を計測した。620 nmでの吸光度をblankとした。
9)  検量線を作成し、不織布についている抗体量を同定した。
　結果を図１０に示す。図１０の縦軸について、二次抗体に抗CD25抗体のF(ab’)2部位を認識する抗体を用いているため、縦軸は抗体固定量と価数の積、即ち固定されている抗原認識部位の数に比例すると考えられる。結果からまず化合物BS/化合物DSのシート状集合体を足場として抗体を固定した場合、4μｇ/枚（BET多点法からは3.92 mg/m2）という非常に高い密度で抗体を固定化できていることを確認した。また化合物GS/化合物DSのシート状集合体による被覆のみで抗CD25抗体を固定化していない不織布については、抗体がほとんどついていないことを示す結果となっており、ELISA法による測定が正確に行われていることを示している。
　一方シート状集合体の光固定化回数では有意差が見られず、これは図５で1回目の光固定化で表面の100%以上がシート状集合体で被覆されているという結果と矛盾しない。
　試験例4．PP不織布に固定した抗体による制御性T細胞（Treg）の選択的除去
　試験例3で作製した足場とするシート状集合体が異なる抗体固定化PP不織布を用いて、Treg除去能の違いについて評価を行った。評価に際しては、抗体固定化PP不織布にマウスの脾細胞を流すことで、脾細胞中からTregがどれだけ特異的に除去されているかどうかを調べた。具体的には以下のようにして行った。
　マウスの脾細胞にはTregが全細胞中の10%程度存在する。Treg以外のリンパ球の吸着も確認することで、抗体固定化PP不織布の非特異的接着を評価した。なお、リンパ球はCD3にて、TregはCD3+CD4+CD25+Foxp3+にて判断した。
　[使用機器]
BD Biosences製BD LSRFORTESSA X-20。
1)  6-8週齢, BALB/c マウス(white, メス)から脾臓を取り出し、脾細胞を採取した。
2)  溶血剤（1x RSC Lysis Buffer Solution, eBiosence）を用いて製造元のプロトールに従い、溶血した
3)  40 μmのフィルターに通し、塊状物の除去を行った。
4)  10の懸濁液の一部(10 μL)を取り、Trypan Blueで1:1染色し、血球計算盤で細胞密度のカウントを行った。
5)  11で行ったカウントに基づいて2×107細胞/5 mLになるようにRPMI培地で希釈を行った。
6)  12の溶液を5 mLずつ取り分けた。残った溶液は流す前の細胞組成をチェックするためのサンプルとして、2% FBS入PBS(FACS Buffer)に置換した後、氷上で保管した。
7)  Mobitec社製モビコールカラムに任意の枚数の抗体固定化PP不織布をセットし、10 mLの生理食塩水を15分間かけてシリンジポンプを用いて流した。
8)  滅菌済み10 mLシリンジに細胞懸濁液5 mLを取り込み、抗体固定化PP不織布をセットしたカラムとエキステンションチューブを用いて接続した。
9)  12 mL/hの流速で細胞懸濁液を5 mLシリンジポンプを用いてカラムに通した。流出した懸濁液は回収した。
10)  フロー終了後、溶出液の量と細胞密度を測定し、流出した細胞数を計算した。
11)  フロー後の細胞を4 ℃, 300 Gで5分間遠心し、FACS Bufferに置換した。
12) 1×106 cellsになるようにフロー後の懸濁液とフロー前の懸濁液を入れ、4 ℃, 300 Gで5分間遠心沈降させた。
13)  AF700, BV510, BV711, PEが結合した抗CD3, CD8, CD4, CD25抗体および、Fixible Viability dye eFlour 780を用いて、製造元のプロトールに従い染色した。
14)  染色後の細胞をeBiosence製Foxp3 stating buffer set
および、PECy7結合抗Foxp3抗体を用いて、製造元のプロトールに従い細胞内のFoxP3を染色した。
15)  染色後の細胞を懸濁しフローサイトメーターで解析を行った。
　結果を図１１に示す。図１１の結果から化合物BS/化合物DSのシート状集合体を足場として抗CD25抗体を固定した場合に、最もTregの除去率が高く、その除去率は90％を超えることがわかった。またその時のその他の細胞の非特異的接着率は20％を優に下回り、Tregの特異的除去が実現できていることが確認できた。
　化合物MS/化合物DSのシート状集合体を足場として抗CD25抗体を固定した場合では、Tregの除去率は65％程度とある程度の値を示しているものの、非特異的接着も大きいことがわかる。この原因には2つの理由が考えられる。
　化合物GS/化合物DSのシート状集合体で被覆して、抗体を固定していないPP不織布については、Tregとリンパ球共に低い除去率にとどまっていることがわかる。非常に高い密度の親水性サルコシンポリマーブラシを表面にもつシート状集合体によって、高い疎水性を持つPP不織布表面が被覆されたために、細胞の非特異的な接着が抑制されていると考えられる。
　続いて、化合物BS/化合物DSのシート状集合体を足場として抗CD25抗体を固定化したPP不織布をさらに多い枚数積層すると、Tregの除去率が上がるのか検討した。結果を図１２に示す。図１２から分かるように、積層枚数を9枚以上にするとTregの除去率が95％程度
まで向上することが確認できた。さらに注目すべきは、積層枚数を増やしてもTreg以外の細胞の非特異的な除去率が上昇していないことである。先程述べたようにシート状集合体で被覆された表面は細胞の非特異的な接着が極めて起こりにくいことがあらためて確認できた。
　試験例5．Treg除去後のPP不織布の観察
　Tregを除去した後のPP不織布を走査型電子顕微鏡（SEM）にて観察した。結果を図１３に示す。
　図１３から分かるように、5枚目程度まではTregと思われる細胞の接着が確認できる。しかし7枚目以降は細胞と思われるものの接着はあまり確認できない。これは図１２の結果より、抗体固定化PP不織布は6枚で90%のTregを除去できていること、9枚積層しても非特異的な接着は15%程度であることなどの結果とも一致する。

Claims (13)

  1. 反応ユニット及び集合体形成ポリマーユニット1を有する基材結合ポリマー、並びにボロニル基含有ユニット及び集合体形成ポリマーユニット2を有する表面形成ポリマーを含む、集合体。
  2. 前記集合体形成ポリマーユニット1及び前記集合体形成ポリマーユニット2が共にステレオコンプレックスを形成している、請求項１に記載の集合体。
  3. シート状である、請求項１又は２に記載の集合体。
  4. 請求項１～３のいずれかに記載の集合体が基材の表面に結合してなる、表面修飾基材。
  5. 前記基材が繊維質材料である、請求項４に記載の表面修飾基材。
  6. 前記疎水性基材がポリプロピレンである、請求項４又は５に記載の表面修飾基材。
  7. 請求項４～６のいずれかに記載の表面修飾基材と抗体とが結合してなる、抗体結合表面修飾基材。
  8. 前記抗体が抗制御性T細胞抗体である、請求項７に記載の抗体結合表面修飾基材。
  9. 請求項７又は８に記載の抗体結合表面修飾基材を含む、抗体修飾フィルター。
  10. 制御性T細胞吸着用である、請求項９に記載の抗体修飾フィルター。
  11. 反応ユニット及び集合体形成ポリマーユニット1を有する基材結合ポリマー、並びにボロニル基含有ユニット及び集合体形成ポリマーユニット2を有する表面形成ポリマーを混合する工程を含む、集合体の製造方法。
  12. 反応ユニット及び集合体形成ポリマーユニット1を有する基材結合ポリマー、ボロニル基含有ユニット及び集合体形成ポリマーユニット2を有する表面形成ポリマー、並びに基材を混合し、光を照射する工程を含む、表面修飾基材の製造方法。
  13. 血液ポンプと、請求項１０に記載の抗体修飾フィルターを備えるカラムと、前記血液ポンプと前記カラムとを接続する流路とを含む制御性Ｔ細胞除去装置。
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