CN108623802B - 一种功能性聚氨基酸衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医用材料领域，涉及一种功能性聚氨基酸衍生物及其制备方法和应用。功能性聚氨基酸衍生物含有式Ⅰ的结构，R1为含有M基团的取代基，M基团为：R′‑苯基、C2‑C20的直链烷基、C3‑C60的支链烷基、联苯基、R″‑联苯基、疏水性荧光染料分子及其衍生物的脱氢基团、疏水性生物活性分子及其衍生物的脱氢基团及含有多个环状结构的直链或支链烷基中的至少一种，R′为C2‑C20的直链烷基或C3‑C60的支链烷基，R″为C1‑C20的直链烷基或C3‑C60的支链烷基，n＞0。本发明聚氨基酸衍生物在烷基化修饰下或活性氧物质作用下可实现高级结构和功能的转变，用作生物传感、药物递送、疾病诊断或治疗。
Figure DDA0001653034400000011

Description

一种功能性聚氨基酸衍生物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医用材料技术领域，尤其涉及一种功能性聚氨基酸衍生物及其制备方法和应用。
背景技术
在自然界，蛋白质等生物大分子能够折叠成不同的三维结构，多肽链段二级构象的形成和精确折叠可以指导蛋白质的自组装过程，从而调控其生物性能。而多肽构象的异常变化则会导致蛋白质错误折叠，进而引起各种“蛋白质构象病”。此外，生物体内存在的大多数抗菌蛋白或多肽都含有两亲性的二级构象，有利于其与微生物细胞膜相互作用。由此可见，蛋白质和多肽的二级构象在维持其结构和执行生理功能过程中扮演举足轻重的角色。对蛋白质和多肽折叠行为和高级自组装结构的探索已成为生命科学领域、材料学领域和生物医学领域的重要研究方向。
聚氨基酸具有良好的生物相容性、生物降解性，其多种多样的活性侧基反应位点为得到性能可控的功能材料提供了充分的可能性。而且可以通过侧基修饰引入不同的基团来调节分子的亲疏水性和电荷密度，进而调控自组装过程。除此之外，与传统高分子材料相比，聚氨基酸具有更高级的有序的二级结构(如α螺旋，β折叠，β转角等)，还可通过氢键、π-π共轭和静电相互作用形成有趣的高级自组装仿生结构，这为其在生物医用材料领域的应用提供了优势。
近30年来，聚氨基酸的自组装研究引起了广大研究者的兴趣，并且取得了重要的研究进展。然而，大多数文献报道主要关注氨基酸的合成、药物和基因靶向传输效率和安全性等，而对其高级组装结构和功能化的研究相对较少。近年来，受蛋白质多级结构的启发，已有科学家开始关注聚氨基酸二级构象对自组装结构和功能的影响。现有研究已经证明聚氨基酸的二级构象对其自组装行为以及生物学性能具有重要影响。很多文献通过使用构象成核模板、主链氢键替代、侧链盐桥、化学交联和金属离子鳌合等来实现聚氨基酸构象的稳定和调控，但这些方法需要设计特定序列的短肽，化学合成过程冗长复杂，且不适应于通过聚合反应制备的多肽。此外，现有的聚氨基酸衍生物大多数缺乏功能性，因此对聚氨基酸高级结构和功能的有序调控成为高分子领域的难点问题。
发明内容
针对上述问题，本申请提供一种功能性聚氨基酸衍生物，所得聚氨基酸衍生物能够在烷基化修饰或活性氧作用下使其高级结构和功能发生变化，进而使其在自组装、生物传感、药物递送、疾病诊断及治疗等领域具有较好的应用潜力。
本发明的技术方案：
本发明要解决的第一个技术问题是提供一种功能性聚氨基酸衍生物，其含有如式Ⅰ所示的结构：
Figure BDA0001653034380000021
其中，所述R1为含有M基团的取代基，所述M基团为：R′-苯基、C2-C20的直链烷基、C3-C60的支链烷基、联苯基、R″-联苯基、含有多个环状结构的直链或支链烷基、疏水性荧光染料分子及其衍生物的脱氢基团或疏水性生物活性分子及其衍生物的脱氢基团中的至少一种，其中，R′为C2-C20的直链烷基或C3-C60的支链烷基，R″为C1-C20的直链烷基或C3-C60的支链烷基，n＞0。
进一步，R1中，所述疏水性荧光染料分子及其衍生物的脱氢基团选自：尼罗红及其衍生物脱氢基团、异硫氰酸荧光素及其衍生物脱氢基团、花青素类荧光染料及其脱氢基团、芘及其衍生物脱氢基团、具有聚集诱导发光效应的分子的脱氢基团、苝及其衍生物脱氢基团或亲脂性羰花青染料及其衍生物脱氢基团；所述疏水性生物活性分子及其衍生物的脱氢基团选自：阿霉素及其衍生物脱氢基团、紫杉醇及其衍生物的脱氢基团、喜树碱及其衍生物脱氢基团、环丙沙星及其衍生物脱氢基团或植物销氨醇衍生物及其脱氢基团；所述含有多个环状结构的直链或支链烷基选自：偶氮苯基、萘基、R″-萘基、菲基、R″-菲基、精蒽基、R″-精蒽基、荧蒽基、R″-荧蒽基、屈基、R″-屈基、芴基、R″-芴基、苊基或R″-苊基；R″为C1-C20的直链烷基或C3-C60的支链烷基。
优选的，R1中的M基团选自下述结构式中的一种：
Figure BDA0001653034380000031
Figure BDA0001653034380000041
进一步，式Ⅰ中，n(聚合度)≧5；优选的：10≤n≤100，更优选的：10≤n≤50。
进一步，所述功能性聚氨基酸衍生物的结构式如式Ⅱ所示：
Figure BDA0001653034380000042
其中，R2选自带氨基的小分子残基或聚合物取代基。
进一步，R2选自：带有乙烯基/炔基/叠氮基(其中“/”表示“或”)的C1-C20的直链烷基、带有乙烯基/炔基/叠氮基的C3-C60的支链烷基、C1-C20的直链烷基、C3-C60的支链烷基、甲氧基聚乙二醇胺脱氨基基团、聚赖氨酸脱氨基基团、聚谷氨酸脱氨基基团或聚天冬氨酸脱氨基基团中的一种；优选为甲氧基聚乙二醇胺脱氨基基团、炔丙基、叠氮丙基或聚赖氨酸脱氨基基团。
进一步，所述功能性聚氨基酸衍生物在烷基化修饰和活性氧作用下其功能和高级结构能够发生有序转变，并且始终保持有序的高级结构。即式Ⅰ所示的功能性聚氨基酸衍生物能够与活性氧物质(如超氧阴离子、过氧化氢、羟自由基等)或烷基化试剂(如碘甲烷、2-溴甲基吡啶盐酸盐、2,3-环氧丙基三甲基氯化铵等)发生化学作用，从而使其高级结构(如α螺旋，β折叠等)和功能发生变化，且始终为有序的高级结构。
本发明要解决的第二个技术问题是提供上述功能性聚氨基酸衍生物的制备方法，所述方法为：用R1对半胱氨酸进行修饰，然后在引发剂的作用下通过开环聚合得到式Ⅰ所示的功能性聚氨基酸衍生物。
进一步，所述引发剂为R2-NH2，其中，R2选自带氨基的小分子残基或聚合物取代基。
进一步，所述引发剂中的R2选自：带有乙烯基/炔基/叠氮基的C1-C20的直链烷基、带有乙烯基/炔基/叠氮基的C3-C60的支链烷基、C1-C20的直链烷基、C3-C60的支链烷基、甲氧基聚乙二醇胺脱氨基基团、聚赖氨酸脱氨基基团、聚谷氨酸脱氨基基团或聚天冬氨酸脱氨基基团中的一种；优选为甲氧基聚乙二醇胺脱氨基基团、炔丙基、叠氮丙基或聚赖氨酸脱氨基基团。
优选的，所述引发剂为甲氧基聚乙二醇胺、炔丙胺、叠氮丙胺或聚赖氨酸。
进一步，上述功能性聚氨基酸衍生物的制备方法采用下述任意一种方法：
方法一：以半胱氨酸-R1为单体合成R1修饰的半胱氨酸-N-羧基环内酸酐，然后以R2-NH2为引发剂引发R1修饰的半胱氨酸-N-羧基环内酸酐中的N-羧基环内酸酐(NCA)发生开环聚合反应，得到式Ⅰ所示的功能性聚氨基酸衍生物；其中，R1选自含有M基团的取代基，M基团为：R′-苯基、C2-C20的直链烷基、C3-C60的支链烷基、联苯基、R″-联苯基、含有多个环状结构的直链或支链烷基、疏水性荧光染料分子及其衍生物的脱氢基团或疏水性生物活性分子及其衍生物的脱氢基团中的至少一种，R′为C2-C20的直链烷基或C3-C60的支链烷基，R″为C1-C20的直链烷基或C3-C60的支链烷基；R2选自带氨基的小分子残基或聚合物取代基；单体半胱氨酸-R1的结构式如式Ⅲ所示：
Figure BDA0001653034380000051
或：
方法二：以半胱氨酸为单体，合成半胱氨酸-N-羧基环内酸酐，然后以R2-NH2为引发剂引发半胱氨酸-N-羧基环内酸酐中的N-羧基环内酸酐(NCA)发生开环聚合反应得到聚半胱氨酸，再利用R1-X对聚半胱氨酸侧链进行修饰，得到式Ⅰ所示的功能性聚氨基酸衍生物；其中，R1选自含有M基团的取代基，M基团为：R′-苯基、C2-C20的直链烷基、C3-C60的支链烷基、联苯基、R″-联苯基、含有多个环状结构的直链或支链烷基、疏水性荧光染料分子及其衍生物的脱氢基团或疏水性生物活性分子及其衍生物的脱氢基团中的中的至少一种，R′为C2-C20的直链烷基或C3-C60的支链烷基，R″为C1-C20的直链烷基或C3-C60的支链烷基；R2选自带氨基的小分子残基或聚合物取代基；X为卤素或-CH＝CH2；即X为F、Cl、Br或I，优选为Br。
进一步，上述方法一中，所述开环聚合反应中，R2-NH2与R1修饰的半胱氨酸-N-羧基环内酸酐中N-羧基环内酸酐的摩尔比≦1/5，优选为1/100～1/10，更优选为1/50～1/10。
进一步，上述方法二中，所述开环聚合反应中，R2-NH2与胱氨酸-N-羧基环内酸酐中的N-羧基环内酸酐的摩尔比≦1/5，优选为1/100～1/10，更优选为1/50～1/10。
进一步，上述方法一和方法二中，所述开环聚合反应中，反应温度为30～70℃(优选为35℃)，反应时间为12h～80h，优选为24h～72h，更优选为72h。
进一步，上述方法一中，所述半胱氨酸-R1单体按照以下任意一种方法制得：方法1)R1-X与半胱氨酸上的巯基发生亲核取代反应得到；其中，X为卤素，即F、Cl、Br或I，优选为Br；方法2)R1-X与半胱氨酸上的巯基发生加成反应得到；其中，X为-CH＝CH2。
本发明要解决的第三个技术问题是指出：式Ⅰ所示的功能性聚氨基酸衍生物能够用于自组装体、生物传感、药物递送、疾病诊断或治疗中。
进一步，式Ⅰ中，当R1为R′-苯基、C2-C20的直链烷基、C3-C60的支链烷基、联苯基、R″-联苯基、含有多个环状结构的直链或支链烷基的至少一种时，所述功能性聚氨基酸衍生物可用于药物递送；当R1为疏水性生物活性分子及其衍生物的脱氢基团时，所述功能性聚氨基酸衍生物用于生物传感、药物递送、疾病治疗等；当R1为疏水性荧光染料分子及其衍生物的脱氢基团时，所述功能性聚氨基酸衍生物用于生物传感、药物递送、疾病诊断等。
进一步，式Ⅰ所示的功能性聚氨基酸衍生物在用作自组装体、生物传感、药物递送或疾病诊断中的整个作用过程中，能够始终保持有序的高级结构(如α螺旋，β折叠等)。
本发明要解决的第四个技术问题是提供一种功能性聚氨基酸衍生物自组装体，其由式I所示的功能性聚氨基酸衍生物通过溶剂置换法得到功能性聚氨基酸衍生物自组装体。
本发明的有益效果：
与现有技术相比，本发明提供的式Ⅰ所示的功能性聚氨基酸衍生物能够与烷基化试剂进行化学反应使其高级结构(如二级构象)发生转变，同时所得功能性聚氨基酸衍生物还能够在活性氧物质存在下通过半胱氨酸上硫醚键的氧化使其结构发生变化。此外，所得功能性聚氨基酸衍生物具有高级结构，并且其高级结构和功能在烷基化修饰或活性氧物质作用下能够发生有序转变。由于烷基化修饰比较简单，活性氧物质在很多病灶区域都存在，因此本发明提供的功能性聚氨基酸衍生物在生物医疗领域具有广阔的应用前景。另外，不同于现有氨基酸聚合物高级结构和功能调控技术，本发明所提供的功能性聚氨基酸衍生物的高级结构和功能调控的手段比较简单，而且本发明提供的功能性聚氨基酸衍生物中的R1可以为含有多个环状结构的直链或支链烷基、疏水性荧光染料、疏水性生物活性分子；因此，本发明所提供的功能性聚氨基酸衍生物在自组装、生物传感、药物传递、疾病诊断和治疗等方面具有巨大的应用潜力。
附图说明
图1为实施例2中所得自组装体聚乙二醇-聚半胱氨酸-喜树碱的透射电镜照片。
图2为实施例3中所得自组装体的透射电镜照片。
图3为实施例2所得自组装体的圆二色谱图。
图4为实施例3所得自组装体的圆二色谱图。
图5为实施例5所得自组装体的圆二色谱图：其中，图5a为聚赖氨酸-聚半胱氨酸-十六烷基苯自组装体圆二色谱图，图5b为烷基化修饰的聚赖氨酸-聚半胱氨酸-十六烷基苯自组装体的圆二色谱图。
图6为实施例13中体外抗肿瘤抑制实验所得的结果图：其中，图6中的a为聚乙二醇-聚半胱氨酸-喜树碱自组装体的结果图、图6中b为自由喜树碱(CPT)的结果图、图6中c为聚乙二醇-聚半胱氨酸-喜树碱氧化自组装体的结果图；每组图中从左至右依次为a、b、c。
图7为实施例12中入胞性能研究的激光共聚焦照片：其中，图7A为实施例2所得自组装体的结果图，图7B为实施例3所得自组装体的结果图，图7C为实施例5所得聚赖氨酸-聚半胱氨酸-十六烷基苯自组装体的结果图，图7D为实施例5所得的烷基化修饰的聚赖氨酸-聚半胱氨酸-十六烷基苯自组装体的结果图；DAPI标记细胞核。
具体实施方式
本发明要解决的第一个技术问题是提供一种功能性聚氨基酸衍生物，其结构式如式Ⅰ所示：
Figure BDA0001653034380000071
其中，所述R1为含有M基团的取代基，所述M基团为：R′-苯基、C2-C20的直链烷基、C3-C60的支链烷基、联苯基、R″-联苯基、疏水性荧光染料分子及其衍生物的脱氢基团、疏水性生物活性分子及其衍生物的脱氢基团以及含有多个环状结构的直链或支链烷基中的至少一种，其中，R′为C2-C20的直链烷基或C3-C60的支链烷基，R″为C1-C20的直链烷基或C3-C60的支链烷基，n＞0。
本发明提供了一种功能性聚氨基酸衍生物，本发明创造性地采用所述的R1基团对半胱氨酸进行修饰，所得聚氨基酸衍生物实现了在烷基化修饰或活性氧物质作用下，其功能和高级结构能够发生有序转变，并且始终保持为有序的高级结构。
本发明中，R1可以为R′-苯基、C2-C20的直链烷基或C3-C60的支链烷基、联苯基、R″-联苯基以及含有多个环状结构的直链或支链烷基的至少一种，R′为C2-C20的直链烷基或C3-C60的支链烷基，R″为C1-C20的直链烷基或C3-C60的支链烷基，这样的目的是将该功能性聚氨基酸衍生物用于药物递送时，有利于聚氨基酸药物载体的自组装和运载药物的稳定性。R1也可以为具有刚性结构的生物活性的生物小分子及其衍生物的脱氢基团，如具有刚性结构的生物活性的生物小分子及其衍生物可以为具有刚性结构的小分子药物，其包括但不限于紫杉醇、阿霉素和喜树碱类药物，这样的目的是不仅可以将该功能性聚氨基酸衍生物用于药物递送，还可以用于生物传感、疾病治疗。R1还可以是具有刚性结构的荧光染料的脱氢基团，即一些近红外荧光分子及其衍生物的脱氢基团或具有聚集诱导效应的分子的脱氢基团，近红外荧光分子及其衍生物如异硫氰酸染料(FITC)、尼罗红、花青素类荧光染料等，这样的目的是可以将该功能性聚氨基酸衍生物用于药物递送、生物传感、疾病的检测或诊断。
本发明利用所述的R1基团对半胱氨酸进行修饰，然后在引发剂的作用下通过开环聚合得到式Ⅰ所示的功能性聚氨基酸衍生物，此功能性聚氨基酸衍生物侧链含有硫醚键，能够在烷基化修饰或活性氧作用下使其结构发生变化，进而使其功能和高级结构发生有序转变。
具体的，所述功能性聚氨基酸衍生物可采用下述两种方法中的任意一种：
方法一：以半胱氨酸-R1为单体，利用如Fuchs-Farthing法、Curtius法或Leuchs等方法合成R1修饰的半胱氨酸-N-羧基环内酸酐，然后以R2-NH2为引发剂引发N-羧基环内酸酐发生开环聚合反应，得到式Ⅰ所示的功能性聚氨基酸衍生物；
方法二：以半胱氨酸为单体，利用Fuchs-Farthing法、Curtius法或Leuchs等方法合成半胱氨酸-N-羧基环内酸酐，然后以R1-NH2为引发剂引发半胱氨酸-N-羧基环内酸酐中N-羧基环内酸酐发生开环聚合反应得到聚半胱氨酸，再利用R1-X对聚半胱氨酸侧链进行修饰，得到式Ⅰ所示的功能性聚氨基酸衍生物。
本发明制备了一种功能性聚氨基酸衍生物，该功能性聚氨基酸衍生物在用作自组装体、生物传感、药物递送或疾病诊断中的整个作用过程中，能够始终保持有序的高级结构(如α螺旋，β折叠等)；并且在烷基化修饰或活性氧作用下能够使其高级结构和功能发生有序转变，从而使其具有较好的生物学性能；而且本发明提供的功能性聚氨基酸衍生物中的R1可以为含有多个环状结构的直链或支链烷基、疏水性荧光染料、疏水性生物活性分子；因此，本发明有望提供一个在自组装体、生物传感、药物递送、疾病诊断或治疗等领域有较好应用前景的仿生纳米材料。
为了进一步理解本申请，下面结合实施例对本申请提供的功能性聚氨基酸衍生物及其制备方法进行具体描述。
本发明实施例对所述的R2-NH2的来源没有特殊限制，优选为甲氧基聚乙二醇胺、炔丙胺、叠氮丙胺、聚赖氨酸。
本发明采用式Ⅲ所示的半胱氨酸-R1原料，对所述半胱氨酸-R1原料的来源没有特殊限制，优选按照以下方法制得：将半胱氨酸和R1-Br进行反应得到式Ⅲ所述半胱氨酸-R1原料，对所述的半胱氨酸来源没有特殊限制。
本发明对所述反应的条件没有特殊限制，如所用的有机溶剂可为四氢呋喃(THF)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)；反应可在振荡或搅拌条件下进行，反应温度优选为30℃-70℃；反应时间优选为12h-80h，更优选为24h-72h。
在本发明中，以R2-NH2为起始引发剂引发半胱氨酸-R1环内羧酸酐(NCA)开环聚合，得到式Ⅰ所示的功能性聚氨基酸的方法中，对R2-NH2与半胱氨酸-R1环内羧酸酐的摩尔比优选为1/100～1/10，更优选为1/50～1/10。
实施例1聚乙二醇-聚半胱氨酸-喜树碱的制备
1)、半胱氨酸-喜树碱的制备
将10-羟基喜树碱(4.0g)溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(50mL)中，冰浴至0℃，加入N-溴代丁二酰亚胺(NBS)(1.0g,5.5mmol)，室温反应2h，反应完毕后倒入冰水中(300mL)，加入1mol/L HCl调节pH 3～4，充分搅拌后抽滤，水洗，干燥，得黄色产品9-溴-10-羟基喜树碱。
将半胱氨酸盐酸盐水合物(5.52g)溶于140ml氢氧化钠溶液中(2M)，加入催化剂四正丁基碘化胺(0.8g)，冰盐浴冷却；将9-溴-10-羟基喜树碱(3.25g)溶于氯仿(77ml)和乙醇(260ml)的混合溶剂，然后通过恒压漏斗滴加至反应体系，自然恢复至室温反应48h；反应停止后减压浓缩，然后用二氯甲烷提取产物，所得油相依次用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和氯化钠溶液洗涤两遍，水相反洗后合并有机相，用无水硫酸钠过夜干燥；抽滤浓缩，所得固体干燥后通过柱层析色谱法提纯，得到半胱氨酸-喜树碱单体(产率60％)；
以氘代氯仿为溶剂，对上述半胱氨酸-喜树碱原料进行核磁共振分析，δ0.88ppm(t，3H)，1.81-1.95ppm(m，4H)，2.39ppm(s，1H)，5.29ppm(s，2H)，5.42ppm(s，2H)，6.50ppm(s，1H)，7.28ppm(s，1H)，7.63ppm(d，1H)，8.07ppm(d，1H)，8.72ppm(s，1H),11.2ppm(s，1H)。
2)、半胱氨酸-喜树碱环内羧酸酐的制备
取上述制备的半胱氨酸-喜树碱单体(3.2g)溶于30ml无水四氢呋喃，缓慢加入三光气(0.56g)的四氢呋喃溶液(20ml)，于50℃下反应4h；然后浓缩四氢呋喃，所得产物在四氢呋喃/正己烷混合溶剂中重结晶3次后干燥保存，得到半胱氨酸-喜树碱环内羧酸酐；产率70％。
3)、功能性聚乙二醇-聚半胱氨酸-喜树碱的制备
取上述所得的半胱氨酸-喜树碱环内羧酸酐(2.41g)溶于30mlN,N-二甲基甲酰胺中，加入甲氧基聚乙二醇胺(MPEG-NH2)(0.96g)，于35℃下反应3天；反应结束后，在冰乙醚中沉淀3次，真空干燥48h；得到聚乙二醇-聚半胱氨酸-喜树碱。
实施例2功能性聚乙二醇-聚半胱氨酸-喜树碱自组装体的制备
取实施例1所得的聚乙二醇-聚半胱氨酸-喜树碱10mg溶于1ml四氢呋喃，以30s/d的速度缓慢滴加到快速搅拌的去离子水(9ml)中，滴加完毕后，继续搅拌半小时；然后将液体转移到MWCO 3500的透析袋中，于去离子水中透析3天，每隔3h换一次水；然后将液体离心(3500r/min)，过滤(0.45μm)，定容得到聚乙二醇-聚半胱氨酸-喜树碱自组装体。
采用动态光散射(DLS)测定所制得的自组装体的粒径，其结果为115nm；采用透射电镜(TEM)对自组装体的形貌进行表征，结果如图1所示，所制得的自组装体为胶束结构。采用圆二色谱仪对自组装体的二级构象进行测试，结果如图3所示，所制得的自组装体含有β折叠结构。
实施例3聚乙二醇-聚半胱氨酸-喜树碱响应性测试
取实施例2所制得的聚乙二醇-聚半胱氨酸-喜树碱自组装体(10ml)在10％双氧水及5％的醋酸环境中，于37℃反应24h；然后将液体转移到MWCO3500的透析袋中，于去离子水中透析2天，每隔3h换一次水；最后收集得到的聚乙二醇-聚半胱氨酸-喜树碱氧化自组装体。
采用动态光散射(DLS)测定所制得的自组装体的粒径，其结果为122nm；采用透射电镜(TEM)对自组装体的形貌进行表征，结果如图2所示，所制得的自组装体由原来的胶束结构转变为囊泡结构。采用圆二色谱仪对氧化自组装体的二级构象进行测试，结果如图4所示，所制得的自组装体转变为α螺旋结构。
实施例4聚赖氨酸-聚半胱氨酸-十六烷基苯的制备
1)、半胱氨酸-十六烷基苯的制备
将半胱氨酸盐酸盐水合物(4.28g)溶于230ml氢氧化钠溶液中(2M)，加入催化剂四正丁基碘化胺(1.12g)，冰盐浴冷却；将对-溴代十六烷基苯(3.82g)溶于氯仿(70ml)和乙醇(200ml)的混合溶剂，然后通过恒压漏斗滴加至反应体系，自然恢复至室温反应38h；反应停止后减压浓缩，然后用氯仿提取产物，所得油相依次用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和氯化钠溶液洗涤两遍，水相反洗后合并有机相，用无水硫酸钠过夜干燥；抽滤浓缩，所得固体干燥后通过柱层析色谱法提纯，得到半胱氨酸-十六烷基苯单体(产率82％)。
2)、半胱氨酸-十六烷基苯环内羧酸酐的制备
取上述制备的半胱氨酸-十六烷基苯单体(3.39g)溶于45ml无水四氢呋喃，缓慢加入三光气(1.5g)的四氢呋喃溶液(30ml)，于35℃下反应4h；然后浓缩四氢呋喃，所得产物在四氢呋喃/正己烷混合溶剂中重结晶3次后干燥保存，得到半胱氨酸-十六烷基苯环内羧酸酐；产率73％。
3)、功能性聚赖氨酸-聚半胱氨酸-十六烷基苯的制备
取上述所得的半胱氨酸-十六烷基苯环内羧酸酐(5.09g)溶于35mlN,N-二甲基乙酰胺中，加入聚(苄氧羰基-L-赖氨酸)(PLL)(4.54g)，于37℃下反应4天；反应结束后，在冰乙醚中沉淀3次，真空干燥48h；得到聚赖氨酸-聚半胱氨酸-十六烷基苯。
实施例5功能性聚赖氨酸-聚半胱氨酸-十六烷基苯烷基化修饰及其自组装体制备
1)、聚赖氨酸-聚半胱氨酸-十六烷基苯烷基化修饰
取实施例4所得的聚赖氨酸-聚半胱氨酸-十六烷基苯聚氨基酸(30mg)于50ml反应瓶中，三抽三通后，加入10ml二氯甲烷溶解，然后加入2,3-环氧丙基三甲基氯化铵(239mg)的二氯甲烷溶液，室温下反应48h；反应结束后用1：1(体积比)的去离子水洗涤2遍，收集有机相，减压蒸馏除去有机溶剂，干燥后得到固体产物即烷基化修饰的聚赖氨酸-聚半胱氨酸-十六烷基苯。
2)、聚赖氨酸-聚半胱氨酸-十六烷基苯烷基化修饰前后自组装体制备
分别取上述所得的烷基化修饰的聚赖氨酸-聚半胱氨酸-十六烷基苯和实施例4所得的聚赖氨酸-聚半胱氨酸-十六烷基苯10mg溶解于1ml二氯甲烷，以30s/d的速度缓慢滴加入快速搅拌的去离子水(9ml)中，滴加完毕后，继续搅拌半小时，然后将液体转移到MWCO3500的透析袋中，于去离子水中透析3天，每隔3h换一次水；然后将液体离心(3500r/min)，过滤(0.45μm)，定容分别得到烷基化修饰的聚赖氨酸-聚半胱氨酸-十六烷基苯自组装体和聚赖氨酸-聚半胱氨酸-十六烷基苯自组装体。
利用动态光散射电位仪对所得自组装体的粒径、Zeta电位进行测试，其结果为聚赖氨酸-聚半胱氨酸-十六烷基苯自组装体粒径为115nm，Zeta电位为-2.87mV，烷基化修饰的聚赖氨酸-聚半胱氨酸-十六烷基苯自组装体粒径为129.6nm，zeta电位为17.97mV。烷基化修饰前后对比，烷基化修饰后体系粒径略微增加，其zeta电位由负转变为正。采用圆二色谱仪对自组装体的二级构象进行测试，结果如图5所示，由图5可知，聚赖氨酸-聚半胱氨酸-十六烷基苯自组装体的二级构象为β折叠，烷基化修饰后的聚赖氨酸-聚半胱氨酸-十六烷基苯自组装体的二级构象转变为α螺旋结构。
实施例6聚乙二醇-聚半胱氨酸-十六烷基的制备
1)、半胱氨酸-十六烷基的制备
将半胱氨酸盐酸盐水合物(8.52g)溶于120ml氢氧化钠溶液中(2M)，加入催化剂四正丁基碘化胺(1g)，冰盐浴冷却；将氯代十六烷(C16-Cl)(8.62g)溶于氯仿(77ml)和乙醇(260ml)的混合溶剂，然后通过恒压漏斗滴加至反应体系，自然恢复至室温反应36h；反应停止后减压浓缩，然后用二氯甲烷提取产物，所得油相依次用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和氯化钠溶液洗涤两遍，水相反洗后合并有机相，用无水硫酸钠过夜干燥；抽滤浓缩，所得固体干燥后通过柱层析色谱法提纯，得到半胱氨酸-十六烷基单体(产率64％)。
2)、半胱氨酸-十六烷基环内羧酸酐的制备
取上述制备的半胱氨酸-十六烷基单体(3.3g)溶于30ml无水四氢呋喃，缓慢加入三光气(0.42g)的四氢呋喃溶液(20ml)，于55℃下反应3.5h；然后浓缩四氢呋喃，所得产物在四氢呋喃/正己烷混合溶剂中重结晶3次后干燥保存，得到半胱氨酸-十六烷基环内羧酸酐；产率74％。
3)、功能性聚乙二醇-聚半胱氨酸-十六烷基的制备
取上述所得的半胱氨酸-十六烷基环内羧酸酐(2.52g)溶于30mlN,N-二甲基甲酰胺中，加入甲氧基聚乙二醇胺(MPEG-NH2)(0.85g)，于37℃下反应3天；反应结束后，在冰乙醚中沉淀3次，真空干燥48h；得到聚乙二醇-聚半胱氨酸-十六烷基。
实施例7叠氮丙胺-聚半胱氨酸-丙基苯的制备
1)、半胱氨酸-丙基苯的制备
将半胱氨酸盐酸盐水合物(9.32g)溶于150ml氢氧化钠溶液中(2M)，加入催化剂四正丁基碘化胺(1.2g)，冰盐浴冷却；将烯丙基苯(C3P)(6.32g)溶于氯仿(82ml)和乙醇(260ml)的混合溶剂，然后通过恒压漏斗滴加至反应体系，自然恢复至室温反应48h；反应停止后减压浓缩，然后用二氯甲烷提取产物，所得油相依次用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和氯化钠溶液洗涤两遍，水相反洗后合并有机相，用无水硫酸钠过夜干燥；抽滤浓缩，所得固体干燥后通过柱层析色谱法提纯，得到半胱氨酸-丙基苯原料(产率70％)。
2)、半胱氨酸-丙基苯的制备
取上述制备的半胱氨酸-丙基苯单体(3.6g)溶于30ml无水四氢呋喃，缓慢加入三光气(0.7g)的四氢呋喃溶液(20ml)，于55℃下反应4h；然后浓缩四氢呋喃，所得产物在四氢呋喃/正己烷混合溶剂中重结晶3次后干燥保存，得到半胱氨酸-丙基苯环内羧酸酐；产率68％。
3)、功能性叠氮丙胺-聚半胱氨酸-丙基苯的制备
取上述所得的半胱氨酸-丙基苯环内羧酸酐(2.59g)溶于30mlN,N-二甲基乙酰胺中，加入叠氮丙胺(N3)(0.55g)，于40℃下反应3天；反应结束后，在冰乙醚中沉淀3次，真空干燥48h；得到叠氮丙胺-聚半胱氨酸-丙基苯。
实施例8聚乙二醇-聚半胱氨酸-苯丙氨酸的制备
1)、半胱氨酸-苯丙氨酸的制备
将半胱氨酸盐酸盐水合物(6.32g)溶于120ml氢氧化钠溶液中(2M)，加入催化剂四正丁基碘化胺(1g)，冰盐浴冷却；将苄氧羰基-L-3-溴代苯丙氨酸(7.25g)溶于氯仿(90ml)和乙醇(280ml)的混合溶剂，然后通过恒压漏斗滴加至反应体系，自然恢复至室温反应72h；反应停止后减压浓缩，然后用二氯甲烷提取产物，所得油相依次用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和氯化钠溶液洗涤两遍，水相反洗后合并有机相，用无水硫酸钠过夜干燥；抽滤浓缩，所得固体干燥后通过柱层析色谱法提纯，得到半胱氨酸-苯丙氨酸原料(产率82％)。
2)、半胱氨酸-苯丙氨酸环内羧酸酐的制备
取上述制备的半胱氨酸-苯丙氨酸单体(2.53g)溶于30ml无水四氢呋喃，缓慢加入三光气(0.42g)的四氢呋喃溶液(20ml)，于45℃下反应4h；然后浓缩四氢呋喃，所得产物在四氢呋喃/正己烷混合溶剂中重结晶3次后干燥保存，得到半胱氨酸-苯丙氨酸环内羧酸酐；产率68％。
3)、功能性聚乙二醇-聚半胱氨酸-苯丙氨酸的制备
取上述所得的半胱氨酸-苯丙氨酸环内羧酸酐(1.98g)溶于30mlN,N-二甲基甲酰胺中，加入甲氧基聚乙二醇胺(MPEG-NH2)(0.65g)，于37℃下反应3天；反应结束后，在冰乙醚中沉淀3次，真空干燥48h；得到聚乙二醇-聚半胱氨酸-苯丙氨酸。
实施例7聚乙二醇-聚半胱氨酸-偶氮苯的制备
1)、半胱氨酸环内羧酸酐的制备
将S-叔丁基硫-L-半胱氨酸单体(5.8g)溶于100ml无水四氢呋喃，缓慢加入三光气(2.4g)的四氢呋喃溶液(20ml)，于45℃下反应4.5h，然后浓缩四氢呋喃，所得产物在所得产物在四氢呋喃/正己烷混合溶剂中重结晶3次后干燥保存，得到半胱氨酸环内羧酸酐；产率82％。
2)、聚乙二醇-聚半胱氨酸制备
取上述制备的半胱氨酸环内羧酸酐单体(3.7g)溶于45ml N,N-二甲基乙酰胺中，加入甲氧基聚乙二醇胺(MPEG-NH2)(2.87g)，于37℃下反应3天；反应结束后，在冰乙醚中沉淀3次，真空干燥48h；得到聚乙二醇-聚半胱氨酸；产率73％。
3)、功能性聚乙二醇-聚半胱氨酸-偶氮苯的制备
取上述所得的聚乙二醇-聚半胱氨酸(4.52g)溶于40mlN,N-二甲基甲酰胺中，加入三氟乙酸汞(4.8g)和5ml冰醋酸，于37℃下反应4h；反应结束后，在冰乙醚中沉淀3次，真空干燥48h；再将所得产物溶于30ml N,N-二甲基甲酰胺中，加入4-溴偶氮苯(2.62g)的N,N-二甲基甲酰胺溶液(12ml)，于室温下反应3天；反应结束后在冰乙醚中沉淀3次，真空干燥48h得到功能性聚乙二醇-聚半胱氨酸-偶氮苯。
实施例10炔丙胺-聚半胱氨酸-联苯的制备
1)、半胱氨酸-联苯的制备
将半胱氨酸盐酸盐水合物(6.54g)溶于240ml氢氧化钠溶液中(2M)，加入催化剂四正丁基碘化胺(1.32g)，冰盐浴冷却；将2-溴联苯(2.32g)溶于氯仿(70ml)和乙醇(200ml)的混合溶剂，然后通过恒压漏斗滴加至反应体系，自然恢复至室温反应36h；反应停止后减压浓缩，然后用氯仿提取产物，所得油相依次用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和氯化钠溶液洗涤两遍，水相反洗后合并有机相，用无水硫酸钠过夜干燥；抽滤浓缩，所得固体干燥后通过柱层析色谱法提纯，得到半胱氨酸-联苯原料(产率75％)。
2)、半胱氨酸-联苯环内羧酸酐的制备
取上述制备的半胱氨酸-偶氮苯单体(4.59g)溶于40ml无水四氢呋喃，缓慢加入三光气(1.2g)的四氢呋喃溶液(30ml)，于35℃下反应4h；然后浓缩四氢呋喃，所得产物在四氢呋喃/正己烷混合溶剂中重结晶3次后干燥保存，得到半胱氨酸-联苯环内羧酸酐；产率76％。
3)、功能性炔丙胺-聚半胱氨酸-联苯的制备
取上述所得的半胱氨酸-联苯环内羧酸酐(3.29g)溶于25mlN,N-二甲基乙酰胺中，加入炔丙胺(PA)(1.62g)，于35℃下反应3天；反应结束后，在冰乙醚中沉淀3次，真空干燥48h；得到炔丙胺-聚半胱氨酸-联苯。
实施例11聚赖氨酸-聚半胱氨酸-芘的制备
1)、半胱氨酸-芘的制备
将半胱氨酸盐酸盐水合物(8.53g)溶于180ml氢氧化钠溶液中(2M)，加入催化剂四正丁基碘化胺(1.3g)，冰盐浴冷却；将1-溴-芘(8.32g)溶于氯仿(120ml)和乙醇(300ml)的混合溶剂，然后通过恒压漏斗滴加至反应体系，自然恢复至室温反应72h；反应停止后减压浓缩，然后用二氯甲烷提取产物，所得油相依次用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和氯化钠溶液洗涤两遍，水相反洗后合并有机相，用无水硫酸钠过夜干燥；抽滤浓缩，所得固体干燥后通过柱层析色谱法提纯，得到半胱氨酸-芘原料(产率82％)。
2)、半胱氨酸-芘环内羧酸酐的制备
取上述制备的半胱氨酸-芘单体(7.39g)溶于65ml无水四氢呋喃，缓慢加入三光气(3.2g)的四氢呋喃溶液(30ml)，于60℃下反应4h；然后浓缩四氢呋喃，所得产物在四氢呋喃/正己烷混合溶剂中重结晶3次后干燥保存，得到半胱氨酸-芘环内羧酸酐；产率73％。
3)、功能性聚赖氨酸-聚半胱氨酸-芘的制备
取上述所得的半胱氨酸-芘环内羧酸酐(6.09g)溶于35mlN,N-二甲基乙酰胺中，加入聚(苄氧羰基-L-赖氨酸)(PLL)(3.62g)，于35℃下反应4天；反应结束后，在冰乙醚中沉淀3次，真空干燥48h；得到聚赖氨酸-聚半胱氨酸-芘。
实施例12功能性聚氨基酸入胞性能研究
分别选择实施例2、实施例3制备的自组装体和实施例5所得自组装体包载阿霉素后与HELA细胞共培养4h后，利用激光共聚焦进行观察，结果如图7所示，由图7可知，实施例3所得的聚乙二醇-聚半胱氨酸-喜树碱氧化自组装体的荧光强度比实施例2所得的聚乙二醇-聚半胱氨酸-喜树碱自组装体强，实施例5中所得的烷基化修饰的聚赖氨酸-聚半胱氨酸-十六烷基苯自组装体的荧光强度比聚赖氨酸-聚半胱氨酸-十六烷基苯强，且主要分布在细胞核中；分析其原因，相应的聚氨基酸分别在烷基化修饰或活性氧作用后，其高级结构和功能发生有序转变，提高了其入胞性能。
实施例13功能性聚氨基酸衍生物体外肿瘤抑制实验
分别选择实施例2和实施例3制备的自组装体与HELA细胞共培养，利用MTT法得到细胞存活率，绘制出HELA细胞随各自组装体浓度变化存活率的曲线，结果如图6所示，由图6可知，在不包载其它药物的情况下，所有样品都表现出了浓度依赖的细胞毒性；而且实施例3的聚乙二醇-聚半胱氨酸-喜树碱氧化自组装体的肿瘤抑制效果好于实施例2的聚乙二醇-聚半胱氨酸-喜树碱自组装体。
实施例14功能性聚氨基酸衍生物体内肿瘤抑制研究
通过尾静脉注射方式将聚乙二醇-聚半胱氨酸-喜树碱自组装体、聚乙二醇-聚半胱氨酸-喜树碱氧化自组装体、自由喜树碱(CPT)、生理盐(Saline)水以4mg/kg-1的喜树碱剂量注射到接种了HELA细胞的裸鼠体内，对不同时间的肿瘤大小进行测量；在开始给药后的第15天，将裸鼠人道处死，并将肿瘤剥离出来，称重；结果显示：聚乙二醇-聚半胱氨酸-喜树碱自组装体在体内具有显著的肿瘤抑制效果，并且发现该功能化的聚乙二醇-聚半胱氨酸-喜树碱自组装体能响应肿瘤微环境实现高级结构和功能的改变，提高自组装体的入胞和控释效果，从而在体内达到很好的特异性肿瘤抑制效果。
尽管上面结合实施例描述了本发明，但是本领域技术人员应该清楚，在不脱离权利要求的精神和范围的情况下，可以对上述实施例进行各种修改。

Claims (19)

1.一种使功能性聚氨基酸衍生物的功能和高级结构发生有序转变的方法，其特征在于，所述方法为：采用式Ⅰ所示的结构的功能性聚氨基酸衍生物，将其进行烷基化修饰，功能性聚氨基酸衍生物在烷基化修饰下其功能和高级结构能够发生有序的转变，并且始终保持有序的高级结构；
Figure 159811DEST_PATH_IMAGE001
式Ⅰ；
其中，所述R1为含有M基团的取代基，所述M基团为：R′-苯基、C2-C20的直链烷基、C3-C60的支链烷基、联苯基、疏水性荧光染料分子及其衍生物的脱氢基团以及含有多个环状结构的直链或支链烷基中的至少一种，R′为C2-C20的直链烷基或C3-C60的支链烷基；n＞0。
2.根据权利要求1所述的使功能性聚氨基酸衍生物的功能和高级结构发生有序转变的方法，其特征在于，n≧5。
3.根据权利要求2所述的使功能性聚氨基酸衍生物的功能和高级结构发生有序转变的方法，其特征在于，10≤n≤100。
4.根据权利要求3所述的使功能性聚氨基酸衍生物的功能和高级结构发生有序转变的方法，其特征在于，10≤n≤50。
5.根据权利要求1所述的使功能性聚氨基酸衍生物的功能和高级结构发生有序转变的方法，其特征在于，R1中所述疏水性荧光染料分子及其衍生物的脱氢基团选自：尼罗红及其衍生物脱氢基团、异硫氰酸荧光素及其衍生物脱氢基团、花青素类荧光染料及其脱氢基团、芘及其衍生物脱氢基团、苝及其衍生物脱氢基团或亲脂性羰花青染料及其衍生物脱氢基团；所述含有多个环状结构的直链或支链烷基选自：R′′-联苯基、R′′-萘基、R′′-菲基、R′′-精蒽基、R′′-荧蒽基、R′′-屈基、R′′-芴基或R′′-苊基；R′′为C1-C20的直链烷基或C3-C60的支链烷基。
6.根据权利要求5所述的使功能性聚氨基酸衍生物的功能和高级结构发生有序转变的方法，其特征在于，R1中的M基团选自下述结构式中的一种：
Figure 918819DEST_PATH_IMAGE002
、
Figure 267892DEST_PATH_IMAGE003
、
Figure 112351DEST_PATH_IMAGE004
、
Figure 205072DEST_PATH_IMAGE005
、
Figure 84166DEST_PATH_IMAGE006
、
Figure 604141DEST_PATH_IMAGE007
、
Figure 139158DEST_PATH_IMAGE008
、
Figure 35570DEST_PATH_IMAGE009
、
Figure 706854DEST_PATH_IMAGE010
、
Figure 663309DEST_PATH_IMAGE011
、
Figure 482360DEST_PATH_IMAGE012
、
Figure 143584DEST_PATH_IMAGE013
、
Figure 669374DEST_PATH_IMAGE014
、
Figure 265571DEST_PATH_IMAGE015
、
Figure 40761DEST_PATH_IMAGE016
、
Figure 13396DEST_PATH_IMAGE017
、
Figure 987168DEST_PATH_IMAGE018
、
Figure 754267DEST_PATH_IMAGE019
、
Figure 547911DEST_PATH_IMAGE020
或
Figure 324237DEST_PATH_IMAGE021
。
7.根据权利要求1～6任一项所述的使功能性聚氨基酸衍生物的功能和高级结构发生有序转变的方法，其特征在于，所述功能性聚氨基酸衍生物的结构式如式Ⅱ所示：
Figure 824619DEST_PATH_IMAGE022
式Ⅱ，
其中，R2选自：含有乙烯基/炔基/叠氮基的C1-C20的直链烷基、含有乙烯基/炔基/叠氮基的C3-C60的支链烷基、C1-C20的直链烷基、C3-C60的支链烷基、甲氧基聚乙二醇胺脱氨基基团、聚赖氨酸脱氨基基团、聚谷氨酸脱氨基基团或聚天冬氨酸脱氨基基团中的一种。
8.根据权利要求7所述的使功能性聚氨基酸衍生物的功能和高级结构发生有序转变的方法，其特征在于，R2选自甲氧基聚乙二醇胺脱氨基基团、炔丙基、叠氮丙基或聚赖氨酸脱氨基基团。
9.根据权利要求1~6任一项所述使功能性聚氨基酸衍生物的功能和高级结构发生有序转变的方法，其特征在于，所述功能性聚氨基酸衍生物采用下述制备方法制得：用R1对半胱氨酸进行修饰，然后在引发剂的作用下通过开环聚合得到功能性聚氨基酸衍生物。
10.根据权利要求9所述使功能性聚氨基酸衍生物的功能和高级结构发生有序转变的方法，其特征在于，所述引发剂为R2-NH2，其中，所述引发剂中的R2选自：含有乙烯基/炔基/叠氮基的C1-C20的直链烷基、带有乙烯基/炔基/叠氮基的C3-C60的支链烷基、C1-C20的直链烷基、C3-C60的支链烷基、甲氧基聚乙二醇胺脱氨基基团、聚赖氨酸脱氨基基团、聚谷氨酸脱氨基基团或聚天冬氨酸脱氨基基团中的一种。
11.根据权利要求10所述使功能性聚氨基酸衍生物的功能和高级结构发生有序转变的方法，其特征在于，所述引发剂中的R2选自：甲氧基聚乙二醇胺脱氨基基团、炔丙基、叠氮丙基或聚赖氨酸脱氨基基团。
12.根据权利要求1~6任一项所述使功能性聚氨基酸衍生物的功能和高级结构发生有序转变的方法，其特征在于，所述功能性聚氨基酸衍生物采用下述两种方法中的任意一种：
方法一：以半胱氨酸-R1为单体合成R1修饰的半胱氨酸-N-羧基环内酸酐，然后以R2-NH2为引发剂引发R1修饰的半胱氨酸-N-羧基环内酸酐中的N-羧基环内酸酐发生开环聚合反应，得到式Ⅰ所示的功能性聚氨基酸衍生物；单体半胱氨酸-R1的结构式如式Ⅲ所示：
Figure 824936DEST_PATH_IMAGE023
式Ⅲ；
方法二：以半胱氨酸为单体，合成半胱氨酸-N-羧基环内酸酐，然后以R2-NH2为引发剂引发半胱氨酸-N-羧基环内酸酐中的N-羧基环内酸酐发生开环聚合反应得到聚半胱氨酸，再利用R1-X对聚半胱氨酸侧链进行修饰，得到式Ⅰ所示的功能性聚氨基酸衍生物；其中， X为卤素或-CH=CH2。
13.根据权利要求12所述使功能性聚氨基酸衍生物的功能和高级结构发生有序转变的方法，其特征在于，所述方法一或方法二中，开环聚合反应中，R2-NH2与R1修饰的半胱氨酸-N-羧基环内酸酐中N-羧基环内酸酐的摩尔比≦1/5。
14.根据权利要求13所述使功能性聚氨基酸衍生物的功能和高级结构发生有序转变的方法，其特征在于，R2-NH2与R1修饰的半胱氨酸-N-羧基环内酸酐中N-羧基环内酸酐的摩尔比为1/100~1/10。
15.根据权利要求14所述使功能性聚氨基酸衍生物的功能和高级结构发生有序转变的方法，其特征在于，R2-NH2与R1修饰的半胱氨酸-N-羧基环内酸酐中N-羧基环内酸酐的摩尔比为1/50~1/10。
16.根据权利要求12所述使功能性聚氨基酸衍生物的功能和高级结构发生有序转变的方法，其特征在于，所述方法一或方法二中，开环聚合反应中，反应温度为30~70℃，反应时间为12h~80h。
17.根据权利要求16所述使功能性聚氨基酸衍生物的功能和高级结构发生有序转变的方法，其特征在于，所述方法一或方法二中，开环聚合反应中，反应时间为24h~72h。
18.根据权利要求17所述使功能性聚氨基酸衍生物的功能和高级结构发生有序转变的方法，其特征在于，所述方法一或方法二中，开环聚合反应中，反应时间为72h。
19.根据权利要求12所述使功能性聚氨基酸衍生物的功能和高级结构发生有序转变的方法，其特征在于，所述方法一中，半胱氨酸-R1单体按照以下任意一种方法制得：1） R1-X与半胱氨酸上的巯基发生亲核取代反应得到；其中，X为卤素；2）R1-X与半胱氨酸上的巯基发生加成反应得到；其中，X为-CH=CH2。
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