JPH07113799A - 細胞の選択的分離方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 特定の細胞のみを特異的にかつ効率よく分離
する方法を提供する。 【構成】 単離する細胞表面に発現されている抗原との
結合性を有するモノクロナール抗体またはポリクロナー
ル抗体あるいは結合性を保持されたそれらの断片を含む
タンパク質またはペプチドを、カルボキシル基を含有す
る分子量２００００以下の化合物に結合させ（修飾抗
体）目的細胞を含んだ血液，血漿，血清，体液あるいは
細胞懸濁液のいずれかを修飾抗体と反応させることによ
り目的細胞を結合させ、修飾抗体の結合した細胞液を、
アミノ基またはイミノ基を表面に含有する水不溶性担体
に処理することにより目的細胞を担体に結合させ、その
他の細胞または他の物質を除去し、目的細胞のみを上記
担体から解離させる工程から成る、細胞の選択的分離方
法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は従来のアフィニティクロ
マト法に改良を加えることにより、特定のマーカー抗原
を有する細胞あるいは細胞集団を効率よく分離する方法
に関するものである。本発明による細胞分離方法は生化
学分野の研究を目的とする場合のみならず、血液の体外
循環により特定の細胞を分離することにより、種々の疾
患の治療に際しても適用されるものである。たとえばＣ
Ｄ４陽性細胞あるいはＣＤ８陽性細胞のいずれか一方を
分離除去することにより両者の比率を制御することがで
き、それにより免疫反応が過剰に作用する自己免疫疾患
やアレルギー性の疾患あるいは逆にＡＩＤＳに代表され
るような免疫不全性の疾患の治療に有用なものである。
またＣＤ３４陽性細胞を分離することにより、特に末梢
血中から極微量に存在する最も未分化な幹細胞を効率よ
く単離することが可能であり、癌，悪性腫瘍などにおい
て化学療法あるいは放射線療法を適用した場合にこれを
注入することにより、その造血機能を回復させることが
可能である。

【０００２】

【従来の技術】現在適用されている細胞の分離方法とし
ては遠心分離法，所望の細胞以外の細胞を死滅させる方
法，蛍光抗体標識細胞分離法（以下ＦＡＣＳと言う），
水不溶性担体に目的細胞に親和性を有するリガンドを固
定化しこれに目的細胞を直接的または間接的に結合させ
る方法，免疫吸着カラムによる分離および免疫磁気ビー
ズによる分離法などがある。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】遠心分離法は細胞の大
きさおよび比重の相違により分離する方法であり、白血
球，赤血球および血小板のように物理的性質に大きな相
違のある場合には有用であるが、たとえばＴ細胞とＢ細
胞のように物理的な差異の小さな細胞を分離する場合に
は適用できない。

【０００４】所望の細胞以外の細胞を死滅させる方法は
種々検討されてきたが、これが適用されるのは移植手術
に際して自家骨髄中に存在する癌細胞を死滅させるため
に薬剤やモノクロナール抗体を用いる程度である。薬剤
は一般的に４−ヒドロパーオキシシクロホスファミドが
使用されるが、正常骨髄細胞までも損傷を受ける場合が
多い。また癌細胞やＴ細胞に結合する抗体が所望の細胞
以外の細胞を死滅させるために用いられてきたが、この
場合にも他の薬剤を併用する必要がある。しかし抗体と
癌細胞の結合性は変化しやすいため、癌細胞を完全に死
滅させることは困難である場合が多い。また併用する薬
剤においても目的とする正常細胞をも損傷させる場合が
生じやすい。

【０００５】ＦＡＣＳは最初に細胞混合液を目的とする
細胞に発現されている膜抗原を認識するような蛍光標識
したモノクロナール抗体とインキュベートした後、処理
した細胞にレーザー光を照射することにより抗体が結合
した細胞のみが蛍光を発することを応用して、蛍光抗体
が結合した細胞を分離する方法である。この方法は研究
用に少量の細胞分離には効果的であるが、１×１０⁷ 個
／時間の細胞処理速度が限界であるため診断や治療に要
する大量の細胞を分離するためには不適当である。たと
えばＦＡＣＳ装置を用いて有核細胞を約２×１０⁷ 個含
有する２０ｍｌ程度の血液を処理するのに数時間を要す
ることになり、一般に骨髄移植に必要とされる１〜２×
１０⁸ 個の幹細胞を分離するためには数週間を要する。
またＦＡＣＳ装置は非常に高価なものであり、操作する
にも熟練した高度な技術が必要であり、維持するのに要
する費用も大きいなどの問題がある。

【０００６】ＷＯ８７−０４６２８には２種類の細胞分
離方法が記載されている。一つは目的細胞の膜表面に存
在する抗原に対するモノクロナール抗体を直接分離装置
表面に固定化して用いる方法である。細胞分離は担体ま
たは装置に固定化されたモノクロナール抗体に対して、
該抗原陽性細胞が直接結合することで行なわれる。もう
一つの方法は最初に細胞混合液を目的細胞上の膜抗原に
結合するモノクロナール抗体とインキュベートして、そ
れから細胞表面上の抗体に結合する抗イムノグロブリン
抗体のようなリガンドを固定化した細胞分離装置で処理
される。これらの方法に含まれるパニング法では、抗体
を固定化したプラスチック皿上で分離される。この方法
の手順を記すと、細胞混合液は最初抗体を固定化したプ
ラスチック皿上に注がれ、抗体と目的細胞上の膜抗原と
を結合させるためにインキュベートされる。インキュベ
ート後プラスチック皿を洗浄して結合していない細胞を
除去して分離する。このようにパニング法は非常に簡単
ではあるが、抗原と抗体の結合が弱いために効率よく細
胞と抗体とを結合させるには細胞をプラスチック皿上で
長時間インキュベートする必要があり、このため目的以
外の細胞の非特異的な接着が生じ純度が低下するという
欠点がある。さらに細胞と抗体との結合が弱いために多
くの抗体が細胞と結合せずに残存し、多量の細胞を結合
させるためには大量の抗体をプラスチック皿に固定化す
る必要があり装置のコストが非常に高くなる。また赤血
球の非特異的な吸着を防止するために、この方法では細
胞混合液から先に赤血球を除去して用いなければならな
いなどの多くの欠点を有する。

【０００７】免疫磁気ビーズ法は最初に細胞混合液を抗
体の結合した磁気ビーズとインキュベートすることによ
り目的細胞を磁気ビーズで標識する。標識後磁気装置を
用いて標識されていない細胞から標識細胞を分離する。
この技術は患者の骨髄液から癌細胞を除去して臨床に用
いるために応用されている。ビーズと目的細胞を効率よ
く結合させるために長時間のインキュベートが必要であ
り、そのため目的以外の細胞の非特異的な接着が生じ純
度が低下すると同時に小さな磁気ビーズに吸着した目的
細胞を回収することが非常に困難であり治療に適用する
ことは難しい。

【０００８】免疫吸着カラム法は目的細胞上の膜抗原に
対する抗体などのリガンドをビーズ表面に固定化しこれ
をカラムに充填して細胞分離を行なうものである。この
場合もパニング法や磁気ビーズ法と同様に細胞膜抗原と
抗体の結合力が弱いため、細胞をビーズ表面の抗体に結
合させるにはインキュベートする必要があり、このため
目的以外の細胞の非特異的な接着が生じ純度が低下す
る。さらに抗原と抗体との結合が弱いために大量の抗体
を固定化する必要がありカラムのコストが非常に高くな
り大量の細胞分離が必要な治療分野への適用は困難であ
る。

【０００９】ＷＯ９１−１６１１６には目的細胞上の膜
抗原に対する抗体をビオチン標識したものを細胞混合液
中に加えて、インキュベートすることにより細胞−抗体
−ビオチン結合を形成させた後、多孔質アクリルアミド
ゲルにアビジンを固定化したビーズを充填したカラムを
通過させビオチン−アビジンの強力な結合を利用して目
的細胞をカラム内に結合させて分離する方法が記載され
ている。この方法は前述した種々の方法と比較すると処
理速度および純度の点で改良されており臨床応用が可能
である。しかしビオチン−アビジンの結合が非常に強固
であるため一旦細胞分離に用いてビーズに固定化したア
ビジンのすべてがビオチンと結合するとこの結合を切断
してカラムを再生することが困難である。したがってカ
ラムを並列に並べて一方のカラムが飽和になると他方の
カラムに切換え、その間に飽和したカラムの再生を行な
うといった方式を採用することができないため、カラム
の大容量化，プライミング容量の増大を招く。さらにア
クリルアミドビーズにアビジンが直結しているためアビ
ジンが有効に作用しにくく、細胞−抗体−ビオチン結合
体の吸着速度およびその効果が低下するなどの問題点が
ある。

【００１０】本発明は上記のような欠点や問題点を改良
して目的の細胞を効率よく高速で分離が可能であり、純
度もよく分離された細胞の機能低下を招くことのない細
胞分離方法および装置を提供するものである。さらには
再生の可能な細胞分離方法および装置を提供することに
も本発明の大きな特徴がある。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明は（１）単離する
細胞表面に発現されている抗原との結合性を有するモノ
クロナール抗体またはポリクロナール抗体あるいは結合
性を保持しているそれらの断片を含むタンパク質または
ペプチドを、カルボキシル基を含有する分子量１０００
０以下の化合物に共有結合させ、（２）目的の細胞を含
んだ血液，血漿，血清，体液あるいは細胞懸濁液のいず
れかを（１）で得た修飾抗体と反応させることにより目
的の細胞を結合させ、（３）（２）で得られた修飾抗体
の結合した細胞液を、アミノ基またはイミノ基を表面に
含有する水不溶性担体と処理することにより目的細胞を
担体に結合させ、それ以外の細胞または他の物質を除去
し、（４）適当な方法により目的細胞のみを上記担体か
ら解離させるという工程を含むことを特徴とする細胞の
分離方法。

【００１２】本発明により分離が可能な細胞は特に限定
されないが、特に内皮細胞，癌細胞，ランゲルハンス島
細胞，マクロファージ，単球，Ｂリンパ球，Ｔリンパ球
および造血系の各種細胞、さらには妊婦の血液中の胎児
細胞などのヒト細胞などが挙げられる。このうちＢリン
パ球，Ｔリンパ球は多くの亜集団に分類されるが、特に
Ｔリンパ球においてＣＤ４陽性細胞，ＣＤ８陽性細胞，
ＣＤ１９陽性細胞，インターロイキン２レセプター（Ｉ
Ｌ２Ｒ）陽性細胞，トランスフェリンレセプター（Ｔｒ
Ｒ）陽性細胞などの亜集団を分離することは各種の自己
免疫疾患，ＡＩＤＳあるいは移植術後の急性拒絶反応の
防止などに応用が可能となり有意義なものである。また
造血系の悪性腫瘍，癌の治療において行なわれる自家骨
髄移植療法のためにＣＤ３４を発現している造血幹細胞
の分離は現在注目されており今後需要の増すと思われる
分野である。

【００１３】これらの細胞を認識する抗体としてはモノ
クロナール抗体，ポリクロナール抗体のいずれを用いる
ことも可能であるが、その単一性や結合特異性の点から
はモノクロナール抗体の方がより好ましい。また抗体分
子をそのまま利用することも可能であるが、各種プロテ
アーゼ処理により得られる抗原結合部位を含む断片であ
るＦａｂ，Ｆ（ａｂ')₂ あるいはＦａｃｂなども適用す
ることができる。さらには可変領域を構成するペプチド
またはそのうちでも相補性決定領域を構成するアミノ酸
配列から成るペプチドおよびその修飾ペプチドを用いる
ことができる。その他にも本発明をヒト体内の血液を体
外循環に応用する場合には抗体が血液中に遊離した際の
副作用，抗原性などを考慮して可変領域以外の部分をヒ
ト型抗体にするようなキメラ抗体を用いることも有用で
ある。これらの中で細胞（マーカー抗原）との結合強度
や遊離した場合の副作用などを考慮するとＦａｂ，Ｆ
（ａｂ')₂ あるいは可変領域を構成するペプチドを用い
ることが好ましい。これら抗体の作製方法は特に限定さ
れるものではないが、高純度に精製されたものを用いな
ければならない。モノクロナール抗体の場合には通常行
なわれているハイブリドーマを無血清培地による培養上
清から得る方法でよい。断片ペプチドの場合には抗体分
子の酵素処理により得ることができるが、遺伝子工学的
な手法により細菌，酵母などに産生させることも可能で
ある。

【００１４】上記抗体とカルボキシル基を含有する化合
物と結合させる方法は特に限定されるものではないが、
一般的なものとしてはカルボジイミド化合物を用いて抗
体中のアミノ基を該カルボキシル基と縮合させる方法が
挙げられる。上記のカルボキシル基を含有する化合物と
しては、一分子内に少なくとも２個以上、好ましくは４
個以上のカルボキシル基を有する化合物が好ましい。こ
れらの化合物としては分子量１００ないし２００００、
好ましくは１５０ないし１００００のポリアクリル酸
（ＰＡＡ），ポリメタクリル酸（ＰＭＡＡ）およびこれ
らの誘導体ポリマーが挙げられる。ここでいう誘導体ポ
リマーとはアクリル酸（ＡＡ），メタクリル酸（ＭＡ
Ａ）のモノマー単位を少なくとも１種類を１０ないし８
０モル％以上を含む他のビニルモノマーとの共重合体を
意味する。またそれ以外にも安定性，安全性に問題がな
ければ、２個以上のカルボキシル基を含有する種々の化
合物を用いることも可能である。

【００１５】上記化合物の結合した抗体と細胞液との結
合は、懸濁液の場合には１％牛血清アルブミン（以下Ｂ
ＳＡと言う）含有ＰＢＳ溶液中で行なうのが好ましく、
４℃で３０分ないし１時間程度インキュベートを行なっ
た後、同ＰＢＳ溶液で２〜３回洗浄するのがよい。細胞
や抗体の種類により結合の容易さが異なるが、約１×１
０⁷ 個の細胞液を処理する場合には、５ないし５００μ
ｇ、好ましくは１０ないし１００μｇの抗体を混合して
反応させるのが好ましい。

【００１６】本発明で用いられる水不溶性担体は、その
素材自体あるいは溶出物に毒性がなければ合成，天然い
ずれでもよく、水不溶性または水不溶化された高分子化
合物はすべて適用可能である。これらの形状はビーズ，
繊維，中空糸などいずれも可能であり、分離する細胞の
大きさ，形状，性質などに応じて使い分けることができ
る。このうちビーズ状で使用する素材として適当なもの
は、ポリアクリルアミド，ポリアクリル酸エステル誘導
体，ポリビニルアルコール，ポリスチレンンおよびその
誘導体，セルロース，アガロース，キトサン，キチンお
よびその他の市販ビーズ状高分子がある。これらのうち
非特異的な吸着を防止するためには、親水性の強いポリ
アクリルアミド，ポリビニルアルコールおよびセルロー
スが好ましい。ビーズの粒径は分離する目的の細胞の大
きさにより変わるが、概して５ないし４０００μｍが適
当である。目的細胞の大きさが１ないし５μｍの場合に
はビーズの粒径は５ないし５００μｍ好ましくは１０な
いし３００μｍであり、目的細胞の大きさが５ないし５
０μｍの場合にはビーズの粒径は３０ないし４０００μ
ｍ好ましくは５０ないし２０００μｍが適している。ま
たビーズは多孔質であることが好ましく、その排除限界
分子量は５×１０⁶程度が好ましい。さらにビーズ全体
に占める細孔容量としては１０ないし９０％、好ましく
は２０ないし８０％がよい。

【００１７】繊維状担体の素材としてはポリエステル，
ポリアミド，ポリエチレン（ＰＥ），セルロース，ポリ
プロピレン（ＰＰ），ポリエチレンテレフタレート（Ｐ
ＥＴ），レーヨン，ポリスチレン，ポリビニルアセター
ルなどが挙げられる。このうち改質の容易さ、強度保持
の点からポリエステル，セルロース，レーヨン，ＰＥ
Ｔ，ポリスチレンが好ましい。繊維の形状は織物，綿
状，不織布などいずれでもよいが、取扱いの容易さ、吸
着効率の点から不織布が好ましい。また繊維径は１ない
し２００μｍ、好ましくは２ないし１００μｍさらに好
ましくは３ないし５０μｍである。これらの繊維は多孔
性であってもよく、孔径はビーズの場合と同様の範囲が
好ましい。

【００１８】上記の水不溶性担体へのアミノ基またはイ
ミノ基の導入は種々の方法が挙げられる。たとえばＰ
Ｅ，ＰＰの場合には、あらかじめアミノ基またはイミノ
基を有するビニル化合物たとえば化１および化２で表わ
されるようなジアルキルエチルアクリレートやジアルキ
ルアミノプロピルアクリレートなどの化合物を共重合し
て製造する方法がある。またこれらの素材を電子線，紫
外線またはオゾンを照射することによりラジカルやイオ
ンを発生させ、化１または化２のようなアミノ基または
イミノ基を有するビニル化合物をグラフトさせる方法が
ある。この場合には他のビニルモノマーを共存させるこ
とも可能である。

【００１９】

【化１】 化１において、Ｒ₁ は水素原子またはメチル基を、Ｒ_2,
Ｒ₃ はともに、水素原子または炭素数１ないし５のアル
キル基を、ｎは２ないし５の整数を示す。

【００２０】

【化２】 化２において、Ｒ₁ は水素原子またはメチル基を、Ｒ_2,
Ｒ₃ はともに、水素原子または炭素数１ないし５のアル
キル基を、ｎは２ないし５の整数を示す。

【００２１】綿やビスコースの場合には、過ヨウ素酸に
より酸化してそのグリコール部位を開裂させてアルデヒ
ド基を形成させ、アンモニア，エチレンジアミン，ヘキ
サメチレンジアミン，ポリエチレンイミンのような少な
くとも一級アミノ基を１個以上有する化合物を反応させ
てシッフ塩基を形成しこれを還元してアミノ基またはイ
ミノ基を導入するのがよい。このうちポリエチレンイミ
ンを用いるのが特に好ましく、その場合の分子量は２０
０ないし２００００が好ましく、５００ないし１０００
０がより好ましい。

【００２２】さらに電子線照射によりアミノ基またはイ
ミノ基を導入する方法としては、化１または化２のよう
なアミノ基またはイミノ基を有するビニル化合物を直接
または適当な溶媒に溶解した後乾燥させ電子線を照射す
る方法がある。この際にビニル化合物の沸点が低いと乾
燥条件で蒸発しグラフト量の制御が困難であり、この場
合には高沸点化合物と混合して塗布し蒸発を抑えること
が好ましい。混合する高沸点溶媒としてはエチレングリ
コール，ジエチレングリコール，重合度１０以下のポリ
エチレングリコール，グリセリンなどの多価アルコール
類が特に好ましい。

【００２３】また化１および化２で例示されるアミノ基
またはイミノ基を有するビニル化合物のグラフト効率を
向上させるために、多官能性の架橋性ビニル化合物と混
合して用いることが好ましい。これらの架橋性ビニル化
合物としてはメチレンビスアクリルアミド，トリメチロ
ールプロパンジアクリレート，トリメチロールプロパン
トリアクリレート，テトラメチロールメタンテトラアク
リレート，トリアリルイソシアヌレートのようなビニル
基を複数個有するモノマーの他に、化３の一般式で示さ
れる化合物が挙げられる。これらの架橋性化合物のうち
で化３を用いた場合がアミノ基またはイミノ基の導入率
が最も良好で、アミノ基またはイミノ基含量の自在に制
御することも可能である。

【００２４】

【化３】 化３において、Ｒ₁ 〜Ｒ₃ は水素原子またはメチル基を
示し、ｎは１ないし３００の整数を示す。

【００２５】さらに化３とたとえばポリエチレンイミ
ン，ポリ（ジメチルアミノプロピルアクリルアミド）お
よびポリ（ジエチルアミノエチルアクリレート）やポリ
（ジエチルアミノメタアクリレート）またはその誘導体
のようなビニル基をもたないアミノ基またはイミノ基を
高濃度に含有するポリマー，たとえばポリエチレンイミ
ンとを混合して用いることによりグラフトしてアミノ基
またはイミノ基を導入することができる。ここで用いら
れるポリエチレンイミンの分子量は１００ないし２００
００好ましくは１５０ないし１００００である。化３に
おけるｎの値は５ないし１５０であることが好ましく、
１０ないし７０であることがさらに好ましい。

【００２６】これらの化合物を塗布するための溶液の濃
度は０．１ないし２０％、好ましくは０．５ないし１０
％であり、用いる溶媒は架橋性化合物とアミノ基または
イミノ基を含有する化合物の両者を溶解する溶媒であれ
ばすべて使用できるが、水，メタノール，エタノール，
塩化メチレン，クロロホルム，アセトン，ジオキサン，
テトラヒドロフランまたはこれらの混合溶媒を用いるこ
とができる。アミノ基またはイミノ基を含有する化合物
と架橋性化合物との混合比は５０：１ないし１：５０、
好ましくは３０：１ないし１：３０である。コーティン
グする混合物は担体に対して０．５ないし３０ｗｔ％、
好ましくは１ないし２０ｗｔ％である。

【００２７】特に不織布の場合においてアミノ基または
イミノ基の導入方法を種々検討したところ、化１，化２
の単位を１０モル％以上含有させて他のビニル化合物と
共重合させて得られるポリマーまたはポリエチレンイミ
ンおよびその誘導体と化３で示される化合物とを混合し
て不織布に塗布した後、電子線照射によりグラフトさせ
る方法が簡便で強度低下などの劣化が少ないことから特
に好ましい。この場合に用いる素材としてはＰＥＴ，Ｐ
Ｅ，レーヨンあるいは綿が好ましく特にＰＥＴが好まし
い。照射線量は１ないし２０Ｍｒａｄ、好ましくは２な
いし１０Ｍｒａｄである。このようにしてアミノ基また
はイミノ基を導入した不織布はアミノ基またはイミノ基
とポリエチレングリコールとの相乗効果により、特にこ
れを用いて血液を体外循環させる場合においては血小
板，白血球などの粘着性がなく血液の補体活性や凝固系
因子の活性化も抑制されるなどの点からも有利である。

【００２８】先に述べた細胞の結合したカルボキシル基
含有化合物を上記のようなアミノ基またはイミノ基含有
担体を充填したカラムに供して接触させることにより、
両者のイオン結合が生じ目的細胞が担体に捕集される。
細胞は攪拌あるいは振盪処理により容易に解離すること
ができる。また上記処理後におけるアミノ基またはイミ
ノ基含有担体は、ｐＨ９．５ないし１１．５好ましくは
ｐＨ１０．０ないし１１．０の塩基性緩衝液により再生
することが可能である。

【００２９】

【実施例】本発明による細胞分離に関する実施例を以下
に示す。 ＜実施例１＞ ＣＤ３４陽性細胞の分離 （１）バッフィコート細胞の分離 ヘパリンを加えた骨髄液を１００×ｇで５分間遠心分離
を行ない、沈殿層の上部にあるバッフィコート細胞層
（有核細胞層）を採取する。さらにＰＢＳ溶液で同条件
での遠心分離による洗浄を２回行なった。洗浄したバッ
フィコート細胞を１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液に懸濁して
細胞数が５×１０⁷ 個／ｍｌ程度になるように分散させ
た。

【００３０】（２）抗ＣＤ３４抗体へのカルボキシル基
含有化合物の結合 分子量が２０００であるＰＡＡ１０μｇをｐＨ４．５の
０．１Ｍ酢酸緩衝液２０ｍｌに溶解して氷冷して、水溶
性カルボジイミド（ＥＤＣ）５μｇを添加して３０分間
振盪しながら反応させ、さらに抗ＣＤ３４抗体であるＨ
ＰＣＡ−１（ベクトンディッキンソン社製）１００μｇ
を加えて室温で振盪しながら２０時間反応させた。反応
後同酢酸緩衝液を外液として透析した後、硫安塩析によ
り抗体を回収して、再溶解してＰＢＳ溶液（ｐＨ７．
４）を外液として透析を行ない４℃で保存した。

【００３１】（３）バッフィコート細胞の抗体との結合 （１）で得たバッフィコート細胞懸濁液に、（２）で得
た修飾抗体を１０μｇ／ｍｌの濃度になるように添加
し、４℃で３０分間保温した。その後１％ＢＳＡ含有Ｐ
ＢＳ溶液（ｐＨ７．４）で２回洗浄した。処理する細胞
は１×１０⁷ 個／ｍｌ程度になるように同緩衝液中に再
分散させた。

【００３２】（４）水不溶性担体へのイミノ基の導入 化３において、Ｒ₁,Ｒ₂,Ｒ₃ が水素原子でありｎの値が
１４であるポリエチレンジアクリレート（ＣＨ₂ ＝ＣＨ
−ＣＯＯ−（ＣＨ₂ ＣＨ₂ Ｏ）₁₄−ＯＣ−ＣＨ ₂ ＝ＣＨ
₂ ）１．２５ｇおよび分子量１００００のポリエチレン
イミン１．２５ｇを２５０ｍｌのメタノールに溶解し、
１５ｃｍ平方の大きさに切断した繊維径３．５μｍのＰ
ＥＴ製不織布をこの溶液に浸した後、５Ｍｒａｄずつ合
わせて１０Ｍｒａｄの電子線を不織布の両面に照射し
た。電子線照射の終了した不織布を水およびメタノール
で３回ずつ洗浄を行ない風乾した。得られた不織布のイ
ミノ基含量は塩酸による滴定により定量を行ない０．４
５ｍｅｑ／ｇであった。

【００３３】（５）細胞の分離 上記不織布を一辺５ｃｍの菱形のポリカーボネート製モ
ジュールケースの大きさおよび形状に合わせて切断して
それを２０枚を充填したカラムを作製した。このカラム
に（３）で調製した抗体の結合した細胞の懸濁液１ｍｌ
をチュービングポンプにより１ｍｌ／分でカラムを通過
させながら１０分間循環させた。その後ＰＢＳ溶液（ｐ
Ｈ７．４）で洗浄して、カラムを軽く振動させて細胞を
カラムから脱離させた。脱離した細胞を同ＰＢＳ溶液を
流して回収した。ＣＤ３４陽性細胞の回収率は蛍光標識
フローサイトメトリーによる定量結果から算出した。同
時にＣＤ３４陰性細胞との比率からＣＤ３４陽性細胞の
純度を算出した。また回収された細胞の生存率を、トリ
パンブルーを用いた色素排除法により生死を判別してＮ
ｅｕｂａｕｅｒ型血球計算盤を用いて計量して算出し
た。これらの結果を表１に示した。

【００３４】

【表１】

【００３５】＜実施例２＞ ＣＤ４陽性細胞の分離 １０％ヘパリン（１００Ｕ／ｍｌ）添加ヒト末梢血を３
５０×ｇで１０分間遠心分離してバッフィコート細胞層
を採取し等量のマッコイ５Ａ培地（ＧＩＢＣＯ製）に混
和した後、等量ずつＦｉｃｏｌｌ−Ｃｏｎｒａｙ液上に
重層して７５０×ｇで２０分間遠心分離した。得られた
単核細胞層を上記培地を含む別の試験管に採取して３２
０×ｇで１０分間遠心分離による洗浄を３回繰返した。

【００３６】抗ＣＤ４抗体であるＬｅｕ−３ａ（ベクト
ンディッキンソン社製）１００μｇを実施例１と同様に
して、分子量が２０００であるＰＡＡを結合させ、上記
の単核細胞と結合させた。処理する細胞は１×１０⁷ 個
／ｍｌ程度になるように１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液（ｐ
Ｈ７．４）中に再分散させた。さらに実施例１と同様に
して調製したカルボキシル基含有不織布（０．４４ｍｅ
ｑ／ｇ）を充填カラムを作製して、同様の方法でＣＤ４
陽性細胞の分離回収率，純度，生存率を評価した。結果
を表１に示した。

【００３７】＜実施例３＞ ＣＤ８陽性細胞の分離 抗ＣＤ８抗体であるＬｅｕ−２ａ（ベクトンディッキン
ソン社製）１００μｇを用いて、その他は実施例２と同
様にしてＣＤ８陽性細胞の分離回収率，純度，生存率を
評価した。結果を表１に示した。

【００３８】

【発明の効果】以上示したように、本発明により細胞の
分離方法は目的の細胞のみを特異的にかつ効率よく高純
度に回収することが可能となった。本発明は生化学的研
究における細胞分離、あるいは医療を目的とした特定の
細胞捕集などの分野において有用に展開されるものであ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ａ６１Ｍ 1/36 ５４５ 9052−4Ｃ (72)発明者 田中 昌和 滋賀県大津市堅田二丁目１番１号 東洋紡 績株式会社総合研究所内

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 次に示すような工程から成ることを特徴
   とする細胞の選択的分離方法。 （１）単離する細胞表面に発現されている抗原との結合
   性を有するモノクロナール抗体またはポリクロナール抗
   体あるいは結合性を保持しているそれらの断片を含むタ
   ンパク質またはペプチドを、カルボキシル基を含有する
   分子量２００００以下の化合物に共有結合させる。 （２）目的の細胞を含んだ血液，血漿，血清，体液ある
   いは細胞懸濁液のいずれかを（１）で得た修飾抗体と反
   応させることにより目的の細胞を結合させる。 （３）（２）で得られた修飾抗体の結合した細胞液を、
   アミノ基またはイミノ基を表面に含有する水不溶性担体
   と処理することにより目的細胞を担体に結合させ、それ
   以外の細胞または他の物質を除去する。 （４）目的細胞のみを上記担体から解離させる。