JP2008507956A

JP2008507956A - 動物についての、バイオテクノロジー（生物学的研究を含む）および医学的診断での適用のための、細胞、生体粒子および／または分子を液体から単離するための装置ならびに方法

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Publication number: JP2008507956A
Application number: JP2007522913A
Authority: JP
Inventors: ハインリッヒ，ハンス−ワーナー
Original assignee: ハインリッヒ，ハンス−ワーナー
Priority date: 2004-07-30
Filing date: 2005-07-29
Publication date: 2008-03-21
Anticipated expiration: 2025-07-29
Also published as: AU2005269067A1; JP5079506B2; AU2005269067B2; KR101290558B1; JP2012196212A; RU2007107358A; CN101057141B; CN101057141A; RU2386967C2; EP1776582A1; WO2006012886B1; WO2006012886A1; EP1776582B1; US8969073B2; US20070190653A1; KR20070061807A; CA2578539A1; WO2006012884A1; WO2006012884B1

Abstract

本発明は、好適な担体および公知の固定化方法を用いて、液体中の特定の生体粒子ならびに溶解した生体分子を認識し、かつそこから分離するための装置および方法を記載する。当該装置は、液体の不連続な処理と、直接的で連続的な処理の両者に用いることができる。本発明の適用範囲は、動物、バイオテクノロジー（生物学的研究を含む）および医学的診断である。
【選択図】なし

Description

発明の説明
本発明は、細胞、生体粒子および／または分子を液体から単離するための装置および方法を記載する。本発明を使用し、適切な担体および公知の固定化方法を使用して、特定の生体粒子を認識し、かつ分離することができる。本発明の適用分野は、動物、バイオテクノロジー（生物学的研究を含む）および医学的診断である。

細胞、生体粒子および／または分子を液体から単離することは多くの技術分野において重要であり、そのための多数の方法もまた公知である。

細胞の分析および細胞の分離は、数十年間、蛍光標示式細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）を用いて行われてきた。それは、表面マーカーによる特定の細胞集団の分析に好ましい方法である。ＦＡＣＳの適用は多数の細胞の単離に関する問題をもたらす。細胞を含有する媒体を高度に希釈する必要があり、大量の細胞に関しては分離時間が比較的長く、無菌的条件の確保が問題となる。総合すると、上記方法はかなりの費用を生じる。

ここ１０年以上の間、生体粒子および細胞の認識ならびに単離に磁気分離法が使用されるようになっている。この方法のためには、捕捉用分子に鉄を保持させるか、あるいは鉄のコアを含有する微粒子を捕捉用分子でコーティングする。その分離は強磁場によって行われる。とりわけＤｙｎａｌおよびＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃによって商業的に成功している免疫磁気分離は、シンプルで比較的好都合な価格の細胞分離法として確立されている。特にフローサイトメトリーと比較して、磁気分離は、比較的まれなタイプの細胞の単離に関して、例えば出生前診断のために母親の血液から胎児細胞を単離するにあたって、その価値が証明されている。別の適用は、次の処置を開始するために原発腫瘍の外科的除去後に血液中の腫瘍細胞を検出することである。

昨今、治療目的で、造血系のある種の悪性疾患を患っている患者由来の同系ＣＤ３４^＋末梢血幹細胞が再移植のために日常的に取得されている。これは、好ましくは、磁気ビーズにカップリングされた特異的抗体で白血球を純化することによって行われる。血液／細胞提供時の細胞分画では、重力場での分離（遠心分離）用の、血液細胞の種々のサイズおよび特有の密度を利用するいくつかの系が利用可能である。

すべての選別方法の不都合はそれらを連続して実行できないことである。すなわち、血液またはリンパ球サンプルを採取し、細胞を免疫磁性粒子とインキュベートする。分離および洗浄後、磁性粒子から細胞を分離すると、治療目的で使用できるようになる。

ＦＡＣＳおよびＭＡＣＳの有用な概要は「Flow Cytometry and Sorting」（Melamed et al.編, Wiley & Sons, Inc., New York, 1990）に提供されている。

細胞を単離および／または除去する他の方法は、ＥＰ１２３１１９５６Ａ２、ＵＳ６９０００２９、ＵＳ６４３２６３０、ＵＳ２００２００１２９５３Ａ１、ＤＥ１００２２６３５Ａ１、ＵＳ５２４６８２９、ＵＳ５７３９０３３、ＵＳ５７６３２０３、ＥＰ００１６５５２Ａ１、ＷＯ００／３８７６２、ＥＰ０５０２２１３Ｂ１およびＥＰ０５５４４６０Ｂ１に記載されている。
ＥＰ１２３１１９５６Ａ２ＵＳ６９０００２９ＵＳ６４３２６３０ＵＳ２００２００１２９５３Ａ１ＤＥ１００２２６３５Ａ１ＵＳ５２４６８２９ＵＳ５７３９０３３ＵＳ５７６３２０３ＥＰ００１６５５２Ａ１ＷＯ００／３８７６２ＥＰ０５０２２１３Ｂ１ＥＰ０５５４４６０Ｂ１「Flow Cytometry and Sorting」（Melamed et al.編, Wiley & Sons, Inc., New York, 1990）

本発明は、動物について、同様にバイオテクノロジー、例えば生物学的研究で、および医学的診断においても使用することができる、細胞、生体粒子および他の分子を分離するためのシンプルな系を開発するという課題に基づくものであった。

本発明は、請求項１、１４および２９〜３０にしたがって理解され、下位の請求項は選択的なバリエーションである。

本発明は、分離対象の物質の混合物からなる物質に関して特異的リガンドを表面上に機能的に固定することができる場合であれば常に使用することができるシンプルな分離方法を記載する。実際の分離は、粒子サイズに基づく選別（ろ過、ふるい分け）によって行われる。

この課題の解決のために、特異的リガンドを固体担体にカップリングさせる標準的方法が使用される。

使用される固体担体は公知の生体高分子、例えば有機もしくは合成ポリマー由来のメンブレンまたは粒子である。表面は生体適合性であってよく、それには、コラーゲン、精製タンパク質、精製ペプチド、多糖類、例えばキトサン、アルギナート、デキストラン、セルロース、グリコサミノグリカンまたは合成ポリマー、例えばポリスチレン、ポリエステル、ポリエーテル、ポリ無水物、ポリアルキルシアノアクリラート、ポリアクリルアミド、ポリオルトエステル、ポリ酢酸ビニル、ブロックコポリマー、ポリプロピル、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）またはポリウレタンが含まれうる。それに加えて、ポリマーは乳酸ポリマーまたはコポリマー（乳酸および／またはグリコール酸（ＰＬＧＡ））を含有することができる。

使用される表面は生分解性または非生分解性であってよい。

細胞の表面上の標的分子の結合に使用される特異的リガンドは、天然であるか、あるいは合成性であってよく、例えば抗体、抗体フラグメント、ペプチド、ポリペプチド、糖ペプチド、可溶性受容体、ステロイド、ホルモン、マイトジェン、抗原、スーパー抗原、成長因子、サイトカイン、レプチン、ウイルスタンパク質、接着分子またはケモカインである。

特定の用途では、少なくとも１種の抗体または抗体フラグメントが使用され、その場合、特異的リガンドはそれらに共有結合されているか、あるいはスペーサーまたはリンカーを介してそれらに固定されている。

担体物質は任意の形状を呈してよい。毛細管としてのメンブレンまたは粒子は広い表面という利点を提供する。以下に記載する方法では、直径が１０μｍより大きく、８００μｍより小さい微粒子、好ましくは５０〜５００μｍの微粒子を使用する。他の課題に関しては、より大きい粒子または小さい粒子を使用することもできる。

特異的リガンド（例えばＣＤ３４またはＣＤ１ｄに対する抗体、またはＨＩＶ−ｇｐ１２０に対する抗体）で活性化された微粒子を、採取された血液とｅｘｖｉｖｏで接触させる。該血液は通例の抗凝固剤で処理されたものである。これは別個の反応区画で行う。反応区画が体外循環中に設置される場合、ホース接続部、弁、フィルターおよびポンプを安全装置に連結することによって、対応する抗凝血後に患者に対する副作用を伴わずに系を作動できるよう確保する。

標的細胞に機能化微粒子を結合させる。細胞を結合した微粒子の分離は、好ましくは管の形状の、メンブレン（スクリーン）を利用する静水圧によって行われる。該メンブレンはすべての血液成分を障害なく通過させるが（孔サイズは１０μｍより大きく、８００μｍより小さい）、微粒子を保持する。垂直方向および同様に接平面方向の圧力の両効果によってろ過を行うことができる。管中に残っている粒子は、反応容器に戻されるか、あるいは分析または調製のために導出される。

血液の流動を停止した後、微粒子から細胞を分離するために反応容器を使用することができる。このように分離された分散細胞を同一のプロセスによって粒子から除去することができ、そして診断上の適用に利用可能である。

別の適用は、対象となる細胞タイプがその要求される機能の達成のために表面分子および／または生体分子、例えば他の細胞タイプのサイトカインを必要とする場合に、共培養のために意図的に複数の細胞タイプを単離することである。

必要な細胞−細胞接触のために不可欠な標的細胞の十分な近接を達成するために、いくつかの特異的リガンドを１粒子上に結合させることができる。

この適用のための具体的細胞は、とりわけ、Ｔ細胞、Ｂ細胞または幹細胞であってよい。

本方法は不連続に使用することができ、連続して使用することもできる。材料、直径および表面修飾に関する粒子デザインにおける高い変動性により、動物について、医学的診断での、さらにバイオテクノロジーおよび生物学的研究においての適用の可能性の非常に大きな多様性が得られる。

ラット全血からのＣＤ４陽性細胞の単離
Ａｓｃｉｔｉｓ抗体（ＲＩＢ５／２）について、プロトコルにしたがってＭｉｌｌｉｐｏｒｅＭｏｎｔａｇｅＡｎｔｉｂｏｄｙＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ（ＬＳＫ２ＡＢＧ２０）を使用した。

その後、ＳＤＳ変性ゲル（１０％）を用いて精製を確認した。

抗ＣＤ４抗体とポリメチルアクリラート（ＰＭＡ）粒子のカップリング
１．ＰＭＡ１ｍｌ（粒径＝４０μｍ＋／−１０μｍ；１０ｍｇ／ｍｌ；ＣＯＯＨ／ＰＥＧ−ＣＯＯＨ修飾型）を３，０００×ｇで２分間遠心分離し、上清を捨て、１ｍｌの０．１ＭＭＥＳバッファー（ｐＨ６．３）中に加える。

２．０．５ｍｌの０．１ＭＭＥＳバッファー（ｐＨ６．３）中に２ｍｇのＥＤＣおよび２．４ｍｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミドを溶解し、ＰＭＡ粒子の懸濁液に加える。室温で１時間、撹拌しながらインキュベートする（粒子の活性化）。

３．遠心分離によってＰＭＡ粒子を分離し、０．１ＭＭＥＳバッファー（ｐＨ６．３）で２回洗浄する。

４．抗体１００〜１５０μｇを含む１ｍｌの０．１ＭＭＥＳバッファー（ｐＨ６．３）中に活性化済みＰＭＡ粒子を加え；カップリング反応を室温で１６時間（一晩）行う。

５．１００μｌの１Ｍエタノールアミンを加えることによって自由な結合点を機能消失させ、その後１時間インキュベートする。

６．遠心分離によって分離し、機能化ＰＭＡ粒子をＰＢＳで３回洗浄する。

７．１ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ７．４）中に抗ＣＤ４ＰＭＡ粒子を加え、４℃で保存する。ＰＥで標識されたヤギ抗マウス抗体を用いて抗体のカップリングを確認する（図１）。

全血からのＣＤ４陽性細胞由来の特異的な細胞単離
１．４ｍｌの抗凝血処理ラット全血を機能化抗ＣＤ４ＰＭＡ粒子懸濁液１ｍｌ（粒子１ｍｇ）と混合する。

２．室温で６０分間、振とうしながらインキュベートする。

３．細胞スクリーン（４０μｍ）を有する特殊なチャンバーを用いて血液粒子混合物をろ過することによって、抗ＣＤ４ＰＭＡ粒子（細胞が結合している粒子および細胞が結合していない粒子）を全血から分離する。

４．抗ＣＤ４ＰＭＡ粒子を３０ｍｌのＰＢＳ（１％ＦＣＳ）で洗浄する。

５．スクリーンチャンバーから得た粒子を約１ｍｌのＰＢＳに加え、１５〜２０秒間ボルテックス（混合）する。

６．顕微鏡解析のために粒子サンプルを取り出す（図２）。

７．抗ＣＤ４ＰＭＡ粒子での処理前および処理後にラット全血中の白血球フラクションをＦＡＣＳ解析する（図３および４）。

粒子からの細胞の分離および認定
１．慎重な遠心分離によって細胞が付着している抗ＣＤ４ＰＭＡ粒子を沈降させる。

２．ＰＢＳ、２ｍＭＥＤＴＡ、３ｍＭメルカプトエタノールおよび２０Ｕパパイン中に沈降物を加える。

３．３０分間混合しながらインキュベートする。

４．細胞スクリーン（４０μｍ）を有する特殊なチャンバーを用いてろ過することによって細胞および粒子を分離し；３０ｍｌのＰＢＳ（１％ＦＣＳ）で粒子を洗浄し；細胞スクリーンから得た粒子を約１ｍｌのＰＢＳに加え；１５〜２０秒間ボルテックス（混合）し、洗浄を繰り返す。

５．３５０×ｇでの遠心分離によって単離リンパ球フラクションを濃縮し、ＦＡＣＳを用いて解析する（図５）。

細胞ライセートからのタンパク質（ＩｇＧ）の単離
Ａｓｃｉｔｉｓ抗体（ＲＩＢ５／２）について、プロトコルにしたがってＭｉｌｌｉｐｏｒｅＭｏｎｔａｇｅＡｎｔｉｂｏｄｙＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ（ＬＳＫ２ＡＢＧ２０）を使用した。

抗ＣＤ４抗体（マウスＩｇＧ _２）とポリメチルアクリラート（ＰＭＡ）粒子のカップリング
１．ＰＭＡ１ｍｌ（粒径＝４０μｍ＋／−１０μｍ；１０ｍｇ／ｍｌ；ＣＯＯＨ／ＰＥＧ−ＣＯＯＨ修飾型）を３．０００×ｇで２分間遠心分離し、上清を捨て、１ｍｌの０．１ＭＭＥＳバッファー（ｐＨ６．３）中に加える。

７．１ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ７．４）中にマウスＩｇＧＰＭＡ粒子を加え、４℃で保存する。ＰＥで標識されたヤギ抗マウス抗体を用いて抗体のカップリングを確認する（図１）。

細胞ライセートからのヤギ抗マウスＩｇＧの特異的単離
１．１ｍｌの細胞ライセート（ＨｅｐＧ２，４×１０^６）を１ｍｇのヤギ抗マウスＩｇＧと混合する。

２．機能化マウスＩｇＧＰＭＡ粒子懸濁液０．１ｍｌ（粒子１００μｇ）をタンパク質混合物に加える。

３．室温で６０分間、振とうしながらインキュベートする。

４．スクリーンメンブレン（１０μｍ）を有する特殊なチャンバーを用いてろ過することによって、細胞ライセートからマウスＩｇＧＰＭＡ粒子（ヤギ抗マウスＩｇＧが結合している粒子およびヤギ抗マウスＩｇＧが結合していない粒子）を分離する。

５．各５ｍｌのＰＢＳを用いてＰＭＡ粒子を３回洗浄する。

粒子からのタンパク質の分離および確認
１．スクリーンチャンバーから得た付着タンパク質を伴う機能化ＰＭＡ粒子を０．５ｍｌのクエン酸バッファー（ｐＨ２．２）に加え；３０分間インキュベートする。

２．スクリーンメンブレン（１０μｍ）を有する特殊なチャンバーを用いてろ過することによって粒子を分離し；２ｍｌのクエン酸バッファーで粒子を洗浄する。

３．クエン酸バッファー中の分離されたタンパク質を分析する（図６）。

図７〜１１は、装置に基づく本発明の実現または、場合によっては、その一部分の実現の例を示す。図７は、連続使用に典型的に適用可能な系を示す。点在する矢印はホース系を表し、矢印の先端は液体の流動方向を示す。生物（哺乳動物）から出発し、血液ポンプおよび弁（図中で円形で示される）によって、体液、例えば血液をポンプするか、あるいは導いて、機能化粒子を含有する反応容器に入れる。機能化粒子は混合物中の体液の成分と相互作用することができるものである（図８）。次いで細胞混合物および機能化粒子を含む媒体を粒子分離系に導入する。一例では、細胞混合物および機能化粒子を含む媒体を導いて、スクリーンを通過させ、中空繊維メンブレンを通過させて、機能化粒子を伴わない細胞混合物と機能化粒子を伴う細胞混合物に分離する（図９）。機能化粒子を伴わない減少した濃度の混合物を弁によって導出し、該生物に導入する一方、機能化粒子を伴う細胞混合物およびそれらに結合している標的細胞／生体粒子／分子を反応容器に戻す（図７）。図１０は、中空繊維メンブレン内での分離の原理を典型例として示す。細胞混合物および機能化粒子を含む媒体を導いて中空管メンブレンを通過させるが、該中空管メンブレンは細胞混合物の通過のみを許容する孔サイズ（破線）を備えていて、したがって、この時点で媒体は標的細胞／生体粒子／分子をほとんど含有せず、一方、分離対象の標的細胞／生体粒子／分子を伴う機能化粒子は中空管系の内部に残留する。

図１１は、対応する粒子分離系の詳細を表す。該粒子分離系は、直径が異なる２種類の機能化粒子に関して使用することができる。

ＰＥ標識ヤギ抗マウス抗体を用いて標識した抗ＣＤ４ＰＭＡ粒子の顕微鏡像を示す。ラット全血とインキュベートした後の、抗ＣＤ４ＰＭＡ粒子の顕微鏡像を示す。ＰＭＡ粒子での処理前でのラット全血中の白血球フラクションのＦＡＣＳ解析を示す。ＰＭＡ粒子での処理後でのラット全血中の白血球フラクションのＦＡＣＳ解析を示す。単離リンパ球フラクションのＦＡＣＳ解析を示す。細胞ライセートからのタンパク質分離の分析結果を示す。連続使用に典型的に適用可能な系を示す。点在する矢印はホース系を表し、矢印の先端は液体の流動方向を示す。混合物中の体液の成分と相互作用する機能化粒子を模式的に示す。細胞混合物および機能化粒子を含む媒体を導いて、スクリーンを通過させ、中空繊維メンブレンを通過させて、機能化粒子を伴わない細胞混合物と機能化粒子を伴う細胞混合物に分離する、粒子分離系の一例を示す。中空繊維メンブレン内での分離の原理を典型例として示す。異なるサイズの２種類の機能化粒子を用いる分離系の一例を表す。

Claims

動物についての、バイオテクノロジー（生物学的研究を含む）および医学的診断での適用のための、細胞、生体粒子および分子を液体から単離するための装置であって、以下のものを含む装置：
ａ．細胞、粒子および／または分子の混合物が配置される、生体適合性材料からなる反応容器；
ｂ．必要とされる細胞、生体粒子および／または分子集団を認識し、かつそれらを結合する機能化微粒子；
ｃ．細胞、生体粒子および／または分子の通過を許容するが、前記微粒子の通過を許容しない孔を有する１以上のメンブレンに基づく粒子分離系；
ｄ．および、連続使用のために、細胞、生体粒子および／または分子の単離、分離、加工および除去のすべての工程を実行可能にするための、種々のホース系、メンブレン、ポンプおよび弁。
特定の細胞、生体粒子および／または分子が体細胞、細胞レベル以下の構造、タンパク質および／または核酸であり、適用可能であれば、ウイルス、細菌および／または原生動物であり、ならびに液体が分泌物および排泄物、血液、リンパ、体液（liquor）、洗浄サンプル、あるいは器官採取物または栄養培地もしくは発酵沈殿由来の分離細胞の懸濁液であり、かつ細胞、生体粒子および／または分子を含有する、請求項１に記載の装置。
追加の機能化微粒子を使用することによって、細胞／生体粒子／分子の分離を細胞、生体粒子および／または分子の吸着の原理と組み合わせる、請求項１および２に記載の装置。
併用される機能化微粒子同士がそのサイズに関して異なっている、請求項３に記載の装置。
機能化微粒子が２種以上の特異的リガンドを保持し、ゆえに２種以上の異なる細胞、生体粒子および／または分子が該微粒子に特異的に吸着する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の装置。
追加のリガンドによって生細胞に関する細胞刺激機能をもたらすことができる、請求項４に記載の装置。
細胞膜／メディエーター相互作用によって少なくとも１種の細胞タイプの刺激がもたらされる少なくとも２種の異なる細胞タイプを追加のリガンドによって分離する、請求項４に記載の装置。
機能化微粒子が液体に懸濁され、自由可動性である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の装置。
機械的作用によって微粒子を懸濁状態で維持する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の装置。
微粒子が配備されている反応区画由来の液体をろ過によって微粒子と分離させる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の装置。
特異的に吸着されないすべての成分の通過を許容するが、使用される微粒子の通過を許容しない直径を有する孔を特徴とするメンブレンをろ過に使用する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の装置。
孔の直径が１μｍより大きく、１，０００μｍより小さい平面状または中空管メンブレンを分離に使用する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の装置。
反応容器を使用して単離された細胞の追加の加工を行う、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の装置。
細胞、生体粒子および／または分子を液体から分離するための方法であって、分離される細胞が特定の表面抗原により特徴づけられる方法。
細胞、生体粒子および／または分子を分離するための請求項１４に記載の方法であって、該表面抗原を認識する原理が天然または合成起源のリガンドである方法。
リガンドが抗体、抗体フラグメント、ペプチド、ポリペプチド、糖ペプチド、受容体、ステロイド、ホルモン、マイトジェン、抗原、スーパー抗原、成長因子、サイトカイン、レクチン（lektin）、ウイルスタンパク質、接着分子またはケモカインである、請求項１５に記載の方法。
リガンドが共有結合または非共有結合によって微粒子に結合している、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
固体担体として生体適合性ポリマーを使用する、請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の方法。
リガンドが、好ましくはセファロースにカップリングされている、請求項１４〜１８のいずれか１項に記載の方法。
細胞、生体粒子および／または分子を連続して、または不連続に分離する、請求項１４〜１９のいずれか１項に記載の方法。
任意の数量の個別のモジュールとして、異なる機能化微粒子に応じて反応容器を順番に切り替えることができる、請求項１４〜２０のいずれか１項に記載の方法。
連続分離のために、機能化微粒子を反応容器に入れ、細胞、生体粒子および／または分子を含有する液体によりこれを流動させる、請求項１４〜２０のいずれか１項に記載の方法。
液体が血液である、請求項２１に記載の方法。
所定のバッファーを適用することによって、細胞、生体粒子および／または分子を微粒子から分離する、請求項１４〜２２のいずれか１項に記載の方法。
細胞の放出および、必要であれば、別の細胞、生体粒子および／または分子の放出を同一反応容器中で実行する、請求項１４〜２３のいずれか１項に記載の方法。
液体の分離に使用されるメンブレンと同一のメンブレンでのろ過によって、細胞、生体粒子および／または分子を微粒子懸濁液から分離する、請求項１４〜２４のいずれか１項に記載の方法。
分離された細胞、生体粒子および／または分子を、ヒトへの適用を目的とせずに、分析および／または別の機械処理および／または加工のために使用する、請求項１４〜２５のいずれか１項に記載の方法。
分離された細胞、生体粒子および／または分子を、加工せずに、あるいは修飾して、疾患の研究または治療のために動物に投与することができる、請求項１４〜２６のいずれか１項に記載の方法。
体外循環においてｅｘｖｉｖｏで血液を処理するための、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の装置および方法。
診断またはさらなる加工のための、細胞、生体粒子および／または分子の浄化、富化または濃縮に適している、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の装置および方法。