RU2484139C1 - Устройство для выделения нуклеиновых кислот - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к области молекулярной биотехнологии и химии и предназначено для выделения и очистки ДНК и РНК из биологических образцов - проб с чистотой, пригодной для их последующего анализа методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (Real Time PCR). Устройство включает корпус, пробирки для размещения в каждой из них адсорбированных на магнитных частицах нуклеиновых кислот и намагниченного перпендикулярно оси пестика. Корпус выполнен из немагнитного материала. В корпусе установлены с возможностью образования вращающегося неоднородного магнитного поля горизонтально расположенный вал и магнитные цилиндры. Вал состоит из повторяющихся вдоль продольной оси вала блоков из четырех скрещенных постоянных магнитов. Положение каждого из магнитов определено углом поворота одноименных полюсов относительно первого магнита, второй магнит повернут на 90 градусов, третий - на 270 градусов, четвертый магнит - на 180 градусов. Магнитные цилиндры расположены по обе стороны горизонтального вала. Каждый из магнитных цилиндров намагничен перпендикулярно оси с возможностью вращения только вокруг этой оси и расположен параллельно стенке пробирки. Каждая пара магнитных цилиндров по разные стороны от продольной оси горизонтального вала размещена с возможностью взаимодействия с двумя скрещенными постоянными магнитами горизонтального вала, причем горизонтальный вал выполнен и размещен в корпусе таким образом, что его ось перпендикулярна осям магнитных цилиндров. Количество пар скрещенных постоянных магнитов на валу равно количеству магнитных цилиндров, расположенных с одной стороны от продольной оси вала, при этом пробирки размещены в корпусе в магнитном неоднородном вращающемся поле. Изобретение позволяет обеспечить повышение эффективности истирания клубка магнитных частиц, опутанных нуклеиновыми кислотами и получения образцов - проб с чистотой, пригодной для их последующего анализа методом полимеразной реакции. 5 ил.

Description

Изобретение относится к области молекулярной биологии и химии.

Устройство для выделения нуклеиновых кислот применяется в лабораторной диагностике и предназначено для выделения и очистки ДНК и РНК из биологических образцов-проб с чистотой, пригодной для их последующего анализа методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (Real Time PCR).

В настоящее время выпускаются ручные и автоматические устройства, например: Spherotec Inc AutoMag Processor(CUlA), Merck Magnetic Rack (Германия), планшетный сепаратор с ячейками (лунками)PerSeptive Biosystems 96, Multi-6 Separator, Solo-Sep Separator(США), Dynal Magnetik Particies Concentrators. Устройства основаны на использовании смеси связанных с магнитными частицами НК (нуклеиновых кислот) биологического образца. Смесь магнитных частиц и НК выводится магнитом на стенку пробирки, а жидкость сливают или отсасывают из пробирки. После этого в пробирку помещается новая промывочная жидкость и процесс повторяется. К основным недостаткам вышеперечисленных устройств следует отнести то, что после адсорбции НК на поверхности магнитных частиц и сбора магнитных частиц у одной из стенок пробирки происходит образования клубка магнитных частиц, опутанных НК. Это затрудняет дальнейшее проведение этапов промывки и снижает качество полимеразной реакции в реальном времени для анализа нуклеиновых кислот, и в ряде случаев требует проведения дополнительных операций.

Наиболее близким техническим решением является заявка РФ №2009130779 с приоритетом от 13 августа 2009 года, опубликованная 20.02.2011 г. Способ гомогенизации образцов, содержащих магнитные наночастицы при выделении ДНК в процессе автоматической пробоподготовки для ПЦР анализа.

Способ включает адсорбцию НК (нуклеиновых кислот) на поверхности магнитных частиц, растирание клубка магнитных частиц, опутанных НК, между внутренней поверхностью пробирки и вращающимся вокруг своей оси магнитным зондом (пестиком), а вращение и прижим к стенке пробирки осуществляется расположенным с внешней стороны пробирки вращающимся магнитным шариком. К недостаткам способа следует отнести то, что магнитные частички собираются в одной точке вблизи полюса магнита, а магнитный зонд (пестик) участвует в процессе только частью своей поверхности, что значительно снижает эффективность процесса. Устройство по вышеприведенному способу из-за своей конфигурации затрудняет дальнейшее увеличение количества одновременно обрабатываемых образцов, а также использование его в автоматических раскапывающих станциях.

Изобретение «Устройство для выделения нуклеиновых кислот» включает совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата, выразившегося в улучшении истирания клубка магнитных частиц, опутанных НК, и получения образцов-проб с чистотой, пригодной для их последующего анализа методом полимеразной цепной реакции. Отделение нуклеиновых кислот от сопутствующих продуктов происходит за счет того, что магнитные частицы с адсорбированными НК собираются в пробирке вдоль оси вращения магнитного цилиндра, расположенного с внешней стороны, а магнитный зонд (пестик) участвует в процессе всей своей поверхностью за счет взаимной параллельности магнитного цилиндра, пестика и стенки пробирки. Площадь, на которой распределены магнитные частицы, значительно увеличена, соответственно уменьшается толщина слоя магнитных частиц с адсорбированными на них НК. Это значительно снижает возможность образования клубка магнитных частиц, опутанных НК, и повышает эффективность работы пестика и промывочной жидкости. Практически решен вопрос удержания магнитных частиц, опутанных НК, в пробирке при сливе или отсасывании раствора. Сила взаимодействия пестика и магнитных частиц обеспечивается вращающимся неоднородным магнитным полем, создаваемым магнитным цилиндром с магнитным валом. Вся схема: магнитный вал, магнитный цилиндр, намагниченный пестик - работоспособна лишь при условии, что магнитный цилиндр и пестик намагничены перпендикулярно своим осям, а магнитный цилиндр установлен в устройстве из немагнитного материала с возможностью вращения только вокруг своей оси, перпендикулярной оси магнитного вала для передачи вращательного момента сил во взаимно перпендикулярных направлениях (вал перпендикулярен магнитному цилиндру, а магнитный цилиндр в свою очередь параллелен намагниченному пестику).

Каждая пара скрещенных (под скрещенными магнитами понимается перпендикулярность осей постоянных магнитов, не лежащих в одной плоскости и проходящих одновременно через ось магнитного вала) постоянных магнитов, расположенных на приводном валу, взаимодействует с двумя магнитными цилиндрами, расположенными с разных сторон от оси вращения вала. Магнитные цилиндры, расположенные по разные стороны от магнитного вала, взаимодействуя с ним, вращаются в противоположные стороны и создают вращающиеся магнитное поле в месте расположения магнитных цилиндров. Направление вращения магнитных цилиндров можно изменить на противоположенное, изменив направление вращения вала.

Расположение магнитных цилиндров, каждый из которых расположен рядом с пробиркой, позволяет разместить максимальное количество пробирок на единице длины, что соответствует требованиям к автоматическим раскапывающим станциям. Магнитные цилиндры, выстроенные в один ряд с каждой стороны от оси вращения вала, образуют одномерную «решетку Изинга» из-за более плотной линейной упаковки. Для разрушения и использования взаимодействия магнитных цилиндров, создающих «решетку Изинга», необходимо дать возможность рядом расположенным магнитным цилиндрам вращаться в разные стороны. Это достигается построением на валу блока из четырех скрещенных постоянных магнитов и повторением таких блоков вдоль горизонтальной оси вала необходимое количество раз. Положение каждого из 4 магнитов определяется углом поворота одноименных полюсов относительно первого магнита, второй магнит повернут на 90 градусов, третий магнит - на 270 градусов, четвертый - на 180 градусов. Поворот магнитов может осуществляться как по часовой, так и против часовой стрелки, устройство работает независимо от направления вращения вала.

Вращение в разные стороны стоящих рядом магнитных цилиндров обеспечивается вращением вала с распределенными на валу постоянными магнитами по схеме 0-90-270-180. На каждый рядом стоящий магнитный цилиндр магнитный вал воздействуют поочередно разноименными полюсами. При вращении вала за один оборот дважды обеспечивается воздействие на каждый магнитный цилиндр одноименными полюсами с последующим изменением полярности на противоположную, которая также повторяется два раза. Повторяющиеся блоки, состоящие из четырех скрещивающихся магнитов и выстроенные последовательно на валу, обеспечивают вращение любого количества магнитных цилиндров, создающих одномерную «решетку Изинга». Направление вращения первого магнитного цилиндра зависит только от направления поворота второго и последующих магнитов по часовой или против часовой стрелки при установки магнитов на валу, как указано выше.

Использование взаимодействия магнитных цилиндров в одномерной «решетке Изинга» позволяет двигателю небольшой мощности вращать 16 магнитных цилиндров в определенной последовательности. Увеличение количества одновременно обрабатываемых образцов на единицу площади дает возможность использовать предложенное устройство в автоматических раскапывающих станциях. Устройство по данному техническому решению не имеет ограничений по количеству магнитных цилиндров и, соответственно, пробирок, установленных в ряд. За счет расположения магнитных цилиндров параллельно стенке пробирки и перпендикулярно оси магнитного вала размеры устройства определяются в основном высотой и диаметром пробирки.

Изобретение «Устройство для выделения нуклеиновых кислот» состоит из пробирки (1), в которой помещены адсорбированные на магнитных частицах нуклеиновые кислоты и намагниченный перпендикулярно оси пестик (2), во вращающемся неоднородном магнитном поле. В устройстве из немагнитного материала (3) с возможностью вращения только вокруг этой оси параллельно стенке пробирки установлен магнитный цилиндр (4). Магнитные цилиндры намагничены перпендикулярно оси. Каждая пара магнитных цилиндров, расположенных по разные стороны от оси вращающегося вала (5), приводимого во вращение электродвигателем (6), взаимодействует с двумя скрещенными постоянными магнитами (7), расположенными на валу. Ось вала перпендикулярна осям магнитных цилиндров, а вал состоит из повторяющихся вдоль оси блоков, состоящих из четырех постоянных скрещенных магнитов. Положение каждого магнита определяется распределением на валу по схеме 0-90-270-180 градусов, как указано выше. Количество магнитных цилиндров, установленных в один ряд и образующих одномерную «решетку Изинга» с каждой стороны от оси вращения вала, равно количеству пар скрещенных постоянных магнитов на приводном валу. Магнитные цилиндры, установленные по разные стороны от оси вращения вала, образуют две одномерные «решетки Изинга», слабо взаимодействующие между собой из-за их взаимного удаления.

Основным принципом, характеризующим устройство, является передача вращающего момента от горизонтально вращающегося магнитного вала к перпендикулярно вращающимся магнитным цилиндрам посредством их магнитного взаимодействия с получением сильного вращающегося неоднородного магнитного поля в пробирке с адсорбированными нуклеиновыми кислотами и намагниченным пестиком. Благодаря этому происходит истирания клубка магнитных частиц, опутанных НК. Размеры, определяющие положение магнитных полюсов на вращающемся валу и положение магнитного цилиндра, зависит от радиуса вала с постоянными магнитами и коэффициентов, определенных расчетным путем М=3,125 и N=1,125. В этом случае длина линии (расстояние), лежащей в горизонтальной плоскости и соединяющая оси вращения магнитного цилиндра и вала с постоянными магнитами, равна R*M=3,125R, где R - радиус магнитного вала, а магнитные полюса на валу расположены на расстоянии R*N=1,125R, где R - радиус магнитного вала. Данное устройство является источником вращающегося неоднородного магнитного поля, а магнитные цилиндры зафиксированы в корпусе из немагнитного материала параллельно стенке пробирки с возможностью вращения только вокруг своей оси. При условии, что оси магнитных цилиндров и магнитного вала всегда перпендикулярны друг другу.

Магнитные полюса на горизонтальном валу и синхронное вращение магнитных цилиндров попарно в различных направлениях уменьшает требуемую величину усилия, прилагаемого к магнитному валу. Разрушение одномерной «решетки Изинга» требует значительных усилий. Однако все магнитные цилиндры, образующие «решетку Изинга», можно заставить вращаться самосогласованно, обеспечивая при этом взаимную равновесную ориентацию магнитных цилиндров, т.е. ориентацию, обеспечивающую минимум потенциальной энергии их взаимодействия.

Существует строгая последовательность воздействия постоянных магнитов блока на магнитные цилиндры, создающие «решетку Изинга». Преодоление сил взаимодействия двух магнитных цилиндров возможно только при условии вращения магнитных цилиндров в разные стороны. Это достигается воздействием на два магнитных цилиндра, расположенных рядом разноименными полюсами, повторяющимися дважды, затем происходит смена полюсов на противоположные, которые также повторяющиеся дважды. При воздействии на магнитные цилиндры важна не только последовательность, но и расстояние между магнитами на вращающемся валу, равное 1,125R, где R - радиус магнитного вала.

При вращении горизонтального магнитного вала проекция напряженности магнитного поля на горизонтальную плоскость в центре оси магнитного цилиндра (рис.1), вращаясь, описывает фигуры, подобные приведенной на рис.3, близкую к окружности. Вращательный момент сил $$\overrightarrow{N},$$

действующий на магнитный момент $$\overrightarrow{m}$$

( $$\overrightarrow{m}$$

- направлен перпендикулярно вертикальной оси магнитного цилиндра) в магнитном поле $$\overrightarrow{H},$$

выражающийся формулой $$\overrightarrow{N}=\left[\overrightarrow{m}\times \overrightarrow{H}\right],$$

стремится повернуть магнитный момент в направлении, обратном направлению магнитного поля. Следовательно, при вращении магнитного поля $$\overrightarrow{H}$$

вокруг вертикальной оси вращаться будет и магнитный цилиндр с радиальной намагниченностью.

Следуя за вращением магнитного цилиндра, поперечно намагниченный магнитный «пестик» в каждой пробирке также будет совершать вращение вокруг вертикальной оси. Приведем для справок формулу для вращательного момента, действующего со стороны магнитного момента $${\overrightarrow{m}}_1$$

(магнитный цилиндр), магнитный момент $${\overrightarrow{m}}_2$$

(намагниченный пестик): $${\overrightarrow{N}}_2=\frac{3\cdot \left({\overrightarrow{m}}_1\cdot \overrightarrow{r}\right)\cdot \left({\overrightarrow{m}}_2\times \overrightarrow{r}\right)}{r^5}+\frac{\left[{\overrightarrow{m}}_1\times {\overrightarrow{m}}_2\right]}{r^3}.$$

Кроме того, сила взаимодействия двух магнитных моментов $$\overrightarrow{F}$$

(магнитный момент втягивается в область сильного неоднородного поля $$\overrightarrow{F}=\left(\overrightarrow{m}\cdot \overrightarrow{\nabla }\right)\cdot B$$

) обеспечивает постоянный прижим магнитного пестика к стенке пробирки, что является необходимым условием для успешного растирания неоднородностей магнитных частиц вращающимся и прижатым к стенке пестиком. Приведем формулу для этой силы:

$${\overrightarrow{F}}_2=-{\overrightarrow{F}}_1=\frac{3}{r^5}\cdot \left[\left({\overrightarrow{m}}_1\cdot \overrightarrow{r}\right)\cdot {\overrightarrow{m}}_2+\left({\overrightarrow{m}}_2\cdot \overrightarrow{r}\right)\cdot {\overrightarrow{m}}_1+\left({\overrightarrow{m}}_1\cdot {\overrightarrow{m}}_2\right)\cdot \overrightarrow{r}\right]-\frac{15}{r^7}\cdot \left({\overrightarrow{m}}_1\cdot \overrightarrow{r}\right)\cdot \left({\overrightarrow{m}}_2\cdot \overrightarrow{r}\right)\cdot \overrightarrow{r}$$

Сам способ растирания магнитных неоднородностей вращающимся и прижатым к стенке пробирки магнитным пестиком предложен в заявка РФ №2009130779 с приоритетом от 13 августа 2009 года, дата публикации заявки 20.02.2011 г. «Способ гомогенизации образцов, содержащих магнитные наночастицы при выделении ДНК в процессе автоматической пробоподготовки для ПЦР анализа», находящейся в процессе рассмотрения. Настоящая заявка заявляет преимущество заявки №2009130779 от 13 августа 2009 г., которая тем самым включается полностью в описание настоящего изобретения путем ссылки.

Предложенное изобретение позволяет значительно улучшить контакт рабочего органа - намагниченного пестика (зонда) с магнитными частицами, собирающимися не в одной точке вблизи полюса магнита, как в прототипе, а вдоль линии полюса радиально намагниченного магнитного цилиндра, а также увеличения силы прижатия намагниченного пестика к внутренней стенки пробирки, в том числе и за счет сил магнитного взаимодействия с магнитным цилиндром.

При остановке вращательного движения происходит сбор магнитных частиц на стенки пробирок. Характерной особенностью изобретения является тот факт, что магнитные частицы собираются не в одной точке вблизи полюса магнита, а вдоль линии полюса радиально намагниченного магнита. Это уменьшает вероятность потерь адсорбированных на магнитных частицах нуклеиновых кислот, при сливании или отсасывании жидкости из пробирки, в связи с увеличением площади взаимодействия магнитных частиц с магнитным цилиндром. А уменьшение толщины слоя магнитных частиц на стенке пробирки с дополнительной фиксацией намагниченным пестиком существенно уменьшает вероятность образования «комков».

В прототипе намагниченный пестик выполнен в виде цилиндра и взаимодействует с магнитными частицами линией образующий цилиндр, а в заявляемом решении намагниченный пестик в поперечном сечении имеет форму многоугольника и взаимодействует с магнитными частицами не только углами многогранника, но и сторонами, увеличивая площадь контакта со средой и соответственно улучшая процесс растирания и перемешивания. При испытании трех, четырех, пятиугольных и круглых в сечении пестиков выбран четырехугольный пестик, как наиболее технологичный при изготовлении и распределении по пробиркам.

Прибор ДТ МАГ 16Р предназначен для ручного раскапывания жидкостей, однако укомплектованный электронной схемой управления от компьютера может являться составной частью устройства предназначенного для автоматического выделения и очистки ДНК и РНК с использованием стандартных пробирок на 1,5 мл путем установки на одной платформе двух, трех, четырех и более приборов ДТ МАГ 16Р.

Рис.1 - принцип передачи вращающегося момента от горизонтально вращающегося магнитного вала к вертикально вращающимся магнитным цилиндрам посредством их магнитного взаимодействия.

Рис.2 - расположение магнитных полюсов на магнитном валу, расположение магнитных цилиндров и направление их вращения.

Рис.3 - фигура, описываемая вращающимся вектором проекции напряженности магнитного поля, создаваемого вращающимся магнитным валом, с центром в точке проекции оси вращения вертикального магнитного цилиндра (расчет проведен для параметров устройства ДТ Маг 16Р).

Рис.4 - сечение ДТ МАГ-16Р с магнитным валом и электродвигателем.

Рис.5 - ДТ МАГ-16Р в разрезе с пробирками в двух штативах, вал с постоянными магнитами, магнитный цилиндр и пестики.

Пример конкретного исполнения: Модель ДТ МАГ-16Р предназначена для ручного раскапывания и забора жидкостей и повышения производительности выделения и очистки ДНК, РНК с использованием стандартных пробирок на 1.5 мл. В модели ДТ МАГ-16Р установлены шестнадцать пробирок, сгруппированных по восемь пробирок, в каждом из двух штативов. В основу работы ДТ МАГ-16Р положен «Способ гомогенизации биологических образцов с использованием магнитных наночастиц для автоматизации выделения и очистки ДНК для ПЦР анализа». В каждой пробирке располагается небольшой (0.9×1.0×6 мм) намагниченный пластиковый пестик, приводимый во вращение вокруг своей главной - вертикальной оси и одновременно прижимаемый к стенке пробирки. В ручном режиме перед началом работы во все пробирки (два штатива с восемью пробирками в каждой) с помощью магнитной пипетки помещается магнитный пестик из магнитопласта (поставляется производителем ООО «НПО ДНК-Технология» как одноразовый расходный материал). Для приведения в движение 16 магнитных пластиковых пестиков в ДТ МАГ-16Р используется 16, вращающиеся вокруг своей главной - вертикальной оси, магнитных цилиндров. С остаточной намагниченностью перпендикулярно оси вращения (В=1.4 Тл). Магнитные цилиндры имеют следующие размеры (⌀4 мм Н=10 мм). Горизонтальный вал вращается электродвигателем. Вал состоит из четырех блоков, каждый из которых включает четыре скрещенных постоянных магнита. Магнитные полюса на вращающемся валу расположены с шагом 1,125 R, где R - радиус магнитного вала.

Магнитные полюса взаимодействуют с 16, вращающимися вокруг своей главной - вертикальной оси, магнитными цилиндрами. Ось вала с магнитными полюсами перпендикулярна всем 16, вращающимся вокруг своей главной - вертикальной оси, магнитным цилиндрам и установлены в устройстве из немагнитного материала параллельно стенке пробирки, только с возможностью вращения. Растирание и перемешивание (гомогенизация) биологических образцов одновременно в 16 стандартных пробирках по 1.5 мл, объединенных в два (по 8 пробирок) съемных штатива для легкого и быстрого перемещения всех пробирок из прибора ДТ-Маг 16Р в магнитный штатив или термостат «Термит» производства ООО «НПО ДНК-Технология», говорит о том, что работы, выполняемые прибором ДТ-Маг 16Р, важны, но являются только частью большого технологического процесса. Характерной особенностью прибора ДТ Маг 16Р является полная визуальная доступность всех пробирок и процессов в них происходящих, а также расположение магнитных полюсов на магнитном валу, обеспечивающее синхронное вращение магнитных цилиндров, расположенных с одной стороны от вала попарно в различных направлениях, уменьшая при этом требуемую величину усилия, прилагаемого к магнитному валу. Включение и выключение прибора осуществляется кнопкой на верхней панели. На передней верхней панели устройства имеется индикатор его состояния. В настоящее время прибор прошел экспериментальные испытания в микробиологических лабораториях, выпущена пробная партия из 10 штук, используемая для проведения экспериментальных работ, выпущен полный комплект технической документации с индексом ДТ МАГ-16Р и проведена подготовка к мелкосерийному производству приборов.

Технические характеристики

Количество пробирок: 16=2×8 (2 съемных штативов по 8 пробирок емкостью 1.5 мл). Приблизительное время одного цикла работы прибора при полной его загрузке составляет около 30 минут (около 70% времени - ручное раскапывание и около 30% - работа «ДТ МАГ-16Р»).

Количество магнитных валов: 1 шт.

Остаточная намагниченность магнитов вала: 1.4 Тл.

Частота вращения магнитного вала: 30-50 Гц.

Количество магнитных цилиндров: 16 шт.

Остаточная намагниченность магнитного цилиндра: 1.4 Тл.

Частота вращения магнитных цилиндров: 30-50 Гц.

Размер магнитного цилиндра: D=4 мм, Н=10 мм.

Остаточная намагниченность магнитного пестика из магнитопласта в пробирки: 0.3 Тл.

Размер магнитного пестика: 0,9*.1,0*6 мм.

Время сбора (дрейфа) магнитных частиц на внутренние стенки пробирок около 60 сек.

Максимальная потребляемая мощность: 0.15 Вт.

Электропитание Li ионовый аккумулятор: 3.7 Вт.

Габариты (длинна, ширина, высота): 210×65×80 мм.

Вес: 0.3 кг.

Условия эксплуатации

Температура 20-30°C

Относительная влажность не более 50%.

Claims (1)

1. Устройство для выделения нуклеиновых кислот, включающее корпус, пробирки для размещения в каждой из них адсорбированных на магнитных частицах нуклеиновых кислот и намагниченного перпендикулярно оси пестика, отличающееся тем, что корпус выполнен из немагнитного материала, в корпусе установлены с возможностью образования вращающегося неоднородного магнитного поля горизонтально расположенный вал, состоящий из повторяющихся вдоль продольной оси вала блоков из четырех скрещенных постоянных магнитов, причем положение каждого из магнитов определено углом поворота одноименных полюсов относительно первого магнита, второй магнит повернут на 90°, третий - на 270°, четвертый магнит - на 180°, и расположенные по обе стороны горизонтального вала магнитные цилиндры, каждый из которых намагничен перпендикулярно оси с возможностью вращения только вокруг этой оси, и расположен параллельно стенке пробирки, каждая пара магнитных цилиндров по разные стороны от продольной оси горизонтального вала размещена с возможностью взаимодействия с двумя скрещенными постоянными магнитами горизонтального вала, причем горизонтальный вал выполнен и размещен в корпусе таким образом, что его ось перпендикулярна осям магнитных цилиндров, а количество пар скрещенных постоянных магнитов на валу равно количеству магнитных цилиндров, расположенных с одной стороны от продольной оси вала, при этом пробирки размещены в корпусе в магнитном неоднородном вращающемся поле.

Images