JP5079506B2 - 動物についての、バイオテクノロジー(生物学的研究を含む)および医学的診断での適用のための、細胞、生体粒子および/または分子を液体から単離するための装置ならびに方法 - Google Patents
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Description
本発明は、細胞、生体粒子および/または分子を液体から単離するための装置および方法を記載する。本発明を使用し、適切な担体および公知の固定化方法を使用して、特定の生体粒子を認識し、かつ分離することができる。本発明の適用分野は、動物、バイオテクノロジー(生物学的研究を含む)および医学的診断である。
Ascitis抗体(RIB5/2)について、プロトコルにしたがってMillipore Montage Antibody Purification Kit(LSK2 ABG 20)を使用した。
1. PMA1ml(粒径=40μm+/−10μm;10mg/ml;COOH/PEG−COOH修飾型)を3,000×gで2分間遠心分離し、上清を捨て、1mlの0.1M MESバッファー(pH6.3)中に加える。
1. 4mlの抗凝血処理ラット全血を機能化抗CD4 PMA粒子懸濁液1ml(粒子1mg)と混合する。
1. 慎重な遠心分離によって細胞が付着している抗CD4 PMA粒子を沈降させる。
Ascitis抗体(RIB5/2)について、プロトコルにしたがってMillipore Montage Antibody Purification Kit(LSK2 ABG 20)を使用した。
1. PMA1ml(粒径=40μm+/−10μm;10mg/ml;COOH/PEG−COOH修飾型)を3.000×gで2分間遠心分離し、上清を捨て、1mlの0.1M MESバッファー(pH6.3)中に加える。
1. 1mlの細胞ライセート(HepG2,4×106)を1mgのヤギ抗マウスIgGと混合する。
1. スクリーンチャンバーから得た付着タンパク質を伴う機能化PMA粒子を0.5mlのクエン酸バッファー(pH2.2)に加え;30分間インキュベートする。
Claims (10)
- 動物についての、バイオテクノロジー(生物学的研究を含む)における、および医学的診断の補助のための、細胞を液体から単離するための装置であって、以下のもの、すなわち
a. 細胞が配置される、生体適合性材料からなる反応容器、
b. 必要とされる細胞の集団を認識し、かつそれらを結合するリガンド結合微粒子、
c. 細胞の通過を許容するが、前記微粒子の通過を許容しない孔を有する1以上のメンブレンに基づく粒子分離系、ならびに
d. 連続使用のために、細胞の単離、分離、加工および除去のすべての工程を実行可能にするための、種々のホース系、メンブレン、ポンプおよび弁
を含む上記装置。 - 請求項1に記載の装置であって、
特定の細胞が体細胞、または、ウイルス、細菌、原生動物もしくはこれらの混合物であり、ならびに液体が分泌物および排泄物、血液、リンパ、体液(liquor)、洗浄サンプル、あるいは器官採取物または栄養培地もしくは発酵沈殿由来の分離細胞の懸濁液であり、かつ細胞を含有するものであり、かつ/または
追加のリガンド結合微粒子を使用することによって、細胞の分離を細胞の吸着の原理と組み合わせ、
併用されるリガンド結合微粒子同士がそのサイズに関して異なっており、追加のリガンドによって生細胞に関する細胞刺激機能をもたらすことができ、あるいは細胞膜/メディエーター相互作用によって少なくとも1種の細胞タイプの刺激がもたらされる少なくとも2種の異なる細胞タイプを追加のリガンドによって分離するものであり、かつ/または
リガンド結合微粒子が2種以上の特異的リガンドを保持し、ゆえに2種以上の異なる細胞が該微粒子に特異的に吸着する、
上記装置。 - 請求項1または2に記載の装置であって、
リガンド結合微粒子が液体に懸濁され、自由可動性であり、かつ/または
機械的作用によって微粒子を懸濁状態で維持し、かつ/または
微粒子が配備されている反応区画由来の液体をろ過によって微粒子と分離させるものであり、かつ/または
特異的に吸着されないすべての成分の通過を許容するが、使用される微粒子の通過を許容しない直径を有する孔を特徴とするメンブレンをろ過に使用するものであり、かつ/または
孔の直径が1μmより大きく、1,000μmより小さい平面状または中空管メンブレンを分離に使用するものであり、かつ/または
反応容器を使用して単離された細胞の追加の加工を行う、
上記装置。 - 細胞を液体から分離するための方法であって、分離される細胞が特定の表面抗原により特徴づけられ、かつ請求項1〜3のいずれか1項に記載の装置を使用して細胞を分離することにより特徴付けられる、上記方法。
- 細胞を分離するための請求項4に記載の方法であって、該表面抗原を認識する原理が天然または合成起源のリガンドであり、リガンドが抗体、抗体フラグメント、ペプチド、ポリペプチド、糖ペプチド、受容体、ステロイド、ホルモン、マイトジェン、抗原、スーパー抗原、成長因子、サイトカイン、レクチン(lektin)、ウイルスタンパク質、接着分子またはケモカインである、上記方法。
- 請求項4または5に記載の方法であって、
リガンドが共有結合または非共有結合によって微粒子に結合しており、かつ/または
固体担体として生体適合性ポリマーを使用し、かつ/または
リガンドが、セファロースにカップリングされており、かつ/または
細胞を連続して、または不連続に分離するものであり、かつ/または
任意の数量の個別のモジュールとして、異なるリガンド結合微粒子に応じて反応容器を順番に切り替えることができるものであり、かつ/または
連続分離のために、リガンド結合微粒子を反応容器に入れ、細胞を含有する液体または血液、によりこれを流動させるものであり、かつ/または
所定のバッファーを適用することによって、細胞を微粒子から分離するものであり、かつ/または
細胞の放出および、別の細胞の放出を同一反応容器中で実行するものであり、かつ/または
液体の分離に使用されるメンブレンと同一のメンブレンでのろ過によって、細胞を微粒子懸濁液から分離するものであり、かつ/または
分離された細胞を、ヒトへの適用を目的とせずに、分析および/または別の機械処理および/または加工のために使用するものであり、かつ/または
分離された細胞を、加工せずに、あるいは修飾して、疾患の研究または治療のために非ヒト動物に投与することができる、
上記方法。 - 動物についての、バイオテクノロジー(生物学的研究を含む)および医学的診断での適用のための、細胞を液体から単離するための請求項1〜3のいずれか1項に記載の装置であって、以下のもの、すなわち
a. 細胞が配置される、生体適合性材料からなる反応容器、
b. 必要とされる細胞の集団を認識し、かつそれらを結合するリガンド結合微粒子であって、自由可動性であり、反応容器から粒子分離系へ導出することができる微粒子、
c. 細胞の通過を許容するが、前記微粒子の通過を許容しない孔を有する1以上のメンブレン/スクリーンに基づく粒子分離系であって、
細胞混合物および微粒子を含む媒体を、静水圧によって、微粒子を伴う細胞混合物と微粒子を伴わない細胞混合物とに分離するための、または
細胞混合物および微粒子を含む媒体を、静水圧によって、メンブレンを通過する、細胞に結合していない遊離の微粒子を含む細胞混合物と、リガンド結合微粒子および標的細胞からなる特異的複合体のみを含有する、メンブレンの手前の媒体とに分離するための粒子分離系、
d. スクリーン/中空繊維メンブレンであって、微粒子を伴わない細胞混合物のみの通過を許容する孔サイズを備えているもの、
e. 弁によって反応容器中へ液体をポンプ/導入するためのポンプ、
f. 反応容器中へ液体をポンプ/導入するための弁、
g. 微粒子を伴わない細胞混合物を粒子分離系から導出するための弁、
h. (A)細胞混合物を含む液体を、リガンド結合微粒子を含有する反応容器中へ弁によって導入またはポンプするためのホース系、(B)反応容器から細胞混合物およびリガンド結合微粒子を含む媒体を導いて、リガンド結合微粒子を伴わない細胞混合物とリガンド結合微粒子を伴う細胞混合物とに該媒体を分離するための中空繊維メンブレンを有するスクリーンを通過させるためのホース系、または反応容器から細胞混合物およびリガンド結合微粒子を含む媒体を導いて、該媒体を、メンブレンを通過する、細胞に結合していない遊離の微粒子を含む細胞混合物と、リガンド結合微粒子および標的細胞からなる特異的複合体のみを含有するメンブレンの手前の媒体とに分離するためのスクリーンを通過させるホース系、(C)リガンド結合微粒子を伴わない分離済み細胞混合物を弁によって導出するためのホース系、および(D)リガンド結合微粒子およびそれに結合している細胞を伴う分離済み細胞混合物を導いて反応容器に戻すホース系、またはリガンド結合微粒子およびそれに結合している細胞を伴う細胞混合物を分析または調製のために導出するためのホース系、ならびに
i. 連続使用のために、細胞の単離、分離、加工および除去のすべての工程を実行可能にするための、種々のホース系、メンブレン、ポンプおよび弁
を含む上記装置。 - 細胞を液体から分離するための請求項4〜6のいずれか1項に記載の方法であって、以下のステップ、すなわち
細胞を含む液体をポンプするか、または弁によって導いて、混合物中の該液体の成分と相互作用するリガンド結合微粒子を含有する生体適合性反応容器に入れるステップ、
細胞混合物およびリガンド結合粒子を含む媒体を、反応容器から、スクリーンおよび中空繊維メンブレンを有する粒子分離系に導入し、該スクリーンおよび中空繊維メンブレンは、リガンド結合粒子を伴わない細胞混合物の通過のみを許容する孔サイズを備えており、その結果として、細胞混合物およびリガンド結合粒子を含む該媒体を静水圧によって該スクリーンおよび中空繊維メンブレンを通過させて、リガンド結合粒子を伴わない細胞混合物とリガンド結合粒子を伴う細胞混合物とに分離するステップ、
リガンド結合粒子を伴わない分離済み細胞混合物を弁によって粒子分離系から導出するステップ、および
リガンド結合粒子を伴う細胞混合物および、標的細胞を導いて反応容器に戻すか、あるいは分析または調製のために導出するステップ
を含む上記方法。 - 体外循環においてex vivoで血液を処理するための、請求項1〜3及び7のいずれか1項に記載の装置。
- 診断またはさらなる加工のための、細胞の浄化、富化または濃縮に適している、請求項1〜3、7及び9のいずれか1項に記載の装置。
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